WO2015025864A1 - 吸収剤ポリヌクレオチドを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット - Google Patents

吸収剤ポリヌクレオチドを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット Download PDF

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WO2015025864A1
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modified
target nucleic
modified nucleobase
capture probe
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PCT/JP2014/071705
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達樹 松野
麻里子 堀池
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富士レビオ株式会社
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for measuring modified nucleobases.
  • nucleic acids eg, DNA, RNA
  • nucleic acids eg, DNA, RNA
  • many techniques have been reported so far for detecting nucleobases into which a substance such as biotin has been artificially introduced by an immunoassay using an antibody.
  • a technique for detecting a naturally occurring modified nucleobase (eg, methylcytosine, hydroxylmethylcytosine) by immunoassay has been reported (Patent Document 1, and Non-Patent Documents 1 and 2).
  • an immunoassay system for detecting a modified nucleobase as described above, the present inventors have prepared a nucleic acid of an antibody against the modified nucleobase (eg, a portion other than the modified nucleobase in the target nucleic acid containing the modified nucleobase and / or It has also been found that there is a problem that the background value of the detection signal increases due to non-specific binding to the capture probe). Therefore, in order to construct a highly sensitive immunoassay system, it was necessary to develop a technique for suppressing the background value.
  • a nucleic acid of an antibody against the modified nucleobase eg, a portion other than the modified nucleobase in the target nucleic acid containing the modified nucleobase and / or It has also been found that there is a problem that the background value of the detection signal increases due to non-specific binding to the capture probe). Therefore, in order to construct a highly sensitive immunoassay system, it was necessary to develop a technique for suppressing the background value.
  • a method for measuring a modified nucleobase comprising: (1) incubating the nucleic acid sample and capture probe in solution; and (2) modified nucleobase in the solution obtained in (1) using an antibody against the modified nucleobase in the presence of an absorbent polynucleotide. To measure.
  • [2] The method of [1], wherein the nucleic acid sample contains a target nucleic acid containing a modified nucleobase, and steps (1) and (2) are performed by (1 ′) and (2 ′), respectively: (1 ′) reacting a nucleic acid sample containing a target nucleic acid containing a modified nucleobase and a capture probe by incubation in solution to form a hybrid composed of the target nucleic acid and the capture probe; and (2 ′ ) Measuring the modified nucleobase using the antibody in the presence of the absorbent polynucleotide in the solution containing the hybrid.
  • [3] The method of [1] or [2], wherein the target nucleic acid is a target nucleic acid that may contain two or more modified nucleobases.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], further comprising adding a capture probe to a solution containing the nucleic acid sample to prepare a solution containing both the nucleic acid sample and the capture probe.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the nucleic acid sample is a sample containing a target DNA containing a modified nucleobase.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the absorbent polynucleotide contains 12 or more nucleotide residues.
  • a kit for measuring a modified nucleobase comprising: (I) a capture probe; (II) an absorbent polynucleotide; and (III) an antibody against the modified nucleobase.
  • the modified nucleobase in the target nucleic acid can be measured with high sensitivity by reducing the background value of the detection signal.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an outline of measurement of a modified nucleobase in a target nucleic acid according to the method of the present invention.
  • RN a nucleotide residue having a modified nucleobase
  • N a nucleotide residue having a nucleobase
  • R a substituent that the nucleobase has.
  • FIG. 2 shows signal values measured in measurement under conditions of a target nucleic acid (-) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), an absorbent polynucleotide (+) and an antibody against the modified nucleobase (+) ( It is a figure which shows (background value).
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an outline of measurement of a modified nucleobase in a target nucleic acid according to the method of the present invention.
  • RN a nucleotide residue having a modified nucleobase
  • N a nucleotide residue having a nucleobase
  • R
  • S / N signal-to-noise ratio
  • S indicates a signal value measured in measurement under conditions of target nucleic acid (+), capture probe (+), absorbent polynucleotide (+), and antibody against modified nucleobase (+).
  • N indicates the signal value (background value) measured in the measurement under the conditions of the target nucleic acid ( ⁇ ), the capture probe (+), and the antibody against the modified nucleobase (+).
  • FIG. 4 shows a comparison of the effects of absorbent polynucleotide 1 (poly C), comparative substance 1 (poly T), comparative substance 2 (poly A), and comparative substance 3 (poly G) in measuring the background value.
  • FIG. FIG. 5 shows the effects of the absorbent polynucleotide 1 (poly C), the comparative substance 1 (poly T), the comparative substance 2 (poly A), and the comparative substance 3 (poly G) in measuring the S / N value. It is a figure which shows a comparison.
  • FIG. 6 is a diagram showing a comparison of the effects of the comparative substance 4 (dCTP), the comparative substance 5 (dATP), and the comparative substance 6 (dGTP) in the measurement of the background value.
  • FIG. 7 is a diagram showing a comparison of the effects of the comparative substance 4 (dCTP), the comparative substance 5 (dATP), and the comparative substance 6 (dGTP) in the measurement of the S / N value.
  • FIG. 8 was measured in measurements under conditions of target nucleic acid (-) containing modified nucleobase (-), capture probe (+), absorbent polynucleotide (-or +) and various antibodies (+) against modified nucleobase. It is a figure which shows a background value.
  • the antibody clones used are as follows.
  • FIG. 9 is a diagram showing the effect of the length of the absorbent polynucleotide (consisting of one nucleotide residue) on the suppression of the background value.
  • FIG. 10 is a diagram showing the effect of the length of the absorbent polynucleotide (composed of one kind of nucleotide residue) on the improvement of the S / N value.
  • FIG. 11 is a graph showing the effect of the nucleotide composition of the absorbent polynucleotide on the suppression of the background value and the improvement of the S / N value.
  • the number below the table indicates the number of the absorbent polynucleotide.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of the nucleotide composition of the absorbent polynucleotide on the suppression of the background value and the improvement of the S / N value.
  • the number below the table indicates the number of the absorbent polynucleotide.
  • FIG. 13 shows signal values (background values) measured in measurement under conditions of a target nucleic acid (-) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), an absorbent polynucleotide and an antibody against the modified nucleobase (+). ).
  • FIG. 14 is a diagram showing signal-to-noise ratio (S / N) calculated in measurement of modified nucleobases at various concentrations using a nucleic acid probe.
  • the capture probe, absorbent polynucleotide and antibody used are the same as in FIG. FIG.
  • FIG. 15 shows signal values (background values) measured in measurement under conditions of a target nucleic acid (-) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), an absorbent polynucleotide and an antibody (+) against the modified nucleobase. ).
  • FIG. 16 is a diagram showing signal-to-noise ratio (S / N) calculated in measurement of modified nucleobases at various concentrations using a nucleic acid probe.
  • the capture probe, absorbent polynucleotide and antibody used are the same as in FIG. FIG.
  • FIG. 17 shows signal values (background values) measured in measurement under conditions of a target nucleic acid (-) containing a modified nucleobase, a capture probe (+), an absorbent polynucleotide and an antibody against the modified nucleobase (+). ).
  • FIG. 18 is a diagram showing signal-to-noise ratio (S / N) calculated in measurement of modified nucleobases at various concentrations using a nucleic acid probe. The capture probe, absorbent polynucleotide and antibody used are the same as in FIG.
  • FIG. 19 shows signal values (background values) measured in measurement under conditions of target nucleic acid ( ⁇ ) containing modified nucleobase, capture probe (+), absorbent polynucleotide and antibody against modified nucleobase (+). ).
  • FIG. 20 is a diagram showing signal-to-noise ratio (S / N) calculated in measurement of modified nucleobases at various concentrations using a nucleic acid probe.
  • the capture probe, absorbent polynucleotide and antibody used are the same as in FIG.
  • the present invention provides a method for measuring modified nucleobases.
  • the method of the present invention includes: (1) incubating the nucleic acid sample and capture probe in solution; and (2) modified nucleobase in the solution obtained in (1) using an antibody against the modified nucleobase in the presence of an absorbent polynucleotide. To measure.
  • the nucleic acid sample is a sample containing a target nucleic acid containing a modified nucleobase, or a sample suspected of containing the target nucleic acid.
  • the nucleic acid sample may also be a biological sample from an organism, or an environmental sample or the like. Examples of organisms from which biological samples are derived include animals such as mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, horses, goats, sheep), birds (eg, chickens), insects, and the like. , Microorganisms, plants, fungi, and fish.
  • a biological sample can also be a blood-related sample (eg, whole blood, serum, plasma), saliva, urine, milk, tissue or cell extract, or a mixture thereof, which is the blood itself or a sample derived from blood. Also good.
  • the biological sample may further be derived from a mammal suffering from a disease (eg, cancer, leukemia) or a mammal potentially having a disease.
  • the environmental sample include samples derived from soil, seawater, and fresh water that may contain nucleic acids. Such samples may be subjected to other processing before being used in the method of the present invention. Examples of such treatment include extraction of nucleic acid (eg, DNA such as genomic DNA, RNA) and fragmentation (eg, treatment with an enzyme such as a restriction enzyme).
  • the methods of the invention may further comprise extracting nucleic acid from the nucleic acid sample and / or fragmenting the nucleic acid.
  • the method of the present invention may further comprise processing the sample by centrifugation, extraction, filtration, precipitation, heating, freezing, refrigeration, stirring, and the like.
  • the target nucleic acid is DNA or RNA, but DNA is preferred.
  • the target nucleic acid is also a coding or non-coding region of DNA (eg, a transcriptional regulatory region).
  • the number of nucleotide residues constituting the target nucleic acid is not particularly limited as long as it can hybridize with the capture probe. For example, it is 10 or more, preferably 15 or more, more preferably 20 It may be the above.
  • the number of nucleotides constituting the target nucleic acid is not particularly limited, and may be any number that may be generated by fragmentation processing of genomic DNA, for example.
  • the number of nucleotides constituting the target nucleic acid may be 10,000 or less, 5000 or less, 2000 or less, 1000 or less, 500 or less, 200 or 100 or less.
  • the GC content of the target nucleic acid is not particularly limited, and may be, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, or 60% or more.
  • the GC content of the target nucleic acid may also be 90% or less, 80% or less, or 70% or less, for example.
  • the number of modified nucleobases contained in the target nucleic acid is not particularly limited as long as it is 1 or more (eg, 1 to 100, 1 to 20, 1 to 10, or 1 to 5).
  • the modified nucleobase is modified with respect to a normal nucleobase selected from the group consisting of adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T) and uracil (U).
  • a nucleobase having a structure includes, for example, adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (T) when the target nucleic acid is DNA. It is done.
  • the target nucleic acid when the target nucleic acid is RNA, examples thereof include adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and uracil (U).
  • the nucleobase is preferably cytosine (C).
  • Modifications include, for example, introduction of substituents into normal nucleobases, elimination of groups (eg, amino group, oxo group, methyl group) possessed by ordinary nucleobases, substituents of groups possessed by ordinary nucleobases The exchange to is mentioned.
  • the substituent is not particularly limited as long as it can be possessed by a naturally occurring nucleobase.
  • the substituent is preferably methyl, hydroxymethyl, or carboxyl, and more preferably methyl or hydroxymethyl.
  • the position of modification such as substitution is not particularly limited, but in the case of a nucleobase having a pyrimidine ring (C, T or U), for example, it is at the 2-position, 4- to 6-position, preferably at the 5-position, In the case of a nucleobase (A or G) having a purine ring, they are, for example, the 2nd, 6th and 8th positions.
  • the modified nucleobase is not particularly limited as long as it can exist in nature.
  • Administrative Instructions under the Patent Cooperation Treaty (enforced on January 1, 2009), Annex C, Appendix 2, Table 2: Examples thereof include modified nucleobases possessed by modified nucleotides described in Modified Nucleotides.
  • the modified nucleotides described in this document may be the same as the modified nucleotides described in Appendix 2, Table 2: Modified Base Table of the above guidelines. Accordingly, reference can also be made to the above guidelines for modified nucleobases.
  • the modified nucleobase is methylcytosine (eg, 5-methylcytosine), hydroxymethylcytosine (eg, 5-hydroxymethylcytosine), carboxyl cytosine (eg, 5-carboxyl cytosine). More preferably, the modified nucleobase is methylcytosine (eg, 5-methylcytosine), hydroxymethylcytosine (eg, 5-hydroxymethylcytosine).
  • a modified nucleobase is known to cause a change in the function of the nucleic acid (eg, a change in the transcriptional regulatory ability of a given gene).
  • the capture probe is a nucleic acid molecule that can hybridize with the target nucleic acid.
  • the capture probe is composed of a nucleic acid that is homologous and / or heterologous to the target nucleic acid.
  • the term “same species” means that the capture probe has the same main-chain structure as the main-chain structure of the target nucleic acid (structure composed of a sugar moiety and a phosphate moiety) as a whole of the main-chain structure. .
  • the term “heterologous” means that the capture probe has a main chain structure that is different from the main chain structure of the target nucleic acid (structure composed of a sugar moiety and a phosphate moiety) as a part or the whole of the main chain structure. means. Therefore, the type of capture probe is determined according to the type of target nucleic acid. For example, when the target nucleic acid is DNA, a DNA probe can be used as a capture probe for homologous nucleic acids, and a nucleic acid probe other than a DNA probe can be used as a capture probe for heterologous nucleic acids.
  • the target nucleic acid is a natural RNA
  • a normal RNA probe composed of the same type of RNA as the natural RNA can be used as the same type of nucleic acid capture probe, and a normal RNA probe as a heterologous nucleic acid capture probe.
  • Other nucleic acid probes can be used.
  • the capture probe examples include a DNA probe, an RNA probe, a peptide nucleic acid (PNA) probe, a lock nucleic acid (also referred to as LNA, bridged nucleic acid (BNA)) probe, a phosphorothioate (S) nucleic acid probe, and such 2 probes.
  • PNA peptide nucleic acid
  • BNA bridged nucleic acid
  • S phosphorothioate
  • a chimeric nucleic acid probe in which the above nucleic acid probes are linked and / or mixed the chimeric nucleic acid probe necessarily includes a nucleic acid heterologous to the target nucleic acid).
  • RNA probe examples include a normal RNA probe composed of a natural ribonucleotide having a hydroxyl group at the 2 ′ position, and a modified RNA probe composed of a ribonucleotide modified with a hydroxyl group at the 2 ′ position.
  • a ribonuclease resistant RNA probe may be used as the modified RNA probe.
  • modified RNA probes include 2′-O-alkylated RNA probes. The 2′-O-alkylated RNA probe is preferably a 2′-O—C 1 -C 6 alkylated RNA probe.
  • the C 1 -C 6 alkylated C 1 -C 6 alkyl group is a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as a methyl, ethyl, propyl group (eg, n -Propyl, iso-propyl), butyl group (eg, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl), pentyl group, hexyl group and the like.
  • the 2′-O—C 1 -C 6 alkylated RNA probe is preferably a 2′-O-methylated RNA probe.
  • the number of nucleotide residues constituting the capture probe is not particularly limited as long as it is long enough for hybridization with the target nucleic acid. For example, it is 10 or more, preferably 15 or more. More preferably, it may be 20 or more. The number of nucleotides constituting the capture probe may also be, for example, 100 or less, 80 or less, 60 or less, 50 or less, 40 or less, or 30 or less.
  • the GC content of the target nucleic acid is not particularly limited, and may be, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, or 60% or more. The GC content of the target nucleic acid may also be 90% or less, 80% or less, or 70% or less, for example.
  • Such a capture probe can be prepared, for example, by a probe synthesis method known in the art.
  • the capture probe is used in a free form or a form immobilized on a solid phase (described later).
  • the capture probe may be labeled with a substance or group that allows immobilization to the solid phase. Labeling is performed, for example, at either the 5 'end or the 3' end.
  • the group or substance that enables immobilization to a solid phase include a group or substance that enables covalent binding to a solid phase, and an affinity substance.
  • Examples of the group or substance that enables covalent binding to the solid phase include, for example, a thiol group or a substance having a thiol group (such a thiol group introduced into the capture probe is a group of a maleimide group on the solid phase).
  • an amino group or a substance having an amino group can bind to maleic anhydride on a solid phase.
  • the affinity substance include streptavidin, biotin, digoxigenin, dinitrophenol, fluorescein, and fluorescein isothiocyanate.
  • the solid phase one coated with another affinity substance having affinity with the affinity substance of the capture probe can be used.
  • the incubation is performed under conditions that allow a hybridization reaction between the capture probe (free or immobilized on a solid phase described later) and the target nucleic acid in the nucleic acid sample. Undertaken in a suitable solution.
  • a suitable solution for example, a buffer solution containing a salt (eg, sodium citrate) and other components (eg, a surfactant) can be used.
  • the hybridization temperature is, for example, 15 to 95 ° C. (preferably 25 to 65 ° C.).
  • the incubation may be performed in the absence or presence of an absorbent polynucleotide (free or immobilized on a solid phase described later).
  • the solution subjected to the incubation may or may not contain an absorbent polynucleotide described later. This is because the absorbent polynucleotide does not hybridize with the target nucleic acid and the capture probe. Therefore, when the solution to be incubated contains a nucleic acid sample, a capture probe, and an absorbent polynucleotide, the order of addition of the nucleic acid sample, the capture probe, and the absorbent polynucleotide to the solution is naturally not particularly limited. . If the solution to be incubated does not contain the absorbent polynucleotide, the absorbent polynucleotide is added to the solution after the incubation.
  • the addition of the absorbent polynucleotide to the solution may be performed before or after the addition of the antibody solution to the modified nucleobase, or may be performed at the same time. If the nucleic acid sample does not contain the target nucleic acid, incubation of the nucleic acid sample and capture probe in solution does not form a hybrid. In this case, in the step (2) described later, the modified nucleobase cannot be detected, but it can be determined that the modified nucleobase is not present in the nucleic acid sample.
  • the nucleic acid sample and the capture probe can be included in the solution to contain the modified nucleobase.
  • No target nucleic acid and capture probe react to form a hybrid composed of the target nucleic acid and capture probe.
  • the modified nucleobase cannot be detected, but the modified nucleobase is not present in the nucleic acid sample (although the target nucleic acid is present), in other words, the target It can be determined that a given nucleobase in the nucleic acid is not modified.
  • the target nucleic acid containing the modified nucleobase and the capture probe react with each other by incubating the nucleic acid sample and the capture probe in a solution, and the target nucleic acid and the capture probe Is formed.
  • the presence of the modified nucleobase can be determined, and the modified nucleobase can also be quantified.
  • a hybrid is a hybridization complex having a double-stranded structure of a target nucleic acid and a capture probe formed by hybridization.
  • hybrid structures are as described in Table 1 below.
  • the double-stranded structure may be formed in the entire region of the target nucleic acid and the capture probe.
  • the double-stranded structure may also be formed in a partial region of the target nucleic acid or capture probe, as shown in (b) to (i).
  • the hybrid may have a single-stranded structure of the target nucleic acid in either the 5 ′ terminal region or the 3 ′ terminal region in addition to the double-stranded structure [eg, (b) to (e)
  • the target nucleic acid may have a single-stranded structure in both the 5 ′ end region and the 3 ′ end region [eg, (i)].
  • the hybrid may also have a single-stranded structure of the capture probe in either the 5′-terminal region or the 3′-terminal region in addition to the double-stranded structure [eg, (b), (c), (F), (g)], and may have a single-stranded structure of the target nucleic acid in both the 5 ′ terminal region and the 3 ′ terminal region [eg, (h)].
  • a single-stranded structure is formed by either or both of the hybridized target nucleic acid or capture probe having a non-hybridizing region of one or more nucleotide residues at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end. Is the structure.
  • the 5 ′ terminal region and 3 ′ terminal region of the target nucleic acid and at least two terminal regions of the 5 ′ terminal region and 3 ′ terminal region of the capture probe are hybridized.
  • the structure was presented. However, in a hybrid, such two terminal regions do not necessarily have to hybridize either, and single-stranded structural portions (ie, non-hybridized) in both the 3 ′ end region of the target nucleic acid and the 5 ′ end region of the capture probe. Soy region) and may have a single-stranded structure in both the 5 ′ end region of the target nucleic acid and the 3 ′ end region of the capture probe.
  • the number of nucleotide residues in the target nucleic acid and capture probe corresponding to the double stranded structure is sufficient to allow hybridization with the target nucleic acid. Although it does not specifically limit as long as it is length, For example, 10 or more, Preferably it is 15 or more, More preferably, 20 or more may be sufficient.
  • the number of nucleotide residues of the target nucleic acid and the capture probe corresponding to the double-stranded structure part is also, for example, 100 or less, 80 or less, 60 or less, 50 or less, 40 or less, or 30 or less. Also good.
  • the GC content in the double-stranded structure is not particularly limited, and may be, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, or 60% or more.
  • the GC content in the double-stranded structure part may also be 90% or less, 80% or less, or 70% or less, for example.
  • the number of nucleotide residues of the target nucleic acid and the capture probe corresponding to the single-stranded structural portion of the 5′-terminal region or 3′-terminal region is one.
  • the number is not particularly limited as long as it is above, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 15 or more , 20 or more, or 50 or more.
  • Such a number is not particularly limited, and may be, for example, 10,000 or less, 5000 or less, 2000 or less, 1000 or less, 500 or less, 200 or less, or 100 or less.
  • the capture probe may be designed to form such a single stranded structural moiety in the hybrid at the 5 'or 3' end region.
  • the capture probe may be designed such that an unpaired portion of the modified nucleobase is formed in the hybrid double-stranded structure portion.
  • the unpaired portion of the modified nucleobase can be introduced to facilitate detection of the modified nucleobase by the antibody.
  • a capture probe having a nucleotide sequence that is not completely complementary to the target nucleic acid in the double-stranded structure portion may be used.
  • An example of a capture probe in which an unpaired portion of a modified nucleobase is formed in a double-stranded structure part of a hybrid is a capture probe that lacks a nucleotide residue complementary to a nucleotide residue having a modified nucleobase in a target nucleic acid [Example (I) in Table 2].
  • Such a capture probe may lack only one nucleotide residue complementary to a nucleotide residue having a modified nucleobase in the target nucleic acid (eg, (I-1) in Table 2), It may lack two or more (eg, 2-20, 2-10, or 2-5) contiguous nucleotide residues including nucleotide residues with modified nucleobases in nucleic acids [eg, (I-2) in Table 2].
  • the number in the unpaired portion of the nucleotide residue having the modified nucleobase is not particularly limited as long as it is 1 or more as described above.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 See, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 2. Such a design is possible if the position of the nucleotide residue having the modified nucleobase in the target nucleic acid to be measured is known.
  • Another example of a capture probe in which an unpaired portion of a modified nucleobase is formed in the double stranded structural portion of the hybrid has a nucleotide residue that is non-complementary to the nucleotide residue having the modified nucleobase in the target nucleic acid It is a capture probe [eg, (I ′) in Table 2].
  • Such a capture probe may have only one nucleotide residue that is non-complementary to a nucleotide residue having a modified nucleobase in the target nucleic acid [eg, (I′-1) in Table 2], Two or more (for example, 2 to 20, 2 to 10, or 2 to 5) adjacent nucleotide residues including a nucleotide residue having a modified nucleobase in the target nucleic acid may be non-complementary. [Example, (I′-2) in Table 2].
  • Such a design is possible if the position of the nucleotide residue having the modified nucleobase in the target nucleic acid to be measured is known.
  • the capture probe may be designed such that the modified nucleobase is present in the hybrid single stranded structure.
  • the modified nucleobase may be present at the non-terminal portion of the single-stranded structure portion on the 5 ′ end side (eg, (II) in Table 4), It may be present at the end of the single-stranded structure portion on the 5 ′ end side (eg, (III) in Table 4), and may be present at the non-terminal portion of the single-stranded structure portion on the 3 ′ end side.
  • the capture probe may be designed such that the hybrid single-stranded structural portion (target nucleic acid) contains the modified nucleobase in this manner.
  • the number in the single-stranded structure portion of the nucleotide residue having a modified nucleobase is not particularly limited as long as it is 1 or more as described above.
  • the capture probe is such that the modified nucleobase is present in the hybrid single-stranded structure and, as described above, an unpaired portion of the modified nucleobase is further formed in the hybrid double-stranded structure. May be designed. Such a design is possible if the position of the nucleotide residue having the modified nucleobase in the target nucleic acid to be measured is known.
  • the method of the present invention may further include adding a capture probe to a solution containing a nucleic acid sample to prepare a solution containing both the nucleic acid sample and the capture probe.
  • the capture probe can be added to the nucleic acid sample in solid form or as a solution.
  • the concentration of the target nucleic acid in the solution is not particularly limited as long as it can be detected by the method of the present invention. 0.01 nM or more, preferably 0.1 nM or more, more preferably 1 nM or more, even more preferably 5 nM or more, and particularly preferably 10 nM or more.
  • the concentration of the target nucleic acid in the solution may also be, for example, 1 M or less, 100 mM or less, 10 mM or less, 1 mM or less, 100 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, or 1 ⁇ M or less.
  • the target nucleic acid concentration in the nucleic acid sample is often unknown, so it may be difficult to set the exact target nucleic acid concentration.
  • concentration of the target nucleic acid may be known (eg, the presence and absence of modified nucleobases in the target nucleic acid, although the size and / or concentration of the target nucleic acid is separately measured) And the content of the modified nucleobase in the target nucleic acid is unknown). In such a case, the concentration of the target nucleic acid may be set as described above.
  • the concentration of the capture probe in the solution is not particularly limited as long as the target nucleic acid can be detected by the method of the present invention. For example, 0.01 nM or more, preferably 0.1 nM or more, more preferably 1 nM or more, and even more preferably It may be 5 nM or more, particularly preferably 10 nM or more.
  • the concentration of the capture probe in the solution may also be, for example, 1 M or less, 100 mM or less, 10 mM or less, 1 mM or less, 100 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, or 1 ⁇ M or less.
  • capture probes may be added to the solution so that such concentrations are achieved.
  • the target nucleic acid may be a target nucleic acid that may contain two or more modified nucleobases.
  • the number of modified nucleobases that may be contained in the target nucleic acid is not particularly limited as long as it is 2 or more. For example, 2 to 30, 2 to 20, 2 to 10, or 2 to 5 (Eg, 2, 3, 4 or 5).
  • the number of modified nucleobases contained in the target nucleic acid is plural, even if the target nucleic acid in the solution used for hybridization between the target nucleic acid and the capture probe is at a very low concentration (eg, 0.1 nM or more), It has been confirmed that the modified nucleic acid can be measured with high sensitivity.
  • the methods of the invention can use capture probes designed to hybridize with target nucleic acids that may contain more than one modified nucleobase. Such a design is possible if the number of nucleobases that may be modified in the target nucleic acid to be measured is known.
  • the modified nucleobase is measured using an antibody against the modified nucleobase in the solution containing the hybrid in the presence of the absorbent polynucleotide.
  • the solution obtained in the step (1) may be used as it is.
  • another solution is added and / or another solution is added.
  • Exchange to a solution may be performed. Such exchange can be performed, for example, by adding the solution obtained in step (1) to the solid phase, immobilizing the hybrid that may be contained in the solution to the solid phase, and then removing the solution from the solid phase.
  • another solution eg, a solution containing an antibody against the absorbent polynucleotide and / or the modified nucleobase
  • the solution used for the measurement is not particularly limited as long as it is a solution suitable for the antigen / antibody reaction.
  • Measurement can be performed by immunological techniques.
  • immunological techniques include enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competition ELISA, indirect competition ELISA, sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), Examples include immunochromatography, luminescence immunoassay, spin immunoassay, western blot, and latex agglutination.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • FFA fluorescence immunoassay
  • Examples include immunochromatography, luminescence immunoassay, spin immunoassay, western blot, and latex agglutination.
  • the absorbent polynucleotide refers to a nucleotide residue containing a nucleobase (that is, an unmodified nucleobase) constituting a modified nucleobase to be measured according to the present invention (hereinafter, such nucleotide residue is referred to as “A polynucleotide comprising (sometimes referred to as “effective nucleotide residues”).
  • a polynucleotide comprising sometimes referred to as “effective nucleotide residues”.
  • the “modified nucleobase” that is the target of the antibody used in the present invention differs from the “nucleobase” contained in the effective nucleotide residue in terms of the presence or absence of modification.
  • the absorbent polynucleotide is a nucleotide comprising adenine, guanine, cytosine or thymine, respectively, as the nucleobase A polynucleotide comprising residues.
  • the absorbent polynucleotide contains a nucleotide containing adenine, guanine, cytosine or uracil as the nucleobase, respectively.
  • the absorbent polynucleotide can be composed of the same or different type of nucleic acid with respect to the target nucleic acid, but is preferably composed of the same type of nucleic acid as the target nucleic acid.
  • the term “same species” means that the absorbent polynucleotide has the same backbone structure as the backbone structure of the target nucleic acid (a structure composed of a sugar moiety and a phosphate moiety).
  • heterologous means that the absorbent polynucleotide has a main chain structure different from the main chain structure of the target nucleic acid (structure composed of a sugar moiety and a phosphate moiety).
  • the type of absorbent polynucleotide may be determined according to the type of target nucleic acid.
  • the target nucleic acid is DNA
  • an absorbent polynucleotide (DNA) of a homologous nucleic acid or an absorbent polynucleotide (RNA) of a heterologous nucleic acid can be used.
  • the target nucleic acid is a natural RNA
  • an absorbent polynucleotide (RNA) of a homologous nucleic acid or an absorbent polynucleotide (DNA) of a heterologous nucleic acid can be used.
  • RNA is used.
  • the absorbent polynucleotide is preferably DNA.
  • modified cytosine is preferable as the modified nucleobase, the absorbent polynucleotide is preferably DNA containing a nucleotide residue containing cytosine.
  • the total number of nucleotide residues constituting the absorbent polynucleotide is, for example, 12 or more, preferably 14 or more, 16 or more, 18 or more, or 20 or more. Also good.
  • the total number of nucleotides constituting the absorbent polynucleotide may also be, for example, 100 or less, 80 or less, 70 or less, or 60 or less.
  • the number of effective nucleotide residues in the absorbent polynucleotide is not particularly limited as long as suppression of the background value and / or improvement of the S / N ratio is recognized in the present invention, but it is, for example, 12 or more, preferably 14
  • the number may be 16 or more, 18 or more, and more preferably 20 or more.
  • the number of effective nucleotide residues in the absorbent polynucleotide may also be, for example, 100 or less, 80 or less, 70 or less, 60 or less, 50 or less, 40 or less, or 30 or less.
  • Such an absorbent polynucleotide can be prepared by, for example, a nucleotide polymerization method known in the art.
  • the absorbent polynucleotide is used in a free form or a form fixed to a solid phase (described later).
  • the absorbent polynucleotide may be labeled with a substance or group that allows immobilization to the solid phase. Labeling is performed, for example, at either the 5 'end or the 3' end. Groups or substances that allow immobilization to the solid phase include groups or substances as described above for capture probes.
  • the absorbent polynucleotide is a homopolynucleotide.
  • a homopolynucleotide refers to a polynucleotide composed of only homologous nucleotide residues.
  • the target nucleic acid is DNA and the modified nucleobase is modified adenine, modified guanine, modified cytosine or modified thymine
  • the homopolynucleotide is a nucleotide residue containing adenine, guanine, cytosine or thymine, respectively, as the nucleobase.
  • DNA composed of only groups.
  • the absorbent polynucleotide contains a nucleotide containing adenine, guanine, cytosine or uracil as the nucleobase, respectively. It is RNA composed only of residues.
  • the absorbent polynucleotide is preferably a polynucleotide composed only of nucleotide residues containing cytosine, and more preferably DNA composed only of nucleotide residues containing cytosine.
  • the absorbent polynucleotide is a heteropolynucleotide.
  • a heteropolynucleotide refers to a polynucleotide composed of two or more heterologous nucleotide residues.
  • the absorbent polynucleotide can be an effective nucleotide residue and one or more other nucleotide residues, respectively.
  • a polynucleotide comprising a group is a group.
  • the absorbent polynucleotide is an effective nucleotide residue and one or more other nucleotide residues, respectively.
  • the absorbent polynucleotide is preferably a polynucleotide comprising a cytosine-containing nucleotide residue (effective nucleotide residue) and one or more other nucleotide residues, More preferably, it is a DNA containing a nucleotide residue containing cytosine (effective nucleotide residue) and one or more other nucleotide residues.
  • the content of effective nucleotide residues in the absorbent polynucleotide is not particularly limited as long as suppression of background value and / or improvement of S / N ratio is observed in the present invention. However, it may be 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • the antibody against the modified nucleobase may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody against the modified nucleobase may be any isotype of immunoglobulin (eg, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY).
  • the antibody against the modified nucleobase may also be a full-length antibody.
  • a full-length antibody refers to an antibody comprising a heavy chain and a light chain comprising a variable region and a constant region, respectively (eg, an antibody comprising two Fab portions and an Fc portion).
  • the antibody against the modified nucleobase may also be an antibody fragment derived from such a full-length antibody.
  • the antibody fragment is a part of a full-length antibody, and examples thereof include F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, and Fv.
  • the antibody against the modified nucleobase may also be a modified antibody such as a single chain antibody.
  • the antibody against the modified nucleobase may be further used as a primary antibody in an immunoassay such as ELISA, and in this case, a secondary antibody is used in combination.
  • An antibody against a modified nucleobase is a modified nucleobase, a nucleoside having a modified nucleobase (a structural unit composed of a modified nucleobase and 2′-deoxyribose or ribose), or a nucleotide having a modified nucleobase (modified nucleobase, 2 '-Deoxyribose or structural unit composed of ribose and phosphate) or affinity to two or more nucleotides (eg, oligonucleotide composed of 2 to 5 nucleotides) including nucleotides with modified nucleobases If you do.
  • the antibody against the modified nucleobase is 1) from the group consisting of 2′-deoxy modified adenosine, 2′-deoxy modified guanosine, 2′-deoxy modified cytidine and 2′-deoxy modified thymidine Selected antibodies against deoxyribonucleosides with modified nucleobases 2) 2'-deoxy modified adenosine 5'-phosphate, 2'-deoxy modified guanosine 5'-phosphate, 2'-deoxy modified cytidine 5'-phosphate and 2 ' -An antibody against deoxyribonucleotides having a modified nucleobase selected from the group consisting of deoxy-modified thymidine 5'-phosphate, and 3) against two or more deoxyribonucleotides comprising the above deoxyribonucleotides having a modified nucleobase Body, and the like.
  • an antibody against a modified nucleobase when the target nucleic acid is RNA for example, 1 ′
  • an antibody against a nucleoside having a modified nucleobase selected from the group consisting of modified adenosine, modified guanosine, modified cytidine and modified uridine e.g., 1 ′
  • an antibody against a ribonucleotide having a modified nucleobase selected from the group consisting of modified adenosine 5'-phosphate, modified guanosine 5'-phosphate, modified cytidine 5'-phosphate and modified uridine 5'-phosphate e.g., 3'
  • An antibody against two or more ribonucleotides including the ribonucleotide having a modified nucleobase can be mentioned.
  • An antibody against a modified nucleobase includes, for example, a modified nucleobase, a nucleoside having a modified nucleobase, a nucleotide having a modified nucleobase, or two or more nucleotides including a nucleotide having a modified nucleobase, and a carrier protein (eg, BSA, KLH). ) And a complex prepared using an antigen as an antigen.
  • a complex prepared using an antigen as an antigen may be used in the method of the present invention.
  • an antibody against a modified nucleobase prepared as described below may be used.
  • a polyclonal antibody against a modified nucleobase is used about 2 to 4 times every 2 to 3 weeks subcutaneously or intraperitoneally in an animal together with a commercially available adjuvant (eg, complete or incomplete Freund's adjuvant) using the above complex as an antigen. It is obtained by collecting whole blood about 3 to about 10 days after the final immunization and purifying the antiserum.
  • adjuvant eg, complete or incomplete Freund's adjuvant
  • animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, cows, guinea pigs, and hamsters.
  • a monoclonal antibody against the modified nucleobase can be produced, for example, by a cell fusion method.
  • the above complex is administered to a mouse subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times together with a commercially available adjuvant, and the spleen or lymph node is collected about 3 days after the final administration, and white blood cells are collected.
  • the leukocytes and myeloma cells eg, NS-1) are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the factor.
  • Examples of cell fusion include a PEG method and a voltage pulse method.
  • a hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody can be cultured in vitro or in vivo, such as mouse or rat, preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively.
  • the monoclonal antibody may be any isotype such as IgG, IgM, IgA, and IgE.
  • monoclonal antibody production methods include phage display (Ulman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1184-89 (1993)), ADLib system (International Publication No. 2004 / Since in vitro methods such as No. 016444) are also known, such methods may be used for the production of antibodies against modified nucleobases.
  • the antibody against the modified nucleobase may be used by being immobilized on a solid phase.
  • the solid phase include particles (eg, magnetic particles), membranes (eg, nitrocellulose membrane), supports such as glass, plastic and metal, containers such as plates (eg, multiwell plates), and devices. It is done.
  • the antibody may also be provided in a form impregnated in a medium such as filter paper.
  • the antibody against the modified nucleobase may be labeled with a labeling substance.
  • the labeling substance examples include enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase), affinity substances (eg, streptavidin, biotin), fluorescent substances or proteins (eg, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green) Fluorescent proteins, red fluorescent proteins), luminescent substances (eg, luciferin, aequorin), radioactive substances (eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I).
  • enzymes eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase
  • affinity substances eg, streptavidin, biotin
  • fluorescent substances or proteins eg, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green Fluorescent proteins, red fluorescent proteins), luminescent substances (eg, luci
  • the measurement of the modified nucleobase using an antibody against the absorbent polynucleotide and the modified nucleobase is performed qualitatively or quantitatively, and the presence or amount of the modified nucleobase can be evaluated.
  • the measurement of the modified nucleobase is intended not only to measure the modified nucleobase itself but also to measure the target nucleic acid containing the modified nucleobase.
  • the measurement of the modified nucleobase using the antibody against the absorbent polynucleotide and the modified nucleobase can be achieved by allowing the antibody against the absorbent polynucleotide and the modified nucleobase to coexist in the solution obtained in (1) above. it can.
  • the concentration of the absorbent polynucleotide in the solution is not particularly limited as long as suppression of the background value and / or improvement of the S / N ratio is recognized in the present invention, but for example, 0.1 nM or more, preferably 1 nM or more, more preferably May be 2 nM or more, even more preferably 10 nM or more, particularly preferably 50 nM or more.
  • the concentration of the capture probe in the solution may also be 1 M or less, 100 mM or less, 10 mM or less, 1 mM or less, 100 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, for example.
  • an absorbent polynucleotide may be added to the solution so that such a concentration is achieved.
  • the determination of the presence or absence of a modified nucleobase may be performed as follows: (2-1) In the solution obtained in the above step (1), assay using an antibody against the absorbent polynucleotide and the modified nucleobase and measure the signal value; (2-2) Measuring a background value by assaying using an absorbent polynucleotide and an antibody against the modified nucleobase in a solution containing no target nucleic acid containing the modified nucleobase and containing the capture probe. And (2-3) evaluating the presence or absence of modified nucleobases by comparing signal values with background values.
  • the signal value and the background value are values measured using a label bound to an antibody against the modified nucleobase or a secondary antibody (when a secondary antibody is used) (eg, absorbance, Fluorescence, color development, and radioactivity).
  • the measurement of the amount of the modified nucleobase may be performed together with the measurement of the background value, for example. Specifically, it may be done by: (2-1 ′) In the solution obtained in the above step (1), assay using an antibody against the absorbent polynucleotide and the modified nucleobase, and measure the signal value; (2-2 ′) In a solution that does not contain a target nucleic acid containing a modified nucleobase and contains a capture probe, assay using an antibody against the absorbent polynucleotide and the modified nucleobase, and measure the background value. thing; (2-3 ′) correcting the signal value with the background value to obtain a corrected signal value; and (2-4 ′) evaluating the amount of modified nucleobase based on the corrected signal value.
  • the amount of modified nucleobase may be measured using a standard. Specifically, it may be done by: (2-1 ′′) measuring the signal value by assaying in the solution obtained in the above step (1) using an antibody against the absorbent polynucleotide and the modified nucleobase; (2-2 ′′) A target nucleic acid containing a modified nucleobase (standard) and a solution containing a capture probe, and assay using an antibody against the absorbent polynucleotide and the modified nucleobase to measure a calibration value And (2-3 ′′) assessing the amount of modified nucleobase by comparing the signal value to a calibration value.
  • the measurement using the standard may be used in combination with the measurement of the background value.
  • the methods of the invention may be performed by ELISA.
  • the method of the invention by ELISA may be performed as follows: (I) A nucleic acid sample containing a target nucleic acid containing a modified nucleobase and a capture probe labeled with a first affinity substance are incubated in a solution to form a hybrid composed of the target nucleic acid and the capture probe.
  • the first affinity substance and the second affinity substance are Used in combination with affinity (eg, combination of biotin and streptavidin).
  • affinity eg, combination of biotin and streptavidin.
  • (i ′) a nucleic acid sample containing a target nucleic acid containing a modified nucleobase and a capture probe fixed on a solid phase are added in a solution. Incubating to form a hybrid composed of the target nucleic acid and the capture probe. In this case, further comprising obtaining a capture probe immobilized on a solid phase (eg, adding a capture probe labeled with a first affinity substance to a solid phase treated with a second affinity substance). You may go out.
  • the method of the present invention may comprise washing the solid phase prior to step (iii).
  • the secondary antibody may be an antibody that recognizes only the primary antibody (eg, an antibody that binds to the constant region of the primary antibody), but both the primary antibody and the primary complex in the secondary complex. May be recognized.
  • the methods of the invention involving (i)-(v) can also be performed according to the methodology described in detail herein.
  • the present invention also provides a kit for measuring a modified nucleobase.
  • the kit of the present invention includes, for example: (I) a capture probe; (II) an absorbent polynucleotide; and (III) an antibody against the modified nucleobase.
  • the capture probe, absorbent polynucleotide, and antibody to the modified nucleobase are as described above.
  • the capture probe may be labeled with an affinity substance
  • the antibody against the modified nucleobase may be labeled with a labeling substance.
  • the kit of the present invention comprises an affinity substance, a labeling substance, a secondary antibody, a detection reagent for the secondary antibody (eg, a substrate for the enzyme when the secondary antibody is labeled with an enzyme), a solid phase, etc. It may further contain the components as described above.
  • the solid phase may be treated with an affinity substance.
  • the kit of the present invention may also contain a modified nucleobase preparation or a target nucleic acid preparation containing the modified nucleobase as a solution or as a powder.
  • the kit of the present invention includes each component in an isolated form or a mixed form.
  • each component may be provided in a form accommodated in a different container (eg, tube, plate).
  • a different container eg, tube, plate
  • an antibody against the absorbent polynucleotide and the modified nucleobase is: It may be provided in mixed form (eg, in the same solution).
  • the kit of the present invention may be provided in the form of a device. Specifically, all of the components may be provided in a form housed in the device. Alternatively, some of the components may be provided in a form housed in the device, and the rest may be provided in a form that is not housed in the device (eg, a form housed in a different container). In this case, components that are not contained in the device may be used by being injected into the device during measurement of the target substance.
  • Example 1 Use of Absorbent Polynucleotide in Measurement of Modified Nucleobase
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid is 5′-TTGCCGGGCGTC [C] GTCCTGTTGAACTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 1, [C] is 5-methylcytosine)
  • the nucleotide sequence of the capture probe for capturing the target nucleic acid was 5′-GAAGTCAACAGGACGGACGCCGCCAA-3 ′ (SEQ ID NO: 2), and those artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. were used.
  • the capture probe was designed such that when a hybrid with the target nucleic acid was formed, an unpaired portion was formed at the nucleobase [C] in the double-stranded structure portion.
  • the nucleotide sequence of the absorbent polynucleotide (DNA) containing cytosine is 5′-CCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 3, absorbent polynucleotide 1), which is artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. did.
  • the measurement of the modified nucleobase using the absorbent polynucleotide was performed as follows.
  • a target nucleic acid (1 pmol) containing 5-methylcytosine and a capture probe (5 pmol) were dissolved in 100 ⁇ L of hybridization buffer (4 ⁇ SSC, 0.3% Tween 20) (in a nucleic acid sample solution, The concentration was 10 nM and the concentration of the capture probe was 50 nM), and the reaction was performed at 60 ° C. for 2 hours to form a hybrid of the target nucleic acid and the capture probe.
  • a solution not containing the target nucleic acid was also prepared and the same operation was performed.
  • the hybridized solution was immobilized on the streptavidin plate by adding 100 ⁇ L of the solution after the hybridization reaction to a streptavidin-coated plate (Thermo Scientific) and allowing the mixture to react at 37 ° C. for 30 minutes. Wash twice with 300 ⁇ L PBS-T, and add 100 ⁇ L of 75 ng / mL anti-methylcytosine antibody (Nippon Gene, Clone 33D3) solution containing 0.2, 1, 5, or 25 pmol of Absorbent Polynucleotide 1 And reacted at 37 ° C. for 1 hour (in the solution, the concentration of the absorbent polynucleotide 1 is 2, 10, 50, or 250 nM, respectively).
  • Example 2 a test was performed in the same manner as in Example 1 except that a polynucleotide (DNA) containing no cytosine was used instead of the absorbent polynucleotide 1.
  • the sequence of the polynucleotide (DNA) not containing cytosine used is 5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 4, comparative substance 1), 5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 5, comparative substance 2), or 5′-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 6, comparative substance 3).
  • the results are shown in Table 4 and FIGS.
  • Example 2 a test was conducted in the same manner as in Example 1 except that deoxyribonucleotide triphosphate was used in place of the absorbent polynucleotide 1.
  • the deoxyribonucleotide triphosphate used was deoxycytidine triphosphate (dCTP) (Comparative Substance 4), deoxyadenosine triphosphate (dATP) (Comparative Substance 5), or deoxyguanosine triphosphate (dGTP) (Comparative Substance 6).
  • DCTP, dATP, or dGTP was added at 0.4, 2, 10, 50, or 250 pmol, respectively. The results are shown in Table 5 and FIGS.
  • absorbent polynucleotide 1 which is a polynucleotide containing cytosine (Table 5, FIGS. 4, 5). Moreover, the effect was not recognized by the nucleotide (Table 6, FIG. 6, 7).
  • absorbent polynucleotides eg, polynucleotides containing nucleotide residues containing unmodified nucleobases such as cytosine
  • S / N value the signal-to-noise ratio
  • Example 2 Examination of antibody clone difference 100 ng / mL anti-methylcytosine antibody (Millipore, Clone33D3), 100 ng / mL antimethylcytosine antibody instead of 50 ng / mL anti-methylcytosine antibody (Nippon Gene, Clone33D3)
  • 10 ng / mL anti-methylcytosine antibody manufactured by ZYMO RESEARCH, Clone 10G4
  • ZYMO RESEARCH Clone 162 33 D3
  • Example 3 Examination of length of absorbent polynucleotide containing cytosine In the same manner as in Example 1 except that 5 pmol of absorbent polynucleotide 2 to 11 was added instead of absorbent polynucleotide 1. .
  • the outline of the absorbent polynucleotides 2 to 11 is as shown in Table 8.
  • the measurement of modified nucleobase using an antibody against a modified nucleobase shows that the effect is particularly excellent by using a polynucleotide containing only 12 kinds of one unmodified nucleobase as an absorbent polynucleotide. It was.
  • Example 4 Examination of cytosine content in absorbent polynucleotide containing cytosine In the same manner as in Example 1, except that 5 pmol of absorbent polynucleotide 12-23 was added instead of absorbent polynucleotide 1. Tested.
  • the effect is particularly excellent by using a polynucleotide containing 12 or more unmodified nucleobases as the absorbent polynucleotide.
  • Example 5 Use of different capture probes in the measurement of modified nucleobases using absorbent polynucleotides
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5'-AATCAG [C] GGGAGCTCTTTTTTTGCGCGGGTCCCGTCCTGTTGAACTTC-3 '(SEQ ID NO: 29, [C] is 5-methylcytosine)
  • the nucleotide sequence of the capture probe for capturing the target nucleic acid is 5′-GAAGTCAACAGGACGGACGCCGCGCAA-3 ′ (SEQ ID NO: 2, 5 ′ end is labeled with biotin), and was artificially synthesized by Hokkaido System Science Each one was used.
  • the nucleotide sequence of the absorbent polynucleotide (DNA) containing cytosine is 5′-CCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 3, absorbent polynucleotide 1), and an artificially synthesized product by Hokkaido System Science Co., Ltd. was used. .
  • the capture probe was designed such that when a hybrid with the target nucleic acid was formed, the modified nucleobase [C] was present in the single stranded structure portion of the hybrid.
  • Measurement of modified nucleobases using absorbent polynucleotides was achieved using different target nucleic acids in different amounts (1 pmol, 0.1 pmol, or 0.01 pmol), using absorbent polynucleotide 1 at 5 pmol, and 50 ng. This was performed in the same manner as in Example 1 except that / mL anti-methylcytosine antibody (Nippon Gene, Clone33D3) was used.
  • Example 6 Use of different target nucleic acids and different capture probes in the measurement of modified nucleobases using absorbent polynucleotides (1)
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-G [C] GGAGCTCTCCCT [C] GGGA [C] GGTGGCAGCCCTGAGGTGCCTGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 30, [C] is 5-methylcytosine), for capturing the target nucleic acid
  • the nucleotide sequence of the capture probe was 5′-TGCAGGACCACTCGAGGCTGCCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 31, 5 ′ end was labeled with biotin), and those artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. were used.
  • the nucleotide sequence of the absorbent polynucleotide (DNA) containing cytosine is 5′-CCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 3, absorbent polynucleotide 1), and an artificially synthesized product by Hokkaido System Science Co., Ltd. was used. .
  • the capture probe was designed such that when a hybrid with the target nucleic acid was formed, the modified nucleobase [C] was present in the single stranded structure portion of the hybrid.
  • Measurement of modified nucleobases using absorbent polynucleotides can be achieved by using different target nucleic acids in different amounts (1 pmol, 0.1 pmol, or 0.01 pmol), using different capture probes, absorbent polynucleotide 1 It was carried out in the same manner as in Example 1 except that it was used at 25 pmol and 50 ng / mL anti-methylcytosine antibody (Nippon Gene, Clone 33D3) was used.
  • Example 7 Use of different target nucleic acids and different capture probes in the measurement of modified nucleobases using absorbent polynucleotides
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-G [C] GCAC [C] GTTTG [C] GACTTGGTGAGTGTCTGGGT [C] GCCT [C] GCCTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 32, [C] is 5-methylcytosine)
  • the nucleotide sequence of the capture probe for capturing the target nucleic acid is 5′-ACCCAGAACTACTACCAAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 33, 5 ′ end is labeled with biotin), and those artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd.
  • the nucleotide sequence of the absorbent polynucleotide (DNA) containing cytosine is 5′-CCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 3, absorbent polynucleotide 1), and an artificially synthesized product by Hokkaido System Science Co., Ltd. was used.
  • the capture probe was designed such that when a hybrid with the target nucleic acid was formed, the modified nucleobase [C] was present in the single stranded structure portion of the hybrid.
  • Measurement of modified nucleobases using absorbent polynucleotides can be achieved by using different target nucleic acids in different amounts (1 pmol, 0.1 pmol, or 0.01 pmol), using different capture probes, absorbent polynucleotide 1 It was carried out in the same manner as in Example 1 except that it was used at 25 pmol and 50 ng / mL anti-methylcytosine antibody (Nippon Gene, Clone 33D3) was used.
  • Example 8 Use of different target nucleic acids and different capture probes in the measurement of modified nucleobases using absorbent polynucleotides (3)
  • the nucleotide sequence of the target nucleic acid (DNA) is 5′-GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTT [C] GT-3 ′ (SEQ ID NO: 34, [C] is 5-methylcytosine), and the nucleotide sequence of the capture probe for capturing the target nucleic acid is 5 ′ -CACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCAAAAAAAAAAA-3 '(SEQ ID NO: 35, 3' end is biotin-labeled), and those artificially synthesized by Hokkaido System Science Co., Ltd. were used.
  • the nucleotide sequence of the absorbent polynucleotide (DNA) containing cytosine was 5′-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 9, absorbent polynucleotide 4), which was artificially synthesized by Hokkaido System Science.
  • the capture probe was designed such that when a hybrid with the target nucleic acid was formed, the modified nucleobase [C] was present in the single stranded structure portion of the hybrid.
  • Measurement of modified nucleobases using absorbent polynucleotides can be achieved using different target nucleic acids in different amounts (1 pmol, 0.1 pmol, or 0.01 pmol), using different capture probes, absorbent polynucleotide 4 It was carried out in the same manner as in Example 1 except that it was used at 25 pmol and 50 ng / mL anti-methylcytosine antibody (Nippon Gene, Clone 33D3) was used.
  • the present invention relating to the measurement of modified nucleobases using absorbent polynucleotides reduces the background value regardless of the type of target nucleic acid and capture probe, and It was shown to be useful for improving the S / N value.
  • the method and kit of the present invention are useful for measuring modified nucleobases.

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Abstract

　本発明は、修飾核酸塩基を検出するイムノアッセイ系の構築のために、検出シグナルのバックグラウンド値を抑制する技術を提供することを目的とする。具体的には、本発明は、核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすること、ならびに得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定することを含む、修飾核酸塩基の測定方法を提供する。本発明はまた、捕捉プローブ、吸収剤ポリヌクレオチド、および修飾核酸塩基に対する抗体を含む、修飾核酸塩基の測定用キットを提供する。

Description

吸収剤ポリヌクレオチドを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびそのキット
　本発明は、修飾核酸塩基の測定方法およびキットに関する。
　核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の検出において、ビオチン等の物質が人工的に導入された核酸塩基を、抗体を利用したイムノアッセイで検出する技術が、これまでに多数報告されている。また、天然に存在する修飾核酸塩基（例、メチルシトシン、ヒドロキシルメチルシトシン）をイムノアッセイで検出する技術も報告されている（特許文献１、及び非特許文献１、２）。
特開２０１２－２３００１９号公報
Ｐｒｏｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１３，３７－４２（２００６） Ｋｕｒｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　２０１２，８４，７５３３－７５３８
　本発明者らは、上記のような修飾核酸塩基を検出するイムノアッセイ系を構築するにあたり、修飾核酸塩基に対する抗体の核酸（例、修飾核酸塩基を含む標的核酸中の修飾核酸塩基以外の部分および／または捕捉プローブ）に対する非特異的な結合により、検出シグナルのバックグラウンド値が高くなるという課題が存在することを見出した。したがって、高感度のイムノアッセイ系の構築のためには、バックグラウンド値を抑制する技術の開発が必要であった。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、修飾核酸塩基に対する抗体を用いる、標的核酸中の修飾核酸塩基の測定において、吸収剤ポリヌクレオチドを用いることによりバックグランド値を抑制することなどに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法：
（１）核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔２〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、〔１〕の方法：
（１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および捕捉プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；ならびに
（２’）該ハイブリッドを含む溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、前記抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
〔３〕標的核酸が、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕核酸サンプルを含有する溶液に捕捉プローブを添加して、核酸サンプルおよび捕捉プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕吸収剤ポリヌクレオチドがヌクレオチド残基を１２個以上含む、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕吸収剤ポリヌクレオチドがホモポリヌクレオチドである、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕吸収剤ポリヌクレオチドが、シトシンを含むヌクレオチド残基を含み、かつ修飾核酸塩基が修飾シトシンである、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕修飾シトシンがメチルシトシンである、〔８〕の方法。
〔１０〕ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、捕捉プローブが設計される、〔２〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、捕捉プローブが設計される、〔２〕～〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕吸収剤ポリヌクレオチドおよび前記抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、〔１〕～〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕以下を含む、修飾核酸塩基の測定用キット：
（Ｉ）捕捉プローブ；
（ＩＩ）吸収剤ポリヌクレオチド；および
（ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
　本発明の方法およびキットによれば、検出シグナルのバックグランド値の低減により、標的核酸中の修飾核酸塩基を高感度に測定できる。
図１は、本発明の方法による標的核酸中の修飾核酸塩基の測定概要の一例を示す図である。Ｒ－Ｎ：修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基；Ｎ：核酸塩基を有するヌクレオチド残基；Ｒ：核酸塩基が有する置換基。 図２は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（－）、捕捉プローブ（＋）、吸収剤ポリヌクレオチド（＋）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図３は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。Ｓ／Ｎにおいて、Ｓは、標的核酸（＋）、捕捉プローブ（＋）、吸収剤ポリヌクレオチド（＋）および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値を示し、Ｎは、標的核酸（－）、捕捉プローブ（＋）、および修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す。 図４は、バックグランド値の測定における、吸収剤ポリヌクレオチド１（ポリＣ）と、比較物質１（ポリＴ）、比較物質２（ポリＡ）および比較物質３（ポリＧ）との効果の比較を示す図である。 図５は、Ｓ／Ｎ値の測定における、吸収剤ポリヌクレオチド１（ポリＣ）と、比較物質１（ポリＴ）、比較物質２（ポリＡ）および比較物質３（ポリＧ）との効果の比較を示す図である。 図６は、バックグランド値の測定における、比較物質４（ｄＣＴＰ）、比較物質５（ｄＡＴＰ）および比較物質６（ｄＧＴＰ）の効果の比較を示す図である。 図７は、Ｓ／Ｎ値の測定における、比較物質４（ｄＣＴＰ）、比較物質５（ｄＡＴＰ）および比較物質６（ｄＧＴＰ）の効果の比較を示す図である。 図８は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（－）、捕捉プローブ（＋）、吸収剤ポリヌクレオチド（－または＋）および修飾核酸塩基に対する各種抗体（＋）の条件下での測定において計測されたバックグランド値を示す図である。用いた抗体クローンは、次のとおりである。Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３－Ｎ：抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製）；Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３－Ｍ：抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）；Ｃｌｏｎｅ１６２　３３　Ｄ３：抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）；Ｃｌｏｎｅ１０Ｇ４：抗メチルシトシン抗体（ＺＹＭＯ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）。 図９は、バックグランド値の抑制に対する吸収剤ポリヌクレオチド（１種のヌクレオチド残基から構成される）の長さの効果を示す図である。 図１０は、Ｓ／Ｎ値の向上に対する吸収剤ポリヌクレオチド（１種のヌクレオチド残基から構成される）の長さの効果を示す図である。 図１１は、バックグランド値の抑制およびＳ／Ｎ値の向上に対する、吸収剤ポリヌクレオチドのヌクレオチド組成の効果を示す図である。表の下の番号は、吸収剤ポリヌクレオチドの番号を示す。 図１２は、バックグランド値の抑制およびＳ／Ｎ値の向上に対する、吸収剤ポリヌクレオチドのヌクレオチド組成の効果を示す図である。表の下の番号は、吸収剤ポリヌクレオチドの番号を示す。 図１３は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（－）、捕捉プローブ（＋）、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図１４は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた捕捉プローブ、吸収剤ポリヌクレオチドおよび抗体は、図１３と同様である。 図１５は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（－）、捕捉プローブ（＋）、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図１６は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた捕捉プローブ、吸収剤ポリヌクレオチドおよび抗体は、図１５と同様である。 図１７は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（－）、捕捉プローブ（＋）、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図１８は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた捕捉プローブ、吸収剤ポリヌクレオチドおよび抗体は、図１７と同様である。 図１９は、修飾核酸塩基を含む標的核酸（－）、捕捉プローブ（＋）、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体（＋）の条件下での測定において計測されたシグナル値（バックグランド値）を示す図である。 図２０は、核酸プローブを用いた各濃度の修飾核酸塩基の測定において算出されたシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を示す図である。用いた捕捉プローブ、吸収剤ポリヌクレオチドおよび抗体は、図１９と同様である。
　本発明は、修飾核酸塩基の測定方法を提供する。本発明の方法は、以下を含む：
（１）核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
（２）（１）で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
　核酸サンプルは、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有するサンプル、または当該標的核酸を含有すると疑われるサンプルである。核酸サンプルはまた、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられる。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよい。生物学的サンプルはさらに、疾患（例、癌、白血病）に罹患している哺乳動物、または疾患に罹患している可能性がある哺乳動物に由来するものであってもよい。環境サンプルとしては、例えば、核酸を含有する可能性がある土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。このようなサンプルは、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、核酸（例、ゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ、ＲＮＡ）の抽出および断片化（例、制限酵素等の酵素による処理）が挙げられる。したがって、本発明の方法は、核酸サンプルから核酸を抽出すること、および／または核酸を断片化することをさらに含んでいてもよい。本発明の方法はまた、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、攪拌等によりサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。
　標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであるが、ＤＮＡが好ましい。標的核酸はまた、ＤＮＡのコーディング領域または非コーディング領域（例、転写調節領域）である。標的核酸を構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、標的核酸の長さ）は、捕捉プローブとハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。標的核酸を構成するヌクレオチドの個数はまた、特に限定されず、例えば、ゲノムＤＮＡの断片化処理によって生ずる可能性のある任意の個数であってもよい。例えば、標的核酸を構成するヌクレオチドの個数は、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個または１００個以下であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。標的核酸が含む修飾核酸塩基の数は、１個以上（例、１～１００個、１～２０個、１～１０個または１～５個）であれば特に限定されない。
　本発明において、修飾核酸塩基とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より選ばれる通常の核酸塩基に対して修飾された構造を有する核酸塩基をいう。例えば、表現「修飾核酸塩基」中の用語「核酸塩基」としては、標的核酸がＤＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合には、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。核酸塩基は、好ましくはシトシン（Ｃ）である。修飾としては、例えば、通常の核酸塩基への置換基の導入、通常の核酸塩基が有する基（例、アミノ基、オキソ基、メチル基）の脱離、通常の核酸塩基が有する基の置換基への交換が挙げられる。置換基としては、天然に存在する核酸塩基が保有し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ　Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ　Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ　Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　２，Ｔａｂｌｅ　２：Ｌｉｓｔ　ｏｆ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチド中の修飾核酸塩基が保有する置換基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、日本特許庁により公開されている「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（平成１４年７月）または（平成２１年１２月）」の附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。置換基は、好ましくは、メチル、ヒドロキシメチル、カルボキシルであり、より好ましくは、メチル、ヒドロキシメチルである。置換等の修飾の位置は、特に限定されないが、ピリミジン環を有する核酸塩基（Ｃ、ＴまたはＵ）の場合には、例えば、２位、４～６位であり、好ましくは５位であり、プリン環を有する核酸塩基（ＡまたはＧ）の場合には、例えば、２位、６位、８位である。
　修飾核酸塩基は、天然に存在し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ　Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ　Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ　Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　２，Ｔａｂｌｅ　２：Ｌｉｓｔ　ｏｆ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドが保有する修飾核酸塩基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、上記ガイドラインの附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５－メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５－ヒドロキシメチルシトシン）、カルボキシルシトシン（例、５－カルボキシルシトシン）である。より好ましくは、修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例、５－メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５－ヒドロキシメチルシトシン）である。修飾核酸塩基は、核酸の機能の変化をもたらすこと（例、所定の遺伝子の転写調節能の変化）が知られている。
　捕捉プローブは、標的核酸とハイブリダイズし得る核酸分子である。捕捉プローブは、標的核酸に対して同種および／または異種の核酸から構成される。ここで、用語「同種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と同じ主鎖構造を、主鎖構造の全体として捕捉プローブが有することを意味する。一方、用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部または全体として捕捉プローブが有することを意味する。したがって、捕捉プローブの種類は、標的核酸の種類に応じて決定される。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ＤＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、同種核酸の捕捉プローブとしては、当該天然ＲＮＡと同種のＲＮＡから構成されるノーマルＲＮＡプローブを用いることができ、異種核酸の捕捉プローブとしては、ノーマルＲＮＡプローブ以外の核酸プローブを用いることができる。
　捕捉プローブとしては、例えば、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ、架橋型核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、およびこのような２以上の核酸プローブが連結および／または混合したキメラ型核酸プローブ（キメラ型核酸プローブは、必然的に、標的核酸に対して異種の核酸を含む）が挙げられる。ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’位にヒドロキシル基を有する天然リボヌクレオチドから構成されるノーマルＲＮＡプローブ、および２’位のヒドロキシル基が修飾されているリボヌクレオチドから構成される修飾ＲＮＡプローブが挙げられる。修飾ＲＮＡプローブとしては、リボヌクレアーゼ耐性のＲＮＡプローブを用いてもよい。修飾ＲＮＡプローブとしては、例えば、２’－Ｏ－アルキル化ＲＮＡプローブが挙げられる。２’－Ｏ－アルキル化ＲＮＡプローブは、好ましくは、２’－Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブである。Ｃ１～Ｃ６アルキル化のＣ１～Ｃ６アルキル基は、直鎖、分岐鎖または環状の炭素原子数１～６個のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル基（例、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル）、ブチル基（例、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル）、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。製造・入手の容易性等の観点から、２’－Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル化ＲＮＡプローブは、好ましくは２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡプローブである。
　捕捉プローブを構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、捕捉プローブの長さ）は、標的核酸とのハイブリダイゼーションに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。捕捉プローブを構成するヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下または３０個以下であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。標的核酸のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。このような捕捉プローブは、例えば、当該分野で公知のプローブ合成法により調製できる。
　捕捉プローブは、遊離の形態または固相（後述）へ固定された形態で用いられる。したがって、捕捉プローブは、固相への固定を可能にする物質または基で標識されていてもよい。標識は、例えば５’末端または３’末端の一方にて行われる。固相への固定を可能にする基または物質としては、例えば、共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質、および親和性物質が挙げられる。共有結合的な固相への結合を可能にする基または物質としては、例えば、チオール基またはチオール基を有する物質（捕捉プローブに導入されたこのようなチオール基は、固相上のマレイミド基と結合できる）、アミノ基またはアミノ基を有する物質（捕捉プローブに導入されたこのようなアミノ基は、固相上の無水マレイン酸と結合できる）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。この場合、固相としては、捕捉プローブが有する親和性物質と親和性を有する別の親和性物質でコーティングされたものを用いることができる。
　工程（１）において、インキュベートは、核酸サンプル中に標的核酸が含まれる場合に捕捉プローブ（遊離、または後述する固相に固定）と核酸サンプル中の標的核酸とのハイブリダイゼーション反応が可能である条件下で適切な溶液中で行われる。このような溶液としては、例えば、塩（例、クエン酸ナトリウム）およびその他の成分（例、界面活性剤）を含む緩衝液を用いることができる。ハイブリダイゼーション温度は、例えば１５～９５℃（好ましくは２５～６５℃）である。なお、上記インキュベートは、吸収剤ポリヌクレオチド（遊離、または後述する固相に固定）の不在下または存在下で行われてもよい。換言すれば、上記インキュベートに付される溶液は、核酸サンプルおよび捕捉プローブに加えて、後述する吸収剤ポリヌクレオチドを含有していてもよく、含有していなくてもよい。吸収剤ポリヌクレオチドは標的核酸および捕捉プローブとハイブリダイズしないためである。したがって、上記インキュベートに付される溶液が核酸サンプル、捕捉プローブおよび吸収剤ポリヌクレオチドを含有する場合、溶液への核酸サンプル、捕捉プローブおよび吸収剤ポリヌクレオチドの添加の順番は当然のことながら特に限定されない。インキュベートに付される溶液が吸収剤ポリヌクレオチドを含有していない場合、吸収剤ポリヌクレオチドは、インキュベーション後に溶液中に添加される。吸収剤ポリヌクレオチドの溶液への添加は、修飾核酸塩基に対する抗体の溶液の添加よりも前もしくは後に行われてもよく、またはそれと同時に行われてもよい。
　核酸サンプルが標的核酸を含まない場合、核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートしても、ハイブリッドは形成されない。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に修飾核酸塩基が存在しないことを判定できる。
　核酸サンプルが修飾核酸塩基を含まない標的核酸（換言すれば、非修飾核酸塩基のみを含む標的核酸）を含有する場合、核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含まない標的核酸および捕捉プローブが反応して、当該標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基を検出することはできないが、核酸サンプル中に（標的核酸が存在するにもかかわらず）修飾核酸塩基が存在しないこと、換言すれば、標的核酸中の所定の核酸塩基が修飾されていないことを判定できる。
　核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすることにより、修飾核酸塩基を含む標的核酸および捕捉プローブが反応して、当該標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドが形成される。この場合、後述する工程（２）において、修飾核酸塩基が存在することを判定でき、また修飾核酸塩基を定量することもできる。
　本発明において、ハイブリッドは、ハイブリダイゼーションにより形成される標的核酸および捕捉プローブの二本鎖構造を有するハイブリダイゼーション複合体である。ハイブリッドの構造の例は、以下の表１に記載されるとおりである。二本鎖構造は、（ａ）に示されるように、標的核酸および捕捉プローブの全体領域で形成されていてもよい。二本鎖構造はまた、（ｂ）～（ｉ）に示されるように、標的核酸または捕捉プローブの一部領域で形成されていてもよい。例えば、ハイブリッドは、二本鎖構造に加えて、５’末端領域または３’末端領域のいずれかに標的核酸の一本鎖構造を有していてもよく〔例、（ｂ）～（ｅ）〕、また、５’末端領域および３’末端領域の双方に標的核酸の一本鎖構造を有していてもよい〔例、（ｉ）〕。ハイブリッドはまた、二本鎖構造に加えて、５’末端領域または３’末端領域のいずれかに捕捉プローブの一本鎖構造を有していてもよく〔例、（ｂ）、（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）〕、また、５’末端領域および３’末端領域の双方に標的核酸の一本鎖構造を有していてもよい〔例、（ｈ）〕。一本鎖構造は、ハイブリッドを形成した標的核酸または捕捉プローブのいずれか一方または双方が５’末端および／または３’末端において、１個以上のヌクレオチド残基の非ハイブリダイズ領域を有することにより形成される構造である。なお、（ａ）～（ｉ）では、標的核酸の５’末端領域および３’末端領域ならびに捕捉プローブの５’末端領域および３’末端領域のうちの少なくとも二つの末端領域がハイブリダイズしている構造を提示した。しかし、ハイブリッドでは、このような二つの末端領域もまた必ずしもハイブリダイズする必要はなく、標的核酸の３’末端領域および捕捉プローブの５’末端領域の双方で一本鎖構造部分（即ち、非ハイブリダイズ領域）を有していてもよく、かつ、標的核酸の５’末端領域および捕捉プローブの３’末端領域の双方で一本鎖構造部分を有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ハイブリッドにおいて、二本鎖構造部分に対応する標的核酸および捕捉プローブのヌクレオチド残基の個数（即ち、二本鎖構造部分の長さ）は、標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１０個以上、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。二本鎖構造部分に対応する標的核酸および捕捉プローブのヌクレオチド残基の個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下または３０個以下であってもよい。二本鎖構造部分中のＧＣ含有率は、特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、または６０％以上であってもよい。二本鎖構造部分中のＧＣ含有率はまた、例えば、９０％以下、８０％以下、または７０％以下であってもよい。
　ハイブリッドにおいて、その５’末端領域または３’末端領域の一本鎖構造部分に対応する標的核酸および捕捉プローブのヌクレオチド残基の個数（即ち、各一本鎖構造部分の長さ）は、１個以上であれば特に限定されないが、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、または５０個以上である。このような個数はまた、特に限定されないが、例えば、１００００個以下、５０００個以下、２０００個以下、１０００個以下、５００個以下、２００個以下または１００個以下であってもよい。捕捉プローブは、このような一本鎖構造部分をハイブリッドにおいて５’末端領域または３’末端領域に形成するように設計されてもよい。
　一実施形態では、捕捉プローブは、ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように設計されてもよい。修飾核酸塩基の不対部分は、抗体による修飾核酸塩基の検出を容易にするために導入され得る。このような不対部分の形成のためには、例えば、二本鎖構造部分において、標的核酸に対して完全には相補的ではないヌクレオチド配列を有する捕捉プローブを使用すればよい。
　ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成される捕捉プローブの一例は、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に対して相補的なヌクレオチド残基を欠落する捕捉プローブである〔例、表２の（Ｉ）〕。このような捕捉プローブは、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に相補的な１個のヌクレオチド残基のみを欠落するものでもよいが〔例、表２の（Ｉ－１）〕、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基を含む２個以上（例えば、２～２０個、２～１０個または２～５個）の隣接ヌクレオチド残基を欠落するものであってもよい〔例、表２の（Ｉ－２）〕。修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の不対部分中の数は、上述したとおり１個以上であれば特に限定されない。なお、このような核酸プローブについては、例えば、特許文献１および非特許文献２を参照のこと。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成される捕捉プローブの別の例は、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に対して非相補的なヌクレオチド残基を有する捕捉プローブである〔例、表２の（Ｉ’）〕。このような捕捉プローブは、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基に非相補的な１個のヌクレオチド残基のみを有するものでもよいが〔例、表２の（Ｉ’－１）〕、標的核酸における修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基を含む２個以上（例えば、２～２０個、２～１０個または２～５個）の隣接ヌクレオチド残基が非相補的なものであってもよい〔例、表２の（Ｉ’－２）〕。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　別の実施形態では、捕捉プローブは、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように設計されてもよい。ハイブリッドの一本鎖構造部分（標的核酸）において、修飾核酸塩基は、５’末端側の一本鎖構造部分の非末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＩ）〕、５’末端側の一本鎖構造部分の末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＩＩ）〕、３’末端側の一本鎖構造部分の非末端部に存在していてもよく〔例、表４の（ＩＶ）〕、または３’末端側の一本鎖構造部分の末端部に存在していてもよく〔例、表４の（Ｖ）〕、あるいはこれらの２つ、３つまたは４つの組合せであってもよい。ハイブリッドの一本鎖構造部分（標的核酸）が修飾核酸塩基をこのような様式で含むように、捕捉プローブが設計されてもよい。修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の一本鎖構造部分中の数は、上述したとおり１個以上であれば特に限定されない。あるいは、捕捉プローブは、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在し、かつ、上述したように、ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分がさらに形成されるように設計されてもよい。測定すべき標的核酸中の修飾核酸塩基を有するヌクレオチド残基の位置が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明の方法は、核酸サンプルを含有する溶液に捕捉プローブを添加して、核酸サンプルおよび捕捉プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含んでいてもよい。捕捉プローブは、固体の形態、または溶液として、核酸サンプルに添加することができる。
　修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルから上述したインキュベーション用溶液が調製される場合、溶液中の標的核酸の濃度は、本発明の方法により検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の標的核酸の濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。核酸サンプル中の標的核酸の濃度は不明であることも多いので標的核酸の厳密な濃度の設定は難しい場合もあるが、核酸サンプルの種類によっては、核酸サンプルに含有され得る標的核酸の濃度を経験的にある程度予測できることがあり、また、標的核酸の濃度が判明していることもある（例えば、標的核酸のサイズおよび／または濃度が別途測定されているものの、標的核酸中の修飾核酸塩基の有無および標的核酸中の修飾核酸塩基の含有率が不明な場合）ので、そのような場合には、上記のとおり標的核酸の濃度設定を試みてもよい。
　溶液中の捕捉プローブの濃度は、本発明の方法により標的核酸が検出可能である限り特に限定されないが、例えば０．０１ｎＭ以上、好ましくは０．１ｎＭ以上、より好ましくは１ｎＭ以上、さらにより好ましくは５ｎＭ以上、特に好ましくは１０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下または１μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、捕捉プローブを溶液に添加してもよい。
　好ましい実施形態では、標的核酸は、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸であってもよい。ここで、標的核酸に含まれる可能性がある修飾核酸塩基の個数は、２以上である限り特に限定されないが、例えば、２～３０個、２～２０個、２～１０個または２～５個（例、２、３、４もしくは５個）である。標的核酸に含まれる修飾核酸塩基の個数が複数である場合、標的核酸と捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに用いられる溶液中の標的核酸が極めて低い濃度（例、０．１ｎＭ以上）であっても、修飾核酸を高感度に測定できることが確認されている。したがって、本発明の方法では、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸とハイブリダイズするように設計された捕捉プローブを用いることができる。測定すべき標的核酸中の修飾される可能性がある核酸塩基の個数が判明しているのであれば、このような設計が可能である。
　修飾核酸塩基は、ハイブリッドを含む溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて測定される。測定に際しては、工程（１）で得られた溶液をそのまま用いてもよいが、抗体による修飾核酸塩基の測定により適した溶液において測定を行うため、別の溶液の添加および／または溶液の別の溶液への交換を行ってもよい。このような交換は、例えば、工程（１）で得られた溶液を固相に添加して、溶液中に含有され得るハイブリッドを固相に固定化し、次いで固相から溶液を除去し、必要に応じて洗浄液で洗浄した後、別の溶液（例、吸収剤ポリヌクレオチドおよび／または修飾核酸塩基に対する抗体を含有する溶液）を添加することにより行うことができる。測定に用いられる溶液は、抗原・抗体反応に適切な溶液である限り特に限定されない。
　測定は、免疫学的手法により行うことができる。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。
　本発明において、吸収剤ポリヌクレオチドとは、本発明の測定対象である修飾核酸塩基を構成する核酸塩基（即ち、非修飾核酸塩基）を含むヌクレオチド残基（以下、このようなヌクレオチド残基を「有効ヌクレオチド残基」と呼ぶことがある）を含むポリヌクレオチドを意味する。換言すれば、本発明で用いられる抗体の標的である「修飾核酸塩基」は、有効ヌクレオチド残基に含まれる「核酸塩基」と修飾の有無の点で相違する。例えば、標的核酸がＤＮＡであり、かつ、修飾核酸塩基が修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシンまたは修飾チミンのとき、吸収剤ポリヌクレオチドは、それぞれ、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを含むヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドである。一方、標的核酸がＲＮＡであり、かつ、修飾核酸塩基が修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシンまたは修飾ウラシルのとき、吸収剤ポリヌクレオチドは、それぞれ、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドである。修飾核酸塩基としては修飾シトシンが好ましいことから、吸収剤ポリヌクレオチドは、好ましくは、シトシンを含むヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドである。
　吸収剤ポリヌクレオチドは、標的核酸に対して同種または異種の核酸から構成され得るが、好ましくは、標的核酸に対して同種の核酸から構成される。ここで、用語「同種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と同じ主鎖構造を吸収剤ポリヌクレオチドが有することを意味する。一方、用語「異種」とは、標的核酸の主鎖構造（糖部分およびリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を吸収剤ポリヌクレオチドが有することを意味する。したがって、吸収剤ポリヌクレオチドの種類は、標的核酸の種類に応じて決定されてもよい。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合、同種核酸の吸収剤ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）または異種核酸の吸収剤ポリヌクレオチド（ＲＮＡ）を用いることができるが、好ましくは、同種核酸の吸収剤ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）が用いられる。一方、標的核酸が天然ＲＮＡである場合、同種核酸の吸収剤ポリヌクレオチド（ＲＮＡ）または異種核酸の吸収剤ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を用いることができるが、好ましくは、同種核酸の吸収剤ポリヌクレオチド（ＲＮＡ）が用いられる。標的核酸としてはＤＮＡが好ましいことから、吸収剤ポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡである。また、修飾核酸塩基としては修飾シトシンが好ましいことから、吸収剤ポリヌクレオチドは、好ましくは、シトシンを含むヌクレオチド残基を含むＤＮＡである。
　吸収剤ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド残基の総数（即ち、吸収剤ポリヌクレオチドの長さ）は、例えば１２個以上、好ましくは１４個以上、１６個以上、１８個以上または２０個以上であってもよい。吸収剤ポリヌクレオチを構成するヌクレオチドの総数はまた、例えば１００個以下、８０個以下、７０個以下または６０個以下であってもよい。吸収剤ポリヌクレオチド中の有効ヌクレオチド残基の個数は、本発明においてバックグランド値の抑制および／またはＳ／Ｎ比の向上が認められる限り特に限定されないが、例えば１２個以上であり、好ましくは１４個以上、１６個以上または１８個以上であり、より好ましくは２０個以上であってもよい。吸収剤ポリヌクレオチド中の有効ヌクレオチド残基の個数はまた、例えば１００個以下、８０個以下、７０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下または３０個以下であってもよい。このような吸収剤ポリヌクレオチドは、例えば、当該分野で公知のヌクレオチド重合法により調製できる。
　吸収剤ポリヌクレオチドは、遊離の形態または固相（後述）へ固定された形態で用いられる。したがって、吸収剤ポリヌクレオチドは、固相への固定を可能にする物質または基で標識されていてもよい。標識は、例えば５’末端または３’末端の一方にて行われる。固相への固定を可能にする基または物質としては、捕捉プローブについて上述したような基または物質が挙げられる。
　一実施形態では、吸収剤ポリヌクレオチドは、ホモポリヌクレオチドである。ホモポリヌクレオチドとは、同種のヌクレオチド残基のみから構成されるポリヌクレオチドをいう。例えば、標的核酸がＤＮＡであり、かつ、修飾核酸塩基が修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシンまたは修飾チミンのとき、ホモポリヌクレオチドは、それぞれ、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを含むヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡである。一方、標的核酸がＲＮＡであり、かつ、修飾核酸塩基が修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシンまたは修飾ウラシルのとき、吸収剤ポリヌクレオチドは、それぞれ、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチド残基のみから構成されるＲＮＡである。吸収剤ポリヌクレオチドは、好ましくは、シトシンを含むヌクレオチド残基のみから構成されるポリヌクレオチドであり、より好ましくは、シトシンを含むヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡである。
　別の実施形態では、吸収剤ポリヌクレオチドは、ヘテロポリヌクレオチドである。ヘテロポリヌクレオチドとは、２以上の異種のヌクレオチド残基から構成されるポリヌクレオチドをいう。例えば、標的核酸がＤＮＡであり、かつ、修飾核酸塩基が修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシンまたは修飾チミンのとき、吸収剤ポリヌクレオチドは、それぞれ、有効ヌクレオチド残基およびそれ以外の１以上のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドである。一方、標的核酸がＲＮＡであり、かつ、修飾核酸塩基が修飾アデニン、修飾グアニン、修飾シトシンまたは修飾ウラシルのとき、吸収剤ポリヌクレオチドは、それぞれ、有効ヌクレオチド残基およびそれ以外の１以上のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドである。修飾核酸塩基としては修飾シトシンが好ましいことから、吸収剤ポリヌクレオチドは、好ましくは、シトシンを含むヌクレオチド残基（有効ヌクレオチド残基）およびそれ以外の１以上のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドであり、より好ましくは、シトシンを含むヌクレオチド残基（有効ヌクレオチド残基）およびそれ以外の１以上のヌクレオチド残基を含むＤＮＡである。吸収剤ポリヌクレオチドがヘテロポリヌクレオチドである場合、吸収剤ポリヌクレオチド中の有効ヌクレオチド残基の含有率は、本発明においてバックグランド値の抑制および／またはＳ／Ｎ比の向上が認められる限り特に限定されないが、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上であってもよい。
　修飾核酸塩基に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。修飾核酸塩基に対する抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖが挙げられる。修飾核酸塩基に対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。修飾核酸塩基に対する抗体はさらに、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイにおいて１次抗体として用いられるものであってもよく、この場合、２次抗体が併用される。
　修飾核酸塩基に対する抗体は、修飾核酸塩基、修飾核酸塩基を有するヌクレオシド（修飾核酸塩基および２’－デオキシリボースもしくはリボースから構成される構造単位）、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチド（修飾核酸塩基、２’－デオキシリボースもしくはリボースおよびホスフェートから構成される構造単位）、あるいは修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを含む２以上のヌクレオチド（例、２～５個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド）に対する親和性を有していればよい。例えば、標的核酸がＤＮＡの場合における修飾核酸塩基に対する抗体としては、１）２’－デオキシ修飾アデノシン、２’－デオキシ修飾グアノシン、２’－デオキシ修飾シチジンおよび２’－デオキシ修飾チミジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオシドに対する抗体、２）２’－デオキシ修飾アデノシン　５’－ホスフェート、２’－デオキシ修飾グアノシン　５’－ホスフェート、２’－デオキシ修飾シチジン　５’－ホスフェートおよび２’－デオキシ修飾チミジン　５’－ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するデオキシリボヌクレオチドに対する抗体、ならびに３）修飾核酸塩基を有する上記デオキシリボヌクレオチドを含む２以上のデオキシリボヌクレオチドに対する抗体が挙げられる。一方、標的核酸がＲＮＡの場合における修飾核酸塩基に対する抗体としては、例えば、１’）修飾アデノシン、修飾グアノシン、修飾シチジンおよび修飾ウリジンからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドに対する抗体、２’）修飾アデノシン　５’－ホスフェート、修飾グアノシン　５’－ホスフェート、修飾シチジン　５’－ホスフェートおよび修飾ウリジン　５’－ホスフェートからなる群より選ばれる、修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチドに対する抗体、ならびに３’）修飾核酸塩基を有する上記リボヌクレオチドを含む２以上のリボヌクレオチドに対する抗体が挙げられる。
　修飾核酸塩基に対する抗体は、例えば、修飾核酸塩基、修飾核酸塩基を有するヌクレオシド、修飾核酸塩基を有するヌクレオチド、または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを含む２以上のヌクレオチドと、キャリアタンパク質（例、ＢＳＡ、ＫＬＨ）との複合体を、抗原として用いて調製されたものを用いることができる。例えば、このような複合体を用いて調製された修飾核酸塩基に対する種々の抗体が市販されているので、本発明の方法では、市販抗体を用いてもよい。本発明の方法では、修飾核酸塩基に対する抗体はまた、例えば、下記のとおり調製されたものを用いてもよい。
　例えば、修飾核酸塩基に対するポリクローナル抗体は、上記複合体を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２～３週間おきに２～４回程度投与し、最終免疫から約３～約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
　修飾核酸塩基に対するモノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、上記複合体を市販のアジュバントと共にマウスに２～４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ－１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよい。あるいは、モノクローナル抗体の作製方法としては、ファージディスプレイ法（Ｕｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，１１８４－８９（１９９３））、ＡＤＬｉｂシステム（国際公開第２００４／０１１６４４号）等のｉｎ　ｖｉｔｒｏ法も知られているので、修飾核酸塩基に対する抗体の作製のため、このような方法を使用してもよい。
　修飾核酸塩基に対する抗体は、固相に固定化されて用いられてもよい。固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチックおよび金属等の支持体、プレート（例、マルチウェルプレート）等の容器、ならびにデバイスが挙げられる。抗体はまた、濾紙等の媒体に含浸された形態で提供されてもよい。修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法で２次抗体が用いられる場合、２次抗体は、このような標識物質で標識されていてもよい。
　吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定は、定性的または定量的に行われ、修飾核酸塩基の有無または量を評価することができる。なお、本発明において、修飾核酸塩基の測定とは、修飾核酸塩基自体の測定のみならず、修飾核酸塩基を含む標的核酸の測定もまた意図される。
　吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定は、上記（１）で得られた溶液中に、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を共存させることにより達成することができる。溶液中の吸収剤ポリヌクレオチドの濃度は、本発明においてバックグランド値の抑制および／またはＳ／Ｎ比の向上が認められる限り特に限定されないが、例えば０．１ｎＭ以上、好ましくは１ｎＭ以上、より好ましくは２ｎＭ以上、さらにより好ましくは１０ｎＭ以上、特に好ましくは５０ｎＭ以上であってもよい。溶液中の捕捉プローブの濃度はまた、例えば１Ｍ以下、１００ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下であってもよい。したがって、このような濃度が達成されるように、吸収剤ポリヌクレオチドを溶液に添加してもよい。
　例えば、修飾核酸塩基の有無の測定は、以下により行われてもよい：
（２－１）上記工程（１）で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２－２）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブを含有する溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；および
（２－３）シグナル値をバックグランド値と比較して、修飾核酸塩基の有無を評価すること。
　修飾核酸塩基の測定において、シグナル値およびバックグランド値は、修飾核酸塩基に対する抗体または２次抗体（２次抗体が用いられる場合）に結合した標識を利用して計測される値（例、吸光度、蛍光度、発色度、および放射活性）である。
　また、修飾核酸塩基の量の測定は、例えば、バックグランド値の測定とともに行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２－１’）上記工程（１）で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２－２’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有せず、かつ捕捉プローブを含有する溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、バックグランド値を計測すること；
（２－３’）バックグランド値でシグナル値を補正して、補正シグナル値を得ること；ならびに
（２－４’）補正シグナル値に基づき、修飾核酸塩基の量を評価すること。
　あるいは、修飾核酸塩基の量の測定は、標品を用いて行われてもよい。具体的には、以下により行われてもよい：
（２－１’’）上記工程（１）で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、シグナル値を計測すること；
（２－２’’）修飾核酸塩基を含む標的核酸（標品）、かつ捕捉プローブを含有する溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体を用いてアッセイして、検量用値を計測すること；ならびに
（２－３’’）シグナル値を検量用値に照合して、修飾核酸塩基の量を評価すること。
　標品を用いる上記測定は、バックグランド値の上記測定と併用されてもよい。
　特定の実施形態では、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡにより行われてもよい。例えば、核酸サンプルが修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する場合、ＥＬＩＳＡによる本発明の方法は、以下により行われてもよい：
（ｉ）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプルおよび第１の親和性物質で標識された捕捉プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該捕捉プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；
（ｉｉ）ハイブリッドを、第２の親和性物質で処理された固相に固定すること；
（ｉｉｉ）修飾核酸塩基に対する１次抗体を、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下において、固相に固定されたハイブリッドと反応させて、１次抗体とハイブリッドとの１次複合体を得ること；
（ｉｖ）標識物質で標識された２次抗体を１次複合体と反応させて、２次抗体と１次抗体との２次複合体を得ること；ならびに
（ｖ）２次複合体中の２次抗体が有する標識物質を利用して、形成されたハイブリッド（換言すれば、修飾核酸塩基）の存在および／または量を測定すること
　第１の親和性物質および第２の親和性物質は、互いに親和性を有する組合せ（例、ビオチンとストレプトアビジンとの組合せ）で用いられる。なお、本発明の方法は、上記工程（ｉ）および（ｉｉ）の代わりに、（ｉ’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および固相に固定された捕捉プローブを溶液中でインキュベートして、当該標的核酸および当該捕捉プローブから構成されるハイブリッドを形成することを含んでいてもよい。この場合、固相に固定された捕捉プローブを得ること（例、第１の親和性物質で標識された捕捉プローブを、第２の親和性物質で処理された固相に加えること）をさらに含んでいてもよい。本発明の方法は、工程（ｉｉｉ）の前に、固相を洗浄することを含んでいてもよい。２次抗体は、１次抗体のみを認識する抗体（例、１次抗体の定常領域に結合する抗体）であってもよいが、２次複合体中の１次抗体および１次複合体の双方を認識するものであってもよい。（ｉ）～（ｖ）を含む本発明の方法はまた、本明細書中に詳細に記載された方法論にしたがって行うことができる。
　本発明はまた、修飾核酸塩基の測定用キットを提供する。本発明のキットは、例えば、以下を含む：
（Ｉ）捕捉プローブ；
（ＩＩ）吸収剤ポリヌクレオチド；および
（ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
　捕捉プローブ、吸収剤ポリヌクレオチド、および修飾核酸塩基に対する抗体は、上述したとおりである。例えば、捕捉プローブは、親和性物質で標識されていてもよく、修飾核酸塩基に対する抗体は、標識物質で標識されていてもよい。本発明のキットは、親和性物質、標識物質、２次抗体、２次抗体の検出試薬（例、２次抗体が酵素で標識されている場合には、その酵素の基質）および固相等の上述したような構成成分をさらに含んでいてもよい。固相は、親和性物質で処理されていてもよい。本発明のキットはまた、修飾核酸塩基の標品、または修飾核酸塩基を含む標的核酸の標品を、溶液としてまたは粉末として含んでいてもよい。
　本発明のキットは、互いに隔離された形態または混合された形態にて各構成成分を含む。例えば、本発明のキットでは、各構成成分が、それぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよいが、例えば、吸収剤ポリヌクレオチドおよび修飾核酸塩基に対する抗体は、混合された形態（例、同一溶液中）で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：修飾核酸塩基の測定における吸収剤ポリヌクレオチドの使用
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣ［Ｃ］ＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号１、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は５’－ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ－３’（配列番号２）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、二本鎖構造部分中の核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計した。また、シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は、５’－ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ－３’（配列番号３、吸収剤ポリヌクレオチド１）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
　吸収剤ポリヌクレオチドを用いた修飾核酸塩基の測定は、以下のとおり行った。まず、５－メチルシトシンを含む標的核酸（１ｐｍｏｌ）と捕捉プローブ（５ｐｍｏｌ）をハイブリダイゼーションＢｕｆｆｅｒ（４×ＳＳＣ、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中に溶解させた後（核酸サンプル溶液中、標的核酸の濃度は１０ｎＭであり、捕捉プローブの濃度は５０ｎＭである）、６０℃で２時間反応させることで、標的核酸と捕捉プローブのハイブリッドを形成させた。また、標的核酸を含まない溶液も調製し、同様の操作を行った。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を、ストレプトアビジンでコートされたプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に１００μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、ストレプトアビジンプレート上にハイブリッドを固定化した。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄し、０．２、１、５、または２５ｐｍｏｌの吸収剤ポリヌクレオチド１を含む７５ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３。）溶液を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた（溶液中、吸収剤ポリヌクレオチド１の濃度はそれぞれ２、１０、５０または２５０ｎＭである）。同時に吸収剤ポリヌクレオチド１を含まない７５ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）溶液でも同様の操作を行った。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、２５０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬずつ加え、３７℃で３０分反応させた。３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅを１００μＬずつ加え、遮光室温で１５分反応させた。その後、２Ｎ塩酸溶液を１００μＬずつ加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製Ａｒｖｏ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表４、図２、３に示す。
　また、吸収剤ポリヌクレオチド１の代わりに、シトシンを含まないポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で試験した。用いたシトシンを含まないポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の配列は、５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号４、比較物質１）、５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号５、比較物質２）、または５’－ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ－３’（配列番号６、比較物質３）である。結果を表４、図４、５に示す。
　さらに、吸収剤ポリヌクレオチド１の代わりに、デオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いた以外は、実施例１と同様の方法で試験した。用いたデオキシリボヌクレオチド三リン酸は、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）（比較物質４）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）（比較物質５）、またはデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）（比較物質６）である。また、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、またはｄＧＴＰはそれぞれ０．４、２、１０、５０、または２５０ｐｍｏｌで添加された。結果を表５、図６、７に示す。
　その結果、シトシンを含むポリヌクレオチドである吸収剤ポリヌクレオチド１以外では、効果が認められなかった（表５、図４、５）。また、ヌクレオチドでは効果が認められなかった（表６、図６、７）。このことは、修飾核酸塩基（例、修飾シトシン）に対する抗体を用いた修飾核酸塩基の測定において、吸収剤ポリヌクレオチド（例、シトシン等の非修飾核酸塩基を含むヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチド）が、検出シグナルのバックグランド値の抑制、およびシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ値）の向上に役立つことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上より、吸収剤ポリヌクレオチドを用いることで、修飾核酸塩基の高感度なイムノアッセイが可能であることが示された。
実施例２：抗体クローン差についての検討
　５０ｎｇ／ｍＬ抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）の代わりに、１００ｎｇ／ｍＬ抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）、１００ｎｇ／ｍＬ抗メチルシトシン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｃｌｏｎｅ１６２　３３　Ｄ３）、１０ｎｇ／ｍＬ抗メチルシトシン抗体（ＺＹＭＯ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製、Ｃｌｏｎｅ１０Ｇ４）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で試験した。
　その結果、異なる抗体クローンを用いた場合であっても、検出シグナルのバックグランド値の抑制効果があることが確認された（表７、図８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　以上より、本発明の効果は、特定の抗体クローンに限定されるものではないことが示された。
実施例３：シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチドの長さについての検討
　吸収剤ポリヌクレオチド１の代わりに、吸収剤ポリヌクレオチド２～１１を５ｐｍｏｌ添加した以外は、実施例１と同様の方法で試験した。吸収剤ポリヌクレオチド２～１１の概要は、表８に示したとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　その結果、シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチドの長さが１２個以上のとき、顕著な効果が得られることを確認した（表９、図９、１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　以上より、修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定では、１種の非修飾核酸塩基のみを１２個以上含むポリヌクレオチドを吸収剤ポリヌクレオチドとして用いることにより、効果が特に優れることが示された。
実施例４：シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチドにおけるシトシンの含有量についての検討
　吸収剤ポリヌクレオチド１の代わりに、吸収剤ポリヌクレオチド１２～２３を５ｐｍｏｌ添加した以外は、実施例１と同様の方法で試験した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　吸収剤ポリヌクレオチドがシトシンを１２個以上含むとき、顕著な効果が認められた（表１１、図１１）。また、長さが異なる吸収剤ポリヌクレオチドにおいてもシトシンを１２個以上含むときに効果が認められ、含有率ではなくシトシン数の重要性が確認された（表１２、図１２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　以上より、修飾核酸塩基に対する抗体を用いる修飾核酸塩基の測定では、非修飾核酸塩基を１２個以上含むポリヌクレオチドを吸収剤ポリヌクレオチドとして用いることにより、効果が特に優れることが示された。
実施例５：吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定における異なる捕捉プローブの使用
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＡＡＴＣＡＧ［Ｃ］ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＣ－３’（配列番号２９、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は５’－ＧＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ－３’（配列番号２、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。また、シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ－３’（配列番号３、吸収剤ポリヌクレオチド１）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
　吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、または０．０１ｐｍｏｌ）で用いたこと、吸収剤ポリヌクレオチド１を５ｐｍｏｌで用いたこと、および５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で行った。
　その結果、標的核酸と捕捉プローブとのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように、捕捉プローブを設計した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表１３、図１３、１４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　以上より、修飾核酸塩基を含む標的核酸を抗体で測定する場合、ハイブリッドの二本鎖構造部分中の修飾核酸塩基［Ｃ］で不対部分が形成されるように設計された捕捉プローブのみならず（実施例１）、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計された捕捉プローブ（実施例５）もまた、有効であることが示された。
実施例６：吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定における異なる標的核酸および異なる捕捉プローブの使用（１）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－Ｇ［Ｃ］ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴ［Ｃ］ＧＧＧＡ［Ｃ］ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡ－３’（配列番号３０、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は５’－ＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＣ－３’（配列番号３１、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。また、シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ－３’（配列番号３、吸収剤ポリヌクレオチド１）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
　吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、または０．０１ｐｍｏｌ）で用いたこと、異なる捕捉プローブを用いたこと、吸収剤ポリヌクレオチド１を２５ｐｍｏｌで用いたこと、および５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で行った。
　その結果、吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定において、実施例１および実施例５と異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表１３、図１５、１６）。また、標的核酸が複数の修飾核酸塩基を含む場合、標的核酸が０．０１ｐｍｏｌという非常に少ない量であっても（即ち、溶液中の標的核酸の濃度を０．１ｎＭにして捕捉プローブとハイブリダイズさせて、ハイブリッドを形成させたときでさえも）、Ｓ／Ｎ（吸収剤ポリヌクレオチド：－）に対するＳ／Ｎ（吸収剤ポリヌクレオチド：＋）の明確な改善が認められた。本実施例でこのような改善が認められた実験条件は、（標的核酸中の修飾核酸塩基の個数＝３、標的核酸の量＝０．０１ｐｍｏｌ）である。一方、実施例５で改善が認められた条件は、（標的核酸中の修飾核酸塩基の個数＝１、標的核酸の量＝１ｐｍｏｌ）である。つまり、修飾核酸塩基の個数の差異が３倍しかないにもかかわらず、標的核酸の量について１０２オーダーも検出感度を向上させた。以上のとおり、標的核酸が複数の修飾核酸塩基を含む場合、検出感度が増幅されていたことから、吸収剤ポリヌクレオチドの特に優れた効果が確認された（表１４、図１６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
実施例７：吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定における異なる標的核酸および異なる捕捉プローブの使用（２）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－Ｇ［Ｃ］ＧＣＡＣ［Ｃ］ＧＴＴＴＧ［Ｃ］ＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴ［Ｃ］ＧＣＣＴ［Ｃ］ＧＣＴＣＣ－３’（配列番号３２、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は５’－ＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣ－３’（配列番号３３、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。また、シトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ－３’（配列番号３、吸収剤ポリヌクレオチド１）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
　吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、または０．０１ｐｍｏｌ）で用いたこと、異なる捕捉プローブを用いたこと、吸収剤ポリヌクレオチド１を２５ｐｍｏｌで用いたこと、および５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で行った。
　その結果、吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定において、実施例１、実施例５および実施例６と異なる標的核酸および異なる捕捉プローブを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表１４、図１７、１８）。また、標的核酸が複数の修飾核酸塩基を含む場合、標的核酸が０．０１ｐｍｏｌという非常に少ない量であっても（即ち、溶液中の標的核酸の濃度を０．１ｎＭにして捕捉プローブとハイブリダイズさせて、ハイブリッドを形成させたときでさえも）、Ｓ／Ｎ（吸収剤ポリヌクレオチド：－）に対するＳ／Ｎ（吸収剤ポリヌクレオチド：＋）の明確な改善が認められた。本実施例でこのような改善が認められた実験条件は、（標的核酸中の修飾核酸塩基の個数＝５、標的核酸の量＝０．０１ｐｍｏｌ）である。一方、実施例５で改善が認められた条件は、（標的核酸中の修飾核酸塩基の個数＝１、標的核酸の量＝１ｐｍｏｌ）である。つまり、修飾核酸塩基の個数の差異が５倍しかないにもかかわらず、標的核酸の量について１０２オーダーも検出感度を向上させた。以上のとおり、標的核酸が複数の修飾核酸塩基を含む場合、検出感度が増幅されていたことから、吸収剤ポリヌクレオチドの特に優れた効果が確認された（表１５、図１８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
実施例８：吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定における異なる標的核酸および異なる捕捉プローブの使用（３）
　標的核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＴＧＧＴＴ［Ｃ］ＧＴ－３’（配列番号３４、［Ｃ］は５－メチルシトシン）、標的核酸を捕捉するための捕捉プローブのヌクレオチド配列は５’－ＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＴＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号３５、３’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものをそれぞれ使用した。またシトシンを含む吸収剤ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）のヌクレオチド配列は５’－ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ－３’（配列番号９、吸収剤ポリヌクレオチド４）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。捕捉プローブは、標的核酸とのハイブリッドが形成されたとき、ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基［Ｃ］が存在するように設計した。
　吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定は、異なる標的核酸を異なる量（１ｐｍｏｌ、０．１ｐｍｏｌ、または０．０１ｐｍｏｌ）で用いたこと、異なる捕捉プローブを用いたこと、吸収剤ポリヌクレオチド４を２５ｐｍｏｌで用いたこと、および５０ｎｇ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体（ニッポンジーン社製、Ｃｌｏｎｅ３３Ｄ３）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で行った。
　その結果、吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定において、実施例１、実施例５、実施例６および実施例７と異なる標的核酸、異なる捕捉プローブおよび異なる吸収剤ポリヌクレオチドを使用した場合にも、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上が認められた（表１６、図１９、２０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　以上の実施例１、５～８で実証されたように、吸収剤ポリヌクレオチドを用いる修飾核酸塩基の測定に関する本発明は、標的核酸および捕捉プローブの種類にかかわらず、バックグラント値の低下、およびＳ／Ｎ値の向上に有用であることが示された。
　本発明の方法およびキットは、修飾核酸塩基の測定に有用である。

Claims (13)

  1. 　以下を含む、修飾核酸塩基の測定方法：
    （１）核酸サンプルおよび捕捉プローブを溶液中でインキュベートすること；ならびに
    （２）（１）で得られた溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、修飾核酸塩基に対する抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
  2. 　核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有し、かつ工程（１）および（２）がそれぞれ（１’）および（２’）により行われる、請求項１記載の方法：
    （１’）修飾核酸塩基を含む標的核酸を含有する核酸サンプル、および捕捉プローブを溶液中でインキュベートにより反応させて、当該標的核酸および捕捉プローブから構成されるハイブリッドを形成すること；ならびに
    （２’）該ハイブリッドを含む溶液において、吸収剤ポリヌクレオチドの存在下で、前記抗体を用いて修飾核酸塩基を測定すること。
  3. 　標的核酸が、２以上の修飾核酸塩基を含む可能性がある標的核酸である、請求項１または２記載の方法。
  4. 　核酸サンプルを含有する溶液に捕捉プローブを添加して、核酸サンプルおよび捕捉プローブの双方を含有する溶液を調製することをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
  5. 　核酸サンプルが、修飾核酸塩基を含む標的ＤＮＡを含有するサンプルである、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　吸収剤ポリヌクレオチドがヌクレオチド残基を１２個以上含む、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
  7. 　吸収剤ポリヌクレオチドがホモポリヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 　吸収剤ポリヌクレオチドが、シトシンを含むヌクレオチド残基を含み、かつ修飾核酸塩基が修飾シトシンである、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
  9. 　修飾シトシンがメチルシトシンである、請求項８記載の方法。
  10. 　ハイブリッドの二本鎖構造部分において修飾核酸塩基の不対部分が形成されるように、捕捉プローブが設計される、請求項２～９のいずれか一項記載の方法。
  11. 　ハイブリッドの一本鎖構造部分において修飾核酸塩基が存在するように、捕捉プローブが設計される、請求項２～１０のいずれか一項記載の方法。
  12. 　吸収剤ポリヌクレオチドおよび前記抗体を用いる修飾核酸塩基の測定が、ＥＬＩＳＡにより行われる、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
  13. 　以下を含む、修飾核酸塩基の測定用キット：
    （Ｉ）捕捉プローブ；
    （ＩＩ）吸収剤ポリヌクレオチド；および
    （ＩＩＩ）修飾核酸塩基に対する抗体。
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