【명세서】
【발명의 명칭】
반복사슬과 단량체의 복합체 간의 교차결속에 의해 형성된 초복합체 및 이의 용도 【기술분야】
본 발명은 반복사슬과 단량체의 복합체 간의 교차결속에 의해 형성된 초복합체 및 이를 통한 단량체의 생물화학적 효과를 증폭하는 기술에 관한 컷이다.
구체적으로, 단량체 (monomer)에 결속 (binding) 특이성이 있는 결속부위 (binding domain)의 반복사슬을 유효성분으로 포함하여 반복사슬과 단량체의 복합체 (complex)를 형성하고 이들 복합체 사이에 교차결속 (cross-binding)에 의해 엉김체 (aggregate)인 초복합체 (super-complex)가 생성된다. 이런 초복합체에는 다수의 단량체가 들어 있으므로 단량체의 표적에 대한 생물학적 화학적 효과가 단량체에 비해 매우 높은 배수의 효과를 주어 단량체의 효과가 증폭되는 결과를 준다.
여기서, 반복사슬은 자연계에 존재히 "는 단량체에 대한 특이적 결속력이 있는 물질이나 결속력이 있는 일부의 도메인으로 만들 수 있고 이런 결속체가 결속하는 (bidinding) 단량체은 매우 다양하며,그 예로는 리간드,수용체,항체,효소 등이 있다. 반복시슬을 이용하여 다수의 단량체와 반복시슬의 복합체와 그 복합체들의 초복합체를 만들어 사용하면 단량체의 효과를 매우 크게 증폭시킬 수 있다. 이러한 단량체는 생물학적 화학적 작용기가 연결 ( l inked) , 접합 (conjugated) , 융합 (fusion)되어 있을 수 있으며 , 이 경우 그 작용기의 효과가 매우 크게 증폭될 수 있다.
【배경기술】
단량체가 단량체의 표적 (target) 물질을 탐지 (detect ion)하기 위해 표적에 결속 (binding)하고 그 탐지신호 (detect ion signal )를 주는 경우에는 그 단량체의 효과인 탐지신호의 세기는 검출표적물질 (target )의 농도 검출표적물질과 탐지탐침물질 (detect ion probe) 사이의 결속도 (binding aff inity, 친화도), 탐침물질 (probe)의 농도, 탐침물질의 신호 (signal )의 세기 등에 의해 결정된다. 일반적인 경우에서는 탐침물질은 단량체이고, 검출표적물질은 단량체의 표적물질, 신호는 단량체의 효과에 해당한다. 항체를 이용한 검출 방법인 면역크로마토그래피법 ( Immunochromatographic assay)은 신속항원검사법 (rapid ant igen test) , 시료의 흐름이 측선일 경우의 측선유동검사법 ( lateral f low test) 또는 간단히 스트립 검사법 (strip test)라고도 불리우며 진단 키트 개발을 위해 광범위하게 웅용되고 있다. 현재까지 보고된 면역크로마토그래피법을 이용한 진단분야로는 약물남용, 혈액 내 구성 성분, 박테리아 그룹 A 스트렙토코컬 (group A streptococcal ) 항원, ¾리코박터 파아로리 (Hel icobacter pylori ) , 사람의 마이코박테리움 튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) , 바이러스 (간염 B 표면 (hepat it is B surface) 항원 및 항체, 뎅기열 바이러스 (Dengue virus) , 인플루엔자 ( inf luenza) , 기생충 (말라리아 진단을 위한 플라스모디움 팔시파럼 (Plasmodium falciparum) 등이 있다. 면역크로마토그래피법은 사용이 간편하고 검사 소요시간이 5 내지 10분 이내로 매우 신속하며 실온에서도 보존성이 뛰어나고 검사비용이 저렴하다는 장점을 가지므로, 다양한 검사 목적으로 사용할 수 있는 질병 진단의 최적 기술이다.
이러한 면역크로마토그래피법의 발색체로서 콜로이드 골드 (Col loidal gold)가 널리 사용되며, 이를 표지한 면역글로불린 G瞧 unoglobul in)은 질병 진단분야에서 매우 유용하게 시"용되고 있다. 면역글로불린과 결합한 콜로이드 골드 입자들은 항원분자를 직접 검출하는데 웅용되었다. 1981년 Leuvering 등은 졸 입자 면역분석 (sol particle immunoassay, SPIA)이라 부르는 골드 입자 웅집 분석 (gold particle agglutination assay)을 개발하였으며, 이를 이용한 임신진단키트를 개발하였다. 이후 세균, 바이러스, 기생충 및 곰광이성 질병 .진단올 위해 골드 (gold)를 이용한 멤브레인 검사법이 소개되었고, 이와 같은 신속 항원 면역검사법 역시 콜로이드 골드를 이용하여 사용이 간편하고 검사 소요시간이 10 내지 15분으로 매우 신속한 야외 진단방법으로서 개발되었다. 이러한 신속항원진단법은 사람의 전염병의 조기 차단뿐만 아니라 동물의 전염병의 조기 진단 및 차단에 사용될 수 있는 중요성을 갖는다. 현재 용되고 있는 신속 항원 진단키트의 문제점은 급성질환 증상이 나타난 후 가급적 2~3일 이내에 검사해야만 유용한 결과를 나타난다는 것이다. 예를 들면, 바이러스 진단의 경우 증상 발현 3일 이후 바이러스가 급감함에 따라 신속 항원 진단키트에서 음성결과가 나타날 수 있다. 또한, 나이가 어린 환자인 경우 바이러스 농도의 감소 시기가 더 길어질 수 있어 증상 발현 후 5일 이후에 검체를 채취해 검사해도 유용하나, 성인 환자인 경우 시간이 지날수록 바이러스 농도가 급격히 감소하기 때문에 증상이 발현된 후 4~5일 이내로 검체를 채취해야 하는바, 나이에 따라 항원 진단이 제한적이다. 아울러, 기존의 신속 항원 진단시약 제품들의 민감도는 낮은 항원 농도의 시료에 대해 기대보다 낮은 수준이다. 세계적으로 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 신속진단시약이 출시되어 시용되고 있으며, 이들 제품의 민감도가 지속적으로 향상되고 있으나, 계절 질환에 대해서는 60~83¾의 민감도를 보이며, 신종 스와인 바이러스에 대해서는 40~69% 수준의 민감도를 보인다. 미국내 시판 중인 'BinaxNow'와 백른 디킨슨사의 ΈΖ 폴루 A+B' , 퀴델사의 'Quickvue' 등 3 개 진단 테스트의 효능은,시험 결과 H1N1 바이러스 검출 비율이 BinaxNow 가 40%로 가장 낮았고 Quickvue는 , EZ 플루 A+B 는 49%에 그쳤다 (Centers for Disease Control and Prevent ion (CDC) , Evalulation of rapid influenza diagnostic tests for detect ion of novel influenza A (HlNl) virus: United States, 2009. Morb Mortal Wkly Rep 2009; 58:826-829) .
상기 기존 신속 항원 진단시약의 민감도가 낮은 이유는, 어린 나이의 감염자를 제외한 감염자의 신체 내 낮은 바이러스 양과 최상의 상태로 채취되지 못한 채취된 검체에 검사시에 필요한 충분한 양의 바이러스가 포함되어 있지 않았기 때문이다. 따라서 , 바이러스에 감염된 상태일지라도 환자로부터 채취된 검체에 충분한 양의 항원이 포함되어 있지 않을 경우, 질병을 정확히 진단할 수 없으므로, 검체 안의 낮은 농도의 항원을 검출할 수 있는 방법 및 물질에 대한 연구가 필요하다. 기존에 본 발명자들은 항체-독소와 같은 단량체에 대해 항체의 Fab에 결속 특이성을 갖는 결속체의 반복사슬을 골격 (matrix, scaffold)으로 이용하여 , 단량체와 반복사슬의 복합체를 제작하여 단량체의 국부 농도 ( local concentration)을 높임으로써 단량체간의 충돌빈도를 높이고, 이로써 결합 가교의 생성을 촉진시켜 결합 가교 다량체의 수득률을 향상시키는 방법을 개발한바 있다 (대한민국 등록특허번호 제 10-1161323호) . 상기 발명은 단량체에 대해 결속 특이성을 갖는 결속체의 반복사슬을 이용하여
단량체들의 결합 가교의 생성을 촉진시켜 결합 가교 다량체를 대량으로 얻는 방법이지만, 상기 단량체에 결속 특이성이 있는 결속체 반복사슬을 면역 분석에 이용하여 항체의 효과를 증폭시키는 방법은 현재까지 밝혀진 바 없다. 본 발명자들은 낮은 농도의 항원을 진단하고자 할 때, 이의 검출 민감도를 높이고자 연구하였으며 , 항원 탐지에 쓰이는 방법인 웨스턴 블랏팅 (western blotting) , 효소면역즉정법 '(enzyme— l inked immunosorbent assay, ELISA) , FACS(F 1 uorescence act ivated cel l sorter) 등에도 신호 증폭제로서 항체 단량체에 결속특이성이 있는 결속체 반복사슬을 사용하였을 때, 낮은 농도의 항원에 대하여 높은 민감도를 갖는 것을 확인하였으므로 항체를 탐지 단량체로 이용하여 항원을 탐지하는 분석에 탐지 항체 단량체의 효과를 증폭하여 유용하게 활용할 수 있음을 밝혔다. 본 발명의 상을 적용할 수 있는 단량체와 그에 결속하는 결속부위의 쌍은 자연에서 무수히 많은 경우가 있다.
[발명의 상세한 설명]
[기술적 과제】
본 발명의 목적은 항체, 수용체, 신호전달물질 , 효소 등의 단량체 (monomer)에 결속특이성 (binding specif icity^ 있는 결속도메인 (binding domain)의 반복사슬을 유효성분으로 포함하여 반복시슬과 단량체의 복합체 (complex)를 형성하고 이들 복합체 사이에 교차결속 (cross-binding)이 일어나서 생성되는 초복합체 (super-complex)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 초복합체에는 다수의 단량체가 들어 있으프_로 단량체의 표적에 대한 생물학적 화학적 효과가 단량체에 비해 매우 높은 배수의 효과를 주어 단량체의 효과가 증폭되는 결과를 주기 때문에, 상기 초복합체를 이용하여 단량체의 효과를 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.
[기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 [1] ~ [13]을 제공한다.
[1] 본 발명은 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제조하는 단계를 포함하는, 초복합체 생산용 반복사슬의 제조방법올 제공한다. ᅳ
[2] 본 발명은 1) 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제조하는 단계 ; 및, 2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 상기 반복사슬에 결속부위를 두 개 이상 갖는 단량체를 흔합시켜 디수단량체 /반복시슬 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 초복합체 생산용 다수단량체 /반복사슬 복합체의 제조방법을 제공한다.
[3] 본 발명은 1) 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제조하는 단계 ; 2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 상기 반복사슬에 결속부위를 두 개 이상 갖는 단량체를 흔합시켜 다수단량체 /반복사슬 복합체를 제조하는 단계 ; 및, 3) 상기 단계 2)의 다수단량체 /반복사슬 복합체들 간에 교차결속 (cross-binding)을 형성시켜 상기 복합체들의 집단인 엉김체 (aggregate)를 생성하는 단계를 포함하는
초복합체 (super-complex)의 제조방법을 제공한다.
[4] 본 발명은 상기 [1]의 제조방법으로 제조된 반복시ᅳ슬을 제공한다.
[5] 본 발명은 상기 [2]의 제조방법으로 제조된 다수단량체 /반복사슬 복합체를 제공한다.
[6] 본 발명은 상기 [3]의 제조방법으로 제조된 초복합체 (super-complex)를 제공한다.
[7] 본 발명은 단량체의 표적에, 상기 [4]의 반복사슬, 상기 [5]의 다수단량체 /반복사슬 복합체 또는 상기 [6]의 초복합체를 흔합시켜 상기 단량체의 표적에 결속된 초복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 단량체의 효과 증폭 방법을 제공한다.
[8] 본 발명은 생물화학적으로 작용하고자 또는 검출하고자 하는 표적에 특이적이고 한 개의 단량체 내에 반복사슬에 대해 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단량체, 및 상기 단량체에 결속 특이성이 있는 결속도메인의 반복시슬을 포함하는 생물화학적 작용, 검출, 분석, 진단, 치료 키트를 제공한다.
[9] 본 발명은 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복시슬에 생물화학작용기 또는 검출기능기 (biological and chemical effector group or detect ion funct ional group)를 연결 ( l inked) , 접합 (conjugated) 또는 융합 (fusion)시키는 단계를 포함하는 반복사슬"생물화학작용기의 제조방법을 제공한다.
[10] 본 발명은 1) 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복시슬에 생물화학작용기를 연결 ( l inked) , 접합 (conjugated ) 또는 융합 (fusion)시켜 반복사슬"생물화학작용기를 제조하는 단계 ; 및, 2) 상기 단계 1)의 반복시슬~생물화학작용기에 단량체를 흔합시켜 다수단량체 /반복시슬 "생물화학작용기의 복합체의 제조방법을 제공한다.
[11] 본 발명은 상기 [9]의 제조방법으로 쎄조된, 단량체 결속 도메인의 반복사슬 "생물화학작용기를 제공한다.
[12] 본 발명은 상기 [1이의 제조방법으로 제조된, 다수단량체 /반복시슬 "생물화학작용기의 복합체를 제공한다.
[13] 본 발명은 단량체의 표적에, 상기 [12]의 다수단량체 /반복사슬"생물화학작용기의 복합체를 흔합시켜 상기 단량체 4 표적에 결속된 초복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 표적에 대한 생물화학 작용, 검출, 분석 , 진단, 치료방법을 제공한다.
【유리한 효과 3
본 발명에 있어서, 다수의 단량체와 반복시슬은 결속을 통해 복합체를 형성하고, 이들 복합체들 사이에 교차결속이 일어나서 불용성 초복합체를 형성하며, 이는 고농도일 때 침전된다. 초복합체의 엉김, 침전 및 크기는 단량체와 반복사슬의 구조에 의존적이고, 반복사슬 내 결속도메인의 반복수는 복합체들 사이 교차결속에 영향을 주며 , 단량체의 수용성 및 분자 크기는 복합체 사이의 교차결속의 기회에 영향을 준다. 이런 초복합체 형성은 상기 초복합체 내에 다수의 단량체가 들어 있으므로 단량체의 표적에 대한 생물학적 화학적 효과가 단량체에 비해 매우 높은 배수의 효과를 제공하므로, 단량체의 대표적 물질인 항체를 이용한 탐지신호와 작용효과, 치료효과의 증폭 등에 유용하게 이용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 발현 플라스미드의 제작 개요도로서, GR1 - 10까지와 내용을 나타낸 것이다. 도 la는 pGRl 백터를 이용하여 pGR2부터 pGRO까지 만들었으며, 같은 방법으로 pGR20까지 제작하였다. 각 플라스미드는 도메인 m 사이에 하나의 G4S 링커가 있다. 도 lb는 PGR2-2, -3, -4 시리즈는 두 개의 도메인 m 사이에 G4S 링커가 두 개, 세 개 , 네 개가 있다.
도 2는 정제한 단백질 G 도메인 ΙΠ 반복사슬의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. 정제된 반복사슬은 16% SDS-PAGE로 분석하였다. 1번부터 13번 레인은 GR1, GR2, GR2-2, GR2-3, GR2-4, GR3, GR4, GR5, GR6, GR7, GR8, GR9, 및 GR10 이다.
도 3은 GR시리즈 complex의 Size-exclusion 크로마토그래피 결과를 나타낸 그림이다. 두 개의 수직 화살표는 disulfide-dimer (왼쪽) [Fab-ext-PE38]2과 monomer (오른쪽) Fab-e¾-PE38의 피크를 각각 나타낸다. 오른쪽 표는 GR complex의 겉보기 분자량을 비교한 것이다. 단량체 monomer(»와 이황화가교 이량체 disul fide-bridged dimer(«)의 겉보기 분자량을 나타내었다. 도식화한 그림은 Fab-ext-PE38의 GR3 또는 GR7과의 complex를 보여주는 것이다.
도 4는 GR2-2, -3, -4와의 complex의 Size-exclusion 크로마토그래피 결과를 나타낸 그림이다. A는 size-exclusion chromatography이다. 두 세로 화살표의 왼쪽은 [Fab-ext-PE38]2 피크이고 오른쪽은 Fab-ext-PE38 피크를 나타낸 것이다. B는 일션 프로파일은 Fab-ext-PE38와 GR2-2, -3, -4 사이의 복합체의 size-exclusion chromatography를 보여준다. 분획은 non-reducing 8% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하였다. 9 - 15.5까지의 용출 부피에 해당하는 분획을 분석하였다. 화살표 (arrow)는 [Fab-ext-PE38]2을 나타낸 것이다. 화살촉 (arrowhead)은
Fab-ext-PE38을 나타낸 것이다. C는 reducing 12% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분획을 전기영동 하였다. 화살표 (arrow) , 화살촉 (arrowhead), 흰 화살표 (open arrow)는 각각 Fd-ext-PE38, H6-L, 및 GR 단백질을 나타낸 것이다.
도 5는 [Fab-ext-PE38]2 및 Fab_ext-PE38의 흔합물에 대한 GR2 또는 GR3와의 복합체 분석결과를 나타낸 그림이다. A, 크기 배제 크로마토그래피이다. 395 의 [Fab-ext-PE38]2와 Fab_ext-PE38 흔합물을 GR2 또는 GR3 단백질과 섞어 주었다. 15 //g의 GR protein을 사용하였다. 세로 화살표와 숫자는 피크의 위치를 나타낸다. B, 용출된 분획의 SDS-PAGE이다. [Fab-ext-PE38]2 와 [Falrext-PE38] 흔합물을 컨트를로 사용하였으며, Non-reducing 8% 아크릴아마이드 겔을 전기영동 하였다. 용출 부피가 7 ml에서 12.5 nil에 해당하는 같은 13 - 26 번 분획들을 서로 비교하였다. 검은 화살표 (arrow)와 흰 화살표 (open arrow)는 각각 [Fab_ext-PE38]2 과 Fatrext_PE38을 나타낸다.
도 6은 Fab-PE38 단량체와 GR2-2, -3, -4를 섞은 단백질의 크기 배제 크로마토그램의 비교 결과를 나타낸 그림이다. Fab-PE38 단량체 (오른쪽)와 이황화가교이량체 (왼쪽)의 수직 화살표가 컨트를이다. Fab-PE38 단량체와 GR2-2부터 2-4까지 섞은 것이 크로마토그램에 겹쳐 나타난다. 이는 생성된 복합체에 Fab-PE38 단량체가 두 개 들어있어서 단량체의 이량체 형태로 복합체가 형성되어 있음을 보여준다. 도 7은 GR 반복사슬들과 Fab-PE38 단백질의 복합체의 정제를 위한 크기배,제 크로마토그래피 결과를 나타낸 그림이다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용해 최종적으로 단백질을 정제하였다. 모든 크로마토그램은 자외선 흡광도 280 m에 의한 기록이다. 크로마토그램은 같은 용출부피가 되도록 같은 간격으로 겹처 배열 하였다.
A는 GR1 ~ 6을 정제하기 위해 Hi load superdex-75 pg(26/60) 컬럼을 사용하몄다. B는 GR7 ~ 10을 정제하기 위해 Hi load superdex-200 pg(26/60) 컬럼을 사용하였다. C는 antibody-toxin을 최종적으로 정제하기 위해 Hi load superdex-200 pg(26/60) 컬럼을 사용하였다.
도 8은 Fab-toxin 단량체와 GR10 또는 GR2-2, GR2-3, GR2-4 와의 복합체 내에서 환원산화 섞음 반웅에 의한 Fab-toxin 단량체로 부터의 이황화가교 이량체 형성 결과를 8% 비환원 SDS-PAGE 로 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 제 1통로: 반웅시작 시료인 Fab-toxin 단량체 . 제 2통로: 상온에서 40mM 2Ttiercaptoethanol 로 30분간 환원시킨 시료. 제 3통로: 37° C에서 5mM glutathione oxidized form (GSSG) 으로 2시간 산화시킨 시료. 화살표는 위에서부터 환원산화 섞음 반웅에 의해 생성된 이황화가교 이량체, Fab-toxin 단량체 및 Fd 사슬을 각각 가리킨다.
도 9는 기존의 웨스턴 블랏 시약을 사용한 GR10에 의한 웨스턴 블랏팅 (western blotting) 화학루미니센스발광 (chemi luminescence) 신호 증폭에 관한 그림이다; Lane A: 20 μ of A431 whole cel l lysate(WCL) : A431 전체 세포 용해물 20 ; Lane 1 : 2 β of A431 WCL: A431 전체 세포 용해물 2 ', Lane 2: ί / of A431 WCL: A431 전체 세포 용해물 1 ug; Lane 3: 0.5 / g of A431 WCL: A431 전체 세포 용해물 0.5 jug; GR10 treated Western blot : GR10이 처리된 웨스턴 블랏;및 GR10이 처리된 웨스턴 블랏은 기존의 웨스턴 블랏의 신호에 비해 32배로 증폭된 높은 신호을 준다.
도 10은 GR10 반복 A 슬에 의한 웨스턴 블¾ 화학루미니센스 발광 신호의 증폭을 나타낸 그림이다. a는 생쥐 anti-p-actin 단일클론 항체와 GR10 복합체에 의해 초복합체가 17배의 높은 신호를 주는 결과이다. b는 A431 세포 맑은 용해물은 10% denaturing SDS-PAGE에서 분리한 후, PVDF 막으로 transfer 시켜서 초복합체가 니트로셀롤로오스 막과 비슷한 신호증폭 효과를 나타냄을 확인한 결과이다.
도 11은 GR10에 의한 ELISA 민감도의 증가를 확인한 결과를 나타낸 그림이다. a는 AGS 세포 용해물 lg이 각 웰에 코팅되었다. 1차 항체는 연속적으로 희석되었다. b는 1차 항체만으로 측정하였을 때와 비교하여 A450 흡광고가 몇 배 증가하였는가를 각각의 1차 항체 희석배율에 따라 초복합체를 형성하기 위해 넣어준 1차 항체와 GR10의 몰비율에 대하여 그래프를 나타낸 것이다. c는 1차 항체를 1: 120 회석비율로 고정시키고, AGS 세포 용해물을 연속적으로 회석하여 96 웰 플레이트에 코팅하였다. d는 1차 항체만으로 측정하였을 때와 비교하여 A450 흡광도가 몇 배 증가하였는가를 각각의 코팅한 세포 용해물의 양에 따라 초복합체를 형성하기위해 넣어준 1차 항체와 GR10의 몰비율에 대하여 그래프를 나타낸 것이다.
도 12는 2차 항체의 연속 희석에 따른 신호증폭 효과를 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 13은 GR10에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가 효과를 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 14는 GR1-FI C 접합체에 의한 인간 편평 암 (human squamous carcinoma) A431 암세포주의 면역 형광탐색을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 15는 GR 반복사슬에 의한 신속항원검사의 검사선 항체와의 교차 결합을 보여준다.
도 16은 AR, LR, LAR 반복사슬에 의한 신속항원검사의 검사선 항체와의 교차 결합을 보여준다.
도 17은 GR5에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 18은 GR10에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 19는 GR15에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 20은 GR20에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 21은 AR5에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 22는 LR5에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 23은 LAR3에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 24는 GR10이 IgG와 초복합체를 형성하여 수용액에 녹지 않는 침전을 형성한 모습을 나타내는 그림이다. 왼쪽에서부터 각각 IgG대 GR10의 몰비가 1: 1, 5: 1, 10: 1이 되도록 섞어주고 반웅시킨 것이다.
도 25는 GR10이 GR1이나 GR2보다 IgG와 초복합체 형성으로 인한 침전이 많이 생기는 것올 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 각 시료의 1/36을 비환원 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 확인하였다. 1번과 2번 줄은 각각 GR10과 IgG를 반웅시킨 것의 침전물과 상충액이며, 3번부터 6번 줄까지 순서대로 각각 GRl, GR2 IgG를 반웅시킨 것의 침전물과 상층액이다. 7, 8번 줄은 BSA와 1^를 반웅시킨 대조 시료이고 9, 10번 줄은 IgG만 있는 대조시료이다.
도 26은 GR이 IgG와 초복합체 형성으로 생긴 침전의 모습을 나타내는 그림이다. GRl ~ 10을 IgG와 섞어서 반웅시키고, 대조 시료로 BSA와 IgG 그리고 IgG만 단독으로 반웅시킨 후 13000rpm, 20° C에서 30분 동안 원심 분리하였다. 그리고 마이크로 센트리퓨즈 튜브를 뒤집어서 육안으로 보이는 침전의 모습을 확인하였다. 동그라미는 형성된 침전물을 나타낸다.
도 27은 GR이 IgG와 초복합체 형성으로 생긴 침전을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 1번부터 20번 줄까지 순서대로 GR1~10을 IgG와 반웅시킨 것의 침전물과 상충액이며, 21, 22번 줄은 BSA와 IgG를 반웅시킨 대조 시료이고 23, 24번 줄은 IgG만 있는 대조 시료이다. 각 시료의 1/30씩 환원 15% SDS—폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 확인하였다.
도 28은 GR10보다 큰 GR도 IgG와 초복합체를 형성할 수 있는지 SDS—PAGE로 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 1번부터 12번 줄까지 순서대로 GR1, 3, 5, 10, 15, 20을 IgG와 반웅시킨 것의 침전물과 상층액이며, 13, 14번 줄은 IgG만 있는 대조 시료의 침전물과 상층액이다. 각 시료의 1/10씩 환원 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 확인하였다.
도 29A는 GR에 의한 웨스턴블럿의 detection l imit이 늘어나는 것을 GR을 사용하지 않았을 경우의 웨스턴블럿과 비교 대조하여 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 도 29B는 도 29의 A의 내용을 도식화 것이다.
도 30의 A는 같은 양의 항원이 존재할 때 GR로 웨스턴블럿의 chemi luminescence 시그널이 증폭되는 것올 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 도 30의 B는 도 30의 A를 그래프화한 것이다.
도 31의 A는 GR의 초목합체 형성을 통한 웨스턴블럿의 신호증폭을 다른 종류의 항원을 사용하여 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 도 31의 B는 다른 종류의 1차 항체를 사용해도 반복사슬에 의한 웨스턴블럿의 신호증폭이 가능하다는 것을 나타내는 그림이다.
도 32의 A는 모든 반복사슬이 웨스턴블럿을 증폭시키는 정도를 비교한 것이다.
GR10, ARIO, MAR5 (LAR5 사슬에서 L 이 다른 형태인 반복사슬)를 같은 조건에서 증폭시키는 정도가 얼마나 다른지 비교 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 도 32의 B는 LR10을 적용한 웨스턴블럿 결과를 나타내는 그림이다.
도 33은 GR 시리즈 단백질에 의한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합을 나타내는 그림이다.
도 34는 AR 시리즈 단백질에 의한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합을 나타내는 그림이다.
도 35는 LR 시리즈 단백질에 의한 반복시슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합을 나타내는 그림이다.
도 36은 MAR시리즈 단백질에 의한 반복시슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합을 나타내는 그림이다.
도 37은 정제된 TR1, 3, 5, 10, 15, 20 (=GR1, 3, 5, 10, 15, 20) 단백질 및 이에 접착된 B3(Fab)-ext-PE38들을 이용하여 [B3(Fab)-ext_PE38]2를 생산하기 위해, 2-멀캅토에탄올로 환원시키고 글루타치온 산화 형태 (glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 분자를 비환원 SDS-PAGE에 의해 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 38은 정제된 GR5, GR10, GR15, GR20 (= , TRIO, TR15, ΊΚ20) 단백질 및 이에 접착된 Hercept in(Fab)-ext-PE38들을 이용하여 [Hercept in(Fab)-ext-PE38]2를 생산하기 위해, 2-멀캅토에탄을로 환원시키고 글루타치온 산화 형태 (glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 SDS-PAGE에 의해 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 39는 GR 반복사슬 단백질과 [Hercept in(Fab)-ext-PE38] 단량체의 복합체의 SKBR3 세포 및 BT 474 세포에 대한 세포독성 효과를 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 40은 GR 반복사슬 단백질과 [e23(Fab)-ext-PE38] 단량체의 복합체의 SKBR3 세포 및 BT 474 세포에 대한 세포독성 효과를 분석한 결과를 나타내는 그림이다. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 설명한다. 본 발명에서 시"용되는 용어 "결속체 반복시슬 "은 항체와 같은 단량체에 결속특이성이 있는 부위가 반복되어 만들어진 물질과 재조합 단백질을 의미하며 , 상기 결속특이성이 있는 부위는 단량체에 대한 결속 도메인을 뜻하고,' 이는 천연의 단백질의 경우에는 그 단백질의 부위증 일부 도메인 부위로서 단량체에 특이적으로 결속하는 도메인이다.
또한, 본 발명에서 시용되는 용어 "항체단량체"는 항체로부터 유래한 분자를 의미하고, 이에는 항체의 조각이나 그에 더하여 다른 단백질이나 기능성 생물 -화학 분자를 융합시킨 분자를 의미하고, 이를 반복사술과 흔합할 때의 분자를 '항체단량체 '라고 의미한다. 자연의 항체는 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄를 가지고 있어 한 개의 중쇄와 한 개의 경쇄를 단위로 하였을 경우에는 이것의 이량체 (dimer)로 볼 수 있으나 본 명세서에서는 자연의 통상의 항체를 반복사슬과 흔합할 경우에는 이를 항체단량체로 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "다수항체단량체 /반복사슬 복합체 "는 상기 항체 단량체와 이에 특이적으로 결속하는 결속체의 반복사슬을 접촉하여 제조한 복합체를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "다수항체단량체 /반복시슬 복합체의 초복합체"는 상기 항체 단량체와 이에 특이적으로 결속하는 결속체의 반복사슬을 접촉하여 제조한 복합체들 사이에 교차결속 (cross-binding)을 하여 형성된 복합체들의 집단인 초복합체 (super-complex)를 의미한다.
아울러, 본 발명에서 사용되는 용어 "항원 /다수항체단량체 /반복사슬 복합체 "는 상기 다수항체단량체 /반복사슬 복합체를 항원에 접촉하여 제조한 복합체를 의미한다. 아울러, 본 발명에서 사용되는 용어 "항원 /다수항체단량체 /반복사슬 복합체의 초복합체"는 상기 다수항체단량체 /반복사슬 복합체가 복합체들 사이에 교차결속
(cross-binding)을 하여 형성된 복합체들의 집단인 초복합체 (super -complex)를 항원에 접촉하거나, 항원과 반복사슬와 흔합물을 먼저 만들고 이를 항체단량체에 가하여 항원의 존재 하에 반복사슬과 단량체가 초복합체를 형성하면서 항원과 결속하여 생성되는 항원과 초복합체의 결속체를 의미한다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제조하는 단계를 포함하는 반복시슬의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 반복시슬과 다수의 단량체를 흔합시켜 다수단량체 /반복사슬 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 다 단량체 /반복사슬 복합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 다수단량체 /반복사슬 복합체들 간에 교차결속 (cross-binding)을 형성시켜 상기 복합체들의 집단인 엉김체 (aggregate)를 생성하는 단계를 포함하는 초복합체 (super-complex)의 제조방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단량체는 단백질인 것이 바람직하고, 항체, 리간드 및 수용체, 그들의 조각, 그들의 재조합체, 그들의 유도체, 및 그들과 생물화학 기능기의 융합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 방법에 있어서 , 항체는 항체의 조각, Fab 단편, Fab 단편을 포함하는 단편 , Fv 단편, Fv 단편을 포함하는 단편, Fc 단편, 및 Fc 단편을 포함하는 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 결속도메인은 단백질인 것이 바람직하고, 미생물 유래 단백질인 것이 더욱 바람직하며, 특히 연쇄상 구균 (streptococcal )의 단백질 G, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A, 펩토스트랩토코커스 마그너스 (Peptostreptococcus magnus)의 단백질 L, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에 따른 반복사슬에 있어서 , 반복되는 결속도메인 사이에 각 도메인이 자유롭게 회전이 가능하게 하고 도메인 사이의 거리를 떨어지게 하는 유연한 링커 시^ 포함시킬 수 있다. 이는 단량체가 결속할 때 단량체 상호 간의 충돌로 입체적 방해가 일어나 결속반웅속도상수 (binding reaction rate constant)가 작아져서 결속반웅 평형상수 (binding reaction equi l ibrium constant)가 작아지는 것을 방지하여 높은 결합반웅평형 (binding reaction equi l ibrium)을 얻을 수 있게 할 수 있다.
이런 결속도메인 (binding domain)의 반복사슬은 결속도메인 사이의 유연한 링커 (f lexible l inker)에 의해 시"슬 내의 결속도메인이 자유로이 회전 (rotat ion)할 수 있고 사슬의 굽힘 (bending)이 가능하다. 따라서 반복사슬에 단량체를 접촉시켜 생성한 복합체 내에서 각각의 결속된 단량체도 회전자유도 (rotat ional freedom)와 진동자유도 ( vibrat ional freedom, bending freedom)를 매우 크게 가지게 된다. 이런 각 결속된 단량체는 그 움직임이 제한된 회전 방향과 굽힘 각도에서만 가능한 것이 아니라 매우 큰 범위의 방향과 각도에서 움직임이 자유롭기 때문에 상호간의 충돌을 피할 수 있게 되어 여러 개의 단량체가 반복서슬에 동시에 결속하는 것이 가능해 진다. 유연한 링커 서열은 반복사슬의 결속도메인 사이의 공간을 충분히 크게 만들어 복합체 형성을 위해 접근해 오는 단량체들이 상호간에 입체적 장애를 받지 않으면서 반복시슬에 결속할 수 있게 해준다. 본 발명의 반복사슬에 시ᅳ용될 수 있는 결속 도메인을 가지고 있는 천연의 단백질은 그 안의 결속도매인 사이에 이러한 유연성을 가지고 있지 않다. 천연의 단백질들은 그 안의 결속도매인 사이에 이러한 자유도를 허락하지 않으며, 다수단량체와의 복합체를 형성하기에는 접근하는 단량체나 이미 결속되어 있는 단량체에 이러한 높은 수준의 회전 자유도와 진동 지유도를 주지 못한다.
본 발명에 따른 반복사슬에 사용된 결속도메인은 천연의 단백질 분자의 조각이 바람직하며, 이런 조각은 천연의 전체 단백질에 비해 분자량이 작다. 이런 작은 분자량의 결속도메인을 이용하여 인공적 반복사슬을 만듦으로써 상기 결속도메인이 유래한 큰 분자량의 천연의 단백질 분자보다 결속도메인이 매우 많으면서 분자량은 작은 반복사슬을 제작하는 것이 7 능하다. 이는 많은 양의 단량체가 작은 분자량의 반복사슬에 결속하는 것을 가능하게 한다. 결속도메인의 숫자가 많으면서 분자량이 작은 반복사슬은 그 생산과 정제가 용이하며, 이는 천연의 단백질로는 이루어 낼 수 없는 큰 장점이다. 본 발명에서는 결속 도메인의 반복횟수를 20번까지 반복되는 시슬을 제작하였으나, 이에 한정되지 않는다.
결속도메인의 숫자가 많으면서 분자량이 작은 반복사슬을 용할 경우에는 천연의 분자에서는 얻어낼 수 없는 단량체의 단량체를 결속하는 분자 (천연의 미생물 단백질 분자, 본 발명에서의 반복사슬)에 대한 결속비율 (monomer to binding molecule rat io)을 매우 높게 얻어 단량체의 효과를 크게 증폭할 수 있다. 이러한 반복시슬은 그 분자량이 작기 때문에 인공적인 단백질 생산도 용이하다. 본 발명에 있어서, 단량체 내의 서로 다른 부위 a' 및 b'가 있고, 결속체에는 이들과 결속히 "는 부위 a, b 가 있을 때, 반복시슬은 a 와 b의 반복시슬, 단량체에는 a' 및 b'가 적어도 각각 한 개씩 또는 그 이상이 있어야 다수단량체 /반복사슬의 복합체간의 초복합체의 형성이 가능하다.
본 발명에 있어서, 단량체는 (a'b' ) 의 형태로 한 개의 단량체에 a' 및 b'가 같이 존재해야하고,반복 A 슬의 결속체에는 결속부의 a 및 b가 한 개의 결속체에 같이 존재하여 (ab)-(ab)-(ab)—- (ab)의 형태로서 반복사슬을 이루거나, 또는 결속부위 a와 b가 서로 다른 결속체에 독립적으로 있어서 반복사슬을 a-b-a-b-a-b -— a-b 형태로 독립적인 a 도메인과 b 도메인의 반복으로 이루어진 경우가 가능하다. 반복 A}슬에서의 독립적인 a 도메인과 b 도메인의 개수와 순서는 한정되지 않는다. 또한 a=b일 때는 단량체는
(a' a' )이고 반복사슬은 (aa)-(aa)-(aa)―이거나 a_a-a-a_a— a 의 형태가 가능하다. 본 발명에 있어서, 교차결속 (cross-binding)하는 복합체 형성을 위한 반복사슬은
서로 결합히 "는 결속도메인 c 및 d를 가질 수 있으며, 이는 다수단량체 /반복사슬 결속과는 상관이 없는 독립적인 것일 수 있다. 만약 반복사슬이 c-a-a-a d로 구성되는 경우, 여기서 상기 단량체는 도메인 a에 결합하고, 복합체들 사이에 교차결속은 c에 대한 d의 결속을 통한 것이다. 예를 들면, c-a-a-a——a-d. . . c-a-a-a a~d— c-a-a-a aᅳ d와 같이 초복합체가 구성되어 질 수 있으며, 여기서 '는 반복사슬 사이에 교차결속이다. 이렇게 형성된 초복합체는 반복사슬에 결속된 단량체의 효과를 증폭시킬 수 있다. 이러한 경우의 반복시슬의 구조는 하나의 반복사슬 내의 c 및 d 도메인이 서로 결속하지 않기 위해 휘어지지 않게 단단해야 한다. 만약 한 개의 반복시슬 내의 c 와 d 도매인이 결속한다면, 다수단량체 /반복사슬 복합체 사이의 교차결속이 일어날 확률이 매우 낮기 때문에 초복합체가 형성될 가능성도 매우 낮아지게 된다. 또한 단량체와 흔합하기 전에 한 개의 반복사슬의 c 가 다른 반복사술의 d 에 결속하여서도 안 된다. 이러한 두 반복사슬간의 결속이 미리 일어난다면 반복시슬을 다루기가 매우 어려울 것이며 , 단량체와의 복합체를 형성하기도 어려울 것이다. 또한, 본 발명은 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 반복사슬에 다수의 단량체가 결속되어 제조된 다수단량체 /반복사슬 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다수단량체 /반복사슬 복합체들 간에 교차결속 (cross-binding)이 형성되어 상기 복합체들의 집단인 엉김체 (aggregate)인 초복합체 (super-complex)를 제공한다.
상기 단량체는 단백질인 것이 바람직하고, 항체, 리간드 및 수용체, 그들의 조각, 그들의 재조합체, 그들의 유도체, 및 그들과 생물화학 기능기의 융합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.
상기 항체는 항체의 조각, Fab 단편 , Fab 단편을 포함하는 단편, Fv 단편 , Fv 단편을 포함하는 단편, Fc 단편, 및 Fc 단편을 포할하는 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 결속도메인은 단백질인 것이 바람직하고, 미생물 유래 단백질인 것이 더욱 바람직하며, 특히 연쇄상 구균 (streptococcal )의 단백질 G, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A, 펩토스트랩토코커스 마그너스 (Peptostreptococcus magnus)의 단백질 L, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명은 단량체의 표적에, 본 발명에 따른 반복사슬, 다수단량체 /반복시슬 복합체 또는 초복합체를 흔합시켜, 상기 단량체의 표적에 결속된 초복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 단량체의 효과 증폭 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단량체의 표적에 대한 단량체의 효과를 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서 , 단량체의 표적은 항원, 항체, 펩티드 (pept ide) , 단백질, 박테리아, 바이러스 및 진균, 또는 그들의 조각으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이
바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 박테리아는 헬리코박터 파이로리 (Hel icobacter pylori ) , 마이코박테리움 류버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis; 결핵균) 및 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 바이러스는 인플루엔자, 구제역 바이러스, 인체유두종바이러스 (human papi l loma virus, HPV) , 뎅기열 바이러스, C형 간염 바이러스, 간염 B 표면 (hepatit is B surface) 항원 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단량체 효과의 측정은 단량체ᅳ표지체 접합체 또는 2차 탐지체 (항체) -표지체 접합체 및 표지체의 표지기질을 이용하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 초복합체의 생성은 초복합체에 다수의 단량체가 들어 있으 Ή_로 단량체의 표적에 대한 생물학적 화학적 효과가 단량체에 비해 매우 높은 배수의 효괴를 제공함으로써 신호 증폭과 같은 단량체의 . 효과를 증폭할 수 있다. 또한, 본 발명은 검출하고자 하는 표적에 특이적이고 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단량체 다수, 및 상기 단량체에 결속 특이성이 있는 결속도메인의 반복시슬을 포함하는 분석 키트를 제공한다.
상기 키트는,
1) 단량체에 결속 특이성이 있는 결속도메인의 반복시슬;
2) 검출 표적과 특이작으로 결속하는 단량체 ;
3) 기질과의 반웅에 의해 표지기능을 나타내는 표지체가 접합된 2차 탐침 접합체 ; *1254) 상기 표지체와 표지 반웅할 표지기질 용액 ;
5) 각 반웅단계에 사용할 세척액 ; 및
6) 효소 표지반웅 정지용액을 포함하는 것이 바람직하나, 상기 구성에 한정되지 않는다.
상기 키트는 면역조직화학법 (i™unohistochemical techniques) , 면역블롯법 (iiraiunoblot) , 면역침강법 |加111 01) 01 101 ), 효소결합 면역흡착분석법 (enzyme l inked immunosorbent assay, ELISA) , 웅집법 (agglutinat ion) , 면역크로마토그래피 (Immunochromatographic assay) 및 방사능 면역시험법 (radkrimmuno assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석을 수행할 수 있다.
상기 표지체는 겨자무 과산화효소 (horseradish peroxidase, HRP) , 염기성 탈인산화효소 (alkal ine phosphatase) , 콜로이드 골드 (col loid gold) , 형광물질 (fluorescein) , 퀀탐 닷 (Quantum dot) , 글루코스 옥시다아제 (glucose oxidase) , 루시퍼라아제 ( luc if erase) , 베티ᅳ디-갈락토시다아제 (beta- "galactosidase), 말산탈수소효소 (ma late dehydrogenase, MDH) , 아세틸콜린에스터라아제 (acetylchol inesterase) 및 방사성 물질 및 색소 (dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 발색기질은 3,3' , 5,5'-테트라메틸 벤자이딘 (3,3', 5(5'-tetramethyl bezidine,
Ί Β) ,
2, 2 ' -아지노 -비스 (3—에틸벤조타이아졸린 -6-설폰산 ) (2 , 2 ' -az ino-bi s(3-ethy lbenzothi azol i ne-6-sul fonic acid) , ABTS) , 으페닐렌디아민 (o-phenylenediamine , QPD) , 디아미노벤자이딘 (diaminobenzidine, DAB) , 3-아미노 -9-에틸카바졸 (3-amino-9-ethylcarbasole) , 5-브로모ᅳ4-클로로 -3ᅳ인도일 포스페이트 / 아이오도니트로테트라졸리움 (5— bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodoni trotetrazol ium, BCIP/INT) , 뉴 푸친 (New fuchinᅳ NF) 및 패스트 레드 염 (fast red R salts)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. ,、 또한, 본 발명은 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복사슬에 검출기능기 (detect ion funct ional group)를 연결 ( l inked) , 접합 (conjugated) 또는 융합 ( fusion)시키는 단계를 포함하는 반복시^"검출기능기의 제조방법을 제공한다.
또한' 본 발명은
1) 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복시슬에 검출기능기를 연결 ( l inked) , 접합 (conjugated) 또는 융합 (fusion)시켜 반복사슬"검출기능기를 제조하는 단계 ; 및
2) 상기 단계 1)의 반복사슬"검출기능기에 단량체를 흔합시켜 다수단량체 /반복사슬"검출기능기의 복합체의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복사슬에 검출기능기 (detect ion funct ional group)를 연결 ( l inked) , 접합 (conjugated ) 또는 융합 ( fusion)되어 제조된, 단량체 결속 도메인의 반복시슬"검출기능기를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단량체 결속 도메인의 반복시ᅳ슬"검출기능기에 다수단량체가 결속되어 제조된 , 다수단량체 /반복사슬"검출기능기의 복합체를 제공한다. 또한, 본 발명은 단량체의 표적에, 본 발명에 따른 다수단량체 /반복사슬"검출기능기의 복합체를 흔합시켜 상기 단량체의 표적에 결속된 초복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 단량체의 표적의 검출 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단량체의 표적에 대한 단량체의 검출 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 검출기능기는 Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green f luorescent protein) , RFP(red f luorescent protein) 및 텍사스레드 (Texas Red)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단량체가 항체인 경우 항체는 항체의 조각, Fab 단편, Fab 단편을 포함하는 단편, Fv 단편, Fv 단편을 포함하는 단편, Fc 단편,및 Fc 단편을 포함하는 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명을 암치료제 인 항체 -독소 (ant ibody-toxin, immunotoxin)에 적용하여 암세포 특이 항체 -독소의 초복합체를 생산하는 것이 가능하며 , 이는 매우 약효능이 (drug eff icacy) 뛰어나게 높은 항체-독소의 초복합체로서 세포살상 기능기를 매우 많은 량 암 표적 세포로의 전달을 가능하게 하여 암치료가 가능해진다. 이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다.
단. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이
실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1 단백질 G의 항체 접착 도메인 ΠΙ의 반복사슬 GR8 ~ GR20, GR2-2, -3, -4의 제조 단백질 G(protein G)의 도메인 HKdomain ΙΠ) 유전자를 한국생명공학연구소 유전자은행 (Korean Col lection for Type Cultures, KCTC)에서 받은 연쇄상구균 (KCTC 3098)의 염색체 DNA( chromosomal DNA)로부터 얻었다. G4S 링쩌가 두 개의 도메인 ΙΠ 사이에 2번에서 4번까지 반복된 플라스미드 pGR2-2부터 pGR2-4를 제조하였다. 단백질 G(protein G)의 도메인 HKdomain ΙΠ)를 가지고 있는 플라스미드인 pGRl(Y. Lee et al , Enhanced Formation of Disulf ide bridged Dimer(Fab-PE38)2 Uti l izing Repeats of the Fab Binding Domain of Protein G (2010) J. Biol . Chem. 285, 5127-5131)을 site-directed mutagenesis를 이용하여 도메인 ΙΠ의 끝 G4S 링커의 앞에 추가적인 Agel 제한효소 자리를 넣어 pGRl-A을 제조하였다.
2개의 프라이머 P3[5'-AGACCnTAC GGTMCTCM ACCGG GGAG GCGGG CCGG ATA-3' (서열번호: 1)]과 P4[5'-TA CCGGACC CGCCTCCACC GGTT CAGTT ACCGTAMGG TCT-3' (서열번호: 2)] 프라이머 (primer)로 Quick-chage site-directed mutagenesis를 하였다. 상기 mutagenesis 후에 pGRl-A의 핵산 서열을 디데옥시 DNA 서열 검사법에 의해 확인하였다. 플라스미드 pGRl-A을 Ndel과 BspEI 제한효소로 잘랐고 여기서 나온 작은 fragment를 정제하였다. 또한 pGRl을 Ndel과 6 His tag자리 뒤에 있는 Agel으로 잘랐다. pGR2— A은 pGRl을 Ndel과 Agel으로 잘라 얻은 큰 fragment와 pGRl-A올 Ndel과 BspEI으로 잘라 얻은 작은 fragment를 l igation하여 만들었다. 이 결과 나온 pGR2-A을 Ndel과 Agel으로 절단하여 Protein G의 두 번째 도메인 m와 그 앞에 G4S 링커가 남은 큰 fragment를 얻었다. 이 큰 fragment와 pGRl-A의 Ndel과 BspEI으로 절단하여 얻은 작은 fragment를 l igation하여 첫 번째 도메인 m와 두 번째 도메인 m 사이에 G4S가 두 개 있는 pGR2-2가 되도록 제조하였다. 계속해서 G4S 링커가 3개있는 pGR2-3과 G4S 링커가 4개있는 pGR2-4를 pGR2_2를 만들 때와 같은 방법으로 제조하였다.
GR8 ~ 20은 pGRKY. Lee et al , Enhanced Formation of Disulfide bridged Dimer(FatrPE38)2 Uti lizing Repeats of the Fab Binding Domain of Protein G (2010) J. Biol . Chem. 285 , 5127-5131)의 논문에서와 같은 방법으로 제조하였다. 발현 플라스미드의 제작은 도 1과 같이 수행하였으며 (도 1) , 정제된 반복시슬은 16% SDS-PAGE 로 분석하였다 (도 2) .
<실시예 2> Fab-toxin 단량체와 단백질 G 도메인 ΙΠ의 반복사슬 G 1 ~ GR10, GR2-2, -3, -4와의 복합체에 대한 크기 배제 크로마토그래피 (Size~«xclusion chromatography) 분석 및 복합체 내에서의 이황화가교 이량체 형성 확인
면역글로불린에 접착하는 단백질 G의 도메인 ΙΠ는 IgG의 Fc와 Fab fragment에 모두 붙는다. 단백질 G의 면역글로불린 접착부위 (도메인 E0는 Fab fragment의 CHI에 붙는다고 보고되었다. 단백질 G의 도메인 m의 second β— strand는 Fab의 CHI 도메인 seventh β-strand와 역평행하게 붙는다. 두 단백질 사이에 있는 β/β interaction은 CHI 도메인과 도메인 m 사이에 다섯 개의 수소결합을 하게 해 준다. 이에 더하여 세 개의 수소결합이 더 있는데 이 또한 CH1 도메인의 주요 원자들과의 결합이다. 두 단백질 사이에 complex를 형성하면서 도메인 m나 CH1 도메인의 구조에 어떠한 큰 변화는 나타나지 않는다.
도메인 m가 반복된 반복사슬의 두 가지 다른 타입을 제조하였다. 우선 , 도메인 m사이에 하나의 G4S 아미노산이 있는 것을 제조하였다. 이 중에서 도메인 m가
10번까지 반복된 반복사슬을 Fab-PE38 단량체와 association하여 복합체를 형성하였다. 사용한 반복사슬은 GR1부터 GR10이었다. 이 반복사슬과 단량체를 association하면 단량체가 다수가 붙어있는 단량체 2가, 3가 또는 4가의 복합체를 얻을 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 두 개의 도메인 ΙΠ 사이에 길이가 다른 G4S 링커를 가지는 반복시슬을 제조하였다. 이것은 Fab-PE38 단량체가 도메인 III 반복시슬과 association하는데 링커에 따른 차이점을 알 수 있게 한다. 이런 반복사슬은 GR2-2, GR2-3, GR2-4이고, 각각 두 개의 도메인 ΙΠ 사이에 2개, 3개, 4개의 G4S 링커가 있었다. 이것은 두 개의 Fab-PE38 단량체가 반복사슬과 복합체를 형성하여 단량체의 이량체가 형성되는 적절한 길이를 알게 한다.
제조된 GR2-2, -3, -4를 이용해 비공유결합으로 형성된 복합체를 크기 배제 컬럼 (size exclusion column)으로 분석하였다.
GR 시리즈 complex의 Size-exclusion 크로마토그래피 결과를 도 3에 나타내었다. 구체적으로, 크기 배제 크로마토그라피 분석을 Superdex-200TM HR 컬럼을 사용하였다. Fab-ext-PE38와 GR 시리즈의 associat ion은 각각 다른 비율로 실행하였다. 715 μ& Fab-ext-PE38을 각각의 GR 단백질과 association시켰다. GR1 ~ 3에 대하여서는 Fab-ext-PE38과 GR 단백질을 2: 1의 몰 비율로 흔합하였다. GR4 ~ 10에 대해서는 715 M Fab-ext-PE38과 각 2¾«g의 GR 단백질을 흔합하였다. 모든 크로마토그램은 같은 용출부피에 맞추어 겹치게 표시하였다. 기준 물질로 사용된 [Fab-ext-PE38]2(D)와 Fab-ext-PE38(M)의 크로마토그램은 같은 조건하에서 elution하여 얻었다.
또한, GR2-2, ᅳ 3, -4와의 complex의 Size-exclusion 크로마토그래피 결과를 도 4에 나타내었다.
또한, [Fab-ext-PE38]2 및 Fab-ext_PE38의 흔합물에 대한 GR2 또는 GR3와의 복합체 분석결과를 도 5에 나타내었다.
또한, Fab-PE38 단량체와 GR2-2, -3, -4를 섞은 단백질의 크기 배제 크로마토그램의 비교 결과를 도 6에 나타내었다.
또한, GR 반복사슬들과 Fab-PE38 단백질의 복합체의 정제를 위한 크기배제 크로마토그래피 결과를 도 7에 나타내었다.
또한, Fab-toxin 단량체와 GR10 또는 GR2-2, GR2-3, GR2-4 와의 복합체 내에서 환원 산화 섞음 반웅에 의한 Fab-toxin 단량체로 부터의 이황화가교 이량체 형성 결과를 8% 비환원 SDS-PAGE 로 분석한 결괴 "를 도 8에 나타내었다 (도 3 내지 도 8) .
그 결과, Fab-PE38 단량체 두 개가 각각의 반복사슬과 복합체를 만들며 모두 이량체가 형성됨을 알 수 있었다.
【표 1】
Fab-toxin 단량체로부터 환원산화 섞음 반웅에 의해 형성된 이황화가교 이량체의 분률
Antibody-toxin bound to metal
n.d(not determined): 관찰되지 않음.
<실시예 3> 단백질 G 도메인 III의 반복사슬 GR10에 의한 웨스턴 블랏팅에서의 항체 신호 ^과의 증폭 확인
cel l signal ing technology®의 웨스턴 블로팅 프로토콜을 변형하여 시용하였으며, abcom®의 직접 ELISA 프로토콜의 수정된 버전을 시 "용하였다.
용액 및 시약은 다음과 같이 준비하였다. 용액은 Mi l l ie 또는 동등한 순도의 물을 사용하여 만들었다. 1) IX SDS 샘플 버퍼 : 62.5 mM 트리스 -HC1 (25 ° C, pH 6.8), 2% W/V SDS, 10 % 글리세를, 50 mM DOT, 0.01 % W/V 브로무페놀블루 또는 페놀레드. 2) 이동버퍼 : 25 mM 트리스베이스, 0.2 M 글라이신. 3) 10X 트리스 완충 식염수 OBS) : 10X TBS 1 리터의 준비 : 24.2 g 트리스베이스, 80g 염화나트륨,염산으로 pH 7.6로 산도를 조정 . (IX에서 사용) 4) 달걀 알부민 : (부피에 대한 무게 [W / V] ) . 5) 차단 완충용액 : 1X TBS, 0.1¾ 트뷘 -20과 2%의 W/V 닭 혈청 알부민 . 6) 세척 완충요액 : IX IBS, 0.1% 트원 -20 (m . 7) 1차 항체 : 산타크루즈 생명공학의 힝 베티ᅳ액틴 마우스 항체 . 8) 1차 항체 희석 완충용액 : IX IBS, 0.1% 트원 -20과 2% W/V 닭 혈청 알부민. 9) 2차 항체 : 염소 항-마우스 베타 액틴 HRP. 10) 블라팅 막 : 니트로 셀를로오스 막 (Wattiran) , PVDF 막 (PALL) . 11) GR 재조합 단백질 : GR10. 12) 루미놀 용액 : 100 mM 트리스 /HC pH8.8, 1.25 mM 루미놀, 2 mM 4IPBA, 5.3 mM 과산화수소. 13) 슈퍼 신호 펨토 최대 감도 (Super signal femto maximum sensit ivity) 入 1약 (Thermo Scient i f ic) .
웨스턴 블럿팅을 다음과 같이 수행하였다. 우선, A431 또는 AGS 암세포주를 시"용하여 세포 lysate를 준비한 후, 배양액을 흡입 제거하였다. IX PBS로 세포를 세척한 후 PBS를 흡입 제거하였다. 그런 다음ᅳ IX SDS 시료 완충용액올 가하여 세포를 용해시킨 후, 95 - 100 ° C에서 5분 동안 시료에 열올 가한 다음, 5분 동안 소형 원심분리하여 시료를 가라앉혔다. 그런 다음, SDS-PAGE 젤 (10 cm X 10 cm)에 올려 적재한 후 전기영동한 후, 니트로 셀를로오스 또는 PVDF 막에 전기이동시켰다.
막 (membrane) 표면차단과 항체 결합반웅은 다음과 같은 순서로 수행하였다. 용액의 부피는 10 Cm x 10 αη(100 cm2)인 멤브레인에 대한 것이며 , 다론 크기의 멤브레인에 따라 부피 # 조정하였다.
막 표면차단은 우선 , 전기이동 후 나이트로 셀를로오스 또는 PVDF 멤브레인을
실온에서 5 분간 적절한 부피의 TBS로 세척한 후, 멤브레인을 적절한 부피의 막표면 차단 버퍼에 넣고 실은에서 한 시간 동안 보은시킨 다음, TBS/T로 5분 동안 각각 세 번 세척하였다. 둘째로, 초복합체를 준비하였다. 우선, GR10과 1차 항체를 결과에 표시된 몰 비에 맞추어 흔합하여 37 °C에서 1 시간에 보온시킨 후, 생성된 초복합체를 얼음에 넣어 사용할 때까지 보관하였다. 셋째로, 1차 항체와의 반웅은 10 ml의 1차 항체 희석완충용액에 막과 1차 항체 또는 1차 항체와 반복사슬과의 복합체를 결과에 표시된 희석비율에 맞추어 넣고 상온에서 1시간 동안 보은시킨 후, 1BS/T 15 ML로 5 분씩 세 번 세척한 다음, 1차 항체의 종에 적합한 HRP-접합된 2차 항체 (1:2000)를 적절한 부피의 막 표면차단 완충용액과 섞은 후 부드럽게 교반하며 1시간 동안 실온에서 보은시켰다. 그런 다음, TBS/T 15ML로 5 분씩 세 번 세척한 후, 섹션 D에 있는 검출 단계로 진행하였다. 마지막으로, 항원 단백질 검출은 우선 , 루미놀 용액 또는 슈퍼신호 펨토 최대감도 시약 (super signal femto maximum sensit ivity reagent , Thermo Scient i fic)과 멤브레인을 부드럽게 교반하며 상온에서 보온시킨 후, 건조되지 않게 과하게 있는 현상용액을 따라 낸 다음, 플라스틱 랩으로 싸서 X-선 필름에 노출시켰다.
기존의 웨스턴 블랏 시약을 사용한 GR10에 의한 웨스턴 블랏팅 (western blott ing) 화학루미니센스 발광 (chemi luminescence) 신호 증폭 결과를 도 9에 나타내었다 (도 9) . 또한, G 10 반복사슬에 의한 웨스턴 블럿 화학루미니센스 발광 신호의 증폭 결과를 도 10에 나타내었다 (도 10) . 구체적으로, GR10과 1차 항체의 초복합체 형성은 괄호 안에 표기된 몰 비에 따라 제조하였다. 1차 항체는 1: 1000 희석된 농도로 시"용하였으며, 초복합체도 같은 1차 항체 농도를 이용하여 제조하였다. 2차 항체로는 goat ant Hnouse-HRP 접합항체를 두 실험 모두에 이용하였다. 1차, 2차 항체와 시료는 모두 실온에서 1시간 동안 보은시켰다. 실험의 모든 세포 용해물 시료는 10% denaturing SDS-PAGE로 분리한 후, 니트로셀를로오스 막으로 이동하였고, 이것을 세 조각으로 잘라 1차 항체로 탐지하였다. 민감도가 매우 높은 Thermo Supers ignal Femto substrate를 현광발색 시약으로 사용하였다. 또한, A431 세포 맑은 용해물은 10% denaturing SDS-PAGE에서 분리하였고 PVDF 막으로 transfer 시켜서 초복합체가 니트로셀를로오스 막과 비슷한 신호증폭 효과를 주는가를 알아보았다. 막은 처음에는 1차 항체만으로 탐지되고 2차 항체와 종래의 ECL 시약으로 발색하였고, 그 후 즉시 TBST 용액으로 세척한 디음 Supersignal Femto 기질로 발색하였다. 이 경우에는 신호의 증가와 동시에 매우 강한 배경잡음신호의 증가를 관찰하였다. 배경잡음신호는 2차 항체의 PVDF 막에 대한 비특이성 흡착과 Supersignal Femto 기질의 매우 높은 민감성 때문이다. 그 이후 SDS 와 2ᅳ tnercaptoetha l을 시용하여 같은 막에서 항체들을 벗겨 낸 후, 1차 항체와 반복시슬을 흔합하여 만든 초복합체를 결속시킨 후, 2차 항체와 종래와 ECL 발색시약을 시ᅳ용하여 검출하였다. 이 경우 초복합체는 종래의 방법에 비해 15배 높은 만감도를 주었으며, 이는 니트로셀롤로오스 막을 이용한 결과와 비슷한 결과를 나타내었다. 이 실험에서는 종래의 중간세기 민감도의 화학루미니센스 발광 기질을 사용하였으며 , Haan and Behrmann (2007)의 방법에 따른 ECL 시약을 제조하여 사용하였다. 신호증폭 효과는 니트로셀롤로오스 막에서와 비슷하게 관찰되었으며, 증폭된 신호는 고민감도 Supersignal Femto substrate 를 사용했을 때와 비슷한 정도였으나 배경잡음신호의 동반 증가가 없는 깨끗한 신호의 증폭올 보여 주었다. PVDF 막에는 세포용해물 잘 붙기 때문에 중간세기 민감도의 발색기질로 적은 량의 시료의 검출이 가능하였다.
<실시예 4> 단백질 G 도메인 ΙΠ의 반복사슬 GR10에 의한 간접 효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에서의 항체 신호 효과 증폭 확인
간접 ELISA는 다음과 같이 수행하였다.
용액 및 시약은 다음과 같이 사용하였다. Mi l l i~Q 또는 동등하게 정제된 물로 모든 용액을 만들었다. 1) 중탄산염 /탄산염 코팅 버퍼 (100 ) 항원 또는 항체를 wel l에 고정하기 위해 코팅 버퍼에 희석하였다: 3.03 g Na2C03, 6.0 g NaHC03, 1000 ml 증류수 pH 9.6. 2) PBS. 3) 차단 용액 : 1 % BSA 혈청을 포함하는 PBS. 4) 세척 용액 : 0.05% (v/v) Tween20 세제를 포함하는 PBS. 5) 항체 희석 버퍼 : 1차 및 2차 항체의 비특이적 결속을 줄이기 위해 IX 블로킹 솔루션에 희석하여 사용함.
마이크로플래이트에 항원 코팅은 우선, A431 또는 AGS 세포주를 세포 용해물을 준비하는데 사용하였고, 탄산염 코팅 버퍼로 최종 농도가 20 /ml이 되게 세포 용해물을 희석하였다. 그런 다음ᅳ 마이크로플레이트 웰 상단부에 파이펫으로 희석한 용해물 50 μ ΐ를 가하여 코팅한 후, 플레이트 뚜껑을 덮고 하루 밤 4° C에 보은시킨 다음, 코팅 용액을 제거한 후, 200 uL PBS로 웰을 두 번 세척하였다. 코팅 용액이나 세척 용액의 제거는 싱크대에 플레이트를 가볍게 뒤집어 흔들어 제거하였다. 남아 있는 용액은 종이 타월에 플레이트를 가볍게 두드려 제거하였다.
막 표면 차단은 우선, 웰 당 1 % BSA/PBS의 블로킹 버퍼 200 iL를 가하여 코팅된 웰의 나머지 단백질 결속 자리를 차단한 후, 플레이트 뚜껑을 덮고 실온에서 최소 2 시간 동안 보온시킨 다음, PBS로 플레이트를 두 번 세척하였다. 항체 반웅은 우선, 블로킹 버퍼에 시"용하기 직전에 지정된 농도로 희석된 1차 항체 또는 초복합체 100 μ ΐ를 넣은 후, 플레이트 뚜껑을 덮고 실온에서 1 시간 동안 보온시켰다. 그런 다음, PBS로 플레이트 두 번 세척한 후,블로킹 버퍼에 사용하기 직전에 최적의 농도로 희석한 2차 항체 -HRP 100 μ ΐ를 첨가한 다음, 플레이트 뚜껑을 덮고 실온에서 1 시간 동안 보은한 후, PBS로 플레이트 두 번 세척하였다.
검출은 우선, 멀티채널 파이펫으로 웰마다 1MB 기질 용액을 100 μ ΐ씩 첨가한 후, 층분한 발색 후 (30 분) 각 웰에 반웅정지용액을 100 씩 첨가한 다음, 플레이트 리더로 각 웰의 흡광도 (광밀도)를 측정하였다.
GR10이 크게 ELISA의 민감도를 향상시키는 결과를 도 ιι에 나타내었다 (도 u) . 구체적으로, 두 개의 서로 다른 ELISA 실험에서 ELISA 신호의 상당한 증폭이 단클론 항 -β-액틴 항체와 GR10의 초복합체가 1차 항체로 사용했을 때 관찰되었다. AGS 세포 lysate는 일반 세포배양 시험용 96wel l 플레이트에서 섭씨 4°C에서 하룻밤 동안 보은하였고, ELISA는 표준 절차에 따라 수행하였다. GR10과 1차 항체의 초복합체는 괄호 안에 표시된 몰비에 따라 미리 형성하였다. 1차 항체는 마우스 단클론 항 -βᅳ액틴 항체를 사용하였다. 2차 항체인 염소 항-마우스 -HRP 접합체가 두 실험 모두에 사용 되었다. 1차와 2차 항체는 모두 상온 Τ에서 1시간 동안 반웅시켰다. 기질인 ΊΜΒ는 상온에서 30 분 동안 반웅시켰다.
2차 항체의 연속 희석에 따른 신호증폭 효과를 도 12에 나타내었다 (도 12) . 일차 항체와 GR10의 초복합체가 크게 ELISA의 신호를 층가시키고, 2차 항체의 시험된 희석의 범위에 꽤 일정한 것을 보여주었다. 이 ELISA 실험에서 마우스 단클론 항 -β-액틴 항체와 GR10의 초복합체를 1차 항체로 사용했을 때 ELISA 신호의 상당한 증폭이 관찰되었다. A431 세포 용해물을 사용하였다. GR10과 1차 항체의 복합물은 1: 10의 몰
비율에 따라 미리 만들었다. 2차 항체로는 염소 항-마우스 -HRP 결합체자 사용되었다. A431 세포 용해물 lg 이 각 웰에 코팅되었다. 1차 항체는 10배씩 연속적으로 희석되었다. 표기된 1차 항체의 고정된 희석비율에서, 2차 항체는 연속적으로 2배씩 희석되었다. <실시예 5>단백질 G도메인 III의 반복사슬 G 10에 의한 인플루엔자 (influenza) 신속 항원 진단 키트 (Rapid Antigen Test)의 민감도 증진 확인
항체를 이용한 가장 대표적인 인플루엔자 신속 항원 진단 키트에 GR10을 시용하여 이의 민감도 증진을 관찰하였다. SD 바이오라인 인플루엔자 항원 진단 키트 (SD사)또는 녹십자사의 키트를 사용하였으며 , 키트에는 항원 완층용액, 점적기, 류브, 검체 체취용 면봉 및 스트립이 포함되어 있다. 상기 항원 완충용액을 점적기 (Dropper)의 선 부분까지 빨아들인 후 항원 완충용액을 튜브 (Tube)에 넣고, 항원 샘플을 항원 완충용액이 들어있는 튜브에 넣고 5회 이상 흔합하였다. 이때, 항원 완충용액에 GR10 단백질을 항원과 함께 단순 희석하였다. 스트립을 류브에 넣고 10분 ~ 15분 후에 결과를 판독하였다.
그 결과, 기존에 시판중인 신속항원 진단 키트의 항원 희석용액에 GR10 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR10이 없는 경우에 비하여 항원이 1000배 까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다 (도 13) .
<실시예 S> 항체에 대한 표지 시약으로 G 단백질을 이용한 암세포주의 면역 형광 탐색
GR1에 형광 색소인 플루오레세인 이소티오시안산 (Fluorescein isothiocyanate, FTTC)를 접합한 형태의 단백질을 제작 (GR1-FITC)하여 배양 암세포주 A431(human squamous carcinoma)의 면역 형광염색에 사용하였다. 1차 항체는 마우스 (mouse) 항 -LC3 항체를 사용하였고, 이에 대한 이차 항체 대신 제작된 GR1-FITC를 탐지에 사용하였다. 형광 탐지된 세포는 또한 F-액틴 (F-act in)에 대해 로다민-팔로이딘 (Rhodamine-phal loidinXsigma aldrich)을 이용하여 염색하였으며 형광현미경으로 발색 정도를 관찰하였다.
그 결과, 사용된 단백질의 양은 2차 항체 -형광발색기 접합체의 경우보다 GR1-FI C 접합체를 시용하였을 경우 훨씬 적은 양의 단백질을 시용하였으며 선명하게 발색된 형광 염색 영상을 얻어낼 수 있었다 (도 14) .
따라서 , GR1-FI C 와 같이 GR 단백질에 탐지 기능기를 연결 , 접합, 융합시키면 모든 항체에 사용이 가능하며, 이에 각각의 항체에 탐자 기능기를 접합시킬 필요가 없는 것을 알 수 있었다. 또한 GR 단백질은 매우 작은 분자이기 때문에 생산이 용이하고 다루기도 매우 쉬운 것을 알 수 있었다.
<실시예 Ί> 포도상 구균 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A의 항체 접착 도메인 (domain B)의 반복사슬 발현 플라스미드의 제작
단백질 A(protein A)의 도메인 B(domain B)의 DNA 서열을 (표 7-1) 인공 합성하여 백터에 넣은 플라스미드를 (주)바이오니아 [Bioneer Corporation] 로부터 받아 대장균 DH5 a을 형질전환 하여 클로닝하였다.
상기 플라스미드를 Ndel과 BspEI으로 잘라 얻은 작은 DNA 조각을 (245bp) 정제한 후, 상기와 같은 효소로 자른 pGRl (ρΊΚΙ)의 백터 부분에 클로닝하여 단백질 Α의 도메인 B를 1개 가지고 있는 pARl을 제작하였다. 그런 다음,상기 도메인 B의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검사법에 의해 확인하였다.
각 도메인 B 사이에는 (G4S)2 서열의 10개의 아미노산 서열이 스페이서 (spacer)로 있다ᅳ 단백질 A의 도메인 B가 2번 반복되어 있는 pAR2를 제작하기 위하여 상기 결과물인 플라스미드 pARl (표 2) 을 다시 Ndel과 BspEI로 잘랐다. 그런 다음, 도메인 B 및 두개의 G4S를 암호화하는 245bp의 작은 단편을, Ndel과 Agel으로 자른 동일한 폴라스미드의 큰 단편에 붙여 넣었다. 상기 결과물인 플라스미드인 pAR2를 Ndei과 Agel로 자른 다음, 얻어진 큰 단편을 245 bp 단편과 붙여 단백질 A의 도메인 B가 3번 반복되어 있는 pAR3를 얻었다. 상기와 같은 클로닝 방법을 사용하여, 단백질 A의 도메인 B가 5번까지 반복된 플라스미드 (pAR5)를 제조하였다.
【표 2】
단백질 A(protein A)의 도메인 B(domain B) 염기서열
단백질 A의 도메인 B의 염기서열
I GMTTC-3' (서열번호: 3)
* 밑줄 친 부분: 코딩 서열 (coding sequence) 【표 3】
¾4S; GGGGS의 아미노산 서열 (서열번호: 4) ;
b(His)6: 6개의 히스티딘 태그 (6xHistidine tag) ; 및
¾: 포도상 구균 (Staphylococcus aureus) 단백질 A의 도메인 B. 이전에 보고된 방법 (J.H. Park, et al . , Mol Cel ls 12 (2001) 398-402)을 이용하여, 상기 반복시슬 컨스트럭트로 부터 단백질올 과발현시켰다.
순수한 용해물을 Ni2+-킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피( Ni 2+一 chelat ing sepharose fast f low chromatography) (Amersham Bi osc i ence
Sweden)로 분리한 후, Hi load Superdex-75 pg또는 Hi load Superdex-200 pg( 26/60) (Amersham Bioscience, Sweden)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography)로 분리하였다 . .
<실시예 S> 펩토스트랩토커스 (P rtostreptococcus magruis) 의 단백질 L의 항체 접착 도메인 (domain B1) 의 반복사슬 발현 플라시미드의 제작
단백질 Uprotein L)의 도메인 Bl( domain B1)의 DNA 서열을 (표 4) 인공 합성하여 백터에 넣은 플라스미드를 (주)바이오니아 [Bioneer Corporation] 로부터 받아 대장균 DH5 a을 형질전환 하여 클로닝하였다.
상기 플라스미드를 Ndel과 BspEI으로 잘라 얻은 작은 DNA 조각을 (299bp) 정제한 후, 상기와 같은 효소로 자른 pGRl (ρΊΕΙ)의 백터 부분에 클로닝 하여 단백질 L의 도메인
Bl을 1개 가지고 있는 pLRl을 제작하였다. 그런 다음, 상기 도메인 B1의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검사법에 의해 확인하였다.
각 도메인 B1 사이에는 (G4S)2 서열의 10개의 아미노산 서열이 스페이서 (spacer)로 있다. 단백질 L의 도메인 B1이 2번 반복되어 있는 pLR2를 제작하기 위하여 상기 결과물인 플라스미드 pLRl (표 5) 을 다시 Ndel과 BspEI로 잘랐다. 그런 다음,도메인 B1 및 두개의 G4S를 암호화하는 299bp의 작은 단편을, Ndel과 Agel으로 자른 동일한 플라스미드의 큰 단편에 붙여 넣었다. 상기 결과물인 플라스미드인 pLR2를 Ndel과 Agel로 자른 다음, 얻어진 큰 단편을 299 bp 단편과 붙여 단백질 L의 도메인 B1이 3번 반복되어 있는 PLR3를 얻었다. 상기와 같은 클로닝 방법을 사용하여, 단백질 L의 도메인 B1이 5번까지 반복된 플라스미드 (pLR5)를 제조하였다
【표 4】
단백질 L(protein L)의 도메인 BKdomain Bl) 염기서열
【표 5]
¾4S; GGGGS의 아미노산 서열 (서열번호: 4) ;
b(His)6: 6개의 히스티딘 태그 (6xHistidine tag) ; 및
¾1: 펩토스트렙토커스 (Peptostreptococcus) 단백질 L의 도메인 B1. 이전에 보고된 방법 (J.H. Park, et al . , Mol Cel ls 12 (2001) 398-402)을 이용하여, 상기 반복사슬 컨스트릭트로 부터 단백질을 과발현시켰다.
순수한 용해물을 Ni2+-킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피 ( Ni2+-chelating sepharose fast flow chranatography) (Amer sham Bioscience, Sweden)로 분리한 후, Hi load Superdex-75 pg 또는 Hi load Superdex-200 pg( 26/60) (Amer sham Bioscience, Sweden)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography)로 분리하였다. <실시예 9> 펩토스트랩토코커스 (Peptostreptococcus magrais)의 단백질 L의 항체 접착 도메인 (domain Bl) 과 포도상 구균 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A의 항체 접착 도메인 (domain B)의 반복사슬 발현 플라시미드의 제작
단백질 L(protein L)의 도메인 BKdomain Bl)의 DNA 서열을 인공 합성하여 백터에 넣은 플라스미드를 (주)바이오니아 [Bioneer Corporation]로부터 받아 pLRl을 만들었다.
상기 플라스미드 pLRl을 Ndel과 BspEI으로 잘라 얻은 작은 DNA 조각을 (299bp) 정제한 후, 상기와 같은 효소로 자른 pARKprotein A의 도메인 B 포함)의 백터 부분에 클로닝 하여 단백질 L의 도메인 Bl 1개와 단백질 A의 도메인 B 1개를 연결하여 (B1-B) 가지고 있는 pLARl을 제작하였다. 그런 다음, 상기 도메인 BKprotein L의 도메인 B1)과 B(protein A의 도메인 B)의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검사법에 의해 확인하였다. 각 도메인 BKprotein L의 도메인 Bl) , BCprotein A의 도메인 B) 사이에는 (G4S)2 서열의 10개의 아미노산 서열이 스페이서 (spacer)로 있다. 단백질 L의 도메인 B1와 단백질 A의 도메인 B 연결된 LA서열 (B1-B)이 2번 반복되어 있는 pLAR2를 제작하기 위하여 상기 결과물인 플라스미드 pLARl (표 6) 을 다시 Ndel과 BspEI로 잘랐다. 그런 다음, B1-(G4S)2-B-(G4S)2 (Bl— B)를 암호화하는 521 bp 작은 단편을, Ndel과 Agel으로 자른 동일한 플라스미드의 큰 단편에 붙여 넣었다. 상기 결과물인 플라스미드인 pLAR2를 Ndel과 Agel로 자른 다음, 얻어진 큰 단편을 521 bp 단편과 붙여 LA서열이 3번 반복되어 있는 PLAR3를 얻었다. 상기와 같은 클로닝 방법을 사용하여, 단백질 L의 도메인 B1과 단백질 A의 도메인 B가 3번까지 반복된 플라스미드 (pLAR3)를 제조하였다.
【표 6】
단백질 LA(protein LA)의 도메인 Bl-B(domain B1-B) 염기서열
* 밑줄 친 부분: 코딩 서열 (coding sequence) [표 7】
^4: GGGG의 아미노산 서열 (서열번호: 7) ;
(His)6: 6개의 히스티딘 태그 (Hist idine tag) ;
¾1: 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) 단백질 L의 도메인 B1; 및
¾: 포도상 구균 (Staphylococcal) 단백질 A의 도메인 B. 이전에 보고된 방법 (J.H. Park, et al . , Mol Cel ls 12 (2001) 398-402)을 이용하여, 상기 반복시슬 컨스트릭트를 과발현시켰다.
순수한 용해물을 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피 (chelat ing sepharose fast f low chromatography) (Amersham Bioscience, Sweden)로 분리한 후, Hi load Superdex-75 pg 또는 Hi load Superdex-200 pg(26/ 60) (Amersham Bioscience, Sweden)을
사용하여 크기배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography)로 분리하였다.
<실시예 10> 신속 항원 진단 키트 (Rapid Antigen Test)를 이용한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합
항체를 이용한 가장 대표적인 검출법인 인플루엔자 신속 항원 진단 키트를 이용하여 항원을 가하지 않은 상태에서 반복서열을 가하여 형성되는 골드항체와의 복합체 또는 초복합체가 검출선 항체와 교차결합을 하여 골드항체가 검출 되는지를 관찰하였다. 이렇게 나타나는 검출선은 반복사슬 /골드항체의 복합체 또는 초복합체 내의 반복사슬의 항체 결합 도메인 중 비어 있는 자리가 검출선 항체에 교차결합하여 나타나는 것이다. SD 바이오라인 인플루엔자 항원 진단 키트와 녹십자 인플루엔자 항원 진단 키트를 시용하였으며, 키트에는 항원 완충용액, 검체 체취용 면봉 및 스트립이 포함되어 있다. 상기 항원 완층용액 뚜껑을 열고, 항원 완충용액을 튜브 (Tube)에 넣고, GR, AR, LR, LAR 반복시 _슬 시리즈를 항원 완충용액이 들어있는 튜브에 넣고 5회 이상 흔합하였다. 스트립을 튜브에 넣고 10분 ~ 15분 후에 결과를 판독하였다.
SD 스트립의 경우, 항원 완충용액에 GR4, GR5, GR7 GR10, GR15 GR20 단백질을 각각
10ug과 lug을 단순 희석하는 것으로 밴드가 나타나 교차결합이 일어나는 것을 볼 수 있으며 녹십자 스트립의 경우에는 lug 경우 SD스트립보다 더 강한 색의 검출선이 나타나는 것을 볼 수 있다. 그러나 0. lug에서는 두 스트립 모두 밴드가 보이지 않으므로 항원이 없는 상태에서 검출선이 검출되지 않는 반복시 "슬의 량임을 알 수 있었다. 이 반복시ᅳ슬의 량은 항원을 가하여 검출하였을 때 반복사슬이 항원검출에 주는 영향을 시험해 볼 때 사용할 량으로 적절한 것이다 (도 15) .
SD 스트립 상에서 AR5, LR3, LR5, LAR1, LAR2, LAR3도 골드항체가 검출선에 나타나는 것을 볼 수 있다. 그러나 녹십자 키트의 경우에는 LR 시리즈에서는 아무 밴드도 나타나지 않는 것을 볼 수 있다. 이것은 LR의 항체 결속도메인이 항체의 경쇄 중에서 카파 경쇄 (kappa l ight chain)에 만 결속하기 때문이며 , 녹십자 키트의 항체가 카파 경쇄로 이루어진 항체가 아니기 때문이다. 그리고 모든 반복시슴에 대해 반복시슬의 시 "용 량이 0. lug에서는 SD와 녹십자 스트립 모두에서 밴드가 관찰 되지 않으므로 항원 검출에 대한 반복사슬의 영향을 시험하는 실험에 시 "용될 량으로 적절하다 (도 16) . <실시예 11> 반복시슬의 인플루엔자 (influenza) 신속 항원 진단 키트 (Rapid Antigen Test)의 신호증폭에 대한 영향
항체를 이용한 가장 대표적인 인플루엔자 신속 항원 진단 키트에 GR, AR, LR, LAR 시리즈 단백질을 사용하여 이의 민감도 증폭을 관찰하였다. SD 바이오라인 인플루엔자 항원 진단 키트를 사용하였으며 . 키트에는 추출액 , 검체 체취용 면봉 및 스트립이 포함되어 있다. 상기 추출액 뚜¾을 열고, 추출액을 튜브 (Tube)에 떨어뜨렸고, Ant igen(HlNl)을 추출액이 들어있는 류브에 넣고 5회 이상 흔합하였다. 이때, 항원 희석용액에 GR, AR, LR, LAR 시리즈 단백질을 항원과 함께 단순 희석하였다. 스트립을 튜브에 넣고 10분 ~ 15분 후에 결과를 판독하였다.
그 결과, GR5 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR5이 없는 경우에 비하여 항원이 10一 7까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다 (도 17) .
GR10 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR10이 없는 경우에 비하여 항원이 10—8까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다 (도 18) .
GR15 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR15이 없는 경우에 비하여 항원이 1에까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다 (도 19).
GR20 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR20이 없는 경우에 비하여 항원이 10_10까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다 (도 20).
AR5 단백질을 항¾과 함께 단순 희석하는 것은 AR5이 없는 경우와 비교하였을 때 효과가없음을알수 있다 (도 21) .
L 5단백질을항원과함께 단순희석하는것으로 LR5이 없는경우에 비하여 항원이 1에까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다 (도 22).
LAR3 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 LAR3이 없는 경우에 비하여 항원이 10— 8까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다 (도 23).
<실시예 12>반복사슬 A , LR, LAR과 IgG사이의 초복합체 침전형성 관찰
IgG 용액은 Equitech Bio,사의 Mouse IgG 파우더를 PBS에 녹인 후 이용하였다. PBS에 녹인 IgG 용액은 로커 위에서 2시간 동안 rocking해준 후, 원심분리기를 이용 21000rpm, 4°C에서 2시간동안원심 분리하여 용액 내에 완벽하게 녹지 않은 IgG 입자를 제거하였다. GR1 ~ 20과 IgG는 모두 BGA 단백질 정량법 (Bicinchoninic Acid protein assay)을통하여 정량하여 원하는농도로희석하여 실험에 시 "용하였다. G 1 20용액과 IgG용액을정량만큼마이크로센트리퓨즈튜브에 섞어준후상온에서 하룻밤 (Overnight) 동안 결속하도록 보관하였다. 13000rpm, 20° C에서 30분 동안 원심 분리하였다. 이때 침전이 가능한 초복합체가 많이 형성되었다면 육안으로 침전의 관찰이 가능하다. 마이크로파이펫을이용하여 상층액을모두제거한후, 75%에탄올 500 ^을 첨가하였다가 다시 제거하는 방법으로 마이크로 센트리퓨즈 류브 벽면에 남아있는 용액을 모두 세척하였다ᅳ 남아있는 75%에탄올을모두증발시켜 제거한후 SDS-PAGE에 전기영동하여 관찰하였다.
그결과, IgG대 GR10의 몰비 (mole rat ion)가 1:1, 5:1, 10:1이 되게 흔합해주었을때 ,
1:1이나 10:1으로섞어준경우보다 5:1이 되게섞어준경우에서 침전이 더 많이 형성되는 것을관찰하였다 (도 24).
IgG와 GR10를 5:1 비율로섞어준후, 들어간 GR10질량과같은질량의 GR1과 GR2를 섞어서 반웅시켜 주었을 때 GR10이 들어간경우가 GRl, GR2가 있는경우에 비해 침전이 많이 형성되는 것을육안으로 그리고 SDS-PAGE결과에서 모두관찰하였다 (도 25). 같은 질량만큼 넣어준 경우에는 반웅액에 존재하는 항체 결속 도메인 Dili 의 전체 몰 수는 같지만 GR10의 경우에는 Dili 10개가 반복되어 연결된 한 개의 시슬형태로 있고, GR2의 경우에는 2개가 반복되어 연결된 한 개의 사슬로 있다. GR단백질의 총량을 같게 하여 도메인 Dili 의 총량이 같은 량 존재할 때 GR1이나 GR2 보다 GR10이 더 긴 반복사슬의 형태이기 때문에 초복합체 형성올더 잘한다는것을알수있다.
또한, IgG와 GR10의 몰비가 5:1이 되게 하고, GRl ~ 9를 GR10과 같은 질량만큼 가하여 각각 IgG와 섞어서 반웅시켜주었다. 이때 섞어준 후 IgG의 최종농도는 400yg/ml이었다. GR3부터 GR10까지 침전이 생성되는것을육안으로관찰할수 있었다 (도 26). 또한 SDS-PAGE를통해서도같은 결과를볼수 있었다 (도 27). 이를통해 GR3부터 복합체 사이의 교차결합으로 인하여 침전 가능한 초복합체의 형성이 일어나 는 것을 확인할수있었다.
IgG만 있는 대조시료의 경우에는 침전이 형성되지 않았고, 또한 GR이 아닌 BSA를
넣어준 대조시료에서도 침전 형성이 관찰되지 않았으므로, 형성되는 침전물이 이종단백질의 유입으로 인한 단백질 용해도의 감소로 인한 것이 아니라 반복사슬에 의한 분자량이 큰 초복합체의 형성으로 인하여 침전이 형성된 것임을 알 수 있다.
GR10보다 도메인 Dili 의 반복횟수가 더 큰 경우의 초복합체의 형성을 확인 하기 위해 IgG와 GR10의 몰비가 5: 1이 되게 하고, GR1, 3, 5, 15, 20를 GR10과 같은 질량만큼 가하여 각각 IgG와 섞어서 반웅시켜주었다. GR1과 IgG의 경우만을 제외하고 나머지는 모두 침전이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. SDS-PAGE 에서도 GR3부터 GR20까지는 모두 침전이 형성되는 것으로 확인 가능하였다 (도 28) . 이를 통해 GR10보다 큰 GR15나 GR20 또한 IgG와 침전 가능한 초복합체를 형성한다는 것을 알 수 있다.
IgG의 최종 농도를 낮추어 가면서 같은 실험을 실행하였을 때 25 tig/ml이하로
IgG의 최종 농도가 내려갔올 때 더 이상 GR에 의해 육안으로 관찰 가능한 침전이 형성되지 않았다. 이를 통해 초복합체 형성을 통한 침전의 형성은 IgG의 농도에 의존한다는 것을 알 수 있다. 또한 위와 같은 방법으로 GR뿐만 아니라 AR1, 3, 5, LR1, 3, 5, LAR1, 2, 3도 IgG와의 몰비가 5: 1이 되게 하여 반웅을 시켰다. 이 때, IgG의 최종 농도는 500 yg/ml이었고, GR과는 달리 AR, LR, LAR의 경우에는 모두 침전이 관찰 되지 않았다. 이 반복시슬들은 IgG와 결속하여 육안으로 관찰 가능한 불용성인 침전을 형성하지 않는다는 것을 알 수 있다.
<실시예 13> 단백질 G의 항체 접착 도메인 III 반복시슬과 형광 단백질 (ΪΡ를 융합한 유전자의 플라스미드 제작 및 발현
연쇄상 구균 (Streptococcus) 단백질 G의 도메인 m가 반복 사슬로 있는 플라스미드 GRl, GR5, GR10에 형광 단백질을 발현하는 GFP DNA 시뭔스 (표 8)를 유전자 융합하여 GRHiFP, GR5-GFP, GR10-GFP 플라스미드를 제조하였다.
GR1과 GFP 시뭔스를 overlap 할 수 있는 PCR 프라이머 (표 9, 표 10)를 제작하였다. 먼저 GR1 플라스미드를 주형으로 하고 GRl forward, reverse 프라이머로 PCR 하여 PCR product 1을 얻었다.
GFP 플라스마드를 주형으로 하고 GFP forward, reverse 프라이머로 PCR하여 PCR product 2를 얻었다. product 1,2를 모두 넣어 주형으로 쓰고 GRl forward 프라이머와 GFP reverse 프라이머로 PCR 하였다.
GR1과 GFP는 G4S 링커로 연결되어 있다. GR1과 GFP가 융합되어 증폭된 조각들은 제한효소 Ndel과 EcoRl으로 잘라 (950bp) 같은 제한효소로 자른 백터 (vector)에 넣었다. 이 플라스미드의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검시법으로 확인하였다.
완성된 GR1ᅳ GFP 플라스미드를 제한효소 Ndel과 Agel으로 잘라 백터로 쓰고, GR4 플라스미드를 Ndel과 BspEl으로 잘라 얻은 작은 조각을 백터에 넣으면 GR5~GFP 플라스미드가 만들어졌다.
같은 방법으로 GR1-GFP 플라스미드를 제한효소 Ndel과 Agel으로 잘라 백터로 쓰고, GR9 플라스미드를 Ndel과 BspEl으로 잘라 백터에 넣으면 GR1CHGFP 플라스미드가 만들어졌다. 만들어진 폴라스미드의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검사법으로 확인하였다.
이전에 보고된 방법을 이용하여, 단백질을 과발현시켰다 (J.H. Park, et al . , Mol
Cel ls 12 (2001) 398-402) . 용해물을 Ni2+ᅳ킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피 (Ni2+— chelating sepharose fast f low chrcmatography)(½ersham Bioscience,
Sweden)로분리한후, ^1081¾ ( ᅳ75 요또는 HiloadSuperclex-200pg(26/60)(AniershaiTi Bioscience, Sweden)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피 (size-exclusion 'chromatography)로분리하였다.
【표 9】 .
|GR1 Forward프라이머 시뭔스
5'-GCC CAT A G CAT CAC CAT CAC-31 (서열번호: 9) ᅳ
GR1 Reverse프라이머 시뭔스 .
i5'-GCC CTT GCT CAC CAT CC GGA GGA CCC GCC CC ACC-3' (서열번호: 10) 턴는의 블 것경럿 을우의
<실시예 14>반복사슬 G , PR, LR, LAR에 의한웨스턴블렷분석법에서의 항체신호효과의 증폭확인
상기 <실시예 3>과동일한방법으로웨스턴블럿을진행하였다.
도 29a에서는 GR에 의한 웨스턴 블럿의 detection limit이 늘에 는 것을 GR을 사용하지 않았을 경우의 웨스턴블럿과 비교 대조하여 확인하였다. GR5, 10, 15, 20를 사용하였고, 도면에 표시된 몰 비 대로하여 실험을 진행하였다. 반복사슬 (Repeat chain)의 길이가 달라지면 최적의 비율이 달라짐을 확인하였다. 그리고 반복사슬의 길이가 길어질수록 증폭이 많이 되어 민감도가 늘어나는 것 또한 확인하였다. GR20의 경우최대 8배 더 민감해졌다 (도 29a). 도 29b은도 29a의 내용을도식화한것으로검출 가능한 최저 항원의 량을비교한것이다 (도 29b).
도 30의 A에서는 같은 양의 항원이 존재할 때 GR로 웨스 화학루미센스 ( chemi luminescence) 신호가 증폭되는 것을 확인하였다. GR2C primary Ab와 복합체인 초복합체의 형성으로 최대 42배가량 신호가 증폭되
확인하였다 (도 30) . 도 30의 B는 도 30의 A를 그래프화한 것이다 (도 30) . 도 31의 A에서는 GR의 초복합체 형성을 통한 웨스턴블럿의 신호 증폭을 다른 종류의 항원을 사용하여 보여준 것이다. 기존에 사용했던 bovine t issue lysate 대신 A431 whole cel l lysate를 사용하여서 신호가 증폭되는 것을 확인하였다 (도 31) .
도 31의 B는 다른 종류의 1차 항체를 시용해도 반복사슬에 의한 웨스턴블럿의 신호 증폭이 가능하다는 것을 보여주었다. 이때의 경우는 ant i-13-act in mouse monoclonal ant ibody가 아닌 ant i—E—cadherin mouse monoclonal ant ibody를 사용하였다 (도 31) .
도 32의 A는 모든 반복사슬이 웨스턴블럿을 증폭시키는 정도를 비교한 것이다. GR10, AR10, MAR5 (LAR5 사슬에서 L이 다른 형태인 반복사슬)를 같은 조건에서 증폭시키는 정도가 얼마나 다른지 비교 확인하였다. AR10과 MAR5 를 비교하면 한가지의 도메인 (A)을 10번 반복한 AR10 보다 두 가지의 도메인 (A와 M)을 5번 반복하였을 때 증폭효과가 좋아 졌음을 볼 수 있다 (도 32) .
도 32의 B는 LR10을 적용한 웨스턴블럿 결과이다. 다른 반복사슬과 다르게 LR의 경우는 증폭 효과가 크게 나타나지 않았다 (도 32) .
<실시예 1 > 신속 항원 진단 키트 (Rapid Antigen Test)를 이용한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결속
항체를 이용한 가장 대표적인 검출법인 인플루엔자 신속 항원 진단 키트를 이용하여 항원을 가하지 않은 상태에서 반복서열올 가하여 형성되는 골드항체와의 복합체 또는 초복합체가 검출선 항체와 교차결속을 하여 골드항체가 검출되는지를 관찰하였다. 이렇게 나타나는 검출선은 반복사슬 /골드항체의 복합체 또는 초복합체 내의 반복시슬의 항체 결속 도메인 중 비어 있는 자리가 검출선 항체에 교차결속 하여 나타나는 것이다. SD 바이오라인 인플루엔자 항원 진단 키트 와 녹십자 인플루엔자 항원 진단 키트를 사용하였으며, 키트에는 항원 완충용액, 검체 체취용 면봉 및 스트립이 포함되어 있다. 상기 항원 완충용액 뚜껑을 열고, 항원 완충용액을 튜브 (Tube)에 넣고, GR, AR, LR, MAR 반복사슬 시리즈를 항원 완충용액이 들어있는 튜브에 넣고 5회 이상 흔합하였다. 스트립을 튜브에 넣고 10분 ~ 15분 후에 ¾과를 판독하였다.
GR에 의한 골드라인의 여부를 보게 되면 GR5, GR10, G 15, GR20의 경우 각각 모든 스트립에 대하여 골드라인을 확인 할 수 있고 (도 33), AR의 경우에는 AR10 에서 모든 스트립에 대하여 골드라인이 나타난 것을 볼 수 있다. AR5의 경우는 어떠한 농도에서도 골드라인이 형성되지 않았다 (도 34) . LR의 경우 SD 스트립에서 LR5와 LR10에 대하여 골드라인이 형성되었으나 녹십자 스트립에서는 모든 LR 단백질에 대하여 교차결속이 이루어 지지 않았다. 이는 녹십자사의 항체의 VL이 LR단백질이 결속하는 카파시슴이 아니기 때문이다 (도 35) . 證 (LAR5 사슬에서 L 이 다른 형태의 L인 반복사슬)은 SD스트립의 경우 MAR1, MAR5, MAR10 대하여 골드라인이 관찰되었으나 녹십자의 스트립의 경우에는 MAR5, MAR10에 대해서만 골드라인이 관찰 되었으며 . 두 스트립간 골드라인 양상에 차이가 있고 SD스트립이 녹십자 스트립보다 훨씬더 강한 골드라인을 형성하였다 (도 36) . 이것은 MAR에 포함되어 있는 L 결속도메인의 검출선 항체와의 결속 여부로 설명할 수 있는데, 스트립상의 검출선 항체가 L 결속도메인이 결속할 수 있는 VL 카파 사슬와 향체인가의 여부에 따라 양상이 달라진 것이다. 검출선 항체가 VL 카파를 갖고 있지 않는 녹십자 스트립에서의 MAR10 골드라인은 MAR10에 포함되어 있는 protein A domain B 로부터 제초된 A 결속도메인의 결속으로만 형성되어 골드라인이 SD스트립 보다
약하게 나타난 것이다.
. 또한 각각의 도메인이 1개 들어 있는 GRl , AR1, LR1 에 대해서는 모든 스트립에 대하여 골드라인이 형성되지 않았다. 도메인 1개로는 골드항체와의 검출선 항체 사이의 교차결속이 불가능하기 때문이다.
<실시예 16> GR/V (1, 5, 10, 15, 20) ,層 (1, 5, 10), Ii¾V (l, 5, 10) , MAR^ (1, 5, 10)에 의한 간접효소면역측정법 (enz me~l inked immunosorbent assay, ELISA)에서의 항체 신호효과 증폭
Bovine t issue lysate를 최종농도가 100 ng/ml이 되도톡 Coat ing buffer에 희석하였다. 마이크로타이터 (microt iter) 폴레이트 (plate)의 웰에 상기 희석된 용해물 50 ^를 파이펫팅 (pipet i ing)하여 희석된 용해물로 코팅하였다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 4°C에서 하룻밤 동안 보은하였다. 그런 다음, 코팅 용액을 제거하고, 200 ιΛ 인산완충식염수로 플레이트를 두 번 세척하였다. 상기 용액 또는 세척액 (세제인 0.1% (v/v) 트원 20(Tween 20)이 포함된 인산완충식염수)은 샹크대에 플레이트를 털어서 제거하였고, 남아있는 방울은 종이 수건에 가볍게 두드려서 제거하였다. 플레이트를 블로킹하기 위해, 차단 용액 (Blocking solut ion)(3 소 혈청 알부민 (BSA) , 인산완충식염수)을 200 ≠ 첨가하여 코팅된 웰에 남아있는 단백질 -결합 부위를 차단하였다. 뚜¾을 덮고 상온에서 2 시간 동안 보온한 후, 인산완충식염수로 플레이트를 두 번 세척하였다. 사용 전에 즉시 희석 완충액과 1차 항체 (마우스 항 -액틴 항체 (mouse ant i -act in ant ibody (Santacruz biotech)) 또는 1차 항체 및 반복서열 단백질돌의 복합체 100 f 첨가하였다. 뚜껑을 덮고 상온에서 2 시간 동안 보온하였고, 인산 완충액으로 플레이트를 두 번 세척하였다. 또한 사용 전에 즉시 희석 완충액과 산양 항ᅳ미 "우스 -항체 -HRP( Goat ant Hrouse beta act in-HRP ant ibody)를 1:2000으로 를 첨가하였다. 뚜껑을 덮고 상은에서 1 시간 동안 보온하였고, 인산 완충액으로 플레이트를 두 번 세척 후 HRP의 기질인 1»를 100 ^ 첨가하였고 상은에서 20분 동안 보온하였으며 이 후 2M 황산을 100≠주입 후 플레이트 리더기에서 450 nm로 리딩하였다.
GR의 경우 GR5, GR10, GR15, GR20에서 신호증폭을 확인할 수 있었으며, GR5는 1차 항체와 GR5의 1:2 몰 비에서 신호증폭에 있어 가장 효과적인 복합체가 형성되는 것을 볼 수 있었으며 증폭량은 보통 항체 신호보다 6배 높았다. GR10의 경우 GR5와 동일하게 1차 항체와 GR10의 1:2 몰비 에서 복합체가 형성되었으며 증폭량은 9.8배 높았으며, GR15와 GR20은 1: 1/2 에서 복합체가 형성되었으며 증폭량은 각각 10.5, 12.9배 높았다 (표 11) . AR과 MAR의 경우 AR10과 MAR10 에서 각각 몰비 1:2에서 1.8배, 1: 1에서 1.6배의 증가를 나타내었다. 반면에 LR는 어느 경우에서도 증폭효과가 나타나지 않았다. 그 이유는 본 연구에 사용한 1차 항체의 VL이 카파시슬이 아니기 대문에 증폭현상이 관찰되지 않은 것이다.
또한 각각의 도메인이 1개 들어 있는 GRl, AR1, LR1 에 대해서는 모든 몰비에 대하여 신호증폭이 관찰되지 않았다. 그 이유는 도메인 1개로는 복합체사이와 교차결속으로 초복합체의 형성이 불 7]·능하기 때문이다. [표 11】
GR/V (1, 5, 10, 15, 20) , A (1 , 5, 10) , LR^ (1, 5, 10) , MAM (1 , 5, 10)에 의한 간접효소면역측정법에서의 항체 신호 측정
<실시예 17> 단백질 G의 Domain III 반복사슬 재조합 단백질과 B3(Fab)"ext~PE38들이 접착된 복합체로부터 [B3(Fab)"ext~PE38]2의 제조
정제된 ΊΚ1 , 3, 5, 10, 15, 20 (= GR1 , 3, 5, 10, 15, 20) 단백질 및 이에 접착된 B3(Fab)-ext— PE38들을 이용하여 [B3(Fab)— ext— PE38]2를 생산하기 위해, 2-멀캅토에탄올로 환원시키고 글루타치온 산화 형태 (glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 분자를 비환원 (도 37) SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
구체적으로, 단백질 복합체를 금속 킬레이팅 세파로스 비드 (metal chelat ing sepharose bead)에 TC에서 1시간 동안 고정시켰다. 40 의 금속 킬레이팅 세파로스 비드 [100 mM Tr isHCl (pH8.2)에 50% 현탁]를 각각의 반웅 혼합물에 첨가한 후, 고정된 단백질 복합체를 실은에서 40 mM의 2-멀캅토에탄올 (Merchaptoethanol )을 첨가한 100 mM Tr isHCKpH8.2)을 첨가하여 환원하였다. B3(Fab)-ext-PE38의 시스테인 잔기를 환원시키는데 필요한 2-멀갑토에탄을의 농도를 결정하기 위해 수행한 예비실험에서, B3(Fab)-ext-PE38의 시스테인 잔기의 완전한 환원은 20 ~ 40 mM의 2-멀캅토에탄올의 첨가에 의해 이루어졌다. 그런 다음, 환원된 단백질 복합체를 100 mM MQPS(pH6.5)가 포함된 세척 완충용액으로 1회 세척한 후, 100 mM Tr isHCl (pH8.2)로 3회 더 세척하였다. 상기 세척 단계 후, 단백질 복합체를 5 mM GSSG 및 100 mM Tr i sHCl (pH8.2)가 포함된 산화 완층용액을 첨가하여 산화 반웅시킨 다음, 37°C에서 2시간 동안 보은하였다. 상기 산화 반웅 후, 2X SDS 시료 완충용액을 첨가한 다음, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 쿠마시 염색으로 분석한 후, 농도계측기를 이용하여 밀도분석을 통해 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 생성율을 분석하였다. 또한, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에서, TR과 산화 환원 과정을 거친 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 밴드 (도 37, Lane4)의 강도를 Ή?없이 산화 환원을 거친 [B3(Fab)_ext-PE38]2의 밴드 (도 37, Lane5)의 강도로 나눈 값을 이용하여 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 증가율을 산출하였다 (표 12) .
그 결과, [B3(Fab)— ext-PE38]2는 B3(Fab)-ext-PE38 단독, TRl과의 복합체 2가지의 시료에서 증가되지 않았다. TR3, 5, 10, 15, 20 복합체 내에서의 단량체 간의 높아진 충돌 상호작용은 이황화결합으로 가교 결합된 이량체의 상당한 증가된 생산을 나타내었다. m, TR5, TRIO, 1R15, ΊΕ20 복합체의 시료에서 [B3(Fab)ᅳ ext-PE38]2의 수득 증가 배율은 각각 4.6배, 3.4배 , 16.7배, 3.5배 및 2.7배를 나타내었다. [B3(Fab)-ext-PE38]2의 생산은 산화제 첨가 후 2시간 내에 이루어졌으며, 추가적인 보은에 의해 유의적인 증가가 나타나지 않았다. 이로써 단백질에 접착되는 B3(Fab)-ext-PE38 분자의 ext내 시스테인 잔기는 반복사슬을 통해 쉽게 가까이 근접하여 함께 접착되어 있음을 알 수 있었다
【표 12】
[B3(Fab)-ext-PE38]2의 수득 증가 배율
<실시예 18> 단백질 G의 Domain III 반복사슬 재조합 단백질과 Herceptin(Fab)ᅳ ext-PE38들이 접착된 복합체로부터 [Herc rtin(Fab) xt PE38]2의 제조
정제된 GR5, GR10, GR15, GR20 (= TR5, TRIO, 1R15, 1R20) 단백질 및 이에 접착된
Hercept in(Fab)-ext-PE38들을 이용하여 [Herceptin(Fab)-ext-PE38]2를 생산하기 위해, 2-멀캅토에탄올로 환원시키고 글루타치은 산화 형태 (glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
구체적으로, 단백질 복합체를 금속 킬레이팅 세파로스 비드 (metal chelat ing sepharose bead)에 4°C에서 1시간 동안 고정시켰다 (도 38, lane 1) . 40 μ ΐ의 금속 킬레이팅 세파로스 비드 [100 mM TrisHCl (pH8.2)에 50% 현탁]를 각각의 반웅 흔합물에 첨가한 후, 고정된 단백질 복합체를 실온에서 40 mM의 2-멀캅토에탄올 (Merchaptoethanol )을 첨가한 100 mM TrisHCKpH8.2)을 첨가하여 환원하였다 (도 38, lane 2) . 그런 다음, 환원된 단백질 복합체를 100 mM M0PS(pH6.5)가 포함된 세척 완충용액으로 1회 세척한 후, 100 mM Tr isHCKpH8.2)로 3회 더 세척하였다. 상기 세척 단계 후, 단백질 복합체를 5 mM GSSG 및 100 mM Tr isHCKpH8.2)가 포함된 산화 완충용액을 첨가하여 산화 반율시킨 다음, 37°C에서 2시간 동안 보온하였다 (도 38, lane 3) . 상기 산화 반웅 후, 2X SDS 시료 완충용액을 첨가한 다음, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 쿠마시 염색으로 분석한 후, 농도 계측기를 이용하여 밀도분석을 통해 [Hercept in(Fab)-ext_PE38]2의 생성율을 분석하였다 (표 13) . 구체적으로, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에서 , 과 산화 환원을 거친 [Hercept in(Fab)-ext-PE38]2의 밴드 (Lane4)의 강도를 1R 없이 산화 환원 과정을 거친 [Hercept in(Fab)-ext-PE38]2의 밴드 (Lane5)강도로 나눈 값을 이용하여
[B3(Fab)ᅳ ext-PE38]2의 증가율을 산출하였다 (표 13) . Hercept in(Fab)-ext-PE38환원 단독 (도 38, Lane2) , Hercept in(Fab)-ext-PE38 산화 단독 (도 38, Lane 3) 및 Hercept in(Fab)-ext-PE38 단독 을 음성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, [Hercept in(Fab)-ext-PE38]2는 Ή 과의 복합체, ΊΚ10 과의 복합체, 와의 복합체 및 Τ 20와의 복합체의 시료에서 [Hercept in(Fab)-ext-PE38]단독 (-T ) 시료 보다 각각 2.3배 , 2.3배, 1.7배 그리고 3.3배 검출되었다. TR5, TRIO , T 15, ΊΚ20복합체 내에서의 단량체간의 높아진 충돌 상호작용은 이황화결합으로 가교 결합된 이량체의 상당한 증가된 생산을 나타내었다. [Hercept in(Fab)-ext-PE38]2의 생산은 산화제 첨가 후 2시간 내에 이루어졌으며, 추가적인 보온에 의해 유의적인 증가가 나타나지 않았다. 이로써 단백질에 접착되는 Hercept in(Fab)-ext-PE38 분자의 ext내 시스테인 잔기는 반복시슬을 통해 쉽게 가까이 근접하여 함께 접착되어 있음을 알 수 있었다ᅳ
[표 13】
[Hercept in(Fab)-ext-PE38]2의 증가율
<실시예 19> GR 반복사슬 단백질과 [Hercept in(Fab)"¾xt~PE38] 단량체의 복합체의 세포 독^ ^과 확 ¾
Hercept in(Fd)-ext-PE38, H6-Hercept in(L) , e23(Fd)-ext_PE38및 H6-e23(L) 봉입체 ( inclusion body)의 과발현, 제조 및 재접힘 (refolding)은 이전에 보고된 방법과 같이 수행하였다 (J .H. Park, et al . , Mol Cel ls 12 (2001) 398-402) . GR protein과의 associat ion 후 세포 독성 효과를 확인하기 위해 [Hercept in(Fab)-ext-PE38]과 GR5 ~ 20의 associat ion을 진행하였다.
구체적으로 [Hercept in(Fab)-ext-PE38]과 Ή ~ 20, [e23(Fab)_ext-PE38]과 Ί1 - 20을 1시간 동안 37°C 배양 후 농도별로 유방암세포에 처리하여 37°C에서 24시간 반웅시켰다. 그리고 CCK-8 solut ion을 배지의 1/10 만큼 처리하고 37°C에서 4시간 반웅시켜 그 효과를 관찰하였다 (도 39 및 도 40, 및 표 14 및 표 15) .
SKBR3 세포주에서의 결과, TR5과의 복합체 , TR10 과의 복합체, ΊΚ15와의 복합체 및 TR20와의 복합체의 시료에서 Hercept in(Fab)-ext-PE38 단독 시료보다 각각 2.8배, 2.2배, 1.7배, 2.3배 높은 세포독성 효과를 보여주었으며, e23(Fab)-ext-PE38 단독시료 보다 각각 4.5배, 1.4배 , 2.4배, 1.7배 높은 세포독성 효과를 보여주었다. BT474 세포주에서의 결과, 1R5과의 복합체 , TR10 과의 복합체 , T 15와의 복합체 및 ΊΚ20와의 복합체의 시료에서 Hercept in(Fab)-ext-PE38 단독 시료보다 각각 1.9배, 2.8배, 3.4배, 2.9배 높은 세포 독성 효과를 보여주었으며, e23(Fab)_ext-PE38 단독시료 보다 각 각 3.8배, 5배 , 23배, 11.3배 높은 세포 독성 효과를 보여주었다.
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