WO2014171116A1 - マラリア原虫感染症に対するワクチン製剤 - Google Patents

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WO2014171116A1
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protein
amino acid
acid sequence
vaccine preparation
csp
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義文 西川
黒田　泰弘
小島　直也
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国立大学法人帯広畜産大学
学校法人東海大学
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine preparation for malaria parasite infection. More specifically, the present invention relates to a vaccine preparation including a liposome preparation formed by encapsulating a soluble protein derived from a malaria parasite into a liposome having an oligosaccharide that can bind to a sugar chain recognition molecule on the surface of an antigen-presenting cell.
  • the malaria pathogen is a unicellular organism, Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum (P. vivax), Plasmodium falciparum (P. malariae), Plasmodium falciparum (P. There are four types of ovale). Malaria caused by Plasmodium falciparum is particularly severe.
  • An anti-malarial antibody is produced in a human host naturally infected with a malaria parasite.
  • a protective immunity humidity immunity
  • cellular immunity with sufficient memory characteristics is not elicited.
  • infection can occur many times, complicating disease treatment and prevention.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 2
  • Non-patent Document 3 discloses a subunit vaccine (peptide preparation).
  • DNA vaccines are known as vaccines that are very simple to handle, such as productivity and storage, compared to live vaccines. Since a DNA vaccine can be easily produced, it is possible to provide an improved vaccine quickly against a virus with a quick mutation.
  • Non-patent Document 4 an effective DNA vaccine for P. falciparum has not been developed yet.
  • the key to developing a malaria vaccine is to transmit a highly immunogenic antigen protein to the antigen-presenting cell, and induce sufficient antigen-specific antibody production and cellular immunity.
  • Patent Document 1 For the delivery of antigen protein, a method is known in which an antigen is encapsulated in a liposome having an oligosaccharide on its surface, such as an oligomannose sugar chain-coated liposome.
  • the inventors encapsulate a soluble antigen derived from Neospora caninum in a liposome having oligosaccharide on its surface, and immunize mice with this liposome, thereby significantly inducing Th1-type immunity against the neospora protozoa.
  • Patent Document 2 Non-Patent Document 9
  • An object of the present invention is to provide a safe vaccine preparation capable of inducing an effective immune response against malaria parasite infection and to improve the prevention effect of malaria parasite infection.
  • the present inventors have made liposomes having oligosaccharides on the surface, and among the conventionally known malaria parasite vaccine antigens, in particular, malaria parasite-derived soluble protein circumsporozoite protein (CSP) and It was clarified that by encapsulating merozoite surface protein 1 (MSP1), an immune response against malaria parasite can be effectively induced.
  • CSP malaria parasite-derived soluble protein circumsporozoite protein
  • the present invention is based on such findings, and CSP or MSP1 derived from malaria parasite, or an immunologically active variant or derivative thereof, or an immunologically active fragment thereof is converted to a sugar on the surface of an antigen-presenting cell.
  • the present invention relates to a liposome preparation in which an oligosaccharide capable of binding to a chain recognition molecule is encapsulated in a liposome having a surface thereof.
  • the immunologically active fragment is not particularly limited, and includes a fragment containing the C-terminal region of CSP or MSP1, or an immunologically active variant or derivative thereof, for example, the C-terminal 100 of CSP or MSP1.
  • a fragment containing at least 8 to 50 consecutive amino acid residues can be used.
  • the immunologically active fragment of CSP or an immunologically active variant or derivative thereof is a protein of any of the following (a) to (c).
  • the oligosaccharide used is preferably 2 to 11 sugar residues, more preferably 3 to 7 sugar residues, and most preferably 3 to 5 sugar residues.
  • Suitable oligosaccharides include sugar chains containing two or more mannoses.
  • the vaccine preparation provided by the present invention has a high preventive effect and at the same time the risk of side effects is reduced.
  • the vaccine of the present invention can deliver sufficient immunogenic antigen protein to the antigen-presenting cells in the affected area and induce sufficient Th1-type immunity and Th2-type immunity.
  • the life cycle of the Plasmodium parasite has a liver stage and an erythrocyte stage, and it is necessary to induce cellular immunity at the liver stage and humoral immunity (antibody production) at the erythrocyte stage.
  • humoral immunity antibody production
  • a vaccine capable of inducing immunity and preventing infection at two stages of the life cycle of the malaria parasite, erythrocytes and liver, using one type of carrier is provided.
  • the upper two graphs show left: IgG1 production (left) and IgG2a production (right) by CSP-encapsulated liposomes.
  • the bottom two graphs show left: IgG1 production (left) and IgG2a production (right) by TRAP encapsulated liposomes (- ⁇ -: CSP encapsulated liposome inoculation,- ⁇ -: TRAP encapsulated liposome inoculation,- ⁇ -: CSP + TRAP encapsulated liposome inoculation,- ⁇ -: liposome inoculation,- ⁇ -: CSP + TRAP inoculation).
  • CSP or MSP1 derived from Plasmodium or an immunologically active variant or derivative thereof is encapsulated in a liposome having an oligosaccharide that can bind to a sugar chain recognition molecule on the surface of an antigen-presenting cell.
  • the present invention relates to a liposome preparation and a vaccine preparation against Plasmodium infection containing the liposome preparation.
  • the present invention will be described in detail.
  • Plasmodium protozoa are eukaryotic unicellular microorganisms that are animal unicellular organisms that have the ability to exercise and prey. Parasites that are particularly pathogenic are often called protozoa to distinguish them from unicellular parasites. There are two types of protozoa with strong host specificity that can only be infested by humans (such as malaria parasites and isospora), and those that parasitize multiple animal species and cause common infectious diseases (such as dysentery amoeba and cryptosporidium). . Pathogenicity varies from lethal infection and severe symptoms to asymptomatic non-pathogenic. Protozoa parasitizing the digestive tract enter the human body through drinking water and food.
  • Infectious types vary depending on the type of protozoa, but include encapsulated cysts, oocysts, and spores. Shigella amoeba and rumble flagellates form cysts, coccidia form oocysts, and microsporidia form spores. Many protozoa parasitizing blood and tissues grow in the intestinal tract of certain blood-sucking insects and ticks and infect the human body using these as vectors.
  • Malaria parasite is a pathogen of malaria and is transmitted by Anopheles.
  • the protozoan parasite (P. knowlesi) is known.
  • the malaria parasite grows in Anopheles and collects in its salivary glands as sporozoites (those that have split out in the shell). Sporozoites are sent into the host body as the mosquito sucks blood, mature in the liver cells, and become thousands of merozoites (dividing bodies).
  • the proliferated merozoites destroy hepatocytes and invade red blood cells, divide, destroy red blood cells, and go out into the blood. The cycle in which this merozoite breaks erythrocytes and enters the blood is repeated. This destruction of red blood cells causes the periodic fever seen in malaria.
  • Malaria parasite antigens As malaria parasite antigens, various antigens such as TRAP, MSP1, MSP2, MSP4, MSP6, MSP7, MSP9, AMA1, CSP, LSA1, LSA3, and SERA are known. Some of them have already been tried to be used as vaccines, but as described above, their clinical effectiveness has not yet been confirmed.
  • the antigen used in the vaccine is highly immunogenic and difficult to avoid the host immune system.
  • an antigen in which an antigen gene constitutes a multigene family, or is devoted to gene polymorphism and changes its antigenicity to avoid the host immune system is not suitable for a vaccine.
  • CSP and MSP1 are used as antigens among various malaria parasite antigens, and encapsulated in liposomes to be described later, whereby two important stages in the life cycle of malaria parasites, ie, erythrocytes and liver, respectively.
  • Circumsporozoite protein (CSP) Circumsporozoite protein (CSP) is a sporozoite surface protein of the malaria parasite, and was identified and reported in 1980 by the group of Nussenzweig et al. Using a monoclonal antibody specific to the mouse malaria parasite P. berghei sporozoite. Later, it was revealed that it is a major target of infrared protective immunity and a widely distributed molecule in other malaria parasites.
  • MSP1 or CSP used in the present invention is not limited in amino acid length as long as it uses an amino acid sequence from the start codon to the stop codon. As described below, MSP1 or CSP fragments may be used as long as they are immunologically active.
  • the amino acid sequence of CSP derived from Plasmodium berghei (GenBank ID M43521, complete CDS) registered in GenBank is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of MSP1 derived from Plasmodium berghei (GenBank ID M28887,87complete CDS) registered in GenBank is shown in SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 4 the amino acid sequence of MSP1 derived from Plasmodium berghei (GenBank ID M28887,87complete CDS) registered in GenBank is shown in SEQ ID NO: 4.
  • one or several amino acids in the original amino acid sequence (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 in the case of CSP or MSP1 derived from Plasmodium berghei) May be a deleted, substituted or added sequence.
  • the term “several” means preferably 2 to 7, more preferably 2 to 5, and most preferably 2 to 3 amino acids.
  • the amino acid substitution is preferably conservative substitution between similar amino acid residues. For example, glycine (Gly) and proline (Pro), glycine and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine.
  • the original amino acid sequence for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 in the case of CSP or MSP1 derived from Plasmodium berghei
  • BLAST etc.
  • it may be a protein having a homology (identity) of about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, most preferably about 97%, about 98% or about 99% or more.
  • C-terminal 100 amino acid residues of CSP or MSP1 preferably C-terminal 80 residues, more preferably C-terminal 60 residues, and even more preferably C-terminal 50 residues, at least continuous 8 to 50 amino acid residues
  • a fragment containing 15 to 50 amino acid residues, more preferably 20 to 50 amino acid residues, still more preferably 30 to 50 amino acid residues can be used.
  • the CSP fragment derived from Plasmodium moberghei described above includes a fragment containing positions 186 to 332 of SEQ ID NO: 2, and a fragment containing positions 1608 to 1768 of SEQ ID NO: 4 as an MSP1 fragment was used in the examples described later. .
  • the CSP or MSP1 fragment may be the original amino acid sequence (for example, in the case of the above example, if it is a CSP derived from Plasmodium berghei, the CSP or MSP1 fragment is from position 186 of SEQ ID NO: 2). 332 or the amino acid sequence represented by positions 1608 to 1768 of SEQ ID NO: 4) and at least about when calculated using BLAST or the like (for example, using BLAST default or initial condition parameters) 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, most preferably about 97%, about 98% or about 99% or more It may be a protein having the homology (identity).
  • MSP1 or CSP 3.1 Preparation from malaria parasite
  • the preparation of MSP1 or CSP used in the present invention is based on a method of purifying from a natural product containing a soluble protein derived from malaria parasite, for example, from a malaria parasite by a general column work. Further, steps such as sugar chain removal partial degradation and modification of the obtained malaria parasite-derived soluble protein may be added as appropriate.
  • Recombinant Production Recombinant protein may be prepared by introducing and expressing the whole or part of the MSP1 or CSP gene of Plasmodium using microorganisms such as E. coli, animal cells, or plants.
  • a vector for producing a recombinant protein can be obtained by linking (inserting) a gene encoding MSP1 or CSP or a part thereof into a known vector.
  • the gene encoding MSP1 or CSP may be any gene as long as it encodes the amino acid sequence of MSP1 or CSP described above, and is appropriately optimized depending on the host described later.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the CSP gene derived from Plasmodium berghei registered in GenBank (GenBank ID M28887), which is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably SEQ ID NO: 1. Is used as long as it encodes MSP1 having a desired immunogenicity as well as a gene having a base sequence having a homology (identity) of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more. can do.
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the MSP1 gene derived from Plasmodium berghei registered in GenBank (GenBank ID U43521), which is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably SEQ ID NO: 3.
  • a gene having a base sequence having a homology (identity) of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more is also used as long as it encodes MSP1 having a desired immunogenicity. be able to.
  • the vector is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA.
  • the plasmid DNA include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), and yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24, YCp50, pYE52, etc.), plasmids for plant cell hosts (pBI221, pBI121) and the like, and phage DNA include ⁇ phage and the like.
  • animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can be used.
  • the purified DNA is cleaved with a suitable restriction enzyme, and inserted into a restriction vector site or a multicloning site of a suitable vector DNA and linked to the vector.
  • a suitable restriction enzyme e.g., a restriction enzyme for cleavage of a restriction vector site or a multicloning site of a suitable vector DNA and linked to the vector.
  • the gene of the present invention needs to be introduced by linking to a promoter corresponding to the host in such a manner that the gene can function.
  • the “functional aspect” means that the gene of the present invention arranged downstream thereof is appropriately expressed in the host and exerts its function by the promoter activity.
  • the type of promoter used is appropriately determined depending on the host cell, and details thereof will be described in the next section.
  • the vector of the present invention includes a promoter, the gene of the present invention, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a transformation marker gene (for example, a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance, if desired. Gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, bialaphos resistance gene, carboxin resistance gene, phleomycin resistance gene, etc.), ribosome binding sequence (SD sequence) and the like.
  • a transformation marker gene for example, a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance, if desired.
  • SD sequence ribosome binding sequence
  • a transformant for producing a recombinant protein can be obtained by introducing the vector into an appropriate host.
  • the host is not particularly limited as long as it can express the CSP or MSP1 gene of the present invention.
  • the genus Escherichia such as Escherichia coli
  • the genus Bacillus such as Bacillus subtilis
  • the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida
  • yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, animal cells such as Aspergillus oryzae, COS cells and CHO cells, or insect cells such as Sf9 and Sf21 Can be mentioned.
  • the vector of the present invention is capable of autonomous replication in the bacterium and at the same time comprises a promoter, a ribosome binding sequence, a gene of the present invention, and a transcription termination sequence. .
  • the gene which controls a promoter may be contained.
  • Escherichia coli include Escherichia coli HMS174 (DE3), K12, and DH1, and examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis MI is114, 207-21, and the like. .
  • the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in the above host such as Escherichia coli, and examples thereof include promoters derived from Escherichia coli and phages such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter and the like. An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used.
  • the method for introducing a vector into bacteria is not particularly limited. For example, a method using calcium ions [Cohen, SN et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114 (1972)] And electroporation method.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris and the like are used.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast.For example, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MF ⁇ 1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter, etc. Can be mentioned.
  • the method for introducing a vector into yeast is not particularly limited. For example, electroporation [Becker, DM et al .: Methods.
  • examples of the promoter include GlaA promoter (Hata et al. Curr. Genet., Vol 22, 85-91, 1992), AmyB promoter (Tuchiya et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 46, 1849-1853, 1992), No. 8 promoter (Ozeki et al. Biosci. Biotech. Biochem. Vol 60, 383-389, 1996).
  • the method for introducing a vector into Aspergillus is not particularly limited, and for example, an electroporation method, a calcium ion method, or the like can be used.
  • CSP or MSP1 protein can be obtained by culturing the aforementioned transformant (host cell) in an appropriate medium and collecting the desired protein from the culture.
  • the transformant may be cultured according to a conventional method.
  • a transformant having a microorganism such as Escherichia coli or yeast as a host
  • a natural medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the microorganism, and capable of efficiently culturing the transformant Alternatively, it may be cultured in a synthetic medium.
  • the cells when plant cells are used as a host, the cells may be cultured in a plant cell medium supplemented with vitamins such as thiamine and pyridoxine.
  • carbon source carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used.
  • nitrogen source ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor and the like are used.
  • monopotassium phosphate dipotassium phosphate
  • magnesium phosphate magnesium sulfate
  • sodium chloride ferrous sulfate
  • manganese sulfate copper sulfate
  • calcium carbonate calcium carbonate
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IAA Acrylic acid
  • Cultivation is usually carried out at about 30 to 37 ° C for about 6 hours to 3 days under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture.
  • the pH is maintained at about 7.0 to 7.5.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like.
  • the protein of the present invention is produced in cells or cells after culturing, the protein is extracted by disrupting the cells or cells.
  • the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like.
  • a partial fragment of CSP or MSP1 or a peptide fragment containing a T cell epitope may be produced by protein engineering or by peptide synthesis.
  • Liposome 4.1 Lipid Constituent Lipid The lipid constituting the liposome used in the present invention may be a normal lipid known to constitute a liposome.
  • natural lipids such as egg yolk, soybean, and other animals and plants are used.
  • examples include lipids derived from substances, those obtained by reducing the degree of unsaturation by hydrogenation, and those obtained by chemical synthesis. These can be used alone or in combination.
  • the amino group on the phospholipid is reacted with the aldehyde group of the oligosaccharide, so that the phospholipid used in the present invention preferably has an amino group, either alone or Two or more types can be used in combination.
  • the two fatty acid residues at the 1st and 2nd positions can be arbitrarily selected, and the fatty acid residues may be derived from natural products or synthetic products, mixed fatty acids, saturated fatty acids, Fatty acid residues having 4 to 30 carbon atoms derived from unsaturated fatty acids, polymerizable fatty acids and the like can be used.
  • Saturated fatty acids are preferably those having 12 to 24 carbon atoms, such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid and the like.
  • the unsaturated fatty acid preferably has 14 to 22 carbon atoms and 1 to 6 unsaturated bonds, and examples thereof include oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, and arachidonic acid.
  • phospholipids having an amino group those derived from natural products are preferably egg yolk or soybean-derived phospholipids.
  • Preferable examples include phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine or phosphatidylthreonine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylcholine and the like.
  • a membrane component of the liposome film-forming component
  • other compounds capable of forming liposomes can be used in addition to phospholipids having amino groups, as long as sugar chains can be introduced.
  • soybean lecithin, egg yolk lecithin , Phosphatidylglycerol, other phospholipids, cholesterol, fatty acids, fatty acid salts and the like conventionally used as membrane constituents of liposomes can be used.
  • sterols such as cholesterol (Chol), 3 ⁇ - [N- (dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (DC-Chol), N- (trimethylammonioethyl) carbamoylcholesterol (TC-Chol); Phosphatidylethanolamines such as palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE); phosphatidylcholines such as dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC); dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS), Phosphatidyl serines such as stearoyl phosphatidyl serine (DSPS); phosphatidic acids such as dipalmitoyl phosphatidic acid (DPPA) and distearoyl phosphatidic acid (DSPA) I can get lost.
  • Phosphatidylethanolamines such as palmitoylphosphatidyl
  • the liposome may be a multilayer type or a monolayer type.
  • the particle size of the liposome used in the present invention is not particularly limited, but is 0.1 to 3 ⁇ m, preferably 0.2 to 2.5 ⁇ m. This is because if the liposome particle size exceeds the above upper limit value, it will gel and cannot be used as a vaccine.
  • the particle size of the liposome can be adjusted according to a conventional method according to the administration form to be used, for example, by filtering with a filter having a desired pore size.
  • the liposome used in the present invention has an oligosaccharide on its surface that can bind to a sugar chain recognition molecule on the surface of an antigen-presenting cell.
  • antigen-presenting cells means macrophages, dendritic cells and the like.
  • Fc receptor Fc receptor
  • complement receptor scavenger receptor
  • mannose receptor LPS
  • lipopolysaccharide (LPS) receptor complement receptor CD11b / CD18 (CR3)
  • Toll-like receptor etc. It plays an important role directly or indirectly in phagocytosis of bacteria through chains, uptake of glycoproteins in foreign bodies and antigen presentation.
  • the oligosaccharide on the surface of the liposome is not particularly limited as long as it can bind to the above-mentioned sugar chain recognition molecule on the antigen-presenting cell surface.
  • sugar residue are D-mannose (D-Man), L- Fucose (L-Fuc), D-acetylglucosamine (D-GlcNAc), D-glucose (D-Glc), D-galactose (D-Gal), D-acetylgalactosamine (D-GalNAc), D-rhamnose (D -Rha).
  • OML-PbMSP1CT-PbTRAP indicates that the liposome has MSP1 protein produced as in Example 1 and oligosaccharide (Man3) encapsulating TRAP protein on its surface. It indicates that the liposome has oligosaccharide (Man3) with no protein encapsulated on its surface.
  • PbMSP1CT-PbTRAP refers to the MSP1 protein and TRAP protein produced as in Example 1.
  • Control indicates a phosphate buffer solution
  • OML-PbCSP is a liposome having an oligosaccharide (Man3) encapsulated in CSP protein prepared as in Example 1 on its surface.

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Abstract

　マラリア原虫感染症に対するワクチン製剤に関する。より詳しくは、マラリア原虫由来の可溶性タンパク質を抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合しうるオリゴ糖を表面に有するリポソームに封入してなるリポソーム製剤を含むワクチン製剤に関する。

Description

マラリア原虫感染症に対するワクチン製剤
　本発明は、マラリア原虫感染症に対するワクチン製剤に関する。より詳しくは、マラリア原虫由来の可溶性タンパク質を抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合しうるオリゴ糖を表面に有するリポソームに封入してなるリポソーム製剤を含むワクチン製剤に関する。
　マラリアは熱帯、亜熱帯地域の７０ヶ国以上に分布している原虫感染症である。全世界で年間３～５億人、累計で約８億人の患者がマラリア原虫に感染し、１００～１５０万人がマラリアで死亡すると報告されている。
　マラリアの病原体は単細胞生物であるマラリア原虫で、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、卵形マラリア原虫（P. ovale）の４種が存在する。特に熱帯熱マラリア原虫によるマラリアは症状が重い。
　マラリア原虫は、雌のAnopheles蚊に吸血されることにより伝染し、ヒト宿主に対してマラリア原虫のスポロゾイトを運ぶ。スポロゾイトは、血液により肝臓まで運ばれ、肝細胞中で増殖し、ライフサイクルの次の形態すなわちメロゾイトに変化する。感染肝細胞が破裂すると、メロゾイトは血流中に放出される。次にメロゾイトは赤血球に感染し、一部は、赤血球中で雄および雌の生殖母細胞になる。別の蚊が感染宿主を吸血すると、雄および雌の生殖母細胞を摂取し、雌の蚊の内部で融合しスポロゾイトになる。この蚊が次の宿主を吸血することで、スポロゾイトはさらに別の宿主に伝染する。
　マラリア原虫に自然感染したヒト宿主では、抗マラリア原虫抗体が産生される。しかし、抗体が産生されるだけで、防御的免疫性としてのマラリア原虫を中和する能力（体液性免疫）は持せず、十分な記憶特性を有する細胞性免疫も惹起されない。その結果として感染が何度も起こることがあり、疾患治療と予防を複雑化させている。
　マラリアワクチンとして最も高い防御効果が確認されているのは、感染型マラリア原虫であるスポロゾイトを放射線照射により不活化したワクチンである。しかし、生産に高度の施設が必要なため、開発途上地域においては普及に不向きである。そのため、強力且つ調製が簡易な新たなワクチンの開発が期待されている。しかし、ヒトマラリアは基本的には霊長類にしか感染しないため、ワクチンの有効性の確認は、サル・ヒトを用いた実験か、マウスマラリア原虫をマウスに感染させる模擬的実験によってしか行うことができない。従って、ヒトマラリアに対する新たなワクチンの開発は困難を極めている（非特許文献１、非特許文献２）。
　従って、上記不活化スポロゾイトワクチンと同等の効果を有する抗原タンパクを精製し、サブユニットワクチン（ペプチド製剤）として生産するのがより実用的であると考えられている。これまで、いくつかのマラリアワクチン候補分子が発見され、一部は臨床治験が開始されているが、有効性が確認されたとの報告はなされていない（非特許文献３）。
　また、生ワクチンと比較して、生産性や保存等の取り扱いが非常に簡便なワクチンとしてＤＮＡワクチンが知られている。ＤＮＡワクチンは容易に製造することが可能であるので、変異が早いウイルスに対して、速やかに改良型ワクチンを提供することが可能である。しかしながら、熱帯熱マラリアに対して有効なＤＮＡワクチンは未だ開発されていない（非特許文献４）。
　このように、現時点でマラリア原虫に対して有効なワクチンは得られていない。マラリアワクチン開発の鍵は、免疫原性の強い抗原タンパクをいかに抗原提示細胞まで伝達し、十分な抗原特異的抗体産生と細胞性免疫を誘導するかにある。
　抗原タンパクの送達については、オリゴマンノース糖鎖被覆リポソームのような、オリゴ糖を表面に有するリポソームに抗原を封入する方法が知られている（特許文献１、非特許文献５～８）。発明者らは、オリゴ糖を表面に有するリポソームにネオスポラ原虫（Neospora caninum）由来の可溶性抗原を封入し、このリポソームでマウスを免疫することで、ネオスポラ原虫に対するTh1型免疫を有意に誘導し、原虫の垂直感染と体内伝播を制御できることを報告している（特許文献２、非特許文献９）。しかしながら、マラリア原虫抗原ついては、未だこうした製剤化の試みはなされていない。
特開平７－１２６１８５号公報（特許第２８２８３９１号公報） 国際公開第２０１０／３２４０８号パンフレット
GoodらImmunity.2010.33:555-566. RichardsらImmunology and Cell Biology.2009.87:377-390. ButlerらTrends in Immunology.2012.33:247-254. HillらHuman Vaccines.2010.6:78-83. Shimizu et al., Parasite Immunol 2007, 29:229-239 横山直明ら、日本寄生虫学会大会プログラム・抄録集2006，67頁、I-D-04 Kuboki et al., J. Protozool Res., 2007, 17:9-15 Kuboki et al., J. Protozool Res., 2008, 18:1-10 Nishikawa et al., Clin Vaccine Immunol. 2009, 16:792-797.
　本発明の課題は、マラリア原虫感染に対して、効果的な免疫応答を誘導しうる、安全なワクチン製剤を提供し、マラリア原虫感染症の予防効果の向上を実現することにある。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、オリゴ糖を表面に有するリポソームに、従来公知のマラリア原虫ワクチン抗原のなかで、特にマラリア原虫由来可溶性タンパク質circumsporozoite protein (CSP)及びmerozoite surface protein 1 (MSP1)を封入することで、マラリア原虫に対する免疫反応を効果的に誘導できることを明らかとした。
　本発明は、係る知見に基づくものであり、マラリア原虫由来のCSP若しくはMSP1、又はその免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体、あるいはその免疫学的に活性な断片を、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合しうるオリゴ糖を表面に有するリポソームに封入してなるリポソーム製剤に関する。
　前記抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子としては、例えばマンノース・レセプターを挙げることができる。
　免疫学的に活性な断片は、特に限定されないが、CSP若しくはMSP1、又はその免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体のC末端領域を含む断片が挙げられ、例えば、CSP又はMSP1のC末端100アミノ酸残基のうち、少なくとも連続した8～50アミノ酸残基を含む断片を利用することができる。
　１つの態様において、CSPあるいはその免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体の免疫学的に活性な断片は、以下の(a)～（c）のいずれかのタンパク質である。
(a) 配列番号２の186位～332位に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b) 配列番号２の186位～332位に示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、マラリア原虫に対する免疫応答を誘導しうるタンパク質、
(c) 配列番号２の186位～332位に示されるアミノ酸配列と60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、マラリア原虫に対する免疫応答を誘導しうるタンパク質
　また、MSP1あるいはその免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体の免疫学的に活性な断片は、以下の(d)～（f）のいずれかのタンパク質である。
(d) 配列番号４の1608位～1768位に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
(e) 配列番号４の1608位～1768位に示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、マラリア原虫に対する免疫応答を誘導しうるタンパク質、
(f) 配列番号４の1608位～1768位に示されるアミノ酸配列と60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、マラリア原虫に対する免疫応答を誘導しうるタンパク質
　用いられるオリゴ糖は、２～１１の糖残基であることが好ましく、３～７の糖残基からなることがより好ましく、３～５の糖残基からなることがもっとも好ましい。
　好適なオリゴ糖としては、２以上のマンノースを含む糖鎖を挙げることができる。
　本発明のリポソーム製剤は、製薬上許容しうる担体とともに製剤化され、マラリア原虫感染症に対するワクチン製剤として利用される。本発明のワクチン製剤は、例えば皮下、皮内、静脈内、経口又は経鼻投与される。
　本発明で提供されるワクチン製剤は、高い予防効果を有すると同時に副作用の危険性が低減されている。本発明のワクチンは、免疫原性の強い抗原タンパクを患部の抗原提示細胞まで送達し、十分なTh1型免疫とTh2型免疫を誘導できる。
　マラリア原虫のライフサイクルには、肝臓ステージと赤血球ステージがあり、肝臓ステージでは細胞性免疫、赤血球ステージでは液性免疫（抗体産生）を誘導する必要がある。しかしながら、これまでのアジュバントやワクチン抗原キャリアは、２つのステージに対して、それぞれ別々のものを使用する必要があった。本発明によれば、１種類のキャリアを使用して、赤血球及び肝臓という、マラリア原虫のライフサイクルの２つのステージで免疫を誘導し、感染を阻止できるワクチンが提供される。
ワクチン接種後から赤内型原虫感染後３０日までの特異抗体産生を示した図である。上の２つのグラフは、左：MSP1封入リポソームによるIgG1産生（左）とIgG2a産生（右）を示す。下の２つのグラフは、左：TRAP封入リポソームによるIgG1産生（左）とIgG2a産生（右）を示す（-○-：MSP1封入リポソーム投与、-□-：TRAP封入リポソーム投与、-△-：MSP1+TRAP封入リポソーム投与、-▽-：リポソーム投与、-◆-：MSP1+TRAP投与、一番下の-○-：コントロール(PBS接種)）。 赤内型原虫感染後３０日間のマウスの生存率を示した図である（-○-：MSP1封入リポソーム接種、-□-：TRAP封入リポソーム接種、-△-：MSP1+TRAP封入リポソーム接種、-▼-：リポソーム接種、-◇-：MSP1+TRAP接種、一番下の-○-：コントロール(PBS接種)）。 ワクチン接種後からスポロゾイト感染後３０日までの特異抗体産生を示した図である。上の２つのグラフは、左：CSP封入リポソームによるIgG1産生（左）とIgG2a産生（右）を示す。下の２つのグラフは、左：TRAP封入リポソームによるIgG1産生（左）とIgG2a産生（右）を示す（-○-：CSP封入リポソーム接種、-□-：TRAP封入リポソーム接種、-△-：CSP+TRAP封入リポソーム接種、-▽-：リポソーム接種、-◆-：CSP+TRAP接種）。 スポロゾイト感染後３０日間のマウスの生存率を示した図である（-●-：CSP封入リポソーム接種、-■-：TRAP封入リポソーム接種、-▲-：CSP+TRAP封入リポソーム接種、上の-：リポソーム接種、下の-：CSP+TRAP接種、-□-：コントロール(PBS接種)）。 OML封入CSP接種によるCSP特異的抗体産生を示した図である。左から、OML-PbCSP, OML, PbCSP, None(未接種)。 OML封入CSP接種によるCSP抗原刺激後の脾臓細胞からのサイトカイン（IFN-γ）産生を示した図である。左から、OML-PbCSP, OML, PbCSP, None(未接種)。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１３－０８７４３１号の明細書に記載された内容を包含する。
　本発明は、マラリア原虫由来のCSP又はMSP1あるいはその免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体を、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合しうるオリゴ糖を表面に有するリポソームに封入してなるリポソーム製剤と前記リポソーム製剤を含むマラリア原虫感染症に対するワクチン製剤に関する。
　以下、本発明について、詳細に説明する。
１．マラリア原虫
　原虫（げんちゅう）とは真核単細胞微生物であって、運動能力や捕食能力を持つ動物的な単細胞生物である。単細胞の寄生虫と区別するため、寄生性で特に病原性のあるものを原虫と呼ぶことも多い。原虫には、ヒトにしか寄生できない宿主特異性の強い種類（マラリア原虫やイソスポーラなど）と、複数の動物種に寄生し、人畜共通の感染症を起す種類（赤痢アメーバやクリプトスポリジウムなど）がある。病原性は致死感染や重篤な症状を起すものから、無症状の非病原性のものまでさまざまである。消化管に寄生する原虫は、飲料水や食物を介して経口的に人体に侵入する。感染型は原虫の種類により異なるが、被嚢したシストやオーシスト、胞子（spore）などがある。赤痢アメーバやランブル鞭毛虫などはシストを、コクシジウム類はオーシストを、微胞子虫類は胞子を形成する。血液や組織に寄生する原虫の多くは特定の吸血昆虫やマダニの腸管で増殖し、これらを媒介者として人体に感染する。
　マラリア原虫は、マラリアの病原体で、ハマダラカによって媒介される。マラリア原虫としては、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、卵形マラリア原虫（P. ovale）の４種のほか、サルマラリア原虫（P. knowlesi）が知られている。マラリア原虫は、ハマダラカ内で増殖し、スポロゾイト（殻の中で分裂した胞子が外に出たもの）としてその唾液腺に集まる。スポロゾイトは蚊の吸血に伴って宿主体内に送り込まれ、その肝細胞内で成熟増殖し、数千個のメロゾイト（分裂小体）となる。増殖したメロゾイトは肝細胞を破壊して赤血球に侵入し、分裂して赤血球を破壊して血液中に出る。このメロゾイトが赤血球破壊し血中に出るサイクルは繰り返される。この赤血球の破壊が、マラリアで見られる周期的な発熱の原因となっている。
２．マラリア原虫抗原
　マラリア原虫抗原としては、TRAP、MSP1、MSP2、MSP4、MSP6、MSP7、MSP9、AMA1、CSP、LSA1、LSA3、SERAなど、種々のものが知られている。そのいくつかは、すでにワクチンとしての利用が試みられているが、前述のとおり、臨床における有効性は未だ確認されていない。
　ワクチンに使用する抗原は、免疫原性が強く、宿主免疫系を回避しにくいものが望まれる。例えば、抗原遺伝子が多重遺伝子族を構成したり、遺伝子多型に冨み、抗原性を変化させて宿主免疫系を回避する抗原はワクチンには適さない。
　本発明においては、様々なマラリア原虫の抗原のなかで、特にCSP及びMSP1を抗原として使用し、後述するリポソームに封入することで、それぞれ赤血球と肝臓というマラリア原虫のライフサイクルにおける２つの重要なステージにおいて、Th1型免疫とTh2型免疫の両方を誘導し、マラリアの感染・増殖を効果的に阻止できるワクチンが提供される。
　Circumsporozoite protein (CSP)
　Circumsporozoite protein (CSP)は、マラリア原虫のスポロゾイト表面タンパク質で、1980年にNussenzweigらのグループによりマウスマラリア原虫P. bergheiスポロゾイト特異的単クローン抗体を用いて同定・報告された。その後，赤外型の防御免疫の主要な標的であることや他のマラリア原虫に広く存在する分子であることが明らかになった。
　Merozoite surface protein 1 (MSP1)
　Merozoite surface protein 1 (MSP1)は、マラリア原虫のメロゾイト表面タンパク質で、分子量200Kの前駆体として合成され、メロゾイト表面で断片化され、メロゾイト表面で非共有結合的に会合しているが、メロゾイトが赤血球に侵入する際に放出される。MSP1は、メロゾイトの赤血球侵入に必要なタンパクであると考えられている。
　本発明で用いられるMSP1又はCSPは、その開始コドンから終止コドン内のアミノ酸配列を使用すれば、アミノ酸の長さは限定されない。後述のとおり、免疫学的に活性である限り、MSP1又はCSPの断片を用いてもよい。
　本発明で用いられるMSP1又はCSPの一例として、GenBankに登録されているPlasmodium berghei由来のCSPのアミノ酸配列（GenBank ID M43521, complete CDS）を配列番号２に示す。また、GenBankに登録されているPlasmodium berghei由来のMSP1のアミノ酸配列（GenBank ID M28887, complete CDS）を配列番号４に示す。各種マラリア原虫間での抗原アミノ酸配列の相同性は37～84％の開きがある。よって、これらの配列に示されるアミノ酸配列に限定されることなく、他のマラリア原虫由来のCSPやMSP1も用いることができ、その配列はいずれもGenBank等の公共のデータベースから容易に得ることができる。
　また、所望の免疫原性を有する限り、本来のアミノ酸配列（例えば、Plasmodium berghei由来のCSPやMSP1であれば、配列番号２あるいは配列番号４に表されるアミノ酸配列）において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加した配列であってもよい。なお、「数個」とは、好ましくは2～7個、より好ましくは2～5個、最も好ましくは2～3個のアミノ酸を意味する。また、アミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましく、例えば、グリシン（Gly）とプロリン（Pro）、グリシンとアラニン（Ala）たはバリン（Val）、ロイシン（Leu）とイソロイシン（Ile）、グルタミン酸（Glu）とグルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）とアスパラギン（Asn）、システイン（Cys）とスレオニン（Thr）、スレオニンとセリン（Ser）又はアラニン、リジン（Lys）とアルギニン（Arg）等のアミノ酸の間での置換を挙げることができる。
　あるいはまた、それが所望の免疫原性を有する限り、本来のアミノ酸配列（例えば、Plasmodium berghei由来のCSPやMSP1であれば、配列番号２あるいは配列番号４に表されるアミノ酸配列）と、BLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、少なくとも約60％以上、約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、特に好ましくは約95％以上、最も好ましくは約97％、約98％若しくは約99％以上の相同性（同一性）を有しているタンパク質であってもよい。
　すなわち、本発明にかかる「免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体」には、投与された生体内においてマラリア原虫に対する免疫応答活性を誘導しうる（例えば抗原性、受容体結合、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子によるペプチドの結合による複合体の形成等）限りにおいて、わずかな改変や修飾を有するMSP1又はCSPタンパク質が含まれる。また、MSP1又はCSPと他のペプチドとの融合タンパク質も、本発明にかかる「免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体」に含まれる。
　本発明では、免疫学的活性を有する限り、上記したCSP若しくはMSP1、又はその免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体の断片を使用することができる。使用する部位は特に限定されないが、CSPであれば、NANP repeat及びthrombospondin-like domainを含むC末端領域が好ましい（Cherif et al., Vaccine 2011; Ahlborg et al., Infection & immunity 2002; Hirunpetcharat et al., Immunity 1997; Wipasa et al., Infection & immunity 2009; Wan Omar et al., Tropical Biomedicine 2007.）。MSP1であれば、赤血球への侵入に不可欠なC末端領域が好ましい（Crompton et al., Science in medicine 2010； Schwartz et al., Malaria journal 2012.）。例えば、CSP又はMSP1のC末端100アミノ酸残基、好ましくはC末端80残基、より好ましくはC末端60残基、さらに好ましくはC末端50残基のうち、少なくとも連続した8～50アミノ酸残基、好ましくは15～50アミノ酸残基、より好ましくは20～50アミノ酸残基、さらに好ましくは30～50アミノ酸残基を含む断片を用いることができる。
　一例として、前述したPlasmodium berghei由来のCSP断片として、配列番号２の186位～332位を含む断片、MSP1断片として、配列番号４の1608位～1768位を含む断片を後述する実施例では使用した。
　CSPまたはMSP1断片は、所望の免疫原性を有する限り、本来のアミノ酸配列（例えば、上記の例であれば、配列番号２の186位～332位あるいは配列番号４の1608位～1768位に表されるアミノ酸配列）において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加した配列であってもよい。なお、「数個」とは、好ましくは2～7個、より好ましくは2～5個、最も好ましくは2～3個のアミノ酸を意味する。また、アミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましく、例えば、グリシン（Gly）とプロリン（Pro）、グリシンとアラニン（Ala）たはバリン（Val）、ロイシン（Leu）とイソロイシン（Ile）、グルタミン酸（Glu）とグルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）とアスパラギン（Asn）、システイン（Cys）とスレオニン（Thr）、スレオニンとセリン（Ser）又はアラニン、リジン（Lys）とアルギニン（Arg）等のアミノ酸の間での置換を挙げることができる。
　あるいはまた、CSPまたはMSP1断片は、それが所望の免疫原性を有する限り、本来のアミノ酸配列（例えば、上記の例であれば、Plasmodium berghei由来のCSPであれば、配列番号２の186位～332位あるいは配列番号４の1608位～1768位に表されるアミノ酸配列）と、BLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、少なくとも約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、特に好ましくは約95％以上、最も好ましくは約97％、約98％若しくは約99％以上の相同性（同一性）を有しているタンパク質であってもよい。
３．MSP1又はCSPの調製
３．１　マラリア原虫からの調製
　本発明で用いられるMSP1又はCSPの調製は、マラリア原虫由来可溶性タンパク質を含む天然物、例えばマラリア原虫から一般的なカラムワークで精製を行う方法によることができ、さらに得られたマラリア原虫由来可溶性タンパク質の糖鎖除去部分分解、修飾等の工程を適宜追加して行ってもよい。
３．２　組換え生産
　大腸菌などの微生物や動物細胞、植物を使用し、マラリア原虫のMSP1又はCSP遺伝子全体あるいは一部を導入・発現して組換えタンパク質を調製してもよい。
　組換えタンパク質作製のためのベクターは、公知のベクターにMSP1又はCSPをコードする遺伝子、又はその一部を連結（挿入）して得ることができる。
　MSP1又はCSPをコードする遺伝子は、前述したMSP1又はCSPのアミノ酸配列をコードするものであればよく、後述する宿主に応じて適宜最適化を行う。
　一例として、配列番号１に、GenBankに登録されているPlasmodium berghei由来のCSP遺伝子の塩基配列（GenBank ID M28887）を示すが、配列番号１と約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上、さらに特に好ましくは約95％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子も所望の免疫原性を有するMSP1をコードする限り使用することができる。
　また、配列番号３に、GenBankに登録されているPlasmodium berghei由来のMSP1遺伝子の塩基配列（GenBank ID U43521）を示すが、配列番号３と約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上、さらに特に好ましくは約95％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子も所望の免疫原性を有するMSP1をコードする限り使用することができる。
　前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110, pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13, YEp24, YCp50, pYE52等）、植物細胞宿主用プラスミド（pBI221, pBI121）等が挙げられ、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
　ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子が機能しうる態様で、宿主に応じたプロモーターに連結して導入される必要がある。ここで「機能しうる態様」とは、プロモーター活性によって、その下流に配置された本発明の遺伝子が宿主中で適切に発現され、その機能を発揮することをいう。使用されるプロモーターの種類は、宿主細胞によって適宜決定されるが、その詳細は次項で説明する。
　本発明のベクターは、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、形質転換マーカー遺伝子（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、カルボキシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子等）、リボソーム結合配列（SD配列）等を含んでいてもよい。
　組換えタンパク質を生産するための形質転換体は、前記ベクターを適当な宿主に導入することにより得ることができる。宿主は、本発明のCSP又はMSP1遺伝子が発現できるものであれば特に限定されない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母、麹菌(Aspergillus oryzae)、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞等が挙げられる。
　大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明のベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)HMS174(DE3)、K12、DH1等が挙げられ、枯草菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)MI 114、207-21等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の上記宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。また、tacプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌へのベクターの導入方法は、特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)]や、エレクトロポレーション法等が挙げることができる。
　酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピヒア・パストリス等が用いられる。プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を挙げることができる。酵母へのベクターの導入方法は、特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-168 (1983)]等を挙げることができる。
　麹菌を宿主とする場合、プロモーターとしては、例えば、GlaA プロモーター（Hata et al. Curr. Genet., Vol 22, 85-91, 1992）、AmyB プロモーター（Tuchiya et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol 46, 1849-1853, 1992）、No. 8 プロモーター（Ozeki et al. Biosci. Biotech. Biochem., Vol 60, 383-389, 1996）が挙げられる。麹菌へのベクターの導入方法は、特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオン法等を用いることができる。
　CSP又はMSP1タンパク質は、前述の形質転換体（宿主細胞）を適当な培地で培養し、その培養物から所望のタンパク質を採取することによって得ることができる。形質転換体の培養は、常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる天然培地、あるいは合成培地で培養すればよい。また、植物細胞を宿主として用いている場合には、チアミン、ピリドキシン等のビタミン類を添加した植物細胞用の培地で培養すればよい。
　炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
　培地中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いたベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いたベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いたベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
　培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下、30～37℃位で6時間～3日間程度行う。培養期間中、pHは7.0～7.5程度に保持する。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、SDS-PAGE、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
　上記した方法のほか、CSP又はMSP1の部分配列や、Ｔ細胞エピトープを含むペプチド断片をタンパク質工学的に、或いはペプチド合成により作製してもよい。
４．リポソーム
４．１　リポソーム構成脂質
　本発明で用いられるリポソームを構成する脂質は、リポソームを構成することが知られている通常の脂質であればよく、例えば、卵黄、大豆、又はその他の動植物などの天然物由来の脂質やこれらを水素添加によって不飽和度を低下したもの、あるいは化学合成したものが挙げられ、これらを単独で又は複数組み合わせて使用することができる。
　後述するように、オリゴ糖導入では、リン脂質上のアミノ基とオリゴ糖の有するアルデヒド基を反応させるため、本発明で用いるリン脂質としてはアミノ基を有するものが好ましく、これらを単独で、又は二種以上組合せて使用できる。これらのリン脂質は１位、２位の２つの脂肪酸残基は任意に選択することができ、その脂肪酸残基は天然物由来又は合成品由来のいずれのものでもよく、混合脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、重合性脂肪酸などに由来する炭素数４～３０の脂肪酸残基を利用できる。飽和脂肪酸としては炭素数１２～２４のものが好ましく、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などがあげられる。また不飽和脂肪酸としては炭素数１４～２２、不飽和結合１～６のものが好ましく、例えばオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸などがあげられる。このようなアミノ基を有するリン脂質の中では、天然物由来のものとしては卵黄又は大豆由来のリン脂質が好ましい。好適な例としては、例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン又はホスファチジルスレオニン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリンなどがあげられる。
　リポソームの膜構成成分（膜形成成分）としては、糖鎖の導入が可能な限り、アミノ基を有するリン脂質の他にもリポソームを形成しうる他の化合物も使用でき、例えば大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルグリセロール、その他のリン脂質類、コレステロール、脂肪酸、脂肪酸塩など、従来からリポソームの膜構成成分として用いられているものが使用できる。
　具体的には、コレステロール（Chol）、3β-［N-（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）、N-（トリメチルアンモニオエチル）カルバモイルコレステロール（TC-Chol）などのステロール類；ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）などのホスファチジルエタノールアミン類；ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）などのホスファチジルコリン類；ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）などのホスファチジルセリン類；ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）などのホスファチジン酸類等が挙げられる。
　リポソームは、多層タイプであっても、単層タイプであってもよい。本発明において用いられるリポソームの粒径は特に限定されないが、0.1～3μm、好ましくは0.2～2.5μmである。リポソームの粒径が上記上限値を超えると、ゲル化してしまい、ワクチンとして使用できないからである。リポソームの粒径は、用いられる投与形態に応じて常法に従い、例えば所望の孔サイズのフィルターにより濾過することにより、調整することができる。
４．２　リポソーム表面のオリゴ糖
　本発明で用いるリポソームは、その表面に抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合可能なオリゴ糖を有する。ここで、「抗原提示細胞」とは、マクロファージ、樹状細胞等を意味する。抗原提示細胞の表面には、Fcレセプターや補体レセプター、スカベンジャーレセプター、マンノース・レセプター、リポ多糖（LPS）レセプター、補体レセプターでもある CD11b/CD18（CR3）、Toll様レセプターなどが存在し、糖鎖を介する細菌などの貪食や、外来異物中の糖蛋白質の取り込みと抗原提示に直接的あるいは間接的に重要な役割を果たしている。本発明にかかる「抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子」とは、前述したような抗原提示細胞表面に存在する糖鎖結合性のレクチン様の性質を有する分子全般を意味しており、その好適な例としてマンノース・レセプターを挙げることができる。
　リポソーム表面のオリゴ糖は、上述の抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子と結合可能なものであれば特に限定されず、構成する糖残基としては、Ｄ－マンノース（D-Man）、Ｌ－フコース（L-Fuc）、Ｄ－アセチルグルコサミン（D-GlcNAc）、Ｄ－グルコース（D-Glc）、Ｄ－ガラクトース（D-Gal）、Ｄ－アセチルガラクトサミン（D-GalNAc）、Ｄ－ラムノース（D-Rha）などが挙げられる。オリゴ糖は、Ｄ－マンノースを含む糖残基から成るハイマンノースタイプであることが好ましく、なかでもＤ－マンノースから成るものやＤ－マンノースとＤ－アセチルグルコサミンとからなるものが好ましく、特にＤ－マンノースのみから成るものが最も好ましい。Ｄ－マンノースから成るオリゴ糖としては、マンノビオース（Man2）、マンノトリオース（Man3）、マンノテトラオース（Man4）、マンノペンタオース（Man5）、マンノヘキサオース（Man6）、マンノヘプタオース（Man7）を挙げることができる。
　オリゴ糖を構成する各糖残基の結合は特に限定されず、α１→２結合、α１→３結合、α１→４結合、α１→６結合、β１→４結合等を挙げることができる。また、各糖残基は１つずつ直鎖状に結合していてもよいし、枝分かれ構造であってもよい。
　オリゴ糖を構成する糖残基の数は２～１１個が好ましく、特に３～１１個、なかでも３～５個程度がもっとも好ましい。
　リポソームの量に対するオリゴ糖の量はオリゴ糖の種類、封入しようとするマラリア原虫由来可溶性タンパク質の種類、リポソームの組合せ構造等により異なるが、一般に、リポソームを構成する脂質1mgに対して0.5μg～500μgである。
　リポソームへのオリゴ糖の導入は、上記オリゴ糖と脂質を結合して調製した人工糖脂質を用いて行うことができる。人工糖脂質は、オリゴ糖の有するアルデヒド基を、アミノ基を有するリン脂質と反応させてシッフ塩基を形成し、次にこのシッフ塩基を、常法に従い還元、好ましくは化学還元、例えばNaBH3CNにより還元することにより、オリゴ糖と脂質とを結合して調製できる（水落次男、糖質工学、224-232頁、1992）。次いで、この人工糖脂質を利用して、リポソームにオリゴ糖を導入する。人工糖脂質が水溶性で有機溶剤に十分溶解しない場合（例えば、人工糖脂質としてオリゴ糖（RN）とDPPEとの結合物（RN-DPPE）を用いるとき）には、これら（RN-DPPE）の水性溶液を調製し、これをリポソームと混合して、例えば4℃ないし80℃（好ましくは内封物質が変性しない温度）、室温もしくは相転移温度において0.5～120時間、例えば約24時間インキュベーションする。人工糖脂質が有機溶剤に溶解する場合には、人工糖脂質をリポソーム構成用脂質と共に、リポソーム製造過程において有機溶剤に溶解し、常法に従いリポソームを形成すればよい。なお、リポソーム表面へのオリゴ糖の結合は、抗原提示細胞表面に存在する糖鎖認識分子あるいはその一部を添加してリポソームの凝集反応が生じるか否かで調べればよい。
４．３　リポソームの製剤化
　本発明のリポソーム製剤は、上記リポソームに前述したCSP又はMSP1タンパク質を内封して製造される。内封されるCSP又はMSP1タンパク質の量は、特に限定されず、投与経路に応じて適宜調節可能であるが、一般的にリポソームに用いる脂質１mgに対して0.1μg～500μgであることが望ましい。
　前述のとおり、マラリア原虫のライフサイクルには、肝臓ステージと赤血球ステージがあり、肝臓ステージでは細胞性免疫、赤血球ステージでは液性免疫（抗体産生）を誘導する必要がある。しかしながら、これまでのアジュバントやワクチン抗原キャリアは、２つのステージに対して、それぞれ別々のものを使用する必要があった。本発明では、１種類のキャリア（抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合しうるオリゴ糖を表面に有するリポソーム）で、肝臓ステージと赤血球ステージの２つのステージに有効なワクチンが提供される。
５．ワクチン製剤
　本発明のワクチン製剤は、本発明のリポソーム製剤に製薬上許容しうる担体を適宜加えて、溶液又は懸濁液のいずれかの形態で、投与可能に調製される。本発明のワクチン製剤には、薬学的に受容可能であって、活性成分に適合した賦形剤がしばしば混合される。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの混合物が挙げられる。さらに、所望に応じて、ワクチンは、少量の補助剤（例えば加湿剤又は乳化剤）、pH緩衝剤、及び/又はワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、例えば以下を包含する。水酸化アルミニウム、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（thr-MDP）、Ｎ－アセチル－ノル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（CGP11637、nor-MDPと称せられる）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（CGP19835A、MTP-PEと称せられる）、及びRIBI。RIBIは、バクテリアから抽出した3成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、及び細胞壁骨格（HPL+TDM+CWS）を2％スクアレン/Tween（登録商標）80エマルジョン中に含有している。アジュバントの効能は、CSP又はMSP1から構成されるワクチンを投与することにより生じる、抗体の量を測定することにより決定され得る。
　本発明のワクチン製剤は、通常皮下注射、静脈内注射又は筋内注射のような、注射により投与される。他の投与態様に適切な別の処方としては、坐薬、及びある場合には経口、経鼻処方薬が挙げられる。
　所望により、アジュバント活性を有する1以上の化合物を加えることができる。アジュバントは、該免疫系の非特異的刺激因子である。それらは、ワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンE、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油及びCarbopolが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例えば、大腸菌（E. coli）易熱性毒素（LT）又はコレラ（Cholera）毒素（CT）が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、油性乳剤（例えば、Bayol（登録商標）又はMarcol 52（登録商標）のもの）、サポニン又はビタミンEソリュビリゼートが挙げられる。したがって、好ましい形態においては、本発明のワクチンはアジュバントを含む。
　例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内に投与する注射剤において、本発明のワクチンと製薬上許容される担体又は希釈剤の他の具体例には、安定化剤、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質、及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）などともに投与することができる。
　投与されるべき量は、通常投与当たり抗原を0.01μgから100,000μgまでの範囲であり、これは、処置される対象（たとえばヒト、豚、羊、山羊、ネコなどの哺乳動物や鳥類）、その対象の免疫系での抗体合成能、及び所望の防御の程度に依存し、経口、皮下、経鼻、皮内、筋肉内、静脈内投与経路などの投与経路にも依存する。
　本発明のワクチン製剤は、単独投与スケジュールで、又は好ましくは複合投与スケジュールで与えられ得る。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に1～10の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持する及び又は強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば２回目の投与として1～4ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引続き投与を行い得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。
　さらに本発明のワクチンは、新たなマラリア原虫感染に対し、予防的に使用してもよい。さらにまた、マラリア原虫に感染した対象に投与し、生体内にマラリア原虫に対する強い免疫反応を誘導することにより、マラリア原虫を排除する治療的ワクチンとして使用してもよい。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：マラリア原虫由来可溶性タンパク質の調製
　Merozoite surface protein 1 (MSP1, GenBank ID U43521、クローニング部位1608-1768アミノ酸), Thrombospondin-related adhesive protein (TRAP, GenBank ID U67763、クローニング部位239-530アミノ酸), Circumsporozoite protein (CSP, GenBank ID M28887、クローニング部位186-332アミノ酸)遺伝子をネズミマラリア原虫（Plasmodium berghei ANKA株）からクローニングし、その遺伝子を基に大腸菌にてglutathione S-transferase (GST)と融合した組換えタンパク質を発現させた。得られた組換えタンパク質は、Glutathione Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて精製し、thrombin protease (GE Healthcare社製)でGSTを除去した。さらに、Detoxi-GelTM Endotoxin Removing Gel（Pierce社製）を用いて、精製した組換えタンパク質からエンドトキシンを除去した。
　TRAPは肝臓ステージと赤血球ステージの両方でワクチン効果を有する抗原として知られている。一方、MSP1は赤血球ステージでの免疫活性が期待される抗原であり、CSPは肝臓ステージでの免疫活性が期待される抗原である。
実施例２：人工糖脂質の調製
　Manα1→6（Manα1→3）Manという構造を有するマンノトリオース（Man3）2.5～5mgに600μlの蒸留水を加えて攪拌溶解してオリゴ糖溶液を調製した。他方、クロロホルム／メタノール（1：1体積比）混合液にDPPEを5mg/mlの濃度で溶解してDPPE溶液を調製した。また、メタノールに、NaBH3CNを10mg/mlの濃度に溶解してNaBH3CN溶液を調製した。前記オリゴ糖溶液600μｌに前記DPPE溶液9.4 ml及び前記NaBH3CN溶液1 mlを加えて攪拌混合した。この反応混合液を60℃にて16時間インキュベートし、人工糖脂質を生成せしめた。この反応混合液をシリカゲルカラム及びC18逆相カラムにより精製することにより人工糖脂質M3-DPPEを得た。
実施例３：マラリア原虫タンパク質封入リポソームの調製
　コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、実施例２で作製したマンノトリオースジパルミトイルホスフファチジルエタノールアミン（M3-DPPE）をモル比で10：10：1、あるいは、コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）をモル比1：1で混合し、クロロホルム2 mlに溶解し、10 mlのナシフラスコ内で脂質フィルムを作製した。次に脂質フィルムに3.75mg/mlの実施例１で得られたトキソプラズマ由来可溶性タンパク質（含量0.5mg/ml）を加え、40℃の水槽でVortexにて、リポソームを作製した。次にこのリポソームを整粒装置のエクストルーダーを用いて、1μmのフィルターに0.2～1MPaの範囲で加圧しながら5回整粒を行った。次にリポソーム液を遠心法にて回収後、PBS(-)で3回懸濁、遠心、上清除去することでリポソームに封入されなかった抗原を除去した。得られたリポソームの分析は、コレステロール量、マラリア原虫由来可溶性タンパク質の測定をそれぞれ市販のキット、コレステロールＥテストワコー（和光純薬、439-17501）、Modified Lowry Protein Assay Reagent Kit（Pierce、23240）を用いて行った。
実施例４：マラリア原虫由来可溶性タンパク質封入リポソームのワクチン効果の検証
　以下の実施例で使用されているリポソーム封入体の略記について、「OML-PbMSP1CT」とは実施例１の様に作製したMSP1タンパク質を封入したオリゴ糖（Man3）を表面に持つリポソームであることを示し、「OML-PbTRAP」とは実施例１の様に作製したTRAPタンパク質を封入したオリゴ糖（Man3）を表面に持つリポソームであることを示し、「OML-PbMSP1CT-PbTRAP」とは実施例１の様に作製したMSP1タンパク質とTRAPタンパク質を封入したオリゴ糖（Man3）を表面に持つリポソームであることを示し、「OML」とはタンパク質を封入していないオリゴ糖（Man3）を表面に持つリポソームであることを示し、「PbMSP1CT-PbTRAP」とは実施例１の様に作製したMSP1タンパク質とTRAPタンパク質であることを示し、「Control」とはリン酸緩衝液であることを示し、「OML-PbCSP」とは実施例１の様に作製したCSPタンパク質を封入したオリゴ糖（Man3）を表面に持つリポソームであることを示し、「OML-PbCSP-PbTRAP」とは実施例１の様に作製したCSPタンパク質とTRAPタンパク質を封入したオリゴ糖（Man3）を表面に持つリポソームであることを示し、「PbCSP-PbTRAP」とは実施例１の様に作製したCSPタンパク質とTRAPタンパク質であることを示す。
　作製したワクチンの赤血球内型マラリア原虫へのワクチン効果を検証するために、赤内型マラリア原虫で発現が認められる原虫由来可溶性タンパク質（MSP1、TRAP）封入リポソーム(タンパク量で3 μg)、タンパク封入無しリポソーム及びPBSをBALB/cマウス（8週齢、メス）に2週間間隔で3回皮下接種した。3回目の接種から2週後にネズミマラリア原虫（Plasmodium berghei ANKA株）感染赤血球を100,000個、腹腔内接種した。感染後３０日間マウスの生存率を計測した。
　各実験群のマウスの抗体産生を測定したところ、OML-PbMSP1CT接種群と OML-MSP1CT-PbTRAP接種群においてワクチン接種期間で抗PbMSP1CT抗体の産生が認められ、OML-PbTRAP接種群とOML-MSP1CT-PbTRAP接種群においてワクチン接種期間で抗PbTRAP抗体の産生が認められた（図１）。
　各実験群のマウスについて30日間の生存率を比較したところ、OML-PbMSP1CT接種群と OML-MSP1CT-PbTRAP接種群において、マウスの生存期間の延長が認められ、最終的な生存率はそれぞれ33.3%と50%であった（図２）。その他の実験群では、感染後30日以内にすべての個体が死亡した。
　作製したワクチンについて肝臓ステージのマラリア原虫へのワクチン効果を検証するために、肝臓ステージのマラリア原虫で発現が認められる原虫由来可溶性タンパク質(CSP、TRAP)封入リポソーム(タンパク量で3μg)、タンパク封入無しリポソーム及びPBSをBALB/cマウス（8週齢、メス）に2週間間隔で3回皮下接種した。3回目の接種から2週後にネズミマラリア原虫（Plasmodium berghei ANKA株）のスポロゾイトを2,000個、皮下接種した。感染後30日間マウスの生存率を計測した。
　各実験群のマウスの抗体産生を測定したところ、OML-PbCSP接種群と OML-CSP-PbTRAP接種群においてワクチン接種期間で抗PbCSP抗体の産生が認められ、OML-PbTRAP接種群とOML-CSP-PbTRAP接種群においてワクチン接種期間で抗PbTRAP抗体の産生が認められた（図３）。
　各実験群のマウスについて30日間の生存率を比較したところ、OML-PbCSP接種群と OML-CSP-PbTRAP接種群において、マウスの生存期間の延長が認められ、最終的な生存率はともに60％であった（図４）。生存が確認されたマウスにおいて、赤血球内に存在するマラリア原虫は確認されなかった。その他の実験群では、感染後30日以内にすべての個体が死亡した。
　実施例５：CSP封入リポソームによる抗体産生及びサイトカン産生
　実施例４にしたがい、OML-PbCSP、OML単独、PbCSP単独、未接種（None）を準備し、それぞれBALB/cマウス（8週齢、メス）に2週間間隔で3回皮下接種した。
　各実験群のマウスの抗体産生を測定したところ、OML-PbCSP接種群においてワクチン接種期間でCSP特異的抗体（IgG1及びIgG2）産生の顕著な更新が認められた（図５）。このことから、OMLワクチン接種により、特異抗体の産生が誘導されることが確認された。
　各実験群のマウスの脾臓細胞からのIFN-γ産生を測定したところ、OML-PbCSP接種群においてCSP抗原刺激に対する顕著なIFN-γ産生が認められた（図６）。このことから、OMLワクチン接種により、抗原特異的な細胞性免疫が活性化されることが確認できた。
　実施例６：マラリア感染防御効果
　実施例４にしたがい、OML-PbCSP、OML-PbTRAP、OML-PbTRAP-PbCSP 、PbTRAP-PbCSP、PbCSP単独、OML-PBS（OML封入したPBS）、未接種（None）を準備し、それぞれBALB/cマウス（8週齢、メス）に2週間間隔で3回皮下接種した。3回目の接種から2週後にネズミマラリア原虫（Plasmodium berghei ANKA株）のスポロゾイトを2,000個、皮下接種した。接種後３０日目のマウスへの感染を調べた。結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　OMLワクチン接種マウス（OML-PbCSP）は、３回免疫により54-66.7%の感染防御効果（マウスマラリア原虫の感染が成立しない）を示した。このことから、OMLワクチンが新規マラリアワクチンとして使用しうる可能性が示された。　
　これらのことから、マラリア原虫由来可溶性タンパク質として、MSP1あるいはCSPを封入したオリゴ糖リポソームは、皮下投与によりマラリア原虫感染を防御できることが明らかとなった。本実施例の結果から明らかなように、従来公知のすべてのワクチン抗原が本発明のオリゴ糖リポソーム系に利用可能なものではなく、本実施例によって初めて有効な抗原が特定できた。
　これまでのマラリアに対するワクチン製剤は、原虫抗原にmonophosphoryl lipid Aやサポニンなどのアジュバントを加えること、ポックスウイルス（modified vaccinia virus Ankara, new fowlpox FP9 strain）をベクターに使用することで防御免疫を誘導した結果がある。しかしこれらの成果は、アジュバントによる非特異免疫による副作用やウイルスを使用することによる安全性の問題が懸念される。本発明のマラリア原虫由来可溶性タンパク質を封入したオリゴ糖リポソームは、リポソーム内に抗原を封入したシンプルな設計でありその他のアジュバントの添加は必要としない。また、オリゴ糖リポソーム自体が感染性を持たないため、安全性が高い。従って、マラリア原虫由来可溶性タンパク質を封入したオリゴ糖リポソームは、安全性の面で大きな利点を持つ。
　また、マラリアの肝臓と赤血球の２つのステージに対するワクチン製剤は、それぞれ別々のアジュバントやワクチン抗原キャリアを使用する必要があった。本発明では、オリゴ糖リポソームをキャリアにすることで、マラリア原虫のライフサイクルの２つのステージ（赤血球と肝臓）に対応できるワクチンの開発が可能となった。したがって、本発明のマラリア原虫由来可溶性タンパク質を封入したオリゴ糖リポソームは、マラリアに対する効果的なワクチンとして利用できる。
　本発明にかかるリポソーム製剤は、安全で高い免疫誘導効果を有し、マラリア原虫感染症に対するワクチンとして有用である。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims (11)

  1. 　マラリア原虫由来の抗原たんぱく質circumsporozoite protein (CSP)若しくはmerozoite surface protein 1 (MSP1)、又はその免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体、あるいはその免疫学的に活性な断片を、抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子に結合しうるオリゴ糖を表面に有するリポソームに封入してなるリポソーム製剤を含むマラリア原虫感染症に対するワクチン製剤。
  2. 　免疫学的に活性な断片が、CSP若しくはMSP1、又はその免疫学的に活性な変異体若しくは誘導体のC末端領域を含む断片である、請求項１に記載のワクチン製剤。
  3. 　免疫学的に活性な断片が、CSP又はMSP1のC末端100アミノ酸残基のうち、少なくとも連続した8～50アミノ酸残基を含む断片である、請求項１に記載のワクチン製剤。
  4. 　免疫学的に活性な断片が、以下の(a)～（c）のいずれかである、請求項１に記載のワクチン製剤。
    (a) 配列番号２の186～332位に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
    (b) 配列番号２の186～332位に示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、マラリア原虫に対する免疫応答を誘導しうるタンパク質、
    (c) 配列番号２の186～332位に示されるアミノ酸配列と60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、マラリア原虫に対する免疫応答を誘導しうるタンパク質
  5. 　免疫学的に活性な断片が、以下の(d)～（f）のいずれかである、請求項１に記載のワクチン製剤。
    (d) 配列番号４の1608～1768位に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
    (e) 配列番号４の1608～1768位に示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、マラリア原虫に対する免疫応答を誘導しうるタンパク質、
    (f) 配列番号４の1608～1768位に示されるアミノ酸配列と60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、マラリア原虫に対する免疫応答を誘導しうるタンパク質
  6. 　前記抗原提示細胞表面の糖鎖認識分子がマンノース・レセプターである、請求項１～５のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
  7. 　前記オリゴ糖が２～１１の糖残基からなる、請求項１～６のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
  8. 　前記オリゴ糖が３～５の糖残基からなる、請求項１～７のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
  9. 　前記オリゴ糖が２以上のマンノース糖残基を含むものである、請求項１～８のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
  10. 　さらに製薬上許容しうる担体を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
  11. 　皮下、皮内、経口、腹腔又は経鼻投与されるものである、請求項１０に記載のワクチン製剤。
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