WO2014176934A1

WO2014176934A1 - 一种中药组合物在制备治疗或预防血管生成相关疾病的药物中的应用

Info

Publication number: WO2014176934A1
Application number: PCT/CN2014/000462
Authority: WO
Inventors: 吴以岭; 魏聪
Original assignee: 河北以岭医药研究院有限公司
Priority date: 2013-05-02
Filing date: 2014-05-04
Publication date: 2014-11-06
Also published as: CN104127798B; CN104127798A

Abstract

一种中药组合物在制备用于治疗或预防血管生成相关疾病的药物中的应用，所述血管生成相关疾病包括癌症。优选的所述药物用于抑制癌转移，特别是向腹膜转移。该中药组合物包含如下的原料药或其提取物：黄芪、女贞子、人参、灵芝、莪术、白术、半枝莲、绞股蓝、茯苓、鸡内金、蛇莓、白英、茵陈、徐长卿、土鳖虫和白花蛇舌草。

Description

一种中药组合物在制备治疗或预防血管生成相关疾病的药物中的应用技术领域

[01] 本发明属于中药应用领域，具体地，涉及一种中药组合物在治疗或预防血管生成相关疾病（包括癌症），尤其是用于抑制癌转移（特别是向腹膜转移）中的应用。

背景技术

[02] 血管生成 (即新生血管形成)包括血管发生和血管新生；血管发生指由已存在血管通过出芽的方式形成新的血管，血管新生是指通过成血管细胞 /内皮祖细胞募集到新生血管形成位点并分化为内皮细胞。正常情况下血管新生过程在促进血管生成和抑制血管生成的各种因子的精密调节下达到平衡状态。血管生成在人体发育、组织修复、女性月经周期等正常生理过程中发挥重要作用。同时，多种疾病的发展也与血管血管新生密切相关。

[03] 与正常血管相比，肿瘤血管的结构缺乏完整性，内皮细胞之间存在较大缝隙，通透性强，血管网状结构紊乱，有大量的血管盲端和动静脉短路，这种结构的异常导致渗出增加及组织间高压，同时也易于癌细胞发生转移。肿瘤的生长有两个不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过 1~2 mm³。抑制血管生成是抗肿瘤治疗的新策略。一般情况下除了在月经期、炎症或外伤时，成人的血管内皮细胞均处于静止状态。血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF). 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 是重要的血管生成因子，对内皮细胞具有高度特异性，以它们为靶目标的治疗药物被证明具有极少副作用。细胞表面受体和细胞外因素可以调控血管生成的过程，这提示药物可以不被细胞吸收而发挥干扰血管生成的作用。

[04] 除过无限制的生长，肿瘤细胞的特征包括粘附、迁移、侵袭，这也是肿瘤细胞离开原发灶，通过血运和体腔向身体局部或远端器官播散的原因。血管新生对肿瘤细胞的远端播散也很重要。肿瘤细胞的功能与肿瘤细胞的转移能力密切相关。黏着斑激酶 (FAK) 在细胞的黏附和迁移中起着至关重要的作用，黏着斑激酶 (FAK)抑制剂可以有效阻止肿瘤细胞的转移。

[05] 磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)信号参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。近年来发现， IA型 PI3K和其下游分子蛋白激酶 B(Akt) 所组成的信号通路与人类肿瘤的发生发展密切相关。该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活，其活性异常不仅能导致细胞恶性转化，而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关，目前以 PI3K-Akt信号通路关键分子为靶点的肿瘤治疗策略正在发展中。渥曼青霉素 (Wortmannin)就是其中最典型的代表，目前已经进入临床研究阶段。癌症会发生远位转移，远位转移是指从原始的发生部位侵入循环系统，转移到身体其他部位继续生长的过程，这样使得治疗上变的更为困难。实体肿瘤的远位转移是引致病人死亡的主要原因。体腔内的转移主要发生在胸腔和腹腔内，而腹膜转移大多数来自胰腺癌、结肠癌和卵巢癌，其次是胃癌和子宫颈，当肿瘤细胞通过胸腔或腹腔进行传播并发展成转移病灶时，癌细胞需要进行自我调节适应环境并且与间皮细胞相互作用。

[06] 间皮是覆盖体内空腔的上皮，空腔主要有腹膜腔、胸膜腔和心包腔构成，形成间皮的主要细胞类型是间质细胞，这是一个单层的细胞层，携带有间质细胞和上皮细胞标记。间皮作为体腔保护层和无粘着力的表面，可以是自我更新的。因此，该层参与了腔内炎症、组织修复、液体和电解质运输和癌细胞的粘附和传播。间皮细胞恶性转化所导致的间皮瘤，是一种侵袭性很高的恶性肿瘤，几乎没有有效的治疗措施。间皮细胞可能是肿瘤细胞的一个特异性附属位点（Cunliffe and Sugarbaker, 1989 )。这被认为是与透明质酸层有关，透明质酸层一种由间皮细胞释放的蛋白质，并连同其他蛋白形成一种间皮的保护性表面。腹膜转移主要是通过两个途径：系统扩散和侵入局部组织后局部植入。远离腔体的肿瘤可能是经系统扩散这条途径发展成种植转移，比如，乳腺癌和肺癌腹膜转移。大多数腹膜转移来自原与腹膜腔相毗邻的原发肿瘤，即来自于胃、结肠、胰腺、卵巢、膀胱等处。来自于肿瘤的癌细胞向周围组织浸润，突破腹膜内面并在腹膜腔体内种植，尽管浆膜内和浆膜下扩散均能被发现。腹膜扩散的许多形式己经明确，肿瘤 -间皮的交互作用是建立体腔内转移肿瘤的必要的步骤。

[07] 研究表明，而腹膜转移灶是妇科肿瘤（60.3%)，其次是胃肠肿瘤（23.4% ) 和乳腺癌（14.0% ) ( Antic et al. 2012)。当肿瘤细胞在胸腔或腹腔传播通过并发展成一个转移病灶时，癌细胞需要适应环境并与间皮的细胞发生交互作用。某些肿瘤出现腹膜转移的发生率更高，比如卵巢癌、胰腺癌和直肠癌分别有 90， 50， 40和 32%将会出现腹膜转移。当然，腹膜转移不会单独发生，可以被视为一个癌症细胞广泛传播的局部区域。比如， 70%具有淋巴转移的卵巢癌也有腹膜转移 (Amadori et l 1997)。同样， 50%已侵入浆膜的胃癌患者具有腹膜转移（Cintro and Pearl 1996, Marutsuka et al 2003 ) , 大多数乳腺癌患者具有腹膜转移（Del Castillo et al 1993, Douglass and Penetrante 1990 )。不幸的是，广泛扩散的腹膜转移患者生存时间不超过 6个月（Sadeghi et al 2000 )。 [08] 目前对于用于抑制血管发生的药物有迫切的需求，然而现有的药物在有效性或安全性方面尚不能让人满意。

[09] 此外，现有临床实践中针对腹膜的治疗选择非常有限。实际上，因为腹膜转移的特殊性质，对这一致命性的状态尚缺乏特殊治疗。外科切除主体肿瘤便成为管理选择。但是，这对己经形成的腹膜转移收效甚微。作为系统转移的部分，全身化疗和腹腔内化疗一直试图作为主要癌症和腹膜转移的治疗选择，但也收效甚微。

[10] 腹膜转移的另一领与是对腹膜转移的预防和早期干预。一个关键的机会是在外科手术程序中。手术方法是根除主要肿瘤的关键。这也许会引起意外的副作用，即肿瘤细胞在腹膜腔种植，尽管外科医生都试图避免这一后果。另外，在手术过程中也存在腹膜转移或肿瘤细胞种植的可能。总之，手术本身显示了出色的防止腹膜转移机会，并在其多面扩散之前尽早对转移采取措施。然而，对于这种介入的选择方法很少。除了技术之外，为防止人为植入，通过使用填充 /隔离材料，以避免接触肿瘤和周围组织。在手术过程中，广泛采用的方法是在手术过程中腹膜洗涤 /灌溉。清洗的目的就是为了通过更多的水去除任何组织碎片和可能存在的肿瘤细胞，这是很难令人满意的解决方案。

发明内容

[1 1] 现有技术中迫切需要一种有效的药物用于抑制血管生成，以治疗或预防与血管生成相关的疾病和病症。特别需要用于治疗和预防癌症，包括癌转移，尤其是用于抑制癌细胞向腹膜转移的药物。

[12] 本发明人在研究中出乎意料地发现，包含下面药材或其提取物的中药组合物可有效抑制血管生成：黄芪、女贞子、人参、灵芝、莪术、白术、半枝莲、绞股蓝、茯苓、鸡内金、蛇莓、白英、茵陈、徐长卿、土鳖虫、白花蛇舌草。

[13] 特别地，所述中药组合物包含如下重量份比例的原药或其提取物：黄芪 140-300 女贞子 150-250 人参 40-90 灵芝 40-85 莪术 75-180 白术 40-80 半枝莲 80-180 绞股蓝 150-300 茯苓 40-80 鸡内金 20-35 蛇莓 75-175 白英 85-175 茵陈 85-175 徐长卿 75-175 土鳖虫 15-25 白花蛇舌草 95-165。

或者，本发明的中药组合物由上述重量份比例的原料药或其提取物组成。 [14] 本发明人更惊奇地发现：本发明的上述组合物还可以有效抑制癌细胞向腹膜转移，而没有明显的副作用。

[15] 本发明所述的中药原料药均可按照《全国中药炮制规范》或《中药大辞典》进行炮制。

[16] 本发明的中药组合物中，可包含上述中药原料药，以及任选的其他中药。在一个优选的实施方案中，所述中药组合物由上述中药原料药组成。在另一份优选的实施方案中，所述中药组合物由上述中药原料药以及任选的赋形剂和 /或载体组成。优选地，在本发明的所述中药组合物中，所述中药原料药以粉碎的形式存在，包括例如粉末、颗粒等形式。更优选地，在本发明的所述中药组合物中，所述中药原料药以其提取物的形式存在；所述提取物可以是溶剂提取物，例如醇提取物、水提取物、以及醇-水提取物等；所述提取物可以是以膏、溶液、干燥后的粉末等形式存在。更特别地，所述用于提取的溶剂为乙醇，特别优选浓度为 50-90%的乙醇，浓度为 50-80%的乙醇、以及浓度为 60-75%的乙醇。在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述中药组合物中的一部分以其中药原料药的形式存在，一部分以其提取物的形式存在。在本发明的一个特别优选的实施方案中，对于莪术、白术和徐长卿单独提取其所含有的挥发油，并将所提取的挥发油合并到其提取物中作为提取物使用。

[17] 优选的，该中药组合物包含如下重量份的原料药或其提取物，或者由其组成：

黄芪 140 女贞子 250 人参 40 灵芝 85 莪术 75 白术 80

半枝莲 85 绞股蓝 300 茯苓 40 鸡内金 35 蛇莓 75

白英 175 茵陈 85 徐长卿 175 土鳖虫 15 白花蛇舌草 165。

[18] 或

黄芪 300 女贞子 150 人参 90 灵芝 40 莪术 180 白术 40

半枝莲 180 绞股蓝 150 茯苓 80 鸡内金 20 蛇莓 175

白英 85 茵陈 175 徐长卿 75 土鳖虫 25 白花蛇舌草 95。

[19] 或

黄芪 250 女贞子 200 人参 65 灵芝 65 莪术 132 白术 64 半枝莲 128 绞股蓝 256 茯苓 65 鸡内金 30

蛇莓 128 白英 128 茵陈 128 徐长卿 128 土鳖虫 20

白花蛇舌草 128 。

[20] 本发明人更出乎意料地发现，本发明的组合物对于防止癌症转移有很好的效果，特别是用于有效抑制癌细胞向腹膜的转移，这在临床应用中有重要的意义和价值。

[21] 所述癌症为胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌或骨肉瘤。

[22] 为实现发明目的，优选地将所述中药组合物的原料药材制成其提取物，所述中药组合物的原料药的提取物是通过包括以下的步骤制得的：

( 1 ) 用醇提取得醇提取物，

(2) 对水提取得水提取物；

(3 ) 将上述醇提取物和水提取物合并即可。

[23] 在一个优选方案中，先对女贞子和人参用醇提取得醇提取物；对莪术、白术、徐长卿提取挥发油；将土鳖虫、鸡内金和茯苓原药材直接粉碎成粉末；将黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英和茵陈用水提取得水提取物；然后将上述人参和女贞子醇提后的残渣，莪术、白术、徐长卿提取挥发油后的残渣，以及上述醇提取物、水提取物和挥发油合并，得到本发明的中药组合物。

[24] 在一个更优选的实施方案中，本发明的中药组合物是通过包括以下的步骤制得的：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(2)、女贞子、人参加 6-10倍量 50-90%乙醇提取 1-3次，每次 1-4小时，合并提取液，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，药渣备用；

(3)、莪术、白术、徐长卿加 4-8倍量水提取挥发油，收集挥发油，另器收集，残渣及水溶液备用；

(4)、土鳖虫、鸡内金、茯苓粉碎成细粉；

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤 (2) 中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤 (3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后残渣及水溶液合并，加 7-10倍量水，加热煎煮 1-3次，每次 1-3小时，合并煎煮液，加入步骤 (2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成清膏，干燥，粉碎，备用；

上述步骤（4) 所得粉碎粉、步骤（3 ) 所得挥发油与步骤（5 ) 所得的干膏粉共同构成该中药组合物。

[25] 为实现发明目的，可将本发明的中药组合物制成合适的剂型，例如胶囊剂、片剂、散剂、口服液、丸剂、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂或注射剂。

[26] 本发明药物的其他剂型按比例称取原料药后，可采用常规的制备方法制备，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社 1997年 12月第 1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的常规剂型。

[27] 为使上述剂型能够实现，可以根据需要在制备这些剂型时加入药学可接受的赋形剂和 /或载体，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二垸基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯垸酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括： PEG6000, PEG4000, 虫蜡等。需要时，可在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社 1997年 12月第 1版中各剂型记载的辅料）。

[28] 优选的，本发明涉及该中药组合物在制备联合 FAK抑制剂、 SRC抑制剂、 CD44抑制剂或 HA抑制剂抑制癌细胞向腹膜转移的药物中的应用。

[29] 本发明还涉及所述中药组合物在制备围手术期防止癌细胞向腹膜转移药物中的应用。

[30] 本发明还涉及所述中药组合物在制备联合化疗抑制癌细胞向腹膜转移药物中的应用。

[31] 本发明药物组合物可以有效地抑制癌细胞向腹膜转移。本发明配伍合理，简单易行，为纯中药制剂，不良反应小，可供病人长期使用。附图说明

[32] 图 1是未使用 DME25的人类肠癌细胞图；

[33] 图 2是使用 DME25的人类肠癌细胞图；

[34] 图 3是未使用 DME25的卵巢癌细胞图；

[35] 图 4是使用 DME25的卵巢癌细胞图；

[36] 图 5是 DME25对结肠直肠癌细胞粘着透明质酸（HA)涂层以及非涂层表面的作用图；

[37] 图 6是 DME25对卵癌细胞粘着透明质酸（HA)涂层以及非涂层表面的作用图；

[38] 图 7是 DME25对胃癌细胞粘着透明质酸（HA)涂层以及非涂层表面的作用图；

[39] 图 8是 DME25和透明质酸酶抑制剂对胃癌细胞的作用图；

[40] 图 9是 DME25和透明质酸酶抑制剂对结直肠癌细胞的作用图；

[41] 图 10是 HAi和 DME25对卵巢癌细胞和透明质酸涂层表面之间粘附的影响图；

[42] 图 11是 HAi和 DME25对结肠直肠癌细胞和透明质酸涂层表面之间粘附的影响图；

[43] 图 12是 DME25和 FAKi对胃癌细胞-间皮细胞相互作用影响图；

[44] 图 13是 DME25和 FAKi对结肠直肠癌细胞-间皮细胞相互作用影响图；

[45] 图 14是 DME25和 FAKi对卵巢癌细胞-间皮细胞相互作用影响图；

[46] 图 15三维图显示 DME25与 FAK抑制剂、抗 CD44和抗 FnR的组合效果；

[47] 图 16 DME25抑制间皮细胞迁移；上面图为电损伤后细胞迁移的踪迹，每个踪迹是 4个实验的平均数，下面四个图为细胞迁移的三维图；

[48] 图 17 c- S RC抑制剂和 DME25对肿瘤 H A与 HT 115细胞相互作用的影响；

[49] 图 18 cSRC抑制剂在 HA抑制剂，抗 CD44和 FAK抑制剂介导肿瘤 HA 相互作用；

[50] 图 19 DME25和 SRC抑制剂对胰腺癌细胞黏附的影响， ASPC-1(上)和 MI PA CA-2 (下）在透明质酸涂覆的表面； [51] 图 20 SRC抑制剂、 AZM 475271和透明质酸抑制剂 (HAi)对 ASPC-1胰腺癌细胞肿瘤间皮细胞的相互作用的效果；

[52] 图 21 DME、 SRC抑制剂和 HA抑制剂对 SRC和 ezrin蛋白磷酸化的效果。左图：蛋白免疫印迹总 SRC和 phospho-SRC，总 ezrin和 phospho-ezrin。右图：磷酸化蛋白与总蛋白定量。

[53] 图 22 DME25对 CSRC和磷酸化 SRC在 ASPC-1胰腺癌细胞上细胞定位；

[54] 图 23 DME25对 HT115结肠直肠癌细胞中 CSRC和磷酸化 SRC细胞定位；

[55] 图 24在原代培养腹膜间皮细胞中，刺激胰腺癌细胞 ASPC-1后 CD44的染色；

[56] 图 25 DME25在体内抑制腹膜大肠癌；

[57] 图 26是未使用本发明中药组合物的结肠直肠癌的转移结节数量图； [58] 图 27是使用了本发明中药组合物的结肠直肠癌的转移结节数量图； [59] 图 28是未使用本发明中药组合物的胰腺癌的转移结节数量图；

[60] 图 29是使用了本发明中药组合物的胰腺癌的转移结节数量图；

[61] 图 30是 DME25抑制胰腺癌细胞转移动到腹膜的结节数量作用图； [62] 图 31是 DME25抑制胰腺癌细胞转移动到腹膜重量作用图；

[63] 图 32大肠癌模型（HT115 ) 腹膜结节的代表图像；

[64] 图 33体内 HT115细胞转移结节平均数，左侧图为在癌细胞播种前接收 DME257天的老鼠体内 HT115细胞转移结节平均数；右侧图为肿瘤细胞接种后接受治疗的的小鼠平均转移性结节；

[65] 图 34各组转移结节数的平均数；

[66] 图 35腹腔的癌细胞数量： .左图为肿瘤结节平均数,右图为每个组的结节总数量；

[67] 图 36来自腹膜腔癌细胞数量；

[68] 图 37 DME25对腹膜腔肿瘤细胞细胞周期进程的影响；

[69] 图 38对结肠腹膜模型浮动的癌细胞的流式细胞术分析代表图像；

[70] 图 39大肠癌模型腹腔内收集细胞 G0/G1期到 G2/ M期比值； [71] 图 40大肠癌模型经 DME25治疗后 G2 /M期与 G0/G1期的改变；

[72] 图 41流式细胞仪分析胃癌腹膜种植模型收集到漂浮癌细胞的代表图像，组 1: 对照组；组 2: 口服 DME25; 组 6: DME25腹腔给药；

[73] 图 42流式细胞仪分析胃癌（AGS)腹膜种植模型细胞周期经 DME25治疗后改变；

[74] 图 43肝脏组织形态学分析；

[75] 图 44无转移性结节的腹膜组织形态学分析；

[76] 图 45结肠癌腹膜转移结节组织形态；

[77] 图 46对照组和 DME25治疗组透明质酸和 CD44染色。

[78] 图 47 DME25对体外 HECV细胞微血管小管生成的作用。 HECV细胞位于基底膜夹层之间，以 HECV作为对照组（A)， FAK抑制剂干预组（25nM) (B)， DME25千预组（1:2000) (C)， FAK抑制剂和 DME25联合干预组（D)。置显微镜观察小管图像（A-D)，用数字图像分析技术量化长度（E)。 DME25 能够显著抑制小管形成并且和 FAK抑制剂之间存在协同作用。

[79] 图 48 DME25对体外内皮细胞生长的作用效果欠佳。用不同稀释浓度的 DME25处理细胞 72h。用结晶紫进行细胞计数。对 HECV细胞生长没有明显作用。

[80] 图 49 A: DME25剂量依赖性抑制 HECV细胞基质粘附， DME25被稀释从 1:40到 1:125,000 (A)。稀释低于 1 :25,000显示抑制作用。 B: 粘附的三维成像。左侧：空白对照。右侧： 1:1,000 稀释的 DME25 处理的细胞。 X 轴：频数。 Y轴：阻抗力。 Z轴：时间。 C和 D: 常规方法研究细胞基质粘附。 C: 龙胆紫染色粘附细胞成像。 D: 每高倍视野下粘附细胞数目。与空白对照组比较， * ρθ.01; 与单独 DME和单独 FAK抑制剂比较， # p<0.01。

[81] 图 50 DME25和细胞黏附之间浓度依赖关系（A)与 FAK途径的依赖性 (B)。所示数据来源于 Rb模型。

[82] 图 51 DME25抑制作用及 FAK的作用。 DME25能够显著减少黏附，其作用在与 FAK抑制剂联用时被增强，图中所示迁移路径（A)和三维模型（B)。 i: 对照组； ii:FAK抑制剂干预细胞 (25nM)； iii: DME25干预细胞 (1:1000)； iv: ii和 iii联合干预。 X轴：频率； Y轴：阻抗力； Z轴：时间。

[83] 图 52 DME25对细胞迁移的抑制作用及 FAK的作用。 DME25能显著减少细胞迁移，其作用在与 FAK抑制剂联用时被增强，图中所示迁移路径（A) 和三维模型（B)。 i: 对照组； ii:FAK抑制剂干预细胞（25nM) ； iii: DME25 干预细胞（ 1 : 1000 ) ; iv : ii和 iii联合干预。 X轴：频率； Y轴：阻抗力； Z 轴：时间。 A图中的箭头提示电损伤诱导的时间点。

[84] 图 53 DME25抑制 HECV内皮细胞 FAK和 Paxillin的磷酸化。血清饥饿 2h后， DME25 ( 2种不同浓度， 1 : 1000和 1 :5000)、 FAK抑制剂（25nM) 或者二者的联合千预 HECV细胞 60min。在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离等量蛋白后，用 FAK和桩蛋白磷酸化特异性抗体对磷酸化 FAK和 Paxillin 进行探针检测。

[85] 图 54 HECV 细胞中粘附斑激酶（FAK ) 和 pFAK 免疫荧光染色。 20,000 HECV细胞分别加到空白培养基、 DME25 (1 : 1,000)、 FAK抑制剂以及二者联用中。 2小时后细胞被冲洗和固定，分别用抗 FAK和抗 pFAK抗体处理后，总 FAK (左侧）和 FAK磷酸化（右侧）被深染。通过 100ms照射后 FAK成像获得， 400ms照射后 pFAK成像获得。

[86] 图 55 DME25对 MCF-7 (上)， MG-63 (中）和 A549 cells (下）基质粘附得影响。浓度高于 1 : 125,000均有抑制作用。

[87] 图 56宽频检测 DME25抑制细胞粘附。 3D模式图证实提取物对细胞粘附的作用， X轴为频率； Y轴为电阻； Z轴为时间。

[88] 图 57 A549细胞 Rb模式数据。

[89] 图 58 DME25抑制 A549细胞迁移。

[90] 图 59 PI3K/AKT通路在 DME25诱导 DU-145细胞粘附中的作用。 A: 加入 Wortmannin对细胞粘附的影响。 B: AKT抑制和 DME25对细胞粘附的作用。

[91] 图 60 DME25 对 A549 细胞 AKT (Ser 473) 磷酸化的影响。 A: West-blot 检测 AKT (Ser 473) 磷酸化； B: ImageJ. Bar 图像分析 pAKT/GAPDH条带比率。

[92] 为了验证本发明中药组合物的效果，进行了以下实验- 具体实施方式

制备实施例 1 :

原料药配方为：黄芪 250g 女贞子 200g 人参 65g 灵芝 65g 莪术 132g

白术 64g 半枝莲 128g绞股蓝 256g 茯苓 65g 鸡内金 30g

蛇莓 128g 白英 128g 茵陈 128g 徐长卿 128g土鳖虫 20g

白花蛇舌草 128g

制备方法为-

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(2)、人参、女贞子，加 8倍量 70%乙醇回流提取 2次，第一次 3小时，第二次 2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用；

(3)、莪术、白术、徐长卿，合并提取挥发油，提油时间 8小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用；

(4)、土鳖虫、鸡内金，水洗， 60Ό烘干，与茯苓合并，粉碎成 100目粉，于 3 GY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用；

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤 (2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤 (3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加 9倍量水，加热煎煮 2次，每次 2小时，合并煎煮液，加入步骤 (2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度 1.20的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤 (5)所得干膏粉加入淀粉 134克，用 85%乙醇制粒；

(7)、将步骤 (3)中所得挥发油用 85%乙醇溶解，喷入步骤 (4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（6) 中所得的颗粒混匀，密闭半小时，装入 1000粒胶囊即得。

特别地，为方便实验进行，将本发明实施例 1所得的胶囊内容物 400mg，加入 DMSO lml, 常温下旋转 20转 /分， 12小时，转速 14000rpm离心 30分钟，取上清液，加入平衡盐溶液，滤过，在 405nm测光度吸收，稀释提取液至光度吸收 0.25，此样品称为 DME25 , 分装保存作为标准化的提取物，用于之后的生物活性及临床研究中。

[93] 制备实施例 2: 原料药配方为：

黄芪 140g 女贞子 250g 人参 40g 灵芝 85g 莪术 75g 白术 80g半枝莲 85g 绞股蓝 300g 茯苓 40g 鸡内金 35g 蛇莓 75g 白英 175g 茵陈 85g 徐长卿 175g土鳖虫 15g 白花蛇舌草 165g 制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(2)、人参、女贞子，加 6倍量 90%乙醇回流提取 4小时，提取液回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用；

(3)、莪术、白术、徐长卿合并,加 4倍量水提取挥发油，提油时间 10小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用；

(4)、土鳖虫、鸡内金，水洗， 60°C烘干，与茯苓合并，粉碎成 100目粉，于 3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用；

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤 (2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤 (3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加 7倍量水，加热煎煮 3次，第一次 1小时，第二次 2小时，第三次 3小时，合并煎煮液，加入步骤 (2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度 1.25的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤 (5)所得干膏粉加入淀粉 112克，用 78%乙醇制粒；

(7)、将步骤 (3)中所得挥发油用 85%乙醇溶解，喷入步骤 (4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（6) 中所得的颗粒混匀，按常规制剂方法制成 1000片片剂。

[94] 制备实施例 3 : 原料药配方为- 黄芪 300g 女贞子 150g 人参 90g 灵芝 40g 莪术 180g 白术 40g半枝莲 180g 绞股蓝 150g 茯苓 80g 鸡内金 20g 蛇莓 175g 白英 85g 茵陈 175g 徐长卿 75g土鳖虫 25g 白花蛇舌草 95g 制备方法为: (1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选;

(2)、人参、女贞子，加 10倍量 50%乙醇回流提取 2次，第一次 3小时，第二次 2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用；

(3)、莪术、白术、徐长卿合并，加入 8倍量水提取挥发油，提油时间 6小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用；

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤 (2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤 (3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加 10倍量水，加热煎煮 3小时，合并煎煮液，加入步骤 (2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度 1.20的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤 (3)中所得挥发油用 80%乙醇溶解，喷入步骤 (4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（5 ) 中所得的干膏粉，按常规制剂方法制成 1000丸丸剂。

[95] 制备实施例 4: 原料药配方为- 黄芪 280g 女贞子 180g 人参 80g 灵芝 40g 莪术 160g 白术 50g半枝莲 100g 绞股蓝 180g 茯苓 70g 鸡内金 25g 蛇莓 145g 白英 95g 茵陈 175g 徐长卿 75g土鳖虫 20g 白花蛇舌草 115g 制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(2)、人参、女贞子，加 8倍量 50%乙醇回流提取 2次，第一次 3小时，第二次 2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用；

(3)、莪术、白术、徐长卿合并，加入 7倍量水提取挥发油，提油时间 6小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用； (4)、土鳖虫、鸡内金，水洗， 60°C烘干，与茯苓合并，粉碎成 100目粉，于 3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用；

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤 (2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤 (3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加 9倍量水，加热煎煮 3小时，合并煎煮液，加入步骤 (2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度 1.20的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤 (3)中所得挥发油用 80%乙醇溶解，喷入步骤 (4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混勾，与步骤（5 ) 中所得的干膏粉，按常规制剂方法制成散剂。

[96] 制备实施例 5 : 原料药配方为：

黄芪 300g 女贞子 200g 人参 70g 灵芝 70g 莪术 100g 白术 60g半枝莲 140g 绞股蓝 180g 茯苓 60g 鸡内金 28g

蛇莓 155g 白英 95g 茵陈 1675g 徐长卿 95g土鳖虫 20g 白花蛇舌草 105g 制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(3)、莪术、白术、徐长卿合并，加入 4倍量水提取挥发油，提油时间 6小时，挥发油另器收集，残渣及水溶液备用；

(4)、土鳖虫、鸡内金，水洗， 60Ό烘干，与茯苓合并，粉碎成 100目粉，于 3KGY⁶⁰CO-r辐射灭菌后备用；

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤 (2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤 (3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加 10倍量水，加热煎煮 3小时，合并煎煮液，加入步骤 (2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度 1.20的清膏，干燥，粉碎，备用； (6)、将步骤 (3)中所得挥发油用 80%乙醇溶解，喷入步骤 (4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（5 ) 中所得的干膏粉，按常规制剂方法制成注射剂。

[97] 制备实施例 6: 原料药配方为- 黄芪 150g 女贞子 170g 人参 80g 灵芝 40g 莪术 150g 白术 60g半枝莲 120g 绞股蓝 180g 茯苓 60g 鸡内金 25g 蛇莓 145g 白英 95g 茵陈 135g 徐长卿 85g 土鳖虫 25g 白花蛇舌草 95g 制备方法为：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(2)、人参、女贞子，加 7倍量 50%乙醇回流提取 2次，第一次 3小时，第二次 2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，人参、女贞子残渣备用；

(5) , 黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤 (2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤 (3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后的残渣及水溶液合并，加 10倍量水，加热煎煮 3小时，合并煎煮液，加入歩骤 (2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成相对密度 1.20的清膏，干燥，粉碎，备用；

(6)、将步骤 (3)中所得挥发油用 80%乙醇溶解，喷入步骤 (4)中所得茯苓、土鳖虫、鸡内金的细粉中，混匀，与步骤（5 ) 中所得的干膏粉，按常规制剂方法制成栓剂。

实验例 1 DME25对于肿瘤-间皮相互作用之影响的研究

[98] 抑制剂：透明质酸抑制剂购自剑桥生物科学 (英国剑桥生物公司，英国）。 FAK抑制剂， PF573228 , 肝细胞生长因子受体抑制剂 (PHA665752), AuroraB 抑制剂 ZM447439, cS C抑制剂 AZM-475271均购自于 Tocris生化药剂（布里斯托尔，英国）。 ERK抑制剂 (FR180204)和 JNK抑制剂 (Inhibitor-I)购自于英国默克公司（密理博，英国）。

[99] 抗体： CD44抗人类抗体来自 RnD欧洲（牛津，英国）和抗体在线。人单克隆 SRC抗体、 phospho-SRC、 phospho-FAK, 人 Ezri phospho-Ezrin、 phospho-Paxillin, GAPDH和多克隆抗体 Radixin、人整合蛋白 -α5β1全都来自于 Santa Cruz生物技术（Santa Cmz，加州，美国）。用于流式细胞仪分析的抗膜联蛋白 -V抗体来自于 Santa Cruz生物技术有限公司。单克隆抗人 FAK 抗体和抗人 Paxillin抗体皆来自于信号转导实验室 (Lexinton, 美国）。羊多克隆抗透明质酸抗体来自于 ABD Serotec有限公司（牛津，英格兰，英国）。

[100] 特殊化学品和培养基

[101] 高分子量透明质酸购自西格玛-奥德里奇（普尔，多塞特，英国）。 Dil ((2Z)-2- [(E)-3-(3 ,3 -dimethyl- 1 -octadecylindol- 1 -ium-2-yl)prop-2enylidene]-3,3- dimethyl- 1 -octadecylindole; perchlorate)购自于分子探针公司（俄勒冈州，美国）。五氟脲嘧啶（5-FU)、青蒿素及 Hoescht 33258购自于西格玛 -奥德里奇。 Ficoll-Hypaque来自 GE电气医疗集团。 16-well and 8-well Chamber slides常规免疫荧光购自于 Nunc, 共聚焦显微镜来自于西格玛 -奥德里奇。 ECIS阵列 ( 96W1E) 来自于应用生物物理学（新泽西，美国）。

[102] 其他试剂和化学物质来自下面的来源:

试剂供应商

胎牛血清 (FCS) 西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

醋酸费舍尔科学，莱斯特，英国

丙酮费舍尔科学,莱斯特，英国

丙烯酰胺混合物 (30%) 西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

琼脂糖实验室有限公司试点，萨福克郡,英国

过硫酸铵西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国

两性霉素 B 西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国

蛋白定量试剂盒 bio rad实验室、海克斯、 CA、美国

硼酸 Duchefa生物,哈勒姆，荷兰

溴酚蓝西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国

氯化钙西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国氯仿西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

Chemiluminiscence工具包通用电气医疗集团、卡迪夫、英国考马斯蓝西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国结晶紫西格玛奥德里奇公司，普尔，多塞特,英国

DAB色原向量实验室公司，伯林盖姆、钙、美国焦碳酸二乙酯西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国二甲基亚砜 Fisons科学设备、拉夫堡、英国

DEME培养基西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

DEME缓冲液西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

EDTA (乙二胺四乙酸） Duchefa生物,哈勒姆，荷兰乙醇费舍尔科学，莱斯特，英国

溴化乙锭西格玛奥德里奇公司，普尔，多塞特,英国荧光介质 CalBiochem,诺丁汉，英国

甲醛西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

Propidium碘染色溶液西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国甘氨酸实验室有限公司试点，萨福克郡,英国甘油西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国盐酸西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国马血清西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国异丙醇西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国氯化钾 Fisons科学设备、拉夫堡、英国磷酸二氢钾 BDH化学品有限公司,普尔，英格兰，英国

Mayers Htx 西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国甲醇费舍尔科学,莱斯特，英国

半脱脂牛奶特易购、卡迪夫、英国

氯化钠西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国磷酸二氢钠 BDH化工有限公司，英国多塞特郡普尔叠氮化钠西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

氢氧化钠西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

硝酸纤维素膜 Ammersham、卡迪夫、英国

青霉素西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

RMPI1640培养基西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

SDS培养液实验室有限公司试点，萨福克郡，英国

Serum bovine albumin 西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

链霉素西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

SupersignalTM西硬脑膜系统皮尔斯生物技术公司，罗克福德, IL,美国

TBS自动化清洗缓冲影响医疗、康科、 CA、美国

四甲基乙二胺 (TEMED) 西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

TRI试剂西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

Tris-Cl 实验室有限公司试点，萨福克郡,英国

Triton 西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

胰蛋白酶西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

Triton XI 00 西格玛奧德里奇公司,普尔，多塞特，英国

吐温 20 实验室有限公司试点，萨福克郡,英国

Propidium碘染色溶液西格玛奥德里奇公司，普尔,多塞特，英国

TRITC共轭抗鼠抗体西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

TRITC共轭抗山羊抗体西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

牛血清白蛋白共轭抗鼠抗体西格玛奥德里奇公司，普尔，多塞特,英国

牛血清白蛋白共轭抗羊抗体西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

HRP共轭抗山羊抗体西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

HRP共轭抗鼠抗体西格玛奥德里奇公司,普尔,多塞特，英国

HRP共轭抗兔抗体西格玛奥德里奇公司,普尔，多塞特，英国

人原代腹膜间皮细胞的主要准备工作

[103] 正常大网膜组织，征得患者同意和伦理委员会批准后，由结直肠手术后收集。通过连续酶制备的方法提取并纯化腹膜间皮细胞。细胞培养系是

RPMI介质，包括 10% FCS、氢化可的松、胰岛素和抗生素。净化间皮细胞使用 8通道。

[104] 研究应用的另一种人类腹膜间皮的细胞是细胞株 LP9，购自美国的老年病研究所。

[105] 本发明的中药提取物，如制备实施例 1中制备的 DME25。 DME25通过使用分光光度计在 405nm波长时量化制剂的光密度使其标准化。不同批次的 DME25通过化学指纹图谱使其一致。在使用前都存储在- 20摄氏度。实验之前，相同数量的 BSS (平衡盐溶液，由 79.5克氯化钠, 2.2 g氯化钾 ,2.1 g和 1.1 g Na₂HP0₄ KH₂P0₄,在 10 1 DD水和 pH值为 7.2 -7.4)作为初始溶液，加入到 DME25的干粉末中，即 5毫升无菌 BSS被添加到提取物冻干粉中，得到一瓶 5毫升的溶液。 10分钟混匀，准备用于实验。

[106] 肿瘤 -间皮的影响

[107] 将腹膜间皮的细胞,或人类腹膜间皮的细胞株 LP9，分配到 96孔板，约 5000细胞 /孔。在孵化器内混合过夜。

[108] 癌症细胞用 Dil(l(^g /毫升 40分钟, 10毫克 /毫升 DMSO)进行荧光染色料，。洗掉多余 Dil,这些细胞被添加到间皮的单层，（含有介质,不同浓度 DME25,各种抑制剂和组合 DME25和抑制剂）， 40分钟。游离的癌细胞使用无菌缓冲溶液 BSS轻轻地洗掉，剩余的附于间皮细胞的癌细胞用 4%福尔马林固定一个小时。附着的细胞的数量是在荧光显微镜下数出（奥林巴斯 DMB)。照片拍摄使用数码相机 (滨松、日本)。每张图片由一个亮视野和一个荧光图像（来自相同的视野）组成。数出癌细胞数量。

[109] 细胞生长试验

[110] 将肿瘤细胞和原代腹膜间皮细胞接种到 96 孔板。向细胞中添加 DME25提取物进行测试。将细胞在 37摄氏度 5%二氧化碳培养 72小时,然后固定于 4%(v / v)福尔马林和 l%(w / v)结晶紫。洗后，染料被 10%(v / v)乙酸提取。经过仔细混合，使用滤波器与波长在 540nm吸光度读出 96孔板的数值。

[1 11] 电子细胞基质阻抗判断分析肿瘤间皮的和肿瘤透明质酸反应

[1 12] 96 wle +复合 ECIS (应用生物物理学,特洛伊，新泽西,美国）首先被腹膜间皮的细胞株 (LP9)或腹膜间皮的细胞经隔夜完全覆盖。对于肿瘤透明质酸的研究，高分子量透明质酸,稀释在无菌水中，添加到 96孔板，数量在 10μ_§ / 孔。允许空气干燥和随后水化。癌症细胞被添加到各自的孔，连同测试试剂包括小抑制剂和提取物。接下来使用 ECIS，并用相关软件分析，然后提供细胞粘附痕迹的 3 d模型。

[1 13] 免疫荧光分析和共焦显微镜

[114] 人类腹膜间皮的细胞被种到 16孔板 (常规 IFC)和 8孔板 (用于共焦显微镜)，过夜。洗掉多余的 Dil洗液后，癌症细胞被添加到间皮的细胞单层。对于双重组织细胞免疫荧光染色，癌症细胞被直接添加到间皮的细胞结合测试。 40分钟后，细胞用福尔马林固定，在短暂的洗涤后，细胞被 0.1%Triton渗透， X100 5分钟，然后冲洗。这些细胞被 TBS缓冲 (TBS由 12.1 gTri和 40克氯化钠 5升蒸馏水组成 ,ρΗ值调整到 7.4。）与 1%马血清混合 1小时,然后添加稀释在 TBS缓冲液的 0.3%马血清。

[1 15] 对于双重免疫荧光染色法，不同物种的抗体添加在 TBS缓冲液 0.1% 稀释马血清添加。双重染色包括 CD44/Ezrin， FAK/integrin, paxillin/integrin, SRC/ezrin。对于单一的蛋白质染色,我们使用前面给出的方法用 Dil预标记癌细胞。切片用 BSS 清洗之后再添加各自的二抗与适当的荧光标记。洗后,切片使用 FluoSave 常规荧光显微镜拍摄 (奥林巴斯英国,英国绍森德在海上,英国）。共焦显微镜载玻片,切片上添加 50% glyceral, 于共焦显微镜检査。于 FluoView FVlOi确定适用范围内检查。

[1 16] 双彩色扫描,即牛血清白蛋白 / TRITC或牛血清白蛋白 / Dil,加上相衬图片，同时采取使用 z-stack功能。图像合成为 2 d和 3 d分析。

[117] 免疫印迹

[1 18] 细胞在组织培养瓶中培养。无血清培养基添加到细胞中，保持 2小时血清饥饿,在测试之前将材料及其组合添加到细胞。 40分钟后,细胞被吸附。离心后收集细胞。提取液（由以下构成：抑制 Triton-X100,2mM-1.5%氯化钙 ,1 毫克 /毫升, 1 毫克 /毫升亮抑酶肽抑肽酶和 10毫米原钒酸钠)被添加到细胞颗粒。加到超声发生器 5分钟， 4摄氏度。通过离心分离不溶物在 13000 rpm, 样本添加加样缓冲然后在 100度煮开 5分钟。等量的蛋白质被加载到 8% sds - page。在印迹蛋白质在硝化纤维在半干压滤,脱脂牛奶 (1小时有 10%半脱脂牛奶)，加上初级抗体 (稀释在 TBS缓冲区包含 0.1% Tween20)包被,洗掉后加入过氧化物酶共轭二抗。蛋白质使用了一个数码成像仪成像。

[1 19] 体内腹膜转移模型的建立

[120] 无胸腺的雌性裸鼠, 4-6周龄，从查尔斯河实验室采购和在过滤器笼子饲养。所有的实验过程进行了二级无菌操作。老鼠接受后一个星期幵始实验。目前的研究己经测试了三个腹膜转移模型，即 AGS人类胃癌细胞株的胃癌模型，人类大肠癌细胞 HT115的结直肠癌模型， ASPC1胰腺癌模型。

[121] 所有的癌症细胞从组织培养瓶满之前恢复并培养。数以五百万计的肿瘤细胞在一个体积为 0.5毫升无菌 BSS缓冲液中被注入到腹膜腔。老鼠被随机分为测试组别。实验前，所有的材料都准备好。然后盲目编码。随后的测试，从编码的测试材料注射到动物组编码都基于盲法基础上。代码在实验完成后被打乱。

[122] 注射癌细胞置于组织培养瓶，注射溶剂包含 DME25、 CSRC抑制剂、 5-FU (作为控制剂使用）、或者为以上药物的混合物。另有组别比较口服与腹腔内注射的不同疗效。每天监测小鼠观察任何可能的副作用（即体重减低、饮食、饮酒习惯和呼吸窘迫)。

[123] 三周后，小鼠癌症晚期。收集腹水。受污染的红细胞被添加 DD水以造成细胞溶解 (1份细胞悬液到 4份 DD水， 30秒)离心后去除上清。细胞颗粒缓冲后，被 4%福尔马林固定。细胞凋亡和细胞周期随后使用流式分析仪数出数目并测出。

[124] 打开腹腔,暴露腹壁、内脏表面、网膜，置于配有 LED照明灯解剖显微镜下检査,以确定所有的转移性结节。这一步是由三个人操作，以便达到公正的计数。计算每只老鼠转移焦点的数量。使用数码相机拍摄的彩色转移焦点。每个转移焦点的大小被量化，如果可能的话,使用一个图像分析工具根据累积体积计算。显示每组平均数量和焦点转移性结节的总数。

[125] 组织学和免疫荧光分析

[126] 体内研究最后得到的肿瘤结节储存在 -80摄氏度直到使用。被冻结的组织切片厚度 8 urn,使用低温恒温器。固定后，切片被风干处理和 H&E染色。对免疫荧光染色，冻结部分首先在 TBE缓冲溶液中缓冲，于 1%马血清中放置一小时。初级抗体在 0.1%马血清 TBE缓冲液稀释一小时,清洗后，添加二级抗体，一个多小时。 Hoescht 33258用作胞核染色剂。进行双重染色: CD44(鼠标) /HA(羊）, CD44(鼠标) / Ezrin (山羊), SRC (兔) / pEzrin (鼠标）。

[127] 通过流式细胞术分析细胞周期和凋亡

[128] 所有的细胞都来源于腹腔。用 4%福尔马林固定。细胞被 PBS冲洗后，在 1 X膜联蛋白绑定缓冲再悬浮，离心。 5μ1膜联蛋白 V和 Ιμΐ的牛血清白蛋白被添加到 ΙΟΟμΙ的细胞悬液。孵化后置于室温下 15分钟, 400μ1 1 χ膜联蛋白-缓冲,混合保存。固定后，细胞悬液的添加 propidium染色，加入孵化核糖核酸酶在 4°C 3小时，随机使用流式细胞分析仪和 FlowMax软件包分析。细胞周期是如图所示的比例 G1 ,G2 I M S和阶段。

[129] 统计分析

[130] 使用 SigmaPlot进行分析 (版本 l l )(Systat软件有限公司， Hounslow、伦敦、英国）。测试正态分布和 t检验,用 ANNO VA测试。对偏离的数据用曼惠特尼 U测试和 ANNOVA进行了测试。

[131 ] 结果

[132] 本发明药物抑制癌细胞-间皮细胞的相互作用

[ 133] 我们首先检验 DME25是否对癌细胞和间皮细胞之间的相互作用造成影响。在此，我们使用腹膜间皮原代细胞，通过图 1 -4，我们可以明显看出 DME25显著减少了粘着的癌细胞数量。表 1显示了间皮单层细胞上粘着的癌细胞的量化结果。

[134] 图 1是未使用 DME25的人类肠癌细胞（HT115 ) , 图 2是使用 DME25 的人类肠癌细胞（HT1 15 ) , 图 3是未使用 DME25的卵巢癌细胞（SKOV3 ) , 图 4是使用 DME25的卵巢癌细胞（SKOV3 )。背景单层细胞是间皮细胞，表 1 -癌细胞和腹膜间皮原代细胞之间的相互作用。表明了间皮细胞上的粘着癌细胞的数量。

表 1

[135] 癌细胞更多地粘附于透明质酸基质表面， DME25可以阻断癌细胞在透明质酸基质表面的粘连。

[136] 透明质酸（ΗΑ )蛋白层是紧密地附着在间皮细胞表面的一层蛋白。为了研究癌细胞是如何粘附与透明质酸上的，我们用透明质酸覆盖细胞培养皿，并且调整 ECIS方法实时追踪细胞 -基质之间的粘附。癌细胞粘附到透明质酸上比在用塑性表面处理的细胞培养基上要更加迅速。 DME25对粘附在透明质酸和用塑性表面处理的细胞培养基上的癌细胞都具有显著效果， HT1 15 和 SKOV3对 DME25更敏感。如图 5-7中所示， DME25对癌细胞粘着透明质酸（HA) 涂层或非涂层表面（对照组）的作用。与非 HA涂层表面相比，癌细胞更快地粘着于 HA涂层的表面上。

[137] DME25(在 1 : 1000的浓度下的情况，并且在 1000Hz条件下)对抑制癌细胞的粘着有显著效果。

[138] HA抑制剂抑制肿瘤 -间皮的相互作用，与本发明药物一起使用有累加效应

[139] 我们进一步探讨了透明质酸酶抑制剂（HAi) 是如何影响癌细胞 -间皮细胞和以及癌细胞 -HA 之间相互作用以及在这些过程中抑制剂是如何与 DME25联合作用的。图 8、 9显示的是癌细胞粘着于间皮细胞的数量，显示了透明质酸酶抑制剂和 DME25组合的作用。 HA抑制剂和 DME25均对相互作用有显著影响。二者的组合具有更加显著的效果，图 8是 DME25和透明质酸酶抑制剂对 AGS胃癌细胞的作用；图 9是 DME25和透明质酸酶抑制剂对结直肠癌细胞的作用。图 10是 HAi和 DME25对 SKOV3和透明质酸涂层表面之间粘附的影响；图 11 HAi和 DME25对 HT115和透明质酸涂层表面之间粘附的影响。

[140] FAK 抑制剂抑制癌细胞-间皮细胞的相互作用，与本发明药物一起使用效果更好。

[141] 整合素类在将癌细胞锁定到间皮细胞表面时发挥重要的作用。 DME25 能够抑制 FAK在内皮细胞和癌细胞中的活性。在此，我们进一步测验 FAK 抑制剂和 DME25是否可以干预癌细胞-间皮细胞之间的相互作用。

[142] 如图 12所示， DME25和 FAKi对 AGS癌细胞-间皮细胞相互作用较明显，并且二者的组合进一步加强了这种抑制作用。图 13显示，尽管 DME25 和 FAKi分别对 HT115有明显的抑制效应，但是二者的组合并没有产生更大的效果。根据图 14，用于 SKOV3细胞的 HT115也出现了类似的观察结果。

[143] 当对癌细胞 -HA之间的相互作用进行测验时，我们发现在 HA涂层表面， HT115和 SKOV3细胞与 FAK抑制剂和 DME25反应良好，并且二者的组合带来更好的抑制效果。 AGS细胞与 FAK抑制剂和 DME25反应均较弱。这些也显示在用 ECIS方法的三维图中，见图 15，

[144] DME25抑制腹膜间皮细胞迁移，图 16所示。

[145] 本发明中药组合物在 HA与 c-SRC通路相关的影响 [146] 探讨 cSRC激酶通路在 DME25介导透明质酸抑制肿瘤相互作用的作用，肿瘤和间质细胞之间的联系需要透明质酸的参与，即肿瘤细胞和间皮细胞将利用细胞表面蛋白质、 CD44来与透明质酸 (HA)发生相互影响。 CD44是跨膜蛋白，变形连接到 ERM家族（埃兹蛋白-根蛋白 -膜突蛋白），并通过 ERM家族连接到细胞骨架， CD44和 ERM蛋白之间的相互作用是与 cSRC通路密切相关的， cSRC通路是一个和粘附、迁移和入侵的癌症细胞有关的重要信号通路。

[147] 我们首先测试和 cSRC抑制剂的相互作用。 cSRC抑制剂所使用的浓度远低于 IC50(0.5-luM)，即为 ΙΟΟηΜ, 避免巨大的细胞毒性。如图 17。由于低浓度，在 lOOnM cSRC抑制剂对肿瘤 HA没有明显效果。然而，在肿瘤 HA 相互作用中， cSRC抑制剂 (上 -D)显著增强 DME25抑制作用（图 17上， C)。值得观注的是 cSRC抑制剂在非 HA涂层培养表面对 DME25没有效果。

[148] 值得注意的是 cSRC抑制剂也增加了 HA抑制剂和抗 CD44的抑制效果，但不是 FAK抑制剂对肿瘤 HA的相互作用，如图 18。 HA抑制剂 (上)和抗 CD44(中)介导的抑制是由 cSRC抑制剂加强，但不是通过 FAK抑制剂介导的 (下；)。

[149] 在胰腺癌细胞, ASPC1和 MIA PA CA2上可看到同样地情况（图 19)。

[150] 同样， DME25和 cSRC抑制剂也能抑制胰腺癌细胞和间皮细胞间的相互作用（图 20)。

[151] DME25对 cSRC和 Ezrin蛋白磷酸化有抑制作用。如图 21， DME抑制 cSRC和 Ezrin蛋白磷酸化。同样， HA抑制剂抑制 Ezrin蛋白的磷酸化，但对它的影响很小。

[152] DME25对 CD44、 Ezrin,、 cSRC和 phospho-SRC细胞定位有显著效果。虽然对 Ezrin效果不明显，但 DME可显著影响总的 cSRC和 phospho-SRC的细胞内定位。（图 22， 23)。

[153] 图 24和 25显示的是 CD44染色的结肠癌细胞 (红色)和原代培养的腹膜间皮细胞之间的相互作用。在原代培养腹膜间皮细胞（MES0998 ) 中加入刺激胰腺癌细胞 ASPC-1后 CD44的染色。在对照组中，间皮细胞呈尖峰或膜褶皱，接触到癌细胞（由白色箭头指示），细胞结构富含 CD44染色。然而，在 DME25处理过的细胞，间皮细胞出现较小高低不平或更少的膜皱褶。

[154] 本发明中药组合物体内抑制癌细胞的腹膜扩散

[155] 我们使用体内模型进一步测验了 DME25对来自结直肠癌和胰脏癌的腹膜转移的抑制作用。每日腹腔注射 DME25能显著降低腹腔中 HT115结肠直肠癌细胞转移结节数。

[156] 图 26 是未使用本发明中药组合物的结肠直肠癌的转移结节数量，图 27是使用了本发明中药组合物的结肠直肠癌的转移结节数量，可以看出，转移结节明显减少；图 28 是未使用本发明药物的胰腺癌的转移结节数量，图 29是使用了本发明药物的胰腺癌的转移结节数量，每天腹腔注射 DME25明显减少了癌细胞在腹腔中的转移结节的数量。

[157] 如图 30、 31所示，同样， DME25也降低了来自 PANC1细胞的转移性肿瘤的重量，这样将逐渐形成较少的结节数量。转移性胰腺癌的体积被 DME25减小。在胰腺癌模型中，我们也测验了 HA抑制剂（HAi) 对转移性肿瘤形成的影响。 HA抑制剂对腹膜转移有明显效果，当与 DME25共同注射时效果更加明显。

[158] 为了评估 DME25试验动物给药，播种癌细胞前，裸鼠首先接受了 7 天的口服 DME25。 7天后进行腹腔注射癌细胞注射。如图 32、 33、 34和表 2 (结肠直肠腹膜信息研究汇总）所示，在大肠癌模型中，预治疗带来提供额外的效果。

表 2

[159] 对腹膜转移和一个胃癌模型预处理的应用, DME25 腹腔内治疗比口服治疗有较强作用

[160] 如图 35所示,在胃癌细胞 (AGS)种植前预处理 7天对结节形成提供了一些切实的好处。此外，腹腔内治疗似乎比口服治疗更有效。表明在研究终末期，口服和腹腔内治疗显著降低了来自腹腔的癌细胞数量。腹膜腔自由浮动的癌细胞数量减少如（图 36)所示。

[161] 采用 DME25和化疗相结合的腹腔内治疗对结肠癌有加强作用

[162] 我们比较 DME25、 5-FU以及它们的联合应用效果。见图 37，用 5-FU 腹腔注射对继发性结节形成有重要作用，虽然这种差异与单独给药时没有统计学区别，但 DME25和 5-FU的联合应用有一个加强的抑制作用，

[163] 为了进一步评估 DME25体内作用,我们从腹腔内获取浮动癌细胞和分析它们的细胞周期分布 (图 38-42)。

[164] 此外,已经证明,转移性结节的数量与 G2 / M期的细胞具有显著相关性 (表 3)。转移性结节数量和 (GO + G1)/(G2 I M)比率也有显著负相关 (表 3)。表 3腹腔转移性结节细胞周期（AGS细胞）之间的相关性

[165] DME25肝脏和小肠组织学没有影响

[166] 肝组织形态学评估。正如图 43所示，肝组织未出现明显形态学改变，同样地，没有出现转移结节的腹膜表面也没有显著的变化（图 44 )。

[167] DME25显著提高与转移性结节相关腹膜的强度和完整性。

[168] 正如图 45中所示，当形成转移结节，腹膜表面被认为不完整。然而，当运用 DME25对小鼠进行治疗后，腹膜层强度增加（较厚），腹膜间皮细胞被覆在腹膜上很好的包绕在肿瘤周围（图 45中的下图）。当进一步对腹膜透明质酸进行研究发现， DME25治疗的小鼠腹膜透明质酸很明显更丰富。此外， DME25治疗组间皮细胞数量同样增加（图 46 )。图 46中所示的是各组的肿瘤和腹膜表面。对照组腹膜薄弱并中断。而 DME25 组具有一个增厚并健康的腹膜表面。

[169] 实 MJ_本发明中药组合物抑制癌细胞向腹膜转移的临床试验

[170] 为阐明本发明中药组合物抑制癌细胞向腹膜转移的活性，用按实施例 1方法制得的胶囊（以下称本发明药物）进行了下列临床试验。

[171] 1、临床资料 [172] 一般资料 102例患者均为河北以岭医院住院病例，随机分为治疗组和对照组，治疗组 53 例，年龄 41 -77岁，平均（67.6士3.3 ) 岁，其中胃癌 15 例，肝癌 10例，肺癌 12例，食管癌 17例，就诊时均已经进行了相应的手术治疗，化疗次数均在 1 次以内，并且未出现远端转移，对照组 49例，年龄 40-76岁，平均（67.3±2.7 ) 岁，胃癌 14例，肝癌 10例，肺癌 10例，食管癌 15例，就诊时均已经进行了相应的手术治疗，化疗次数均在 1次以内，并且未出现远端转移，两组在年龄、病情、病程等方面无显著性差异（P>0.05 )，具有可比性。

[173] 2、治疗方法

[174] 2.1 对照组按照常规化疗，出现相应并发症状时按照常规对症治疗，临床观察两年。

[175] 2.2治疗组在对照组的基础上加服本发明药物，一次 4粒，一日 3次，临床观察两年。

[176] 2.3观察指标

[177] 主要观察远端转移的情况，一旦发生远端转移，即进行相应治疗。

[178] 2.4统计方法计数资料用 χ2检验，计量资料用 t检验。

[179] 3、疗效观察

[180] 根据相应检查结果确定是否发生远端转移，根据转移部位进行统计，分为肝脏转移，腹膜转移，肺部转移，其它部位转移；转移部位不包括原位肿瘤；同时观察两组患者的平均手术结束至发生转移时间周期。

[181] 4、治疗结果：两组肿瘤转移发生情况见表 4-7。

两组肿瘤患者肝脏转移情况比较

组别例数肝脏转移转移时间（月）

治疗组 43 10 (23.3%) * 16.8±3.8*

对照组 39 13 (33.3%) 12.5±2.3

注： *与对照组比较 P<0.05 表 5 两组肿瘤患者腹膜转移情况比较

组别 « 胰膜转移转移时间（月) ~

治疗组 53 5 ( 9.4% ) * 2€.8±3..2*

对照组 49 17 ( 34.7%) 10.5±2.5

ΪΞ = *与对照组比较 Ρ<0.05 表 6 两组肿瘤患者肺部转移情况比较

β 肺部转移转移时间（月) ^

ΐ台疗组 41 10 (24.4%) * 17.8±3.2*

对照组 39 14 ( 35.9%) 12.1士 2.5

注： *与对照组比较 Ρ<ΰ.05

表 7 两组肿瘤患者其它部位转移情况比较

组别 l 其他部位转移 ~~转移时间（月）

治疗组 53 12 ( 22-6%) * 16.8±3.2*

对照组 49 16 ( 32.7%) 12.7i2.5

ΐ± = *与对照组比较 Ρ<0.05

[182] 由以上结果可以看出，治疗组各种远端转移的发生率均显著低于对照组，并且转移发生的时间周期也显著长于对照组。

[183] 并且治疗恶性组肿瘤向腹膜转移的发生率显著低于肺部转移、肝脏转移以及其他部位的转移，发生率仅为肺部转移、肝脏转移以及其他部位的转移等其它方向转移的一半左右，而对照组腹膜转移的发生率和肺部转移、肝脏转移以及其他部位的转移等其它部位转移的发生率则没有显著差异。

[184] 5、结论：由以上临床观察可以得出，本发明药物可以显著抑制癌细胞的远端转移；并且本发明药物对于癌细胞向腹膜转移的抑制效果尤为明显，明显优于对照组的效果。

[185] 实验例 3 本发明中药组合物抑制癌细胞向腹膜转移的临床试验

[186] 为了说明本发明的药物组合物治疗癌细胞转移的效果，用按实施例 1 方法制得的胶囊（以下称本发明药物）进行了下列临床试验。

[187] 1、临床资料

[188] 100 例患者均为河北以岭医院住院病患，随机分为治疗组和对照组，治疗组 50例，年龄在 45-77岁，平均（65.6±3.3 ) 岁，其中胰腺癌 12例，卵巢癌 13例，结肠癌 11例，直肠癌 14例，就诊时均已进行相应的手术治疗，一直在进行化疗，已经出现远端转移，转移到腹膜的病例为 20 例，转移到肝肺等其他部位的病例为 30例；对照组 50例，胰腺癌 13例，卵巢癌 13例，结肠癌 12例，直肠癌 12例，就诊时均已进行相应的手术治疗，在进行化疗，已经出现远端转移，转移到腹膜的病例为 22 例，转移到肝肺等其他部位的病例为 28例；两组在年龄、病情、病程等方面无显著性差异（P>0.05 )，具有可比性。

[189] 2、治疗方法

[190] 2.1 对照组按照常规化疗，出现相应并发症状时按照常规对症治疗，临床观察两年。

[191] 2.2治疗组在对照组的基础上加服本发明药物，一次 4粒，一日 3次，临床观察两年。

[192] 2.3观察指标

[193] 主要观察对癌细胞远端转移的治疗情况。

[194] 2.4统计方法计数资料用 χ2检验，计量资料用 t检验。

[195] 3、疗效观察

[196] 3.1疗效标准

[197] 根据相应检査结果确定转移部位病程有所缓解。

[198] 4、治疗结果：两组肿瘤转移发生情况见表 8-9。

表 8 两组肿瘤患者旗膜转移治疗情况比较

组别例数有效率治疗时间（月）

治疗组 20 12 ( 60%) * 10.8±3.1*

对照组 22 6 (27,3%) 20.5±2,8

注： *与对照组比较 P<0.05

表 9 两组肿瘤患者不同转移部位治疗情况比较

组别 A籠 B例数 A有效率 B有效率

治疗组 30 20 46% 60%

对照组 28 22 28.6% 27,3%

[199] 其中， A为其他部位癌细胞转移部位， B为腹膜转移，从上表可以看出治疗组的效果优于对照组，说明本发明药物可以有效治疗癌细胞的转移，尤其是对腹膜转移的效果尤为佳，对照组的临床有效率差别不大，但是治疗组的腹膜转移的治疗效果好于其他部位的治疗效果。

[200] 实验例 4 手术中使用本发明中药组合物冲洗腹膜的临床试验

[201] 为阐明手术中使用本发明中药组合物冲洗腹膜的效果，用按实施例 1 方法制得的胶囊（以下称本发明药物）进行了下列临床试验。

[202] 1、临床资料

[203] 50例患者均为河北以岭医院住院病例，随机分为治疗组和对照组，治疗组 25例，年龄 41 -77岁，平均（61.6±3.3 ) 岁，其中宫颈癌 8例，前列腺癌 9例，膀胱癌 8例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移；对照组 25 例，年龄 40-76岁，平均（67.3±2.7 ) 岁，其中宫颈癌 9例，前列腺癌 8例，膀胱癌 8例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移，两组在年龄、病情、病程等方面无显著性差异（P>0.05 )，具有可比性。

[204] 2、治疗方法

[205] 2.1对照组手术 +术中腹腔灌洗，临床观察两年。

[206] 2.2治疗组手术 +本发明药物冲洗，临床观察两年。

[207] 2.3观察指标

[208] 主要观察远端转移的情况，一旦发生远端转移，即进行相应治疗。

[209] 2.4统计方法计数资料用 χ2检验，计量资料用 t检验。

[210] 3、疗效观察

[21 1] 根据相应检査结果确定是否发生远端转移；同时观察两组患者从手术结束至发生转移的平均时间周期。

[212] 4、治疗结果：两组肿瘤转移发生情况见表 10。表 10 两组肿瘤患者腹嫫转移洽疗情况比较

组别例数腹膜转移转移时间（月〉

治疗组 25 2 ( 8%) * 22.1 ±2,2*

对照组 25 9 (36%) 11.5±3.5

注： *与对照组比较 PO..05

实验例 5 本发明中药组合物在术前使用的临床试验 [214] 为阐明本发明中药组合物在术前的效果，用按实施例 1方法制得的胶囊（以下称本发明药物）进行了下列临床试验。

[215] 1、临床资料

[216] 60例患者均为河北以岭医院住院病例，随机分为注射组、口服组和对照组，注射组 20例，年龄 41 -77岁，平均（62.5±2.3 ) 岁，其中乳腺癌 10 例，骨肉瘤 10例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移；对照组 20例，年龄 40-76岁，平均（65.3±2.4 ) 岁，其中乳腺癌 9例，骨肉瘤 11例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移；口服组 20 例，年龄 44-77 岁，平均 ( 64.5±3.3 ) 岁，其中乳腺癌 10例，骨肉瘤 10例，未经行手术治疗，并且未出现远端转移；三组在年龄、病情、病程等方面无显著性差异（P>0.05 )，具有可比性。

[217] 2、用药方法

[218] 2.1 对照组术前不进行任何处理，口服组术前口服本发明药物，注射组术前注射本发明药物，均临床观察两年。

[219] 2.2观察指标

[220] 主要观察远端转移的情况，一旦发生远端转移，即进行相应治疗。

[221] 2.4统计方法计数资料用 χ2检验，计量资料用 t检验。

[222] 3、疗效观察

[223] 根据相应检查结果确定是否发生远端转移；同时观察各组患者的平均手术结束至发生转移时间周期。

[224] 4、治疗结果：各组肿瘤转移发生情况见表 11。表 11 各组 W瘤患者转移治疗情况比较

组别例数转移率转移时间（月）

注射组 20 40% 22.1±2,2

口菔组 20 50% 15.6±3.2

对照组 20 60% 11.5±3.5

[225] 从上表可以看出本发明药物对癌细胞的转移具有抑制作用，尤其是术前注射治疗比口服效果更好。

[226] 本发明进行了以下实验，证实了本发明的中药组合物可有效用于抑制血管生成。实验例 6本发明中药组合物抑制血管生成及本发明中药组合物与 FAK抑制剂协同作用的实验

材料与方法材料

[227] 人脐静脉内皮细胞（HECV)购自于 Interlab (米兰，意大利）。这些细胞维持在细胞培养基当中（DMEM) (西格玛奥德里奇，普尔，多赛特，英国），辅以青霉素、链霉素和 10%的胎牛血清（西格玛奥德里奇）。细胞培养在 37 V , 5%C02 和 95%的湿度下进行。人工基底膜（重组基底膜）购自于 Collaborative Research Products公司（贝德福德，马萨诸塞州，美国：)。一种选择性抑制剂黏着斑激酶（FP573228 ) 购自于 Tocri s 公司（布里斯托尔，英国）。 Paxi l l in 来自于转导实验室，磷酸化特异性抗体（ pFAK 和 pPaxi l l in) 购自于 santa- cruz生物技术公司（圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国）。

方法

受试药物预处理

[228] 为方便实验进行，将本发明实施例 1所得的胶囊内容物 400mg，加入 D SO 1ml , 常温下旋转 20转 /分， 12小时，转速 OOOrpm离心 30分钟，取上清液，加入平衡盐溶液，滤过，在 405nm测光度吸收，稀释提取液至光度吸收 0. 25，此样品称为 DME25, 分装保存作为标准化的提取物，备用。

体外细胞生长方法

[229]HECV细胞以每孔 3000个细胞种在 96孔板上。用一式三份的培养板孵育一晚， 3天和 5天。经过充分培养之后，将板子从培养器中移出，用 4%的甲醛固定和 5%的结晶紫染色。随后用 10%的醋酸脱去结晶紫，使用 Bio-Tek EL_X800 多功能酶标仪（Bio-Tek仪器公司，佛蒙特州，美国）检测细胞的密度。

电动细胞基质阻抗传感（ECIS) 为基础的细胞粘附和迁移实验

[23O]ECIS-Z0仪（应用生物物理学，新泽西州，美国）被用于细胞粘附和运动性 (损伤检测）检测研究。细胞模型采用了 ECIS RbA建模软件，由制造商提供。目前的厂家采用 96W1E阵列。 ECIS是通过置于培养皿表面的金膜电极来测量细胞与其附着的底物之间的相互作用。随后处理含有半胱胺酸溶液的阵列表面，该阵列用完全培养基培养 1小时。在每个培养孔里添加相同数量的细胞。在细胞粘附试验中，其粘附性在将细胞加入阵列后被即刻跟踪。对于细胞迁移试验，细胞阵列在 3小时后达到汇合。单层细胞用 2000MA的电流电伤 20秒。细胞层的阻抗和电阻记录 20小时。信号转导抑制剂检测，在试验板孔里各自的抑制剂都位列其中。粘附和迁移是仿照使用 ECIS RbA细胞建模软件。

体外管腔形成实验

[231]体外微血管管腔形成评估使用基底膜内皮细胞小管形成试验。在无血清培养基下，将 250μ_§的基底膜种植在 96孔板上，并放置在培养器中至少 40分钟使之胶化。在这之后， 35000HECV接种到含有和不含 MDE25或 FAK抑制剂的基底层并培养 4-5小时，在培养期间的管腔形成用高倍显微镜记录并拍摄。每一个视野内总的管腔周长用 Image J软件来量化。

免疫荧光染色（IFC)

[232]HECV细胞种于 16孔腔式载玻片中 (LAB-TEK Fisher，英国）， 20000个 /孔，孵育过夜（25 ) 。吸除培养液， 4%的福尔马林固定细胞 20 min， BBS室温孵育 20 min，再滴力 [] 0.1 % Triton X-100 BBS 溶液，细胞穿孔 5 min。采用 MenaPath Autowash buffer封闭液 (A. Menarini Diagnostics,英国）卵爭育 20 min, 以阻断非特异性结合，每 5毫升封闭液含马血清 (Sigma,英国) 2滴。缓冲液润洗 2次后，采用特异性抗体标记蛋白 paxillin、 p-Paxilli. FAK、 p-FAK(Santa-Cruz, 美国)。一抗以 1 :100稀释后孵育细胞 l h，缓冲液润洗 3次，去除残余一抗。滴加 FITC标记的抗鼠二抗 (Insight Biotechnology,英国），将载玻片置于摇床上，避光孵育 l h。最后，载玻片润洗三次，去除未结合二抗， Fluor-save 封片 (Calbiochem-Novabiochem,英国)后，采用奥林巴斯 BX51荧光显微镜于 100倍物镜下观察。

凝胶电泳和免疫蛋白

[233]细胞在 25 cm³组织培养瓶中生长至融合，收集细胞，加入 HCMF缓冲液（含 1% Triton X- 100, 2 mM CaC12, 100 g/ml 苯甲基磺酰氟， 1 mg/ml 亮抑酶肽， 1 mg/ml抑蛋白酶肽 and, 10 mM原钒酸钠），置于 rotor wheel仪中裂解细胞 1 h， 13,000g离心去除不溶物。所得样品采用 Bio-Rad DC蛋白试剂盒 (Bio-Rad,美国)进行蛋白定量。

[234]将蛋白样品进行充分分离，采用 Hybond-C Extra 硝酸纤维素膜 (Amersham Biosciences,英国)转膜， 10%牛奶封闭后，测定特定蛋白的表达。分别采用抗 -pFAK抗体和抗 -pPaxillin抗体标记磷酸化的 FAK和 paximn(27)。采用 GAPDH特异性抗体 (Santa-Cruz, 美国)测定 GAPDH表达，以评价样品的总蛋白水平与一致性。蛋白条带采用 SWDED 底物化学发光系统进行显色 (Perbio Science, 英国），采用 UVIProChem成像系统进行检测 (UVItec, 英国）。结果

本发明药物可抑制微血管样小管的形成但不影响内皮细胞生长

[235]体外小管形成实验结果表明，与对照组比较 DME25能够显著縮短小管长度 (P=0.046) (见图 47按 1 :1000稀释）。这个浓度对小管不产生生长抑制作用，同时对 HECV也不产生细胞毒性。（见图 2) DME25在相当广的浓度范围内对内皮细胞的生长没有显著的影响。

对细胞基质黏附具有抑制作用

[236] DME25对 HECV细胞的黏附表现为浓度依赖性的抑制作用，明显的抑制作用浓度在 1 :5000或者更低（图 49 A，图 4) 。运用三维模型可以看到 DME25 的抑制作用经过重复性实验验证（图 49 B)。常规的细胞基质粘附模型中， DME25 显著抑制细胞粘附作用（图 49 C-D) 。

本发明药物能够减少内皮细胞迁移

[237]和细胞基质黏附相似，细胞迁移同样能够被 DME25抑制，并且在和 FAK 抑制剂联用时细胞迁移能够被进一步抑制。（图 51 ) 。

本发明药物和 FAK抑制剂在内皮细胞黏附、迁移和小管形成存在着协同作用

[238] FAK抑制剂对 HECV细胞作用显著（图 49C， 49D, 50B， 51 ) 。图中可以看出，与 DME25联用时，抑制作用被协同增强。

[239] FAK 抑制剂对小管的形成表现为抑制作用但不具有显著统计学意义 (p=0.14) (图 47E) 。但是 DME25和 FAK抑制剂联用与对照组、单用 FAK 抑制剂组以及单用 DME25组相比对小管生成具有显著的抑制作用。（P=0.006， P=0.041 , P=0.011 )

本发明药物抑制内皮细胞 FAK磷酸化

[240] 我们进一步推断 DME25对 HECV细胞 FAK和 paxillin蛋白活性的作用，也就是这些蛋白的酪氨酸磷酸化，运用酪氨酸磷酸化特异性抗体。如图 53中所示， DME25抑制 FAK磷酸化并且在与 FAK抑制剂联用时产生了更大的抑制作用。单用 DME25或 FAK抑制剂以及二者联用都能够显著作用于 paxillin蛋白的磷酸化。通过免疫荧光方法可见，空白细胞中局部粘附点 FAK被显著染色（图 54，左侧被箭头指出的部位），加入 DME25后， FAK抑制剂以及二者联用与空白组相比，虽然染色的程度没有变化，但表现出有较少细胞粘附斑（图 54，左侧）。有趣的是部分 FAK磷酸化的 FAK被 pFAK磷酸化抗体深染。如图 54所示（右侧，延长暴露的时间），可见空白细胞局部粘附斑处被 pFAK 染色， DME25和 FAK抑制剂导致 pFAK染色减少，然而，二者联用的细胞完全没有被 pFAK染色。

结论

[241]抗血管生成治疗，如阿瓦斯汀，被作为实体肿瘤治疗的新起之秀，并且正在一些肿瘤类型中显现出其临床价值。一些传统的抗肿瘤化合物也被发现在抗血管新生方面的作用。本发明中药组合物作为一种中医药的复方药物，已经显现出其在肿瘤治疗临床疗效方面的优势，包括肝癌、胃癌这两种在中国处于高发病率的肿瘤疾病。也已经证实了其在化疗过程中的一些免疫保护作用。

[242]本实验证实，本发明中药组合物对于肿瘤细胞黏附以及迁移的抑制作用。这两种细胞效应在内皮细胞的血管生成过程中具有重要作用。

[243]由实验结果可见 DME25能够显著的抑制体外血管内皮细胞的小管形成。进一步研究发现该提取物剂量依赖性的抑制细胞基质黏附和细胞迁移。这些结果证实本发明中药组合物具有抑制小管形成的作用。

[244]本实验的结果证实是运用小剂量的 FAK抑制剂阻断 FAK能够显著提高本发明中药组合物的作用，同时提取物本身也对 FAK活性有抑制作用，也就是对 FAK酪氨酸磷酸化的抑制作用。 FAK途径在细胞基质黏附和细胞黏附中的作用强于细胞外基质。在与基质的相互作用中，细胞利用膜整联蛋白与基质结合并触发一系列细胞内活化，其中一个关键的途径就是粘附斑激酶（FAK)的激活， FAK 可反过来激活整联蛋白与细胞骨架系统的相互作用。这就形成了基质黏附与接下来细胞迁移过程中的重要组成部分。 FAK被认为是血管生成过程中的重要信号通路。 FAK抑制剂，在早期对于肺癌及乳腺癌的临床实验中显示了抗肿瘤的作用。

[245]综合来看，可以说本发明中药组合物疗效的其中一个重要作用途径是通过抑制 FAK途径在血管生成中的作用。总之，本发明中药组合物对于体外血管生成具有很好的作用，能够减少细胞基质黏附和细胞迁移，这是由于其作用于粘附斑激酶（FAK) 途径。

实验例 7本发明中药组合物对于肿瘤血管生成的抑制作用、对于肿瘤细胞的转移的抑制作用以及与 Pi3K抑制剂协同作用的实验材料和方法

材料 [246]人乳腺癌细胞系， MCF-7和 MDA MB-231；人前列腺癌细胞系 PC-3和 DU-145; 人胃癌细胞系， HGC27和 AGS; 人结肠癌细胞系， RKO and 和 HRT18; 均来自 ECACC (欧洲动物细胞培养库，英国索尔兹伯里）。人骨肉瘤 MG-63和人肺癌细胞系 A549购自 ATCC (美国标准细胞库)。这些细胞保存于添加青霉素、链霉素和 10% 胎牛血清的 DMEM(Sigma-Aldrich, Poole Dorset, England)培养基中。细胞培养条件 37oC, 5% C02和 95%湿度。

[247] ROCK 抑制剂（Y27632) 购自

Santa Cruz Biotechnologies Inc. (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., CA, US). J K抑制剂 II (SP60015), ERK抑制齐 [J II (FR180204), JAK-3 抑制齐 U (Jak-3 抑制剂 1 {4-(4 ，

-Hydroxyphenyl)amino-6,7-dimethoxyquinazoline; WHI-P131 }),禾口 PLC-g (U73122) 购自 Calbiochem (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, England, UK). cMet kinase抑制剂来自辉瑞制药 . 基质胶（人造基底膜）购自 Collaborative Research Products (Bedford, Massachusetts, USA). 抗人

GAPDH and anti-phopho-Akt抗体购自 Santa-Cruz Biotechnologies。

方法

受试药物预处理

[248]DME25，其样品来源和制备如前所述。

体外细胞增殖检测

[249]细胞增殖采用体外细胞增殖分析方法 (11, 12)。细胞接种于 96孔板中至 3000 个细胞 /?L。三块板分别培养过夜、 3d、 5(1后4% / 甲醛固定， 0.5%(w/v)结晶紫染色。 10%乙酸抽提结晶紫采用分光光度计检测吸光度（Bio-Tek ELx800读板器， Vermont, USA) 。

细胞基质电阻抗传感器检测细胞粘附和迁移

[250] ECIS-Zq( Applied Biophysics Inc, NJ, US)已用于细胞粘附额运动能力检测 (13,14)。采用 ECIS RbA立体化软件构建细胞图。 96W1E ECIS用于本次研究。通过置于培养板表面的金箔电极测量细胞与基质间相互作用。分析仪表面用 10Mm的丝氨酸溶液预处理后，用全培养基在培养中孵育 lh。等量细胞加入每个培养孔。在细胞粘附检测中，细胞加入分析仪后随即示踪。在细胞迁移检测中，要求细胞 3h后融合。单层细胞电阻抗在 2000iA进行损伤。阻抗和电阻随即记录至 20h。采用信号转导抑制剂分析。粘附和迁移采用 ECIS RbA立体化软件进行立体图构建。

蛋白印迹分析

[251]细胞在 25cm3 培养瓶中至融合，随后采用（含 1% Triton X-100, 2 mM CaC12, 100 μ g/ml 苯甲基磺酰氟， 1 mg/ml亮肽素， l mg/ml抑肽酶和， 10 mM原矾酸钠） HCMF缓冲盐吹打并振荡 lh裂解细胞， 13,000g 离心去掉沉淀。样品中的蛋白含量采用 Bio-Rad DC 试剂盒 (Bio-Rad laboratories, California, US A)检测。

[252]等量蛋白采用 SDS-PAGE胶分析。分离完成后向 Hybond-C Extra硝酸纤维素膜 (Amersham Biosciences UK Ltd, Bucks, UK)转印， 10%牛奶封闭，特异蛋白检测表达。磷酸化 AKT(threonine) 表达采用抗 -pAkt 抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA)检测。另夕卜， GAPDH表达也采用特异抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA)检测。一抗连接后加入二抗一连接过氧化物酶的抗小鼠抗体（Sigma, Dorset, UK)。采用 Supersignal West Dura Extended Duration 底物化学发光系统 (Perbio Science UK Ltd, Cramlington, UK) 和 UVIProChem 成像系统 (UVItec Ltd, Cambridge, UK)检查蛋白表达。

结果

本发明中药组合物对人肿瘤细胞粘附的作用

[253]使用高通量 ECIS检测 DME25对不同肿瘤类型的细胞系，包括人乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌和骨肉瘤细胞。 YZXJ浓度从 1 :40 to 1 :600,000。浓度高于 1 :125,000对细胞粘附有抑制性作用。较敏感的细胞包括 MCF-7, MG-63 和 A539，结果见图 9。在现在的模型采用宽谱检测也可以证实其抑制性作用，结果见图 56。使用 Rb法以 A549细胞为例（图 57) 图示定量分析结果。参数 α 表示基底膜与电极（基质）之间的平均距离。因此，它可以清晰地说明 DME25 对肿瘤细胞与基质之间存在剂量依赖性抑制。

本发明中药组合物抑制细胞迁移

[254]检测了对肿瘤细胞粘附的作用之后，进行单层融合肿瘤细胞电损伤。采用 ECIS检测周围肿瘤细胞损伤恢复。结果 DME25对肿瘤细胞，肺癌和结肠癌，迁移表现出浓度依赖性抑制。图 58表示 DME25对 Α549细胞迁移的影响。药物浓度在 1 :125,000即可看到抑制性作用，与细胞粘附实验类似。

本发明中药组合物对人肿瘤细胞增殖影响微弱 [255]进一步研究了 DME25体外对细胞增殖的影响。 DME25 (1 :1000和 1 :25,000) 处理 72h后（结果见表 12) ，在较宽的浓度范围内， DME25对肿瘤细胞增殖无明显影响。

表 12. DME25 对于离体癌细胞的生长抑制作用结果

PI3K/AKT介导本发明中药组合物对细胞粘附的影响

[256]为证实 DNE25对细胞粘附作用的信号通路，针对 PI3K/AKT和 AKT检测抑制剂作用。单独加入 Wortmannin (PI3K抑制剂)或者与 DME25联用抑制前列腺癌细胞 (DU-145)粘附，与对照组和单用 DME25比较，粘附均降低。联用较单用也表现出更强的抑制作用。 AKT 是 PI3K 的下游通路抑制剂，其抑制剂与 DME25联用可提高对细胞粘附的抑制作用。单用抑制对细胞粘附抑制较弱，见图 59。图 60表示 DME25对肺癌细胞系 A549 AKT (Ser 473)磷酸化的影响。高浓度（1 :1000)DME25降低 AKT磷酸化 (pAKT)水平。加入 AKT抑制剂和 DME25 对 pAKT可协同抑制，尤其与低浓度 DME25 ( 1 :5000) 联用。

结论

[257]本发明中药组合物不仅具有抗肿瘤效果，而且可以直接抑制肿瘤细胞的粘附和迁移，防止肿瘤转移，并且与化疗药物的协同作用。

实验例 8本发明中药组合物治疗类风湿性关节炎的作用及对类风湿性关节炎血管生成的抑制作用

1 材料

1. 1 动物 SD大鼠，雌雄各半，体重为 180-200g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号 SCXK (京） 2006-0009。

1. 2 药材与主要试剂本发明药物胶囊（按照实施例 1的方法制备，石家庄以岭药业股份有限公司）；不完全弗氏佐剂（IFA)及酸溶性 II型胶原（collagen II， 3806) 均为 sigma产品；卡介苗为购于中国药品生物制品检定所。方法 2. 1 完全弗氏佐剂 (Freund, s Complete adjuvant CFA) 的制备：在不完全弗氏佐剂（IFA) 加入卡介苗，使之终浓度为 7. 5mg/ml，反复抽打成乳化剂。

2. 2大鼠胶原关节炎模型的制备：将牛 II型胶原溶于 0. 1M的冰醋酸中， 4°C过夜。然后与 CFA研磨均匀，制成含 II型胶原为 2mg/ml的乳剂，将上述乳剂以 150 μ 1/只左足及尾根部皮下多点注入模型组及各给药组免疫大鼠（每只大鼠相当于注射 150 μ _§的 II型胶原），于第 10天每只大鼠尾根部注射同种乳剂 150 μ ΐ加强免疫。正常对照组不做任何处理。

2. 3 实验动物的分组与给药： SD大鼠随机分为 5组。即正常对照组，给等体积溶媒；胶原关节炎模型组，给等体积溶媒；本发明药物大、中、小剂量组，制备模型次日开始灌胃给予本发明药物，剂量分别为 1. 56、 0. 78、 0. 39 g - kg-1 ; 各组给药容积均为 lml/100g体重，连续给药 40天。

2. 4本发明药物对胶原关节炎大鼠关节炎指数的影响：给药结束后大鼠采用关节评分法进行评分。耳：结节和发红症状（无 0分，有 1分）；鼻：红、肿胀（无 0分，有 1分）；尾：结节（无 0分，有 1分）；前爪：至少一个关节的炎症（无 0分，有 1分）；右后爪：肿胀（无 0分，轻度 1分，中度 2分，重度 3分）。每组大鼠的平均得分为关节炎指数。

2. 5本发明药物对胶原诱导的关节炎大鼠的足趾容积的影响：用足趾容积测量仪测量每只大鼠的右后足足趾容积，观察各组大鼠足容积的变化。

2. 6病理变化：处死大鼠，取右侧踝关节，福尔马林固定，石蜡包埋切片， HE 染色方法。

2. 7 统计学分析结果以平均值 ± s表示，采用 SPSS 11. 5软件进行 AN0VA分析处理和 Dunnett检验。结果

3. 1 本发明药物对胶原关节炎大鼠关节炎指数的影响：结果显示，首次免疫后约 14天开始 II型胶原模型大鼠及各给药组大鼠开始出现耳红肿和关节红肿，后足趾关节出现红肿后蔓延到前足和尾部，并日趋严重，有些鼠尾部出现明显的结节。与正常对照组比较，模型组关节炎指数明显升高（P〈0. 01 )；与模型组比较，本发明药物能明显降低关节炎指数，中、高剂量组有统计学意义（P<0. 05， P<0. 01 ) 。见表 12。 3. 2 本发明药物对胶原诱导的关节炎大鼠的足趾容积的影响：与正常对照组比较，模型组足趾容积明显升高（P〈0. 01 ) ；与模型组比较，本发明药物能明显降低足趾容积，中、高剂量组有统计学意义（P<0. 05， P<0. 01 ) 。见表 13。表 13本发明药物对胶原诱导的大鼠关节炎的的影响 (平均值 ± s)

注 :与对照组比较，^{1) 7}〈0. 05，²) ^0. 01；与模型组比较， ³⁾ <0· 05, ⁴)尸<0. 01

3. 3 病理变化：

[258]正常组关节软骨可见 1-2层滑膜细胞，关节面光滑，关节腔内无渗出物。

[259]胶原模型组关节结缔组织及肌肉组织可见炎性细胞浸润，关节软骨可见滑膜组织中中性粒细胞、单核细胞，尤其是淋巴细胞浸润、血管增多，血管内膜变形增生，管腔变窄或阻塞，滑膜细胞下纤维素大量渗出，胶原纤维沉积。

[260]本发明药物大、中剂量组对胶原关节炎的组织损伤有较好的改善作用。结论

[261]本发明药物对 II型胶原诱导的大鼠关节炎有很好的防治作用。

讨论

[262]类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA) 是一种以累及周围关节为主的多系统炎症性自身免疫病。 RA的主要特征是关节炎症反应、滑膜血管新生，进而导致慢性滑膜增生，进一步影响软骨和骨质，导致关节畸形和功能丧失为基本病理改变的疾病。 Π型胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis, CIA)动物模型是目前公认的用于研究 RA发病机制和开发治疗 RA新药的理想动物模型，该模型由 II型胶原（Collagen ll, CII) 诱导， CII是软骨的主要成分，为类风湿关节炎发病的自身抗原。临床类风湿关节炎病人血清和滑膜液中可査出 Π型胶原抗体。由于 CIA模型发病机制更接近人类 RA，因而是近年来研究类风湿性关节炎的首选模型。

[263] 我们的实验观察到大鼠模型组出现耳红肿和关节红肿，后足趾关节出现红肿后蔓延到前足和尾部，有些鼠尾部出现明显的结节。病理也显示关节结缔组织及肌肉组织可见炎性细胞浸润，关节软骨可见滑膜组织淋巴细胞浸润、血管增多，血管内膜变形增生，胶原纤维沉积。本发明药物能明显改善一般症状和病理变化。 [264]模型组关节炎指数和足趾容积明显升高，本发明药物能显著降低关节炎指数和足趾容积，改善病灶血管增多，血管内膜变形增生的病理改变，证实本发明药物对 II型胶原诱导的大鼠关节炎有很好的防治作用。

实验例 9本发明中药组合物治疗糖尿病视网膜病变的作用及对糖尿病视网膜病变血管生成的抑制作用

1 材料

1. 1 动物 KK/Upj-Ay小鼠， 30〜40 g; C57BL/6小鼠， 25〜30 g，均为 SPF 级，雄性， 12周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。

1. 2 药材与主要试剂本发明药物胶囊（按照实施例 1的方法制备，石家庄以岭药业股份有限公司）；内皮生长因子（VEGF) —抗（Santa Cruz公司）。

2方法

2. 1 动物分组与给药 40只 KK/Upj-Ay小鼠按空腹血糖值（FBG)分为模型组、本发明药物高、中、低剂量组，另设 C57BL/6小鼠为对照组，每组 10只动物。采用灌胃给药，本发明药物高、中、低剂量组分别给予 1. 56、 0. 78、 0. 39 g . kg-¹ 的本发明药物，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，每日一次，连续 3个月。

2. 2 形态学变化

2. 2. 1 给药结束后，取小鼠眼球，置于甲醛固定， HE染色；

2. 2. 2 小鼠眼球，取眼球，固定于 10%甲醛液中 48 h，分离视网膜，自来水漂洗，放入 3%胰蛋白酶消化液 37Ό孵箱中消化振荡约 3h，仅剩下一层透明的视网膜血管网，进行 HE- PAS染色。

2. 2. 3 小鼠眼球，置于戊二醛固定，电镜观察超微结构。

2. 3 Western blot法检测 VEGF蛋白的表达取视网膜组织， RIPA裂解法提取总蛋白，将蛋白样品进行 12%的 SDS— PAGE凝胶电泳， 4°C恒压电转移至 PVDF膜上， 5%脱脂奶粉封闭 lh，后加入一抗（1 : 200稀释的 VEGF, 1 : 1000 稀释的 GAPDH 内参）， 4Ό孵育过夜， TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗 (稀释浓度 1 : 1000) , ECL暗室发光显色，凝胶成像系统照相扫描灰度值分析，以目的蛋白灰度值与 GAPDH的灰度值比值用于统计分析。

2. 4 统计学分析结果以平均值 ± s表示，采用 SPSS 11. 5软件进行 AN0VA分析处理和 Dunnett检验。 3结果

3. 1 HE染色：对照组视网膜各层细胞层次分明，细胞结构紧密；模型组视网膜色素上皮层明显变薄，细胞排列紊乱，本发明药物能改善上述变化。

3. 2 HE-PAS染色：正常小鼠视网膜毛细血管分布规则，走向较直，管径粗细均匀一致；模型组视网膜毛细血管网排列紊乱，走向极不规则，多根毛细血管扭聚成丛，部分毛细血管扩张、管腔粗细不均；本发明药物能明显改善上述变化，以高剂组最为明显。

3. 3电镜结果：对照组小鼠视网膜，光感受器细胞内、外节交界处，线粒体嵴清晰，细胞排列整齐，细胞核和细胞器正常；模型组视网膜，出现空泡变性，外节膜盘结构模糊，排列紊乱，肿胀变性。内、外核层细胞内线粒体肿胀，光感受器细胞膜破裂，核固缩，周边可见细胞碎屑。本发明药物组外节膜盘间隙较模型组缩小，排列平行度稍好，内外核层细胞线粒体空泡变性有所减少，高剂量组最为明显。

3. 4 视网膜 VEGF表达： Western blot结果显示 VEGF蛋白表达在对照组正常视网膜中表达较低，模型组 VEGF蛋白表达明显高于对照组（ Ό. 01 ) ，本发明药物干预后 VEGF蛋白表达显著低于模型组，且中、高剂量组有统计差异（尸0. 05， Ρ<Ό. 01 ) 。见表 14。表 14 本发明药物对 ΚΚ小鼠视网膜 VEGF表达的影响（n=3, 平均值 ±

注：与对照组比较， " P<0. 05 , <0. 01；与模型组比较， P<0. 05 , ⁴⁾ P<0. 01

4结论

[265] 本发明药物对糖尿病视网膜病变小鼠有一定的防治作用， VEGF 蛋白表达显著降低，可有效抑制血管生成。

[266] 5讨论

[267]临床中 II型糖尿病占糖尿病群体的 90%以上，一般研究者均选用 II型糖尿病（DM) 动物模型。本实验中选用的 KK小鼠为自发性 DM模型，已被广泛用于 DM的基础研究。有报道称 8-12周龄 KK小鼠饲养 3个月后视网膜出现了明显的毛细血管和神经病变，本研究通过预实验也观察到了相似的结果，因此在此研究中我们选择了 8-12周龄 KK小鼠词养 3个月作为糖尿病视网膜病变（DR) 模型。我们的光镜和电镜结果也显示了模型组小鼠视网膜色素上皮层明显变薄，细胞排列紊乱；毛细血管网排列紊乱，走向极不规则；出现空泡变性，外节膜盘结构模糊，排列紊乱，肿胀变性等病理损伤，提示糖尿病视网膜病变模型已经形成。

[268]光镜和电镜结果同时显示本发明药物能改善视网膜病理损伤，从形态学上证实了本发明药物可延缓糖尿病大鼠视网膜病变的出现，对 DR确有防治作用。

[269]在正常眼组织中，视网膜色素上皮细胞、视网膜血管周细胞、内皮细胞和 MiUler细胞均可产生较低水平的 VEGF, 用以维持血管稳定性和视网膜正常发育，但在高糖条件下， VEGF被释放，导致一系列的反应，包括视网膜血管渗漏、刺激视网膜内皮细胞增殖和迁移，促进新生血管形成等。本实验也证实了模型组 DR小鼠视网膜 VEGF蛋白表达显著升高。给予不同剂量的本发明药物治疗 3个月后， VEGF表达均有不同程度的降低，证实本发明药物可通过降低 VEGF表达，抑制血管生成，从而起到保护糖尿病小鼠视网膜的作用。

实验例 10本发明中药组合物对于动脉斑块的稳定作用及对动脉斑块血管生成的抑制作用

1 材料

1. 1 动物大耳白兔，普通级，雄， 2. (T2. 4 kg，购买于北京科宇动物养殖中心，许可证编号： SCXK (京) 2007 0003。

1. 2 药材与主要试剂本发明药物胶囊（按照实施例 1的方法制备，石家庄以岭药业股份有限公司）；油红 0购自美国 Sigma公司；天狼猩红购自美国 Sigma 公司。方法

2. 1 研究方法： 30 只雄性大耳白兔，应用球囊损伤腹主动脉 +高胆固醇饲料（1% 胆固醇,每只喂养饲料 120-140g/d)喂养 8 周的方法，建立稳定动脉粥样硬化

(As )斑块模型，随机分为：本发明药物治疗组（每天给予 0. 39 g * kg-l本发明药物胶囊，本发明药物组），普通饮食喂养自然消退组（对照组），继续高脂喂养对照组 (模型组）。每组 10只兔子。模型组和本发明药物组建模后继续高脂饮食喂养，分别单笼喂养，自动饮水， 12 周后给予中国斑点螃蛇毒和组胺进行药物触发 0. 15mg/kg腹膜下注射， 30min后耳缘静脉注射组胺 0. 02mg/kg, 处死动物前 24 h、 48 h 两次药物触发，以促使斑块发生实验性破裂，触发后处死。 2.1血管内超声显像检査（IVUS) 的测定：分别药物触发后进行腹主动脉血管内超声检査。 3%戊巴比妥钠麻醉后，将实验兔仰卧位固定于实验台上，具体操作如下：常规应用 4F穿剌针穿刺左股动脉，在 0.014英寸导引钢丝及扩张管辅助下，插入 5F 鞘管，固定，立即静脉给予肝素 lOOu/kg抗凝，沿导引钢丝在体表血管超声的引导下，插入血管内超声探头导管，通过狭窄病变至血管远端，然后缓慢回撤探头导管（0.5min/_S) ，标记斑块远端、近端图像，录像供脱机分析和存档。测量三组动物斑块破裂的发生率，同时测定

(1)血管夕卜弹力膜面积 (external elastic membrance area, EEMA) ：指血管外弹力膜所包含的面积，包括血管腔面积和斑块面积之和。

(2) 管腔面积（lumen area, LA) ：指血管内膜所包含的面积。

(3) 斑块面积（plaque area, PA) ：血管外弹力膜面积与管腔面积之差。

(4)管腔面积狭窄百分率（lumen area stenosis, LAS%) ：斑块面积与血管外弹力膜面积之比。

2.2 特殊染色：利用油红 0染色观察斑块内脂质、胶原相对含量。

2.3 统计学分析结果以平均值 ±s表示，采用 SPSS 11.5软件进行 AN0VA分析处理和 Dunnett检验。结果

3.1 血管内超声显像检査（IVUS) ：与模型组比较，本发明药物组实验兔 EEMA、 PA、 ^^%下降明显（ C0.01) ， (表 4)。测得的三组动物腹主动脉斑块的破裂率：本发明药物组： 0%; 对照组： 0% ；模型组： 33%。表 15 治疗 12周后实验兔腹主动脉 IVUS测值的比较

注：与模型组比较 ** 0.01 3.2 病理变化：特殊染色显示模型组油红 0染色阳性百分比明显高于对照组，与模型组比较，本发明药物组阳性百分比显著降低。结论

本实验应用球囊损伤腹主动脉 +高胆固醇词料建立了家兔动脉粥样硬化模型，通过 IVUS检查表明本发明药物治疗组可显著降低 EEMA、 PA、 LAS%，并降低斑块的破裂率，从而发挥稳定易损斑块的作用，显微观察可明显减少斑块内血管数量，抑制血管生成。

Claims

权利要求

1.一种中药组合物在制备用于治疗或预防血管生成相关疾病的药物中的应用，其中所述中药组合物包含如下重量份比例的原料药或其提取物：

黄芪 140-300 女贞子 150-250 人参 40-90 灵芝 40-85

莪术 75-180 白术 40-80 半枝莲 80-180 绞股蓝 150-300

茯苓 40-80 鸡内金 20-35 蛇莓 75-175 白英 85-175

茵陈 85-175 徐长卿 75-175 土鳖虫 15-25 白花蛇舌草 95-165。

2.根据权利要求 1所述的应用，其特征在于该中药组合物包含下列重量份的原料药或其提取物：

黄芪 140 女贞子 250 人参 40 灵芝 85 莪术 75 白术 80

半枝莲 85 绞股蓝 300 茯苓 40 鸡内金 35 蛇莓 75

白英 175 茵陈 85 徐长卿 175 土鳖虫 15 白花蛇舌草 165。

3.根据权利要求 1所述的应用，其特征在于该中药组合物包含下列重量份的原料药或其提取物：

黄芪 300 女贞子 150 人参 90 灵芝 40 莪术 180 白术 40

半枝莲 180 绞股蓝 150 茯苓 80 鸡内金 20 蛇莓 175

白英 85 茵陈 175 徐长卿 75 土鳖虫 25 白花蛇舌草 95。

4.根据权利要求 1所述的应用，其特征在于该中药组合物包含下列重量份的原料药或其提取物：

黄芪 250 女贞子 200 人参 65 灵芝 65 莪术 132 白术 64

半枝莲 128 绞股蓝 256 茯苓 65 鸡内金 30 蛇莓 128

白英 128 茵陈 128 徐长卿 128 白花蛇舌草 128 土鳖虫 20。

5. 根据权利要求 1-4中任一项所述的应用，其中所述疾病为癌症。

6. 根据权利要求 1-4中任一项所述的应用，其中所述药物用于防止癌症转移。

7. 根据权利要求 6的用途，其中所述中药组合物联合黏着斑激酶抑制剂用于防止癌症转移。

8. 根据权利要求 6的用途，其中所述中药组合物联合磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂用于防止癌症转移。

9. 根据权利要求 8的应用，其中所述磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂为渥曼青霉素。

10. 根据权利要求 6的用途，其中所述中药组合物联合 AKT抑制剂用于防止癌症转移。

11. 根据权利要求 6-10中任一项的用途，用于防止癌细胞向腹膜转移。

12. 根据权利要求 11的用途，其中所述中药组合物联合 FAK抑制剂、 SRC抑制剂、 CD44抑制剂或 HA抑制剂用于抑制癌细胞向腹膜转移。

13. 根据权利要求 11-12中任一项的用途，用于围手术期防止癌细胞向腹膜转移。

14. 根据权利要求 11-13中任一项的用途，其中所述中药组合物联合化疗抑制癌细胞向腹膜转移。

15.根据权利要求 5-14中任一项所述的应用，其特征在于所述癌选自胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌和骨肉瘤。

16. 根据权利要求 1-15中任一项的应用，其中所述中药组合物的原料药的提取物是通过包括以下的步骤制得的：

( 1 ) 用醇提取得醇提取物，

(2) 对水提取得水提取物；

(3 ) 将上述醇提取物和水提取物合并即可。

17. 根据权利要求 16的应用，其中所述醇为乙醇，优选 50-90%乙醇。

18. 根据权利要求 16-17中任一项的应用，其中在步骤（2) 中用水提取之前先用水提取挥发油，然后将所得挥发油与醇提取物和水提取物合并得到提取物。

19.根据权利要求 1-18任一项所述的应用，其中所述中药组合物的原料药的提取物是通过包括以下的步骤制得的：：

(1)、按照原料药重量比例称取中药材，净选；

(3)、莪术、白术、徐长卿加 4-8倍量水提取挥发油，收集挥发油，另器收集，残渣及水溶液备用？

(4)、土鳖虫、鸡内金、茯苓粉碎成细粉；

(5)、黄芪、灵芝、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、蛇莓、白英、茵陈，与步骤 (2)中所得人参、女贞子的醇提后残渣，及步骤 (3)中所得莪术、白术、徐长卿提油后残渣及水溶液合并，加 7-10 倍量水，加热煎煮 1-3次，每次 1-3小时，合并煎煮液，加入步骤 (2)中所得人参、女贞子醇提液，浓缩成清膏，干燥，粉碎，备用；

步骤（4)所得粉碎粉、步骤（3 )所得挥发油与步骤（5 )所得的干膏粉共同构成该中药组合物的活性成分。

20. 根据权利要求 1-19中任一项所述的应用，其中所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、散剂、口服液、丸剂、酊剂、糖桨剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂、洗剂或注射剂。