WO2014202704A1 - Verfahren und optische vorrichtung zum mikroskopischen untersuchen einer vielzahl von proben - Google Patents

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WO2014202704A1
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Werner Knebel
Wernher FOUQUET
Frank Sieckmann
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G01N2021/135—Sample holder displaceable

Definitions

  • the invention relates to a method for microscopically examining a plurality of samples.
  • the invention also relates to an optical device for microscopically examining a plurality of samples, comprising a sample holder holding a plurality of samples and being movably mounted relative to a sample illumination position, in particular by motor and / or automatically, such that at least one successive one each the sample is positionable in the sample illumination position.
  • an optical device for microscopically examining a plurality of samples comprising a sample holder holding a plurality of samples and being movably mounted relative to a sample illumination position, in particular by motor and / or automatically, such that at least one successive one each the sample is positionable in the sample illumination position.
  • DE 199 50 225 A 1 discloses a special arrangement for scanning a large number of specific detection regions, which are distributed in a grid on a support of up to 22 60 mm, with a confocal scanning microscope.
  • the problem that the carrier is substantially larger than the object field of a conventional scanning microscope is solved according to the teaching of this document by means of a pivotable arm in a plane parallel to the support, which carries a part of the optical components.
  • a working according to the SPIM method microscope is described in DE 102 57 423 A1.
  • a sample is illuminated with a thin strip of light while the observation is perpendicular to the plane of the illuminating light strip.
  • the illumination and the detection via two separate optical beam paths, each with a separate optics, in particular with two separate, mutually perpendicular lenses.
  • the light strip is generated by an illumination objective and a cylinder optics connected in front of it.
  • the sample is moved through the fixed relative to the detector strip of light to record layer by layer fluorescent and / or scattered light with a flat detector.
  • the slice image data thus obtained can then be combined to form a data record which corresponds to a three-dimensional image of the sample.
  • this method can not be performed as a rule with devices that have a classic microscope setup with a standard microscope stand. Rather, elaborate and complicated special arrangements are necessary for the execution of these techniques.
  • the object is achieved by a method characterized by the following steps: a. Arranging the samples in a, in particular motor and / or automatically, relative to a sample illumination position movable sample holder such that successively at least one of the samples in the sample illumination position is positionable, each adjacent to the sample, which is currently in the sample illumination position, a Free space for a deflection means, remains,
  • a device which is characterized in that in each case adjacent to the sample, which is currently in the sample illumination position, there is a clearance for a deflection means, which from a Reflecting light emitted light stripe to the illumination position so that the light stripe at an angle other than zero degrees, in particular at a right angle, propagates to the optical axis of the illumination objective, and with a detector emanating from the sample located in the sample illumination position Detected light detected.
  • the invention makes it possible to carry out mass examinations of light-sensitive samples, such as living cell aggregates, such as, for example, tissue cultures of skin cells and embryonic development of vertebrates, with high image contrast and low phototoxicity. In this case, a high throughput of samples per unit time is made possible, without sacrificing the aforementioned parameters have to be accepted.
  • the present invention makes it possible to advantageously carry out an automated mass examination of samples, which is particularly supported by the inventive use of the SPIM technology in conjunction with the inventive arrangement and use of the sample holder and the special beam guidance relative to the samples.
  • the samples may be held with the sample holder in matrix form and / or in a common plane.
  • Such a sample arrangement enables a fast and precise, successive change of the samples into the sample illumination position by simple displacement movements.
  • the samples are held with the sample holder in at least one straight row. In such an embodiment, a translational movement along a single direction will suffice to successively transfer the samples to the sample illumination position.
  • the samples may be held with the sample holder in a curved row, in particular in an annular row.
  • the sample holder is designed as a revolver.
  • the samples can be successively spent each time by performing a rotational movement in the sample illumination position.
  • one or more of the samples are held in at least one sub-holder of the sample holder.
  • the sample holder has a plurality of, in particular strand-shaped, sub-holder.
  • the sub-holder or the sub-holder can / can advantageously be arranged in a, in particular open-topped vessel, which is filled with an immersion liquid; this in particular such that the samples and / or the sub-holder, preferably completely, are submerged in the immersion liquid.
  • the deflecting means for example one or more deflecting mirrors, are immersed in the immersion liquid during the examination process.
  • the sample holder has at least one strand-shaped sub-holder, with which at least one sample, in particular a row of samples, is respectively held.
  • the deflection means moves laterally along the sub-holder and / or the string-shaped sub-holder moves in a linear movement past the deflection means, for example a deflection mirror.
  • the strand-shaped sub-holder may also be advantageous to provide for the strand-shaped sub-holder to be moved through two successive deflection means, for example deflecting mirrors, during the successive transfer of the samples into the sample illumination position.
  • the sample holder has a plurality of strand-shaped sub-holders, with each of which at least one sample, in particular in each case a row of samples, is held.
  • the sample holder has a plurality of strand-shaped sub-holders that are aligned in a common plane and / or parallel to each other and / or that the sample holder has a plurality of cubic sub-holders, with each of which at least one of the samples is supported.
  • the sample holder has sub-holders designed as shells, in each of which at least one sample is arranged. It can also be provided that the sample holder has a, in particular cylindrical, tube in which at least one of the samples is held or in which a plurality of the samples are arranged, in particular lined up. Such an embodiment also enables a fast and precise transfer of the individual samples into the sample illumination position.
  • the sample illumination position is located outside of the illumination objective, but in extension of the optical axis of the illumination objective. In this way, it is possible to illuminate at least one sample in each case precisely, efficiently and space-saving.
  • such an arrangement allows a mechanically particularly robust design. This in particular because long support arms are avoided for holding optical components that may be disturbed in a disturbing manner.
  • the illumination light is guided eccentrically by the illumination lens.
  • At least one sub-holder preferably transparent, embedding medium, in particular agarose or a - preferably similar - gel-like, transparent medium and / or a similar, galert-like, transparent matrix, in which the sample held by the sub-holder is embedded or the samples held by the sub-holder are embedded.
  • a design has the particular advantage that the respective sample can be observed without shading by opaque holding components.
  • an embedding medium can be used to create a favorable and protective environment for obtaining the samples.
  • the samples which have already been examined and have already been removed from the sample illumination position are removed from the sample holder.
  • further samples to be examined are transferred to the sample holder, in particular to vacant positions of the sample holder.
  • the sample holder is rotated in order to respectively position the next sample to be examined in the illumination position.
  • the sample holder is rotated about the optical axis of the illumination objective or about an axis parallel to the optical axis of the illumination objective in order to respectively position the next sample to be examined in the illumination position.
  • the sample holder is linearly displaced relative to the illumination position in at least one direction in order to respectively position the next sample to be examined in the illumination position and / or that a displacement device is provided with which the sample holder, in particular automatically, is displaceable in two different, in particular mutually orthogonal, directions and / or that a displacement device is provided with which the sample holder, in particular automatically, in three different, in particular mutually orthogonal, directions is displaced.
  • the deflection means and the sample located in the illumination position are arranged in a common plane, wherein the deflection means within this plane surrounds the sample located in the illumination position only incompletely, in particular only on one side or on two opposite sides.
  • at least one area within said plane remains free, through which samples can be moved to and removed from the sample illumination position.
  • the type of sample holder used in each case is automatically, in particular software-controlled, recognized, so that subsequently the successive positioning of the samples in the sample illumination position, in particular automatically, taking into account the detected type and / or using a recognized type assigned , In particular, stored in a software memory, position change routine can be done.
  • position change routine can be done.
  • the samples to be examined are arranged automatically, for example with a placement machine, in the sample holder and / or in a sub-holder of the sample holder.
  • the samples are advantageously aligned within the sample holder with regard to the microscopic examination, preferably automatically.
  • the light strip can be produced, for example, with a cylinder optic comprising a cross-sectionally round light bundle, for example a laser.
  • the light strip it is also possible for the light strip to be a quasi-light strip, which consists of a light bundle which continuously moves back and forth in a light stripe plane.
  • the optical device can have, for example, a beam deflecting device with which a light bundle is preferably movable so fast in an illumination plane that de facto a light stripe is present in the illumination plane and / or that this illumination with the detector for the detection of the outgoing of the sample light detectors and the downstream evaluation devices of a microscope is not distinguishable from a continuous, for example generated with a cylinder optics, light stripes and / or that the recorded image data is not or not significantly different from the data that would be generated in a lighting with a continuous light strip.
  • a beam deflecting device with which a light bundle is preferably movable so fast in an illumination plane that de facto a light stripe is present in the illumination plane and / or that this illumination with the detector for the detection of the outgoing of the sample light detectors and the downstream evaluation devices of a microscope is not distinguishable from a continuous, for example generated with a cylinder optics, light stripes and / or that the recorded image data is not or not significantly different from the data that would be generated
  • the light stripe plane, in which the deflected light strip propagates is perpendicular to the optical axis of the illumination objective and / or the Aligned detection lens.
  • the detection light emanating from the sample also passes through the illumination objective and / or is collimated with the illumination objective.
  • the detection light emanating from the sample can pass through a detection objective and / or to be collimated with a detection objective.
  • Such a design has the particular advantage that the optical device can be made particularly compact and robust and that the sample illumination area is particularly easily accessible, so that a fast and precise, successive transfer of the samples into the sample illumination area is made possible.
  • the light strip first extends in a vertical direction through the illumination objective and is then deflected in the horizontal direction with the deflection means in order to illuminate a layer of the sample.
  • the light emanating from the illuminated layer in particular fluorescent light, runs in the vertical direction through a detection objective.
  • the deflecting device which may have, for example, one or more deflection mirrors, may be advantageously attached to the illumination objective and / or to the detection objective, in particular movably.
  • a particularly robust and compact design is made possible in that the deflection means is held on the detection objective, which is arranged instead of a condenser at the condenser position of the inverted microscope stand.
  • the illumination objective and the deflection device are arranged to be movable relative to each other and / or that the deflection device is movably attached to the illumination objective and / or that the deflection device is movably attached to the detection objective.
  • such an embodiment advantageously makes it possible to use an illumination objective with a high numerical aperture even when a sample to be examined is larger than the image field of the illumination objective.
  • the use of high-aperture illumination objectives has the particular advantage that the light strip or the quasi-light Light stripe that hits the sample may be particularly thin formed, which increases the resolution.
  • a method of the detection objective preferably takes place only within predetermined ranges. Due to the lateral arrangement of the deflection means respectively on the right and left, the method of the sample or of the sample holder is restricted in relation to the detection objective. In order to avoid possible collisions with the sample, a safeguard is needed which allows the positioning of the sample stage or sample holder relative to the detection objective only within predetermined ranges. These predetermined ranges can be defined both via the control software and via mechanical and electronic switches.
  • This clearance can also be used to position the point of interest within the sample in the center of the light strip.
  • the predetermined ranges can be defined, a) by precisely specifying the arrangement of multiple samples or sub-holders in a special sample chamber or on a special sample holder, which is stored in the control software. These can be loaded as needed, eg automatically by detecting / reading when inserting special sample holders or manually.
  • An embodiment of a particular sample holder is shown in FIG. 8; b) and / or by pre-examining the samples or sub-holders contained in the sample holder by an imaging method, and calculating the positions or the arrangement of the samples / sub-holders via an automated image analysis of the recorded image.
  • sample chambers and embedding media made especially for this purpose can help to more accurately characterize the sample space, for example by using fluorescent markers.
  • different optical methods can be used.
  • the transition from the cover glass or transparent bottom of the sample holder into the sample area by means of a confocal reflection measurement with illumination light via the illumination objective. If a sample is present on the coverslip, the reflection at the transition decreases, since typically the refractive index of the sample is higher than that of the aqueous medium. The higher the refractive index difference between cover glass and medium / sample, the higher the reflection at the transition. This can be used to determine where the sample rests and thus the free space between adjacent sample areas.
  • contrast-enhancing methods such as e.g. Differential interference contrast (DIC) or phase contrast, can be used to better represent the outlines.
  • DIC Differential interference contrast
  • phase contrast phase contrast
  • sample support medium for example agar, hydrogel
  • dye can both absorb and fluoresce. Both with Weitfieldmikroskopie or confocal / multiphoton microscopy this dye and thus the sample area can be determined.
  • a sample holder could be designed as follows:
  • the sample holder comprises a sufficiently dimensioned safe area (safety edge), which is dimensioned such that a detection objective with deflection means is movable around a restricted range of movement.
  • safe edge a detection objective with deflection means
  • the sample holder could have a restricted range of motion in which to place individual samples or sub-holders
  • these arbitrarily arranged samples or sub-holders each have a predeterminable or necessary distance to the adjacent samples or sub-holders, in order to enable a scanning or imaging of the samples, without a sample through the Destroy detection objective or deflection.
  • a scanning of the samples or sub-holders along only one direction is possible in particular when the samples or sub-holders are arranged substantially parallel and at a suitable distance.
  • the suitable distance depends on the dimensioning of the deflection.
  • the sample holder has markings, which may be arranged in particular in the restricted range of motion.
  • markings may be arranged in particular in the restricted range of motion. The correct placement of samples on the sample container can thereby be facilitated for an operator, so that the required distances between adjacent sub-holders or sample strips can be maintained.
  • FIG. 1 is a detail view of an embodiment of an optical device according to the invention for explaining a possible embodiment of the method according to the invention
  • FIG. 2 is a detail view of another embodiment of an optical device according to the invention for explaining another, possible embodiment of the method according to the invention
  • FIG. 3 is a detailed view of another embodiment of an optical device according to the invention for explaining a further possible embodiment of the method according to the invention
  • Fig. 4 shows an embodiment of a possible, optical according to the invention
  • Fig. 5 shows an embodiment of a modified optical inventive
  • Fig. 6 shows another embodiment of a possible, optical according to the invention
  • FIG. 7 is a schematic representation of a possible course of the light strip
  • FIG. 8 is a plan view of a specific sample holder
  • FIG. 9 shows a perspective view of an exemplary embodiment of a sample holder with sub-holders
  • FIG. 10 is a perspective view of another embodiment of a
  • FIG. 1 shows a detailed view of an embodiment of an optical device according to the invention for the microscopic examination of a plurality of samples 1 for explaining a possible embodiment of the method according to the invention.
  • the optical device has a sample holder 2, wherein the samples 1 to be examined are held in several sub-holders 3 of the sample holder 2.
  • the sub-holder 3 are each formed as a strand-shaped cuboid.
  • Each sub-holder 3 consists of a dimensionally stable embedding medium, for example of agarose or of a - preferably similar - gel-like, transparent medium into which the samples 1 held by the respective sub-holder 3 are embedded.
  • the sub-holders 3 are arranged in a common, preferably horizontal, plane and parallel to each other in a transparent shell 4 of the sample holder 2, which is filled with an immersion liquid (not shown). Due to this special design of the sample holder 2 and the special arrangement of the held samples 1 advantageously remains on both sides of the samples 1 each have a free space for a deflection 6, which has two held by a detection lens 8 deflection mirror 7.
  • the detection objective 8 is immersed in the immersion liquid (not shown) during the microscopic examination of one of the samples.
  • the deflection means 6, which is attached to the detection objective 8, is located in the immersion liquid during the microscopic examination.
  • the deflection means 6 serves to deflect a light strip 1 1 emitted from an illumination objective 10 to an illumination position 5 in such a way that the light stripe 1 1 propagates at an angle other than zero degrees, in particular at a right angle, to the optical axis of the illumination objective 10. In this way, a layer of the sample 1 located in the illumination position 5 is illuminated with the light strip focused by the illumination objective 10.
  • the detection light emanating from the illuminated layer is passed through the detection objective 8 to a detector (not shown in FIG. 1).
  • the detector may for example be a sensor for detecting a two-dimensional image, for example a CCD sensor.
  • the sample holder 2 and located in the sample illumination position 5 sample 1 relative to each other perpendicular to the plane of the deflected light strip 1 1 and / or parallel to the optical axis of the illumination lens 10 can be moved to a to illuminate another, different layer of the sample 1 and to examine microscopically.
  • the illumination objective 10 can be moved in the direction of its optical axis for changing the illumination layer.
  • deflection means 6 parallel to the plane of the deflected light strip 11 and / or perpendicular to the optical axis of the illumination objective 10 in order to illuminate another layer of the sample 1 with the deflected light strip 11.
  • the sample holder 2, which holds the samples 1, is preferably movably and / or automatically mounted relative to the sample illumination position 5 in such a way that successively at least one of the samples 1 can be positioned in the sample illumination position 5.
  • the sample holder 2 with a displacement device in two mutually perpendicular directions, one of which is preferably the longitudinal extension direction of the sub-holder 3, guided guided, arranged, which is illustrated in the figure by the double arrows 9.
  • Fig. 2 shows a detailed view of another embodiment of an optical device according to the invention.
  • the sub-holders 3 of the sample holder are designed as further, transparent dishes filled with a transparent, preferably liquid, embedding medium, in each of which at least one sample 1 is arranged.
  • the further shells are arranged matrix-like within the transparent shell 4 in a common plane.
  • the detection objective 8 together with the deflection means is introduced from above into the further shells, which is illustrated in the figure by the curved double arrows 13.
  • the sample holder is also movably arranged guided in this embodiment with a (not shown) displacement device in two mutually perpendicular directions, which is illustrated in the figure by the double arrows 9.
  • the sample holder 2 has a turret 14 which carries a plurality of samples 1 each held in a sub-holder 3.
  • the sub-holders 3 are cube-shaped, but there is no limitation to such a shape; Rather, other geometric shapes are possible.
  • the sub-holders 3 each consist of a dimensionally stable embedding medium, for example of agarose or a - preferably similar - gel-like, transparent medium, in each of which at least one sample 1 is embedded.
  • the samples By turning the turret 14, the samples can be successively moved to the illumination position 5 and examined microscopically.
  • the exemplary embodiment shown in FIG. 3 also has a handling device 14, which automatically arranges the sub-holders 3 with the samples 1 to be examined in the revolver 14 and removes already-examined samples 1 together with their sub-holders 3 from the revolver 14.
  • the handling device 14, preferably automatically, removes the samples 1, which have already been removed and have already been removed from the sample illumination position 5 by rotating the revolver 14, from the revolver 14 and further, new samples 1 to be examined together with their sub-holders 3 to the revolver 14, in particular to those by removing the already examined Samples 1 vacant positions, passes.
  • a continuous investigation process is advantageously achieved in which samples 1 can be examined successively, endlessly and without interruption.
  • FIG. 4 shows an exemplary embodiment of a possible optical device according to the invention with a sample carrier 2, which has a similar construction to the sample carrier shown in FIG. 1. However, the sample carrier 2 contains only one subcarrier 3.
  • the optical device has a light source 16, which is designed as a laser and emits a cross-sectionally substantially round light bundle 17.
  • the light beam 17 is formed by means of a cylindrical lens 18 to a light strip 1 1 and then passes to the illumination objective 10.
  • optical elements 19 such as mirrors and lenses, are present. The process of lighting is as described above with respect to the embodiment shown in FIG.
  • FIG. 5 shows an embodiment of an embodiment modified in comparison with the embodiment shown in FIG. 4.
  • the light bundle 17 produced by the light source 16, which is round in cross-section is deflected so rapidly in a plane by means of a beam deflection device 23, which can for example contain a galvanometer mirror, that a light strip 1 1 is de facto present in the illumination plane and / or that this illumination with the detectors 22 provided for the detection of the light emitted by the sample 1 and the downstream evaluation devices of a microscope can not be distinguished from a light strip 1 1 produced with a cylinder optics and / or that the recorded image data does not differ significantly or not from the Distinguish data that would be generated in a lighting with a continuous strip of light 1 1.
  • Fig. 6 shows another embodiment of a possible optical device according to the invention.
  • the sample holder 2 consists of a transparent slide plate 24, a cuboid subholder 3 made of agarose or a carries similar medium.
  • the samples to be examined 1 are embedded in the cuboid.
  • the sample holder 2 is moved stepwise in the direction of the longitudinal extension direction of the sub-holder 3.
  • a special feature is that the sub-holder 3 is produced during the ongoing investigation process.
  • a sub-holder generating means 25 having a shaping means 26 is provided.
  • the sub-holder-generating means 25 receives on the one hand agarose or a similar, transparent medium via a first feed line 27, and on the other hand samples 28 to be embedded via a second feed line 28.
  • a light barrier arrangement 29 with a light source 30 and a light receiver 31 is provided, which detects the sequence of the samples 1 fed through the second supply line 28.
  • Fig. 7 shows a schematic representation of a possible course of the light strip 1 first
  • the light strip 1 1 is produced by continuously moving a light bundle 33 back and forth with a beam deflection device (not shown), which is indicated in the figure by the curved double arrow.
  • a beam deflection device not shown
  • the continuously reciprocating, exiting from the illumination lens 10 and focused by the illumination lens 10 light beam 33 passes to a deflection mirror 7 and is deflected by this so that he then below a different angle of 0 °, in the present example under a Angle of 90 °, to the optical axis of the illumination lens 10 propagates.
  • the light beam 33 In the illumination position 5, the light beam 33 has a focus 32.
  • the quasi-light strip 1 1 generated by the rapid reciprocating motion is consequently located in a plane perpendicular to the optical axis of the illumination objective 10.
  • a sample strip may be formed from agar-agar and may contain one to several samples.
  • the dotted lines 35 indicate the course of movement of the deflection mirror 7, wherein the deflection mirror 7 can be moved in the free space or the predeterminable range, without colliding with the sample strip or sub-holder 3.
  • the free space or the predefinable area depends on the distance between the two deflection mirrors 7 and on the extent of the sample strip or sub-holder 3.
  • the distance between two adjacent sub-holders 3 must be sufficiently large in order to avoid collisions between the sub-holders 3 and the deflection means 6 or deflecting mirrors 7 or other components which are arranged on the detection objective 8.
  • the sample holder 2 has integrated calibration objects or markers 39, which have prominent points at predetermined positions, fluorescent dots, fluorescent patterns (beat clusters) or microstructures visible in the microscopic transmitted-light mode.
  • Such an integrated marker 39 could in particular also serve for calibration purposes, namely it could be approached in order to be able to determine, for example, a relative position between the illumination and / or detection objective and the sample holder 2.
  • FIG. 9 shows a perspective view of an exemplary embodiment of a sample holder 2 with substantially elongated sub-holders 3 in a shell 4.
  • the sub-holders 3 are arranged substantially parallel to each other.
  • the course of movement 37 of the detection objective not shown in FIG. 9, has a meandering form or extends in the safe area along the longitudinal side and the transverse side of the sample holder 2.
  • the positions of the sub-holders 3 can be fixed. The positions may be read out of a memory when the system recognizes that samples are to be detected on the special sample holder 2.
  • FIG. 10 shows in a perspective view a further exemplary embodiment of a sample holder 2 with sub-holders 3 in a shell 4.
  • the sub-holders 3 may have different lengths and are arranged substantially parallel to each other. However, the longitudinal directions of the sub-holder 3 may also be oriented along different directions (not shown) or not arranged in parallel.
  • FIG. 10 shows an optimally calculated course of motion 37 of the detection objective (not shown in FIG. 10). This could be the shortest course of motion of the detection objective and / or the shortest detection duration, but a collision between the detection objective / deflection means and the sample should be avoided.
  • the shortest course of motion between the end point 40 of the one sub-holder 3 and the starting point 41 of the next sub-holder 3 is determined within the restricted movement range 38. If the end point 42 is too close to the edge of the restricted movement range 38, then the next sub-holder 3 is approached via the safe area 37.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben. Das Verfahren beinhaltet den Schritt des Anordnens der Proben in einem, insbesondere motorisch und/oder automatisch, relativ zu einer Probenbeleuchtungsposition bewegbaren Probenhalter derart, dass sukzessive jeweils zumindest eine der Proben in der Probenbeleuchtungsposition positionierbar ist, wobei jeweils angrenzend an die Probe, die sich gerade in der Probenbeleuchtungsposition befindet, ein Freiraum für ein Umlenkmittel, verbleibt, den Schritt des Fokussierens eines Lichtstreifens mit einem Beleuchtungsobjektiv, den Schritt des Umlenkens des Lichtstreifens nachdem dieser das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen hat mit dem Umlenkmittel derart, dass sich der Lichtstreifen unter einem von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs ausbreitet und in der Probenbeleuchtungsposition einen Fokus aufweist, und den Schritt des sukzessiven Positionierens der mit dem Probenhalter gehalterten Proben in der Probenbeleuchtungsposition und Detektierens des von der jeweils in der Probenbeleuchtungsposition befindlichen Probe ausgehenden Detektionslichtes. Die Erfindung betrifft außerdem eine optische Vorrichtung mit einem Probenhalter, der eine Vielzahl von Proben hält und der, insbesondere motorisch und/oder automatisch, relativ zu einer Probenbeleuchtungsposition derart bewegbar gelagert ist, dass sukzessive jeweils zumindest eine der Proben in der Probenbeleuchtungsposition positionierbar ist.

Description

Verfahren und optische Vorrichtung zum mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben. Die Erfindung betrifft außerdem eine optische Vorrichtung, zum mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben, mit einem Probenhalter, der eine Vielzahl von Proben hält und der, insbesondere motorisch und/oder automatisch, relativ zu einer Probenbeleuchtungsposition derart bewegbar gelagert ist, dass sukzessive jeweils zumindest eine der Proben in der Probenbeleuchtungsposition positionierbar ist. Es besteht bei einigen Anwendungen, beispielsweise für besondere Reihenuntersuchungen oder statistische Untersuchungen, das Bedürfnis, schnell und vorzugsweise automatisch eine Vielzahl von Proben nacheinander mikroskopisch zu untersuchen. Beispielsweise ist aus DE 199 50 225 A 1 eine besondere Anordnung bekannt, um eine große Anzahl von spezifischen Nachweisregionen, die gitterförmig auf einem Träger von bis zu 22 60 mm verteilt sind, mit einem konfokalen Scanmikroskop, abtasten zu können. Das Problem, dass der Träger wesentlich größer ist, als das Objektfeld eines üblichen Scanmikroskops wird gemäß der Lehre dieser Druckschrift mithilfe eines in einer zum Träger parallelen Ebene schwenkbaren Armes gelöst, der einen Teil der optischen Komponenten trägt.
Eine solche Lösung ist nicht nur sehr aufwändig, sie hat auch den Nachteil, dass ein dreidimensionales Abbilden einer Vielzahl von Proben nach wie vor sehr lange dauern würde, was insbesondere bei den zumeist lebensdauerbegrenzten, lichtempfindlichen Proben nicht akzeptabel ist.
Viele mikroskopisch zu untersuchende Proben weisen eine begrenzte Lebensdauer auf. Dieser Umstand ist u.a. oft durch ihre Lichtempfindlichkeit begründet. Insoweit ist eine dreidimensionale Abtastung von beispielsweise matrixförmig auf einem Probenträger angeordneten Proben, beispielsweise mit einem Scanmikroskop, in der Praxis problematisch, weil der Scanvorgang viel Zeit in Anspruch nimmt und während des Scanvorganges jeweils auch Probenbereiche mit Beleuchtungslicht beaufschlagt und dadurch geschädigt werden, die außerhalb des gerade relevanten Rasterpunktes liegen. Eine ganz andere Technik, bei der eine schichtweise Beleuchtung der Probe erfolgt, erlaubt zwar grundsätzlich eine schnellere und probenschonendere Erfassung von Bilddaten, ist jedoch bislang nicht für schnelle Massenuntersuchungen von Proben geeignet, weil die erforderlichen optischen Vorrichtungen technisch sehr aufwändig sind und weil die Proben einzeln und individuell in besonderen Vorrichtungen angeordnet und die Beobachtungsvorrichtung aufwändig jeweils individuell für jede Probe eingerichtet werden muss. Dieses Verfahren ist insbesondere unter der Bezeichnung SPIM (Single Plane Illumination Microscopy) bekannt.
Ein nach dem SPIM-Verfahren arbeitendes Mikroskop ist in DE 102 57 423 A1 beschrieben. Bei diesem Mikroskop wird eine Probe mit einem dünnen Lichtstreifen beleuchtet, während die Beobachtung senkrecht zu der Ebene des beleuchtenden Lichtstreifens erfolgt. Hierbei erfolgen die Beleuchtung und die Detektion über zwei separate optische Strahlengänge mit jeweils separater Optik, insbesondere mit zwei separaten, zueinander senkrechten Objektiven. Der Lichtstreifen wird von einem Beleuchtungsobjektiv und einer ihm vorgeschalteten Zylinderoptik erzeugt. Für die Bildaufnahme wird die Probe durch den bezüglich des Detektors feststehenden Lichtstreifen bewegt, um schichtweise Fluoreszenz- und/oder Streulicht mit einem flächigen Detektor aufzunehmen. Die so gewonnenen Schichtbilddaten lassen sich anschließend zu einem aus einer dreidimensionalen Abbildung der Probe entsprechenden Datensatz zusammensetzen.
Insbesondere kann diese Methode in aller Regel nicht mit Vorrichtungen ausgeführt werden, die einen klassischen Mikroskopaufbau mit einem Standard-Mikroskopstativ aufweisen. Vielmehr sind zur Ausführung dieser Techniken aufwändige und komplizierte Spezialanordnungen nötig.
Aus DE 10 2004 034 957 A1 ist eine Anordnung zur mikroskopischen Beobachtung einer Probe über ein Mikroskopobjektiv bekannt, in dessen Gehäuse außerhalb der Linsenoptik Lichtführungen für das Beleuchtungslicht der Probe vorgesehen sind. Das Beleuchtungslicht verläuft dabei zunächst parallel zur optischen Achse des Objektivs innerhalb der Lichtführung und trifft danach auf einen am Objektivgehäuse angebrachten, ringförmigen Reflektor mit geringer Apertur, die das Beleuchtungslicht mit Hilfe zusätzlicher Abbildungselemente senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs und damit senkrecht zur Beobachtungsrichtung in die Probe fokussieren. Auch hier erfolgt die Beleuchtung der Probe flächenartig nach dem SPIM- Prinzip. Bei dieser Ausführung ist insbesondere problematisch, die Probe innerhalb des ringförmigen Refelektors zu positionieren. Eine solche Vorrichtung ist zur Anwendung eines automatisierten Verfahrens für eine Reihenuntersuchung einer Vielzahl von Proben daher ungeeignet.
Insbesondere zur Untersuchung von aquatischen Organismen ist es auch bekannt, die Proben nicht mit einem Probenhalter zu halten, sondern durch eine Glaskapillare zu saugen, die mit einem Lichtblatt durchleuchtet wird. Eine solche Vorgehensweise ist beispielsweise aus dem Artikel von Burns et al., „Preparation strategy and Illumination of three-dimensional cell cultures in light sheet-based fluorescence microscopy", Journal of Biomedical Optics, Vol. 17(19), 101518 (Oct. 2012) bekannt. Eine solche Vorgehensweise ist zum strukturierten, systematischen und gezielten mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben ungeeignet. Auch in dem Artikel von Yanik et al.,„Technologies for Micromanipulating, Imaging, and Phenotyping Small Invertebrates and Vertebrates", Annu. Rev. Biomed. Eng. 201 1 ; 13: 185-217, ist ein Verfahren bekannt, bei dem die Proben durch eine Kapillare gepumpt werden.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, das es ermöglicht, probenschonend, effizient, präzise und vorzugsweise automatisiert eine mikroskopische Untersuchung einer Vielzahl von Proben vorzunehmen.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist: a. Anordnen der Proben in einem, insbesondere motorisch und/oder automatisch, relativ zu einer Probenbeleuchtungsposition bewegbaren Probenhalter derart, dass sukzessive jeweils zumindest eine der Proben in der Probenbeleuchtungsposition positionierbar ist, wobei jeweils angrenzend an die Probe, die sich gerade in der Probenbeleuchtungsposition befindet, ein Freiraum für ein Umlenkmittel, verbleibt,
b. Fokussieren eines Lichtstreifens mit einem Beleuchtungsobjektiv, c. Umlenken des Lichtstreifens nachdem dieser das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen hat mit dem Umlenkmittel derart, dass sich der Lichtstreifen unter einem von Null Grad verschiedenen Winkel, insbesondere unter einem Winkel größer als 10 Grad, ganz insbesondere unter einem rechten Winkel, zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs ausbreitet und in der Probenbeleuchtungsposition einen Fokus aufweist, und
d. Sukzessives Positionieren der mit dem Probenhalter gehalterten Proben in der Probenbeleuchtungsposition und Detektieren des von der jeweils in der Probenbeleuchtungsposition befindlichen Probe ausgehenden Detektionslichtes.
Es ist außerdem eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung anzugeben, die es ermöglicht, probenschonend, effizient, präzise und vorzugsweise automatisiert eine mikroskopische Untersuchung einer Vielzahl von Proben vorzunehmen.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, dass jeweils angrenzend an die Probe, die sich gerade in der Probenbeleuchtungsposition befindet, ein Freiraum für ein Umlenkmittel vorhanden ist, das den aus einem Beleuchtungsobjektiv austretenden Lichtstreifen zu der Beleuchtungsposition so umlenkt, dass sich der Lichtstreifen unter einem von Null Grad verschiedenen Winkel, insbesondere unter einem rechten Winkel, zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs ausbreitet, und mit einem Detektor, der das von der jeweils in der Probenbeleuchtungsposition befindlichen Probe ausgehende Detektionslicht detektiert.
Durch die Erfindung ist es ermöglicht, bei hohem Bildkontrast und niedriger Phototoxizität eine Massenuntersuchung von lichtempfindlichen Proben, wie beispielsweise lebenden Zellverbänden, wie zum Beispiel Gewebekulturen von Hautzellen und Embryonalentwicklung von Wirbeltieren, vorzunehmen. Hierbei ist auch ein hoher Durchsatz von Proben pro Zeiteinheit ermöglicht, ohne dass Einbußen hinsichtlich der vorgenannten Parameter hingenommen werden müssen. Insbesondere ermöglicht die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise eine automatisierte Massenuntersuchung von Proben vornehmen zu können, was insbesondere durch die erfindungsgemäße Ausnutzung der SPIM-Technologie in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Anordnung und Verwendung des Probenhalters und der besonderen Strahlführung relativ zu den Proben unterstützt wird.
Beispielsweise können die Proben mit dem Probenhalter in Matrixform und/oder in einer gemeinsamen Ebene gehalten sein. Eine solche Probenanordnung ermöglicht ein schnelles und präzises, sukzessives Wechseln der Proben in die Probenbeleuchtungsposition durch einfache Verschiebebewegungen.
Alternativ oder zusätzlich kann auch vorgesehen sein, dass die Proben mit dem Probenhalter in wenigstens einer geraden Reihe gehalten sind. Bei einer solchen Ausführung reicht eine Verschiebebewegung entlang einer einzigen Richtung, die Proben sukzessive in die Probenbeleuchtungsposition zu verbringen.
Alternativ können die Proben mit dem Probenhalter in einer gebogenen Reihe, insbesondere in einer ringförmigen Reihe gehalten sein. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass der Probenhalter als Revolver ausgebildet ist. Bei diesen Ausführungen können die Proben sukzessive jeweils durch Ausführung einer Drehbewegung in die Probenbeleuchtungsposition verbracht werden.
Bei einer besonderen Ausführung sind eine oder mehrere der Proben in wenigstens einem Subhalter des Probenhalters gehaltert. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass der Probenhalter mehrere, insbesondere strangförmige, Subhalter aufweist. Der Subhalter bzw. die Subhalter kann/können vorteilhaft in einem, insbesondere oben offenen Gefäß, angeordnet sein, das mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllt ist; dies insbesondere derart, dass die Proben und/oder der Subhalter, vorzugsweise vollständig, in der Immersionsflüssigkeit untergetaucht sind. Bei der Untersuchung der Proben kann ein Detektionsobjektiv, das insbesondere auch das Umlenkmittel tragen kann, in die Immersionsflüssigkeit eintauchen oder wenigstens mit der Frontlinse in die Immersionsflüssigkeit eingetaucht sein. Vorzugsweise sind während des Untersuchungsvorganges auch das Umlenkmittel, beispielsweise einer oder mehrere Umlenkspiegel, in die Immersionsflüssigkeit eingetaucht.
Insbesondere kann vorgesehen sein, dass der Probenhalter wenigstens, einen strangförmigen Subhalter aufweist, mit denen jeweils mindestens eine Probe, insbesondere jeweils eine Reihe von Proben, gehaltert ist. Eine solche Ausführung hat den Vorteil, dass sich das Umlenkmittel während des sukzessiven Verbringens der Proben in die Probenbeleuchtungsposition seitlich an dem Subhalter entlang bewegt und/oder sich der strangförmige Subhalter in einer Linearbewegung an dem Umlenkmittel, beispielsweise einem Umlenkspiegel, vorbei bewegt. Insbesondere kann vorteilhaft auch vorgesehen sein, dass der strangförmige Subhalter während des sukzessiven Verbringens der Proben in die Probenbeleuchtungsposition zwischen zwei einander gegenüberliegend angeordneten Umlenkmitteln, beispielsweise Umlenkspiegeln, hindurch bewegt wird.
Bei einer besonderen Ausführung weist der Probenhalter mehrere strangförmige Subhalter auf, mit denen jeweils mindestens eine Probe, insbesondere jeweils eine Reihe von Proben, gehaltert ist. Alternativ oder zusätzlich kann vorgesehen sein, dass der Probenhalter mehrere strangförmige Subhalter aufweist, die in einer gemeinsamen Ebene und/oder parallel zueinander ausgerichtet sind und/oder dass der Probenhalter mehrere würfelförmige Subhalter aufweist, mit denen jeweils mindestens eine der Proben gehaltert ist.
Bei einer anderen Ausführung weist der Probenhalter als Schalen ausgebildete Subhalter auf, in denen jeweils mindestens eine Probe angeordnet ist. Es kann auch vorgesehen sein, dass der Probenhalter eine, insbesondere zylinderförmige, Röhre aufweist, in der wenigstens eine der Proben gehalten ist oder in der mehrere der Proben angeordnet, insbesondere aufgereiht, sind. Auch eine solche Ausführung ermöglicht ein schnelles und präzises Verbringen der einzelnen Proben in die Probenbeleuchtungsposition.
Bei einer besonderen Ausführung ist die Probenbeleuchtungsposition außerhalb des Beleuchtungsobjektivs, jedoch in Verlängerung der optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs angeordnet. Auf diese Weise ist es ermöglicht, jeweils mindestens eine Probe präzise, effizient und bauraumsparend beleuchten zu können. Darüber hinaus ermöglicht eine solche Anordnung eine mechanisch besonders robuste Ausführung. Dies insbesondere, weil lange Trägerarme zum halten optischer Bauteile, die in störender Weise in Schwingung geraten können, vermieden sind. Insbesondere hierbei kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass das Beleuchtungslicht außermittig durch das Beleuchtungsobjektiv geführt wird.
Bei einer besonders vorteilhaften Ausführung weist wenigstens ein Subhalter ein, vorzugsweise durchsichtiges, Einbettungsmedium, insbesondere Agarose oder ein - vorzugsweise ähnliches - gelartiges, durchsichtiges Medium und/oder eine ähnliche, galertartige, durchsichtige Matrix, auf, in das die von dem Subhalter gehaltene Probe eingebettet ist oder die von dem Subhalter gehaltenen Proben eingebettet sind. Eine solche Ausführung hat den besonderen Vorteil, dass die jeweilige Probe ohne Abschattung durch undurchsichtige Haltebauteile beobachtet werden kann. Darüber hinaus kann durch ein Einbettungsmedium eine zum Erhalt der Proben günstige und schützende Umgebung geschaffen werden.
Bei einer besonderen Ausführung ist vorgesehen, dass die Proben, die bereits untersucht wurden und bereits aus der Probenbeleuchtungsposition entfernt wurden, insbesondere automatisch, aus dem Probenhalter entnommen werden. Insbesondere kann zusätzlich vorgesehen sein, dass, insbesondere automatisch, weitere zu untersuchende Proben an den Probenhalter, insbesondere an freigewordene Positionen des Probenhalters, übergeben werden. Auf diese Weise ist vorteilhaft ein kontinuierlicher Untersuchungsprozess möglich, bei dem sukzessive, endlos und unterbrechungsfrei Proben untersucht werden können.
Wie bereits erwähnt kann beispielsweise vorgesehen sein, dass der Probenhalter gedreht wird, um jeweils die nächste zu untersuchende Probe in der Beleuchtungsposition zu positionieren. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass der Probenhalter um die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs oder um eines zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs parallele Achse gedreht wird, um jeweils die nächste zu untersuchende Probe in der Beleuchtungsposition zu positionieren. Eine solche Vorgehensweise bietet sich vorteilhaft insbesondere dann an, wenn die Proben in dem Probenhalter ringförmig angeordnet sind.
Alternativ oder zusätzlich kann vorgesehen sein, dass der Probenhalter relativ zur Beleuchtungsposition in wenigstens einer Richtung linear verschoben wird, um jeweils die nächste zu untersuchende Probe in der Beleuchtungsposition zu positionieren und/oder dass eine Verschiebevorrichtung vorhanden ist, mit der der Probenhalter, insbesondere automatisch, in zwei verschiedene, insbesondere zueinander orthogonale, Richtungen verschiebbar ist und/oder dass eine Verschiebevorrichtung vorhanden ist, mit der der Probenhalter, insbesondere automatisch, in drei verschiedene, insbesondere zueinander orthogonale, Richtungen verschiebbar ist.
Bei einer besonderen Ausführung sind das Umlenkmittel und die in der Beleuchtungsposition befindliche Probe in einer gemeinsamen Ebene angeordnet, wobei das Umlenkmittel innerhalb dieser Ebene die in der Beleuchtungsposition befindliche Probe nur unvollständig, insbesondere nur einseitig oder auf zwei gegenüberliegenden Seiten, umgibt. Vorzugsweise bleibt wenigstens ein Bereich innerhalb der genannten Ebene frei, durch den Proben in die Probenbeleuchtungsposition verbracht und aus dieser entfernt werden können. Eine solche Ausführung hat den besonderen Vorteil, dass die Proben mit dem Proebenhalter in der genannten Ebene bevorratet sein können und dass durch eine oder mehrere Verschiebebewegungen der Proben ausschließlich in der genannten, gemeinsamen Ebene, die insbesondere auch die Beleuchtungsebene sein kann, jeweils eine Probe in die Probebeleuchtungsposition verbracht werden kann oder aus dieser entfernt werden kann, ohne dass eine Positionierungsbewegung senkrecht zu der genannten gemeinsamen Ebene notwendig ist.
Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung wird der Typ des jeweils verwendeten Probenhalters automatisch, insbesondere softwaregesteuert, erkannt, so dass anschließend das sukzessive Positionieren der Proben in der Probenbeleuchtungsposition, insbesondere automatisch, unter Berücksichtigung des erkannten Typs und/oder unter Verwendung einer dem erkannten Typ zugeordneten, insbesondere in einem Softwarespeicher abgelegten, Positionswechselroutine erfolgen kann. Auf diese Weise ist es möglich, unterschiedliche Typen von Probenhaltern, beispielsweise strangförmige oder revolverförmige Probenhalter, verwenden zu können, wobei sich die optische Vorrichtung, vorzugsweise automatisch, an den gerade aktuellen Typ von Probenhalter anpasst.
In vorteilhafter Weise kann vorgesehen sein, dass die zu untersuchenden Proben automatisch, beispielsweise mit einem Bestückungsautomaten, in dem Probenhalter und/oder in einem Subhalter des Probenhalters angeordnet werden. Hierbei kann außerdem vorteilhaft vorgesehen sein, dass die Proben im Hinblick auf die mikroskopische Untersuchung, vorzugsweise automatisch, vorteilhaft innerhalb des Probenhalters ausgerichtet werden.
Der Lichtstreifen kann beispielsweise mit einer Zylinderoptik aus einem im Querschnitt runden Lichtbündel, beispielsweise eines Lasers, erzeugt werden. Es ist alternativ auch möglich, dass der Lichtstreifen ein Quasi-Lichtstreifen ist, der aus einem in einer Lichtstreifenebene kontinuierlich hin- und her bewegtem Lichtbündel besteht. Hierzu kann die optische Vorrichtung beispielsweise eine Strahlablenkvorrichtung aufweisen, mit der ein Lichtbündel vorzugsweise derart schnell in einer Beleuchtungsebene bewegbar ist, dass de facto in der Beleuchtungsebene ein Lichtstreifen vorliegt und/oder dass diese Beleuchtung mit den zur Detektion des von der Probe ausgehenden Lichtes vorgesehenen Detektoren und den nachgeschalteten Auswertevorrichtungen eines Mikroskops nicht von einem kontinuierlichen, beispielsweise mit einer Zylinderoptik erzeugten, Lichtstreifen unterscheidbar ist und/oder dass die aufgenommenen Bilddaten sich nicht oder nicht wesentlich von den Daten unterscheiden, die bei einer Beleuchtung mit einem kontinuierlichen Lichtstreifen erzeugt würden.
Vorzugsweise ist die Lichtstreifenebene, in der sich der umgelenkte Lichtstreifen ausbreitet, senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs und/oder des Detektionsobjektivs ausgerichtet.
Bei einer besonderen Ausführung ist vorgesehen, dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht ebenfalls durch das Beleuchtungsobjektiv verläuft und/oder mit dem Beleuchtungsobjektiv kollimiert wird.
Alternativ ist es jedoch auch möglich, dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv verläuft und/oder mit einem Detektionsobjektiv kollimiert wird. Hierbei kann insbesondere vorgesehen sein, dass die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die optische Achse des Detektionsobjektivs parallel und/oder kollinear zueinander ausgerichtet sind. Eine solche Ausführung hat den besonderen Vorteil, dass die optische Vorrichtung besonders kompakt und robust ausgeführt werden kann und dass der Probenbeleuchtungsbereich besonders einfach zugänglich ist, so dass ein schnelles und präzises, sukzessives Verbringen der Proben in den Probenbeleuchtungsbereich ermöglicht ist.
Insbesondere kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass der Lichtstreifen zunächst in vertikaler Richtung durch das Beleuchtungsobjektiv verläuft und anschließend in horizontale Richtung mit dem Umlenkmittel umgelenkt wird, um eine Schicht der Probe zu beleuchten. Vorzugsweise verläuft das von der beleuchteten Schicht ausgehende Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, in vertikaler Richtung durch ein Detektionsobjektiv. Ein solcher Aufbau ermöglicht die Verwendung von aufrechten oder inversen Standard-Mikroskopstativen zur Herstellung der erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung.
Die Umlenkvorrichtung, die beispielsweise einen oder mehrere Umlenkspiegel aufweisen kann, kann vorteilhaft an dem Beleuchtungsobjektiv und/oder an dem Detektionsobjektiv, insbesondere beweglich, befestigt sein. Bei der Verwendung eines inversen Mikroskopstativs zur Herstellung der erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung ist eine besonders robuste und kompakte Ausführung dadurch ermöglicht, dass das Umlenkmittel an dem Detektionsobjektiv, das anstelle eines Kondensors an der Kondensorposition des inversen Mikroskopstativs angeordnet ist, gehalten ist.
Im Hinblick auf eine zuverlässige Einstellbarkeit der Einstrahlrichtung und/oder des Einstrahlortes auf die jeweils in der Probenbeleuchtungsposition befindliche Probe, kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass das Beleuchtungsobjektiv und die Umlenkvorrichtung relativ zueinander beweglich angeordnet sind und/oder dass die Umlenkvorrichtung beweglich an dem Beleuchtungsobjektiv befestigt ist und/oder dass die Umlenkvorrichtung beweglich an dem Detektionsobjektiv befestigt ist. Eine solche Ausführung erlaubt in vorteilhafter Weise darüber hinaus, ein Beleuchtungsobjektiv mit hoher numerischer Apertur auch dann verwenden zu können, wenn eine zu untersuchende Probe größer als das Bildfeld des Beleuchtungsobjektivs ist. Die Verwendbarkeit hochaperturiger Beleuchtungsobjektive hat den besonderen Vorteil, dass der Lichtstreifen oder der Quasi- Lichtstreifen, der die Probe trifft, besonders dünn ausgeformt sein kann, was das Auflösungsvermögen erhöht.
Im Folgenden wird darauf eingegangen, dass ein Verfahren des Detektionsobjektives vorzugsweise nur innerhalb vorgegebener Bereiche erfolgt. Durch die seitliche Anordnung der Umlenkmittel jeweils rechts und links ist das Verfahren der Probe bzw. des Probenhalters im Verhältnis zum Detektionsobjektiv eingeschränkt. Um eventuelle Kollisionen mit der Probe zu vermeiden wird eine Absicherung benötigt, die das Positionieren/Verfahren des Probentisches bzw. Probenhalters relativ zum Detektionsobjektiv nur innerhalb vorgegebener Bereiche erlaubt. Diese vorgegebenen Bereiche können sowohl über die Steuerungssoftware als auch über mechanische und elektronische Schalter definiert sein.
Zur Sicherstellung, dass das Umlenkmittel nicht mit der Probe kollidiert, muss ein genügend großer Freiraum zwischen Probe und Umlenkmittel vorhanden sein.
Dieser Freiraum kann auch benutzt werden, um die interessante Stelle innerhalb der Probe in die Mitte des Lichtstreifens zu positionieren.
Besonders hinsichtlich der - vorzugsweise softwarebedingten - Definition der Verfahreinschränkung können die vorgegebenen Bereiche festgelegt werden, a) indem die Anordnung multipler Proben oder Subhalter in einer speziellen Probenkammer bzw. auf einem speziellen Probenhalter genau vorgegeben wird bzw. ist, welche in der Steuerungssoftware gespeichert ist. Diese können nach Bedarf geladen werden, z.B. automatisch durch die Erkennung / das Auslesen beim Einsetzen spezieller Probenhalter oder manuell. Ein Ausführungsbeispiel eines speziellen Probenhalters ist in Fig. 8 gezeigt; b) und/oder indem die in dem Probenhalter enthaltenen Proben bzw. Subhalter durch ein Bildgebungsverfahren voruntersucht werden und über eine automatisierte Bildanalyse des aufgenommenen Bilds die Positionen bzw. die Anordnung der Proben / Subhalter berechnet werden. Hierfür können unterschiedliche mikroskopische Verfahren verwendet werden, z.B. Konfokal-, Durchlicht-, Phasenkontrast-, Multiphoton-, Reflexions- und Epifluoreszenzmikroskopie. Durch die Anwendung einzelner Verfahren oder durch die Kombination mehrerer Methoden können so die Bereiche bestimmt werden, in denen sich der Probentisch bewegen kann, ohne dass das Umlenkmittel mit der Probe kollidiert. Außerdem können speziell für diesen Zweck hergestellte Probenkammern und Einbettmedien dabei helfen, zum Beispiel durch die Anwendung fluoreszierender Marker, den Probenraum genauer zu charakterisieren. Zur Detektion des Freiraums bzw. des vorgebbaren Bereichs, in welchem eine Relativbewegung zwischen Umlenkmittel und Probenhalter ohne Kollision zwischen Umlenkmittel und Probe möglich ist, können unterschiedliche optische Methoden eingesetzt werden. Zum einen ist es denkbar, mit einer konfokalen Reflexionsmessung mit Beleuchtungslicht über das Beleuchtungsobjektiv den Übergang vom Deckglas bzw. transparenten Boden des Probenhalters in den Probenbereich zu ermitteln. Liegt eine Probe auf dem Deckglas auf, vermindert sich die Reflexion am Übergang, da typischerweise der Brechungsindex der Probe höher ist als der vom wässrigen Medium. Je höher der Brechungsindexunterschied zwischen Deckglas und Medium/Probe ist, umso höher ist auch die Reflexion am Übergang. Damit lässt sich bestimmen, wo die Probe aufliegt und somit der Freiraum zwischen benachbarten Probenbereichen.
Eine weitere Möglichkeit, um den Freiraum zu bestimmen, sind Verfahren, die die Absorption der Probe ausnutzen. Sowohl mit lichtmikroskopischen Weitfieldverfahren als auch mit scannenden lichtmikroskopischen Verfahren können Bilder aufgenommen werden, die die Umrisse der Probe darstellen und somit den Freiraum zwischen den verschiedenen Proben.
Besteht nur ein geringes Absorptionsverhalten der Probe können weitere kontrastverstärkende Verfahren, wie z.B. Differentialinterferenzkontrast (DIC) oder Phasenkontrast, benutzt werden, um die Umrisse besser darzustellen.
Denkbar ist auch ein Probenauflagemedium (z.B. Agar, Hydrogel) zumindest teilweise mit einem Farbstoff zu versetzen, so dass diese Auflage oder das Einbettmedium detektiert werden kann. Dieser Farbstoff kann sowohl absorbieren als auch fluoreszieren. Sowohl mit Weitfieldmikroskopie oder Konfokal-/Multiphotonenmikroskopie kann dieser Farbstoff und damit der Probenbereich bestimmt werden.
Ganz allgemein und insbesondere auch unabhängig von der vorliegenden Erfindung könnte ein Probenhalter wie folgt ausgebildet sein:
Der Probenhalter umfasst einen ausreichend bemessenen sicheren Bereich (Sicherheitsrand), welcher derart bemessen ist, dass ein Detektionsobjektiv mit Umlenkmitteln rund um einen eingeschränkten Bewegungsbereich bewegbar ist. In diesem Sicherheitsrand befinden sich keine„Störungen" in Form von Proben und/oder Subhalter(n), welche eine Kollision mit dem Detektionsobjektiv bzw. den Umlenkmitteln verursachen können. Weiterhin könnte der Probenhalter einen eingeschränkten Bewegungsbereich aufweisen, in welchem einzelne Proben oder Subhalter angeordnet sein können. Vorzugsweise weisen diese beliebig angeordneten Proben bzw. Subhalter jeweils einen vorgebbaren bzw. notwendigen Abstand zu den benachbarten Proben bzw. Subhaltern auf, um ein Abrastern bzw. Abbilden der Proben zu ermöglichen, ohne eine Probe durch das Detektionsobjektiv bzw. Umlenkmittel zu zerstören.
Ein Abrastern der Proben oder Subhalter entlang nur einer Richtung ist insbesondere dann möglich, wenn die Proben bzw. Subhalter im Wesentlichen parallel und in einem geeigneten Abstand angeordnet sind. Der geeignete Abstand hängt von der Dimensionierung des Umlenkmittels ab.
Bevorzugt weist der Probenhalter Markierungen auf, welche insbesondere im eingeschränkten Bewegungsbereich angeordnet sein können. Das korrekte Platzieren von Proben auf dem Probenbehälter kann hierdurch für einen Bediener erleichtert werden, so dass die erforderlichen Abstände zwischen benachbarten Subhaltern bzw. Probenstreifen eingehalten werden können.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 eine Detailansicht eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung zur Erläuterung einer möglichen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
Fig. 2 eine Detailansicht eines anderen Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung zur Erläuterung einer anderen, möglichen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
Fig. 3 eine Detailansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung zur Erläuterung einer weiteren, möglichen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
Fig. 4 ein Ausführungsbeispiel einer möglichen, erfindungsgemäßen optischen
Vorrichtung,
Fig. 5 ein Ausführungsbeispiel einer abgewandelten erfindungsgemäßen optischen
Vorrichtung,
Fig. 6 ein anderes Ausführungsbeispiel einer möglichen, erfindungsgemäßen optischen
Vorrichtung,
Fig. 7 eine schematische Darstellung eines möglichen Verlaufs des Lichtstreifens, Fig. 8 in einer Aufsicht Ausführungsbeispiel eines speziellen Probenhalters,
Fig. 9 in einer perspektivischen Ansicht ein Ausführungsbeispiel eines Probenhalters mit Subhaltern und
Fig. 10 in einer perspektivischen Ansicht ein weiteres Ausführungsbeispiel eines
Probenhalters mit Subhaltern.
Fig. 1 zeigt eine Detailansicht eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung zum mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben 1 zur Erläuterung einer möglichen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Optische Vorrichtung weist einen Probenhalter 2 auf, wobei die zu untersuchenden Proben 1 in mehreren Subhaltern 3 des Probenhalters 2 gehaltert sind. Die Subhalter 3 sind jeweils als strangförmiger Quader ausgebildet. Jeder Subhalter 3 besteht aus einem formstabilen Einbettungsmedium, beispielsweise aus Agarose oder aus einem - vorzugsweise ähnlichen - gelartigen, durchsichtigen Medium, in das die von dem jeweiligen Subhalter 3 gehaltenen Proben 1 eingebettet sind. Die Subhalter 3 sind in einer gemeinsamen, vorzugsweise horizontalen, Ebene und parallel zueinander in einer durchsichtigen Schale 4 des Probenhalters 2 angeordnet, die mit einer Immersionsflüssigkeit (nicht dargestellt) gefüllt ist. Durch diese spezielle Ausbildung des Probenhalters 2 und die spezielle Anordnung der gehaltenen Proben 1 verbleibt in vorteilhafter Weise beidseitig der Proben 1 jeweils ein Freiraum für ein Umlenkmittel 6, das zwei von einem Detektionsobjektiv 8 gehaltene Umlenkspiegel 7 aufweist.
Das Detektionsobjektiv 8 ist während der mikroskopischen Untersuchung einer der Proben in die (nicht dargestellte) Immersionsflüssigkeit eingetaucht. Das Umlenkmittel 6, das an dem Detektionsobjektiv 8 angebracht ist, befindet sich während der mikroskopischen Untersuchung in der Immersionsflüssigkeit.
Das Umlenkmittel 6 dient dazu, einen aus einem Beleuchtungsobjektiv 10 ausgetretenen Lichtstreifen 1 1 zu einer Beleuchtungsposition 5 so umzulenken, dass sich der Lichtstreifen 1 1 unter einem von Null Grad verschiedenen Winkel, insbesondere unter einem rechten Winkel, zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 10 ausbreitet. Auf diese Weise wird eine Schicht der in der Beleuchtungsposition 5 befindlichen Probe 1 mit dem vom Beleuchtungsobjektiv 10 fokussierten Lichtstreifen beleuchtet.
In der Figur 1 und in den Figuren 2 bis 6 ist der Lichtstreifen 1 1 der besseren Übersichtlichkeit halber nur teilweise und schematisch eingezeichnet. Eine etwas genauere Darstellung des Verlaufs des Lichtstreifens 1 1 findet sich in Figur 7.
Das von der beleuchteten Schicht ausgehende Detektionslicht, insbesondere Fluoreszenzlicht, wird durch das Detektionsobjektiv 8 hindurch zu einem (in Figur 1 nicht dargestellten) Detektor geleitet. Der Detektor kann beispielsweise einen Sensor zum Erfassen eines zweidimensionalen Bildes, beispielsweise einen CCD-Sensor, aufweisen.
Nachdem die gewünschten Bildinformationen bezüglich der beleuchteten Schicht aufgenommen sind, können der Probenhalter 2 und die jeweils in der Probenbeleuchtungsposition 5 befindliche Probe 1 relativ zueinander senkrecht zur Ebene des umgelenkten Lichtstreifens 1 1 und/oder parallel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 10 verschoben werden, um eine weitere, andere Schicht der Probe 1 zu beleuchten und mikroskopisch zu untersuchen. Alternativ ist es auch möglich, das Umlenkmittel und/oder das Beleuchtungsobjektiv 10 zu bewegen, um mit dem umgelenkten Lichtstreifen 1 1 eine andere Schicht der Probe 1 zu beleuchten. Beispielsweise kann das Beleuchtungsobjektiv 10 in Richtung seiner optischen Achse zum Wechseln der Beleuchtungsschicht bewegt werden. Alternativ oder zusätzlich ist es beispielsweise auch möglich, das Umlenkmittel 6 parallel zur Ebene des umgelenkten Lichtstreifens 1 1 und/oder senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 10 zu verschieben, um mit dem umgelenkten Lichtstreifen 1 1 eine andere Schicht der Probe 1 zu beleuchten.
Durch sukzessives Abtasten mehrerer Schichten kann so eine dreidimensionale Abbildung der die jeweils in der Probenbeleuchtungsposition 5 befindliche Probe 1 bzw. können Bilddaten gewonnen werden, die eine dreidimensionale Abbildung der jeweils in der Probenbeleuchtungsposition 5 befindliche Probe 1 ermöglichen.
Der Probenhalter 2, der die Proben 1 hält, ist vorzugsweise motorisch und/oder automatisch, relativ zu der Probenbeleuchtungsposition 5 derart bewegbar gelagert, dass sukzessive jeweils zumindest eine der Proben 1 in der Probenbeleuchtungsposition 5 positionierbar ist. Vorzugsweise ist der Probenhalter 2 mit einer Verschiebevorrichtung in zwei zueinander senkrechten Richtungen, von denen eine vorzugsweise die Längserstreckungsrichtung der Subhalter 3 ist, geführt bewegbar angeordnet, was in der Figur durch die Doppelpfeile 9 illustriert ist.
Dadurch, dass seitlich neben - und zwischen den Subhaltern 3 ausreichend Freiraum für das Umlenkmittel 6 verbleibt, kann durch eine einfache, insbesondere horizontale, Linearbewegung des Probenhalters 2 relativ zu dem Beleuchtungsobjektiv 10 jeweils die nächste Probe in die Beleuchtungsposition 5 verbracht und mikroskopisch untersucht werden. Zum Wechseln von einer Probe 1 zur nächsten Probe 1 desselben Subhalters 3 ist in vorteilhafter Weise lediglich und ausschließlich eine einzige Linearbewegung des Probenhalters 2 relativ zu dem Beleuchtungsobjektiv 10 nötig, was durch den Doppelpfeil 12 angedeutet ist. Lediglich zum Wechseln von einem Subhalter 3 zum nächsten Subhalter 3, was durch die gekrümmten Doppelpfeile 13 illustriert ist, ist auch eine Relativbewegung des Detektionsobjektivs samt dem Umlenkmittel in vertikaler Richtung erforderlich.
Fig. 2 zeigt eine Detailansicht eines anderen Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung. Bei dieser Ausführung sind die Subhalter 3 des Probenhalters 2 - ebenso wie bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführung - in einer durchsichtigen Schale 4 angeordnet. Jedoch anders als bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführung sind die Subhalter 3 des Probenhalters als weitere, durchsichtige und mit einem durchsichtigen, vorzugsweise flüssigem, Einbettungsmedium gefüllte Schalen ausgebildet, in denen jeweils mindestens eine Probe 1 angeordnet ist. Die weiteren Schalen sind innerhalb der durchsichtigen Schale 4 in einer gemeinsamen Ebene matrixförmig angeordnet. Zum Positionieren einer Probe 1 in der Beleuchtungsposition 5 wird das Detektionsobjektiv 8 samt dem Umlenkmittel jeweils von oben in die weiteren Schalen eingeführt, was in der Figur durch die gekrümmten Doppelpfeile 13 illustriert ist. Der Probenhalter ist auch bei dieser Ausführung mit einer (nicht dargestellten) Verschiebevorrichtung in zwei zueinander senkrechten Richtungen geführt bewegbar angeordnet, was in der Figur durch die Doppelpfeile 9 illustriert ist.
Fig. 3 zeigt eine Detailansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung, bei der der Probenhalter 2 einen Revolver 14 aufweist, der eine Vielzahl jeweils in einem Subhalter 3 gehaltenen Proben 1 trägt. Die Subhalter 3 sind würfelförmig ausgebildet, allerdings gibt es keine Beschränkung auf eine solche Form; vielmehr sind auch andere geometrische Formen möglich. Die Subhalter 3 bestehen jeweils aus einem formstabilen Einbettungsmedium, beispielsweise aus Agarose oder einem - vorzugsweise ähnlichen - gelartigen, durchsichtigen Medium, in das jeweils mindestens eine Probe 1 eingebettet ist.
Durch Drehen des Revolvers 14 können die Proben sukzessive in die Beleuchtungsposition 5 verbracht und mikroskopisch untersucht werden.
Das in Fig. 3 gezeigte Ausführungsbeispiel weist außerdem eine Handhabungsvorrichtung 14 auf, die die Subhalter 3 mit den zu untersuchenden Proben 1 automatisch in dem Revolver 14 anordnet und bereits untersuchte Proben 1 samt ihren Subhaltern 3 aus dem Revolver 14 entnimmt. Hierbei kann insbesondere vorteilhaft vorgesehen sein, dass die Handhabungsvorrichtung 14, vorzugsweise automatisch, die Proben 1 , die bereits untersucht wurden und bereits aus der Probenbeleuchtungsposition 5 durch Drehen des Revolvers 14 entfernt wurden, von dem Revolver 14 entnimmt und weitere, neue zu untersuchende Proben 1 samt deren Subhaltern 3 an den Revolver 14, insbesondere an die durch Entnehmen der bereits untersuchten Proben 1 freigewordene Positionen, übergibt. Auf diese Weise ist vorteilhaft ein kontinuierlicher Untersuchungsprozess erreicht, bei dem sukzessive, endlos und unterbrechungsfrei Proben 1 untersucht werden können.
In der Figur 3 ist, wie bereits erwähnt, der Lichtstreifen 1 1 der besseren Übersichtlichkeit halber nur teilweise und schematisch eingezeichnet. Außerdem sind der besseren Übersichtlichkeit halber im Bereich der Beleuchtung einige Konturlinien der dortigen Subhalter 3 nicht oder nur teilweise eingezeichnet.
Fig. 4 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer möglichen, erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung mit einem Probenträger 2, der ähnlich aufgebaut ist, wie der in Fig. 1 gezeigte Probenträger. Der Probenträger 2 beinhaltet jedoch lediglich einen Subträger 3.
Die optische Vorrichtung weist eine Lichtquelle 16 auf, die als Laser ausgebildet ist und ein im Querschnitt im Wesentlichen rundes Lichtbündel 17 emittiert. Das Lichtbündel 17 wird mit Hilfe einer Zylinderoptik 18 zu einem Lichtstreifen 1 1 geformt und gelangt anschließend zu dem Beleuchtungsobjektiv 10. Zur Führung und Formung des Lichtbündels 17 und des Lichtstreifens 1 1 sind optische Elemente 19, wie beispielsweise Spiegel und Linsen, vorhanden. Der Vorgang des Beleuchtens erfolgt so, wie in Bezug auf die in Fig. 1 dargestellte Ausführungsform oben beschrieben.
Das von der Probe 1 ausgehende Detektionslicht 20 gelangt über weitere optische Elemente 21 zu einem Detektor 22. Fig. 5 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer gegenüber der Ausführung, die in Fig. 4 dargestellt ist, abgewandelte Ausführung. Bei dieser Ausführung wird das von der Lichtquelle 16 erzeugte, im Querschnitt runde Lichtbündel 17 mit Hilfe einer Strahlablenkeinrichtung 23, die beispielsweise einen Galvanometerspiegel beinhalten kann, derart schnell in einer Ebene abgelenkt wird, dass de facto in der Beleuchtungsebene ein Lichtstreifen 1 1 vorliegt und/oder dass diese Beleuchtung mit den zur Detektion des von der Probe 1 ausgehenden Lichtes vorgesehenen Detektoren 22 und den nachgeschalteten Auswertevorrichtungen eines Mikroskops nicht von einem mit einer Zylinderoptik erzeugten Lichtstreifen 1 1 unterscheidbar ist und/oder dass die aufgenommenen Bilddaten sich nicht oder nicht wesentlich von den Daten unterscheiden, die bei einer Beleuchtung mit einem kontinuierlichen Lichtstreifen 1 1 erzeugt würden.
Fig. 6 zeigt ein anderes Ausführungsbeispiel einer möglichen, erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung.
Bei diesem Ausführungsbeispiel besteht der Probenhalter 2 aus einer durchsichtigen Objektträgerplatte 24, die einen quaderförmigen Subhalter 3 aus Agarose oder einem ähnlichen Medium trägt. In den Quader sind die zu untersuchenden Proben 1 eingebettet. Um nacheinander die einzelnen zu untersuchenden Proben 1 in die Beleuchtungsposition 5 zu verbringen, wird der Probenhalter 2 schrittweise in Richtung der Längserstreckungsrichtung des Subhalters 3 verschoben. Eine Besonderheit besteht darin, dass der Subhalter 3 während des laufenden Untersuchungsprozesses hergestellt wird. Hierzu ist ein Subhalter-Erzeugungsmittel 25, das ein Formungsmittel 26 aufweist, vorhanden. Das Subhalter-Erzeugungsmittel 25 empfängt über eine erste Zuleitung 27 einerseits Agarose oder ein ähnliches, durchsichtiges Medium, und andererseits über eine zweite Zuleitung 28 einzubettende Proben 1 . Es ist außerdem eine Lichtschrankenanordnung 29 mit einer Lichtquelle 30 und einem Lichtempfänger 31 vorgesehen, die die Abfolge der durch die zweite Zuleitung 28 zugeführten Proben 1 detektiert.
Das Formungsmittel 26 ist relativ zu dem Beleuchtungsobjektiv 10 ortsfest angeordnet und bewegt sich nicht mit der Objektträgerplatte 24 mit. Fig. 7 zeigt eine schematische Darstellung eines möglichen Verlaufs des Lichtstreifens 1 1 . In diesem Ausführungsbeispiel wird der Lichtstreifen 1 1 dadurch erzeugt, dass ein Lichtbündel 33 mit einer nicht dargestellten Strahlablenkeinrichtung kontinuierlich hin- und her bewegt wird, was in der Figur durch den gebogenen Doppelpfeil angedeutet ist. Insoweit ist in der Figur der besseren Übersichtlichkeit halber lediglich eine kurze Momentaufnahme dargestellt.
Das kontinuierlich hin- und her bewegte, aus dem Beleuchtungsobjektiv 10 austretende und von dem Beleuchtungsobjektiv 10 fokussierte Lichtbündel 33 gelangt zu einem Umlenkspiegel 7 und wird von diesem derart umgelenkt, dass er sich anschließend unter einem von 0° verschiedenen Winkel, im vorliegenden Beispiel unter einem Winkel von 90°, zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 10 ausbreitet. In der Beleuchtungsposition 5 weist das Lichtbündel 33 einen Fokus 32 auf. Der durch das schnelle Hin- und Herbewegen erzeugte Quasi-Lichtstreifen 1 1 befindet sich folglich in einer zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 10 senkrechten Ebene.
Es ist auch möglich, aber nicht zwingend erforderlich, die jeweils in der Beleuchtungsposition 5 befindliche Probe 1 mit mehreren Lichtstreifen 1 1 , die sich nach dem Umlenken vorzugsweise alle in derselben Beleuchtungsebene ausbreiten, aus verschiedenen Richtungen - simultan oder sequenziell - zu beleuchten. Dieser Fall ist in der Figur der besseren Übersichtlichkeit halber jedoch nicht eingezeichnet.
In Fig. 8 ist ein Ausführungsbeispiel eines speziellen Probenhalters gezeigt. Mit dem Bezugszeichen 34 ist die Bewegungsrichtung des Detektionsobjektivs 8 - welches lediglich schematisch angedeutet ist - dargestellt, bei welcher keine Kollision zwischen dem Umlenkmittel 6 bzw. den Umlenkspiegeln 7 und dem Probenstreifen bzw. Subhalter 3 erfolgt. Ein Probenstreifen kann beispielsweise aus Agar-Agar gebildet sein und kann ein bis mehrere Proben enthalten. Die gepunktet eingezeichneten Linien 35 deuten den Bewegungsverlauf der Umlenkspiegel 7 an, wobei die Umlenkspiegel 7 im Freiraum bzw. des vorgebbaren Bereich bewegt werden können, ohne mit dem Probenstreifen bzw. Subhalter 3 zu kollidieren. Grundsätzlich hängt der Freiraum bzw. der vorgebbare Bereich von dem Abstand der beiden Umlenkspiegel 7 und von der Ausdehnung des Probenstreifens bzw. Subhalters 3 ab. Weiterhin muss der Abstand zwischen zwei benachbarten Subhaltern 3 ausreichend groß sein, um Kollisionen zwischen den Subhaltern 3 und den Umlenkmitteln 6 bzw. Umlenkspiegeln 7 bzw. sonstigen Bauteilen, welche an dem Detektionsobjektiv 8 angeordnet sind, zu vermeiden.
Mit der gepunktet eingezeichneten Mittellinie 36 ist ein möglicher Bewegungsverlauf in einem sicheren Bereich 37 gezeigt, in welchem das Detektionsobjektiv 8 bewegt werden kann, ohne einen Probenstreifen bzw. Subhalter 3 zu durchschneiden. Der eingeschränkte Bewegungsbereich 38, in welchem sich die Probenstreifen bzw. Subhalter 3 befinden dürfen, ist grau hinterlegt gezeigt. In dem eingeschränkten Bewegungsbereich 38 darf eine Relativbewegung zwischen Probenhalter 2 und dem Detektionsobjektiv 8 nur in bestimmten, zum Subhalter 3 parallelen Bewegungsbahnen erfolgen, und zwar derart, dass immer sichergestellt ist, dass keine Probe bzw. Subhalter 3 durch das Beobachtungsobjektiv 8 beschädigt werden kann. Der Probenhalter 2 weist integrierte Kalibrierobjekte bzw. Marker 39 auf, welche markante Punkte an vorgegebenen Positionen, fluoreszierende Punkte, fluoreszierende Muster (beat Cluster) oder im mikroskopischen Durchlichtmodus sichtbare Mikrostrukturen aufweisen. Ein solcher integrierter Marker 39 könnte insbesondere auch zu Kalibrierzwecken dienen, er könnte nämlich angefahren werden, um beispielsweise eine Relativposition zwischen Beleuchtungs- und/oder Detektionsobjektiv und dem Probenhalter 2 bestimmen zu können.
In Fig. 9 ist in einer perspektivischen Ansicht ein Ausführungsbeispiel eines Probenhalters 2 mit im Wesentlichen länglich ausgebildeten Subhaltern 3 in einer Schale 4 gezeigt. Die Subhalter 3 sind im Wesentlichen parallel zueinander angeordnet. Der Bewegungsverlauf 37 des in Fig. 9 nicht gezeigten Detektionsobjektivs hat eine Mäanderform bzw. erstreckt sich in dem sicheren Bereich entlang der Längsseite und der Querseite des Probenhalters 2. Bei einem speziellen Probenhalter 2 können die Positionen der Subhalter 3 fest vorgegeben sein. Die Positionen können aus einem Speicher ausgelesen werden, wenn das System erkennt, dass Proben auf dem speziellen Probenhalter 2 detektiert werden sollen. In Fig. 10 ist in einer perspektivischen Ansicht ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Probenhalters 2 mit Subhaltern 3 in einer Schale 4 gezeigt. Die Subhalter 3 können unterschiedliche Längen aufweisen und sind im Wesentlichen parallel zueinander angeordnet. Die Längsrichtungen der Subhalter 3 können jedoch auch entlang unterschiedlicher Richtungen orientiert sein (nicht gezeigt) bzw. nicht parallel angeordnet sein. In Fig. 10 ist ein optimiert berechneter Bewegungsverlauf 37 des in Fig. 10 nicht gezeigten Detektionsobjektivs gezeigt. Dies könnten der kürzeste Bewegungsverlauf des Detektionsobjektivs und/oder die kürzeste Detektionsdauer sein, wobei jedoch eine Kollision zwischen Detektionsobjektiv/Umlenkmittel und der Probe vermieden werden soll. So wird z.B. innerhalb des eingeschränkten Bewegungsbereichs 38 der kürzeste Bewegungsverlauf zwischen dem Endpunkt 40 des einen Subhalters 3 und dem Anfangspunkt 41 des nächsten Subhalters 3 ermittelt. Liegt der Endpunkt 42 zu nahe am Rand des eingeschränkten Bewegungsbereiches 38, so wird der nächste Subhalter 3 über den sicheren Bereich 37 angefahren.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zum mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
a. Anordnen der Proben in einem, insbesondere motorisch und/oder automatisch, relativ zu einer Probenbeleuchtungsposition bewegbaren Probenhalter derart, dass sukzessive jeweils zumindest eine der Proben in der Probenbeleuchtungsposition positionierbar ist, wobei jeweils angrenzend an die Probe, die sich gerade in der Probenbeleuchtungsposition befindet, ein Freiraum für ein Umlenkmittel, verbleibt,
b. Fokussieren eines Lichtstreifens mit einem Beleuchtungsobjektiv,
c. Umlenken des Lichtstreifens nachdem dieser das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen hat mit dem Umlenkmittel derart, dass sich der Lichtstreifen unter einem von Null Grad verschiedenen Winkel, insbesondere unter einem Winkel größer als 10 Grad, ganz insbesondere unter einem rechten Winkel, zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs ausbreitet und in der Probenbeleuchtungsposition einen Fokus aufweist, und
d. Sukzessives Positionieren der mit dem Probenhalter gehalterten Proben in der Probenbeleuchtungsposition und Detektieren des von der jeweils in der Probenbeleuchtungsposition befindlichen Probe ausgehenden Detektionslichtes.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass
a. die Proben mit dem Probenhalter in Matrixform und/oder in einer gemeinsamen Ebene gehalten sind oder dass
b. die Proben mit dem Probenhalter in wenigstens einer geraden Reihe gehalten sind oder das
c. die Proben mit dem Probenhalter in einer gebogenen Reihe, insbesondere in einer ringförmigen Reihe gehalten sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
a. eine oder mehrere der Proben in einem Subhalter des Probenhalters gehaltert sind und/oder dass
b. der Probenhalter mehrere, insbesondere strangförmige, Subhalter aufweist, mit denen jeweils mindestens eine Probe gehaltert ist und/oder dass c. der Probenhalter wenigstens einen strangförmigen Subhalter aufweist, mit denen jeweils mindestens eine Probe, insbesondere jeweils eine Reihe von Proben, gehaltert ist, und/oder dass
d. der Probenhalter mehrere strangförmige Subhalter aufweist, die in einer gemeinsamen Ebene und/oder parallel zueinander ausgerichtet sind und/oder dass
e. der Probenhalter mehrere würfelförmige Subhalter aufweist, mit denen jeweils mindestens eine der Proben gehaltert ist und/oder dass
f. der Probenhalter als Schalen ausgebildete Subhalter aufweist, in denen jeweils mindestens eine Probe angeordnet ist und/oder dass
g. der Probenhalter eine, insbesondere zylinderförmige, Röhre aufweist, in der wenigstens eine der Proben gehalten ist oder in der mehrere der Proben angeordnet, insbesondere aufgereiht, sind und/oder dass
h. die Probenbeleuchtungsposition außerhalb des Beleuchtungs-objektivs, jedoch in Verlängerung der optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Subhalter ein Einbettungsmedium, insbesondere Agarose oder ein - vorzugsweise ähnliches - gelartiges, durchsichtiges Medium, aufweist, in das die von dem Subhalter gehaltene Probe eingebettet ist oder die von dem Subhalter gehaltenen Proben eingebettet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass
a. die Proben, die bereits untersucht wurden und bereits aus der Probenbeleuchtungsposition entfernt wurden, insbesondere automatisch, aus dem Probenhalter entnommen werden oder dass
b. die Proben, die bereits untersucht wurden und bereits aus der Probenbeleuchtungsposition entfernt wurden, insbesondere automatisch, aus dem Probenhalter entnommen werden und weitere zu untersuchende Proben an den Probenhalter, insbesondere an freigewordene Positionen des Probenhalters, übergeben werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass
a. der Probenhalter gedreht wird, um jeweils die nächste zu untersuchende Probe in der Beleuchtungsposition zu positionieren und/oder dass
b. der Probenhalter um die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs oder um eines zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs parallele Achse gedreht wird, um jeweils die nächste zu untersuchende Probe in der Beleuchtungsposition zu positionieren und/oder dass
c. der Probenhalter relativ zur Beleuchtungsposition in wenigstens einer Richtung linear verschoben wird, um jeweils die nächste zu untersuchende Probe in der Beleuchtungsposition zu positionieren und/oder dass
d. eine Verschiebevorrichtung vorhanden ist, mit der der Probenhalter, insbesondere automatisch, in zwei verschiedene, insbesondere zueinander orthogonale, Richtungen verschiebbar ist und/oder dass
e. eine Verschiebevorrichtung vorhanden ist, mit der der Probenhalter, insbesondere automatisch, in drei verschiedene, insbesondere zueinander orthogonale, Richtungen verschiebbar ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass
a. das Umlenkmittel und die in der Beleuchtungsposition befindliche Probe in einer gemeinsamen Ebene angeordnet sind, wobei das Umlenkmittel innerhalb dieser Ebene die in der Beleuchtungsposition befindliche Probe nur unvollständig, insbesondere nur einseitig oder auf zwei gegenüberliegenden Seiten, umgibt, und/oder dass
b. wenigstens ein Bereich innerhalb einer Ebene, in der sich die Probenbeleuchtungsposition und das Umlenkmittel befinden, frei bleibt, durch den Proben in die Probenbeleuchtungsposition verbracht und aus dieser entfernt werden können.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Typ des jeweils verwendeten Probenhalters automatisch, insbesondere softwaregesteuert, erkannt wird und dass das sukzessive Positionieren der Proben in der Beleuchtungsposition, insbesondere automatisch, unter Berücksichtigung des erkannten Typs und/oder unter Verwendung einer dem erkannten Typ zugeordneten, insbesondere in einem Softwarespeicher abgelegten, Positionswechselroutine erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Proben automatisch in dem Probenhalter und/oder in einem Subhalter des Probenhalters angeordnet werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstreifen ein Quasi-Lichtstreifen ist, der aus einem in einer Lichtstreifenebene kontinuierlich hin- und herbewegtem Lichtbündel besteht.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstreifen derart in das Beleuchtungsobjektiv eingekoppelt wird, dass er außermittig durch das Beleuchtungsobjektiv verläuft.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht ebenfalls durch das Beleuchtungsobjektiv verläuft und/oder mit dem Beleuchtungsobjektiv kollimiert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv verläuft und/oder mit einem Detektionsobjektiv kollimiert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die optische Achse des Detektionsobjektivs parallel und/oder kollinear zueinander ausgerichtet sind.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass
a. das Beleuchtungsobjektiv und die Umlenkvorrichtung relativ zueinander beweglich angeordnet sind und/oder dass
b. die Umlenkvorrichtung beweglich an dem Beleuchtungsobjektiv befestigt ist und/oder dass
c. die Umlenkvorrichtung beweglich an dem Detektionsobjektiv befestigt ist.
16. Optische Vorrichtung mit einem Probenhalter, der eine Vielzahl von Proben hält und der, insbesondere motorisch und/oder automatisch, relativ zu einer Probenbeleuchtungsposition derart bewegbar gelagert ist, dass sukzessive jeweils zumindest eine der Proben in der Probenbeleuchtungsposition positionierbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils angrenzend an die Probe, die sich gerade in der Probenbeleuchtungsposition befindet, ein Freiraum für ein Umlenkmittel vorhanden ist, das den aus einem Beleuchtungsobjektiv austretenden Lichtstreifen zu der Beleuchtungsposition so umlenkt, dass sich der Lichtstreifen unter einem von Null Grad verschiedenen Winkel, insbesondere unter einem rechten Winkel, zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs ausbreitet, und mit einem Detektor, der das von der jeweils in der Probenbeleuchtungsposition befindlichen Probe ausgehende Detektionslicht detektiert.
17. Optische Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass
a. die Proben mit dem Probenhalter in Matrixform und/oder in einer gemeinsamen Ebene gehalten sind oder dass
b. die Proben mit dem Probenhalter in wenigstens einer geraden Reihe gehalten sind oder das c. die Proben mit dem Probenhalter in einer gebogenen Reihe, insbesondere in einer ringförmigen Reihe gehalten sind.
18. Optische Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass
a. eine oder mehrere der Proben in einem Subhalter des Probenhalters gehaltert sind und/oder dass
b. der Probenhalter mehrere, insbesondere strangförmige, Subhalter aufweist, mit denen jeweils mindestens eine Probe gehaltert ist und/oder dass
c. der Probenhalter wenigstens einen strangförmigen Subhalter aufweist, mit denen jeweils mindestens eine Probe, insbesondere jeweils eine Reihe von Proben, gehaltert ist, und/oder dass
d. der Probenhalter mehrere strangförmige Subhalter aufweist, die in einer gemeinsamen Ebene und/oder parallel zueinander ausgerichtet sind und/oder dass
e. der Probenhalter mehrere würfelförmige Subhalter aufweist, mit denen jeweils mindestens eine der Proben gehaltert ist und/oder dass
f. der Probenhalter als Schalen ausgebildete Subhalter aufweist, in denen jeweils mindestens eine Probe angeordnet ist und/oder dass
g. der Probenhalter eine, insbesondere zylinderförmige, Röhre aufweist, in der wenigstens eine der Proben gehalten ist oder in der mehrere der Proben angeordnet, insbesondere aufgereiht, sind und/oder dass
h. die Probenbeleuchtungsposition außerhalb des Beleuchtungs-objektivs, jedoch in Verlängerung der optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs angeordnet ist.
19. Optische Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Subhalter ein Einbettungsmedium, insbesondere Agarose oder ein - vorzugsweise ähnliches - gelartiges, durchsichtiges Medium, aufweist, in das die von dem Subhalter gehaltene Probe eingebettet ist oder die von dem Subhalter gehaltenen Proben eingebettet sind.
20. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Handhabundvorrichtung vorhanden ist, die
a. die Proben, die bereits untersucht wurden und bereits aus der Probenbeleuchtungsposition entfernt wurden, insbesondere automatisch, aus dem Probenhalter entnimmt oder die
b. die Proben, die bereits untersucht wurden und bereits aus der Probenbeleuchtungsposition entfernt wurden, insbesondere automatisch, aus dem Probenhalter entnimmt und weitere zu untersuchende Proben an den Probenhalter, insbesondere an freigewordene Positionen des Probenhalters, übergibt.
21. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass
a. eine Steuerungsvorrichtung vorhanden ist, die den drehbar gelagerten
Probenhalter dreht, um jeweils die nächste zu untersuchende Probe in der Beleuchtungsposition zu positionieren und/oder dass
b. eine Steuerungsvorrichtung vorhanden ist, die den Probenhalter um die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs oder um eines zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs parallele Achse dreht, um jeweils die nächste zu untersuchende Probe in der Beleuchtungsposition zu positionieren und/oder dass c. eine Steuerungsvorrichtung vorhanden ist, die den verschiebbar gelagerten Probenhalter mit einer Verschiebevorrichtung relativ zur Beleuchtungsposition in wenigstens einer Richtung linear verschiebt, um jeweils die nächste zu untersuchende Probe in der Beleuchtungsposition zu positionieren und/oder dass d. eine Verschiebevorrichtung vorhanden ist, mit der der Probenhalter, insbesondere automatisch, in zwei verschiedene, insbesondere zueinander orthogonale, Richtungen verschiebbar ist und/oder dass
e. eine Verschiebevorrichtung vorhanden ist, mit der der Probenhalter, insbesondere automatisch, in drei verschiedene, insbesondere zueinander orthogonale,
Richtungen verschiebbar ist.
22. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass
a. das Umlenkmittel und die in der Beleuchtungsposition befindliche Probe in einer gemeinsamen Ebene angeordnet sind, wobei das Umlenkmittel innerhalb dieser
Ebene die in der Beleuchtungsposition befindliche Probe nur unvollständig, insbesondere nur einseitig oder auf zwei gegenüberliegenden Seiten, umgibt, und/oder dass
b. wenigstens ein Bereich innerhalb einer Ebene, in der sich die Probenbeleuchtungsposition und das Umlenkmittel befinden, frei bleibt, durch den
Proben in die Probenbeleuchtungsposition verbracht und aus dieser entfernt werden können.
23. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuerungsvorrichtung den Typ des jeweils verwendeten Probenhalters automatisch, insbesondere softwaregesteuert, ermittelt und das sukzessive Positionieren der Proben in der Beleuchtungsposition, insbesondere automatisch, unter Berücksichtigung des ermittelten Typs und/oder unter Verwendung einer dem ermittelten Typ zugeordneten, insbesondere in einem Softwarespeicher abgelegten, Positionswechselroutine vornimmt.
24. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass eine Handhabungsvorrichtung vorhanden ist, die zu untersuchenden Proben automatisch in dem Probenhalter und/oder in einem Subhalter des Probenhalters anordnet und/oder bereits untersuchte Proben aus dem Probenhalter entnimmt.
25. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstreifen ein Quasi-Lichtstreifen ist, der aus einem in einer
Lichtstreifenebene kontinuierlich mit einer Strahlablenkeinrichtung hin- und herbewegtem Lichtbündel besteht.
26. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtstreifen außermittig durch das Beleuchtungsobjektiv verläuft.
27. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht durch das Beleuchtungsobjektiv verläuft und/oder von dem Beleuchtungsobjektiv kollimiert wird.
28. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv verläuft und/oder von einem Detektionsobjektiv kollimiert wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die optische Achse des Detektionsobjektivs parallel und/oder kollinear zueinander ausgerichtet sind.
30. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass
a. das Beleuchtungsobjektiv und die Umlenkvorrichtung relativ zueinander beweglich angeordnet sind und/oder dass
b. die Umlenkvorrichtung beweglich an dem Beleuchtungsobjektiv befestigt ist und/oder dass
c. die Umlenkvorrichtung beweglich an dem Detektionsobjektiv befestigt ist.
31. Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Vorrichtung durch Umrüstung eines Scanmikroskops, insbesondere eines konfokalen Scanmikroskops, hergestellt ist.
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