WO2014202803A1 - Procedimiento de obtención de extractos de hojas de corema album y su aplicación terapéutica - Google Patents

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Definitions

  • the present invention aims at an extract of ethyl acetate from the leaves of Corema album (L.) D. Don (Ericaceae), with cytotoxic activity, as well as the isolated active ingredients thereof, which generate reactive oxygen species and induce apoptosis.
  • the present invention belongs to the Pharmaceutical scientific area, since it establishes the methods of obtaining and phytochemical analysis of extracts of the Corema album sheets, as well as isolated active fractions and principles and their cytotoxic activity.
  • the pharmaceutical industry of natural products and the agri-food industry are potential users of the present invention, which may be applied for the development of drugs, nutraceuticals or functional foods in the treatment and prevention of cancer.
  • Chalconas constitute an important group of phenolic compounds that present a great variety of biological activities, such as antioxidant, anti-inflammatory, antibacterial, cytotoxic ... They are naturally in our diet and in different medicinal plants, for example, isoliquiritigenina is abundant in the licorice, obtained from the root of Glycyrrhiza glabra. In recent years, the ability of chalconas and their derivatives to inhibit different steps of the development of carcinogenesis, and their involvement in the mechanisms of apoptosis of transformed cells and the regulation of the cell cycle, have been revealed. as a family of molecules with great potential in chemoprevention and cancer treatment.
  • chalconas can prevent the stage of tumor progression by activating apoptosis, both by extrinsic and intrinsic route, with the Bcl-2 antiapoptotic protein being one of the most frequent targets (Yadav et al., 2011 Int Immunopharmacol, 11 (3), 295-309).
  • Corema album is a species belonging to the family Ericaceae, which also includes species of great agroindustrial interest, such as blueberries (Vaccinium sp.). It grows in the sand and sub-coastal dunes of the Atlantic coast of the Iberian Peninsula. In Spain it appears on the Galician coast of La Coru ⁇ a and Pontevedra and in Andalusia at different points along the coast of Huelva and Cádiz. It is a dioecious shrub, up to 1 m tall, very branched. The lower branches are glabrous and with numerous leaf scars; those of the last years, densely tomentose, with little wavy hairs and grayish color. The leaves are xeromorphic, adapted to the dry climate and measure around 5-6 x 1 -2 mm. There are no previous published data about the chemical composition or pharmacological activity of the leaves of this species.
  • the present invention relates to obtaining and using any extract, fraction or active ingredient isolated from the leaves of Corema album (L.) D. Don, Ericaceae, in the prevention and treatment of neoplastic diseases; preferably the ethyl acetate extract that exhibits marked cytotoxic activity in the HT-29 cell line from colon adenocarcinoma versus the standard 5-fluouracil (Cl 50 : 5.8 ⁇ 2.6 and 16.2 ⁇ 2.6 ⁇ 9 / ⁇ _, respectively).
  • the cytotoxic activity shown by the extract in the HT-29 cell line from colon adenocarcinoma is maintained in the fractions and the isolated compounds, 2 ', 4'-dihydroxydihydrochalcone (Cl 50 : 1.8 ⁇ 0.4 ⁇ ), 2'- Methox ⁇ -4'-hydroxyhydrochalcone (IC 5 or: 8.5 ⁇ 2.1 ⁇ ) and fraction of pinocembrina and 2 ', 4'-dihydrochalcone (Cl 50 : 6.8 ⁇ 1.2 ⁇ Q / r ⁇ ⁇ L) versus the 5-fluorouracil standard ( Cl 50 : 8.7 ⁇ 4.0 ⁇ , 16.2 ⁇ 2.6 ⁇ g / mL). Therefore, the extract, fractions or compounds could be used in antitumor therapy.
  • an extract of the Corema album sheets is provided characterized in that the active principles 2 ', 4'-dihydroxydihydrochalcone, 2'-methoxy-4'-hydroxyhydrochalcone, pinocembrin, 2' are identified , 4'-dihydrochalcone, ursolic acid and oleanolic acid that exhibit cytotoxic activity and this activity is due to the fact that they generate apoptosis and a stop in the cell cycle in the G2 / M phase.
  • a second aspect of the present invention relates to obtaining the extract described above, obtained using an extraction procedure comprising the steps:
  • a third aspect of the present invention relates to the fractionation and analysis of said extract, characterized by chromatography of the silica column extract using n-hexane and ethyl acetate as eluent in different gradients. The fractions obtained were grouped according to their chromatographic behavior (See Table 1).
  • Table 1 Chromatographic fractionation of the ethyl acetate extract from the Corema album sheet.
  • CA1 2 ', 4'-dihydroxydihydrochalcone
  • CA2 2'-methox ⁇ -4'-hydroxyhydrochalcone
  • CA3 pinocembrina
  • CA4 2 ', 4'-dihydrochalcone.
  • composition of the fractions with the highest content in phenolic compounds is determined using different analytical techniques, including spectrometry of masses and nuclear magnetic resonance.
  • the extract of the leaves of Corema album, its fractions or active principles isolated from it may be administered in the form of a medicinal preparation characterized by cytotoxic activity.
  • the formulation of the medicament preparations may be done following any of the conventional procedures, and may be presented in the form of powder, paper, granulate, capsule, seal, tablet, tablet, tablet, solution, syrup, suspension, tincture or any other pharmaceutical form.
  • Pharmaceutical preparations containing leaf extracts of Corema album may be formulated with different vehicles, excipients and diluents in order to optimize the administration thereof by the desired route.
  • Example 1 Obtaining the extract, fractionation and chemical analysis.
  • the sheets of Corema album (L.) D. Don were collected in September in the province of Huelva. After drying them at room temperature, 500 g of leaves were subjected to an ultrasonic bath extraction process. 1000 mL of ethyl acetate was added to the dried leaves without crushing and extracted for 45 minutes at a temperature below 40 ° C in an ultrasound bath. Subsequently, the resulting extract was filtered and concentrated to dryness under reduced pressure on a rotary evaporator.
  • This extract was chromatographed on a silica column using n-hexane and ethyl acetate as eluent in different gradients.
  • the 419 fractions of 15 mL obtained were grouped according to their chromatographic behavior (Figure 1), being revealed in UV light and with oleic and AICI 3 reagents.
  • the cytotoxic activity of the ethyl acetate extract of the Corema album leaves and the isolated and identified compounds was evaluated by the technique of Sulforhodamine B (SRB), presenting a cytotoxic profile similar to that of the 5-fluorouracil standard.
  • SRB Sulforhodamine B
  • the protocols established by the NCI were followed (Monks et al., J. Nati. Cancer Inst. 1991, 83, 757).
  • the HT-29 colon adenocarcinoma cell line was cultured in RPMI 1640 medium (Bio Whittaker) containing 20% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • the cytotoxicity test was performed using 96-well plates. All cells were maintained at 37 ° C in an atmosphere of 5% C0 2 with 95% humidity. The cells were subcultured weekly, and the culture medium was renewed twice a week.
  • the compounds were initially dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), and 5 serial dilutions were logarithmically prepared in RPMI medium (RosweII Park Memorial Institute medium). The final concentration of DMSO was never greater than 0.6%, to avoid cytotoxicity due to this solvent. The maximum dose tested was 10 "4 M for pure compounds.
  • the compounds were not filtered or sterilized since microbial contamination was controlled by adding gentamicin (50 ⁇ g / mL) to the medium. Then, it was added to each well of the plates incubated above, the different solutions of the extracts or pure compounds (100 ⁇ ) were subsequently incubated for 48 h at 37 ° C in a 5% C0 2 atmosphere.
  • SRB Sulforhodamine B
  • Tumor cells were fixed by the addition of 50 ⁇ of 50% cold trichloroacetic acid, incubating at 4 ° C for one hour. The plates were then washed 5 times with deionized water and allowed to dry. Subsequently, 100 ⁇ of SRB solution (0.4% w / v in 1% acetic acid) was added to each well, incubating 30 minutes at room temperature. The plates were then washed 5 times with 1% glacial acetic acid and allowed to dry. Finally the cells were solubilized in 100 ⁇ of 10 mM Tris buffer, stirred 5-10 minutes and the absorbance at 492 nm was measured in an automatic plate spectrophotometer. Parallel to this test, a control plate was performed, in which this SRB technique was performed after the first incubation.
  • Table 2 Results of the cytotoxicity test ⁇ g / ml) performed with the extract, fraction and isolated compounds of Corema album and the standard drug 5-fluorouracil.
  • the ability of the fraction composed of 2 ', 4'-dihydroxydihydrochalcone and pinocembrin to induce apoptosis was evaluated by an annexin-V kit linked to fluorescein isothiocyanate (Annexin V-FITC). To do this, we planted 50,000 cells per well in 6-well plates with a final volume of 2 mL, and incubated overnight at 37 ° C and 5% C0 2 . The next day we treated with 0, 6 and 12 pg / mL of fraction, and incubated under the same conditions for 48 hours.
  • the analysis of the cell cycle was performed by fluorescence mapping of the nuclei of the cells in suspension with propidium iodide (IP), and the subsequent analysis of the nuclear DNA content of each cell in the population, by flow cytometry. (N ⁇ ez, 2001, Curr issues Mol Biol. 3 (3), 67-70).
  • IP propidium iodide

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Abstract

La presente invención tiene por objeto a un extracto citotóxico procedente de las hojas de Corema album (Ericaceae), así como a sus fracciones y principios activos aislados, que generan especies reactivas de oxígeno (ERO) e inducen apoptosis. También incluye las composiciones farmacológicas que contienen tanto al extracto como a fracciones o principios activos aislados de éste y al uso de estas composiciones en la preparación de medicamentos para la prevención y el tratamiento del cáncer. La presente invención tiene su aplicación en el sector farmacéutico.

Description

Título
Procedimiento de obtención de extractos de hojas de Corema álbum y su aplicación terapéutica
Objeto
La presente invención tiene por objeto un extracto de acetato de etilo procedente de las hojas de Corema álbum (L.) D. Don (Ericaceae), con actividad citotóxica, así como a los principios activos aislados del mismo, que generan especies reactivas de oxígeno e inducen apoptosis.
La presente invención pertenece al área científica Farmacéutica, dado que establece los métodos de obtención y análisis fitoquímico de extractos de las hojas de Corema álbum, así como fracciones y principios activos aislados y su actividad citotóxica. La industria farmacéutica de productos naturales y la industria agroalimentaria son potenciales usuarios de la presente invención, que podrá aplicarse para el desarrollo de medicamentos, nutracéuticos o alimentos funcionales en el tratamiento y prevención del cáncer.
Estado de la técnica
El cáncer supone un 12.5% de las muertes en el mundo al año. A pesar de los avances médicos, la tasa de mortalidad no ha sufrido apenas variación en las últimas décadas. La cirugía y la radioterapia han demostrado ser efectivas en las primeras etapas de la aparición del tumor, pero en muchos casos éste no es detectado hasta que ya ha producido metástasis en otros órganos. Entonces, es necesario administrar por vía sistémica agentes quimioterapéuticos que, al producir numerosos efectos adversos, han de administrarse a dosis que resultan ineficaces en muchos casos. Esta ineficacia se refleja en las bajas tasas de supervivencia en pacientes con un cáncer avanzado (Jemal et al., 201 1. Glob. Canc.Stat., 61 (2), 69- 90).
La baja eficacia de la terapia actual del cáncer en pacientes con metástasis, junto con los efectos adversos y la aparición de tumores resistentes, hace necesario el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos. El uso de productos naturales es especialmente extenso en Oncología, donde, de las 155 moléculas de bajo peso molecular aprobadas entre la década de 1940 y 2006, un 73% estaban relacionadas con productos naturales (Cragg et al., 2009. Chem. Rev. 109(7), 3012-3043).
Existe un creciente interés por los extractos vegetales como una alternativa en el tratamiento y prevención de enfermedades neoplásicas ya que en muchos casos se puede disponer de materia prima en cantidad por un menor coste y pueden tener igual o mayor eficacia a los antineoplásicos existentes.
Las chalconas constituyen un importante grupo de compuestos fenólicos que presentan una gran variedad de actividades biológicas, como antioxidante, antiinflamatoria, antibacteriana, citotóxica... Están de manera natural en nuestra dieta y en distintas plantas medicinales, por ejemplo, isoliquiritigenina es abundante en el regaliz, obtenido de la raíz de Glycyrrhiza glabra. En los últimos años se ha puesto de manifiesto la capacidad de las chalconas y sus derivados para inhibir diferentes pasos del desarrollo de la carcinogénesis, y su implicación en los mecanismos de apoptosis de células transformadas y la regulación del ciclo celular, por lo que se presentan como una familia de moléculas con gran potencial en la quimioprevención y tratamiento del cáncer. Entre los mecanismos de acción de las chalconas se encuentra la interacción con los factores de transcripción NF-KB, STAT3, AP-1 , NRF2, PPAR-γ, que regulan la expresión de numerosos genes implicados en el proceso de la carcinogénesis y que forman parte de las rutas de señalización celular en estados de estrés oxidativo e inflamatorio. Además, se ha visto que las chalconas pueden prevenir la etapa de progresión tumoral mediante la activación de la apoptosis, tanto por la vía extrínseca como intrínseca, siendo la proteína antiapoptótica Bcl-2 una de las dianas más frecuentes (Yadav et al., 2011. Int Immunopharmacol, 11 (3), 295-309).
Corema álbum, es una especie perteneciente a la familia Ericaceae, la cual también incluye especies de gran interés agroindustrial, como los arándanos (Vaccinium sp.). Crece en los arenales y dunas subcosteras del litoral atlántico de la Península Ibérica. En España aparece en las costas gallegas de La Coruña y Pontevedra y en Andalucía en diferentes puntos del litoral de Huelva y Cádiz. Es un arbusto dioico, de hasta 1 m de altura, muy ramificado. Las ramas inferiores son glabras y con numerosas cicatrices foliares; las de los últimos años, densamente tomentosas, con pelos poco ondulados y color grisáceo. Las hojas son xeromórficas, adaptadas al clima seco y miden en torno a 5-6 x 1 -2 mm. No existen datos previos publicados acerca de la composición química o actividad farmacológica de las hojas de esta especie.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a la obtención y uso de cualquier extracto, fracción o principio activo aislado de las hojas de Corema álbum (L.) D. Don, Ericaceae, en la prevención y tratamiento de enfermedades neoplásicas; preferentemente el extracto de acetato de etilo que presenta marcada actividad citotóxica en la línea celular HT- 29 procedente de adenocarcinoma de colon frente al patrón utilizado 5-fluouracilo (Cl50: 5.8 ± 2.6 y 16.2 ± 2.6 μ9/ηιΙ_, respectivamente).
La actividad citotóxica mostrada por el extracto en la línea celular HT-29 procedente de adenocarcinoma de colon, se mantiene en las fracciones y los compuestos aislados, 2',4'-dihidroxidihidrochalcona (Cl50: 1.8 ± 0.4 μΜ), 2'-metox¡-4'- hidroxidihidrochalcona (CI5o: 8.5 ± 2.1 μΜ) y fracción de pinocembrina y 2', 4'- dihidrochalcona (Cl50: 6.8 ± 1.2 μQ/rτ\L) frente al patrón de 5-fluorouracilo (Cl50: 8.7 ± 4.0 μΜ, 16.2 ± 2.6 μg/mL). Por tanto, el extracto, fracciones o los compuestos podrían ser empleados en la terapia antitumoral.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un extracto de las hojas de Corema álbum caracterizado porque se identifican los principios activos 2',4'-dihidroxidihidrochalcona, 2'-metoxi-4'-hidroxidihidrochalcona, pinocembrina, 2',4'-dihidrochalcona, ácido ursólico y ácido oleanólico que presentan actividad citotóxica y esta actividad es debida a que generan apoptosis y una parada en el ciclo celular en la fase G2/M.
Un segundo aspecto de la presente invención, se refiere a la obtención del extracto que se describe anteriormente, obtenido usando un procedimiento de extracción que comprende los pasos:
a) Desecar las hojas de Corema álbum a temperatura ambiente
b) Añadir entre 1 y 10 volúmenes de acetato de etilo u otro disolvente orgánico (p.ej. acetona, hexano, etanol, metanol) o mezcla de solventes a las hojas desecadas
c) Extraer entre 30 y 120 minutos a temperatura ambiente en baño de ultrasonido. El proceso extractivo descrito puede repetirse si fuese necesario a fin de aumentar el rendimiento. También puede ser extraído por maceración, percolación o extracción continua,
d) Finalmente filtrar y concentrar a presión reducida en rotavapor para obtener un extracto seco.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al fraccionamiento y análisis de dicho extracto, caracterizado por la cromatografía del extracto en columna de sílice utilizando como eluyente n-hexano y acetato de etilo en diferentes gradientes. Las fracciones obtenidas fueron agrupadas de acuerdo a su comportamiento cromatográfico (Ver Tabla 1 ).
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Tabla 1. Fraccionamiento cromatográfico del extracto de acetato de etilo de la hoja de Corema álbum. CA1 : 2',4'-dihidroxidihidrochalcona; CA2: 2'-metox¡-4'- hidroxidihidrochalcona; CA3: pinocembrina; CA4: 2',4'-dihidrochalcona.
La composición de las fracciones de mayor contenido en compuestos fenólicos es determinada empleando diferentes técnicas analíticas, incluyendo espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear.
Por último, el extracto de las hojas de Corema álbum, sus fracciones o principios activos aislados del mismo podrán administrarse en forma de preparado medicamentoso caracterizado por actividad citotóxica. La formulación de los preparados medicamentosos podrá hacerse siguiendo cualquiera de los procedimientos convencionales, pudiendo presentarse en forma de polvo, papeles, granulado, cápsula, sello, pastilla, comprimido, tableta, solución, jarabe, suspensión, tintura o cualquier otra forma farmacéutica. Los preparados farmacéuticos que contengan extractos de hojas de Corema álbum podrán formularse con diferentes vehículos, excipientes y diluyentes a fin de optimizar la administración del mismo por la vía deseada.
Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
Modo de realización de la invención
Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Ejemplo 1: Obtención del extracto, fraccionamiento y análisis químico.
Las hojas de Corema álbum (L.) D. Don fueron recolectadas en el mes de septiembre en la provincia de Huelva. Tras desecarlas a temperatura ambiente, 500 g de hojas fueron sometidas a un proceso de extracción en baño ultrasonido. Se añadieron 1000 mL de acetato de etilo a las hojas desecadas sin triturar y se extrajeron durante 45 minutos a temperatura menor de 40°C en un baño de ultrasonido. Posteriormente se filtró el extracto resultante y se concentró hasta sequedad a presión reducida en rotavapor.
Este extracto se cromatografió en columna de sílice utilizando como eluyente n- hexano y acetato de etilo en diferentes gradientes. Las 419 fracciones de 15 mL obtenidas, fueron agrupadas de acuerdo a su comportamiento cromatográfico (Figura 1), siendo reveladas a la luz UV y con los reactivos óleum y AICI3.
De la reunión de las fracciones [57-66], se aisló por cristalización en metanol un compuesto en forma de agujas de color amarillo, que fue identificado como 2',4'- dihidroxidihidrochalcona.
De las fracciones agrupadas [67-73], se cristalizó en metanol un compuesto en forma de agujas blancas, que fue identificado pinocembrina.
Reunidas las fracciones [74-92], 500 mg se sometieron nuevamente a una subcolumna de silicagel (Columna A2). La fracción 3 (Fr3), que cristalizó en forma de agujas amarillas. Mediante cromatografía líquida acoplada a masas (LC-MS/MS), se conoció la proporción de la mezcla de dos compuestos: pinocembrina y 2', 4'- dihidrochalcona (4:6).
De la reunión de las fracciones [135-154], cristalizó en metanol un compuesto como agujas blancas, que identificamos como 2'-metoxi-4'-hidroxidihidrochalcona.
Todas las sustancias aisladas fueron caracterizadas por sus espectros de masas y RMN. Su determinación estructural se realizó fundamentalmente en base a la aplicación de diversas experiencias de RMN (COSY, NOESY, HSQC y HMBC), habiéndose asignado todas las señales que aparecen en sus espectros de 1H-RMN y 13C-RMN.
Ejemplo 2: Determinación de la actividad citotóxica
La actividad citotóxica del extracto de acetato de etilo de las hojas de Corema álbum y los compuestos aislados e identificados fue evaluada por la técnica de la Sulforhodamina B (SRB), presentando un perfil citotóxico similar al del patrón 5- fluorouracilo.
Se siguieron los protocolos establecidos por el NCI, (Monks et al., J. Nati. Cáncer Inst. 1991 , 83, 757). La línea celular HT-29 de adenocarcinoma de colon fue cultivada en medio RPMI 1640 (Bio Whittaker) que contenía 20% suero bovino fetal, 2 mM L- glutamina, 100 U/ml penicilina y 100 μg/ml estreptomicina. El ensayo de citotoxicidad fue realizado utilizando placas de 96 pocilios. Todas las células fueron mantenidas a 37°C en una atmósfera de 5% C02 con 95% de humedad. Las células fueron subcultivadas semanalmente, y el medio de cultivo era renovado dos veces por semana.
Los compuestos fueron disueltos inicialmente en dimetilsulfóxido (DMSO), y se prepararon 5 diluciones seriadas logarítmicamente en medio RPMI (RosweII Park Memorial Institute médium). La concentración final de DMSO nunca fue superior al 0.6%, para evitar la citotoxicidad debida a este disolvente. La dosis máxima ensayada fue de 10"4 M para los compuestos puros. Los compuestos no fueron filtrados ni esterilizados ya que la contaminación microbiana se controló por adición de gentamicina (50 μg/mL) al medio. A continuación, se añadió a cada pocilio de las placas incubadas anteriormente, las diferentes disoluciones de los extractos o compuestos puros (100 μΐ). Posteriormente se incubaron durante 48 h a 37 °C en atmósfera de C02 al 5%.
El ensayo de Sulforhodamina B (SRB) fue utilizado en este estudio para determinar la inhibición del crecimiento. Este ensayo colorimétrico estima el número de células de forma indirecta tiñendo las proteínas totales celulares con el colorante SRB.
Las células tumorales fueron fijadas por la adición de 50 μί de ácido tricloroacético frío al 50%, incubándose a 4°C durante una hora. A continuación, las placas se lavaron 5 veces con agua desionizada y se dejaron secar. Posteriormente se adicionó a cada pocilio 100 μί de solución de SRB (0.4% p/v en ácido acético al 1 %), incubándose 30 minutos a temperatura ambiente. Después se lavaron las placas 5 veces con ácido acético glacial al 1 % y se dejaron secar. Finalmente las células se solubilizaron en 100 μί de tampón Tris 10 mM, se agitó 5-10 minutos y se midió la absorbancia a 492 nm en un espectrofotómetro automático de placa. De forma paralela a este ensayo se realizó una placa control, en la que se realizó esta técnica del SRB una vez realizada la primera incubación.
Finalmente, se calcularon los valores de Cl50 concentración de extracto o compuesto que produce una inhibición de crecimiento del 50% respecto al control, Tres experimentos diferentes fueron realizados para cada extracto o compuesto. Los datos fueron dados como media de dos o tres experimentos + SEM.
Los resultados obtenidos de actividad citotóxica, de los extractos, fracciones y compuestos aislados, se recogen en la siguiente tabla: IC50 ( iglmL)
Extracto AcOEt hojas Corema álbum 15,8 + 2,6 μg/mL
2',4'-dihidrox¡dihidrochalcona 0,44 ± 0,1 μg/mL
2'-metoxi-4'-h¡droxidihidrochalcona 1 ,8 ± 0,5 μg/mL
Fracción de pinocembrina y 2',4'-dihidrochalcona 6.8 ± 1.2 μg/mL
Patrón 5-fluorouracilo 16.2 ± 2.6 μg/mL
Tabla 2: Resultados del ensayo de citotoxidad ^g/ml) realizado con el extracto, fracción y compuestos aislados de Corema álbum y el fármaco patrón 5- fluorouracilo.
La incubación con agentes antioxidantes, simultáneamente con tratamiento, disminuyó la citotoxicidad de los compuestos ensayados, lo que puso de manifiesto la implicación de la formación de especies reactivas de oxígeno (ERO) en el mecanismo de citotoxicidad de 2',4'-dihidroxidihidrochalcona y 2'-metoxi-4'- hidroxidihidrochalcona (Figura 1 ).
La capacidad de la fracción compuesta por 2',4'-dihidroxidihidrochalcona y pinocembrina para inducir apoptosis fue evaluada mediante un kit de Anexina-V unida a isotiocianato de fluoresceína (Anexina V-FITC). Para ello, sembramos 50.000 células por pocilio en placas de 6 pocilios con un volumen final de 2 mL, e incubamos una noche a 37 °C y 5% de C02. Al día siguiente tratamos con 0, 6 y 12 pg/mL de fracción, e incubamos en las mismas condiciones durante 48 horas.
Transcurrido el tiempo de tratamiento, recogimos el medio con células en suspensión, lavamos los pocilios dos veces con tampón fosfato salino (PBS), y recolectamos las células, que estaban adheridas, por tripsinización. Combinamos estas células con las anteriores, centrifugamos y resuspendimos el pellet con medio completo. Tras incubar las células durante 30 minutos a 37 °C y 5% de C02, centrifugamos y resuspendimos el pellet en tampón 1x de Anexina V. A continuación, incubamos 10 minutos a temperatura ambiente con anticuerpo unido a isotiocianato de fluoresceína (FITC). Por último se añadió el ioduro de propidio (IP) a 4 °C.
El análisis se realizó en un citómetro de flujo, midiendo la fluorescencia de la suspensión de células con una longitud de onda de excitación de 488 nm, y registrando la emisión de la fluorescencia verde (518 nm) del FITC y la roja (620 nm) del IP. (Figura 2)
El análisis del ciclo celular se realizó por medio del mareaje por fluorescencia de los núcleos de las células en suspensión con ioduro de propidio (IP), y el posterior análisis del contenido de ADN nuclear de cada célula de la población, mediante citometría de flujo. (Núñez, 2001 , Curr issues Mol Biol. 3(3), 67-70). Sembramos 50.000 células por pocilio en placas de 6 pocilios con un volumen final de 2 mL incubamos una noche a 37 °C y 5% de C02. Al día siguiente, tratamos con 0, 6 y 12 Mg/mL de fracción e incubamos en las mismas condiciones 48 horas.
Transcurrido ese tiempo, recogimos el medio con células en suspensión, lavamos los pocilios dos veces con tampón PBS, y recolectamos las células que estaban adheridas por tripsinización. Combinamos estas células con las anteriores, centrifugamos y resuspendimos el pellet en 2 mL de EtOH al 70%. Tras incubar a 4 °C durante 72 horas, se centrifugó y se resuspendió el pellet en una solución que contiene IP y ARNasa A, disueltos en PBS. Se incubó una noche a 4 °C y se analizó al día siguiente en un citómetro de flujo, midiendo la fluorescencia de la suspensión de células con una longitud de onda de excitación de 488nm y registrando la emisión de la fluorescencia roja (620nm) del IP (Figura 3).
Descripción del contenido de las figuras
Figura 1. Efecto de los agentes antioxidantes N-acetilcisteína (NAC) y pentacloruro de Manganeso (III) tetrakis (1-metil1-4p¡rid¡l) porfirina (MnTMPyP) sobre la actividad citotóxica de los flavonoides: 2'-4'-dihidroxidihidrochalcona y 2'-metox¡-4'- hidroxidihidrochalcona. Tras 48 horas de exposición, la viabilidad celular fue determinada mediante el test de SRB. Los resultados se expresan como (Μ±δ, n=3). (*, p<0.05; **, p<0.01 ; ***, p<0.001 , vs. Control, por t de Student).
Figura 2. Porcentaje de células en apoptosis al tratar las líneas HT-29 con 0 (control), 6 y 12 g/mL de la fracción Fr3, aislada de las hojas de Corema álbum, durante 48 horas. Los resultados se expresan como (Μ±δ2, n=3). (*, p<0.05; **, p<0.01 ; ***, p<0.001 , vs. Control, por t de Student)
Figura 3. Porcentaje de células en las distintas fases del ciclo celular al tratar las células HT-29 con 0 (control), 6 y 12 Mg/mL de la fracción Fr3, aislada de las hojas de Corema álbum, durante 48 horas. Los resultados se expresan como (Μ±δ2, n=3). (*, p<0.05; **, p<0.01 ; ***, p<0.001 , vs. Control, por t de Student).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de obtención de un extracto de las hojas de Corema álbum (L.) D., caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
a) Desecar las hojas de Corema álbum a temperatura ambiente
b) Añadir entre 1 y 20 volúmenes de acetato de etilo u otro disolvente orgánico o mezcla de disolventes a las hojas desecadas.
c) Extraer entre 30 y 120 minutos a temperatura ambiente en baño de ultrasonido. El proceso extractivo descrito puede repetirse si fuese necesario a fin de aumentar el rendimiento.
d) Finalmente filtrar y concentrar a presión reducida en rotavapor para obtener un extracto seco.
2. Procedimiento de obtención de un extracto de las hojas de Corema álbum (L.) D., según reivindicación 1 , caracterizado porque en la etapa c) la extracción se hace por maceración o percolación o extracción continua.
3. Procedimiento de obtención de un extracto de las hojas de Corema álbum (L.) D., según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extracto de Corema álbum puede ser fraccionado cromatográficamente, manteniendo las fracciones su actividad citotóxica porque contenga algunos de los principios activos
4. Extracto de hojas de Corema álbum (L.) D. obtenido por el procedimiento descrito en las reivindicaciones anteriores, caracterizado por contener los compuestos activos 2',4'-dihidroxidihidrochalcona, pinocembrina, 2',4'-dihidroxichalcona, 2'- metoxi-4'-hidroxidihidrochalcona.
5. Uso del extracto de hojas de Corema álbum (L.) D., según reivindicaciones anteriores, en la preparación de un medicamento con actividad citotóxica, preferentemente en la línea HT-29 de adenocarcinoma de colon humano.
6. Uso del extracto de hojas de Corema álbum (L.) D., según reivindicaciones anteriores, en la preparación de un medicamento para la quimioprevención y el tratamiento del cáncer.
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