WO2015016096A1 - 自己免疫性関節炎の判定方法および自己免疫性関節炎惹起性ｔ細胞活性化抑制物質のスクリーニング方法 - Google Patents

自己免疫性関節炎の判定方法および自己免疫性関節炎惹起性ｔ細胞活性化抑制物質のスクリーニング方法 Download PDF

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志文 坂口
能永 伊藤
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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining autoimmune arthritis and a method for screening an autoimmune arthritis-inducing T cell activation inhibitor.
  • Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that causes chronic inflammation and tissue destruction centering on joints throughout the body, affecting about 1% of the total population.
  • pathological autoimmune reactions by acquired immune cells (T cells and B cells) and chronic inflammation by inflammatory cytokines are two pillars of the disease state.
  • inflammatory cytokines good control has been obtained by anti-cytokine therapy.
  • the pathological autoimmune reaction has not been corrected, the relapse of the disease after the discontinuation of the anti-cytokine therapy has become a major problem.
  • CD4-positive T cells are important as a central player of pathological autoimmune reactions occurring in rheumatoid arthritis, but the self-antigen recognized by disease-induced CD4-positive T cells has long been unknown. Met. This has hindered antigen-specific control of autoimmune reactions and analysis of disease-inducing CD4-positive T cells.
  • Type II collagen-induced arthritis see Non-Patent Document 1
  • CD4 positive T cells are necessary in this system
  • type II collagen produced in the body as a result of immunization It is known that autoantibodies against can also cause arthritis, and it is unclear whether type II collagen-specific CD4-positive T cells can cause arthritis in the absence of autoantibodies.
  • autoimmune arthritis There are still many unclear points about autoimmune arthritis such as rheumatoid arthritis, and finding a new self-antigen that causes autoimmune arthritis is an important issue. Among them, no autoantigen of autoimmune arthritis caused by CD4 positive T cell dependency and autoantibody independence has been reported so far. If such an autoantigen can be found, autoimmune arthritis It is expected to lead to the analysis of the mechanism and the development of therapy.
  • An object of the present invention is to find an autoantigen of autoimmune arthritis caused by CD4 positive T cell dependence and autoantibody independence. Further provided are methods for determining the onset or likelihood of development of autoimmune arthritis using such autoantigens, and causing T cell-dependent autoimmune arthritis in response to such autoantigens. It is an object of the present invention to provide a method for screening a substance that suppresses activation of CD4 positive T cells.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • a method for determining the onset or likelihood of onset of autoimmune arthritis wherein the following (1) or (2) present in a sample derived from a subject is detected.
  • ribosomal protein L23a or a fragment thereof for determining the onset or likelihood of development of autoimmune arthritis, using ribosomal protein L23a or a fragment thereof as an antibody against ribosomal protein L23a, or ribosomal protein L23a Use characterized by detecting reactive CD4 positive T cells.
  • the ribosomal protein L23a is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the fragment of ribosomal protein L23a comprises the 71st to 90th positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a screening method for a substance that suppresses activation of autoimmune arthritis-inducing T cells comprising a step of bringing a test substance into contact with a T cell that reacts with ribosomal protein L23a, ribosomal protein L23a or its A screening method comprising: contacting a fragment; measuring the activation state of the T cell; and analyzing a change in the activation state of the T cell depending on a test substance.
  • an inflammatory cytokine secreted from the T cell, proliferation of the T cell, or an activation surface marker of the T cell is measured. The screening method according to [7] above.
  • ribosomal protein L23a is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention it is possible to provide a method for determining the onset or likelihood of onset of autoimmune arthritis.
  • the protein fragment which can be used suitably for research of these methods and autoimmune arthritis can be provided.
  • the present inventors have established an SKG mouse that causes autoimmune arthritis that closely resembles rheumatoid arthritis (Japanese Patent No. 3467520), and has proceeded with analysis.
  • SKG mice have a point mutation in the T cell signaling factor ZAP70, which causes abnormal selection of T cells in the thymus, and autoreactive T cells that cause arthritis appear in the periphery and cause arthritis (Sakaguchi, N. et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice.Nature 426, 454-460, doi: 10.1038 / nature02119 (2003), Hirota, K. et al.
  • T cell self-reactivity forms a cytokine milieu for spontaneous development of IL-17 + Th cells that cause autoimmune arthritis.
  • Arthritis in SKG mice is CD4-positive T cell dependent. That is, recipient mice develop arthritis by transferring CD4 positive T cells to immunodeficient mice.
  • the present inventors found CD4 positive T cells that cause arthritis in an autoantibody independent manner using SKG mice, and searched for recognition antigens of the CD4 positive T cells.
  • Ribosomal protein L23a was identified as an autoantigen that causes CD4-positive T cell-dependent autoimmune arthritis. As a result of further research on this self-antigen, the present invention was completed.
  • the present invention provides a method for determining the onset or likelihood of onset of autoimmune arthritis.
  • the determination method of the present invention can be performed by detecting (1) an antibody against ribosomal protein L23a present in a sample derived from a subject, or (2) a CD4-positive T cell that reacts with ribosomal protein L23a.
  • the autoimmune arthritis to be determined according to the present invention may be any arthritis as long as it is arthritis caused by autoantibodies or autoreactive T cells. Examples include rheumatoid arthritis, reactive arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, collagen disease-related arthritis, and the like. Rheumatoid arthritis is preferable.
  • the subject is not particularly limited, but is preferably a person who has developed arthritis or a person who is suspected of having arthritis. Those who are suspected of developing arthritis include those who have subjective symptoms of arthritis. Moreover, it is preferable that a test subject is anti-CCP antibody negative. Specifically, it is preferable to be a subject who develops arthritis but is anti-CCP antibody negative, or a subject who is suspected of developing arthritis but is negative for anti-CCP antibody.
  • the subject-derived sample is not particularly limited as long as it contains an antibody or T cell.
  • blood, serum, plasma, tissue fluid, lymph fluid, cerebrospinal fluid, pus, mucus, runny nose, sputum, urine, feces Body fluids such as ascites can be preferably used.
  • the antibody against ribosomal protein L23a (hereinafter referred to as “L23a”) may be any antibody that specifically binds to L23a.
  • the CD4 positive T cell that reacts with L23a may be any CD4 positive T cell that reacts with L23a and is activated.
  • L23a or a fragment thereof can be used for detection of an antibody against L23a and detection of CD4-positive T cells that react with L23a.
  • the origin of L23a to be used is not particularly limited, but mammalian L23a is preferable. As mammals, humans, chimpanzees, monkeys, dogs, cows, sheep, rabbits, mice, rats, guinea pigs and the like are preferable, and humans are more preferable. Mammalian L23a is well conserved, and at least the amino acid sequences of human, rhesus monkey, cow, sheep, rat, and mouse L23a are identical (SEQ ID NO: 1). The amino acid sequence of L23a of various animals and the base sequence of the gene encoding it can be obtained from a known database (DDBJ / GenBank / EMBL, etc.) with the accession numbers shown in Table 1, for example.
  • the fragment of L23a is not particularly limited as long as it comprises a part of L23a, but preferably comprises a part of mammalian L23a, and a part of L23a comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It is more preferable that The number of amino acid residues in the L23a fragment is not particularly limited, but is preferably 5 residues or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably about 140 residues or less, more preferably about 120 residues or less, further preferably about 100 residues or less, further preferably about 80 residues or less, and further preferably about 60 residues or less. About 40 residues or less, more preferably about 20 residues or less.
  • the fragment of L23a is preferably a fragment comprising the amino acid sequence at positions 71 to 90 (LDHYAIIKFPLTTESAMKKI, SEQ ID NO: 3) of the amino acid sequence of L23a (SEQ ID NO: 1), more preferably SEQ ID NO: 3. A fragment consisting of the amino acid sequence shown.
  • L23a and L23a fragments are constructed by constructing a recombinant expression vector in which a gene encoding L23a or a fragment thereof can be expressed, for example, by a known genetic engineering technique, and introducing this into a suitable host cell as a recombinant protein. It can be produced by expressing and purifying.
  • the L23a and L23a fragments can be produced, for example, using an in vitro transcription / translation system.
  • the L23a and L23a fragments can be produced by a solid phase synthesis method (Fmoc method, Boc method) or a liquid phase synthesis method according to a known general peptide synthesis protocol.
  • the method for detecting an antibody against L23a is not particularly limited, and a known method for detecting an antibody that specifically binds to an antigen can be appropriately selected and used.
  • the ELISA method can be suitably used.
  • L23a or a fragment thereof can be immobilized on a plate, reacted with serum from a subject, and detected using an appropriate secondary antibody.
  • the criteria for determining whether the antibody against L23a is positive can be determined on the basis of the amount of antibody against L23a as a control, for example, using a normal individual with respect to arthritis (for example, a person without subjective symptoms of arthritis) as a control. For example, using the same method as the method for detecting an antibody against L23a in a subject, the amount of antibody against L23a in a plurality of controls is measured, and an average value and a standard deviation (SD) are calculated.
  • SD standard deviation
  • Examples of the reference value include a method of determining that a value below that is normal and a value exceeding that value as positive. However, it is not limited to this. It is also possible to accumulate the control antibody amount as background data and calculate the reference value using the accumulated data.
  • the method for detecting CD4 positive T cells that react with L23a is not particularly limited, and a known method for detecting T cells that react specifically with an antigen can be appropriately selected and used.
  • a method for detecting cells that secrete inflammatory cytokines by reacting with L23a a method for detecting the proliferation of L23a-reactive CD4-positive T cells, a method for detecting an activated surface marker (such as CD154), etc.
  • CD4-positive T cells are isolated from the blood of a subject by a known method, the obtained cells are contacted with L23a or a fragment thereof, and cells that secrete inflammatory cytokines are detected with a flow cytometer.
  • Inflammatory cytokines include IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL17, IL-18 and the like.
  • the subject can determine that the L23a-reactive CD4-positive T cell is positive.
  • the subject When it is judged that at least one of an antibody against L23a and a CD4 positive T cell that reacts with L23a is positive, the subject is determined to have autoimmune arthritis or is likely to develop autoimmune arthritis Can do. Being able to determine the onset or likelihood of onset of autoimmune arthritis makes it possible to determine the onset of disease by earlier and effective therapeutic intervention or by more careful follow-up.
  • the determination method of the present invention is for those who develop arthritis but are anti-CCP antibody-negative or This is very useful in that it can be used for subjects who are suspected of developing arthritis but are negative for anti-CCP antibodies, and can determine the onset or onset of autoimmune arthritis in these subjects.
  • the present invention provides a screening method for a substance that suppresses the activation of autoimmune arthritis-induced T cells.
  • the screening method of the present invention comprises a step of bringing a test substance into contact with a T cell that reacts with L23a, a step of bringing the T cell into contact with L23a or a fragment thereof, a step of measuring the activation state of the T cell, What is necessary is just to include the process of analyzing the change of an activation state dependent on a test substance.
  • the substance obtained by the screening method of the present invention is useful as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for autoimmune arthritis.
  • test substances to which the screening method of the present invention is applied include, for example, nucleic acids, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, mammalian tissues An extract, plasma, etc. are mentioned.
  • the test substance may be a novel substance or a known substance.
  • T cells that react with L23a (hereinafter referred to as “L23a-reactive T cells”) can be collected from autoimmune arthritis patients according to the above-described method for detecting CD4-positive T cells that react with L23a.
  • L23a-reactive T cells can be obtained by introducing a T cell receptor gene that specifically recognizes L23a into a T cell line that does not express T cell receptor (eg, 5KC-73.8.20). Can be produced (see Examples).
  • the method for bringing the test substance into contact with the L23a-reactive T cell may be any method as long as the cell can be brought into contact with the test substance, and is not particularly limited. .
  • a method of adding a test substance to a medium in which L23a-reactive T cells are cultured a method of replacing a medium in which L23a-reactive T cells are cultured with a medium containing a test substance, and the like can be mentioned.
  • the method of bringing L23a-reactive T cells into contact with L23a or a fragment thereof is not particularly limited, and it is not limited to the medium in which L23a-reactive T cells are cultured. Examples include a method of adding L23a or a fragment thereof, and a method of exchanging a medium in which L23a-reactive T cells are cultured with a medium containing L23a or a fragment thereof.
  • Either the step of bringing the test substance into contact with the T cells that react with L23a and the step of bringing L23a or a fragment thereof into contact with the L23a-reactive T cells may be performed first or simultaneously. That is, L23a or a fragment thereof may be contacted after contacting a test substance with L23a-reactive T cells, or a test substance is contacted with L23a-reactive T cells after contacting L23a or a fragment thereof. Alternatively, the test substance and L23a or a fragment thereof may be simultaneously contacted with L23a-reactive T cells.
  • the measurement target is not particularly limited as long as it is an indicator of the activation state of L23a-reactive T cells.
  • measurement of inflammatory cytokines secreted from L23a-reactive T cells, measurement of proliferation of L23a-reactive T cells, measurement of activation surface markers of L23a-reactive T cells, and the like can be suitably used.
  • the inflammatory cytokine secreted from L23a-reactive T cells can be measured in the step of measuring the activation state of L23a-reactive T cells.
  • the inflammatory cytokine to be measured is not particularly limited, and one or more of the known inflammatory cytokines exemplified above may be appropriately selected.
  • the method for measuring inflammatory cytokine is not particularly limited, and may be appropriately selected from known methods (for example, Western blot method, EIA method, ELISA method, RIA method, etc.) capable of measuring the inflammatory cytokine to be measured.
  • the change in the test substance-dependent inflammatory cytokine secretion may be analyzed.
  • the method for analyzing changes in the amount of inflammatory cytokine secretion dependent on the test substance is not particularly limited. For example, if the amount of inflammatory cytokine secretion is reduced when the test substance is contacted as compared to the amount of inflammatory cytokine secretion in the control group that is not contacted with the test substance, the test substance is induced to cause autoimmune arthritis. It can be selected as a substance that suppresses the activation of T cells.
  • the degree to which the test substance decreases the inflammatory cytokine secretion amount is not particularly limited, but, for example, a test substance that reduces the inflammatory cytokine secretion amount to 50% or less of the cells not contacted with the test substance is preferable, and 25% The test substance to be made below is more preferable.
  • the proliferation of L23a-reactive T cells may be measured in the step of measuring the activation state of L23a-reactive T cells.
  • the method for measuring the proliferation of L23a-reactive T cells is not particularly limited, and can be appropriately selected from known cell proliferation measurement methods.
  • the measurement can be performed by measurement of tritiated thymidine incorporation, detection of division by CFSE label, and the like.
  • the change in the amount of cell proliferation dependent on the test substance may be analyzed.
  • the method for analyzing the change in the amount of cell growth dependent on the test substance is not particularly limited. For example, if the amount of cell proliferation is decreased when the test substance is contacted compared to the amount of cell proliferation in the control group not contacted with the test substance, the test substance is treated with the activity of autoimmune arthritis-inducing T cells. It can be selected as a substance that suppresses crystallization.
  • the degree to which the test substance decreases the amount of cell growth is not particularly limited. For example, a test substance that is 50% or less is preferable compared to the cell growth amount of cells not contacted with the test substance, and the test is to be 25% or less. Substances are more preferred.
  • the activation surface marker of L23a-reactive T cells may be measured in the step of measuring the activation state of L23a-reactive T cells.
  • the target activation surface marker is not particularly limited, and examples thereof include CD154.
  • the method for measuring the surface marker is not particularly limited, and may be appropriately selected from known methods (for example, a method using a flow cytometer) that can measure the cell surface marker.
  • the change in the amount of the activation surface marker dependent on the test substance may be analyzed.
  • the method for analyzing the change in the amount of the activated surface marker depending on the test substance is not particularly limited. For example, if the amount of the activated surface marker decreases when the test substance is brought into contact with the amount of the activated surface marker in the control group that is not brought into contact with the test substance, the test substance is caused to cause autoimmune arthritis. It can be selected as a substance that suppresses the activation of T cells.
  • the degree to which the test substance decreases the amount of the activated surface marker is not particularly limited. For example, a test substance that is reduced to 50% or less as compared with the amount of the activated surface marker of cells not contacted with the test substance is preferable, and 25% The test substance to be made below is more preferable.
  • the present invention includes a medicament for preventing or treating autoimmune arthritis, which comprises a substance that suppresses activation of L23a-reactive T cells as an active ingredient.
  • preparations for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), Examples include syrups, emulsions, and suspensions.
  • These preparations are produced by a known method and contain carriers, diluents or excipients usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • injections for example, injections, suppositories and the like are used, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, intraarticular injections. And other dosage forms.
  • Such an injection is prepared by, for example, dissolving, suspending or emulsifying the substance that suppresses the activation of the L23a-reactive T cells or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections according to a known method. To prepare.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used, and suitable solubilizers such as alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, , Propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50, etc.) and the like.
  • suitable solubilizers such as alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, , Propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50, etc.) and the like.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • a suppository used for rectal administration is prepared by mixing a substance that suppresses the expression or function of SIK3 or a salt thereof with an ordinary suppository base. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, humans or mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.) Can be administered orally or parenterally.
  • humans or mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • the present invention provides a fragment of L23a.
  • the fragment of the present invention can be used for detection of an antibody against L23a and detection of CD4 positive T cells that react with L23a.
  • the fragment of the present invention can also be used for basic studies such as analysis of CD4 positive T cells that cause arthritis independent of autoantibody, and analysis of mechanism of arthritis independent of autoantibody.
  • Effector CD4-positive T cells were collected from the joint area of efox SKG mice that developed arthritis. Specifically, the synovial tissue was separated from the ankle joint, and decomposed at 37 ° C. for 1 hour using LIBERASE TM TM (Roche) -containing RPMI1640. The tissue was passed through a nylon mesh to prepare a single cell suspension. GFP-negative CD4-positive T cells were sorted into single cells on a 96-well PCR plate using a Moflo cellor sorter cyclone apparatus. The plate was stored at ⁇ 80 ° C. until use.
  • the T cell receptor was cloned from the sorted GFP negative CD4 positive T cells by the nested PCR method. Specifically, 5 ⁇ L / well reaction mix [100 mg / mL gelatin, 0.1% Triton X-100, 4U / mL RNAsin, 125ng OligodT (Promega), 0.5mM dNTPs, 5U / mL Multiscribe RT enzyme, 1xRT Buffer ( High Throughput cDNA kit, Applied Biosystems)] was added and reacted at 25 ° C for 10 minutes, 37 ° C for 2 hours, and 85 ° C for 5 minutes to perform reverse transcription.
  • 5 ⁇ L / well reaction mix [100 mg / mL gelatin, 0.1% Triton X-100, 4U / mL RNAsin, 125ng OligodT (Promega), 0.5mM dNTPs, 5U / mL Multiscribe RT enzyme, 1xRT Buffer ( High
  • the ⁇ chain was subcloned using MfeI and StuI restriction enzyme recognition sites, and the ⁇ chain was BamHI and XhoI restriction enzyme recognition sites.
  • Each of the T cell receptor genes was cloned from about 150 single cells.
  • a retrogenic mouse was produced using the produced retroviral vector.
  • This vector plasmid was transfected into the Plat-E cell line using Fugene 6 transfection reagent (Roche). After 48 hours and 72 hours, the supernatant containing the retrovirus was collected and passed through a 0.45 ⁇ m filter to remove dust.
  • 150 mg / kg of 5-fluorouracil was intraperitoneally administered to RAG2 knockout mice lacking T cells and B cells and having SKG mutations (produced by crossing SKG mice and RAG2 knockout mice). Four days later, bone marrow cells were collected and red blood cells were removed.
  • DMEM solution containing 20% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, 2-ME in the presence of IL-3 (20 ng / mL), IL-6 (40 ng / mL), SCF (50 ng / mL) (Peprotech)
  • the bone marrow cells were cultured at a concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • IL-3 (20 ng / mL), IL-6 (40 ng / mL), SCF (50 ng / mL) and polybrene (4 ⁇ g / mL) were added to the retrovirus-containing supernatant.
  • the bone marrow cells were infected with the retrovirus by centrifugation at 700 g, 32 ° C. for 90 minutes. On day 4 of culture, the bone marrow cells were injected intravenously into RAG2 knockout mice irradiated with 600 rads. About 30 types of retrogenic mice each infected with one type of retrovirus were prepared.
  • the produced retrogenic mouse expresses only a single pair of T cell receptors introduced and expressed by a retroviral vector as T cell receptors on T cells. By observing whether each retrogenic mouse develops arthritis, it is possible to verify whether the T cell receptor of the retrogenic mouse has arthritis-inducing ability.
  • the produced retrogenic mouse was bred in an SPF environment, and an individual who spontaneously developed arthritis was found. Pictures of mice that developed arthritis are shown in FIGS. 1 (A) and 1 (B). Furthermore, the retrovirus infecting the mouse was analyzed, and the amino acid sequence of the arthritis-inducing T cell receptor was identified (see FIG. 2). In FIG.
  • sequences indicated as “14D-3 / DV8 * 03”, “40 * 01”, “10 * 01” and “2-1 * 01” are, for example, databases IMGT / LIGM-DB (http: / /www.imgt.org/ligmdb/).
  • the arthritis-inducing T cell receptor recognition antigen candidates found above were narrowed down as follows.
  • the T cell receptor gene that has been confirmed to cause arthritis is transferred to the T cell line 5KC-73.8.20 that does not express the T cell receptor using the above-mentioned retroviral vector-containing supernatant. The same method was used for gene transfer.
  • This cell line is known to produce IL-2 upon stimulation from the T cell receptor.
  • CD11c + cells and CD11b + cells were concentrated and recovered with MACS beads from spleen cells of BALB / c mice using MACS beads (Milteny) to prepare antigen-presenting cells (APC).
  • APC antigen-presenting cells
  • a cell lysate of synovial cells of SKG mice that developed arthritis was prepared, separated into each band using the NATIVE-PAGE method, and each band was cut out to extract a protein contained in each band.
  • the T cell line (5 ⁇ 10 4 cells / well) introduced with the T cell receptor gene and the antigen-presenting cells (5 ⁇ 10 4 cells / well) were seeded in a 96-well round bottom plate, and each of the above bands
  • the protein extracted from was added and co-cultured. After incubation for 24 hours, the IL-2 concentration in the supernatant was measured using ELISA (ebioscience). Bands with significantly increased IL-2 concentration were selected as candidate bands. Extracted proteins from candidate bands were subjected to mass spectrometry, and a plurality of candidate proteins were narrowed down from the results.
  • Recombinant proteins are prepared for each candidate protein and added to the above T cell line and antigen-presenting cell co-culture system to determine whether it is an arthritis-inducing T cell receptor recognition antigen or not. The rise was confirmed by an indicator. As a result, it was found that the IL-2 concentration increased when L23a (60S23ribosomal protein L23a) was added.
  • a cell disruption solution (positive control) of the above T cell receptor gene-introduced T cell line, the above antigen presenting cell (APC), recombinant GST-L23a, recombinant GST and mouse myeloma cell (B cell) strain P3U1 The test groups shown in Table 1 below were provided. Each cell was seeded in a 96-well round bottom plate, a medium supplemented with a test substance was added and cultured for 24 hours, and then the IL-2 concentration in the supernatant was measured using ELISA (ebioscience).
  • the present inventor confirmed that the arthritis-inducing T cell receptor cloned this time reacts with the P3U1 cell lysate, and therefore used the P3U1 cell lysate as a positive control.
  • the cell lysate was prepared as follows. That is, 1 ⁇ 10 7 cells were suspended in 1 mL of PBS, frozen in liquid nitrogen and thawed. Subsequently, sonication for 30 seconds was repeated three times, followed by centrifugation at 15000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was used as a cell lysate. The results are shown in FIG. As is apparent from FIG. 3, GST-L23a was shown to activate the arthritis-inducing T cell receptor in a concentration-dependent manner.
  • the peptide concentration was 50 ⁇ g / mL, and the GST-L23a concentration was 100 ⁇ g / mL.
  • the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 4, L23a71-90 markedly increased the IL-2 concentration. On the other hand, L23a6-25 did not increase the IL-2 concentration. Although not shown in the figure, all the peptides other than L23a71-90 had the same results as L23a6-25. From this result, it was clarified that the fragment consisting of the amino acid sequence at positions 71 to 90 (LDHYAIIKFPLTTESAMKKI, SEQ ID NO: 3) of L23a is a recognition antigen for arthritis-inducing T cell receptor.
  • the transferred membrane was reacted with 200-fold diluted serum, washed, and then reacted with HRP-labeled anti-mouse IgG1 antibody as a secondary antibody at 2000-fold dilution. After washing, color was developed using ECL Prime Western Blotting Detection Reagent and detected using LAS-4000mini.
  • histone H1.2 is a protein that has been confirmed to have no reactivity although it was included in the recognition antigen candidate of the arthritis-inducing T cell receptor cloned this time, and encodes mouse histone H1.2.
  • the coding region of DNA (ACCESSION: NM — 015786) was inserted into the expression vector pGEX-6P1 and prepared as a recombinant protein to which a GST tag was added in the same manner as GST-L23a.
  • the left arrow indicates the position of the GST-L23a band
  • the right arrow indicates the position of the protein in the P3U1 cell lysate to which the antibody in the serum is bound. Since there was no antibody binding to GST-histone 1.2, a large amount of antibody recognizing L23a may be present in the serum of an arthritis-inducing T cell receptor-expressing retrogenic mouse that recognizes L23a. It became clear.
  • Serum was obtained from 374 patients with rheumatoid arthritis and 80 normal people without rheumatoid arthritis.
  • Recombinant GST-L23a or recombinant GST was dissolved in PBS to prepare a 200 ng / mL solution.
  • PBS ELISA polysoap plate
  • Each was added to wells of an ELISA polysoap plate (trade name, Nunc) and adsorbed at 4 ° C. for 16 hours. The plate was washed 5 times with PBS containing 0.05% Tween 20, and then blocked with PBS containing 1% BSA for 1 hour.
  • the plate was washed five times in the same manner, and 100 ⁇ L of serum diluted 500-fold with PBS containing 1% BSA was added to each well. After leaving at room temperature for 2 hours and washing 5 times, HRP-labeled anti-human IgG (H + L) (diluted 4000 times with PBS containing 1% BSA) was added and left at room temperature for 1 hour. After washing 5 times, TMB was added and the value of OD450nm was measured 15 minutes later. The value obtained by subtracting the OD value of GST from the OD value of GST-L23a was used as the OD value of the antibody against L23a.
  • HRP-labeled anti-human IgG H + L
  • TMB was added and the value of OD450nm was measured 15 minutes later. The value obtained by subtracting the OD value of GST from the OD value of GST-L23a was used as the OD value of the antibody against L23a.
  • Control represents a normal person
  • RA represents a rheumatoid arthritis patient.
  • the unit (U / mL) is arbitrarily set based on one positive serum.
  • a normal value of + 3SD or less (below the broken line in the figure) of the average of normal persons was determined as a normal value, and a value exceeding that was determined as positive.
  • FIG. 6 only 1 out of 80 normal people was positive, but 64 out of 374 patients with rheumatoid arthritis were positive.
  • the t value was significantly different from the p value of 0.0012.
  • Synovial fluid was collected from one patient with rheumatoid arthritis. Blood was collected from one healthy person. Mononuclear cells were separated from joint fluid and blood, respectively. Specifically, Ficoll was added to joint fluid or blood, and mononuclear cells were separated and collected by centrifugation at 2200 rpm for 20 minutes. The obtained mononuclear cells were seeded at 1 ⁇ 10 6 cells / well in a 96-well plate, and 100 ⁇ g / mL of recombinant GST or recombinant GST-L23a was added to the medium and cultured for 24 hours.
  • Brefeldin A was added to 1 ⁇ g / mL 6 hours before the end of the culture to stop cytokine secretion. After the cells were collected, IL-17A and IFN- ⁇ were stained by a general cytokine staining method and detected with a flow cytometer.
  • Anti-CCP antibody anti-cyclic citrullinated peptide antibody
  • ELISA method Anti-L23a antibody was measured.

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Abstract

　被験者由来の試料中に存在する（１）リボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体、または（２）リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出することを特徴とする自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法、および、リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、該Ｔ細胞にリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程、該Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカインを測定する工程、被験物質依存的な炎症性サイトカイン分泌量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法。

Description

自己免疫性関節炎の判定方法および自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞活性化抑制物質のスクリーニング方法
　本発明は、自己免疫性関節炎の判定方法および自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞活性化抑制物質のスクリーニング方法に関するものである。
　関節リウマチは、全身の関節を中心に慢性炎症や組織破壊を引き起こす自己免疫性疾患で、全人口の約１％が罹患する。関節リウマチにおいては、獲得免疫細胞（Ｔ細胞やＢ細胞）による病的な自己免疫反応と、炎症性サイトカインによる慢性炎症が、病態の２つの柱である。炎症性サイトカインについては近年、抗サイトカイン療法によって良好なコントロールが得られるようになった。しかし、そのような場合でも病的な自己免疫反応は是正できていないために、抗サイトカイン療法中止後の疾患の再燃が大きな問題となっている。関節リウマチで起こっている病的な自己免疫反応の中心的な担い手として、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が重要であることが指摘されてきたが、疾患惹起性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の認識する自己抗原は長らく不明であった。そして、そのことが自己免疫反応の抗原特異的なコントロールや、疾患惹起性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の解析を妨げていた。
　これまでに、自己免疫性関節炎を引き起こすＴ細胞が認識する自己抗原は、特殊な免疫を行う必要のある自己免疫性関節炎の系、あるいはＢ細胞や自己抗体が必須の自己免疫性関節炎の系でのみ知られていた。例えば、ＤＢＡ／１系統のマウスに、ＩＩ型コラーゲン１００ｍｇをＣＦＡ（コンプリートフロインドアジュバント）と共に皮下投与し、さらに２０日後にＩＩ型コラーゲン１００ｍｇをＩＦＡ（インコンプリートフロインドアジュバント）と共に皮下投与すると関節炎を発症させることができることが報告されている（ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎、非特許文献１参照）この系ではＣＤ４陽性Ｔ細胞が必要なことは分かっているが、免疫の結果体内に産生されるＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体も関節炎を起こすことができることが知られており、ＩＩ型コラーゲン特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞が、自己抗体非存在下で関節炎を起こすことができるかどうかははっきりしていない。
　また、加齢に伴って自己免疫疾患を自然発症するＫ／ＢｘＮマウスでは、糖代謝酵素ＧＰＩが標的自己抗原であることが知られている（非特許文献２、３参照）この系では、自己反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化の結果ＧＰＩに対する自己抗体が産生され、その自己抗体が関節炎を引き起こすことが分かっている。ただし、この系においても、自己反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞は自己抗体の非存在下で関節炎を引き起こすことができない。
　関節リウマチ等の自己免疫性関節炎については未だ不明な点が多く、自己免疫性関節炎を惹起する新規な自己抗原を見出すことは重要な課題である。なかでも、ＣＤ４陽性Ｔ細胞依存性かつ自己抗体非依存性に引き起こされる自己免疫性関節炎の自己抗原はこれまでに報告されておらず、このような自己抗原を見出すことができれば、自己免疫性関節炎のメカニズム解析および治療法の開発に繋がることが期待される。
Courtenay JS, Dallman MJ, Dayan AD, Martin A, Mosedale B. Immunisation against heterologous type II collagen induces arthritis in mice. Nature 1980;283:666‐8 論文名Kouskoff, V. et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell 87, 811-822 (1996). 論文名Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C. & Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science 286, 1732-1735 (1999).
　本発明は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞依存性かつ自己抗体非依存性に引き起こされる自己免疫性関節炎の自己抗原を見出すことを課題とする。さらに、そのような自己抗原を用いて自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供すること、およびそのような自己抗原と反応してＴ細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起するＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法であって、被験者由来の試料中に存在する以下の（１）または（２）を検出することを特徴とする判定方法。
（１）リボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体
（２）リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞
［２］リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記［１］に記載の判定方法。
［３］被験者が、抗ＣＣＰ抗体陰性であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の判定方法。
［４］自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定するためのリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントの使用であって、リボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを用いてリボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体、またはリボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出することを特徴とする使用。
［５］リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記［４］に記載の使用。
［６］リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位～第９０位を含むことを特徴とする前記［４］に記載の使用。
［７］自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法であって、リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、該Ｔ細胞にリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程、該Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程、該Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
［８］前記Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、該Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカイン、該Ｔ細胞の増殖、または該Ｔ細胞の活性化表面マーカーを測定することを特徴とする前記［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記［７］または［８］に記載のスクリーニング方法。
［１０］リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位～第９０位を含むことを特徴とする前記［７］または［８］に記載のスクリーニング方法。
［１１］リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示されるアミノ酸配列の少なくとも連続する５アミノ酸残基を含むことを特徴とするフラグメント。
［１２］配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位～第９０位を含むことを特徴とする前記［１１］に記載のフラグメント。
　本発明により、自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供することができる。また、Ｔ細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起するＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供することができる。また、これらの方法や自己免疫性関節炎の研究に好適に用いることができるタンパク質断片を提供することができる。
関節炎を発症したレトロジェニックマウスの写真である。 関節炎惹起性Ｔ細胞受容体のアミノ酸配列を示す図である。 リボソームタンパク質Ｌ２３ａによる関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の活性化を検討した結果を示す図である。 リボソームタンパク質Ｌ２３ａの抗原フラグメントを同定した結果を示す図である。 関節炎惹起性Ｔ細胞受容体発現レトロジェニックマウスの血清中に抗リボソームタンパク質Ｌ２３ａ抗体を検出した結果を示す図である。 関節リウマチ患者の血清中に抗リボソームタンパク質Ｌ２３ａ抗体を検出した結果を示す図である。 関節リウマチ患者の関節液中にリボソームタンパク質Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を検出した結果を示す図である。 抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者の血清中に抗リボソームタンパク質Ｌ２３ａ抗体を検出した結果を示す図である。
　本発明者らは、関節リウマチに酷似した自己免疫性関節炎を引き起こすＳＫＧマウスを樹立し（特許第3467520号）、解析を進めてきた。ＳＫＧマウスは、Ｔ細胞シグナル伝達因子ＺＡＰ７０の点突然変異を持ち、そのために胸腺でのＴ細胞の選択異常が起こり、関節炎を起こす自己反応性Ｔ細胞が末梢に出現して関節炎を引き起こす（Sakaguchi, N. et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature 426, 454-460, doi:10.1038/nature02119 (2003) 、Hirota, K. et al. T cell self-reactivity forms a cytokine milieu for spontaneous development of IL-17+ Th cells that cause autoimmune arthritis. The Journal of experimental medicine 204, 41-47, doi:10.1084/jem.20062259 (2007)）。ＳＫＧマウスの関節炎は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞依存的である。すなわち、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を免疫不全マウスへ移入することで、レシピエントマウスは関節炎を発症する。
　本発明者らは、後段の実施例に示すように、ＳＫＧマウスを用いて自己抗体非依存的に関節炎を惹起するＣＤ４陽性Ｔ細胞を見出し、当該ＣＤ４陽性Ｔ細胞の認識抗原を探索した結果、ＣＤ４陽性Ｔ細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起する自己抗原としてリボソームタンパク質Ｌ２３ａを同定した。さらにこの自己抗原について研究を進めた結果、本願発明を完成させた。
〔自己免疫性関節炎の判定方法〕
　本発明は、自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供する。本発明の判定方法は、被験者由来の試料中に存在する（１）リボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体、または（２）リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出することにより行うことができる。
　本発明の判定対象である自己免疫性関節炎は、自己抗体または自己反応性Ｔ細胞によって発症する関節炎であればどのような関節炎でもよい。例えば、関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、膠原病関連関節炎などが挙げられる。好ましくは関節リウマチである。
　被験者は特に限定されないが、関節炎を発症している者または関節炎の発症が疑われる者が好ましい。関節炎の発症が疑われる者としては、関節炎の自覚症状が認められる者が挙げられる。また、被験者は抗ＣＣＰ抗体陰性であることが好ましい。具体的には、関節炎を発症しているが抗ＣＣＰ抗体陰性の被験者、または関節炎の発症が疑われるが抗ＣＣＰ抗体陰性の被験者であることが好ましい。
　被験者由来の試料としては、抗体またはＴ細胞が含まれる試料であれば特に限定されないが、例えば、血液、血清、血漿、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類を好適に用いることができる。
　リボソームタンパク質Ｌ２３ａ（以下「Ｌ２３ａ」と記す）に対する抗体は、Ｌ２３ａに特異的に結合する抗体であればよい。Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞は、Ｌ２３ａと特異的に反応して活性化されるＣＤ４陽性Ｔ細胞であればよい。
　Ｌ２３ａに対する抗体の検出およびＬ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出には、Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを用いることができる。用いるＬ２３ａの由来は特に限定されないが、哺乳動物のＬ２３ａが好ましい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、モルモットなどが好ましく、より好ましくはヒトである。哺乳動物のＬ２３ａはよく保存されており、少なくともヒト、アカゲザル、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスのＬ２３ａのアミノ酸配列は同一である、（配列番号１）。各種動物のＬ２３ａのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば表１に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｌ２３ａのフラグメントは、Ｌ２３ａの一部からなるものであれば特に限定されないが、哺乳動物のＬ２３ａの一部からなるものであることが好ましく、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＬ２３ａの一部であることがより好ましい。Ｌ２３ａのフラグメントのアミノ酸残基数は特に限定されないが、５残基以上であることが好ましい。上限は特に限定されないが、約１４０残基以下が好ましく、約１２０残基以下がより好ましく、約１００残基以下がさらに好ましく、約８０残基以下がさらに好ましく、約６０残基以下がさらに好ましく、約４０残基以下がさらに好ましく、約２０残基以下が特に好ましい。
　また、Ｌ２３ａのフラグメントは、Ｌ２３ａのアミノ酸配列（配列番号１）の第７１位～第９０位のアミノ酸配列（LDHYAIIKFPLTTESAMKKI、配列番号３）を含むフラグメントであることが好ましく、より好ましくは配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるフラグメントである。
　Ｌ２３ａおよびＬ２３ａのフラグメントは、例えば公知の遺伝子工学的手法により、Ｌ２３ａまたはそのフラグメントをコードする遺伝子を発現可能に挿入した組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させ、精製することにより製造することができる。また、Ｌ２３ａおよびＬ２３ａのフラグメントは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて製造することができる。また、Ｌ２３ａおよびＬ２３ａのフラグメントは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。
　Ｌ２３ａに対する抗体の検出方法は特に限定されず、抗原と特異的に結合する抗体を検出するための公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法を好適に用いることができる。ＥＬＩＳＡ法を用いてＬ２３ａに対する抗体の検出を行う場合、Ｌ２３ａまたはそのフラグメントをプレートに固相化し、被験者由来に血清を添加して反応させ、適当な二次抗体を用いて検出することができる。
　Ｌ２３ａに対する抗体が陽性であることの判断基準は、例えば、関節炎に関して正常な個体（例えば、関節炎の自覚症状のないヒト）を対照とし、対照のＬ２３ａに対する抗体量に基づいて定めることができる。例えば、被験者のＬ２３ａに対する抗体を検出するための方法と同じ方法を用いて、複数の対照のＬ２３ａに対する抗体量を測定し、平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出し、対照の平均値＋３ＳＤを基準値として、それ以下を正常、それを超えるものを陽性と判定する方法が挙げられる。ただし、これに限定されるものではない。対照の抗体量を背景データとして蓄積し、蓄積データを用いて基準値を算出することもできる。
　Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出方法は特に限定されず、抗原と特異的に反応するＴ細胞を検出するための公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、Ｌ２３ａと反応することにより炎症性サイトカインを分泌する細胞を検出する方法、Ｌ２３ａ反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増殖を検出する方法、活性化表面マーカー（ＣＤ１５４など）を検出する方法などを好適に用いることができる。具体的には、例えば、被験者の血液から公知の方法でＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離し、得られた細胞をＬ２３ａまたはそのフラグメントと接触させ、炎症性サイトカインを分泌する細胞をフローサイトメーターで検出する方法などが挙げられる。炎症性サイトカインとしては、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６，ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ１７、ＩＬ－１８などが挙げられる。
　Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞が検出された場合に、当該被験者はＬ２３ａ反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞が陽性であると判断できる。
　Ｌ２３ａに対する抗体およびＬ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも一方が陽性と判断された場合、被験者は自己免疫性関節炎の発症している、または自己免疫性関節炎を発症する見込みがあると判定することができる。自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定できることにより、より早期の効果的な治療介入、あるいはより慎重な経過観察による疾患発症の判定が可能となる。
　さらに、抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者血清の過半数にＬ２３ａに対する抗体が検出されたことから（実施例参照）、本発明の判定方法は、関節炎を発症しているが抗ＣＣＰ抗体陰性の者または関節炎の発症が疑われるが抗ＣＣＰ抗体陰性の者を対象とすることができ、これらの被験者における自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定できる点で、非常に有用である。
〔スクリーニング方法〕
　本発明は、自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、該Ｔ細胞にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程、該Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程、該Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むものであればよい。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、自己免疫性関節炎の予防または治療薬の有効成分として有用である。
　本発明のスクリーニング方法を適用する被験物質としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等が挙げられる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
　Ｌ２３ａと反応するＴ細胞（以下「Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞」と記す）は、自己免疫性関節炎患者から、上記のＬ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出方法に準じて採取することができる。また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞は、Ｌ２３ａを特異的に認識するＴ細胞受容体遺伝子を、Ｔ細胞受容体を発現していないＴ細胞株（例えば５ＫＣ－７３．８．２０）に導入することにより、作製することができる（実施例参照）。
　Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に被験物質を接触させる工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に被験物質を接触させる方法は、細胞と被験物質とが接触できる方法であればどのような方法でもよく、特に限定されない。例えば、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を培養している培地に被験物質を添加する方法、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を培養している培地を被験物質を含有する培地と交換する方法などが挙げられる。なお、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
　また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる方法も特に限定されず、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を培養している培地にＬ２３ａまたはそのフラグメントを添加する方法、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を培養している培地をＬ２３ａまたはそのフラグメントを含有する培地と交換する方法などが挙げられる。
　Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、および、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程は、どちらを先に行ってもよく、同時に行ってもよい。すなわち、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に対して被験物質を接触させた後にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させてもよく、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に対してＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させた後に被験物質を接触させてもよく、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に対して被験物質とＬ２３ａまたはそのフラグメントを同時に接触させてもよい。
　Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、測定対象は、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態の指標となるものであれば特に限定されない。例えば、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカインの測定、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の増殖の測定、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化表面マーカーの測定などを好適に用いることができる。
　測定対象がＬ２３ａ反応性Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカインである場合、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカインを測定すればよい。測定対象の炎症性サイトカインは特に限定されず、上記に例示した公知の炎症性サイトカイン中から一種または二種以上を適宜選択すればよい。炎症性サイトカインの測定方法も特に限定されず、測定対象の炎症性サイトカインを測定できる公知の方法（例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など）から適宜選択すればよい。
　また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程では、被験物質依存的な炎症性サイトカイン分泌量の変化を分析すればよい。本工程において、被験物質依存的な炎症性サイトカイン分泌量の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群における炎症性サイトカイン分泌量と比較して、被験物質を接触させた場合に炎症性サイトカイン分泌量が減少していれば、当該被験物質を自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質として選択することができる。被験物質が炎症性サイトカイン分泌量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の炎症性サイトカイン分泌量と比較して５０％以下にさせる被験物質が好ましく、２５％以下にさせる被験物質がより好ましい。
　測定対象がＬ２３ａ反応性Ｔ細胞の増殖である場合、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の増殖を測定すればよい。Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の増殖を測定する方法は特に限定されず、公知の細胞増殖測定方法のなかから適宜選択して用いることができる。例えば、トリチウム化チミジンの取り込み測定によるもの、ＣＦＳＥラベルによる分裂の検出などを挙げることができる。
　また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程では、被験物質依存的な細胞増殖量の変化を分析すればよい。本工程において、被験物質依存的な細胞増殖量の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群における細胞増殖量と比較して、被験物質を接触させた場合に細胞増殖量が減少していれば、当該被験物質を自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質として選択することができる。被験物質が細胞増殖量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の細胞増殖量と比較して５０％以下にさせる被験物質が好ましく、２５％以下にさせる被験物質がより好ましい。
　測定対象がＬ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化表面マーカーである場合、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化表面マーカーを測定すればよい。対象となる活性化表面マーカーは特に限定されず、例えばＣＤ１５４などが挙げられる。表面マーカーを測定する方法は特に限定されず、細胞表面マーカーを測定できる公知の方法（例えば、フローサイトメーターを用いる方法など）から適宜選択すればよい。
　また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程では、被験物質依存的な活性化表面マーカー量の変化を分析すればよい。本工程において、被験物質依存的な活性化表面マーカー量の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群における活性化表面マーカー量と比較して、被験物質を接触させた場合に活性化表面マーカー量が減少していれば、当該被験物質を自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質として選択することができる。被験物質が活性化表面マーカー量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の活性化表面マーカー量と比較して５０％以下にさせる被験物質が好ましく、２５％以下にさせる被験物質がより好ましい。
〔スクリーニングにより得られた物質を含有する医薬〕
　上記、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、自己免疫性関節炎の予防または治療薬の有効成分として有用である。したがって、本発明には、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質を有効成分とする自己免疫性関節炎の予防または治療用医薬が含まれる。
　本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質を、自己免疫性関節炎の予防または治療用医薬の有効成分として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記ＳＩＫ３の発現または機能を抑制する物質またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
　このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
〔フラグメントの利用〕
　本発明は、Ｌ２３ａのフラグメントを提供する。本発明のフラグメントは、上記本発明の判定方法において、Ｌ２３ａに対する抗体の検出およびＬ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出に用いることができる。また、本発明のフラグメントは、自己抗体非依存的に関節炎を惹起するＣＤ４陽性Ｔ細胞の解析、自己抗体非依存的に関節炎のメカニズム解析等の基礎研究に用いることができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔関節炎を引き起こすＴ細胞のＴ細胞受容体のクローニング〕
　制御性Ｔ細胞の特異的転写因子であるＦｏｘｐ３とＥＧＦＰとの融合蛋白質をコードする融合遺伝子をノックインしたｅｆｏｘマウスを作製した。ｅｆｏｘマウスは、制御性Ｔ細胞をＥＧＦＰのシグナルによって簡便に検出することができる。このｅｆｏｘマウスと、自己免疫性関節炎モデルマウスであるＳＫＧマウスとを掛け合わせて、ｅｆｏｘＳＫＧマウスを作製し、ＳＰＦ環境下で飼育した。ｅｆｏｘＳＫＧマウスは、約３か月間飼育後に関節炎を自然発症した。
　関節炎を発症したｅｆｏｘＳＫＧマウスの関節局所から、エフェクターＣＤ４陽性Ｔ細胞を分取した。具体的には、足関節から滑膜組織を分離して、Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＭ（ロシュ）含有ＲＰＭＩ１６４０にて３７℃１時間分解させた。その組織をナイロンメッシュに通し、単細胞浮遊液を調製した。Ｍｏｆｌｏ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒサイクロン装置を用いて、ＧＦＰ陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を９６ウェルＰＣＲプレート上に単一細胞分取した。そのプレートは使用まで－８０℃で保存した。
　分取したＧＦＰ陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の単一細胞からＴ細胞受容体をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法でクローニングした。具体的には、５μＬ／ウェルのリアクションミックス［100 mg/ mLゼラチン、0.1 % Triton X-100、4U/ mL RNAsin、125ng OligodT （プロメガ）、0.5mM dNTPs、5U/ mL Multiscribe RT enzyme、1xRT Buffer（High Throughput cDNA kit、アプライドバイオシステムズ）］を添加し、２５℃１０分間、３７℃２時間、８５℃５分間反応させて、逆転写を行った。反応液のうち２μＬずつをＴ細胞受容体α鎖、β鎖遺伝子の増幅に用いた。９５℃１分後、９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃３０秒を５サイクル、９５℃３０秒、５８℃１分、７２℃３０秒を３０サイクルの後、７２℃５分を行った後、より内側のプライマーを使用して同様のＰＣＲをもう一度行った。このクローニングしたＴ細胞受容体遺伝子を、Ｔ細胞受容体発現用レトロウイルスベクター（Lennon, G. P. et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity 31, 643-653, doi:10.1016/j.immuni.2009.07.008 (2009)）へサブクローニングした。α鎖はＭｆｅＩおよびＳｔｕＩ制限酵素認識部位、β鎖はＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を用いてサブクローニングした。約１５０個の単一細胞から、それぞれＴ細胞受容体遺伝子をクローニングした。
　作製したレトロウイルスベクターを用いて、レトロジェニックマウスを作製した。このベクタープラスミドを、Ｐｌａｔ－Ｅ細胞株へＦｕｇｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ （ロシュ）を用いて遺伝子導入した。４８時間後、７２時間後にレトロウイルスを含んだ上清を回収して、０．４５μｍフィルターに通してゴミを取り除いた。
　Ｔ細胞、Ｂ細胞を欠損し、ＳＫＧ変異を有するＲＡＧ２ノックアウトマウス（ＳＫＧマウスとＲＡＧ２ノックアウトマウスを掛け合わせて作製）へ１５０ｍｇ／ｋｇの５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌを腹腔内投与した。４日後に骨髄細胞を回収して、赤血球細胞を除いた。その後、ＩＬ－３（20ng/mL）、ＩＬ－６（40ng/mL）、ＳＣＦ（50ng/mL）（ペプロテック）の存在下で、２０％牛胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、２－ＭＥ添加ＤＭＥＭ溶液で骨髄細胞を２×１０６個／ｍＬの濃度で培養した。培養２日目、３日目に、前記レトロウイルス含有上清にＩＬ－３（20ng/mL）、ＩＬ－６（40ng/mL）、ＳＣＦ（50ng/mL）およびポリブレン（4μg/mL）を添加した培地に交換した後、７００ｇ、３２℃、９０分間遠心することにより、レトロウイルスを骨髄細胞へ感染させた。培養４日目に、その骨髄細胞を、６００ｒａｄ放射線照射したＲＡＧ２ノックアウトマウスへ静脈内注射した。１種類のレトロウイルスをそれぞれ感染させたレトロジェニックマウスを約３０種作製した。
　作製されたレトロジェニックマウスは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体として、レトロウイルスベクターによって導入、発現された単一ペアのＴ細胞受容体のみを発現する。各レトロジェニックマウスが関節炎を発症するかどうかを観察することにより、そのレトロジェニックマウスの持つＴ細胞受容体が関節炎惹起能を持つかどうかを検証することができる。
　作製したレトロジェニックマウスをＳＰＦ環境下で飼育し、関節炎を自然発症する個体を見出した。関節炎を発症したマウスの写真を図１（Ａ）および（Ｂ）に示した。さらに、当該マウスに感染させたレトロウイルスを解析し、関節炎惹起性Ｔ細胞受容体のアミノ酸配列を特定した（図２参照）。図２中「14D-3/DV8*03」、「40*01」、「10*01」および「2-1*01」と示された配列は、例えばデータベースＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ－ＤＢ（http://www.imgt.org/ligmdb/）から取得することができる。
〔関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原の同定〕
　上記により見出した関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原の候補の絞り込みを以下のように行った。
　まず、関節炎を起こすことを確認した上記のＴ細胞受容体遺伝子を、Ｔ細胞受容体を発現していない、Ｔ細胞株５ＫＣ－７３．８．２０へ、上記のレトロウイルスベクター含有上清を用いて同じ方法で遺伝子導入した。この細胞株は、Ｔ細胞受容体からの刺激によってＩＬ－２を産生することが知られている。次に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞から、ＭＡＣＳビーズ（ミルテニー社）により、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞を、ＭＡＣＳシステムで濃縮、回収し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製した。
　他方、関節炎を発症したＳＫＧマウス関節滑膜細胞の細胞破砕液を調製し、ＮＡＴＩＶＥ－ＰＡＧＥ法を用いて各バンドに分離し、各バンドを切り出してそれぞれに含まれるタンパク質を抽出した。
　上記のＴ細胞受容体遺伝子を導入したＴ細胞株（５×１０４個／ウェル）と上記抗原提示細胞（５×１０４個／ウェル）を、９６ウェルラウンドボトムプレートに播種し、上記各バンドから抽出したタンパク質を加えて共培養した。２４時間培養後、上清中のＩＬ－２濃度を、ＥＬＩＳＡ（ebioscience）を用いて測定した。ＩＬ－２濃度が有意に上昇したバンドを候補バンドとして選択した。
　候補バンドからの抽出タンパク質を質量分析に供し、その結果から複数の候補タンパク質を絞り込んだ。
　候補タンパク質について、それぞれ組み換えタンパク質を作製し、上記のＴ細胞株と抗原提示細胞の共培養系に添加して、関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原であるか否かをＩＬ－２濃度の上昇を指標に確認した。その結果、Ｌ２３ａ（60S ribosomal protein L23a）を添加したときに、ＩＬ－２濃度が上昇することを見出した。
〔Ｌ２３ａによる関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の活性化〕
　ヒトＬ２３ａをコードするＤＮＡ（配列番号２、ACCESSION:NM_000984）のコード領域を発現ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ１へ挿入した。この発現ベクターを大腸菌に導入し、ＬＢ培地を用いて３７℃で培養した。０．１ｍＭのＩＰＴＧ存在下、２５℃で５時間培養することによりタンパク質の発現を誘導した。その後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳを用いて細菌を溶解し、ソニケーションによりタンパク質を溶解させた。得られたタンパク質を、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ ｂｅａｄｓで精製し、組み換えＧＳＴ－Ｌ２３ａを得た。コントロールとして用いるＧＳＴの組み換えタンパク質は遺伝子導入していないｐＧＥＸ－６Ｐ１ベクターから同様の方法で作製した。
　上記のＴ細胞受容体遺伝子を導入したＴ細胞株、上記の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、組み換えＧＳＴ－Ｌ２３ａ、組み換えＧＳＴおよびマウス骨髄腫細胞（Ｂ細胞）株Ｐ３Ｕ１の細胞破砕液（ポジティブコントロール）を用い、以下の表１の試験群を設けた。各細胞を９６ウェルラウンドボトムプレートに播種し、試験物質を添加した培地を加えて２４時間培養後、上清中のＩＬ－２濃度を、ＥＬＩＳＡ（ebioscience）を用いて測定した。なお、本発明者は、本実験に先立って、今回クローニングした関節炎惹起性Ｔ細胞受容体がＰ３Ｕ１細胞破砕液に反応することを確認していたため、Ｐ３Ｕ１細胞破砕液をポジティブコントロールとして使用した。細胞破砕液は以下のように調製した。すなわち、１×１０７個の細胞を１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、液体窒素で凍結後融解した。続いて、ソニケーション３０秒を３回繰り返し、１５０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、上清を細胞破砕液として使用した。
　結果を図３に示した。図３から明らかなように、ＧＳＴ－Ｌ２３ａは濃度依存的に関節炎惹起性Ｔ細胞受容体を活性化することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔Ｌ２３ａの抗原フラグメントの同定〕
　Ｌ２３ａのアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、約２０アミノ酸残基からなる各種ペプチドを定法に従い合成した。上記のＴ細胞受容体遺伝子を導入したＴ細胞株、上記の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、合成した各種のペプチドおよび上記組み換えＧＳＴ－Ｌ２３ａ（Ｌ２３ａ全長）を用いて、上記と同様に、各細胞を９６ウェルラウンドボトムプレートに播種し、ペプチドまたはＧＳＴ－Ｌ２３ａを添加した培地を加えて２４時間培養後、上清中のＩＬ－２濃度を、ＥＬＩＳＡ（ebioscience）を用いて測定した。なお、ペプチドの濃度は５０μｇ／ｍＬ、ＧＳＴ－Ｌ２３ａの濃度は１００μｇ／ｍＬとした。
　図４に結果を示した。図４から明らかなように、Ｌ２３ａ７１－９０が顕著にＩＬ－２濃度を上昇させた。一方、Ｌ２３ａ６－２５はＩＬ－２濃度を上昇させなかった。図に示していないが、Ｌ２３ａ７１－９０以外のペプチドは、いずれもＬ２３ａ６－２５と同様の結果であった。この結果から、Ｌ２３ａの第７１位～第９０位のアミノ酸配列（LDHYAIIKFPLTTESAMKKI、配列番号３）からなるフラグメントが関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原であることが明らかとなった。
〔関節炎惹起性Ｔ細胞受容体発現レトロジェニックマウス血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕
　関節炎を発症したレトロジェニックマウス（Ｌ２３ａを認識する関節炎惹起性Ｔ細胞受容体発現レトロジェニックマウス）から採血し、血清を得た。
　Ｐ３Ｕ１細胞破砕液、組み換えＧＳＴ－Ｌ２３ａまたは組み換えＧＳＴ－ヒストン１．２を２ＭＥ含有サンプルバッファーに添加し、９５℃で５分間加熱した。１５％のポリアクリルアミドゲルを用いて２０ｍＡ７５分間電気泳動し、その後９０Ｖで３０分間、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Millipore）に転写した。転写した膜に２００倍希釈した血清を反応させ、洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ１抗体を２０００倍希釈で反応させた。洗浄後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて発色させ、ＬＡＳ－４０００ｍｉｎｉを用いて検出した。
　なお、ヒストンＨ１．２は、今回クローニングした関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原候補に含まれていたが、反応性がないことが確認されたタンパク質であり、マウスヒストンＨ１．２をコードするＤＮＡ（ACCESSION:NM_015786）のコード領域を発現ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ１へ挿入し、ＧＳＴ－Ｌ２３ａと同様の方法でＧＳＴタグを付加した組み換えタンパク質として調製した。
　結果を図５に示した。図５中、左側の矢印はＧＳＴ－Ｌ２３ａのバンドの位置を表し、右側の矢印は血清中の抗体が結合したＰ３Ｕ１細胞破砕液中のタンパク質の位置を表す。ＧＳＴ－ヒストン１．２に結合する抗体が存在しなかったことから、Ｌ２３ａを認識する関節炎惹起性Ｔ細胞受容体発現レトロジェニックマウスの血清中に、Ｌ２３ａを認識する抗体が多量に存在することが明らかとなった。
〔関節リウマチ患者血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕
　関節リウマチ患者３７４例、関節リウマチに罹患していない正常人８０例から血液を採取し、血清を得た。
　組み換えＧＳＴ－Ｌ２３ａまたは組み換えＧＳＴをＰＢＳに溶解し、２００ｎｇ／ｍＬの溶液を調製した。ＥＬＩＳＡ用ポリソーププレート（商品名、Nunc）のウェルにそれぞれ添加して、４℃で１６時間吸着させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１時間ブロッキングした。その後同様に５回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５００倍に希釈した血清を１００μＬずつ各ウェルに添加した。室温で２時間放置し、５回洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで４０００倍に希釈したもの）を添加し１時間室温で放置した。５回洗浄した後、ＴＭＢを加えて１５分後にＯＤ４５０ｎｍの値を測定した。ＧＳＴ－Ｌ２３ａのＯＤ値からＧＳＴのＯＤ値を引いた値をＬ２３ａに対する抗体のＯＤ値とした。
　結果を図６に示した。図中Ｃｏｎｔｒｏｌは正常人、ＲＡは関節リウマチ患者を表す。単位（Ｕ／ｍＬ）は、１例の陽性の血清を基準に任意に設定したものである。正常人の平均値の＋３ＳＤ以下（図中の破線以下）を正常値と判定し、それを超えるものを陽性と判定した。図６に示したように、正常人は８０例中１例のみが陽性であったが、関節リウマチ患者は３７４例中６４例が陽性であった。ｔ検定でｐ値が０．００１２と有意差を持っていた。
〔関節リウマチ患者の関節液中のＬ２３ａ反応性Ｔ細胞の検出〕
　関節リウマチ患者１名から関節液を採取した。健常人１名から血液を採取した。それぞれ関節液および血液から単核球を分離した。具体的には、関節液または血液にフィコールを加え、２２００ｒｐｍで２０分間遠心して単核球を分離、回収した。得られた単核球を１×１０６個／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、培地に組み換えＧＳＴまたは組み換えＧＳＴ－Ｌ２３ａを１００μｇ/ｍＬ添加して、２４時間培養した。培養終了６時間前にＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡを１μｇ／ｍＬとなるように加え、サイトカインの分泌を止めた。細胞を回収後、一般的なサイトカイン染色法によりＩＬ－１７ＡおよびＩＦＮ－γを染色し、フローサイトメーターで検出した。
　結果を図７に示した。関節リウマチ患者の関節液中にはＧＳＴ－Ｌ２３ａに反応して炎症性サイトカインであるＩＬ－１７ＡやＩＦＮ－γを分泌する細胞が検出された（右下）。一方、健常人の血液中にはＧＳＴ－Ｌ２３ａに反応して炎症性サイトカインを分泌する細胞は検出されなかった。
〔抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕
　抗ＣＣＰ抗体（抗環状シトルリン化ペプチド抗体）は、関節リウマチ患者において陽性率が９０％を超え、非常に感度の高い関節リウマチの診断マーカーとして広く用いられている。しかし、約１０％の関節リウマチ患者では陰性であることが知られている。
　そこで、抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者５９例から血液を採取して血清を得、上記〔関節リウマチ患者血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕に記載の方法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて、血清中の抗Ｌ２３ａ抗体を測定した。
　結果を図８に示した。正常値の上限は上記〔関節リウマチ患者血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕において設定した数値を採用した。図８に示したように、５９例中３２例（５４％）が陽性であった。抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者の過半数において抗Ｌ２３ａ抗体が検出されたことから、本発明の判定方法の有用性が示された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (12)

  1. 　自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法であって、被験者由来の試料中に存在する以下の（１）または（２）を検出することを特徴とする判定方法。
    （１）リボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体
    （２）リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞
  2. 　リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１に記載の判定方法。
  3. 　被験者が、抗ＣＣＰ抗体陰性であることを特徴とする請求項１または２に記載の判定方法。
  4. 　自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定するためのリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントの使用であって、リボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを用いてリボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体、またはリボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出することを特徴とする使用。
  5. 　リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項４に記載の使用。
  6. 　リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位～第９０位を含むことを特徴とする請求項４に記載の使用。
  7. 　自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法であって、リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、該Ｔ細胞にリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程、該Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程、該Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
  8. 　前記Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、該Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカイン、該Ｔ細胞の増殖、または該Ｔ細胞の活性化表面マーカーを測定することを特徴とする請求項７に記載のスクリーニング方法。
  9. 　リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項７または８に記載のスクリーニング方法。
  10. 　リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位～第９０位を含むことを特徴とする請求項７または８に記載のスクリーニング方法。
  11. 　リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示されるアミノ酸配列の少なくとも連続する５アミノ酸残基を含むことを特徴とするフラグメント。
  12. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位～第９０位を含むことを特徴とする請求項１１に記載のフラグメント。
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