WO2015007216A1 - 多肽、编码该多肽的dna分子、载体、制备方法及应用 - Google Patents

多肽、编码该多肽的dna分子、载体、制备方法及应用 Download PDF

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WO2015007216A1
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infection
seq
polypeptide
caused
amino acid
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PCT/CN2014/082341
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李文鑫
曹志贱
吴英亮
王泽胜
韩松
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武汉摩尔生物科技有限公司
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology, in particular to a polypeptide, a DNA molecule encoding the polypeptide, a carrier, a preparation method and an application thereof.
  • Bacterial infection is an acute systemic infection or local infection caused by pathogenic bacteria or conditional pathogens invading the blood circulation or local environment, producing toxins and other metabolites, clinically with chills, fever, rash, joint pain and liver. Splenomegaly is characteristic, and some may have septic shock and migratory lesions. Especially in the elderly, children, those with chronic diseases or immunocompromised, those who are not treated in time and have complications, can develop sepsis or sepsis.
  • pathogenic bacteria are Staphylococcus aureus, hemolytic streptococcus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, etc., can be caused by a single pathogen, or by a few Bacterial diseases form a mixed infection, so the broad spectrum of clinical drugs It is especially important.
  • Acne is also a non-specific infection that is common and frequently-occurring in adolescents and also occurs in middle age.
  • the clinical manifestations are whitehead acne, blackhead acne, inflammatory papules, secondary abscesses, carbuncles or nodules, pain, itching, and infection can leave scars, affecting appearance and physical and mental health.
  • many pathogenic factors and links play a key role in the occurrence, development and outcome of acne. The most important reason is the microbial action in the edulis and sebaceous gland units. The first is anaerobic acne propionate, followed by aerobic epidermis and Staphylococcus aureus. Bacterial infections are an important cause of acne.
  • Specific infection refers to tuberculosis, tetanus, gas gangrene, anthrax, pertussis, epidemic encephalomyelitis, gonorrhea, typhoid fever, bacterial dysentery, diphtheria, etc. are respectively caused by Mycobacterium tuberculosis, Clostridium tetani, Clostridium perforatum Unique lesions caused by bacteria, Bacillus anthracis, B. pertussis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella typhi, Shigella, and Corynebacterium diphtheriae. Specific infection is different from general infection in pathogenic bacteria, disease progression and treatment, which is the main content of infectious disease research.
  • Chronic refractory wounds are the collective name for wounds infected with bacteria in chronically difficult to heal wounds.
  • Chronic refractory wounds on the surface are caused by a series of traumas and diseases.
  • Long-term unhealed wounds on the surface of the body including traumatic ulcers, venous leg ulcers, compression ulcers, and diabetic ulcers. Because it occurs on the body surface, and has a long course of disease, large appearance, complications, and extremely expensive treatment costs, it has a major impact on the life and quality of patients and is an important issue that must be faced by modern society.
  • Eczema is an inflammatory reaction of the skin caused by a variety of complex internal and external factors, which has pleomorphic skin lesions and tends to ooze. The cause is complicated and difficult to determine. Conscious symptoms Itching is intense. The condition is easy to repeat, accompanied by secondary infection of bacteria, which can be delayed for many years.
  • bioactive antibacterial peptides have become the frontier science of antibiotic development in the international pharmaceutical industry.
  • more than 1,300 antibacterial peptides have been isolated and identified, and their common features are: small molecular weight (12-100 amino acid residues), and more Polycationic, amphiphilic construction.
  • These bioactive substances called peptide antibiotics, have been characterized by pure biological substances, strong stability, strong antibacterial activity, broad spectrum, no drug resistance, no toxic side effects and "three-way" action. It is the best alternative to existing antibiotics.
  • the antibacterial active polypeptide Ctryamp or its structural homologous polypeptide is a natural antibacterial peptide molecule obtained from Moscow T. porpoise.
  • the present invention provides a polypeptide, a DNA molecule encoding the polypeptide, a vector, a preparation method and application.
  • the antibacterial active polypeptide of the Vietnamese snails has a broad-spectrum and high-efficiency inhibitory effect on Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, anaerobic bacteria and clinically resistant pathogenic bacteria, and can promote Tissue repair and wound healing can be used to prepare drugs for treating or preventing non-specific infections caused by bacteria, anaerobic bacteria, especially resistant bacteria, drugs related to specific infections, and drugs for promoting tissue repair and wound healing.
  • the invention provides an additive (such as a cosmetic additive, a health supplement, a feed additive, etc.) for preventing bacterial infection and promoting tissue repair with a broad-spectrum antibacterial active polypeptide as an active ingredient, for preventing bacterial infection and promoting tissue repair. It has good antibacterial effect, promotes skin tissue repair and has no side effects.
  • an additive such as a cosmetic additive, a health supplement, a feed additive, etc.
  • the present invention provides the following technical solutions:
  • the present invention provides a polypeptide having any one of the amino acid sequences represented by (1) and ( ⁇ ): (I) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention discloses a group of homologous structural polypeptides of C. ternatus Ctryamp polypeptide, the sequence of which is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Ctryamp's mature peptide sequence FIRIARLLRIF
  • the secondary structure prediction was performed using the online NPS@ server [DSC method (Discrimination of protein Secondary structure Class)], and its secondary structure image was displayed using the software ATHEEPERT 2000.
  • DSC method Discrimination of protein Secondary structure Class
  • FIXJAX LXglF (Xj, X 2 and X 3 are any of the three basic amino acids of His, Arg and Lys X SEQ ID ⁇ : 1)
  • the sequence does not affect the characteristics of its amphipathic properties (Table 1). Accordingly, the present invention provides a set of homologous structural polypeptides of the C. ternatus Ctryamp polypeptide (SEQ ID ⁇ : 1).
  • the modification comprises amidation, phosphorylation, guanidation, acetylation, ubiquitination, glycosylation or carbonylation.
  • the modification is acetylation; in particular, the resulting polypeptide is modified to have an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO:52.
  • the substitution is substitution of one, two, three, four or five amino acids.
  • the substitution is one, it does not have the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO:21.
  • the resulting polypeptide is substituted with any one of the following amino acid sequences: having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:22;
  • the deletion is the deletion of 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids. More preferably, the deletion is the deletion of one or two amino acids. Further preferably, when the deletion is one, the deleted amino acid residue is not the fourth or ninth position.
  • the resulting polypeptide is deleted and has any one of the following amino acid sequences: having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:28;
  • one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine or ten amino acids are added.
  • the resulting polypeptide is added to have any one of the following amino acid sequences: having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36;
  • the polypeptide provided by the present invention has SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 to SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, and SEQ ID NO: 36 ⁇
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 20
  • SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 29
  • SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 34
  • SEQ ID NO: 36 The amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 45 or SEQ ID NO: 52.
  • the present invention specifically discloses a Vietnamese Trichodonma Ctryamp polypeptide having the sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the precursor tissue form of Ctryamp encodes a 68 amino acid residue consisting of three parts, a signal peptide (23 residues), a mature peptide (11 residues), and a precursor peptide (34 residues).
  • the signal peptide amino acid is in italics
  • the mature peptide amino acid is the shaded amino acid
  • the underlined partial amino acid is the C-terminal precursor peptide.
  • the present invention provides a Vietnamese Terry porpoise antibacterial peptide: FIRIARLLRIF (SEQ ID NO: 2).
  • the invention also provides the use of a polypeptide for the preparation of an antibacterial agent; the polypeptide has any one of the amino acid sequences shown by (1), ( ⁇ ):
  • the modification includes amidation, phosphorylation, thiolation, acetylation, ubiquitination, glycosylation or carbonylation; substitution is substituted for 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids; 1 , 2, 3, 4 or 5 amino acids; added as one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine or ten amino acids; It does not have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 53 or SEQ ID NO: 54.
  • the amino acid sequence of the polypeptide is as shown in SEQ ID NO: 2.
  • the antibacterial agent is used to inhibit bacteria.
  • the bacterium is a Gram-positive bacterium and/or a Gram-negative bacterium.
  • Antimicrobial results indicate that the synthetic peptide Ctryamp and its structural homologous peptides against the standard Gram-negative bacteria E. coli CCTCCAB94012 and the Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus
  • the growth of CCTCCAB94004 has an efficient inhibitory effect. At 6.25 g/mL, the inhibition rate of Ctryamp polypeptide and its structural homologous polypeptide can reach 100% for E. coli CCTCCAB94012, while at 6.25 g/mL, the inhibition rate for S. aureus CCTCCAB94004 can reach 100%. (Table 2 ).
  • Ctryamp polypeptide has a high inhibitory effect on the proliferation of Gram-negative bacteria, especially pathogenic Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa (Table 3).
  • the minimum inhibitory concentration of Ctryamp polypeptide on copper-aluminum-guaranteed bacilli is 8-16 g. /mL.
  • the antibacterial results also showed that the Ctryamp polypeptide has a high inhibitory effect on the proliferation of Gram-positive bacteria and the growth of anaerobic bacteria (Table 3).
  • the Gram-positive bacterium is Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Anaerobe or Corynebacterium.
  • Antimicrobial results indicate that synthetic Ctryamp peptides are resistant to clinically resistant bacteria (resistant to methicillin-resistant Staphylococcus aureus, methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci, erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes, penicillin-resistant and cephalosporins, and resistant to monoamide
  • the Gram-negative bacteria are Neisseria, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus or Haemophilus.
  • the invention also provides the use of a polypeptide for the preparation of a medicament for preventing and/or treating a bacterial infection disease and/or eczema; the polypeptide has any one of the amino acid sequences shown by (1), ( ⁇ ):
  • the modification includes amidation, phosphorylation, thiolation, acetylation, ubiquitination, glycosylation or carbonylation; substitution is substituted for 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids; 1 , 2, 3, 4 or 5 amino acids; added as one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine or ten amino acids; It does not have SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 53 or SEQ ID NO: 54.
  • the amino acid sequence of the polypeptide is set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the polypeptide is a Gram-positive and/or Gram-negative bacterium in the use of a medicament for the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of bacterial infections and/or eczema.
  • the use of the polypeptide in the preparation of a medicament for the prevention and/or treatment of a bacterial infection disease and/or eczema is a Gram-positive bacterium of the genus Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Branch Bacillus, anaerobic bacteria or Corynebacterium.
  • the use of the polypeptide in the preparation of a medicament for preventing and/or treating a bacterial infection disease and/or eczema is a Gram-negative bacterium belonging to the genus Neisseria, Enterobacteriaceae, and pseudomonad Genus, Acinetobacter, B. or Haemophilus.
  • the polypeptide is infected as a non-specific infection and/or a specific infection in the preparation of a medicament for the prevention and/or treatment of a bacterial infection disease and/or eczema.
  • the non-specific infection is sputum, sputum, erysipelas, acute lymphangitis, acute lymphadenitis, Gingival sulcus, purulent finger inflammation, finger-side suppurative tenosynovitis, typhus, deep palm infection, sepsis, bacteremia.
  • the specific infection is tuberculosis, tetanus, gas gangrene, anthrax, pertussis, prevalence Encephalomyelitis, gonorrhea, typhoid, bacterial dysentery or diphtheria.
  • the infection is caused by MRSA, MRCNS, erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes, ESBLs-producing Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa imipenem-resistant strain (IPM-R strain) Infection.
  • the infection is a local infection, a systemic infection or a toxinic disease caused by S. aureus.
  • the infection is a urinary system infection, sepsis or post-operative infection caused by coagulase-negative staphylococci.
  • the infection is suppurative inflammation caused by streptococcus, rheumatic fever and acute glomerulonephritis, scarlet fever, bacterial pneumonia, dental caries, subacute bacterial endocardium Inflammation or neonatal infection.
  • the infection is lobar pneumonia caused by S. pneumoniae, bronchitis, otitis media, meningitis, pleurisy, endocarditis or sepsis.
  • the infection is puerperal sepsis caused by Streptococcus agalactiae, neonatal meningitis, postpartum infection, bacteremia, endocarditis, skin and soft tissue infection or osteomyelitis.
  • the infection is a cardiovascular system infection or a urinary tract infection caused by Enterococcus.
  • the infection is a urinary tract infection caused by Enterococcus faecium, a suppurative abdominal infection, sepsis, endocarditis or diarrhea fever.
  • the infection is endocarditis, cholestasis, meningitis, urinary tract infection or wound infection caused by Enterococcus faecalis.
  • the infection is epidemic cerebrospinal meningitis caused by Neisseria meningitidis.
  • the infection is gonorrhea caused by Neisseria gonorrhoeae.
  • the infection is a urinary tract infection caused by Escherichia, a purulent infection outside the intestine, an intestinal infection, or hemorrhagic colitis.
  • the infection is a bacterial dysentery caused by Shigella.
  • the infection is typhoid and paratyphoid caused by Salmonella.
  • the infection is pneumonia caused by Klebsiella pneumoniae, bronchitis urinary tract infection, traumatic infection, meningitis or peritonitis.
  • the infection is an antibiotic-associated hemorrhagic colitis caused by K. acidophilus.
  • the infection is pneumonia or meningitis caused by citrate
  • the infection is a skin soft tissue infection, a urinary tract infection, a respiratory infection, an abdominal infection, a central nervous system infection, an eye infection, a wound infection, endocarditis or sepsis caused by Enterobacter cloacae;
  • the infection is pneumonia, urinary tract infection, bacteremia or post-operative infection caused by Serratia.
  • the infection is tetanus caused by Clostridium tetani. In other embodiments of the invention, the infection is a clinical infection such as gas gangrene or food poisoning caused by Clostridium perfringens.
  • the infection is an abdominal infection caused by a spore-free anaerobic bacteria, a female genital tract, a pelvic infection or bacteremia.
  • the infection is diphtheria caused by Corynebacterium diphtheriae.
  • the infection is acne, acne caused by Corynebacterium acne.
  • the infection is a wound infection caused by Pseudomonas aeruginosa, a local purulent infection such as a burnt tissue infection, a pulmonary infection, a urinary tract infection, otitis media, keratitis, meningitis or sepsis.
  • the infection is respiratory tract infection caused by Acinetobacter baumannii, bacteremia, urinary tract infection, secondary meningitis, surgical site infection, or ventilator-associated pneumonia.
  • the infection is a hundred cough caused by B. bacillus.
  • the infection is an infant and child bacterial disease caused by Haemophilus bacteria such as Haemophilus influenzae, acute bacterial meningitis, cellulitis, osteomyelitis or joint infection.
  • the infection is tuberculosis caused by M. tuberculosis. In other embodiments of the invention, the infection is a chronic, difficult to heal infected wound.
  • a polypeptide for the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of eczema.
  • the invention also provides the use of a polypeptide for the preparation of a medicament for promoting tissue repair and/or wound healing; the polypeptide has any one of the amino acid sequences shown by (1), ( ⁇ ):
  • the amino acid sequence of the polypeptide is set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the invention also provides the use of the polypeptide in the preparation of a medicament for treating burns, cold injuries, crush injuries, war wounds, animal bites, nuclear radiation wounds or combined injuries;
  • the polypeptide has amino acids represented by (1), ( ⁇ ) Any one of the sequences:
  • the modification includes amidation, phosphorylation, thiolation, acetylation, ubiquitination, glycosylation or carbonylation; substitution is substituted for 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids; 1 , 2, 3, 4 or 5 amino acids; added as one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine or ten amino acids; It does not have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 53 or SEQ ID NO: 54.
  • the amino acid sequence of the polypeptide is as shown in SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides a DNA molecule encoding the above polypeptide, which has any one of the nucleotide sequences shown by I and II:
  • I has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • nucleotide sequence obtained by modifying, substituting, deleting or adding one or more bases of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3.
  • the invention constructs a cDNA library of high-quality Vietnamese T. sinensis scorpion venom gland tissue, specifically includes isolation and mRNA purification of scorpion venom gland, first strand and second strand synthesis of cDNA, ligation and transformation of double-stranded cDNA and pSPORT1 vector, A sputum gland tissue cDNA library. On the basis of constructing the library, 3000 clones were randomly selected for sequencing.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the above DNA molecule.
  • the invention also provides a method for preparing a polypeptide, comprising the following steps:
  • (I) is: having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • ( ⁇ ) is: an amino acid sequence obtained by modifying, substituting, deleting or adding one or more amino acids of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1.
  • the DNA molecule is a method of preparing a polypeptide, and any one of the nucleotide sequences represented by I and II is:
  • I has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • nucleotide sequence obtained by modifying, substituting, deleting or adding one or more bases of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3.
  • the host cell is a prokaryotic host cell or a eukaryotic host cell.
  • the host cell of the prokaryotic system is Escherichia coli.
  • the present invention also provides a pharmaceutical preparation for treating wound infection and/or promoting healing of tissue repair, comprising a polypeptide and a pharmaceutically acceptable adjuvant; wherein the polypeptide has any of the amino acid sequences shown by (1) and ( ⁇ ) One:
  • the modification includes amidation, phosphorylation, thiolation, acetylation, ubiquitination, glycosylation or carbonylation; substitution is substituted for 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids; 1 , 2, 3, 4 or 5 amino acids; added as one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine or ten amino acids; It does not have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 53 or SEQ ID NO: 54.
  • the amino acid sequence of the polypeptide is as shown in SEQ ID NO: 2.
  • the polypeptide comprises from 0.01% to 1.5% by weight of the pharmaceutical formulation.
  • the excipient comprises hydroxypropionylcellulose, and the hydroxypropenylcellulose comprises 7.0% by mass of the pharmaceutical formulation.
  • the pharmaceutical preparation provided by the invention comprises 0.01-1.5% of polypeptide, 5% of glycerol, 7% of hydroxypropyl thioglycolate, 0.1% of glycolic acid, 0.1% of EDTA, and the balance is water. composition.
  • the pharmaceutical preparation provided by the present invention is a gel, a powder, an aerosol, a spray, a liniment, a film, a patch, a plaster, an ointment, a rubber paste, a liquid, a decoction, a granule, a tablet.
  • the invention also provides an application of the polypeptide in preparing a feed additive, a health care product additive, a food additive, a cosmetic additive;
  • the polypeptide has any one of the amino acid sequences shown by (1) and ( ⁇ ):
  • the modification includes amidation, phosphorylation, thiolation, acetylation, ubiquitination, glycosylation or carbonylation; substitution is substituted for 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids; 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids; added as adding 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids; and it does not have SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 53 or The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:54.
  • the amino acid sequence of the polypeptide is set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the present invention contemplates a polypeptide having any one of the amino acid sequences shown by (1), ( ⁇ ):
  • Ctryamp peptide against clinically resistant bacteria resistant to oxyxicillin, Staphylococcus aureus, methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci, erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes, penicillin-resistant and cephalosporins, monoamide-resistant, quinolone Classes, aminoglycosides, sulfonamides with cross-resistance ESBLs-producing Escherichia coli, and imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa (IPM-R strain) have potent inhibitory effects (Table 3).
  • Ctryamp polypeptides have potent inhibitory effects on bacteria that cause specific infections, including B. pertussis, Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Shigella, Salmonella typhi and Corynebacterium diphtheriae (Table 3).
  • the present invention also provides an external gel antibacterial preparation.
  • the antibacterial results indicate that the antibacterial preparation has high inhibitory effect on Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, anaerobic bacteria, and clinically resistant bacteria. Its minimal inhibitory concentration against the standard Gram-negative bacterium Escherichia coli CCTCCAB94012
  • the MIC of the MIC is 6.25 g/mL
  • the minimum inhibitory concentration MIC for the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus CCTCCAB94004 is 6.25 g/mL
  • the minimum inhibitory concentration MIC for the methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is 6.25.
  • Hubei Provincial People's Hospital burn orthopedics used Ctryamp peptide external antibacterial gel preparation of the invention to treat 22 patients with chronic eczema.
  • the experimental results show that the scorpion peptide antibacterial gel has a unique curative effect on eczema, the cure rate is 100%, clinical follow-up There was no recurrence, but the clinical symptoms of the experimental group were alleviated, but the follow-up recurred seriously.
  • the invention also provides a new effective agent for treating wound bacterial infection and acne and eczema prepared by using the active polypeptide of traditional Chinese herbal medicine as an active ingredient, and is used for treating wound bacterial infection, chronic refractory wound of body surface, acne , Eczema and promote tissue repair and wound healing, the treatment effect is remarkable.
  • the invention also relates to an additive for preventing bacterial infection and promoting tissue repair, which is used for preparing cosmetics, health care products, feeds, etc. for preventing bacterial infection and promoting tissue repair, and has the remarkable effects of preventing bacterial infection and promoting skin tissue repair.
  • the raw materials used in the invention are all active ingredients of traditional Chinese herbal medicines, and have no toxic and side effects, leaving no sequelae. This drug or additive can really achieve the effect of quick effect, no side effects, and no recurrence after curing.
  • the invention discloses a polypeptide, a DNA molecule encoding the polypeptide, a carrier, a preparation method and an application thereof, and those skilled in the art can learn from the contents of the paper and appropriately improve the process parameters. It is to be understood that all such alternatives and modifications are obvious to those skilled in the art and are considered to be included in the present invention.
  • the method and the application of the present invention have been described by the preferred embodiments, and it is obvious that the method and application described herein may be modified or appropriately modified and combined without departing from the scope of the present invention. The technique of the present invention is applied.
  • Example 1 Preparation of antibacterial active polypeptide gene of Vietnamese Terry Dolphin
  • Trizol LS-step method Trizol LS was purchased from Invitrogen, USA
  • 1 Take 500mg of appendix gland into a fine powder in liquid nitrogen, add 10mL TRIZOL reagent and mix, room temperature (20-25 ° C, the same below) for 5 minutes; 2 then add 2mL chloroform for 15 seconds, room temperature 2 3 minutes, centrifuge at 12000g for 15 minutes at 4°C; 3 take 1x volume of isopropanol from the aqueous phase, let stand for 10 minutes at room temperature, centrifuge at 12000g for 10 minutes at 4°C for RNA precipitation; 4precipitate with 5ml of 75% ethanol, centrifuge at 7500g 5 minutes; 5 RNA was dried and dissolved in DEPC treated water, and incubated at 55-60 ° C for 10 minutes to completely dissolve RNA.
  • RNA was added to 800 ⁇ of binding buffer containing 32 ⁇ ⁇ -mercaptoethanol.
  • 2 probe annealing Take 250 ⁇ concentration of Oligo (dT) 5 ⁇ , add distilled water to 5 ( ⁇ L; add 1.6mL preheated dilution buffer (dilution buffer has been added 32 L ⁇ -mercaptoethanol), mix with RNA, 70 Incubate for 5 minutes at ° C.
  • Magnetic Bead Activation Take 1.2 mL of magnetic beads SA-PMPS (purchased from Promega) in a 1.5 mL centrifuge tube; resuspend SA-PMPS with 0.5xSSC to magnetically adsorb the magnetic frame Beads, original volume 0.5xSSC wash SA-PMPS 3 times.
  • SA-PMPS purchased from Promega
  • RNA acquisition Mix the RNA incubated at 70 °C with SA-PMPS, place the magnetic beads on the magnetic rack for 5 minutes at room temperature, discard the supernatant; 2mL 0.5XSSC suspension magnetic beads, washing twice, the last time to remove SSC; add RNase-free dd3 ⁇ 40 to the magnetic beads, gently mix, then centrifuge (12000gx3 minutes) or magnetic frame to adsorb magnetic beads; take the supernatant, mRNA was obtained. The concentration and purity of mRNA were determined by electrophoresis and ultraviolet.5 Precipitation of mRNA: The mRNA obtained from 4 was added to glycogen and 2.5 volumes of absolute ethanol, and precipitated overnight, and mRNA was used for cDNA synthesis. C: First strand cDNA synthesis
  • reaction component (sample tube) was incubated at 37 ° C for 1 h, and then placed on water to terminate the reaction; 3 for the tracer tube, 43 L of 20 mM EDTA and 5 L of yeast tRNA were sequentially added, and after mixing, two portions were taken separately. ⁇ on two membranes, 1 part washed with 10% TCA 3 times, each time 5min, 95% ethanol wash once, air dried, put into 1.5mL scintillation liquid (for 1 # sample); After 1 part of air was dried, 1.5 mL of scintillation fluid (for 2 # sample) was placed.
  • Another 30 ⁇ tracer solution add 1.5 L 7.5M ammonium acetate (NH 4 Oac ) and 9 ( ⁇ L absolute ethanol ( -20 °C), mix and centrifuge at 14,000 rpm for 20 min, discard the supernatant, add 0.5 mL 70% Anhydrous ethanol (-20 ° C), centrifuged at 14,000 rpm for 2 min, discard the supernatant, dry at 37 ° C for 1 Omin to evaporate the ethanol, dissolve in 1 (L TEN solution, add 1 ⁇ 2 ⁇ loading buffer, take ⁇ For alkaline gel electrophoresis.
  • NH 4 Oac ammonium acetate
  • 9 ⁇ L absolute ethanol
  • Total volume 50 ⁇ G Removal of excess / 1 adaptor and small fragment in the double-stranded cDNA molecule The excess/I adaptor and the cleavage fragment were removed using a nucleon extraction and purification kit (Amersham, USA). 1 Resuspend the resin at room temperature, then add 600 ⁇ to the spin column, centrifuge at 2 000 rpm for 10 s, and remove the liquid. 40 ⁇ of the above cDNA solution was added to the center of the resin. Centrifuge as above; 2 Collect the eluent for the ligation reaction.
  • nucleotide sequence 3 ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttcctttttttctagttgt tttattattagcaatttcacaatcagaagcttttatcaggatcgccaggctcctcaggatctttggaaaagaagtat gagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaacta atggaaaattactgattatttttgaaaacta atggaaaattactgattattttgaaaaactattgaatataataatgttatctcttttgaaaaaaaaaaaaaaa
  • the precursor tissue form of Ctryam encodes 68 amino acid residues and consists of three parts, a signal peptide (23 residues), a mature peptide (11 residues) and a precursor peptide (34 residues). Accordingly, the present invention provides a Vietnamese trigeminal antibacterial peptide: FIRIARLLRIF (SEQ ID NO: 2).
  • FIRIARLLRIF SEQ ID NO: 2
  • the mature peptide sequence of Ctryamp (FIRIARLLRIF) shown in SEQ ID NO: 2 provided in Example 1 was predicted and utilized by the online NPS@ server [DSC method (Discrimination of protein Secondary structure Class)].
  • the software AHTHEPROT 2000 displays its secondary structure image. The results show that Ctryamp contains 100% ⁇ -Helix structure, has a typical amphiphilic ⁇ -Helix structure, and contains a large number of basic residues with a net positive charge (Arg).
  • Example 2 The peptide's amino acid sequence (FIXJAXsLLXglF, provided in Example 2) was artificially synthesized. Solid phase chemical synthesis obtained high purity Ctryamp polypeptides (as shown in Figures 2 and 3) and their homologous structural amphiphilic polypeptides (Table 1).
  • Example 4 Bacteriostatic Test of Ctryamp Polypeptide and Its Homologous Structure Amphiphilic Polypeptide The inhibition test of Gram-negative bacteria:
  • 96-well plate culture method 1 Pseudomonas aeruginosa (including standard strains, clinical isolates and drug-resistant strains), Escherichia coli (including standard strains CCTCC AB94012 and ATCC25922, clinical isolates and drug-resistant strains), Klebsiella pneumoniae, S.
  • the mL negative control and the positive control well were added with 20 ⁇ 1 liquid medium and 20 ⁇ 1 kanamycin (final concentration 2 ( ⁇ g/ml); after incubation at 37 °C for 12 hours, the 96-well plate was detected by microplate reader. The absorbance at the wavelength of 600 nm of each well; 3 After determining the minimum inhibitory concentration of the 10-fold dilution of the drug Ctryamp polypeptide and its homologous structure amphiphilic polypeptide, the minimum inhibitory concentration was diluted twice, and the top 12 of the repeated test was repeated. Step. Final determination of resistance Polypeptides and peptides Ctryamp amphiphilic polypeptide homology minimum inhibitory concentration of bacteria.
  • the Ctryamp polypeptide provided in Example 1 has an MIC of 8 g /ml against Pseudomonas aeruginosa, a MIC of 6.25-12.5 g/ml for Escherichia coli, and a MIC of 25 g/ml against Klebsiella pneumoniae,
  • the MIC of Juquansharay is 12.5 g/ml
  • the MIC for Salmonella is 12.5 g/ml
  • the MIC for Shigella is 6.25 g /ml
  • the MIC for Acinetobacter baumannii is 6.25 g /ml.
  • the MIC of Neisseria faecalis is 6.25 g/ml
  • the MIC for Neisseria gonorrhoeae is 6.25 g / ml
  • the MIC for B. citrate is 3.13 g/ml
  • the MIC for Haemophilus influenzae is 3.13 g. /ml.
  • the MIC for Proteus was 6.25 g/ml.
  • 96-well plate culture method 1 respectively, Staphylococcus aureus (including standard strain CCTCC)
  • Negative control and positive control wells were added with 20 ⁇ 1 liquid medium and 20 ⁇ 1 penicillin (final concentration 5 ( ⁇ g/ml); 2 37 ° After C-culture for 12 hours, the absorbance at 600 nm wavelength of each well in a 96-well plate was detected by a microplate reader; 3 After determining the minimum inhibitory concentration of the 10-fold dilution of the drug Ctryamp polypeptide and its homologous structural amphiphilic polypeptide, The minimum inhibitory concentration was subjected to a 2-fold equal dilution, and the first 12 steps of the experiment were repeated. The minimum inhibitory concentration of the antimicrobial peptide Ctryamp polypeptide and its homologous structural amphiphilic polypeptide against bacteria was finally determined.
  • Ctryamp polypeptide has a MIC of 3.13-12.5 g/ml for methicillin-sensitive coagulase-negative staphylococci, an MIC of 8-16 g/ml for hemolytic streptococcus, and a MIC against Corynebacterium diphtheriae Both were 3.13 g/ml, the MIC for Corynebacterium acne was 3.13 g/ml, and the MIC for Enterococcus was 6.25 g/ml.
  • Inhibition test for methicillin-resistant Staphylococcus :
  • Example 1 Ctryamp parent polypeptides and polypeptide structural homology provided (Example 2 provided), to a final concentration of lOO g / ml, 10 ⁇ ⁇ / ⁇ 1, 1 ⁇ ⁇ / ⁇ 1, 0.1 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 ⁇ negative control and positive control wells were added with 20 ⁇ 1 medium and 20 ⁇ 1 vancomycin (final concentration of 12 g / ml); after incubation at 2 37 °C for 12 hours, each tube in 96-well plate was measured with a microplate reader.
  • the Ctryamp polypeptide provided in Example 1 was diluted to a final concentration of 100 g/ml, 10 g/ml, ⁇ g/ml, O. ⁇ g/mL. Negative control and positive control wells were added to 20 ⁇ l liquid medium.
  • the MIC of Ctryamp polypeptide to Clostridium tetani is 25 g / ml
  • the MIC for Clostridium perfringens is 25 g / ml
  • the MIC for Bacteroides fragilis is 12.5 ⁇ .
  • Table 2 The minimum inhibitory concentration of Ctryamp polypeptide and its structural homologous polypeptide against standard Escherichia coli and Staphylococcus aureus MIC (g/ml) peptide name amino acid sequence Escherichia coli Staphylococcus aureus
  • Bacteria family
  • experimental bacteria family
  • property family
  • experiment minimum inhibitory concentration
  • strain degree
  • Example 4 1) The finished gelling agent provided in Example 4 was dissolved in sterilized physiological saline at a ratio of 1:49, and diluted in 10 concentrations, and placed in a 4 ° C water tank.
  • the 96-well plate was incubated on a shaker at 37 ° C, 250 rpm for 16 hours.
  • the 96-well plate was taken out, cooled to room temperature, and placed on a microplate reader to measure the absorbance at 630 nm.
  • aeruginosa is 8 g/mL (Ctryamp and its homologous structure amphiphilic synthetic peptide)
  • the MICs for MRSA and Pseudomonas aeruginosa were 6.25 g/mL, 8 g/mL, respectively, while the blank formulation had no antibacterial activity.
  • Staphylococcus aureus 6.25 methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 6.25 Pseudomonas aeruginosa (P. i/erag wo ⁇ X clinical isolate) 8 Clostridium perfringens (C. perfrimgens) 25
  • Example 4 The external administration of the Ctryamp polypeptide external gel (abbreviated as a purine peptide antibacterial gel) provided in Example 4 was applied externally. All wounds or ulcers were rubbed with a purine peptide antibacterial gel, thickness about 1-2 mm, once a day, or applied to the wound with a sputum peptide antibacterial gel infiltrated gauze, and changed every 3 times. Scrub wounds, shallow second degree burn wounds were first rinsed with 3% hydrogen peroxide solution, then rinsed with sterile saline to clean the wound surface.
  • a purine peptide antibacterial gel abbreviated as a purine peptide antibacterial gel
  • the wound was rinsed with sterile saline, 0.2% vital iodine disinfected the surrounding skin, and the wound was dried with a sterile cotton ball, and the antibacterial gel was applied to the wound surface with a thickness of about l-2 mm; Residual burn wounds, chronic ulcers of grade 2 diabetes, and specimens for bacterial culture, to understand the wound infection, debride according to the above method, firstly apply the sputum peptide antibacterial gel, wait for the granulation tissue to grow, point-like skin grafting, and then evenly coat Rubidin antibacterial gel, thickness about l-2mm, covered with mesh yarn, pressure bandage, first change dressing after 3 days.
  • FPG Fasting plasma glucose
  • the antibacterial gel protects the wound surface and has a thickness of about l-2 mm. After laser treatment, the physiological saline solution is used to clean the wound surface and directly apply the rubidin antibacterial gel directly, and the thickness is about l-2 mm.
  • Treatment in the control group All wounds or ulcers were gauze-wrapped after debridement, and after three days of treatment, the wounds were kept dry.
  • the clinical treatment results show that the topical gel provided by the invention can effectively prevent and treat bacterial infection, and can significantly promote wound healing and healing.
  • the scorpion peptide antibacterial gel has a high bactericidal effect on MRSA and Pseudomonas aeruginosa imipenem resistant strain (IPM-R strain), and has unique curative effect on chronic refractory wounds on the surface (82 cases in the treatment group) Eight cases of bacteria were cultured as MRSA infection, and 5 cases of bacteria were cultured as P. aeruginosa IPM-R strain, which was effective by antibacterial gel treatment with purine peptide. Table 5 Mean healing time and comparison of quinone peptide antibacterial gel and conventional dressing
  • Case selection All the patients were selected from the dermatology clinic of Wuhan University People's Hospital, and the clinically confirmed acne patients. Exclude those who have a history of allergies to clindamycin and quinolones, other anti-acne medications used within 15 days, severe liver and kidney dysfunction, and pregnant lactating women.
  • Experimental grouping 258 patients were divided into experimental group and control group by multi-center open parallel control observation method. Experimental group: 168 people, 76 males; 92 females, aged 20 to 38 years old. Control group: 90 people, 46 men: 44 women, age
  • control efficacy 168 cases in the experimental group, 112 cases were cured, accounting for 66.7%; 51 cases were markedly effective, accounting for 30.4%; 5 cases were effective, accounting for 2.98%; 0 cases were invalid, accounting for 0%; Effective 100%.
  • Control group 90 cases, 5 cases were cured, accounting for 5.6%; 14 cases were markedly effective, accounting for 15.6%; 20 cases were effective, accounting for 22.2%; 51 cases were ineffective, accounting for 4%; total effective rate was 43%.
  • the difference between the experimental group and the control group was highly significant, indicating that the whole group was better than the control group in treating acne.
  • Example 4 Hubei Provincial People's Hospital burns plastic surgery used in Example 4 provided by the peptide antibacterial gel preparation for the treatment of 22 patients with chronic eczema, once a day, 19 cases in the control group, treated with 1% hydrocortisone cream, one day For secondary external use, the clinical observation time was 2 weeks.
  • the experimental results showed that the scorpion peptide antibacterial gel had a unique curative effect on eczema, and the cure rate was 100%. There was no recurrence in clinical follow-up, but the clinical symptoms of the experimental control group were alleviated, but the follow-up recurrence was serious.
  • Example 9 Bacteriostatic Test of Ctryamp Polypeptide Mutants
  • Ctryamp polypeptide mutants The amino acid sequence information of each Ctryamp polypeptide mutant is shown in SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 52 in the sequence listing, and the mutation types are shown in Table 6. These Ctryamp polypeptide mutants were all synthesized by Jill Biochemical Co., Ltd.
  • Standard strains Staphylococcus aureus (RA) ATCC25923 and E. coli ATCC25922; Ampicillin (Amp).
  • MH medium beef powder 2.0 g, soluble starch 1.5 g, acid hydrolyzed casein 17.5 g, pure water 1 L, autoclaved at 121 ° C for 20 minutes, spare.
  • Inoculation Take the standard strains Staphylococcus aureus (RA) ATCC25923 and Escherichia coli (E.Coli" ATCC25922 ⁇ , inoculate into 10 mL MH medium, and incubate at 37 ° C, 250 rpm overnight. 16h.
  • Transfer Take the overnight culture of the standard strains Staphylococcus aureus (RA) ATCC25923 and Escherichia coli (E.Coli" ATCC25922, 100 L, and transfer to 10 mL of fresh MH medium. , cultured at 37 ° C, 250 rpm for 2 h.
  • the concentration of the body is the minimum inhibitory concentration (MIC) of the bacteria.
  • Ctryamp polypeptide mutant 7 FIKIGKILKIF SEQ ID NO:27 5-point mutation (substitution)
  • Ctryamp polypeptide mutant 32 Ac-FIRIARLLRIF SEQ ID NO: 52 N-terminal Phe residue acetylation Note: Ctryamp polypeptide mutant 32 corresponding amino acid sequence ⁇ >J "Ac-FIRIARLLRIF ' indicates
  • FIRIARLLRIF the amino group at the N-terminal Phe residue is modified by acetyl; Table 7 Minimum inhibitory concentration of Ctryamp polypeptide mutant against standard strains of Staphylococcus aureus (RA) ATCC25923 and Escherichia coli (Co/) ATCC25922
  • the MIC of the Ctryamp polypeptide mutant is >25 g/mL, which means greater than or equal to 5 ( ⁇ g/ml, indicating that the antibacterial activity is weak or has no antibacterial activity, that is, there is no clinical application value.
  • mutant 2 of Ctryam polypeptide to mutant of Ctryamp polypeptide 9 mutant 12 of Ctryamp polypeptide, mutant 16 of Ctryamp polypeptide to mutant 25 of Ctryamp polypeptide, mutant 32 of Ctryamp polypeptide, Both produced significant inhibition against Staphylococcus aureus (RA) ATCC25923 and/or E. coli ATCC25922, while mutants of Ctryamp polypeptide 1, 10, 11, 13, 14, 15, and 26 31 had a weak antibacterial activity against S. aureus and Escherichia coli (MIC > 25 g/mL) or no antibacterial activity.
  • RA Staphylococcus aureus
  • the experimental results indicate that after the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID: 1 is substituted, deleted, added or modified with one or more amino acids, some of them still have biological activity, and some have weak or no antibacterial activity. active.
  • the Ctryamp polypeptide mutant still has an antibacterial activity
  • the polypeptide having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is substituted with 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids, and the substituted amino acid When the number is 1, the polypeptide having no amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 21 has an antibacterial activity
  • the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is deleted by 1 or 2 amino acids, and when it is deleted When it is 1 amino acid, the deleted amino acid residue cannot be the fourth or ninth position, and the polypeptide having no amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31 still has antibacterial activity
  • ⁇ When the number of amino acids added to the N-terminus of the polypeptide of the amino acid sequence shown in 1 is 1-5, the polypeptide still has antibacterial activity; the Ctryamp polypeptide mutant is amidated, phosphorylated, thiolated, acetylated, ubiquitin After the modification, glycosylation or tracing
  • the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 has no antibacterial activity.
  • SEQ ID When the number of amino acids substituted in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is one, the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 has no antibacterial activity.
  • SEQ ID When the number of amino acids deleted in the amino acid sequence indicated by NO:l is 3, 4 or 5, the biological activity is affected. When the deletion is 1, the deleted amino acid residue cannot be the fourth position or The ninth position does not have the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31.
  • the number of the N-terminal addition of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 When the number of the N-terminal addition of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 6 to 11, the biological activity thereof is affected. Comparative Example 1 Antibacterial activity of existing polypeptides
  • MIC was 5 ( ⁇ g/mL ), such as Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, etc.
  • BmKAMPl -M SEQ ID NO: 6
  • MIC is 5 ( ⁇ g/mL)
  • bacteriostatic effect of monocytogenes is poor (MIC is 5 ( ⁇ g/mL), which has no clinical value.
  • Ctryamp polypeptide (SEQ ID NO: 2) has the broadest antibacterial spectrum, not only for Staphylococcus aureus, Escherichia coli The bacteria and Pseudomonas aeruginosa have strong antibacterial activity, and also have high antibacterial activity against several Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria and specific infectious pathogens, showing significant differences with SEQ. ID NO: 4, clinical use value of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. Meanwhile, the present inventors have also found that Ctryamp polypeptide (SEQ ID NO: 2) also has a unique therapeutic effect on eczema.
  • the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence obtained by modifying, substituting, deleting or adding one or several amino acids provided by the present invention have high antibacterial activity and antibacterial activity.
  • Wide spectrum of features; high activity against a variety of bacteria (pathogenic bacteria), prevention and treatment of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, multi-drug resistant infections, and prevention and treatment Specific infections (infectious diseases) and eczema caused by specific pathogens have a unique role.
  • Table 8 Comparison of minimum inhibitory concentrations of existing peptides
  • Lys lie Ala Lys Leu Leu Lys lie Phe 1 5 10

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Abstract

本发明公开了一种多肽、编码该多肽的DNA分子、载体、所述多肽的制备方法及应用。所述多肽具有（Ⅰ）或（Ⅱ）所示的氨基酸序列：（Ⅰ）具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；（Ⅱ）具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。所述多肽可用于制备治疗或预防细菌导致的感染的药物和促进组织修复和伤口愈合的药物。

Description

多肽、 编码该多肽的 DNA分子、 栽体、 制备方法及应用
本申请要求于 2013 年 07 月 17 日提交中国专利局、 申请号为 201310300278.6、 发明名称为 "多肽、 编码该多肽的 DNA分子、 载体、 制备方法及应用"的中国专利申请和 2014年 07月 10 日提交到中国专利 局、 申请号为 201410327573.5、 发明名称为 "多肽、 编码该多肽的 DNA 分子、 载体、 制备方法及应用" 的中国专利申请的优先权， 其全部内容通 过引用结合在本申请中。 技术领域
本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种多肽、 编码该多肽的 DNA 分子、 载体、 制备方法及应用。 H
在各类创伤中， 无论是烧伤、 冷伤、 挤压伤、 战创伤、 动物咬伤、 核 放射伤、及复合伤等各类创伤， 还是开放伤或闭合伤的临床治疗中， 防治 感染和促进组织修复和创伤愈合始终是创伤治疗中的永恒的主题。
细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环或局部环境中生长繁殖， 产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染或局部感染，临床上以 寒战、 高热、 皮疹、 关节痛及肝脾肿大为特征， 部分可有感染性休克和迁 徙性病灶。 尤其是老人、 儿童、 有慢性病或免疫功能低下者、 治疗不及时 有并发症者， 可发展为败血症或者脓毒血症。
人体感染的致病菌或条件致病菌种类很多，可侵入人体不同部位的组 织器官， 引起局部组织或全身炎症反应及多种病变。
在非特异性的感染中，也就是化脓性感染中，常见的有疖、痈、丹毒、 急性淋巴管炎、 急性淋巴结炎、 曱沟炎、 脓性指头炎、 手指侧化脓性腱鞘 炎、 滑嚢炎、 掌深间隙感染、 脓血症、 菌血症等， 致病菌有金黄色葡萄球 菌、 溶血性链球菌、 大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌等， 可由单一病菌导致感 染，也可以由几种细菌共同致病形成混合感染，所以临床用药的广谱性显 得特别重要。
痤疮也是一种非特异性感染， 为青少年常见病、 多发病， 中年亦有发 生。 临床表现为白头痤疮、 黑头痤疮、 炎性丘疹、 继发性脓疮、 嚢肿或结 节、 发痛、 发痒如若感染可留下疤痕， 影响容颜和身心健康。 现己知许多 发病因素及环节在痤疮发生、发展及转归中起关键作用。其中最为重要的 原因是毛嚢及皮脂腺单位中的微生物作用， 首先是厌氧的丙酸痤疮杆菌， 其次为需氧的表皮及金黄色葡萄球菌等优势化脓菌。细菌感染在痤疮的发 生中是重要发病因素。
特异性感染是指结核、 破伤风、 气性坏疽、 炭疽、 百日咳、 流行性脑 脊髓炎、 淋病、 伤寒、 细菌性痢疾、 白喉等是分别由结核杆菌、 破伤风梭 菌、 产气荚膜梭菌、 炭疽杆菌、 百日咳鲍特菌、 脑膜炎奈瑟菌、 淋病奈瑟 菌、 伤寒沙门氏菌、 志贺氏菌、 白喉棒状杆菌引起的独特病变。 特异性感 染在致病菌、病程演变及治疗等方面与一般的感染不同，这是传染病学研 究的主要内容。
促进伤口愈合，是创伤学中与抗感染同样重要的二大问题之一。近年 来，现代细胞生物学和分子生物学研究的介入，及大量的实验观察到了创 伤愈合过程中的细胞活动及其影响因素，认为多种生长因子参与调控创伤 愈合过程， 其可能的机理也十分复杂。
慢性难愈合感染创面，是体表慢性难愈合创面中感染了细菌的创面的 统称。体表慢性难愈合创面， 是一种由系列创伤和疾病所致。发生在体表 的长期未愈合的创面， 主要包括创伤性溃疡、 下肢静脉性溃疡、压迫性溃 疡以及糖尿病溃疡。 由于发生在体表， 且病程长， 外观影响大、 并发症多 及治疗费用极其昂贵等特点， 因此对患者生活和质量产生重大影响，是现 代社会必须面对的重要问题。
在体表慢性难愈合创面中有 87%的创面有细菌感染， 主要为金黄色 葡萄球菌， 铜绿假单胞菌和大肠埃希菌。 由于患者治疗时间长， 其创面细 菌很大部分产生了不同程度的耐药性， 特别是难愈合创面感染 MRSA、 MRCNS、 耐红霉素化脓性链球菌、 产 ESBLs大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌 亚胺培南耐药株（IPM-R株)时， 由于临床缺乏有效的治疗药物， 可能会 给病人造成截肢的严重后果。
湿疹（ eczema )是由多种复杂的内、 外因素引起的一种具有多形性皮 损伤和易有渗出倾向的皮肤炎症性反应，病因复杂多难以确定。 自觉症状 瘙痒剧烈。 病情易反复， 并伴有细菌的继发感染， 可迁延多年不愈。
就防治伤口感染而言，常用药物是抗生素，但抗生素滥用所致病原菌 的耐药性已使许多创伤无药可用， 导致病人出现脓血症、 菌血症、 其他器 官严重损伤的全身感染，或在体表形成慢性难愈合感染创面。抗生素耐药 性问题已成为全球关注的焦点。耐药菌另一个危害是可以在不同地区、 国 家之间的人群之间传播。肺炎链球菌是引起细菌性肺炎的常见病源菌，近 年来肺炎链球菌对抗生素耐药性呈上升趋势，并已出现多重耐药菌株，是 临床感染控制中棘手的难题。当前许多抗细菌感染治疗药物大部分疗效不 佳是由于耐药细菌特别是耐曱氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA )感染所导 致。 因此， 急需发现新的抗菌物质。
近年来，生物活性抗菌肽的研究已成为国际药学界抗生素发展的前沿 科学， 目前已经有 1300多种抗菌肽被分离鉴定， 其共同特点为： 分子量 小 （12-100个氨基酸残基）、 多聚阳离子型、 两亲建构。 这些被称为肽类 抗生素的生物活性物质， 因为具有纯生物物质、稳定性强、 抗菌力强、 广 谱、 无抗药耐药性、 无毒副作用和"三致"作用特点， 已被认为是现有抗生 素的最佳替代品。抗菌活性多肽 Ctryamp或其结构同源多肽是从西藏特里 豚蝎获得的天然抗菌肽分子， 由于产生机制、杀菌机制和作用方式与传统 抗生素不同， 可很快杀灭微生物 （包括使用由传统抗生素产生的耐药菌） 而自身不产生耐药性， 且肽水解后的氨基酸有利于皮肤组织的生成。 发明内容
有鉴于此， 本发明提供一种多肽、 编码该多肽的 DNA分子、 载体、 制备方法及应用。该西藏特里豚蝎抗菌活性多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏 阴性菌、厌氧菌、 临床耐药病原菌均具有广谱高效抑制作用， 同时能促进 组织修复与创面愈合，可用于制备治疗或预防细菌、厌氧菌特别是耐药细 菌导致的非特异性感染、特异性感染的相关疾病的药物与促进组织修复和 伤口愈合的药物。本发明提供的以广谱抗菌活性多肽为有效成分的预防细 菌感染与促进组织修复的添加剂（如化妆品添加剂、保健品添加剂、饲料 添加剂等）， 用于预防细菌感染与促进组织修复。 预防细菌感染效果好、 促进皮肤组织修复佳、 无副作用。
为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案：
本发明提换了一种多肽， 其具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任意 一个： ( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
本发明公开了一组西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽的同源结构多肽，其序 列为 SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列。 根据 Ctryamp 的成熟肽序列 ( FIRIARLLRIF ), 使用在线 NPS@ server [ DSC 法（Discrimination of protein Secondary structure Class ) ]对其进行二级结构预测， 并利用软件 AHTHEPROT 2000显示其二级结构图像。 结果表明， Ctryamp含有 100% 的 α-Helix结构， 具有典型的两亲性（ amphiphilic ) α-Helix结构， 含有大 量带净正电荷的碱性残基（ Arg )。根据多肽序列的螺旋图，然后对 Ctryamp 多肽序列 FIRIARLLRIF进行大量点突变， 发现 FIXJAX LXglF ( Xj , X2和 X3为 His、 Arg和 Lys的 3个碱性氨基酸中任意一个氨基酸 X SEQ ID ΝΟ:1 )序列并不影响其双亲性的特征（表 1 )。 因此， 本发明提供了一组 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽的同源结构多肽（ SEQ ID ΝΟ:1 )。
在本发明的一些实施例中， 修饰包括酰胺化、磷酸化、 曱基化、 乙酰 化、 泛素化、 糖基化或羰基化。
在本发明的另外一些实施例中，修饰为乙酰化； 具体地， 修饰所得多 肽具有如 SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
作为优选， 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。 当取代为 1个时， 不具有如 SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
更为优选地， 取代所得多肽具有下述氨基酸序列中的任意一个： 具有如 SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
作为优选， 缺失为缺失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。 更为 优选地，缺失为缺失 1个或 2个氨基酸。进一步优选地，当缺失为 1个时， 缺失的氨基酸残基不为第四位或第九位。
更为优选地， 缺失所得多肽具有下述氨基酸序列中的任意一个： 具有 SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
作为优选， 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8 个、 9个或 10氨基酸。 当添加为添加在具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸 序列的多肽的 N端时， 优选为添加 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。
更为优选地， 添加所得多肽具有下述氨基酸序列中的任意一个： 具有 SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；
具有 SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列； 具有 SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
作为优选， 其不具有 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6或 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨基酸序列。
作为优选，本发明提供的多肽具有 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:7 ~ SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO : 22 ~ SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO:36 ~ SEQ ID NO:45或 SEQ ID NO:52中任意一个所示的氨基酸序列。
本发明具体公开了一种西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽， 其序列为 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。 Ctryamp的前体组织形式编码 68个氨基酸 残基， 由三个部分组成， 即信号肽（23个残基）、 成熟肽（11个残基）和 前体肽（34个残基）。 如图 1所示， cDNA序列下方为推断的对应氨基酸 序列； 信号肽氨基酸以斜体标记； 成熟肽氨基酸为阴影部分氨基酸； 下划 线部分氨基酸为 C端前体肽。 因此， 本发明提供一个西藏特里豚蝎抗菌 肽： FIRIARLLRIF ( SEQ ID NO:2 )。
本发明还提供了多肽在制备抗菌剂中的应用； 多肽具有（1 )、 （Π )所 示的氨基酸序列中任意一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
在本明的一些实施例中， 抗菌剂用于抑制细菌。
在本发明的一些实施例中，细菌为革兰氏阳性菌和 /或革兰氏阴性菌。 抗菌结果表明合成多肽 Ctryamp及其结构同源多肽对标准的革兰氏 阴性细菌大肠杆菌 CCTCCAB94012 和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌 CCTCCAB94004 的生长具有高效抑制作用。 在 6.25 g/mL 时， Ctryamp 多肽及其结构同源多肽对大肠杆菌 CCTCCAB94012的抑制率就可以达到 100%, 而在 6.25 g/mL时，对金黄色葡萄球菌 CCTCCAB94004的抑制率 就可以达到 100% (表 2 )。 Ctryamp多肽对革兰氏阴性菌， 特别是致病性 大肠杆菌和铜绿假单胞菌增殖具有高效抑制作用（表 3 ), Ctryamp多肽对 铜铝价担保杆菌的最小抑菌浓度为 8-16 g/mL。 抗菌结果还表明 Ctryamp 多肽对革兰氏阳性细菌的增殖、 厌氧菌的生长具有高效抑制作用 （表 3 )。
在本发明的一些实施例中， 革兰氏阳性菌为葡萄球菌属、 链球菌属、 肠球菌属、 分枝杆菌属、 厌氧细菌或棒状杆菌属。 抗菌结果表明合成 Ctryamp多肽对临床耐药细菌（耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、 耐曱氧西林 凝固酶阴性葡萄球菌、耐红霉素化脓性链球菌、耐青霉素类和头孢类， 耐 单酰胺类， 对喹诺酮类、 氨基糖苷类、 磺胺类有交叉耐药的产 ESBLs大 肠埃希菌、 耐亚胺培南的铜绿假单胞菌 （IPM-R株））具有高效抑制作用 (表 3 )。
抗菌结果表明化学合成 Ctryamp多肽对引起特异性感染的细菌（包括 百日咳鲍特菌、 破伤风梭菌、 产气荚膜梭菌、 志贺氏菌、 伤寒沙门菌和白 喉棒状杆菌）具有高效抑制作用 （表 3 )。
在本发明的另一些实施例中，革兰氏阴性菌为奈瑟菌属、肠道杆菌科、 假单胞菌属、 不动杆菌属、 鲍特菌属或嗜血杆菌属。
本发明还提供了多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病和 /或湿疹 的药物中的应用； 多肽具有（1 )、 （Π)所示的氨基酸序列中任意一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5,、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中细菌为革兰氏阳性菌和 /或革兰氏阴性菌。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中革兰氏阳性菌为葡萄球菌属、 链球菌属、 肠 球菌属、 分枝杆菌属、 厌氧细菌或棒状杆菌属。
在本发明的另一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾 病和 /或湿疹的药物中的应用中革兰氏阴性菌为奈瑟菌属、 肠道杆菌科、 假单胞菌属、 不动杆菌属、 鲍特菌属或嗜血杆菌属。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中感染为非特异性感染和 /或特异性感染。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中， 非特异性感染为疖、 痈、 丹毒、 急性淋巴 管炎、 急性淋巴结炎、 曱沟炎、 脓性指头炎、 手指侧化脓性腱鞘炎、 滑嚢 炎、 掌深间隙感染、 脓血症、 菌血症。
在本发明的一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗细菌感染疾病 和 /或湿疹的药物中的应用中， 特异性感染为结核、 破伤风、 气性坏疽、 炭疽、 百日咳、 流行性脑脊髓炎、 淋病、 伤寒、 细菌性痢疾或白喉。
在本发明的一些实施例中， 感染为 MRSA、 MRCNS、 耐红霉素化脓 性链球菌、产 ESBLs大肠埃希菌、铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株（IPM-R 株） 引起的感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为金黄色葡萄球菌引起的局部感 染、 全身感染或毒素性疾病。
在本发明的另一些实施例中，感染为凝固酶阴性葡萄球菌引起的泌尿 系统感染、 败血症或术后感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为链球菌引起的化脓性炎症、风湿 热与急性肾小球肾炎、 猩红热、 细菌性肺炎、 龋齿、 亚急性细菌性心内膜 炎或新生儿感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为肺炎链球菌引起的大叶性肺炎、 气管炎、 中耳炎、 脑膜炎、 胸膜炎、 心内膜炎或败血症。
在本发明的另一些实施例中，感染为无乳链球菌引起的孕妇产褥期脓 毒血症、 新生儿脑膜炎、 产后感染、 菌血症、 心内膜炎、 皮肤和软组织感 染或骨髓炎。
在本发明的另一些实施例中 ,感染为肠球菌引起的心血管系统感染或 尿路感染。
在本发明的另一些实施例中，感染为屎肠球菌引起的尿路感染、化脓 性腹部感染、 败血症、 心内膜炎或腹泻发烧。
在本发明的另一些实施例中，感染为粪肠球菌引起的心内膜炎，胆嚢 炎， 脑膜炎， 尿路感染或伤口感染。
在本发明的另一些实施例中 ,感染为脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊 髓炎。
在本发明的另一些实施例中， 感染为淋病奈瑟菌引起的淋病。
在本发明的另一些实施例中，感染为埃希菌引起的泌尿系统感染、肠 道外的化脓性感染、 肠道感染或出血性结肠炎。
在本发明的另一些实施例中， 感染为志贺氏菌引起的细菌性痢疾。 在本发明的另一些实施例中， 感染为沙门菌引起的伤寒与副伤寒。 在本发明的另一些实施例中，感染为肺炎克雷伯菌引起的肺炎、支气 管炎泌尿道感染、 创伤感染、 脑膜炎或腹膜炎。
在本发明的另一些实施例中，感染为产酸克雷伯菌引起的抗生素相关 性出血性结肠炎。
在本发明的另一些实施例中， 感染为枸橼酸杆菌引起的肺炎或脑膜 炎；
在本发明的另一些实施例中，感染为阴沟肠杆菌引起的皮肤软组织感 染、泌尿道感染、呼吸道感染、腹部感染、 中枢神经系统感染、 眼部感染、 伤口感染、 心内膜炎或败血症； 在本发明的另一些实施例中，感染为沙雷菌引起的肺炎、泌尿道感染、 菌血症或手术后感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为破伤风梭菌引起的破伤风。 在本发明的另一些实施例中，感染为产气荚膜梭菌引起的气性坏疽或 食物中毒等临床感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为无芽孢厌氧菌引起的腹部感染、 女性生殖道、 盆腔感染或菌血症。
在本发明的另一些实施例中， 感染为白喉棒状杆菌引起的白喉。 在本发明的另一些实施例中，感染为痤疮棒状杆菌引起的痤疮、粉刺。 在本发明的另一些实施例中， 感染为铜绿假单胞菌引起的伤口感染、 烧伤组织感染等局部化脓性感染、 肺部感染、 泌尿道感染、 中耳炎、 角膜 炎、 心膜炎或败血症。
在本发明的另一些实施例中， 感染为鲍曼不动杆菌引起的呼吸道感 染、 菌血症、 泌尿系感染、 继发性脑膜炎、 手术部位感染或呼吸机相关性 肺炎。
在本发明的另一些实施例中， 感染为百曰咳鲍特菌引起的百曰咳。 在本发明的另一些实施例中，感染为流感嗜血杆菌等嗜血杆菌属细菌 引起的婴儿及孩童菌血病症、 急性细菌性脑膜炎、蜂窝组织炎、 骨髓炎或 关节感染。
在本发明的另一些实施例中， 感染为结核分枝杆菌引起的结核病。 在本发明的另一些实施例中， 感染为慢性难愈合感染创面。
在本发明的另一些实施例中， 多肽在制备预防和 /或治疗湿疹的药物 中的应用。
本发明还提供了多肽在制备促进组织修复和 /或伤口愈合的药物中的 应用； 多肽具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任意一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列； 其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了多肽在制备治疗烧伤、 冷伤、 挤压伤、 战创伤、 动物 咬伤、 核放射伤或复合伤的药物中的应用； 多肽具有（1 )、 （Π )所示的氨 基酸序列中任意一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种编码上述多肽的 DNA分子， 其具有 I 、 II所示 的核苷酸序列中任意一个：
I 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
II 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加 一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
本发明构建高质量西藏特里豚蝎毒腺组织 cDNA文库， 具体包括蝎 毒腺总 RNA的分离和 mRNA纯化 , cDNA的第一链和第二链合成 , 双链 cDNA与 pSPORTl载体的连接和转化， 获得蝎毒腺组织 cDNA文库。 在 构建文库的基础上，随机挑选 3000克隆子进行测序，序列分析发现第 2007 克隆子为一个新的西藏特里豚蝎抗菌肽基因， 命名为 Ctryamp, 其序列为 SEQ ID NO:3 所 示 的 核 苷 酸 序 列 ： ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgt tttattattagcaatttcacaatcagaagcttttatcaggatcgccaggctcctcaggatctttggaaaaagaagtat gagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaacta atggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaa (图 1 )。
本发明还提供了一种重组载体， 其含有上述 DNA分子。
本发明还提供了一种多肽的制备方法， 包括以下步骤：
获得具有编码如（ I )或（11 )所限定的氨基酸序列的 DNA分子； 取 DNA分子与表达载体融合， 构建重组表达载体；
取重组表达载体转入宿主细胞， 获得转化体；
诱导转化体表达蛋白， 经分离纯化， 即得；
其中（ I )为： 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
( Π )为： 具有 SEQ ID NO: l所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或 添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中， 多肽的制备方法中 DNA分子为具有 I、 II所示的核苷酸序列中任意一个：
I 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
II 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加 一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为原核系统宿主细胞或真核宿主 细胞。
作为优选， 原核系统宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了一种治疗创面感染和 /或促进组织修复愈合的药物制 剂， 由多肽及药学上可接受的辅料组成； 其中， 多肽具有（1 )、 （Π )所示 的氨基酸序列中任意一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ: 1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。 在本发 明的一些实施例中， 多肽占药物制剂的质量百分含量为 0.01%~1.5%。
在本发明的一些实施例中，辅料包括羟丙曱基纤维素，羟丙曱基纤维 素占所述药物制剂的质量百分含量为 7.0%。
作为优选， 以重量百分数计， 本发明提供的药物制剂由多肽 0.01-1.5%, 丙三醇 5%、 羟丙曱基纤维素 7%、 乙醇酸 0.1%、 EDTA0.1%, 余量为水组成。
作为优选，本发明提供的药物制剂为凝胶剂、粉针剂、气雾剂、喷剂、 擦剂、 膜剂、 贴剂、 膏剂、 软膏剂、 橡胶膏剂、 水剂、 汤剂、 冲剂、 片剂、 丸剂、 緩释剂、 控释剂、 粉剂、 糊剂、 捺剂、 洗剂、 涂膜剂、 离子透入 剂、 滴眼剂、 滴鼻剂、 含漱剂、 舌下片、 吹入剂、 栓剂、 气雾剂、 吸入 剂、 烟剂、 口服液 、 口服片、 注射液、 糖浆剂、 煎膏剂、 酒剂、 散剂、 颗粒剂、 丸剂、 片剂、 胶嚢剂、 灌肠剂或栓剂。
本发明还提拱了多肽在制备饲料添加剂、保健品添加剂、食品添加剂、 化妆品添加剂中的应用； 多肽具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任意一 个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中， 修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化 或羰基化； 取代为取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 缺失为缺 失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸； 添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10氨基酸；且其不具有如 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。 作为优选， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。
本发明提换了一种多肽， 其具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任意 一个：
( I ) 具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添 加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。抗菌结果表明合成多肽 Ctryamp 及其结构同源多肽对标准的革兰氏阴性细菌大肠杆菌 CCTCCAB94012和 革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌 CCTCCAB94014 的生长具有高效抑制 作用。 在 6.25 g/mL 时， Ctryamp 多肽及其结构同源多肽对大肠杆菌 CCTCCAB94012的抑制率就可以达到 100%, 而在 6.25 g/mL时，对金黄 色葡萄球菌 CCTCCAB94014的抑制率就可以达到 100%。 进一步抗菌结 果表明合成 Ctryamp多肽对革兰氏阴性菌，特别是致病性大肠杆菌和铜绿 假单胞菌增殖具有高效抑制作用（表 3 ), Ctryamp多肽对铜绿假单胞菌的 最小抑菌浓度为 8-16 g/mL。抗菌结果还表明化学合成 Ctryamp多肽对革 兰氏阳性细菌的增殖具有高效抑制作用 （表 3 )。 抗菌结果表明化学合成 Ctryamp多肽对厌氧菌的生长具有高效抑制作用 （表 3 )。 Ctryamp多肽对 临床耐药细菌（耐曱氧西林金黄色葡萄球菌、耐曱氧西林凝固酶阴性葡萄 球菌、 耐红霉素化脓性链球菌、 耐青霉素类和头孢类， 耐单酰胺类， 对喹 诺酮类、 氨基糖苷类、 磺胺类有交叉耐药的产 ESBLs大肠埃希菌、 耐亚 胺培南的铜绿假单胞菌 （IPM-R株））具有高效抑制作用（表 3 )。 Ctryamp 多肽对引起特异性感染的细菌（包括百日咳鲍特菌、破伤风梭菌、产气荚 膜梭菌、 志贺氏菌、 伤寒沙门菌和白喉棒状杆菌）具有高效抑制作用 （表 3 )。
本发明还提供了外用凝胶抗菌制剂。抗菌结果表明其抗菌制剂对革兰 氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、厌氧菌、及临床耐药细菌具有高效抑制作 用。 其对标准的革兰氏阴性细菌大肠杆菌 CCTCCAB94012的最小抑菌浓 度 MIC 为 6.25 g/mL , 对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌 CCTCCAB94004的最小抑菌浓度 MIC为 6.25 g/mL, 对耐曱氧西林金黄 色葡萄球菌（MRSA )最小抑菌浓度 MIC为 6.25 g/mL、对铜绿假单孢菌 的最小抑菌浓度 MIC为 8 g/ mL、 对产气荚膜梭菌最小抑菌浓度 MIC为 25 g/ mL (表 4 ) (按照制剂中有效成分抗菌多肽 Ctryamp多肽或其结构 同源多肽计算）。
选用来医院治疗的各种外伤患者、体表慢性难愈合感染创面病人，所 有病人随机分为实验组和对照组。实验组用制备的外用 Ctryamp多肽抗菌 凝胶制剂， 对照组常规用药 （给予 5%的硫横霜）。 对于创面细菌感染， 治疗组 82例患者创面均一期愈合， 未出现感染及创面延迟愈合， 未出现 过敏反应及其他不良反应。 根据卫生部 1988年颁布的抗菌药物临床试验 技术标准分为四级： 痊愈、 显效， 有效， 无效。 结果治疗组 82例中显效 80例，有效 2例，有效率 100% 。对照组 74例中显效 50例，有效 20例， 无效 4例， 有效率 95%, 两组经统计学 F检验， p < 0.05。 两组促进创面 愈合时间比较见表 5, 经过统计学 F检验， p < 0.05。 临床治疗结果表明， 本发明提供的外用凝胶能有效的预防和治疗细菌感染， 特别对 MRSA和 铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株（IPM-R株）有独特的杀菌作用， 同时能 显著的促进伤口的修复愈合。
痤疮治疗的临床观察， 选择痤疮、 青春痘、 粉刺患者 258例为对象， 记录实验组（用 Ctryamp多肽外用抗菌凝胶制剂治疗）、 对照组两组患者 面部痤疮皮损数目、变化和不良反应。按痤疮各种损害（粉刺、炎性疤疹、 脓疮、 结节、 嚢肿）减少的总百分率统计疗效。 抗痤疮丙酸杆菌的抗菌制 剂实验组有效率达到 97%。 而常规用药对照组有效率为 41%。 两组疗效 差异有高度显著性， 说明实验组对治疗痤疮疗效优于对照组。
湖北省人民医院烧伤整形外科用本发明的 Ctryamp 多肽外用抗菌凝 胶制剂抗治疗了 22例慢性湿疹患者， 实验结果显示， 蝎肽抗菌凝胶对湿 疹有独特的疗效， 治愈率 100%, 临床随访无复发， 而实验组临床症状减 轻， 但随访复发严重。 本发明还提供了以传统中药材蝎的活性多肽为有效成分配制的更为 有效的治疗创面细菌感染和痤疮、湿疹的新药剂，用于治疗创面细菌感染、 体表慢性难愈合感染创面、 痤疮、 湿疹与促进组织修复和伤口愈合， 治疗 效果显著。 本发明也涉及了一种预防细菌感染与促进组织修复的添加剂， 用于制备预防细菌感染与促进组织修复的化妆品、保健品、饲料等，预防 细菌感染与促进皮肤组织修复效果显著。本发明所釆用的原料均为传统中 药材蝎的活性成分， 无毒副作用， 不留后遗症。 此药物或者添加剂能够真 正达到见效快、 无副作用、 治愈后不复发的效果。 附图说明
图 1示本发明提供的西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽 Ctryamp基因及 其氨基酸序列；
图 2西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽 Ctryamp的纯度；
图 3西藏特里豚蝎广谱抗菌活性多肽 Ctryamp质谱。 具体实施方式
本发明公开了一种多肽、 编码该多肽的 DNA分子、 载体、 制备方法 及应用， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特 别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易 见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实 施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对 本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合 ,来实现和应用本发明 技术。
下面结合实施例， 进一步阐述本发明： 实施例 1 西藏特里豚蝎广语抗菌活性多肽基因的制备
A: 西藏特里豚蝎毒腺总 RNA的提取 ( Trizol LS—步法： Trizol LS 购自美国 Invitrogen ) ①取 500mg的蝎尾腺在液氮中研成细粉末，加入 10mL TRIZOL试剂 混匀， 室温 (20-25°C , 以下相同）放置 5分钟； ②然后加入 2mL氯仿混合 15秒， 室温放置 2-3分钟， 4°C下 12000g离心 15分钟； ③取水相加 1倍 体积异丙醇，室温放置 10分钟， 4°C下 12000g离心 10分钟得 RNA沉淀； ④沉淀用 5ml75 %乙醇洗涤， 7500g离心 5分钟； ⑤ RNA沉淀干燥后溶 于 DEPC处理水， 55-60°C保温 10分钟以彻底溶解 RNA。 整个过程参照 TRlZOL(Total RNA Isolation)Reagent Kit推荐方法进行。 制备的蝎毒腺总 RNA釆用曱醛变性凝胶电泳检测其质量。得到了高质量的蝎毒腺总 RNA。 B: mRNA的分离纯化
釆用 PolyA Tract mRNA 分离系统 （ Promega, USA ) 分离和纯化 mRNA, 其工作原理是基于 Oligo (dT)与 mRNA 3'端 poly(A)尾的互补配 对特性， 用生物素标记 Oligo (dT), 通过它与 mRNA 3'端 poly(A)的退火 形成杂交体， 然后用标有亲合素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素 Oligo (dT)/mRNA杂交体， 最后用无 RNA酶的灭菌双蒸水（ dd¾0 )将 之洗脱下来， 达到从总 RNA中分离 mRNA的目的。 ①样品的制备： 将 RNA加入到含有 32μ β-巯基乙醇的 800μ 的结合緩冲液中。②探针的退 火： 取 250ρΜ浓度 Oligo(dT) 5μ , 加蒸馏水至 5(^L; 加入 1.6mL预热 的 dilution buffer ( dilution buffer已加入 32 L β -巯基乙醇）， 与 RNA混 匀， 70°C温育 5分钟。 ③磁珠的活化： 取 1.2mL的磁珠 SA-PMPS (购自美 Promega)于 1.5mL的离心管中； 用 0.5xSSC重悬 SA-PMPS, 以磁架吸附 磁珠， 原体积 0.5xSSC洗涤 SA-PMPS3次。 ④ mRNA的获取： 将 70°C温 育的 RNA与 SA-PMPS混合， 室温放置 5分钟放磁架上吸附磁珠， 弃上 清液； 2mL的 0.5XSSC悬浮磁珠，洗涤重复 2次，最后一次尽量去除 SSC; 加入无 RNA酶的 dd¾0至磁珠中， 轻轻混匀， 然后离心 （ 12000gx3分 钟）或磁架吸附磁珠； 取上清， 获得 mRNA。通过电泳和紫外测定 mRNA 的浓度和纯度。 ⑤ mRNA的沉淀： 将④获得的 mRNA中加入糖原和 2.5 倍体积的无水乙醇， 沉淀过夜， mRNA将用于 cDNA的合成。 C: 第一链 cDNA合成
①在 1.5mL E 管中力口入 2μΙ Not I Primer-adapter和 mRNA (含 3 gmRNA), 70°C温育 lOmin, 迅速放于水上， 离心后， 加入下列成分： Ι, 5Χ first strand buffer; 2 L0.1MDTT; \μΙ lOmMdNTPs; l LH20。 轻轻混匀后离心， 37°C放至 2min; ②加入 5 L逆转录酶， 混匀后取 2 L, 加 l L [a-32P]dCTP ( 4μα ) (示踪管）。 与上述反应组分（样品管） 同时 37°C温育 lh, 然后放入水上终止反应； ③对于示踪管， 依次加入 43 L20 mM EDTA和 5 L酵母 tRNA, 混匀后， 分别取两份 ΙΟμΙ^点于两张滤膜 上， 1份用 10% TCA洗 3次，每次 5min, 95%乙醇洗 1次， 空气干燥后， 放入 1.5mL闪烁液中 （为 1 #样品）； 另 1份空气干燥后， 放入 1.5mL闪 烁液（为 2 #样品）。 另 30μ 示踪液， 加 1.5 L 7.5M 醋酸氨 ( NH4Oac ) 和 9(^L无水乙醇（ -20 °C ), 混匀后立即 14,000rpm离心 20min, 弃上清， 加入 0.5mL70%无水乙醇（-20°C ), 14,000rpm离心 2min, 弃上清， 37°C 干燥 1 Omin让乙醇挥发， 溶于 1 ( L TEN溶液 ,加入 1 ΟμΙ^ 2Χ加样緩冲液 , 取 ΙΟμ 用于碱性凝胶电泳。 用 [a-32P]dCTP标记 λϋΝΑ HindlU片段作分 子量标记； ④混匀后室温下放置 15min,加入 2 L 0.2 M EDTA终止反应。 取 6 L反应液和 6mL 2X碱性电泳緩冲液混匀， 电泳 5h后， 用 7% TCA 浸泡 20min, 直至溴酚兰变黄。 然后用卫生纸吸干 （ 8h左右）， 进行放射 自显影； ⑤对于样品管， 用于第二链的合成。
ffind III 10X buffer 2 L dGTP 0.2mM dATP 0.2mM
[a-32P]dCTP 2μΟί
Hind III markers l g
Klenow DNA polymerase 2 unit 补 dd¾0至总体积 20μ D: 第二链 cDNA合成
①水上在样品管中依次加入下列成分； ②轻轻混勾后， 16°C温育 2h; ③加入 2 L ( lOunits ) T4DNA聚合酶， 继续 16°C反应 5min; ④转入水上， 加入 1( L 0.5 M EDTA;⑤加入等体积（ \50μΙ )酚/氯仿 /异戊醇（ 25/24/1 ), 彻底涡旋后， 室温下 14,000rpm 离心 5min。 将水相 （ 140μ )转入另一 1.5mL E 管； ⑥加入 70μ 的 7.5MNH4OAc和 0.5mL无水乙醇（ -20 °C ), 涡旋后， 室温下 14,000rpm离心 20min; ⑦弃上清， 加入 0.5mL70%乙醇 (-20°C ), 同上离心 2min。 弃上清， 37°C干燥 10min。
DEPC-treated water 92μ
5X second strand buffer 30μ
lOmMdNTP mix μL·
E.coli DNA ligase (lOunits/ L) \μL
E.coli DNA polymerase (lOunits^L)
Figure imgf000020_0001
总体积 15(^L
E: 双链 cDNA与 Sal I衔接头的连接
①用 25 L灭菌水溶解实 D的 cDNA样品，然后按下表依次加入；② 轻轻混匀， 16°C反应过夜（约 20h )。 ③用酚 /氯仿 /异戊醇（ 25/24/1 )抽提 和 NH4Oac/乙醇沉淀后， 37 °C干燥 10min。
5X T4DNA ligase buffer ΙΟμΙ,
Sal I adapters lO L
T4DNA ligase 5μί_ 总体积 5(^L
F: Noil消化双链 cDNA ①将 E的样品溶于 41 L, 然后按下表依次加入； ②混匀后， 37 °C温 育 2h; ③用酚 /氯仿 /异戊醇（25/24/1 )抽提一次， 然后用 7.5M NH4Oac/ 乙醇沉淀， 37 °C干燥 10min。 ④溶于 70μΙ^ ΤΕΝ, 取 ΙμΙ^用于定量， 其余 -20 °C保存备用。
REACT 3 buffer
Not I
总体积 50μΙ G: 去除双链 cDNA分子中的过量 / 1衔接头和酶切小片段 用 nucleon extraction and purification kit (Amersham, USA)去除过量 / I衔接头和酶切小片段。 ①室温下悬浮树脂， 然后取 600μ 加于离心 柱中， 2 000 rpm离心 10s , 去掉液体。 在树脂中央加入 40μ 上述 cDNA 溶液。 同上离心； ②收集洗脱液用于连接反应。
H: 双链 cDNA与 pSPORTl载体的连接和转化
①在 1.5mL Ep管中依次加入下列成分； ②室温下反应 16h; ③在② 反应液中依次加入下列成分： 5.0μ yeast tRNA, 12.5 L 7.5 M NH40ac, 70μ 无水乙醇（-20 °C )。 涡旋混匀后立即 14000离心 20min; ④沉淀用 70%乙醇（-20 °C )洗涤， 37 °C干燥后溶于 4 L; ⑤取 2 L电击转化 50μ E.coli K12 MC1061。 用 PCR 方法鉴定文库的质量， 正向引物： 5 ' TCGACCCACGCGTCCG 3' (按 Sail衔接头序列设计）； 反向引物： 5 ' GAGCGGCCGCCCT 15 3， （按 Notl引物 -衔接头的序列设计）。
5X T4 DNA ligase buffer 4 L pSPORT 1 , Not I-Sal I-Cut (50ng L) 1 i
cDNA(3ng L) \i
T4DNA ligase
补 dd¾0至总体积 2(^L I： 随机测序策略筛选 cDNA文库
随机从构建好的西藏特里豚蝎毒腺 cDNA文库中挑选 3000克隆子， 送上海三博公司测序。 序列录入软件为 BioEdit v4.5.8 (Tom Hall, 1999), 同源性比较和信号肽切割位点预测软件分别为 CLUSTAL X 1.8 (Thompson et al., 1997)和 PC/GENE (Intelligenetics Inc., Switzerland)。序歹1 J 分析表明克隆子 2007为一个全新的抗菌肽基因， 命名为 Ctryamp。 其序 列 为 SEQ ID NO:3 所 示 的 核 苷 酸 序 列 ： ttcctctgtgaaagtaagttctgtgaaactcactcttcgataaaatgaaatctcagacctttttccttctttttctagttgt tttattattagcaatttcacaatcagaagcttttatcaggatcgccaggctcctcaggatctttggaaaaagaagtat gagagatatggatactatgaaatacttatatgaaccaagtttgagtgcagctgacttgaaaaccttacaaaaacta atggaaaattactgattatttgaatataataatgttatctctattttagattataaatatttcttttgaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaa (图 1 )。 Ctryam 的的前体组织形式编码 68个氨基酸残基， 由三 个部分组成， 即信号肽（ 23个残基）、 成熟肽（ 11个残基）和前体肽（ 34 个残基）。因此，本发明提供一个西藏特里豚蝎抗菌肽： FIRIARLLRIF( SEQ ID NO:2 )。 实施例 2 Ctryamp多肽的结构分析及其同源结构双亲性多肽
根据实施例 1提供的 SEQ ID NO:2所示的 Ctryamp的成熟肽序列 ( FIRIARLLRIF ), 使用在线 NPS@ server [ DSC 法（Discrimination of protein Secondary structure Class ) ]对其进行二级结构预测， 并利用软件 AHTHEPROT 2000显示其二级结构图像。 结果表明， Ctryamp含有 100% 的 α-Helix结构， 具有典型的两亲性（ amphiphilic ) α-Helix结构， 含有大 量带净正电荷的碱性残基（ Arg )。根据多肽序列的螺旋图，然后对 Ctryamp 多肽序列 FIRIARLLRIF进行大量点突变， 发现 FIX1IAX2LLX3IF ( XI , X2和 X3为 His、 Arg和 Lys的 3个碱性氨基酸中任意一个氨基酸 ) ( SEQ ID ΝΟ: 1 )序列并不影响其双亲性的特征（表 1 )。 因此， 本发明提供了一 组西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽的同源结构多肽（ SEQ ID NO: 1 )。 表 1 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽及其结构同源多肽
多肽名称 ^列 序列表中的位置 突变性质 A螺旋值
Ctryamp FIRIARLLRIF SEQ ID NO:2 野生型 100%
Ctryamp-R3K FIKIARLLRIF SEQ ID NO:7 碱性 100%
Ctryamp-R5K FIRIAKLLRIF SEQ ID NO :8 碱性 100%
Ctryamp-R9K FIRIARLLKIF SEQ ID NO :9 碱性 100%
Ctryamp-R3H FIHIARLLRIF SEQ ID NO: 10 碱性 100%
Ctryamp-R5H FIRIAHLLRIF SEQ ID NO: 11 碱性 100%
Ctryamp-R9H FIRIARLLHIF SEQ ID NO: 12 碱性 100%
Ctryamp- 1 FIKIAKLLRIF SEQ ID NO: 13 碱性 100%
Ctryamp-2 FIKIARLLKIF SEQ ID NO: 14 碱性 100%
Ctryamp-3 FIRIAKLLKIF SEQ ID NO: 15 碱性 100%
Ctryamp-4 FIKIAKLLKIF SEQ ID NO: 16 碱性 100%
Ctryamp-5 FIHIAHLLRIF SEQ ID NO: 17 碱性 100%
Ctryamp-6 FIHIARLLHIF SEQ ID NO: 18 碱性 100%
Ctryamp-7 FIHIAKLLRIF SEQ ID NO: 19 碱性 100%
Ctryamp-8 FIRIAKLLHIF SEQ ID NO:20 碱性 100%
实施例 3 多肽及其同源结构双亲性多肽
根据实施例 1提供的 Ctryamp(FIRIARLL i )及异 is
肽的氛基酸序列 (FIXJAXsLLXglF , 实施例 2提供)进行人工合成。 固相化 学合成的办法获得了高纯度的 Ctryamp多肽（如图 2和图 3所示）及其同 源结构双亲性多肽（表 1 )。 实施例 4 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的抑菌试验 对革兰氏阴性菌的抑制试验：
96 孔板培养法： ①分别将铜绿假单胞菌 （包括标准株、 临床分离株 和耐药株）、 大肠埃希菌 （包括标准株 CCTCC AB94012和 ATCC25922、 临床分离株和耐药株）、 肺炎克雷伯菌、 居泉沙雷菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 痢疾志贺菌、 鲍曼不动杆菌、 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、 百日咳鲍特菌 和流感嗜血杆菌培养到 OD600 = 0.8时， 稀释 400倍后取 80μ1加入到 96 孔板中，然后分别向多孔加入 20μ1经等比稀释的实施例 1提供的 Ctryamp 10^ig/ml, ^g/ml, O.^g/mL 阴性对照和阳性对照孔分别加入 20μ1 液体 培养基和 20μ1的卡那霉素 (终浓度为 2(^g/ml); ② 37°C培养 12小时后， 用酶标仪检测 96孔板中各孔的在 600nm波长处的吸光值； ③确定药物 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的 10倍稀释的最低抑制浓度后， 将最低抑制浓度进行 2倍等比稀释，重复试验的前①②步骤。最终确定抗 菌肽 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽对细菌的最低抑制浓度。
实施例 1提供的 Ctryamp多肽对对铜绿假单胞菌的 MIC为 8 g/ml、 对大肠杆菌的 MIC为 6.25-12.5 g/ml、对肺炎克雷伯菌的 MIC为 25 g/ml、 对居泉沙雷的 MIC为 12.5 g/ml、 对沙门氏菌的 MIC为 12.5 g/ml、 对志 贺菌的 MIC为 6.25 g/ml、 对鲍曼不动杆菌的 MIC为 6.25 g/ml、 对脑膜 炎奈瑟菌的 MIC为 6.25 g/ml、 对淋病奈瑟菌的 MIC为 6.25 g/ml、 对 百曰咳鲍特菌的 MIC为 3.13 g/ml、对流感嗜血杆菌的 MIC为 3.13 g/ml。 对变形杆菌的 MIC为 6.25 g/ml。 对革兰氏阳性菌的抑制试验：
96 孔板培养法： ①分别将金黄色葡萄球菌 （包括标准株 CCTCC
AB94004 和 ATCC25923、 临床分离株）、 曱氧西林敏感凝固酶阴性葡萄 球菌 (MSSCNS)、 溶血性链球菌 （包括标准株、 临床分离株和耐药株） 、 肠球菌、 白喉棒状杆菌、 痤疮棒状杆菌培养到 OD600 = 0.8时， 稀释 400 倍后取 80μ1加入到 96孔板中， 然后分别向多孔加入 20μ1经等比稀释的 实施例 1提供的 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽（实施例 2提供 ), 达到终浓度为 lOO g/ml, lO g/ml, ^g/ml, O.^g/mL 阴性对照和阳性对 照孔分别加入 20μ1 液体培养基和 20μ1 的青霉素 (终浓度为 5(^g/ml); ② 37 °C培养 12小时后， 用酶标仪检测 96孔板中各孔的在 600nm波长处 的吸光值； ③确定药物 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的 10倍稀 释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行 2倍等比稀释，重复试验的前 ①②步骤。最终确定抗菌肽 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽对细菌 的最低抑制浓度。
Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽对金黄色葡萄球菌的 MIC为
1.63-6.25 g/ml、 Ctryamp多肽对曱氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌的 MIC 为 3.13-12.5 g/ml、对溶血性链球菌的 MIC为 8-16 g/ml、对白喉棒状杆 菌的 MIC均为 3.13 g/ml、 对痤疮棒状杆菌的 MIC为 3.13 g/ml、对肠球 菌的 MIC为 6.25 g/ml。 对耐甲氧西林葡萄球菌的抑制试验：
耐曱氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA )和耐曱氧西林凝固酶阴性葡萄 球菌 (MRSCNS) ： 江苏省人民医院临床检验中心分离获得临床株、 中南 大学。
96 孔板培养法： ①将耐曱氧西林金黄色葡萄球菌和耐曱氧西林凝固 酶阴性葡萄球菌培养到 OD600 = 0.8时，稀释 400倍后取 80μ1加入到 96 孔板中，然后分别向多孔加入 20μ1经等比稀释的实施例 1提供的 Ctryamp 多肽及其同源结构双亲性多肽（实施例 2提供 ),达到终浓度为 lOO g/ml, 10μβ/πι1, 1μβ/πι1, 0.1μβ/πι1ο 阴性对照和阳性对照孔分别加入 20μ1培养 基和 20μ1的万古霉素 (终浓度为 12 g/ml); ② 37 °C培养 12小时后， 用酶 标仪测 96孔板中各孔的在 600nm波长处的吸光值； ③确定药物 Ctryamp 多肽的 10倍稀释的最低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行 2倍等比稀释， 重复试验的前①②步骤。最终确定抗菌肽 Ctryamp多肽对耐曱氧西林金黄 色葡萄球菌和耐曱氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的最低抑制浓度为
3.13-12.5 g/ml, 或 4-8 g/ml (第三方试验结果）。
对厌氧菌的抑制试验：
96 孔板培养法： ①分别将破伤风梭菌、 产气荚膜梭菌、 脆弱类杆菌 培养到 OD600 = 0.8时， 稀释 400倍后取 80μ1加入到 96孔板中， 然后分 别向多孔加入 20μ1经等比稀释的实施例 1提供的 Ctryamp多肽， 达到终 浓度为 lOO g/ml, lO g/ml, ^g/ml, O.^g/mL 阴性对照和阳性对照孔分 别加入 20μ1 液体培养基和 20μ1的青霉素 (终浓度为 40(^g/ml); ② 37°C 培养 12小时后， 用酶标仪检测 96孔板中各孔的在 600nm波长处的吸光 值； ③确定药物 Ctryamp多肽及其同源结构双亲性多肽的 10倍稀释的最 低抑制浓度后，将最低抑制浓度进行 2倍等比稀释，重复试验的前①②步 骤。 最终确定抗菌肽 Ctryamp多肽对细菌的最低抑制浓度。
Ctryamp多肽对破伤风梭菌的 MIC为 25 g/ml、 对产气荚膜梭菌的 MIC为 25 g/ml、 对脆弱类杆菌的 MIC为 12.5μ^πι1。
抗菌试验结果见表 2、 3、 4。 表 2 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽及其结构同源多肽对标准大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度 MIC ( g/ml ) 多肽名称 氨基酸序列 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
Ctryamp FIRIARLLRIF 12.5 6.25
Ctryamp-R3K FIKIARLLRIF 12.25 6.25
Ctryamp-R5K FIRIAKLLRIF 6.25 6.25
Ctryamp-R9K FIRIARLLKIF 12.5 6.25
Ctryamp-R3H FIHIARLLRIF 6.25 6.25
Ctryamp-R5H FIRIAHLLRIF 12.5 6.25
Ctryamp-R9H FIRIARLLHIF 6.25 6.25 Ctryamp-1 FIKIAKLLRIF 6.25 6.25
Ctryamp-2 FIKIARLLKIF 6.25 12.5
Ctryamp-3 FIRIAKLLKIF 12.5 6.25
Ctryamp-4 FIKIAKLLKIF 6.25 12.5
Ctryamp-5 FIHIAHLLRIF 6.25 12.5
Ctryamp-6 FIHIARLLHIF 6.25 6.25
Ctryamp-7 FIHIAKLLRIF 12.5 6.25
Ctryamp-8 FIRIAKLLHIF 12.5 6.25 3 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽对革兰氏阴性和阳性细菌、 厌氧菌、 床耐药细菌的抑菌效果
菌（科） 实验菌 属性 实验 最小抑菌浓 属 菌株 度
数 MlC^g/ml) 匍匈 金黄色葡萄球菌 (X m re^) (标准 G+ 1 6.25 球菌属 株 ATCC25923)
金黄色葡萄球菌 (X m re^) (临床 G+ 17 1.63-6.25 分离株）
耐曱氧西林金黄色葡萄球菌 G+ 5 3.13-12.5
(MRSA)
★金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 G+ 1 8 女耐曱氧西林金黄色葡萄球菌 G+ 11 4-8
(MRSA)
女耐曱氧西林凝固酶阴性葡萄球 G+ 11 4 菌 (MRSCNS)
★曱氧西林敏感凝固酶阴性葡萄 G+ 5 4 球菌 (MSSCNS) 链球菌 月申炎链 ί求菌 ( S. pneumoniae ) G+ 1 3.13 属 无孔链球菌 ( S. agalactiae ) G+ 1 25
★链球菌 ATCC19615 (标准株） G+ 1 8
★红霉素敏感化脓性链球菌 G+ 16 (β-hemolytic streptococcus)
女耐红霉素化脓性链球菌 G+ 11 8-16 肠球菌 屎肠
Figure imgf000028_0001
G+ 1 25 属 粪肠球菌E. faecal is) G+ 1 50 奈瑟菌 脑膜炎奈瑟菌 (N. meningitidis) G" 1 6.25 属 淋病奈瑟菌 (N. gonorrhoeae) G" 1 6.25
大肠埃希菌 coli) ATCC25922 G" 6.25
1
肠道杆 (标准株）
菌科 大肠埃希菌 co/z)(临床分离株） G" 6.25-12.5
★ATCC25922 (非产 ESBLs) G- 1 4
★ATCC35218(产 ESBLs) G" 1 4 女产 ESBLs大肠埃希菌 G- 10 4-8
★非产 ESBLs大肠埃希菌 G- 4-8 志贺 ^(dysentery bacilli) G" 1 6.5 沙门菌 G" 1 12.5 月巿炎克雷白菌 peneumoniae) G" 1 25 产酸克雷伯菌 oxytoca) G" 1 12.5 枸橼酸杆菌 （ Citrobacter ) G" 1 12.5 阴沟肠杆菌 cloacae ) G" 1 12.5 居泉沙雷氏菌 （ X fonticola ) G" 1 12.5 厌氧细 破伤风梭菌 (C. tetani) G+ 1 25 菌 产气荚膜梭菌 (C. perfrimgens) G+ 1 25 脆弱类杆菌 G+ 1 12.5 棒状杆 白喉棒状杆菌 ( C. diphtheriae) G+ 1 3.13 菌属 痤疾棒状杆菌 (C. acnes) G+ 1 3.13 假单胞 ★铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa) G- 8
1
菌属 ATCC27853 (标准株）
★铜绿假单胞菌 （IPM-S株） G- 4 8-16
★铜绿假单胞菌 （IPM-R株） G- 8 8-16 不动杆 鲍曼不动杆菌 (A bi7MWi»2Z ) (临床 G" 2 12.5 菌属 分离株）
鲍特菌 百曰咳鲍特菌 (β. pertussis) G" 1 3.13 属
嗜血杆 流感嗜血杆菌 influenzae) G" 1 3.13 菌属
分枝杆 ★结核分枝杆菌 (M tuberculosis) G+ 1 25
菌属
注： ★表示该菌的最小抑菌浓度试验结果为委托第三方试验进行。 实施例 4: Ctryamp多肽抗菌制剂的制作
1 ) 处方： 实施例 1制备的西藏特里豚蝎抗菌多肽 Ctryamp 0.01-1 .5g、 丙三醇 5g、 羟丙曱基纤维素 7g、 乙醇酸 0.1g、 EDTA O. lg, 无菌 水加至 100g。
2 ) 制备： 将羟丙曱基纤维素洒于液面 （60mL左右） ， 隔夜后成为凝 胶剂基质， 静置后真空脱泡， 将乙醇酸与其余药物混勾， 逐渐加 入到浆料中混勾， 避免剧烈搅拌混入过多气泡。 分装， 即得抗菌 凝胶制剂。
3 ) 空白对照凝胶剂： 制剂中除了不含有 Ctryamp多肽外， 其余处方和 制备同以上制剂。 备注： 羟丙曱基纤维素 (Hydroxypropyl Methyl Cellulose, HPMC)。 丙 三醇、 羟丙曱基纤维素、 乙醇酸、 EDTA均为药用规格。 实施例 5: Ctryamp 多肽抗菌制剂对标准大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 MRSA和铜绿假单孢菌的抑制作用
1 ) 将实施例 4提供的成品凝胶剂按照 1:49的比例溶解在灭菌的生 理盐水中， 且进行等比稀释 10个浓度， 置于 4°C水箱。
2 ) 将保种的标准大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 MRSA和铜绿假单 孢菌接种到 LB培养基中, 37°C过夜培养。
3 ) 将过夜培养的菌液用新鲜的 LB培养基稀释到 OD600=0.002。
4 ) 96孔培养板中每孔加入 80μΕ的上述菌液。
5 ) 向菌液中加入 20μ 上述不同浓度的成品凝胶剂溶液。
6 ) 同时做凝胶剂和生理盐水的阴性对照以及原料多肽和抗生素的 阳性对照试验。
7 ) 将 96孔板置于 37°C、 250rpm的振荡仪上培养 16小时。
8 ) 16小时后取出 96孔板， 冷却至室温， 置于酶标仪上 630nm波 长测其吸光值。
9 ) 以完全没有光吸收的孔的溶液浓度作为最小抑制浓度。
10 ) 抗菌结果表明， 抗菌制剂对标准大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 MRSA和铜绿假单孢菌有高效抑制效应， 其对大肠杆菌、 金黄色葡萄球 菌最小抑菌浓度 MIC为 6.25 g/mL(针对该制剂中有效成分多肽来计算）， 而与原料药多肽具有一致的最小抑菌浓度（原料药 Ctryamp及其同源结构 双亲性合成多肽对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌的 MIC为 6.25 g/mL ); 其 抗菌制剂对 MRSA的最小抑菌浓度 MIC为 6.25 g/mL、 对铜绿 £单孢菌 的最小抑菌浓度 MIC为 8 g/mL(原料药 Ctryamp及其同源结构双亲性合 成多肽对 MRSA和铜绿假单孢菌的 MIC分别为 6.25 g/mL、 8 g/mL ), 而空白制剂没有抗菌活性。
抗菌试验结果见表 4。 表 4 西藏特里豚蝎 Ctryamp多肽外用凝胶制剂对革兰阴性、 阳性和耐药 菌的最小抑菌浓度 MIC
实马全细菌菌 最小抑菌浓度 MIC 大肠杆菌 6.25
大肠杆菌 6.25
金黄色葡萄球菌 6.25
金黄色葡萄球菌 6.25 耐曱氧西林金黄色葡萄球菌 （MRSA ) 6.25 铜绿假单胞菌 (P. i/erag wo^X临床分离株） 8 产气荚膜梭菌 (C. perfrimgens) 25
注明： 按照制剂中有效成分 Ctryamp多肽或其结构同源多肽计算。 实施例 6: Ctryamp多肽抗菌制剂对创面细菌感染患者的临床治疗试验
1 ) 病例一般资料： 治疗组病人 82例， 男性 38例， 女性 44例； 年龄 最小 4岁， 最大 76岁； 病种分类： 擦伤创面 28例， 小型烫伤创 面 12例， 烧伤残余创面 10例， 2级糖尿病慢性溃疡 12例， 皮瓣 手术围手术期 12例， 面部大范围激光治疗术后创面 8例。 对照组 病人 74例， 男性 36例， 女性 38例； 年龄最小 5岁， 最大 78岁； 病种分类： 擦伤创面 28例， 小型烫伤创面 13例， 烧伤残余创面 10例， 2级糖尿病' f曼性溃疡 8例， 皮瓣手术围手术期 10例， 激光 治疗术后 5例。
2 ) 实验组治疗方法：釆用给予实施例 4提供的 Ctryamp多肽外用凝胶 (简称蝎肽抗菌凝胶)的药剂外用。 所有伤口或溃疡面用蝎肽抗菌凝 胶外擦， 厚度约 l-2mm, 每日 1次， 或使用蝎肽抗菌凝胶浸润纱 布敷于创面， 每 3 曰换药 1次。 擦伤创面、 浅 II度烫伤创面均先 用 3%过氧化氢溶液冲洗后， 用灭菌生理盐水冲洗至创面清洁。 清 除坏死组织后再用灭菌生理盐水冲洗创面， 0.2%活力碘消毒周围 皮肤， 以无菌棉球将创面拭干后， 使用蝎肽抗菌凝胶均勾涂抹于 创面， 厚度约 l-2mm; 烧伤残余创面、 2级糖尿病慢性溃疡留取标 本做细菌培养， 了解创面感染情况， 按以上方法清创， 先均匀涂 抹蝎肽抗菌凝胶， 待肉芽组织长出， 点状植皮， 再均勾涂擦蝎肽 抗菌凝胶， 厚度约 l-2mm, 网眼纱覆盖住， 加压包扎， 3天后第一 次更换敷料。 慢性糖尿病患者， 长期监控调整血糖， 使之接近正 常值， 最好空腹血糖 (Fasting plasma glucose, FPG)在 8mmol/L以 内； 皮瓣手术围手术期， 清创后， 直接均勾涂擦蝎肽抗菌凝胶保 护创面， 厚度约 l-2mm; 激光治疗术后， 生理盐水清洗创面后直 接均匀涂擦蝎肽抗菌凝胶， 厚度约 l-2mm。
) 对照组治疗方法： 所有伤口或溃疡面清创后纱布包扎， 3天后半暴 露治疗， 保持创面干燥。
) 疗效结果与比较： 治疗组 82例患者创面均一期愈合， 未出现感染 及创面延迟愈合， 未出现过敏反应及其他不良反应。 根据国家卫 生部 2007年颁布的抗菌药物临床试验指导原则判断疗效。 结果治 疗组 82例中显效 80例， 有效 2例， 有效率 100%。 对照组 74例 中显效 50例， 有效 20例， 无效 4例， 有效率 95%, 两组经统计 学 F检验， P < 0.05。 两组促进创面愈合时间比较见表 1 , 经过统 计学 F检验， P < 0.05 (表 5 )。 临床治疗结果表明， 本发明提供的 外用凝胶能有效的预防和治疗细菌感染， 同时能显著的促进伤口 的修复愈合。 蝎肽抗菌凝胶对 MRSA和铜绿假单胞菌亚胺培南耐 药株（IPM-R株）有高效的杀菌作用， 对体表慢性难愈合感染创 面疗效独特（治疗组 82例中， 有 8例细菌培养为 MRSA感染， 有 5例细菌培养为铜绿支单胞菌 IPM-R株， 经蝎肽抗菌凝胶治疗均 有效）。 表 5 蝎肽抗菌凝胶和常规换药的平均愈合时间及其比较 *
^ ] 例数（例 ) ~~愈合时间（天) ~~平均愈合时间 ~
(天） 蝎肽抗菌凝 82 5^20 12.14士 2.96 胶
常规换药 74 7-28 18.85士 2.78
* : 两组比较卩< 0.05。 实施例 7: 多肽抗菌制剂对痤疮患者的临床治疗试验
1 ) 病例选择： 入选病人均来自武汉大学人民医院皮肤科门诊， 经临床 确诊的痤疮病人。 排除对克林霉素、 奎诺酮类有过敏史者， 15 天 内使用过其他抗痤疮药物者， 严重的肝肾功能不全者， 以及孕妇 哺乳期妇女。
2 ) 实验分组： 将 258 例病人釆用多中心开放平行对照观察方法， 分 为实验组、 对照组。 实验组： 168人， 男性 76人； 女性 92人， 年 龄 20岁到 38岁 。 对照组： 90人， 男性 46人： 女性 44人， 年龄
22岁到 39岁。 2组间年龄性别、 病期以及皮损程度等各项指标值 相比， 差异均无明显意义， 具有可比性。
3 ) 实验方法：实验组釆用给予实施例 4提供的 Ctryamp多肽外用凝胶 治疗痤疮的药剂外用； 对照组： 给予 5 %的硫横霜（武汉大学人民 医院制剂室制作） 外用。 用药方法： 用温热水和皂液或^ ^黄药皂 洗脸， 将面部油灰充分洗净， 再用手指蘸药， 反复轻轻涂抹于患 处， 每日早晚各涂抹一次， 连续 2周为一疗程。
4 ) 疗效观察和判断标准： 258例参研者每 1周随访观察一次，复诊时， 详细填写观察表格， 记录患者面部痤疮皮损数目、 变化和不良反 应。 按痤疮各种损害 （粉刺、 炎性疤疹、 脓疮、 结节、 嚢肿）减 少的总百分率统计疗效。 痊愈： 皮损消退 100%; 显效： 皮损消退 76-99%; 有效： 皮损消退 50-70%; 无效： 皮损消退 < 50 %。 疗程 结束后， 用计量方法计算治疗后痤疮的百分数， 进行疗效评估。 同时， 对不良反应进行观察， 观察有无局部刺激及全身症状， 部 分病人临床实验前后作血尿常规检查和肝、 肾功能检查。
5 ) 对照疗效统计分析： 实验组 168例， 痊愈 112例， 占 66.7%; 显效 51例， 占 30.4%; 有效 5例， 占 2.98% ； 无效 0 例， 占 0 %; 总 有效率 100 %。 对照组： 90例， 痊愈 5例， 占 5.6%; 显效 14例， 占 15.6%; 有效 20例， 占 22.2%; 无效 51例， 占 4%; 总有效率 43%。 对照疗效分析， 实验组与对照组差异有高度显著性， 说明实 马全组对治疗痤疮疗效优于对照组。
6 ) 不良反应： 实验组 168例患者中无 1例不良反应。 对照组 90例患 者中有 5 例涂药后局部灼热感， 潮红停药后， 自行緩解， 未作处 理。 此外， 实验组治疗前后共观察了 10例血尿常规、 16例肝功， 8例肾功能检查， 均无异常改变。 实施例 8: Ctryamp多肽抗菌制剂对湿渗患者的临床治疗试验
湖北省人民医院烧伤整形外科用实施例 4提供的多肽外用抗菌凝胶 制剂抗治疗了 22例慢性湿疹患者， 一日一次， 对照组 19例， 用 1%氢化 可的松乳膏治疗， 一日二次外用， 临床观察时间为 2周。 实验结果显示， 蝎肽抗菌凝胶对湿疹有独特的疗效， 治愈率 100%, 临床随访无复发， 而 实验对照组临床症状减轻， 但随访复发严重。 实施例 9: Ctryamp多肽突变体的抑菌试验
实验材料：
Ctryamp多肽突变体：各个 Ctryamp多肽突变体的氨基酸序列信息见 序列表中 SEQIDNO:21至 SEQIDNO:52,突变类型见表 6,这些 Ctryamp 多肽突变体均由吉尔生化公司合成。
标准菌株： 金黄色葡萄球菌 （RA ) ATCC25923 以及大肠埃希菌 (E.Coli) ATCC25922; 氨苄青霉素 （Amp)。
MH培养基： 牛肉粉 2.0g, 可溶性淀粉 1.5g, 酸水解酪蛋白 17.5g, 纯水 1L, 121°C高压灭菌 20分钟， 备用。
实马全方法：
( 1 )接种： 分别取标准菌株金黄色葡萄球菌 （RA) ATCC25923 和 大肠埃希菌 (E.Coli") ATCC25922 ΙΟμΙ^, 接种到 lOmLMH培养基中， 于 37°C、 250rpm条件下， 过夜培养 16h。 (2)转接： 分别取过夜培养的所得标准菌株金黄色葡萄球菌 （RA) ATCC25923和大肠埃希菌 (E.Coli") ATCC25922的菌液 lOO L, 转接到 10mL新鲜的 MH培养基中， 于 37°C、 250rpm条件下， 培养 2h。
( 3 )菌液稀释：分别取步骤（ 2 )所得标准菌株金黄色葡萄球菌（ RA ) 5 ATCC25923和大肠埃希菌 （ Co/ ) ATCC25922的菌液， 测定 OD6。。值， 将菌液用 MH培养基进行稀释至各个菌液的 OD6。。=0.002。
( 4 ) 点样： 向无菌的 96孔板的外周加入 lOO L的 MH培养基作为 保护圈； 向保护圈内的孔里每孔加入 80μ 的步骤（3 ) 所得稀释菌液； 再分别向保护圈内的菌液孔里加入配置好的 Ctryamp多肽突变体溶液，每 10 孔加入 2(^L, 按照由低浓度到高浓度加入， 每个浓度重复 3个孔。 20μ
的 20mg/mL的氨苄青霉素作为阳性对照， 20μΙ^的无菌水作为阴性对照。
(5 )培养： 将步骤（4) 所得 96孔板置于 37°C、 250rpm的振荡仪 上培养 16h。
(6)检测： 培养 16h后， 取出 96孔板， 观测细菌生长情况， 记录实 15 验结果， 以完全没有细菌生长的孔所对应的样品浓度（Ctryamp多肽突变
体的浓度）作为细菌的最小抑制浓度（MIC)。
实验结果：
各个 Ctryamp 多肽突变体对标准菌株金黄色葡萄球菌 （ RA ) ATCC25923和大肠埃希菌 E.Coli") ATCC25922的抑制作用的实验结果 20 见表 7。
Ctryamp多肽突变体的氨基酸序列信息及突变类型
Ctryamp多肽突变体 氨基酸序列 序列表中的位置 突变类型
Ctryamp多肽突变体 1 FIRIARLLEIF SEQIDNO:21 单点突变 （取代）
Ctryamp多肽突变体 2 FIRIADLLRIF SEQ ID NO:22 单点突变 （取代）
Ctryamp多肽突变体 3 FIRIAKLLKIF SEQ ID NO:23 2点突变 （取代）
Ctryamp多肽突变体 4 FIKIARLLKIF SEQ ID NO:24 2点突变 （取代）
Ctryamp多肽突变体 5 FIKIAKLLKIF SEQ ID NO:25 3点突变 （取代）
Ctryamp多肽突变体 6 FIKIGKLLKIF SEQ ID NO:26 4点突变 （取代）
Ctryamp多肽突变体 7 FIKIGKILKIF SEQ ID NO:27 5点突变 （取代） Ctryamp多肽突变体 8 FIRIARLRIF SEQ ID NO:28 缺失 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 9 FRIARLLRIF SEQ ID NO:29 缺失 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 10 FIRARLLRIF SEQIDNO:30 缺失 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 11 FIRIARLLIF SEQIDNO:31 缺失 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 12 FIRRLLRIF SEQIDNO:32 缺失 2个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 13 FIRRLRIF SEQIDNO:33 缺失 3个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 14 FIRLRIF SEQIDNO:34 缺失 4个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 15 RLLRIF SEQIDNO:35 缺失 5个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 16 GFIRIARLLRIF SEQIDNO:36 增加 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 17 FIRIARLLRKIF SEQIDNO:37 增加 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 18 FIRIARLLKRIF SEQIDNO:38 增加 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 19 FIRKIARLLRIF SEQIDNO:39 增加 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 20 FIKRIARLLRIF SEQIDNO:40 增加 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 21 FFIRIARLLRIF SEQIDNO:41 增加 1个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 22 IFFIRIARLLRIF SEQIDNO:42 增加 2个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 23 RIFFIRIARLLRIF SEQIDNO:43 增加 3个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 24 LRIFFIRIARLLRIF SEQIDNO:44 增加 4个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 25 LLRIFFIRIARLLRIF SEQIDNO:45 增加 5个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 26 RLLRIFFIRIARLLRIF SEQIDNO:46 增加 6个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 27 ARLLRIFFIRIARLLRIF SEQIDNO:47 增加 7个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 28 IARLLRIFFIRIARLLRIF SEQIDNO:48 增加 8个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 29 RIARLLRIFFIRIARLLRIF SEQIDNO:49 增加 9个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 30 IRIARLLRIFFIRIARLLRIF SEQIDNO:50 增加 10个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 31 FIRIARLLRIFFIRIARLLRIF SEQIDNO:51 增加 11个氨基酸
Ctryamp多肽突变体 32 Ac-FIRIARLLRIF SEQ ID NO :52 N端 Phe残基乙酰化 注： Ctryamp 多肽突变体 32 对应的氨基酸序歹 >J "Ac-FIRIARLLRIF '表示
"FIRIARLLRIF，的 N端的 Phe残基上的氨基被乙酰基修饰； 表 7 Ctryamp多肽突变体对标准菌株金黄色葡萄球菌（RA)ATCC25923 和大肠埃希菌 （ Co/ ) ATCC25922的最小抑制浓度
MIC ( μg/mL )
Ctryamp多肽突变体 金黄色葡萄球菌 （RA) 大肠埃希菌 (E.Coin
ATCC25923 ATCC25922
Ctryamp多肽突变体 1 >25 >25 Ctryamp多肽突变体 2 25 >25
Ctryamp多肽突变体 3 12.5 12.5
Ctryamp多肽突变体 4 12.5 12.5
Ctryamp多肽突变体 5 25 12.5
Ctryamp多肽突变体 6 25 12.5
Ctryamp多肽突变体 7 >25 12.5
Ctryamp多肽突变体 8 25 12.5
Ctryamp多肽突变体 9 12.5 6.25
Ctryamp多肽突变体 10 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 11 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 12 12.5 25
Ctryamp多肽突变体 13 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 14 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 15 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 16 6.25 6.25
Ctryamp多肽突变体 17 6.25 12.5
Ctryamp多肽突变体 18 6.25 12.5
Ctryamp多肽突变体 19 6.25 6.25
Ctryamp多肽突变体 20 6.25 6.25
Ctryamp多肽突变体 21 12.5 25
Ctryamp多肽突变体 22 12.5 >25
Ctryamp多肽突变体 23 12.5 12.5
Ctryamp多肽突变体 24 25 >25
Ctryamp多肽突变体 25 25 >25
Ctryamp多肽突变体 26 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 27 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 28 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 29 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 30 >25 >25 Ctryamp多肽突变体 31 >25 >25
Ctryamp多肽突变体 32 6.25 25
注： Ctryamp多肽突变体的 MIC>25 g/mL表示大于等于 5(^g/ml , 表示 抗菌活性较弱或没有抗菌活性， 也就是没有临床应用价值。
从表 7中实验结果可知， Ctryam 多肽的突变体 2至 Ctryamp多肽的 突变体 9、 Ctryamp多肽的突变体 12、 Ctryamp多肽的突变体 16至 Ctryamp 多肽的突变体 25、 Ctryamp多肽的突变体 32 ,都对金黄色葡萄球菌（RA ) ATCC25923和 /或大肠埃希菌 （ E.Coli ) ATCC25922产生了显著的抑制作 用， 而 Ctryamp多肽的突变体 1、 10、 11、 13、 14、 15、 26至 31对金黄 色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌活性较弱 （ MIC>25 g/mL )或没有抗菌 活性。
实验结果说明， 具有 SEQ ID ΝΟ: 1所示的氨基酸序列的多肽经取代、 缺失、 添加或修饰一个或多个氨基酸后，有一些依然具有生物学活性， 有 一些则抗菌活性较弱或没有抗菌活性。
就 Ctryamp多肽突变体仍具有抗菌活性而言， 当具有 SEQ ID ΝΟ: 1 所示的氨基酸序列的多肽经取代 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸， 且取代的氨基酸的个数为 1个时， 不具有如 SEQ ID NO:21所示的氨基酸 序列的多肽有抗菌活性； 当具有 SEQ ID ΝΟ: 1所示的氨基酸序列的多肽 缺失 1个或 2个氨基酸，且当缺失为 1个氨基酸时，缺失的氨基酸残基不 能为第四位或第九位， 不具有 SEQ ID NO:30或 SEQ ID NO:31所示的氨 基酸序列的多肽仍具有抗菌活性； 当具有 SEQ ID ΝΟ: 1所示的氨基酸序 列的多肽的 N端添加氨基酸个数为 1-5 个时， 多肽仍具有抗菌活性； Ctryamp多肽突变体经酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基 化或叛基化修饰后仍具有抗菌活性， 如 Ctryamp多肽的 N端 Phe残基经 乙酰化修饰后， 形成具有 SEQ ID NO: 52所示氨基酸序列的突变体 32仍 然有抗菌活性。
就 Ctryamp 多肽突变体抗菌活性较弱或没有抗菌活性而言， 当具有
SEQ ID NO: l所示的氨基酸序列中取代的氨基酸的个数为 1个时，具有如 SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的多肽没有抗菌活性。 当具有 SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列中缺失的氨基酸个数为 3个、 4个或 5个时， 会 影响其生物学活性， 当缺失为 1个时，缺失的氨基酸残基不能为第四位或 第九位， 不具有 SEQ ID NO:30或 SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。 在 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的多肽的 N端添加个数为 6-11个时， 会影响其生物学活性。 对比例 1 现有多肽的抑菌活性
将 SEQ ID NO:2与 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO:6所示 氨基酸序列多肽的抗菌活性进行比较， 结果见表 8。 发现， 虽然四种多肽 均可以有效抑制金黄色葡萄球菌， 但 ABP-W1 ( SEQ ID NO:4 ) 和 BmKAMPl ( SEQ ID NO:5 )对革兰氏阴性菌无任何抑制作用 （MIC 为 5(^g/mL ), 如大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌等； 而 BmKAMPl -M ( SEQ ID NO:6 )对大肠埃希菌有较好的抑制作用， 但对临床感染常见的铜绿假单 胞菌抑菌效果差（MIC 为 5(^g/mL ), 不具有临床应用价值。 而 Ctryamp 多肽（SEQ ID NO:2 )的抗菌谱最广， 不仅对金黄色葡萄球菌、 大肠埃希 菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性强，还对若干种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性 菌和特异性感染致病菌均有较高的抗菌活性， 显示了显著的不同与 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6的临床运用价值。 同时， 本发明 还发现， Ctryamp多肽（SEQ ID NO:2 )对湿疹也具有独特疗效。
由此可见， 本发明提供的具有 SEQ ID ΝΟ:1所示的氨基酸序列的多 肽、及其经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列 的多肽， 具有抗菌活性高， 抗菌谱广的特点； 对多种细菌（病原菌）产生 了高活性的抑菌作用，对预防和治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、 多种 耐药菌引起的感染，及预防和治疗特异性病原菌引起的特异性感染（传染 病）、 湿疹都具有独特的作用。 表 8 现有多肽最小抑菌浓度对比
最 '〗、抑菌浓度 MIC^g/mL)
细菌名称 Ctryamp ABP-W1 BmKAMPl BmKAMPl -M
(SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO :5) (SEQ ID NO :6) 金黄色葡萄球菌
1.63-6.25 3.13 3.13 12.5 (甲氧西林敏感）
耐甲氧西林金黄
6.25 8 12.5 6.25 色葡萄球菌
大肠埃希菌 6.25 >100 >100 12.5 铜绿假单胞菌 8 >100 >100 50 白喉棒状杆菌 3.13 1 1 1 鲍曼不动杆菌 12.5 1 1 1 肺炎克雷伯菌 25 1 1 1 居泉沙雷氏菌 12.5 1 1 1 产气荚膜梭菌 25 1 1 1 沙门氏菌 12.5 1 1 1 志贺氏菌 6.25 1 1 1 枸橼酸杆菌 12.5 1 1 1 产酸克雷伯菌 12.5 1 1 1 百曰咳鲍特菌 3.13 1 1 1 肺炎链球菌 3.13 1 1 1 屎肠球菌 25 1 1 1 无孔链球菌 25 1 1 1 阴沟肠杆菌 12.5 1 1 1 脑膜炎奈瑟菌 6.25 1 1 1 淋病炎奈瑟菌 6.25 1 1 1 破伤风梭菌 25 1 1 1 痤疮棒状杆菌 3.13 1 1 1 流感嗜血杆菌 3.13 1 1 1 结核分枝杆菌 25 1 1 1 " 表示未发现。 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改 进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序 列 表
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉摩尔生物科技有限公司
<120> 多肽、 编码该多肽的 DNA分子、 载体、 制备方法及应用
<130> OP140529
<160> 54
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(11)
<223> Xaa(3)=His、 Arg或 Lys; Xaa(6)=His、 Arg或 Lys; Xaa(9)=His、 Arg或 Lys;
<400> 1
Phe lie Xaa He Ala Xaa Leu Leu Xaa lie Phe
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 西藏特里豚蝎 ( Chaerilus tryznai Kovarik )
<400> 2
Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe
1 5 10 <210> 3
<211> 325
<212> DNA
<213> 西藏特里豚蝎 （ Chaerilus tryznai Kovarik )
<400> 3
ttcctctgtg aaagtaagtt ctgtgaaact cactcttcga taaaatgaaa tctcagacct ttttccttct ttttctagtt gttttattat tagcaatttc acaatcagaa gcttttatca ggatcgccag gctcctcagg atctttggaa aaagaagtat gagagatatg gatactatga aatacttata tgaaccaagt ttgagtgcag ctgacttgaa aaccttacaa aaactaatgg aaaattactg attatttgaa tataataatg ttatctctat tttagattat aaatatttct
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 东亚粉虫曷 ( Mesobuthus martensii karsch )
<400> 4
Phe lie Gly Ala He Ala Arg Leu Leu Arg Lys He Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 东亚粉虫曷 ( Mesobuthus martensii karsch )
<400> 5
Phe lie Gly Ala lie Ala Arg Leu Leu Ser Lys He Phe
1 5 10 <210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 东亚粉虫曷 ( Mesobuthus martensii karsch )
<400> 6
Phe lie Lys Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg Lys He Phe 1 5 10 <210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Phe lie Lys lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Phe lie Arg lie Ala Lys Leu Leu Arg lie Phe
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT <213> 人工序列
<400> 9
Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Lys lie Phe 1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Phe lie His lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe 1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Phe lie Arg lie Ala His Leu Leu Arg lie Phe 1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu His lie Phe 1 5 10 <210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Phe lie Lys lie Ala Lys Leu Leu Arg lie Phe 1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Phe lie Lys lie Ala Arg Leu Leu Lys lie Phe
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Phe lie Arg lie Ala Lys Leu Leu Lys lie Phe 1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT <213> 人工序列
<400> 16
Phe lie Lys lie Ala Lys Leu Leu Lys lie Phe 1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Phe lie His lie Ala His Leu Leu Arg He Phe 1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Phe lie His lie Ala Arg Leu Leu His He Phe
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Phe lie His lie Ala Lys Leu Leu Arg lie Phe <210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Phe lie Arg lie Ala Lys Leu Leu His lie Phe 1 5 10
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Phe lie Arg He Ala Arg Leu Leu Glu He Phe
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Phe lie Arg lie Ala Asp Leu Leu Arg lie Phe 1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT <213> 人工序列
<400> 23
Phe lie Arg lie Ala Lys Leu Leu Lys lie Phe 1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Phe lie Lys lie Ala Arg Leu Leu Lys lie Phe 1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Phe lie Lys lie Ala Lys Leu Leu Lys lie Phe
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Phe lie Lys lie Gly Lys Leu Leu Lys lie Phe <210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Phe lie Lys lie Gly Lys lie Leu Lys lie Phe 1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Phe lie Arg He Ala Arg Leu Arg lie Phe
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Phe Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe
1 5 10
<210> 30
<211> 10
<212> PRT <213> 人工序列
<400> 30
Phe lie Arg Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Phe He Arg lie Ala Arg Leu Leu lie Phe
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 32
Phe lie Arg Arg Leu Leu Arg He Phe
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Phe lie Arg Arg Leu Arg lie Phe
1 5 <210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 34
Phe lie Arg Leu Arg lie Phe
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Arg Leu Leu Arg lie Phe
1 5
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
Gly Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe 1 5 10 <210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列 <400> 37
Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg Lys lie Phe 1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Lys Arg lie Phe
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
Phe lie Arg Lys lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe
1 5 10
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 40
Phe lie Lys Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe <210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 41
Phe Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe
1 5 10
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 42
lie Phe Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe 1 5 10
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 43
Arg lie Phe Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe 1 5 10 <210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列 <400> 44
Leu Arg lie Phe Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe
1 5 10 15 <210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 45
Leu Leu Arg lie Phe Phe lie Arg He Ala Arg Leu Leu Arg He Phe
1 5 10 15
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 46
Arg Leu Leu Arg lie Phe Phe lie Arg He Ala Arg Leu Leu Arg lie 1 5 10 15 Phe
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 47
Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe Phe lie Arg He Ala Arg Leu Leu Arg 1 5 10 15 lie Phe
<210> 48
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 48
lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe Phe lie Arg lie Ala Arg Leu Leu
1 5 10 15
Arg He Phe
<210> 49
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 49
Arg He Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe Phe He Arg lie Ala Arg Leu
1 5 10
Leu Arg He Phe
<210> 50
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 50 Ile Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg He Phe Phe lie Arg He Ala Arg
1 5 10 15
Leu Leu Arg lie Phe
20
<210> 51
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 51
Phe lie Arg He Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe Phe lie Arg lie Ala
1 5 10 15
Arg Leu Leu Arg lie Phe
20
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD— RES
<222> (1)..(1)
<223> Xaa(l)=Ac-Phe
<400> 52
Xaa lie Arg lie Ala Arg Leu Leu Arg lie Phe
1 5 10
<210> 53
<211> 10 <212> PRT
<213> 人工序列
<400> 53
Phe lie Arg lie Arg Leu Leu Arg lie Phe
1 5 10
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 54
Phe He Arg lie Arg Leu Arg He Phe
1 5
+

Claims

权 利 要 求
1、 一种多肽， 其特征在于， 其具有（1 )、 （Π )所示的氨基酸序列中任 意一个：
( I ) 具有 SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列；
( II ) 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加一 个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
2、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述修饰包括酰胺化、 磷酸化、 曱基化、 乙酰化、 泛素化、 糖基化或叛基化。
3、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述取代为取代 1个、
2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。
4、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述缺失为缺失 1个、 2个、 3个、 4个或 5个氨基酸。
5、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述添加为添加 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 6个、 7个、 8个、 9个或 10个氨基酸。
6、根据权利要求 1所述的多肽，其特征在于，其不具有 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所述的氨 基酸序列。
7、根据权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 其具有 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:22 ~ SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO:36 ~ SEQ ID
NO:45或 SEQ ID NO:52中任意一个所示的氨基酸序列。
8、 根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备抗菌剂中的应用。
9、根据权利要求 8所述的应用， 其特征在于， 所述抗菌剂抑制细菌。
10、根据权利要求 9所述的应用， 其特征在于， 所述细菌为革兰氏阳 性菌和 /或革兰氏阴性菌。
11、 根据权利要求 10所述的应用， 其特征在于， 所述革兰氏阳性菌 为葡萄球菌属、 链球菌属、 肠球菌属、 分枝杆菌属、 厌氧细菌或棒状杆菌 属。
12、 根据权利要求 10所述的应用， 其特征在于， 所述革兰氏阴性菌 为奈瑟菌属、 肠道杆菌科、假单胞菌属、 不动杆菌属、 鲍特菌属或嗜血杆 菌属。
13、 根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备预防和 /或治疗细 菌感染疾病和 /或湿疹的药物中的应用。
14、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述细菌为革兰氏 阳性菌和 /或革兰氏阴性菌。
15、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述革兰氏阳性菌 为葡萄球菌属、 链球菌属、 肠球菌属、 分枝杆菌属、 厌氧细菌或棒状杆菌 属。
16、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述革兰氏阴性菌 为奈瑟菌属、 肠道杆菌科、假单胞菌属、 不动杆菌属、 鲍特菌属或嗜血杆 菌属。
17、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述感染为非特异 性感染和 /或特异性感染。
18、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述非特异性感染 为疖、 痈、 丹毒、 急性淋巴管炎、 急性淋巴结炎、 曱沟炎、 脓性指头炎、 手指侧化脓性腱鞘炎、 滑嚢炎、 掌深间隙感染、 脓血症、 菌血症。
19、 根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述特异性感染为 结核、破伤风、 气性坏疽、 炭疽、 百日咳、 流行性脑脊髓炎、淋病、 伤寒、 细菌性痢疾或白喉。
20、根据权利要求 13所述的应用， 其特征在于， 所述感染为 MRSA、 MRCNS、 耐红霉素化脓性链球菌、 产 ESBLs大肠埃希菌、 铜绿假单胞菌 亚胺培南耐药株引起的感染；
或所述感染为金黄色葡萄球菌引起的局部感染、全身感染或毒素性疾 病；
或所述感染为凝固酶阴性葡萄球菌引起的泌尿系统感染、败血症或术 后感染；
或所述感染为链球菌引起的化脓性炎症、 风湿热与急性肾小球肾炎、 猩红热、 细菌性肺炎、 龋齿、 亚急性细菌性心内膜炎或新生儿感染； 或所述感染为肺炎链球菌引起的大叶性肺炎、 气管炎、 中耳炎、脑膜 炎、 胸膜炎、 心内膜炎或败血症；
或所述感染为无乳链球菌引起的孕妇产褥期脓毒血症、 新生儿脑膜 炎、 产后感染、 菌血症、 心内膜炎、 皮肤和软组织感染或骨髓炎；
或所述感染为肠球菌引起的心血管系统感染或尿路感染；
或所述感染为屎肠球菌引起的尿路感染、 化脓性腹部感染、 败血症、 心内膜炎或腹泻发烧；
或所述感染为粪肠球菌引起的心内膜炎， 胆嚢炎， 脑膜炎，尿路感染 或伤口感染；
或所述感染为脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊髓炎；
或所述感染为淋病奈瑟菌引起的淋病；
或所述感染为埃希菌引起的泌尿系统感染、肠道外的化脓性感染、肠 道感染或出血性结肠炎；
或所述感染为志贺氏菌引起的细菌性痢疾；
或所述感染为沙门菌引起的伤寒与副伤寒；
或所述感染为肺炎克雷伯菌引起的肺炎、支气管炎泌尿道感染、创伤 感染、 脑膜炎或腹膜炎；
或所述感染为产酸克雷伯菌引起的抗生素相关性出血性结肠炎； 或所述感染为枸橼酸杆菌引起的肺炎或脑膜炎；
或所述感染为阴沟肠杆菌引起的皮肤软组织感染、泌尿道感染、呼吸 道感染、 腹部感染、 中枢神经系统感染、 眼部感染、 伤口感染、 心内膜炎 或败血症；
或所述感染为沙雷菌引起的肺炎、泌尿道感染、菌血症或手术后感染； 或所述感染为破伤风梭菌引起的破伤风；
或所述感染为产气荚膜梭菌引起的气性坏疽或食物中毒；
或所述感染为无芽孢厌氧菌引起的腹部感染、女性生殖道、盆腔感染 或菌血症；
或所述感染为白喉棒状杆菌引起的白喉；
或所述感染为痤疮棒状杆菌引起的痤疮、 粉刺； 或所述感染为铜绿假单胞菌引起的伤口感染、烧伤组织感染、肺部感 染、 泌尿道感染、 中耳炎、 角膜炎、 心膜炎或败血症；
或所述感染为鲍曼不动杆菌引起的呼吸道感染、菌血症、泌尿系感染、 继发性脑膜炎、 手术部位感染或呼吸机相关性肺炎；
或所述感染为百日咳鲍特菌引起的百曰咳；
或所述感染为流感嗜血杆菌等嗜血杆菌属细菌引起的婴儿及孩童菌 血病症、 急性细菌性脑膜炎、 蜂窝组织炎、 骨髓炎或关节感染；
或所述感染为结核分枝杆菌引起的结核病；
或所述感染为慢性难愈合感染创面。
21、 根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备促进组织修复和 / 或伤口愈合的药物中的应用。
22、 根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备治疗烧伤、 冷伤、 挤压伤、 战创伤、 动物咬伤、 核放射伤或复合伤的药物中的应用。
23、 一种编码如权利要求 1至 7任一项所述的多肽的 DNA分子， 其 特征在于， 其具有 I 、 II所示的核苷酸序列中任意一个：
I 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
II 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加一个 或多个碱基获得的核苷酸序列。
24、 一种重组载体， 其特征在于， 其含有如权利要求 23所述的 DNA 分子。
25、 一种多肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤：
获得具有编码如（ I )或（11 )所限定的氨基酸序列的 DNA分子； 取所述 DNA分子与表达载体融合， 构建重组表达载体；
取所述重组表达载体转入宿主细胞， 获得转化体；
诱导所述转化体表达蛋白， 经分离纯化， 即得；
所述的（ I )为： 具有 SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列；
所述的（Π )为： 具有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
26、 根据权利要求 25所述的制备方法， 其特征在于， 所述 DNA分 子为具有 I 、 II所示的核苷酸序列中任意一个：
I 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
II 具有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、 取代、 缺失或添加一个 或多个碱基获得的核苷酸序列。
27、 根据权利要求 26所述的制备方法， 其特征在于， 所述宿主细胞 为原核系统宿主细胞或真核宿主细胞。
28、 根据权利要求 26所述的制备方法， 其特征在于， 所述原核系统 宿主细胞为大肠杆菌。
29、 一种治疗创面感染和 /或促进组织修复愈合的药物制剂， 其特征 在于，由如权利要求 1至 7任一项所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
30、 根据权利要求 29所述的药物制剂， 其特征在于， 所述多肽占所 述药物制剂的质量百分含量为 0.01%~1.5%。
31、 根据权利要求 29所述的药物制剂， 其特征在于， 所述辅料包括 羟丙曱基纤维素，所述羟丙曱基纤维素占所述药物制剂的质量百分含量为 7.0%。
32、 根据权利要求 29所述的药物制剂， 其特征在于， 以重量百分数 计， 其由如权利要求 1至 7任一项所述的多肽 0.01~1.5%、 丙三醇 5%、 羟丙曱基纤维素 7%、 乙醇酸 0.1%、 EDTA0.1%, 余量为水组成。
33、 根据权利要求 29所述的药物制剂， 其特征在于， 其为凝胶剂、 粉针剂、 气雾剂、 喷剂、 擦剂、 膜剂、 贴剂、 膏剂、 软膏剂、 橡胶膏剂、 水剂、 汤剂、 冲剂、 片剂、 丸剂、 緩释剂、 控释剂、 粉剂、 糊剂、 捺剂、 洗剂、 涂膜剂、 离子透入剂、 滴眼剂、 滴鼻剂、含漱剂、 舌下片、 吹入剂、 栓剂、 气雾剂、 吸入剂、 烟剂、 口月良液 、 口服片、 注射液、 糖浆剂、 煎 膏剂、 酒剂、 散剂、 颗粒剂、 丸剂、 片剂、 胶嚢剂、 灌肠剂或栓剂。
34、根据权利要求 1至 7任一项所述的多肽在制备饲料添加剂、保健 品添力。剂、 食品添力。剂、 化妆品添力。剂中的应用。
+
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