WO2014171698A1 - 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법 - Google Patents

제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법 Download PDF

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기창석
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Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing type 1 myotonic dystrophy.
  • Type 1 myotonic dystrophy is the most common hereditary muscle disease in Koreans. It is an autosomal dominant genetic disease characterized by myotonia and progressive muscle weakness. In addition to muscle-related symptoms, the disease is characterized by abnormalities in various organs, including the heart, eyes, endocrine organs, digestive system and central nervous system (Harper PS et al., DG M. Myotonic dystrophy, in Engel AG, Franzini-Armstrong C (eds): Myology (ed3) .In.New York: NY, McGraw Hill Professional, 2004: 1039-76). It is classified into type 1 and type 2 myotonic dystrophy (DM type 1, 2, DM1, DM2) according to the causative gene.
  • DM type 1, 2, DM1, DM2 type 1 and type 2 myotonic dystrophy
  • Type 1 myotonic dystrophy is expressed by an abnormal increase in the CTG tribasic sequence at the 3 ′ untranslated region of the gene on chromosome 19 encoding DMPK (Dystrophia Myotonics Protein Kinase), and type 2 myotonic dystrophy is 3 Caused by unstable expansion of the CCTG tetrabasic of intron 1 of the zinc finger protein 9 (ZNF9) gene located in the long arm (3Q21) of the chromosome.
  • ZNF9 zinc finger protein 9
  • type 1 myotonic dystrophy is manifested as a physical disorder mainly after adulthood. Therefore, type 1 myotonic dystrophy has been diagnosed in a family of patients who have already developed symptoms or have been diagnosed with the disease.
  • a method of diagnosing a disease by confirming the degree of mutation of the DMPK gene using molecular biological methods has been studied, and a method using PCR or sudden blot has been mainly used.
  • Type 1 myotonic dystrophy is a hereditary disease, and since there is no effective prevention method except pre-pregnancy or early stage of cancer death, it is necessary to secure a short method.
  • the present inventors have made extensive efforts to develop a method for early diagnosis of type 1 myotonic dystrophy. As a result, carriers with alleles with increased CTG repeats of the DMPK gene or patients with mild symptoms gave birth to children. Using the amplification of CTG repeat sequences, the disease was developed. Screening tests were performed to detect carriers or patients with mild symptoms from pregnant women, women of childbearing age or newborns. The present invention has been completed by developing a diagnostic method.
  • an object of the present invention is to provide a method for diagnosing myotonic dystrophy type 1.
  • Another object of the present invention is to provide a computer implementation of Myotonic dystrophy type 1 patient. To provide an identification method. Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description of the claims and drawings.
  • the present invention is to detect the CTG repeat sequence of the dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) gene in order to provide information necessary for the diagnosis of Myotonic dystrophy type 1 (Myotonic dystrophy type 1) It provides a diagnostic method comprising the steps of:
  • two alleles of the DMPK are homozygotes (homozygote) having a CTG sequence of 34 times or less. Or, when the two alleles of the DMPK are heterozygotes having a repeated number of CTG sequences of 34 or less and 35 or more, respectively, (ii) the two alleles of the DMPK are of the CTG sequence Negative for a heterozygote having 34 or fewer repetitions; Uii) positive for other;
  • homozygotes homozygote having a CTG sequence of 34 times or less.
  • the two alleles of the DMPK are heterozygotes having a repeated number of CTG sequences of 34 or less and 35 or more, respectively.
  • step (b) performing a second diagnostic test on the positive individual of step (a) to select a positive individual, wherein the second diagnostic test is isolated from a biological sample of the positive individual of step (a)
  • the second diagnostic test is isolated from a biological sample of the positive individual of step (a)
  • two alleles of DMPK are positive as homozygotes having 34 or fewer CTG sequences in the first diagnostic test. Although it was determined that the allele with the repeat count of 35 or more CTG sequences among the two alleles of the DMPK was not found in the second diagnostic test, it is judged as negative, and (ii) DMPK in the positive individual of the first diagnostic test. Two alleles A positive allele with an allele greater than 35 repetitions of the CTG sequence is detected.
  • the present inventors have made extensive efforts to develop a method for early diagnosis of type 1 myotonic dystrophy. As a result, when a carrier with an allele with an increased CTG repeat sequence of the DMPK gene or a patient with mild symptoms gives birth to a child, the CTG repeat sequence is amplified and a disease occurs.
  • the diagnostic method of the present invention can be applied not only to type 1 myotonic dystrophy, which is an autosomal dominant disorder, but also to the selection of other genetic diseases caused by genetic abnormalities. Or provide important information about acquired acquisition disorders.
  • the diagnostic method of the present invention is described as 'a diagnostic method for detecting the CTG repeat sequence of the dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) gene in order to provide information necessary for the diagnosis of Myotonic dystrophy type 1'.
  • the method for detecting CTG repeat sequences of the dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) gene or It can also be expressed as a diagnostic method of Myotonic dystrophy type 1 comprising identifying a CTG repeat sequence of a dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) gene in a biological sample of an animal.
  • the term "biological sample” refers to a biological sample of an animal separated in vitro, and means a blood, plasma, serum, urine, cell, hair, or tissue sample. According to a specific embodiment of the present invention, the biological sample Is blood, hair or oral mucosa cells. On the other hand, if the subject (subect) is a fetus, the biological sample includes chorionic amnion, placenta or umbilical cord blood.
  • nucleic acid is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and the nucleotides that are the basic building blocks of nucleic acid molecules are naturally occurring nucleotides, as well as sugars or bases.
  • the first diagnostic test is performed in a subject group consisting of pregnant women, women of childbearing age or newborns to select positive individuals.
  • the first diagnostic test is performed by measuring the repetition number of the CTG sequence of the DMPK gene 3 ′ untranslated region in the nucleic acid isolated from the biological sample of the subject population. That is, it is possible to measure whether the CTG sequence is repeated and the number of repetitions by amplifying the DMPK gene 3 'untranslated region.
  • the term "amplification reaction” means a reaction that amplifies a gene or nucleic acid molecule.
  • PCR polymerase chain reactions
  • PCR Polymerase chain reaction
  • the diagnostic method of the present invention includes not only conventional PCR methods, but also touchdown PCR (24), hot start PCR (25, 26), which is a modification of traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR.
  • Nested PCR (2) and booster (27) can be used.
  • real-time PCR differential display PCR (DD-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), inverse polymerase chain reaction: IPCR), vectorette PCR, TA I L-PCRC thermal asymmetric interlaced PCR, and multiplex PCR.
  • DD-PCR differential display PCR
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • IPCR inverse polymerase chain reaction
  • vectorette PCR TA I L-PCRC thermal asymmetric interlaced PCR
  • multiplex PCR For more information on PCR, see McPherson, M.J. , And Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer— Ver lag New York Berlin Heidelberg
  • the diagnostic method of the present invention can be carried out using hybridization, immunoassay or microarray in addition to the above-described gene amplification method.
  • the probe or primer used in the diagnostic method of the present invention is DMPK
  • the (dystrophia myotonica-protein kinase) gene 3 ' has a sequence complementary to the CTG repeat sequence of the untranslated region.
  • the term “complementary” means having sufficient complementarity to selectively localize to the CTG repeat sequence of the DMPK gene 3 'untranslated region under certain specific hybridization or annealing conditions. . Thus, the term “complementary” is different from the term perfectly complementary.
  • the primer or probe of the present invention may have one or more mismatch sequences as long as it can selectively hybridize to the CTG repeat sequence of the DMPK gene 3 'untranslated region.
  • the label of the probe can provide a signal to detect whether it is localized, which can be linked to an oligonucleotide.
  • Suitable labels include fluorophores (e.g. fluorescein, phycoerythr in, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia), chromophores, chemilumines, magnetic particles, radioactivity Isotopes (P32 and S35), mass labels, electron dense particles, enzymes (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), cofactors, substrates for enzymes, heavy metals (eg gold) and antibodies, streptavidin biotin And hapten with specific binding partners such as digoxigenin and chelating groups.
  • fluorophores e.g. fluorescein, phycoerythr in, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia)
  • chromophores e.g. flu
  • Labeling is carried out in a variety of methods conventionally practiced in the art, such as nick translation methods, random priming methods (Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham” (1989)), and chination methods (Maxam & Gilbert Methods in Enzymology, 65: 499 (1986)).
  • the label provides a signal that can be detected by fluorescence, radioactivity, colorimetry, intensification, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, hybridization high frequency, nanocrystals.
  • CTG sequence repetition can be confirmed by GeneScan Genetic Analysis of the reaction product of the above-described polymerase chain reaction.
  • GeneScan Genetic Analysis of the reaction product of the above-described polymerase chain reaction.
  • the second diagnostic test is to perform an overhaul on the positive individual of step (a), wherein the CTG sequence of the DMPK gene 3 'untranslated region is isolated from nucleic acid isolated from the biological sample of the positive individual of step (a). By measuring the number of times.
  • the second diagnostic test may use a Southern blot or triplet repeat-primed amplification (TP PCR) method, which is a DNA-DNA hybridization method.
  • TP PCR triplet repeat-primed amplification
  • the two alleles of DMPK in the first diagnostic test were determined to be positive as homozygotes having 34 or fewer repeats of CTG sequence, but the two alleles of DMPK in the second diagnostic test If alleles with 35 or more repeats of CTG sequences in the gene are not found, they are determined to be negative, and (ii) 35 repeats of CTG sequences among the two alleles of DMPK are found in positive individuals of the first diagnostic test. Positive alleles are found to be positive.
  • the method may further include the step (c) of performing a third diagnostic test on the fetus to select a positive individual.
  • the third diagnostic test is carried out by measuring the repetition number of the CTG sequence of the DMPK gene 3 'untranslated region in the nucleic acid isolated from the biological sample of the fetus, the two alleles of the DMPK If it is 34 or less times, it is judged to be negative, and (ii) it is determined to be positive when alleles having a repeat count of 35 or more CTG sequences among the two alleles of the DMPK are found.
  • the diagnostic method of the present invention is the third If the number of repeats of CTG sequence is 35 -49 in the positive test, it is judged as carrier of myotonic dystrophy, and in the case of 50 -99, it is considered to be the first risk group of myotonic dystrophy. ; 100 to 999 times are the most likely cases of typical type 1 myotonic dystrophy patients and are regarded as the second risk group of myotonic dystrophy; If it is more than 1000 times, the case is likely to be a patient with congenital myotonic dystrophy, and may further include the step of judging as a third risk group of myotonic dystrophy.
  • the first risk group is a 100% chance of developing type 1 myotonic dystrophy, but it is a group in the 20s to 70s, mild symptoms and complications such as cataracts, the second risk group is 100% It is a group of teenagers in their thirties and thirties with typical myotonia and muscle placebo, and most of the complications such as cataracts and arrhythmia. This may indicate a group that usually develops myotonia, typically before age 10.
  • the third diagnostic test for the fetus involves separating nucleic acids (DNA) from chorionic membranes, amniotic fluid, umbilical cord blood, etc., and to determine the number of CTG repeat sequences of the fetal DMPK gene 3′-UTR region from the isolated nucleic acids. PCR or sudden blot test procedures.
  • to determine the exact CTG repeat sequence of the fetus may include the process of confirming the number of CTG repeat sequence of the DMPK gene 3'-UTR region of pregnant women and biological father.
  • the present invention provides a computer-implemented identification method of a Myotonic dystrophy type 1 patient comprising:
  • DMPK distrophia
  • homozygote homozygote
  • the computer-implemented identification method of a patient with type 1 myotonic dystrophy of the present invention is the same as the method for diagnosing type 1 myotonic dystrophy of the present invention described above, and the DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) gene
  • the contents common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the term "computer processor” is a device for processing a plurality of diagnostic information related to the CTG repeat sequence of the DMPK gene of a plurality of individuals carried out by the experimenter, a plurality of diagnostic information input to the database by the experimenter to a certain reference Can be classified according to.
  • the identification method of the present invention may further comprise a third screening step of profiling various information for the fetus positively screened in the second screening after the second screening (step (b)).
  • a profile of the incidence, severity, trait, clinical features, distribution, disease course, and related complications of the genetic disease was generated.
  • the method may further include generating a profile for the number of repetitions.
  • the identification method of the present invention selects 35 -49 times the number of CTG sequence repeat in the positive individuals of the third screening test as a carrier of myotonic dystrophy, 50 times -99 times
  • screening may be additionally selected as the second risk group of myotonic dystrophy in 100 -999 times, and the third risk group of myotonic dystrophy in 1000 or more cases.
  • the method of the present invention may further include displaying the results of the above-described first to third screening on the screen of the computer processor with the screen display.
  • the present invention is a type 1 myotonic dystrophy type (Myotonic dystrophy type
  • a method for identifying a patient with type 1 myotonic dystrophy using a diagnosis method or a computer processor is provided.
  • the method of the present invention can be applied to the diagnosis of various dominant or recessive genetic diseases in which three specific genes and specific nucleotide sequence abnormalities are problematic as an early diagnosis method for genetic diseases in which there is no effective prevention method except for early pregnancy. have.
  • the method of the present invention can accurately determine the risk of the disease by numerically providing the carrier or degree of disease morbidity for the fetus.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for diagnosing type 1 myotonic dystrophy by the diagnostic method of the present invention in pregnant or reproductive women.
  • Figure 2 is a neonatal type 1 by the diagnostic method of the present invention Schematic diagram showing the diagnosis of myotonic dystrophy.
  • Figure 3 shows the flow of the database by the computer-implemented identification method of type 1 myotonic dystrophy patients of the present invention.
  • a type 1 myotonic dystrophy was diagnosed in pregnant women or women of childbearing age who visited Yonsei University Gangnam Severance Hospital (Seoul, Korea). Blood samples were taken from the subject group and used for diagnosis. DNA was isolated from the blood samples using the Roche's 'High Pure PCR Template Preparation Kit' according to the manufacturer's protocol, and the extracted DNA was stored at -20 ° C until used for testing. Polymerase chain reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • DM1-F 5'-GAA GGG TCC TTG TAG CCG GGA A-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • DM1-R S'-FAM-GGA GGA TGG AAC ACG GAC GG-3 '(SEQ ID NO: 2 order)
  • Fluorescein which is a fluorescent substance, was attached to the primer to confirm the size of the amplification product.
  • 2.5 yL of forward primer, 2.5 uL of reverse primer, 1 ⁇ -300 ng of DNA sample), distilled water, dNTP 4 yL, formamide 1.5, and 0.5 tiL of Expanded High Fidelity were mixed, 1 95 ° C. (5 minutes, 1 time) ; 2 94 ° C (1 min)-60 ° C (1 min)-72 ° C (1 min) (28 times); 3 polymerase chain reaction was performed under the condition of 60 ° C. (60 minutes).
  • the amplification products of the DMPK gene obtained by the polymerase chain reaction were analyzed by capillary electrophoresis.
  • a 10-fold dilution of PCR amplification product, 1 iiL, 10 ill of formamide, and 0.3 ⁇ L of R0X standard were heated at 95 ° C for 2 minutes, immediately angled on ice, ABI 3130x1 genetic analyzer (Applied Biosystems, USA) After being mounted on, capillary electrophoresis was performed.
  • Amplification products were sized by using a GeneScan Analysis program to compare the size of the mixed R0X standard.
  • a semiquantitative multiple polymerase chain reaction is performed to determine whether the result is from a normal homozygous allele or a normal heterozygous allele of a patient with type 1 myotonic dystrophy. Performed the law.
  • Amelogenin gene is a gene having a constant amount and can be used as a suitable standard for relatively comparative quantification of the DMPK gene which may have a homozygous or heterozygous value.
  • the reaction conditions and methods of the semi-quantitative multiple polymerase chain reaction method are described in detail in Korean Patent No. 10-1117798.
  • the components, concentrations and reaction conditions of the semiquantitative polymerase chain reaction method are as follows:
  • DMPK-GS-F 5 '-FAM-GAAGGGTCOTGTAGCCGGGAA-3' (SEQ ID NO: 1)
  • DMPK-GS-R 5'-GGAGGATGGAACACGGACGG-3 '(SEQ ID NO: 2 Sequence)
  • Amelogenin— GS-F 5' -FAM-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3 '(SEQ ID NO: 3 Sequence)
  • Amelogenin-GS-R 5'-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3 '(SEQ ID NO: 4 sequence)
  • the polymerase reactions included dNTP (200 mM), MgC12 (1.25 mM), Expanded high fidelity buffer (Roche Diagnostic) 2.5 y L, Expanded high fidelity (Roche Diagnostic) 0.75 uL, dimethyl sulfoxide (DMSO) 5%, primers: each 400 nM, DNA sample: 1 ng, 1 95 ° C. (5 min, 1 time); 2 94 ° C (1 min)-60 ° C (1 min)-72 ° C (1 min) (28 times); 3 It was carried out under reaction conditions of 60 ° C (60 minutes).
  • ROX standard was prepared by combining HiDi formamide (Applied Biosystems, USA) 900 and 500 ROX size standard (Applied Biosystems) 30.
  • the mixture of R0X Standard 10 and 1 yL of the amplified product obtained above was heated at 95 ° C for 2 minutes, cooled immediately on ice, mounted on an ABI 3130x1 Genetic Analyzer (Appl ied Biosystems), and subjected to capillary electrophoresis. .
  • the size and amount of amplification products were determined using a GeneScan Analysis program (Ap Ied Biosystems) compared to the mixed R0X standard.
  • CTG sequence repeat-primed polymerase chain reaction (CTG repeat—primed PCR)
  • CTG sequence repeat-primed polymerase chain reaction was performed using DNA isolated from the target population.
  • the primers used in the polymerase chain reaction are primers capable of more specifically amplifying the CTG repeat sequence in the DMPK gene, and the sequence is as follows:
  • DMPK-P1-F 5'-FAM-GGGGCTCGAAGGGTCOTGT-3 '(SEQ ID NO: 6 Sequence)
  • DMPK-P4CAG-R 5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGACAGCAGCAGCAGCAGCAG-3 '
  • DMPK-P3-R 5 1 -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • the amplification product of the DMPK gene obtained by the polymerase chain reaction was analyzed by capillary electrophoresis. 1 uL of 10-fold dilution of PCR amplification product, 10 uL of formamide, and 0.3 iiL of R0X standard are combined. After heating at 95 ° C for 2 minutes, immediately cooled on ice, mounted on an ABI 3130x1 genetic analyzer (Applied Biosystems, USA), and then capillary electrophoresis was performed. Amplification products were sized using a GeneScan analysis program to compare with the size of the mixed standard. Screening for Patients with Type 1 Myotonic Dystrophy
  • patients with type 1 myotonic dystrophy were selected as follows:
  • the CTG repeat sequence of the DMPK gene 3'-UTR region was 34 or less times and one peak was observed and was positive for screening test, but alleles amplified more than 35 times in the detailed test were not found. If not, it was determined as a negative inspection.
  • Example 1 For pregnant women determined to be positive in Example 1, a diagnosis of type 1 myotonic dystrophy was performed, and samples of chorionic, amniotic fluid or umbilical cord blood of the pregnant woman were collected and used for diagnosis.
  • fetal type 1 myotonic dystrophy is more likely to occur when the number of repetitive sequences of the DMPK gene 3′-UTR region is 50 or more.
  • the number of repeat sequences in the 3'-UTR region of the DMPK gene was 34 or less and one peak was observed. If not, it was determined as a negative inspection.
  • type 1 myotonic dystrophy is more likely to occur when the number of repeat sequences in the 3'-UTR region of the DMPK gene is 50 or more times.
  • 50-99 episodes are more likely to develop mild disease, and 100-999 trials are more likely to be typical type 1 myotonic dystrophy patients, and 1000 or more cases are more likely to be congenital myotonic dystrophy patients. It was.

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Abstract

본 발명은 제 1 형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type 1)의 진단방법 또는 컴퓨터 프로세서를 이용한 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 동정방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 임신 초기 예방 외에는 효과적인 예방방법이 없는 유전질환에 대한 조기 진단방법으로서, 특정 유전자의 특정 염기 반복서열 이상이 문제되는 다양한 우성 유전 또는 열성 유전질환의 진단 방법에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, DDMPK 유전자 3' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수에 따라, 보인자, 제 1 위험군 내지 제 3 위험군의 대상으로 분류하여 향후 발생될 증후와 관련된 적절한 조치가 가능하다. 특히, 본 발명의 방법은 태아에 대한 보인자 또는 질환 이환 정도를 수치적으로 제공하여 질환의 위험도를 정확히 파악할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법 【기술분야】
본 특허출원은 2013년 4월 18일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10— 2013-0042873호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
제 1 형 근긴장성 이영양증은 한국인에서 가장 흔히 발생하는 유전성 근육질환으로， 근육긴장증 (myotonia)과 진행성 근력 약화를 특징으로 하는 상염색체 우성 유전질환이다. 이 질환은 근육과 관련된 증상과 함께, 심장, 눈， 내분비기관， 소화기관 및 중추신경계 등 여러 기관의 이상을 초래하는 특징을 가진다 (Harper PS et al . , DG M. Myotonic dystrophy, in Engel AG, Franzini -Armstrong C (eds)： Myology (ed3) . In. New York: NY, McGraw Hill Professional, 2004:1039-76). 원인 유전자에 따라 제 1 형 및 제 2 형 근육긴장성 이영양증 (DM type 1, 2, DM1, DM2)으로 분류된다. 제 1 형 근긴장성 이영양증은 DMPK (Dystrophia Myotonics Protein Kinase)를 부호화하는 19번 염색체에 존재하는 유전자의 3ᅳ 비번역 부위에서 CTG 삼염기 서열이 비정상적으로 증가하여 발현되며， 제 2 형 근긴장성 이영양증는 3번 염색체의 장완 (3Q21)에 위치하는 징크 핑거 단백질 9 (ZNF9) 유전자의 인트론 1의 CCTG사염기의 불안정한 확장에 의해 발생한다. 특히， 제 1 형 근긴장성 이영양증은 주로 성인이 된 이후에 신체적 장애가 나타나며， 이에 따라 이미 증상이 발현한 환자 또는 질환이 진단된 환자의 가족에 대해서 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단이 시행되어 왔다. 종래에는 DMPK 유전자의 변이 정도를 분자생물학적 방법을 이용해 확인함으로써 질환을 진단하는 방법이 연구되어 왔으며， 주로 PCR 또는 서든블럿을 이용한 방법이 사용되었다.
한편， 제 1 형 근긴'장성 이영양증은 특별한 증상이 없으나， 20- 30대의 성인기에 주로 증상이 발현되므로, 상염색체우성 형태로 자손에게 유전되므로 조기 진단 및 예방이 중요하다. 종래 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단방법은 이미 증상이 발현한 환자 또는 질환이 진단된 환자의 가족에 대해서 진단이 시행되어 왔으나, 이 질환은 보인자의 판단 및 후손에게 유전될 위험성을 판단하는 것이 더욱 중요하다.
따라서， 가임기 여성 및 태아에게 있어서의 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단이 중요하며, 본 발명의 진단방법은 질환의 이환 가능성 및 중증도를 예측하여 보다 적극적인 대비를 할 수 있도록 한다. 제 1 형 근긴장성 이영양증은 유전병으로서 임신 전 또는 암신 초기 예방 외에는 효과적인 예방방법이 없으므로 이에 대한 단 방법의 확보가 필요한 실정이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 톡허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 제 1 형 근긴장성 이영양증의 조기 진단을 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과， DMPK 유전자의 CTG 반복서열이 증가된 대립유전자를 가지고 있는 보인자 또는 증상이 경미한 환자가 자녀를 출산하였을 때. CTG 반복서열이 증폭되어 질환이 발생함을 이용하여， 임산부, 가임기 여성 또는 신생아의 대상집단으로부터 보인자 또는 경미한 증상을 가진 환자를 선별검사로 찾아낸 후 태아에 대한 검사를 시행하여 질환 이환 여부를 판정하는 진단 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1)의 진단방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1) 환자의 컴퓨터一실행 (computer一 implemented) 동정방법 (identification method)을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여， DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 다음의 단계를 포함하는 진단방법을 제공한다:
(a) 임산부, 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체 (individual)를 선별하는 단계로서， 상기 제 1 진단검사는 상기 대상집단의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3 ' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고， ( i ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자 (allele)가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자 (homozygote)인 경우， 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 각각 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자 (heterozygote)인 경우 양성으로 판단하며, (ii) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 경우 음성으로 판단하고， Uii) 그 외의 경우 양성으로 판단하며; 및
(b) 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 제 2 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계로서， 상기 제 2 진단검사는 상기 단계 (a)의 양성 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3 ' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고， ( i ) 상기 제 1 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성으로 판단되었으나, 제 2 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 경우 음성으로 판단하고， (ii) 상기 제 1 진단검사의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 증 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단한다. 본 발명자들은 제 1 형 근긴장성 이영양증의 조기 진단을 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, DMPK 유전자의 CTG 반복서열이 증가된 대립유전자를 가지고 있는 보인자 또는 증상이 경미한 환자가 자녀를 출산하였을 때 CTG 반복서열이 증폭되어 질환이 발생함을 이용하여, 임산부， 가임기 여성 또는 신생아의 대상집단으로부터 보인자 또는 경미한 증상을 가진 환자를 선별검사로 찾아낸 후 태아에 대한 검사를 시행하여 질환 이환 여부를 판정하는 진단방법을 개발하였다.
본 발명의 진단방법은 상염색체 우성질환 (autosomal dominant disorder)인 제 1 형 근긴장성 이영양증 뿐만 아니라, 유전자의 이상을 통해 이환되는 다른 유전질환의 선별에도 적용될 수 있으며， 이로써 유전질환의 진행에 따른 합병증 또는 후천적 획득 장애에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 진단방법은 '제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 진단방법' 으로 기재되어 있으나, 이는 제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 방법' 또는 '체외로 분리된 동물의 생물학적 시료 내 DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 확인하는 단계를 포함하는 제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1)의 진단방법' 으로도 표현될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "생물학적 시료" 는 체외로 분리된 동물의 생체 시료로서， 혈액, 혈장， 혈청， 뇨, 세포， 모발 또는 조직 시료를 의미하며， 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 모발 또는 구강점막세포이다. 한편， 진단 대상 (subect)이 태아인 경우， 상기 생물학적 시료는 융모막 양수， 태반 또는 제대혈을 포함한다. 본 명세서에서 용어 "핵산" 은 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며， 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980)； Uhlman 및 Peyman , Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 아래에서 이와 같은 본 발명의 방법에 따른 제 1 형 근간장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1)의 진단방법에 대하여 구체적으로 설명한다:
단계 (a) ： 제 1 진단검사
우선, 임산부， 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체 (individual)를 선별한다. 상기 제 1 진단검사는 상기 대상집단의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3 ' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시된다. 즉， DMPK 유전자 3 ' 비번역부위에 대한 증폭반웅을 통하여 CTG서열의 반복 여부 및 반복 회수를 측정할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "증폭반웅" 이란 유전자 (gene) 또는 핵산 분자를 증폭하는 반웅을 의미한다. 다양한 증폭 반웅들이 당업계에 보고되어 있으며， 이는 중합효소 연쇄반웅 (이하 PCR이라 한다) (미국 특허 제 4, 683, 195, 4,683,202, 및 4,800， 159호)， 역전사-중합효소 연쇄반: §· (이하 RT— PCR로 표기한다) (Sambrook 등， Molecular Cloning. A Laboratory Manual 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) , Miller, H. I. (W0 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329, 822)의 방법, 리가아제 연쇄 반웅 (ligase chain reaction; LCR)(17, 18)， Gap-LCR(W0 90/01069)， 복구 연쇄 반웅 (repair chain reaction; EP 439,182)， 전사一중재 증폭 (transcript ion— mediated amplification; TMA)(19) (W0 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제 (self sustained sequence replication) (20) (W0 90/06995) , 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭 (selective amplification of target polynucleotide sequences) (미국 특허 제 6,410,276호)， 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반웅 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR) (미국 특허 제 4，437，975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반웅 (arbitrari ly primed polymerase chain react ion; APᅳ PCR) (미국 특허 게 5,413,909호 및 제 5, 861, 245호), 핵산 염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA) (미국 특허 제 5, 130,238호， 제 5,409, 818호， 거 15, 554,517호， 및 거 ]6,063,603호), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리 -중재 항온성 증폭 ( loop-mediated isothermal amplification; LAMP 23)를 포함하나， 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제 5,242,794， 5,494,810, 4，988，617호 및 미국 특허 제 09/854, 317호에 기술되어 있다.
중합효소연쇄반웅 (PCR)은 가장 잘 알려진 유전자 또는 핵산 증폭 방법으로， 그의 많은 변형과 웅용들이 개발되어 있다. 본 발명의 진단방법에는 전통적인 PCR 방법 뿐 아니라， PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시킨， 터치다운 (touchdown) PCR(24) , 핫 스타트 (hot start) PCR(25, 26)， 네스티드 (nested) PCR(2) 및 부스터 (booster) PCR(27)을 이용할 수 있다. 또한， 실시간 (real—t ime) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR) , cDNA 말단의 신속 증폭 (rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응 (inverse polymerase chain reaction: IPCR) , 백토레트 (vectorette) PCR, TA I L-PCRC thermal asymmetric interlaced PCR) 및 멀티플렉스 PCR을 사용할 수도 있다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J. , 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer— Ver lag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 진단 방법은 상술한 유전자 증폭방법 이외에 흔성화법 (hybridization), 면역분석법 (immunoassay) 또는 마이크로어레이 (microarray)를 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 진단방법에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 DMPK
(dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자 3 ' 비번역부위의 CTG 반복 서열에 대하여 상보적인 서열을 가진다. 본 명세서에서 용어 "상보적 (complementary)" 은 어떤 특정한 흔성화 (hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 DMPK 유전자 3 ' 비번역부위의 CTG 반복 서열에 선택적으로 흔성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 "상보적" 은 용어 완전 상보적 (perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 DMPK 유전자 3 ' 비번역부위의 CTG 반복 서열에 선택적으로 흔성화할 수 있을 정도이면， 하나 또는 그 이상의 미스매치 (mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
프로브의 표지는 흔성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며， 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단 (예컨대， 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythr in) , 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단， 자기입자， 방사능동위원소 (P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소 (알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제)， 조인자, 효소에 대한 기질， 중금속 (예컨대， 금) 그리고 항체， 스트렙타비딘 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법， 예컨대， 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert Methods in Enzymology, 65 :499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광， 방사능, 발색 측정, 증량 측정， X-선 회절 또는 흡수， 자기, 효소적 활성， 매스 분석, 결합 친화도， 흔성화 고주파， 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 방법에서 CTG 서열반복은 상술한 중합효소연쇄반웅의 반웅결과물을 유전자스캔 분석 (GeneScan Genetic Analysis)함으로써 확인할 수 있다. 유전자스캔 분석에서 두 개의 피크 (peak)가 관찰되는 경우 두 개의 대립유전자가 모두 확인된 이형접합자 (heterozygote)로 판단하며， 한 개의 피크가 관찰되면 동형접합자 (homozygote)로 판단한다.
본 발명의 방법에 따르면， ( i ) DMPK의 2개 대립유전자 (allele)가
CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자 (homozygote)인 경우, 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 각각 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자 (heterozygote)인 경우 양성으로 판단하며， (ii) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 경우 음성으로 판단하고， (iii) 그 외의 경우 양성으로 판단한다. 단계 (b) ： 제 2 진단검사
이어, 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 게 2 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별한다. 제 2 진단검사는 단계 (a)의 양성 개체에 대한 정밀검사를 실시하는 단계로서, 상기 단계 (a)의 양성 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3 ' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시된다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면， 상기 제 2 진단검사는 DNA-DNA 흔성화법인 서든블롯 또는 삼염기 반복-증폭법 (triplet repeat- primed PCR, TP PCR)을 이용할 수 있다.
삼염기 반복-증폭법에 대한 자세한 내용은， Radvansky 외 Effect of Unexpected Sequence Interrupt ions to Conventional PCR and Repeat Primed PCR in Myotonic Dystrophy Type 1 Testing, Diagnostic Molecular Pathology (2011)； 및 국제특허 공개공보 W0 2011/097503에 기재되어 있으며， 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 방법에 따르면， ( i ) 상기 제 1 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성으로 판단되었으나， 제 2 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 경우 음성으로 판단하고， (ii) 상기 제 1 진단검사의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단한다.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 단계 (b)에서 선별된 양성 개체가 임산부인 경우 태아에 대한 제 3 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계 (c)를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 제 3 진단검사는 상기 태아의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3 ' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고， ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 경우 음성으로 판단하고， (ii) 상기 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단한다.
본 발명의 일 예에 따르면， 본 발명의 진단방법은 상기 제 3 진단검사의 양성 개체에서 CTG 서열 반복 회수가 35회 -49회인 경우 근긴장성 이영양증의 보인자로 판단하고， 50회 -99회인 경우 경증 질환 발생 가능성이 높은 경우로서 근긴장성 이영양증의 제 1 위험군으로 판단하며; 100회 -999회인 경우 전형적인 제 1형 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높은 경우로서 근긴장성 이영양증의 제 2 위험군으로 판단하고; 1000회 이상인 경우 선천성 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높은 경우로서 근긴장성 이영양증의 제 3 위험군으로 판단하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 제 1 위험군은 제 1 형 근긴장성 이영양증의 발병 가능성이 100% 이나 20대부터 70대에 발병하며 증상이 경미하고 백내장 등의 합병증이 나타날 수 있는 집단이고 제 2 위험군은 발병 가능성이 100% 이나 10대부터 30대에 발병하며 전형적인 근긴장증과 근육 위약이 나타나고， 백내장， 부정맥 등의 합병증이 대부분 나타나는 집단이며， 제 3 위험군은 발병 가능성이 100% 이면서 신생아 시기에 근긴장도 저하， 호흡 곤란, 지능 지체 둥이 나타날 수 있으며， 대개 10세 이전에 전형적인 근긴장증이 발생하는 집단을 의미한다.
태아에 대한 제 3 진단검사는 융모막, 양수, 제대혈 등으로부터 핵산 (DNA)를 분리하는 과정을 포함하며， 분리된 핵산으로부터 태아의 DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 CTG 반복서열의 횟수를 확인하기 위한 PCR 또는 써든블롯 검사 과정을 포함한다. 또한, 태아의 정확한 CTG 반복서열 확인을 위해 임산부 및 생물학적 부친의 DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 CTG 반복서열 횟수를 확인하는 과정을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음을 포함하는 제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1) 환자의 컴퓨터- 실행 (computer— implemented) 동정 방법 ( identi f icat ion method)을 제공한다:
(a) 컴퓨터 프로세서를 이용하여, 임산부， 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체 (individual)를 선별하는 단계로서, 상기 제 1 선별은 ( i ) DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase)의 2개 대립유전자 (al lele)의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자 (homozygote)인 개체, 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 각각 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자 (heterozygote)인 개체를 양성 개체로 선별하며， (ii) 상기 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 개체를 음성 개체로 선별하고， (iii) 그 외의 경우를 양성 개체로 선별하며; 및
(b) 컴퓨터 프로세서를 이용하여, 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 제 2 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계로서, 상기 제 2 선별은 ( i ) 상기 게 1 선별에서 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성 개체로 판단되었으나 제 2 선별에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 개체를 음성 개체로 선별하고， (ii) 상기 게 1 선별의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 개체를 양성 개체로 선별한다.
본 발명의 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 컴퓨터- 실행 (computer -implemented) 동정 방법은 상술한 본 발명의 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단방법과 동일하게， DMPK (dystrophia myotonica- protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 방법을 이용한 동정방법으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어 "컴퓨터 프로세서" 는 실험자에 의해 수행된 다수 개체의 DMPK 유전자의 CTG 반복 서열과 관련된 다수의 진단정보를 처리하는 장치로서, 실험자에 의해 데이터베이스에 입력된 다수의 진단정보를 일정 기준에 의거하여 분류할 수 있다.
본 발명의 동정방법은 상기 제 2 선별 (단계 (b))이후에 제 2 선별에서 양성으로 선별된 태아에 대하여 다양한 정보를 프로파일링하는 제 3 선별 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 즉, 제 2 선별에서 양성으로 선별된 태아에 대하여 유전질환의 발병 가능성, 중증도， 형질， 임상양상, 분포， 질병 경과 및 관련 합병증에 대한 프로파일을 생성시키고， 음성으로 선별된 태아에 대하여 유전질환의 발병 가능성， 보인자 여부 및 CTG 서열의 반복 회수에 대한 프로파일을 생성시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 본 발명의 동정방법은 상기 제 3 선별진단검사의 양성 개체에서 CTG 서열 반복 회수가 35회 -49회인 개체를 근긴장성 이영양증의 보인자로 선별하고, 50회 -99회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 1 위험군으로 선별하며， 100회 -999회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 2 위험군으로 선별하고， 1000회 이상인 경우 근긴장성 이영양증의 제 3 위험군으로 선별하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 상술한 계 1 선별 내지 제 3 선별에 의한 결과를 화면표시기가 있는 컴퓨터 프로세서의 화면에 표시하는 단계 추가적으로 포함할 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type
1)의 진단방법 또는 컴퓨터 프로세서를 이용한 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 동정방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 방법은 임신 초기 예방 외에는 효과적인 예방방법이 없는 유전질환에 대한 조기 진단방법으로세 특정 유전자와 특정 염기 반복서열 이상이 문제되는 다양한 우성 유전 또는 열성 유전질환의 진단 방법에 적용될 수 있다.
(c) 본 발명의 방법에 따르면， DMPK 유전자 3 ' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 희수에 따라， 보인자, 제 1 위험군 내지 계 3 위험군의 대상으로 분류하여 향후 발생될 증후와 관련된 적절한 조치가 가능하다.
(d) 특히， 본 발명의 방법은 태아에 대한 보인자 또는 질환 이환 정도를 수치적으로 제공하여 질환의 위험도를 정확히 파악할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 임산부 또는 가임기 여성을 대상으로 본 발명의 진단방법에 의한 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 신생아 대상으로 본 발명의 진단방법에 의한 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 컴퓨터- 실행 (computer- implemented) 동정 방법에 의한 데이터 베이스의 흐름을 나타낸 것이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1: 임산부 또는 가임기 여성 대상의 제 1 형 근긴장성 이영양증 선별검사
DNA 시료 준비
연세대학교 강남 세브란스 병원 (서울， 대한민국)을 내원한 임산부 또는 가임기 여성을 대상으로 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단을 실시하였으며, 상기 대상집단으로부터 혈액 샘플을 채취하여 진단에 이용하였다. 로슈 (Roche)사의 'High Pure PCR Template Preparation Kit' 를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 상기 혈액 샘플로부터 DNA를 분리하였으며, 추출된 DNA는 검사에 사용하기 전까지 -20°C에서 넁동 보관하였다. 중합효소연쇄반웅 (Polymerase chain reaction)
DMPK 유전자 3' 비번역부위 (untranslated region, UTR)의 CTG 반복서열의 횟수를 확인하기 위해， 상기 대상집단으로부터 분리한 DNA를 이용하여 중합효소연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머는 DMPK 유전자내의 CTG 반복서열을 선택적으로 증폭할 수 있는 프라이머로서 그 서열은 다음과 같다:
DM1-F: 5'-GAA GGG TCC TTG TAG CCG GGA A - 3' (서열목록 제 1 서열)
DM1-R: S'-FAM-GGA GGA TGG AAC ACG GAC GG - 3' (서열목록 제 2 서열)
상기 프라이머에는 증폭산물의 크기를 확인할 수 있도록 형광물질인 플로레신 (Fluorescein, FAM)을 부착하였다. 상기 정방향 프라이머 2.5 yL, 역방향 프라이머 2.5 uL, DNA 시료 1 μ ~300 ng), 증류수， dNTP 4 yL, 포름아미드 1.5 및 Expanded High Fidelity 0.5 tiL를 흔합하여, ① 95°C(5분， 1 회); ② 94°C(1분) - 60°C(1분) - 72°C(1분) (28회); ③ 60°C(60분)의 조건으로 중합효소 연쇄반웅을 수행하였다.
상기 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DMPK 유전자의 증폭산물을 모세관 전기영동법을 이용하여 크기를 분석하였다. 10 배로 회석한 PCR 증폭산물 1 iiL와 포름아미드 10 ill, 및 R0X 스탠다드 0.3 μ L를 흔합하여 95°C에서 2분간 가열한 후， 얼음 위에서 즉시 넁각하여， ABI 3130x1 유전 분석기 (Applied Biosystems, 미국)에 장착한 후， 모세관 전기영동을 수행하였다. 유전자스캔 분석 프로그램 (GeneScan Analysis program)을 이용하여， 흔합된 R0X 스탠다드의 크기와 비교함으로써 증폭산물을 크기를 결정하였다. 다중중합효소 연쇄반웅 (Mult即 lex polymerase chain reaction)
상기 유전자스캔 검사결과 한 개의 피크가 확인된 경우, 정상 동형접합체 대립유전자에서 비롯된 결과인지 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 한쪽 정상 이형접합체 대립유전자에 의한 결과인지 확인하기 위하여 반정량 다중중합효소 연쇄반웅법을 수행하였다.
DMPK 유전자의 정량을 위한 기준 유전자로서 아멜로제닌 (Amelogenin) 유전자 (GenBank accession No. 匪_001143.1)를 사용하여 다중중합효소 연쇄반응법을 시행하였다. 아멜로제닌 유전자는 항상 일정한 양을 가지는 유전자로 동형접합체 또는 이형접합체의 값을 가질 수 있는 DMPK 유전자를 상대적으로 비교 정량하기에 적절한 표준물질로 사용될 수 있다. 반정량 다중중합효소 연쇄반웅법의 반웅조건 및 방법에 대해서는 대한민국 등록특허 제 10-1117798호에 자세히 기재되어 있다.
반정량 다중중합효소 연쇄반웅법의 구성물과 농도 및 반웅조건은 다음과 같다:
< 프라이머 > DMPK-GS-F: 5 ' -FAM-GAAGGGTCOTGTAGCCGGGAA-3 ' (서열목록 제 1 서열)
DMPK-GS-R: 5 ' -GGAGGATGGAACACGGACGG-3 ' (서열목록 제 2 서열) 아멜로제닌— GS-F： 5 ' -FAM-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3 ' (서열목록 제 3 서열)
아멜로제닌 -GS-R: 5'-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3' (서열목록 제 4 서열)
증합효소 반웅은 dNTP(200 mM), MgC12(1.25 mM) , Expanded high fidelity 버퍼 (Roche Diagnostic) 2.5 y L, Expanded high fidelity (Roche Diagnostic) 0.75 uL, 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 5%, 프라이머: 각각 400 nM, DNA 시료: 1 ng의 조성으로， ① 95°C(5분， 1 회); ② 94°C(1분) - 60°C(1분) - 72°C(1분) (28회); ③ 60°C(60분)의 반웅조건으로 수행하였다.
PC 증폭산물을 이용한 유전자 스캔을 위하여， HiDi 포름아미드 (Applied Biosystems, 미국) 900 과 500 ROX size standard (Applied Biosystems) 30 을 흔합하여 ROX 표준물질을 제조하였다.
R0X 표준물질 10 와 상기 얻어진 증폭산물 1 yL의 흔합물을 95°C에서 2분간 가열한 후 얼음 위에서 즉시 냉각하여, ABI 3130x1 Genetic Analyzer(Appl ied Biosystems)에 장착한 후， 모세관 전기영동을 시행하였다. GeneScan Analysis program(Ap l ied Biosystems)을 이용하여 흔합된 R0X 스탠다드와 비교하여 증폭산물의 크기 및 양을 결정하였다.
기준유전자로 사용된 아멜로제닌에 대한 DMPK 유전자의 상대 정량값을 구하여， 동형접합체임을 이미 알고 있는 정상 시료의 정량값과 비교함으로써， 시험된 시료에서 얻어진 결과가 동형접합체에서 증폭된 결과인지 환자의 정상 이형접합체 대립유전자가 증폭된 결과인지 확인하였다. 서든블롯 (Southern blot analysis)
상기 유전자스캔 분석 결과， 양성으로 판단된 개체에 대하여 서든블롯을 이용한 정밀검사를 수행하였다. 상기 중합효소연쇄반웅의 증폭산물을 아가로스 젤 상에서 분리한 후， 상기 아가로스 젤을 니트로셀를로스 필터에 흡착시켜 DNA를 필터 상에 고정하였다. 이어， 상기 필터를 방사성 동위원소 (32P)로 표지한 프로브 (서열목록 제 5 서열)와 흔성화 (hybridization)한 후， 필름을 X-선에 노출시켜 방사선으로 감광된 밴드를 확인하였다.
확인 결과， 정상적인 크기의 9 kb 또는 10 kb 크기의 밴드 한 개가 관찰되거나, 9 kb와 10 kb 크기의 밴드 2개가 관찰되는 경우 양쪽 대립유전자가 모두 정상 범위 삼염기 반복서열 횟수를 포함하는 것으로 판단하였다. 또한， 9kb 또는 10 kb 크기의 정상 대립유전자 한 개와, 10 kb 보다 큰 크기의 밴드가 함께 확인되는 경우， 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자로 확진하였다.
CTG서열 반복 -primed 중합효소연쇄반웅 (CTG repeat— primed PCR)
상기 유전자스캔 분석 결과, 양성으로 판단된 개체에 대하여 CTG서열 반복 -primed 중합효소연쇄반웅을 이용한 정밀검사를 수행하였다.
DMPK 유전자 3' 비번역부위 (untranslated region, UTR)의 CTG 반복서열의 횟수를 확인하기 위해， 상기 대상집단으로부터 분리한 DNA를 이용하여 CTG서열 반복 -primed 중합효소연쇄반웅을 실시하였다. 중합효소 연쇄반웅에 사용된 프라이머는 DMPK 유전자내의 CTG 반복서열을 보다 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머로서 그 서열은 다음과 같다:
DMPK-P1-F: 5 ' -FAM-GGGGCTCGAAGGGTCOTGT-3 ' (서열목록 제 6 서열) DMPK-P4CAG-R: 5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGACAGCAGCAGCAGCAGCAG-3 '
(서열목록 제 7 서열)
DMPK-P3-R: 51 -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 ' (서열목록 제 8서열) 상기 정방향 프라이머 P1-F 2 uL, 역방향 프라이머 P4CAG-R 0.5 uL, 역방향 프라이머 P3-R 1.5 ill, DNA 시료 1 μί(~300 ng)， 증류수, dNTP 4 pL, betaine 1M 및 Expanded High Fidelity 0.5 yL를 흔합하여， ① 95°C(15분, 1 회); ② 94°C(1분) - 65 °C(1분) - 72 °C(2분) (34회); ③ 72°C(15분)의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
상기 중합효소 연쇄반웅으로 얻어진 DMPK 유전자의 증폭산물을 모세관 전기영동법을 이용하여 크기를 분석하였다. 10 배로 회석한 PCR 증폭산물 1 uL와 포름아미드 10 uL, 및 R0X 스탠다드 0.3 iiL를 흔합하여， 95°C에서 2분간 가열한 후， 얼음 위에서 즉시 냉각하여， ABI 3130x1 유전 분석기 (Applied Biosystems, 미국)에 장착한 후, 모세관 전기영동을 수행하였다. 유전자스캔 (GeneScan) 분석 프로그램을 이용하여， 흔합된 표준물질의 크기와 비교함으로써 증폭산물을 크기를 결정하였다. 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자의 선별
상기 유전자스캔 분석 결과 및 정밀검사 결과를 이용하여, 다음과 같이 제 1 형 근긴장성 이영양증 환자를 선별하였다:
<제 1 선별 >
① 유전자스캔 분석 결과에서, DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 CTG 반복서열이 34회 이하이면서 두 개의 피크 (peak)가 관찰되어 두 개의 대립유전자가 모두 확인된 이형접합자 (heterozygote)인 경우 선별검사 음성으로 판정하였다.
② 유전자스캔 분석 결과에서， DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 CTG 반복서열이 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되면 선별검사 양성으로 관정하였다. 또한, 34회 이하인 피크 한 개와 35회 이상인 피크 한 개가 각각 관찰되는 경우도 선별검사 양성으로 판정하였다. 선별검사 양성인 경우 정밀검사를 시행하였다. 정밀검사는 임산부 또는 가임기 여성의 혈액， 모발, 구강점막세포 등으로부터 분리한 DNA로부터 써든블롯 또는 CTG 반복서열 특이 primer를 이용한 PCR (CTG repeat -primed PCR) 등의 방법으로 시행하는 검사를 포함한다 .
<제 2 선별 >
③ 유전자스캔 분석 결과에서， DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 CTG 반복서열이 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되어 선별검사 양성으로 판정되었으나， 정밀검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견되지 않은 경우 정밀검사 음성으로 판정하였다.
④ 유전자스캔 분석 결과에서, DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 CTG 반복서열이 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되어 선별검사 양성으로 판정되고 정밀검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견된 경우 정밀검사 양성으로 판정하였다. 또한 선별검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견되고 정밀검사에서도 재확인된 경우도 정밀검사 양성으로 판정하였다. 정밀검사 양성인 임산부의 경우 태아검사를 시행하였다. 실시예 2: 태아의 제 1 형 근긴장성 이영양증 선별검사
DNA 시료 준비 및 진단시험방법
상기 실시예 1에서 양성으로 판단된 임산부를 대상으로, 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단을 실시하였으며, 상기 임산부의 융모막, 양수 또는 제대혈의 샘플올 채취하여 진단에 이용하였다.
DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 CTG 반복서열의 흿수를 확인하기 위한 중합효소연쇄반웅올 이용한 유전자 스캔 분석, 서든블롯 및 CTG서열 반복- primed 중합효소연쇄반웅은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 제 1 형 근긴장성 이영양증 태아의 선별
① 태아의 유전자 스캔 분석에서， DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 흿수가 35회 이상으로 증가된 대립유전자가 관찰되지 않으면 태아검사 음성으로 판정하였고 제 1형 근긴장성 이영양증 위험은 낮다고 판정하였다.
② 태아의 유전자 스캔 분석에서， DMPK 유전자 3' -UT 부위의 반복 서열 횟수가 35회 이상으로 증가된 대립유전자가 관찰되면 태아검사 양성으로 판정하였고 게 1형 근긴장성 이영양증 위험은 높다고 판정하였다. ③ 태아의 유전자 스캔 분석에서， DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 횟수가 35-49회 범위에 해당될 경우 태아는 제 1형 근긴장성 이영양증의 보인자로 판정하였고 질환 발생 가능성은 낮다고 판정하였다.
④ 태아의 유전자 스캔 분석에서, DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 횟수가 50회 이상인 경우 태아의 게 1형 근긴장성 이영양증 발생 가능성이 높다고 판정하였다.
⑤ 태아의 유전자 스캔 분석에서， DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 흿수가 50-99회인 경우 경증 질환 발생 가능성이 높다고 판정하였고, 100-999회인 경우 전형적인 제 1형 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높다고 판정하였으며, 1000회 이상인 경우 선천성 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높다고 판정하였다. 실시예 3: 신생아의 제 1 형 근긴장성 이영양증 선별검사
DNA 시료 준비 및 진단시험방법
연세대학교 강남 세브란스 병원 (서울， 대한민국)을 출생 또는 내원한 신생아를 대상으로 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단을 실시하였으며, 상기 대상집단으로부터 혈액 샘플을 채취하여 진단에 이용하였다.
DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 CTG 반복서열의 횟수를 확인하기 위한 중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 스캔 분석， 서든블롯 및 CTG서열 반복- primed 중합효소연쇄반웅은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 제 1 형 근긴장성 이영양증 신생아의 선별
① 신생아의 유전자 스캔 분석에세 DMP 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 횟수가 34회 이하이면서 두 개의 피크가 관찰되어 두 개의 대립유전자가 모두 확인된 이형접합자 (heterozygote)인 경우 선별검사 음성으로 판정하였다.
② 신생아의 유전자 스캔 분석에세 DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 횟수가 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되면 선별검사 양성으로 판정하였다. 또한, 34회 이하인 피크 한 개와 35회 이상인 peak 한 개가 각각 관찰되는 경우도 선별검사 양성으로 판정하였다. 선별검사 양성인 경우 정밀검사를 시행할 수 있다. 정밀검사는 신생아의 혈액, 구강점막세포, 모발 등으로부터 분리한 핵산 (DNA)으로부터 써든블롯 또는 CTG 반복서열 특이 primer를 이용한 PCR (CTG repeat-primed PCR) 등의 방법으로 시행하는 검사를 포함한다 .
③ 신생아의 유전자 스캔 분석에서， DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 횟수가 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되어 선별검사 양성으로 판정되었으나 정밀검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견되지 않은 경우 정밀검사 음성으로 판정하였다.
④ 신생아의 유전자 스캔 분석에서， DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 횟수가 34회 이하이면서 한 개의 피크가 관찰되어 선별검사 양성으로 판정되고 정밀검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견된 경우 정밀검사 양성으로 판정하였다. 또한, 선별검사에서 35회 이상으로 증폭된 대립유전자가 발견되고 정밀검사에서 재확인된 경우도 정밀검사 양성으로 판정하였다.
⑤ 신생아의 유전자 스캔 분석에서， DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 횟수가 35-49회 범위에 해당될 경우 신생아는 제 1형 근긴장성 이영양증의 보인자로 판정하고 질환 발생 가능성은 낮다고 판정하였다.
⑥ 신생아의 유전자 스캔 분석에서， DMPK 유전자 3' -UTR 부위의 반복 서열 횟수가 CTG 반복서열이 50회 이상인 경우 게 1형 근긴장성 이영양증 발생 가능성이 높다고 판정하였다. 또한， 50-99회인 경우 경증 질환 발생 가능성이 높다고 판정하였고， 100-999회인 경우 전형적인 제 1형 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높으며， 1000회 이상인 경우 선천성 근긴장성 이영양증 환자가 될 가능성이 높다고 판정하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1)의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase) 유전자의 CTG 반복 서열을 검출하는 다음와 단계를 포함하는 진단방법:
(a) 임산부， 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체 (individual)를 선별하는 단계로서, 상기 제 1 진단검사는 상기 대상집단의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고， ( i ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자 (allele)가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자 (homozygote)인 경우, 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 각각 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자 (heterozygote)인 경우 양성으로 판단하며, (ii) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 경우 음성으로 판단하고， (iii) 그 외의 경우 양성으로 판단하며; 및
(b) 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 제 2 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계로서, 상기 제 2 진단검사는 상기 단계 (a)의 양성 개체의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고， ( i ) 상기 제 1 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성으로 판단되었으나, 제 2 진단검사에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 경우 음성으로 판단하고， (ii) 상기 제 1 진단검사의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단한다.
【청구항 2]
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (b)에서 선별된 양성 개체가 임산부인 경우 태아에 대한 제 3 진단검사를 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계 (C) 를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단방법으로서, 상기 제 3 진단검사는 상기 태아의 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 DMPK 유전자 3' 비번역부위의 CTG 서열의 반복 회수를 측정함으로써 실시되고, ( i ) 상기 DMPK의 2개 대립유전자가 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 경우 음성으로 판단하고， (ii) 상기 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 경우 양성으로 판단하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
【청구항 3]
제 2 항에 있어서， 상기 단계 (c)는 상기 제 3 진단검사의 양성 개체에서 CTG 서열 반복 회수가 35회 -49회인 경우 근긴장성 이영양증의 보인자로 판단하고， 50회 -99회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 1 위험군으로 판단하며， 100회 -999회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 2 위험군으로 판단하고， 1000회 이상인 경우 근긴장성 이영양증의 제 3 위험군으로 판단하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단방법,
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 생물학적 시료는 혈액， 혈장， 혈청， 뇨， 세포， 모발 또는 조직 시료인 것을 특징으로 하는 진단방법.
【청구항 5】
제 2 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 융모막, 양수, 태반 또는 제대혈인 것을 특징으로 하는 진단방법.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서, 상기 진단방법은 흔성화법, 유전자 증폭방법， 면역분석 방법 또는 마이크로어레이를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 진단방법 .
【청구항 7】 다음을 포함하는 제 1 형 근긴장성 이영양증 (Myotonic dystrophy type 1) 환자의 컴퓨터—실행 (computer-implemented) 동정 방법 (identification method):
(a) 컴퓨터 프로세서를 이용하여， 임산부, 가임기 여성 또는 신생아로 이루어진 대상집단에서 제 1 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체 (individual)를 선별하는 단계로서, 상기 제 1 선별은 ( i ) DMPK (dystrophia myotonica-protein kinase)의 2개 대립유전자 (al lele)의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자 (homozygote)인 개체， 또는 상기 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 각각 34회 이하 및 35회 이상인 이형접합자 (heterozygote)인 개체를 양성 개체로 선별하며， (ii) 상기 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 이형접합자인 개체를 음성 개체로 선별하고, (iii) 그 외의 경우를 양성 개체로 선별하며; 및
(b) 컴퓨터 프로세서를 이용하여， 상기 단계 (a)의 양성 개체에 대한 제 2 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계로서， 상기 제 2 선별은 ( i ) 상기 제 1 선별에서 DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 동형접합자로서 양성 개체로 판단되었으나， 제 2 선별에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견되지 않은 개체를 음성 개체로 선별하고， (ii) 상기 제 1 선별의 양성 개체에서 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 개체를 양성 개체로 선별한다.
【청구항 8】
제 1 항에 있어세 상기 동정방법은 상기 단계 (b)에서 선별된 양성 개체가 임산부인 경우, 컴퓨터 프로세서를 이용하여 태아에 대한 제 3 선별을 실시하여 양성을 나타내는 개체를 선별하는 단계 (C)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로서 , 상기 제 3 선별은 ( i ) DMPK의 2개 대립유전자의 CTG 서열의 반복 회수가 34회 이하인 개체를 음성 개체로 선별하고， (ii) 상기 DMPK의 2개 대립유전자 중 CTG 서열의 반복 회수가 35회 이상인 대립유전자가 발견된 개체를 양성 개체로 선별하는 것을 특징으로 하는 동정방법
【청구항 9】
제 8 항에 있어서, 상기 동정방법은 컴퓨터 프로세서를 이용하여 양성으로 선별된 태아에 대하여 유전질환의 발병 가능성, 중증도, 형질， 임상양상 분포， 질병 경과 및 관련 합병증에 대한 프로파일을 생성시키고， 음성으로 선별된 태아에 대하여 유전질환의 발병 가능성， 보인자 여부 및 CTG 서열의 반복 회수에 대한 프로파일을 생성시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동정방법.
【청구항 10】
제 8 항에 있어세 상기 동정방법은 컴퓨터 프로세서를 이용하여 상기 제 3 선별의 양성 개체에서 CTG 서열 반복 회수가 35회 -49회인 개체를 근긴장성 이영양증의 보인자로 선별하고, 50회 -99회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 1 위험군으로 선별하며， 100회 -999회인 경우 근긴장성 이영양증의 제 2 위험군으로 선별하고, 1000회 이상인 경우 근긴장성 이영양증의 제 3 위험군으로 선별하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동정방법 .
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