WO2014134968A1 - 吡咯酮并吡唑类化合物及其作为药物的用途 - Google Patents

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WO2014134968A1
WO2014134968A1 PCT/CN2014/000195 CN2014000195W WO2014134968A1 WO 2014134968 A1 WO2014134968 A1 WO 2014134968A1 CN 2014000195 W CN2014000195 W CN 2014000195W WO 2014134968 A1 WO2014134968 A1 WO 2014134968A1
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bromophenyl
phenyl
propyl
dihydropyrrole
pyrazole
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PCT/CN2014/000195
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张万年
缪震元
庄春林
盛春泉
姚建忠
吴岳林
郭子照
李锦�
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中国人民解放军第二军医大学
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    • A61K31/4178—1,3-Diazoles not condensed 1,3-diazoles and containing further heterocyclic rings, e.g. pilocarpine, nitrofurantoin
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Definitions

  • the present invention belongs to the field of medical technology, and in particular, is a pyrrolidone pyrazole compound and its use as a drug, particularly in the preparation of an antitumor drug. Background technique
  • the p53 protein is a tumor suppressor protein whose inactivation is closely related to 50% to 60% of cancers.
  • the reason may be that the transcriptional activation domain of p53 tumor suppressor protein is linked to a cell carcinoma protein, such as a gene (murine double minute 2, MDM2) that was first discovered in the amplification of a double minichromosome gene in a mouse cell line, in murine and Many tissues of human (homologous gene is HDM2) are expressed (Michael SC, et al. Regulation of p53 stability and activity in response to genotoxic stress [J]. Mvta Res, 2000, 462: 179-188.).
  • MDM2 murine double minute 2
  • HDM2 homologous gene
  • p53 can activate MDM2 transcription, which in turn can inhibit p53 activity and form an autoregulatory feedback loop. Both P 53 and MDM 2 are in a low level under normal conditions. Abnormal expression of MDM2 in tumor cells leads to rapid degradation of p53 due to its ubiquitination, which affects the inhibition of tumor cells by p53 (UM Moll, 0. Petrenko. The MDM2-p53 Interaction. Molecular Cancer Research. 2003, l : 1001-1008) o The crystal structure of the p53-MDM2 complex elucidates the mode of action of p53 and MDM2.
  • the analog, the synthetic octapeptide AP and the natural product cyclo-nonapeptide chlorof sin have excellent inhibitory activity, but the anti-tumor activity is not ideal due to the poor cell permeability of the peptide compound (C. Garcia-Echeverria, P. Chene And M. JJ Blommers. Discovery of potent antagonists of the interaction between human double minute 2 and tumor suppressor p53. Journal Medicinal Chemistry. 2000, 43: 3205-3208).
  • non-peptide small molecule p53-MDM2 binding inhibitors have become a hotspot in the research of anti-tumor drugs.
  • researchers at home and abroad have used virtual high-throughput screening to obtain small molecule inhibitors of various structural types, mainly including cis-imidazolines.
  • the present invention provides a novel structure of small molecule inhibitors by virtual screening of commercial databases in combination with structural modifications.
  • a pyrrolidone compound which comprises an optical isomer, a racemate, a cis-trans isomer, and any combination or a pharmaceutically acceptable salt thereof, has a structure of the formula (I);
  • R is hydrogen, lower fluorenyl, lower alkoxy, lower alkenyl, cycloalkyl, triazole ring, aryl, heteroaryl, saturated or partially unsaturated heterocyclic ring, aryl fluorenyl or heteroaryl Alkyl group
  • the substitution is substituted by one or more of the following groups: hydrogen, hydrazine, hydroxy, nitro, amino, cyano, carboxy, lower alkyl, lower decyloxy, lower alkenyl; more preferably, R, is phenyl, p-fluorophenyl, p-chlorophenyl, p-bromophenyl, p-iodophenyl, p-nitrophenyl, p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-methylphenyl, O-fluorophenyl, o-chlorophenyl, o-bromophenyl, o-iodophenyl, o-nitrophenyl, o-hydroxyphenyl,
  • R 2 is hydrogen, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkenyl, cyclodecyl, triazole ring, aryl, heteroaryl, saturated or partially unsaturated heterocyclic ring, aryl fluorenyl or heteroaryl fluorene base;
  • the substitution is substituted by one or more of the following groups: hydrogen, hydrazine, hydroxy, nitro, amino, cyano, carboxy, lower fluorenyl, lower decyloxy, lower alkenyl;
  • it is phenyl, p-fluorophenyl, p-chlorophenyl, p-bromophenyl, p-iodophenyl, p-nitrophenyl, p-hydroxyphenyl, p-methoxyphenyl, p-methylbenzene Base, p-tert-butylphenyl, naphthyl, o-fluorophenyl, o-chlorophenyl, o-bromophenyl, o-iodophenyl, o-nitrophenyl, o-hydroxyphenyl, o-methoxyphenyl, M-fluorophenyl, m-chlorophenyl, m-bromophenyl, m-iodophenyl, m-nitrophenyl, m-hydroxyphenyl, m-methoxyphenyl, dimethylphenyl, dichlorophenyl, thioph
  • R 3 is lower fluorenyl, halogen, halo-like, ortho- or di-substituted aryl, ortho- or di-substituted heteroaryl, ortho-para or sub-substituted or partially unsaturated More preferably, R 3 is chloro, bromo, imidazolyl, pyridyl; said substitution is substituted by one or more of the following: hydrogen, halogen, hydroxy, nitro, amino, cyano, carboxy a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a lower alkenyl group; the lower alkyl group being a linear or branched fluorenyl group having 1 to 7 carbon atoms;
  • R a is hydrogen, lower fluorenyl, lower halogenated fluorene, ortho- or di-substituted aryl, ortho- or di-substituted arylamine, saturated or partially unsaturated heterocyclic, Ortho-substituted or disubstituted aryl fluorenyl or heteroaryl fluorenyl; said substitution is substituted by one or more of the following: hydrogen, halogen, hydroxy, nitro, amino, cyano, carboxy, a lower fluorenyl group, a lower decyloxy group, a lower alkenyl group; the lower alkyl group being a linear or branched fluorenyl group having 1 to 7 carbon atoms;
  • R4 is hydrogen, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkenyl, cycloalkyl, hydroxy substituted lower fluorenyl, carboxy or ester substituted lower fluorenyl, aryl, heteroaryl, saturated or partially unsaturated Heterocyclic, arylalkyl or heteroaryl fluorenyl; more preferably, R4 is hydrogen, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, n-pentyl, n-hexyl, positive Heptyl, n-octyl, tert-butyl, allyl, propynyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, benzyl, p-fluorobenzyl, o-fluorobenzyl, m-fluorobenzyl, acetic acid Ester group, ethyl propionate
  • n is an integer between 1 and 6; preferably n is an integer between 1 and 3;
  • X is an independently oxygen or sulfur atom
  • the lower alkyl group is a linear or branched fluorenyl group having 1 to 8 carbon atoms; preferably, the lower fluorenyl group is a linear or branched fluorenyl group having 1 to 7 carbon atoms; and the lower alkoxy group is 1 to 8 A straight or branched decyloxy group of a carbon atom; a lower haloalkyl group is a lower fluorenyl group substituted with 1 to 3 halogen atoms.
  • lower in relation to alkyl and decyloxy refers to a straight or branched chain saturated aliphatic hydrocarbon group containing from 1 to 8 carbon atoms, preferably a lower fluorenyl group is a straight chain containing from 1 to 7 carbon atoms.
  • branched alkyl group for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, methylthio, ethylthio, methoxy and ethoxy, and the term alkenyl or Alkynyl-related
  • lower refers to a group containing from 2 to 8 carbon atoms and one or more double or triple bonds, for example: vinyl, allyl, allyl, pentenyl, hexyl Alkenyl, propenyl, ethynyl, propynyl and butynyl.
  • haloalkyl is a lower alkyl group substituted with 1 to 3 halogen atoms.
  • cycloalkyl refers to a ring containing from 3 to 10 carbons, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl.
  • aryl refers to a mono-, di- or tricyclic hydrocarbon compound wherein at least one ring is an aromatic ring and each ring contains up to 7 carbon atoms, for example, phenyl, naphthyl, anthryl, biphenyl or anthracenyl.
  • Halogen means chlorine, bromine, iodine or fluorine.
  • halo refers to cyano, trifluoromethyl, trifluoromethoxy.
  • the compound of formula (I) is selected from the following compounds:
  • the 5-position of the pyrrole ring of the compound of the present invention contains an asymmetric carbon atom and has both R and S configurations.
  • the racemate can be isolated by chiral preparation to give a single optically pure compound.
  • the present invention includes these enantiomeric configurations and their various combinations, as well as racemic compounds.
  • certain compounds of the invention may be prepared for pharmaceutical use in accordance with conventional methods.
  • the form of salt Including organic acid salts and inorganic acid salts: inorganic acids including, but not limited to, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, diphosphoric acid, hydrobromic acid, nitric acid, etc., organic acids including, but not limited to, acetic acid, maleic acid, Fumar Acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, p-toluenesulfonic acid, salicylic acid, oxalic acid, and the like.
  • the compounds of the invention can be prepared by the following methods:
  • the pyrrolidone pyrazole core is obtained by cyclization with hydrazine
  • a substituted pyrrolidone pyrazole compound is obtained by a substitution reaction.
  • any one of the above compounds including an optical isomer, a racemate, a cis-trans isomer, and any combination thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in the preparation of an antitumor or anti-inflammatory drug. use.
  • the use is in the pharmaceutical use as a small molecule inhibitor of p53-MDM2/X protein interaction.
  • the compounds of the present invention have good antitumor activity by in vitro antitumor activity studies, and they can be used for treating tumors, including esophagus, stomach, intestine, rectum, mouth, pharynx, larynx, lung, colon, breast, uterus, endometrium. , ovarian, prostate, testis, bladder, kidney, liver, pancreas, bone, connective tissue, skin, eye, brain and central nervous system, etc., as well as thyroid cancer, leukemia, Hawking's disease, lymphoma and myeloma Wait.
  • Anti-inflammatory experiments show that the compounds of the present invention have good anti-inflammatory effects and can be used for treatment including systemic inflammatory response syndrome and multiple organ dysfunction syndrome, dermatitis, encephalitis, pharyngitis, bronchitis, tonsillitis, pneumonia, hepatitis , enteritis, prostatitis, endometritis, cervicitis, pelvic inflammatory disease, paronychia, atherosclerosis, and autoimmune inflammation such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, asthma, tonicity Spondylitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, lupus erythematosus, and the like.
  • the compounds of the invention are administered in an amount effective to treat a condition as described herein.
  • the compounds of the present invention are administered by any suitable route in the form of a pharmaceutical composition suitable for such a route and in a dosage effective for the intended treatment.
  • Therapeutically effective doses of the compound required to treat the development of a medical condition are readily ascertainable by those skilled in the art using preclinical and clinical methods common in the medical arts.
  • the compounds of the invention may be administered orally.
  • Oral administration can include swallowing so that the compound enters the gastrointestinal tract, or can be administered subcutaneously or sublingually, whereby the compound enters the bloodstream directly from the oral cavity.
  • the compounds of the invention may also be administered directly into the bloodstream, into the muscle, or into the internal organs.
  • suitable parenteral means of administration include intravenous, intraarterial, intraperitoneal, Intramembranous, intraventricular, intraurethral, intrasternal, intracranial, intramuscular, and subcutaneous administration.
  • Suitable parenteral administration devices include needle-shaped (including microneedle) syringes, needle-free injectors, and infusion techniques.
  • the compounds of the invention may also be administered topically to the skin or mucosa, i.e., the skin or transdermally. In another embodiment, the compounds of the invention may also be administered intranasally or by inhalation. In another embodiment, the compounds of the invention may be administered rectally or vaginally. In another embodiment, the compounds of the invention may also be administered directly to the eye or ear.
  • the dosage regimen of the compound and/or composition containing the compound is based on a variety of factors including the type, age, weight, sex, and medical condition of the patient; the severity of the condition; the route of administration; and the particular The activity of the compound. Therefore, the dosage regimen can vary widely. Dosage levels ranging from about 0.1 to about 1000 mg/kg body weight per day are used to treat the above conditions. In one embodiment, the total daily dose (administered in a single dose or divided dose) of a compound of the invention is typically from about 0.1 to about 500 mg/kg.
  • the total daily dose of the compound of the invention is from about 0.1 to about 300 mg/kg, and in another embodiment, from about 0.5 to about 200 mg/kg (SP, mg of the compound of the invention per kg) body weight). In one embodiment, the dosage is from 0.1 to 10 mg/kg/day. In another embodiment, the dosage is from 0.1 to 1.0 mg/kg/day. Dosage unit compositions may contain these amounts or submultiples thereof to form a daily dose. In many cases, the administration of the compound is repeated multiple times a day (usually no more than 4 times). If needed, a daily dose can usually be used to increase the total daily dose.
  • the composition may contain 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100, 125, 150, 175, 200, 250 and 500 mg active ingredients. It is provided in tablet form for symptomatic dose adjustment of the patient.
  • the medicament typically contains from about 0.01 mg to about 500 mg of the active ingredient, or in another embodiment from about 1 mg to about 100 mg of the active ingredient.
  • the intravenous dose during a constant ratio infusion can range from about 0.01 to about 10 mg/kg/minute.
  • Suitable subjects in accordance with the present invention include mammalian subjects.
  • mammals include, but are not limited to, dogs, cats, cows, goats, horses, sheep, pigs, rodents, rabbits, primates, etc., and include mammals in the uterus.
  • humans are suitable subjects. Human subjects can be of any gender and can be at any stage of development.
  • the invention encompasses the use of one or more compounds of the invention in the manufacture of a medicament for the treatment of a condition described herein.
  • the compounds of the invention may themselves be administered as a compound.
  • the pharmaceutically acceptable salts are suitable for medical applications due to their greater water solubility relative to the parent compound.
  • the invention includes a pharmaceutical composition.
  • Such pharmaceutical compositions comprise the invention Compounds and pharmaceutically acceptable carriers.
  • the carrier may be solid, liquid or a combination of both, and may be formulated with the compound as a unit dosage composition, such as a tablet, which may contain from 0.05% to 95% by weight of active compound.
  • the compounds of the invention can be coupled to a suitable polymer as a targetable pharmaceutical carrier. Other pharmacologically active substances may also be present.
  • the compounds of the invention may be administered by any suitable route, preferably in the form of a pharmaceutical composition suitable for such route, and in a dosage which is preferred for the intended treatment.
  • the active compounds and compositions can be administered, for example, orally, rectally, parenterally or topically.
  • Oral administration in solid dosage form can be presented, for example, in separate units, such as soft or hard capsules, pills, cachets, lozenges or tablets, each containing a predetermined amount of at least one compound of the invention.
  • the oral administration can be in the form of a powder or granules.
  • the oral dosage form is sublingual, such as a lozenge.
  • the compounds of the invention will usually be combined with one or more adjuvants.
  • Such capsules or tablets may contain a controlled release formulation.
  • the dosage form may also contain a buffer or may be prepared with an enteric coating.
  • the oral administration can be in the form of a liquid dosage.
  • Liquid dosage forms for oral administration include, for example, pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups and elixirs containing inert diluents (i.e., water) conventionally employed in the art.
  • Such compositions may also contain adjuvants such as wetting agents, emulsifying agents, suspending agents, flavoring agents (e.g., sweeteners) and/or fragrances.
  • the invention includes a parenteral dosage form.
  • Parenteral administration includes, for example, subcutaneous injection, intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, intrasternal injection, and infusion.
  • injectable preparations ⁇ ⁇ , sterile injectable aqueous or oleaginous suspensions
  • suitable dispersing agents, wetting agents and/or suspending agents may be formulated according to known techniques using suitable dispersing agents, wetting agents and/or suspending agents.
  • Topical administration includes, for example, transdermal administration (such as via a transdermal patch or iontophoresis device), intraocular administration, or intranasal or inhalation administration.
  • Compositions for topical administration also include, for example, topical gels, sprays, ointments, and creams. Topical formulations can include compounds that enhance the absorption or penetration of the active ingredient through the skin or other affected areas.
  • administration can be accomplished using a patch of a reservoir and a porous membrane type or a patch of a solid matrix type.
  • Typical formulations for this purpose include gels, hydrogels, lotions, solutions, creams, ointments, powders, dressings, foams, films, dermal patches, wafers, burying Implants, sponges, fibers, bandages and microemulsions. Liposomes can also be used.
  • Typical carriers include alcohols, water, mineral oil, liquid paraffin, white petrolatum, glycerin, polyethylene glycol, and propylene glycol.
  • a penetration enhancer can be introduced - see for example J Pharm Sci, 88 (10), 955-958, Finnin and Morgan (October 1999) 0
  • Formulations suitable for topical administration to the eye include, for example, eye drops wherein the compound of the invention is dissolved or suspended in a suitable carrier.
  • a typical formulation suitable for ocular or otic administration may be in the form of a micronized suspension tablet or may be in the form of a solution in isotonic, pH adjusted sterile saline.
  • Other formulations suitable for eye and ear applications include ointments and the like.
  • a polymer such as cross-linked polyacrylic acid, polyvinyl alcohol, hyaluronic acid, a cellulose polymer (for example, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxyethylcellulose or methylcellulose) or a heteropolysaccharide polymer (for example , agarose gel), can be blended with a preservative (such as ampicillin).
  • a preservative such as ampicillin
  • the active compound of the invention is conveniently delivered in the form of a solution or suspension from a pump spray container which is squeezed or pumped by the patient, or as a spray from a pressurized form using a suitable propellant.
  • the container or nebulizer is conveniently delivered.
  • Formulations suitable for intranasal administration are usually in the form of a dry powder (alone, as a mixture, for example, as a dry blend containing lactose, or as a mixed component particle, for example, with a phospholipid (such as lecithin)) from a dry powder inhaler Application, or as a spray from a pressurized container, pump, sprayer, atomizer (preferably using an electro-hydraulic atomizer to produce a fine mist) or sprayer, with or without the use of a suitable propellant, such as 1 1, 1, 1, 2-tetrafluoroethane or 1, 1, 1 , 2, 3, 3, 3-heptafluoropropene.
  • the powder may comprise a bioadhesive, for example, chitosan or cyclodextrin.
  • the invention includes a rectal dosage form.
  • rectal dosage forms can be in the form of, for example, suppositories. Cocoa butter is a traditional suppository base, but various alternatives can be suitably used.
  • compositions of this invention may be prepared by any of the well-known techniques of pharmacy, such as effective formulation and administration steps.
  • effective formulation and administration steps are well known in the art and are described in standard textbooks.
  • Drugs are produced, for example, in Hoover, John E, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1975; Liberman et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, NY, 1980; Wobbe et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients (3rd Ed.), American Pharmaceutical Association, Washington, 1999.
  • the compounds of the invention may be used alone or in combination with other therapeutic agents to treat a variety of conditions or conditions.
  • the compounds of the invention and other therapeutic agents can be administered simultaneously (in the same dosage form or separately) In the dosage form) or sequentially.
  • Combined administration of two or more compounds means that the two compounds are administered in close enough time that the presence of one compound affects the biological effect of the other.
  • Two or more compounds can be administered simultaneously, coexisting or sequentially.
  • homologous administration can be carried out by mixing the compounds prior to administration, or by at the same time point but at different anatomical locations or using different routes of administration.
  • co-administered refers to the combined administration of a compound.
  • kits suitable for use in performing the above methods of treatment contains a first dosage form comprising one or more compounds of the invention and a dosage container in an amount sufficient to carry out the method of the invention.
  • the kit of the invention comprises one or more compounds of the invention.
  • the compounds of the invention may be used in the preparation of a medicament for inhibiting the interaction of the p53-MDM2 protein.
  • the compounds of the present invention and salts thereof have good antitumor activity, and a plurality of compounds are higher than the positive control drug n U tlin-3, and thus the compounds of the present invention and salts thereof can be used for the preparation of antitumor drugs.
  • the compounds of the present invention and salts thereof have good anti-inflammatory activity, and thus the compounds of the present invention and salts thereof can be used for the preparation of anti-inflammatory drugs.
  • reaction mixture became viscous, and a large amount of solid was obtained after dilution with water, and filtered to give a pale yellow solid, which was recrystallized from methanol to give a white solid, 2.40 g, yield: 64.5%.
  • the inhibitory activity of MDM2 was determined by p53 binding to MDM2 residue 1-118.
  • the disclosed crystal structure of this complex (Kussie et al, Science 274: 948-953 (1996)) confirmed a fragment containing a p53 binding site, and we have resolved the X-diffraction structure of the p53 peptide analog MPRFMDYWEGLN (Bottger Et al., J. Mol. Biol. 269:744-756 (1997)).
  • This example uses 5-FAM-(-A)-(PA)-FM-Aib-pY-(6-Cl-DL-Trp)- E-Ac3c-LN-NH 2 (PMDM6-F), which d reached 1 nM.
  • test compound MDM2 (10 nM) and PMDM6-F (10 nM) (buffer: 100 mM tripotassium phosphate, pH 7.5; 100 g/mL BGG; 0.02% sodium azide)
  • buffer 100 mM tripotassium phosphate, pH 7.5; 100 g/mL BGG; 0.02% sodium azide
  • the plate was incubated at a final volume of 125 L for 2 hours at room temperature, and the fluorescence polarization values were read with Biotek-Synergy 2.
  • the curve was plotted using Gmphpad Prism and the protein binding inhibition constant ( ) was calculated.
  • the compounds of the invention range from 0.015 ⁇ to >100 ⁇ .
  • the highly active compound nutlin-3 (Shanghai Haoyuan Chemexpress) was formulated into a positive control solution under the same conditions.
  • test results are shown in Table 2, wherein the sample refers to a pyrrolidone compound prepared in the corresponding examples (for example, Example 5: 5-(3-(1//--imidazolyl)propyl)-4-(4-bromo) Phenyl)-3-phenyl-4,5-dihydropyrrole [3,4-c]pyrazole-6(1 /)-one.
  • the cell line was tested with RAW264.7 (mouse macrophage, ATCC #TIB-71) and frozen and passaged by the Department of Biopharmaceutics, School of Pharmacy, Second Military Medical University.
  • the culture medium was DMEM + 10% FBS + double antibody.
  • Sample preparation After dissolving in DMSO (Merck), add PBS (-) to a solution of 100 ⁇ g/ml or a homogeneous suspension, and then dilute with PBS (-) containing DMSO.
  • the RAW264.7 cells were digested with 0.25% trypsin, the cells were collected, evenly blown, the medium was added to adjust the cell concentration to 1 ⁇ 10 6 cells/mL, and the cells were seeded into 96-well plates at ° ⁇ , at 37 ° C. , overnight under 5% CO 2 .
  • the culture medium was discarded the next day, and 100 ⁇ L of the medium containing 2 g/mL LPS was added. After 1 hour of culture, the drug of each concentration was added, and the culture supernatant was cultured at 37 ° C under 5% CO 2 for 24 hc.
  • test results are shown in Table 3, wherein the sample refers to a pyrrolidone compound prepared in the corresponding example (Example Example 8: 5-(3-(1-imidazole)propyl HK4-bromophenyl) small allyl group 3-phenyl-4,5-dihydropyrrole [3,4-c]pyrazole-6(1/)-one.
  • Example 34 Tumor cell proliferation inhibition assay
  • the compound of the present invention was subjected to a tumor cell proliferation inhibition test using a conventional MTT method (e.g., Lu Qiujun, "New Drug Pharmacology Research Method", Chemical Industry Press, 2007: 242-243).
  • a conventional MTT method e.g., Lu Qiujun, "New Drug Pharmacology Research Method", Chemical Industry Press, 2007: 242-243.
  • the cell line was selected from A549 (human lung adenocarcinoma cells) which naturally expressed wild-type p53, and NCI-H1299 (human lung adenocarcinoma cells), U20S (human osteosarcoma cells), and Saos-2 (human osteosarcoma cells) which were naturally p53-deficient.
  • the control experiment was carried out and frozen and passed down by the pharmacology laboratory of Shanghai Pharmaceutical Industry Research Institute.
  • the culture solution was DMEM + 10% FBS + double antibody.
  • MTT solution Weigh 0.5 g of MTT, dissolve it in 100 ml of phosphate buffer (PBS) or phenol red free medium, and filter with 0.22 ⁇ filter to remove bacteria from the solution. C Protect from light.
  • PBS phosphate buffer
  • C Protect from light.
  • Sample preparation After dissolving in DMSO (Merck), add PBS (-) to a solution of 100 ⁇ g/ml or a homogeneous suspension, and then dilute with PBS (-) containing DMSO.
  • the highly active compound nutlin-3 was formulated into a positive control solution under the same conditions.
  • MTT method A 96-well plate was added with a cell suspension of 100 ⁇ M at a concentration of 5-6 ⁇ 10 4 /ml per well, placed in a 37 ° C, 5% C0 2 incubator. After 24 h, the sample solution was added, ⁇ /well, double-well, 37 ° C, 5% C0 2 for 72 h. Add 5 ⁇ g/ml of MTT solution 20 ⁇ 1 to each well. After 4h, add the solution, ⁇ /well, place in the incubator, dissolve and measure the OD value of 570nm with ⁇ -2 automatic enzyme labeling instrument. Calculate the half inhibitory concentration IC 5 o.
  • test results are shown in Table 4, wherein the sample refers to the pyrrolidone compound prepared in the corresponding example (Example 5: 5-(3-(1-imidazolyl)propyl)-4-(4-bromophenyl) --3-phenyl-4,5-dihydropyrrole [3,4-c]pyrazole-6(1)-one.
  • Example 5 10.99 100 1 1.84 100
  • Example 6 9.65 100 9.83 100
  • Example 7 10.92 100 10.75 100
  • Example 8 > 100 17.26 >100 16.06
  • Example 9 12.67 98.72 34.35 100
  • Example 10 1 1.50 100 14.84 100
  • Example 11 100 28.1 1 >100 13.34
  • Example 12 20.32 100 18.42 100
  • Example 13 14.45 100 12.70 100
  • Example 14 16.94 100 16.50 100
  • Example 16 13.85 100 16.02 100
  • Example 17 8.04 100 1 1.04 100
  • Example 18 2.92 100 3.93 100
  • Example 19 2.61 100 1.55 100
  • Example 20 14.71 100 >100 7.26
  • Example 21 1.73 100 10.47 100
  • Example 22 10.86 100 12.00 100
  • Example 23 10.51 100 9.97 100
  • Example 24 5.63 100 3.13 89.95
  • Example 26 > 100 26.24 >100 30.47
  • Example 27 21.21 100 13.76 86.52
  • Example 25 7.91 2.28
  • Example 26 > 100 > 100
  • Example 28 > 100 87
  • Example 30 2.09 5.08 nutlin-3 12.76 4.14
  • the above experimental results show that most of the compounds of the present invention have good antitumor activity, and a plurality of compounds are higher than the positive control drug nutlin-3, and can be used as a good antitumor agent.
  • Example 35 In vitro antitumor activity of optical isomers
  • the cell line was selected from A549 (human lung adenocarcinoma), which naturally expressed wild-type p53, and NCI-H1299 (human lung adenocarcinoma), U2 0S (human osteosarcoma cells), and Saos-2 (human osteogenic), which were naturally p53-deficient.
  • the sarcoma cells were subjected to a control experiment and frozen and passaged by the pharmacology laboratory of Shanghai Pharmaceutical Industry Research Institute. The experimental results are shown in Table 6:
  • Example 30 Example 30 6.44 1.30 1.33 1.30
  • Example 30 5.77 1.63 1.42 1.12 nutlin-3 8.38 12.20 2.18 1.97
  • the above experimental results show that the optical isomers of the compounds of the present invention also have good antitumor activity and are also higher than positive.
  • the reference drug nutlin-3 can be used as a good anti-tumor agent.
  • Example 36 Study on the efficacy of the compounds of Examples 12, 19, 23 and 30 in human lung cancer A549 nude mice xenografts
  • test compound was added with a drop of hydrochloric acid and dissolved in physiological saline to the desired concentration.
  • the A549 tumor cell suspension was subcutaneously implanted into the right axillary region of the mice.
  • the tumor volume of the tumor-bearing mice was as long as 120 mm 3 , and the animals with better tumor growth were randomly divided into groups (6 in the treatment group). 10 rats in the control group, and started to administer.
  • the dosage regimen is as follows:
  • Control saline
  • gavage dose 25mg/kg, 14 days
  • Compound DOX intravenous, dose 10mg/kg, 1 day
  • Example 12 has an in vivo antitumor activity similar to that of the control drug DOX, and it has little effect on the body weight of the animal at an effective dose.
  • the compounds of the present invention and their salts can therefore be used to prepare p53-MDM2 protein interacting small molecule inhibitors.
  • the basic principles, main features and advantages of the present invention are shown and described above.

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Abstract

本发明属于医药技术领域。本发明提供了一种吡咯酮类化合物，包括其光学异构体、外消旋体、顺反异构体以及任意组合或其药用盐，结构如式（I）所示。本发明的化合物可作为p53-MDM2/X蛋白相互作用小分子抑制剂。本发明的化合物可用于制备抗肿瘤药物或抗炎药物。

Description

吡咯酮并吡唑类化合物及其作为药物的用途
技术领域
本发明属于医药技术领域， 具体的说， 是吡咯酮并吡唑类化合物及其作为 药物的用途， 特别是在制备抗肿瘤药物中的应用。 背景技术
p53蛋白是一种抑癌蛋白， 它的失活与 50%〜60%的癌症发生密切相关。 其 原因可能是 p53抑癌蛋白的转录激活结构域连接有细胞癌蛋白， 如最早在小鼠 细胞系的双微染色体基因扩增中发现的一个基因 (murine double minute 2， MDM2), 在鼠和人 (同源基因为 HDM2)的多处组织都有表达 (Michael S C， et al. Regulation of p53 stability and activity in response to genotoxic stress [J].Mvta Res, 2000， 462 : 179-188.)。
近年来 p53抑癌基因的发现极大的促进了肿瘤发病机制以及抗肿瘤药物的 研究， 大量的研究证明： 编码的 p53蛋白在细胞周期调控、 DNA修复和诱导 细胞凋亡等方面均具有关键性作用，癌症病人出现 p53基因的功能缺失性突变， 是导致肿瘤细胞的迅速生长的主要原因， 重组人 p53腺病毒注射液在我国的上 巿充分说明了 p53是有效的抗肿瘤药物靶点， 使得以 p53为作用靶点的抗肿瘤 药物研究成为一个热点。 分子生物学研究表明细胞中存在的 MDM2(Murine Double Minute 2)蛋白是 p53主要的负性调节子之一， p53能激活 MDM2转录， MDM2反过来又能抑制 p53 活性， 形成自动调节反馈环， 以保持正常情况下 P53和 MDM2都处于低水平状态。 肿瘤细胞内 MDM2的异常表达会导致 p53 因其泛素化而快速降解， 从而影响了 p53 对肿瘤细胞的抑制 (U. M. Moll, 0. Petrenko. The MDM2-p53 Interaction. Molecular Cancer Research. 2003, l :1001-1008)op53-MDM2复合物的晶体结构阐明了 p53与 MDM2的作用模式， p53的关键性氨基酸 Phe19、 Tip23和 Leu26插入 MDM2的活性腔形成三个疏水 性作用力 (P. H. Kussie, S. Gorina, V. Marechal, and et al. Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain. Science. 1996, 274:948-953)。这一发现使得以 p53-MDM2结合为靶标的抗肿瘤药物研究 成为近年来的一个主要领域， 早期的小分子抑制剂的研究主要集中在多肽及其 确认本 类似物，合成的八肽 AP和天然产物环九肽 chlorof sin都具有优异的抑制活性， 但由于肽类化合物的细胞渗透能力差致使抗肿瘤活性并不理想（C. Garcia-Echeverria, P. Chene and M.JJ Blommers. Discovery of potent antagonists of the interaction between human double minute 2 and tumor suppressor p53. Journal Medicinal Chemistry. 2000, 43： 3205-3208)。
近年来非肽类小分子 p53-MDM2结合抑制剂成为抗肿瘤药物研究的热点， 国内外研究者采用虚拟高通量筛选先后获得多种结构类型的小分子抑制剂， 主 要包括顺式咪唑啉类 (Nutlins) (其中 nutlin-3常作为 mdm2抑制剂阳性对照药）、 螺 吲 哚满 酮 类（Spiro-oxindoles) 、 1 ,4- 苯 并 二 氮 卓 -2,5- 二 酮 类 (Benzodiazepinediones)三大结构类型， 其中 Roche 公司的化合物 RO5045337 目前处于 I其月临床 (Melissa Millard, Divya Pathania, Fedora Grande, Shili Xu， and Nouri Neamati*. Small-Molecule Inhibitors of p53-MDM2 Interaction: the 2006-2010 Update. Current Pharmaceutical Design, 2011, 17, 536-559)。 这些小分 子抑制剂在体内外较肽类化合物都表现出了较优的抗肿瘤活性。 发明内容
本发明的目的在于提供一种新的非肽类小分子 p53-MDM2 结合抑制剂， 具体为吡咯酮并吡唑类化合物。本发明的另一目的提供吡咯酮并吡唑类化合物 在制备抗肿瘤药物中的用途， 该类化合物可提高 p53-MDM2 蛋白相互作用抑 制活性。 本发明还提供了吡咯酮并吡唑类在制备抗炎药物中的用途。
本发明通过对商业数据库的虚拟筛选结合结构改造得到全新结构的小分 子抑制剂。
本发明的具体技术方案如下：
作为本发明的第一方面， 一种吡咯酮类化合物， 包括光学异构体、 外消旋 体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 结构如式（ I );
Figure imgf000003_0001
其中， R,是氢、低级垸基、低级烷氧基、低级链烯基、环烷基、三唑环、芳基、 杂芳基、 饱和或部分不饱和杂环、 芳垸基或杂芳基烷基；
优选 是芳基、杂芳基、饱和或部分不饱和杂环、芳烷基或杂芳基烷基； 优选的， 芳基， 杂芳基是指取代的芳基， 取代的杂芳基。 所述的取代是指被下 列一个或多个基团取代： 氢， 素， 羟基， 硝基， 氨基， 氰基， 羧基， 低级烷 基， 低级垸氧基， 低级链烯基； 更佳地， R,是苯基、 对氟苯基、 对氯苯基、 对 溴苯基、 对碘苯基、 对硝基苯基、 对羟基苯基、 对甲氧基苯基、 对甲基苯基、 邻氟苯基、 邻氯苯基、 邻溴苯基、 邻碘苯基、 邻硝基苯基、 邻羟基苯基、 邻甲 氧基苯基、 间氟苯基、 间氯苯基、 间溴苯基、 间碘苯基、 间硝基苯基、 间羟基 苯基、 间甲氧基苯基、 二氯苯基；
R2是氢、 低级烷基、 低级烷氧基、 低级链烯基、 环垸基、 三唑环、 芳基、 杂芳基、 饱和或部分不饱和杂环、 芳垸基或杂芳基垸基；
优选 是芳基、杂芳基、饱和或部分不饱和杂环、芳垸基或杂芳基烷基； 优选的， 芳基， 杂芳基是指取代的芳基， 取代的杂芳基。 所述的取代是指被下 列一个或多个基团取代： 氢， 素， 羟基， 硝基， 氨基， 氰基， 羧基， 低级垸 基， 低级垸氧基， 低级链烯基；
更佳地， 是苯基、 对氟苯基、 对氯苯基、 对溴苯基、 对碘苯基、 对硝基 苯基、 对羟基苯基、 对甲氧基苯基、 对甲基苯基、 对叔丁基苯基、 萘基、 邻氟 苯基、 邻氯苯基、 邻溴苯基、 邻碘苯基、 邻硝基苯基、 邻羟基苯基、 邻甲氧基 苯基、间氟苯基、间氯苯基、间溴苯基、间碘苯基、间硝基苯基、 间羟基苯基、 间甲氧基苯基、 二甲基苯基、 二氯苯基、 噻吩基、 呋喃基、 吡啶基、 邻氯吡啶 基；
是氢、 羟基、 氨基、 任选取代的胺基、 低级垸基、 卤素、 类卤素、 低级 垸氧基、 低级链烯基、 硝基、 羟基亚胺垸基、 三唑环、 邻间对位取代或二取代 的芳基、 邻间对位取代或二取代的杂芳基、 邻间对位取代或二取代的饱和或部 分不饱和杂环；
优选 R3是低级垸基、 卤素、 类卤素、 邻间对位取代或二取代芳基、 邻间 对位取代或二取代杂芳基、 邻间对位取代或二取代饱和或部分不饱和杂环； 更 佳地， R3是氯、 溴、 咪唑基、 吡啶基； 所述的取代是指被下列一个或多个基团 取代： 氢， 卤素， 羟基， 硝基， 氨基， 氰基， 羧基， 低级垸基， 低级垸氧基， 低级链烯基； 所述低级烷基为含 1至 7个碳原子直链或支链垸基；
是氢、 低级烷基、 卤素、 类卤素、 低级卤代垸基、 低级垸氧基、 低级链 烯基、环垸基、硝基、叠氮基、羧基或烷氧基羰基、羟基、氟取代低级垸氧基、 羟基取代低级垸基、 羧基或酯基取代低级垸基、 酰胺基、 低级酰胺基垸基、 羟 基亚胺烷基、 芳基、 杂芳基、 饱和或部分不饱和杂环、 芳垸基或杂芳基垸基、
-NHRa， 其中 Ra是氢、 低级垸基、 低级卤代垸、 邻间对位取代或二取代芳基、 邻间对位取代或二取代芳胺基、 饱和或部分不饱和杂环、 邻间对位取代或二取 代芳垸基或杂芳基垸基； 所述的取代是指被下列一个或多个基团取代： 氢， 卤 素， 羟基， 硝基， 氨基， 氰基， 羧基， 低级垸基， 低级垸氧基， 低级链烯基; 所述低级烷基为含 1至 7个碳原子直链或支链垸基；
优选 R4是氢、 低级烷基、 低级烷氧基、 低级链烯基、 环烷基、 羟基取代 低级垸基、羧基或酯基取代低级垸基、芳基、杂芳基、饱和或部分不饱和杂环、 芳垸基或杂芳基垸基； 更佳地， R4是氢、 甲基、 乙基、丙基、异丙基、正丁基、 异丁基、 正戊基、 正己基、 正庚基、 正辛基、 叔丁基、 烯丙基、 丙炔基、 环丁 基、 环戊基、 环己基、 苄基、 对氟苄基、 邻氟苄基、 间氟苄基、 乙酸乙酯基、 丙酸乙酯基、 丁酸乙酯基、 乙酸基、 丙酸基、 丁酸基；
n为 1至 6之间的整数； 优选 n为 1至 3之间的整数；
X是独立地氧或硫原子；
所述低级烷基为含 1至 8个碳原子直链或支链垸基； 优选低级垸基为含 1 至 7个碳原子直链或支链垸基； 低级烷氧基为含 1至 8个碳原子直链或支链垸 氧基； 低级卤代烷基为含 1至 3个卤原子取代的低级垸基。
在本文中， 与烷基和垸氧基有关的术语 "低级 "指含 1至 8个碳原子的直链 或支链饱和脂肪烃基团， 优选低级垸基为含 1至 7个碳原子直链或支链烷基; 例如， 甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 叔丁基、 甲硫基、 乙硫基、 甲氧基 和乙氧基， 与术语链烯基或链炔基有关的术语 "低级 "指含 2至 8个碳原子和一 个或多个双键或三键的基团， 例如： 乙烯基、 烯丙基、 异烯丙基、 戊烯基、 己 烯基、 丙烯基、 乙炔基、 丙炔基和丁炔基。 术语卤代烷基为含 1至 3个卤原子 取代的低级烷基。术语环垸基是指含 3至 Ί个碳的环，例如，环丙基、环丁基、 环戊基或环己基。 术语芳基指单、 二或三环烃化合物， 其中至少一个环为芳香 环， 每个环含最多 7个碳原子， 例如， 苯基、 萘基、 蒽基、 联苯基或茚基。 术 语卤素指氯、 溴、 碘或氟。 术语类卤素是指氰基、 三氟甲基、 三氟甲氧基。
式 （ I ) 化合物选自以下化合物：
5-(3-(1 /-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡唑 -6(1//)- 酮、 5-(3-(1 -咪唑：)丙基) -4-〔4-溴苯基) 1-甲基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡唑
-6(1/ )-酮、
5-(3-(1 -咪唑)丙基) -4- 〔4-溴苯基) 1-正丁基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1/ )-酮、
5-(3-(1/ -咪唑)丙基) -4- 〔4-溴苯基) 1-烯丙基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1 /)-酮、
5-(3-(1 -咪唑)丙基) -4- (4-溴苯基) 1-炔丙基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1/ )-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4- (4-溴苯基) 1-环己基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1 -咪唑)丙基) -4- (4-溴苯基) 1-正辛基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4- (4-溴苯基) 1-苄基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3，4-c]吡唑
-6(1//)-酮、
5-(3-(1 /-咪唑)丙基〕 -4- (4-溴苯基：) 1-异丙基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基〕 -4- (4-溴苯基) 1-环丁基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1 )-酮、
5-(3-(1/ -咪唑)丙基〕 -4- (4-溴苯基) 1-正庚基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1/ )-酮、
5-(3-(17/-咪唑)丙基〕 -4- (4-溴苯基) .1-环戊基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1 )-酮、
5-(3-(1 /-咪唑)丙基〕 -4- (4-溴苯基) .1-正丙基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(i/y>酮、
5-(3-(1/ -咪唑)丙基: 1-4- (4-溴苯基) .1-乙基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3,4-c]吡唑
-6(1//)-酮、
5-(3- (1 -咪唑)丙基; 1-4- (4-溴苯基) .1-正戊基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1 -咪唑)丙基: )-4- (4-溴苯基) .1-正己基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1/ -咪唑)丙基: )-4- (4-溴苯基)■1-异丁基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1//)-酮、 5-(3-(1/ -咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )小(2- (四氢 -2//-吡喃) -2-羟乙基 )-3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡唑 -6(1/^)-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-(2-羟乙基 )-3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c] 吡唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-邻氟苄基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3,4-c] 吡唑 -6(1 /)-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-叔丁基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1 )-酮、
2- (5-(3-(1 -咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-6 氧代 -3-苯基 -5,6-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -1(4 /)乙酸乙酯、
4-(5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-6 氧代 -3-苯基 -5,6-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -1(4 /)丁酸乙酯、
3- (5-(3-(1/ -咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-6 氧代 -3-苯基 -5,6-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -1(4//)丙酸乙酯、
4- (5-(3-(1/ -咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-6 氧代 -3-苯基 -5，6-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑- 1(4/ )丁酸、
5- (3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-对氟苄基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3,4-c] 吡唑 -6(1 )-酮、
3-(5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-6 氧代 -3-苯基 -5，6-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -1(4/^)丙酸、
(+)-5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )小苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1/ )-酮、
(-)-5-(3-(1/ -咪唑)丙基) -4- (4-溴苯基 )-1-苄基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1/ )-酮、
(+)-5-(3-(1//-咪唑）丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-对氟苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡唑 -6(1//)-酮， 或
(_)— 5_(3-(1//_咪唑）丙基) _4-(4-溴苯基 )-1-对氟苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡唑 -6(1/ )-酮。
本发明化合物的吡咯环的 5位含有一个非对称碳原子,有 R和 S两种构型。 其外消旋体可通过手性制备分离得到单一光学纯化合物。本发明包括这些对映 体构型和它们的各种结合， 以及外消旋化合物。
作为本发明的第二方面， 本发明的某些化合物可按照常规方法制备为药用 盐的形式。包括其有机酸盐及无机酸盐：无机酸包括（但不限于）盐酸、硫酸、 磷酸、 二磷酸、 氢溴酸、 硝酸等， 有机酸包括 （但不限于） 乙酸、 马来酸、 富 马酸、 酒石酸、 琥珀酸、 乳酸、 对甲苯磺酸、 水杨酸、 草酸等。
本发明的化合物可用以下方法制备得到：
第一步， 通过各种 2-羟基 -4-苯基 -4-氧代 -2-丁烯酸甲酯、 相应的醛与相应 的胺在 1,4-二氧六环中进行三组分反应得到吡咯酮基本母核；
第二步， 通过与肼环合得到吡咯酮并吡唑母核；
第三步， 通过取代反应得到取代的吡咯酮并吡唑类化合物。
本发明的第二方面，是提供上述任一化合物，包括光学异构体、外消旋体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 在制备抗肿瘤药物或抗炎药物中的用途。
进一步， 所述用途是在作为 p53-MDM2/X 蛋白相互作用小分子抑制剂的 药物用途。
经体外抗肿瘤活性研究， 本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性， 它们可 用于治疗肿瘤， 包括食道、 胃、 肠、 直肠、 口腔、 咽、 喉、 肺、 结肠、 乳腺、 子宫、 子宫内膜、 卵巢、 前列腺、 睾丸、 膀胱、 肾、 肝、胰腺、骨、 结缔组织、 皮肤、 眼、 脑和中枢神经系统等部位发生的癌症， 以及甲状腺癌、 白血病、 霍 金氏病、 淋巴瘤和骨髓瘤等。 抗炎实验表明， 本发明的化合物具有良好的抗炎 作用，可以用于治疗包括全身炎症反应综合症和多器官功能障碍综合症、皮炎、 脑炎、 咽炎、气管炎、扁桃体炎、肺炎、肝炎、肠炎、 前列腺炎、子宫内膜炎、 宫颈炎、 盆腔炎、 甲沟炎、 动脉粥样硬化， 以及自身免疫性炎症如类风湿性关 节炎、骨关节炎、银屑病、哮喘、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、 Crohn病 (Crohn' s disease), 红斑狼疮等。
施用和给药
通常， 本发明的化合物以有效治疗如本文所述病症的量施用。 本发明的化 合物通过任意合适的途径以适于此种途径的药物组合物的形式且以对预期治 疗有效的剂量施用。
治疗医学病症发展所需的治疗有效的化合物剂量是本领域技术人员利用 医学领域常见的临床前及临床方法容易确定的。
本发明的化合物可以口服施用。 口服施用可以包括吞咽， 以便化合物进入 胃肠道， 或者可以采用含服或舌下施用， 藉此化合物直接从口腔进入血流。
在另一实施方式中， 本发明化合物还可以被直接施用到血流中、 肌肉中或 者施用到内脏器官中。 合适的肠胃外施用手段包括静脉内、 动脉内、 腹膜内、 膜内、 心室内、 尿道内、 胸骨内、 颅内、 肌内和皮下施用。 合适的肠胃外施用 装置包括针状（包括显微针） 注射器、 无针注射器和输注技术。
在另一实施方式中， 本发明的化合物还可以局部施用于皮肤或粘膜， 即皮 肤或经皮施用。 在另一实施方式中， 本发明的化合物还可以鼻内施用或通过吸 入施用。 在另一实施方式中， 本发明的化合物可以直肠或阴道施用。 在另一实 施方式中， 本发明的化合物还可以被直接施用于眼部或耳部。
所述化合物和 /或含所述化合物的组合物的给药方案基于多种因素，其包括 患者的类型、 年龄、 重量、 性别和医学病症； 病症的严重度； 给药途径； 及所 用的具体化合物的活性。因此，给药方案可以广泛变化。约 0.1至约 1000 mg/kg 体重 /天级别的剂量水平用于治疗上述病症。在一个实施方式中，本发明化合物 的日总剂量 (以单次剂量或分份剂量施用） 通常为约 0.1至约 500mg/kg。在另一 实施方式中，本发明化合物的日总剂量是约 0.1至约 300 mg/kg,而在另一实施 方式中， 是约 0.5至约 200 mg/kg( SP , mg本发明化合物 /kg体重)。 在一个实 施方式中， 剂量为 0.1 至 10 mg/kg/ 天。 在另一实施方式中， 剂量为 0.1 to 1.0 mg/kg/天。 剂量单位组合物可以含有这些量或其次倍量以构成日剂量。 在很 多情况中， 化合物的施用在一天重复多次（ 通常不超过 4 次)。 如果需要， 每 日倍剂量通常可用于增加日总剂量。
对于口服施用，组合物可以以含 0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0、 2.5、 5.0、 10.0、 15.0、 25.0、 50.0、 75.0、 100、 125、 150、 175、 200、 250 和 500 mg有效成分 的片剂形式提供， 以便对患者进行症状剂量调整。 药物通常含有约 0.01 mg 至 约 500 mg 有效成分， 或者在另一实施方式中， 约 1 mg至约 100 mg有效成 分。在恒定比率输注期间静脉内剂量可在约 0.01 至约 10 mg/kg/分钟范围内。
根据本发明， 合适的受试对象包括哺乳动物受试对象。 根据本发明， 哺乳 动物包括但不限于犬、 猫、 牛、 山羊、 马、 绵羊、 猪、 啮齿类、 兔形目动物、 灵长类等并且包括在子宫内的哺乳动物。 在一个实施方式中， 人类是合适的受 试对象。 人类受试对象可以是任一性别以及可以处于发育的任意阶段。 在制药 药物中的应用在另一实施方式中， 本发明包括一种或多种本发明化合物在制备 用于治疗本文所述病症的药物中的用途。
药物组合物
为治疗本文所提及的病症， 本发明化合物本身可以作为化合物施用。 可选 地， 可药用盐适合医学应用， 这是由于其相对于母体化合物具有更大水溶性。
在另一实施方式中， 本发明包括药物组合物。 此类药物组合物包含本发明 化合物以及可药用载体。 所述载体可以是固体、 液体或者二者兼有， 而且可以 与所述化合物作为单位剂量组合物来配制， 例如片剂， 其可含有按重量计 0.05 % 至 95 %的活性化合物。本发明的化合物可以与作为可靶向药物载体的合适的聚 合物偶联。 其他药理学活性物质也可以存在。
本发明化合物可以通过任意合适途径施用， 优选以适于此种途径的药物组 合物的形式以及以对预期治疗优选的剂量施用。活性化合物和组合物例如可以 口服、 直肠、 肠胃外或局部施用。
固体剂量形式的口服施用例如可以以单独的单元呈现， 诸如， 软胶囊或硬 胶囊、 丸剂、 扁囊剂、 锭剂或片剂， 每种都含有预定量的至少一种本发明化合 物。在另一实施方式中，口服施用可以是粉剂或颗粒形式。在另一实施方式中， 口服剂量形式是舌下的， 诸如锭剂。 在此类固体剂型中， 本发明化合物通常与 一种或更多种佐剂结合。 此类胶囊或片剂可含有控制释放配方。 在胶囊、 片剂 和丸剂的情况中， 剂型也可以包含缓冲剂或可以与肠溶包衣一起制备。
在另一实施方式中， 口服施用可以是液体剂量形式。 用于口服施用的液体 剂型包括例如含有本领域常用的惰性稀释剂（ 即， 水） 的可药用乳剂、 溶液、 悬浮液、 糖浆剂和酏剂。 这类组合物还可以包含佐剂， 诸如湿润剂、 乳化剂、 悬浮剂、 调味剂（例如， 甜味剂） 和 /或芳香剂。
在另一实施方式中， 本发明包括肠胃外剂量形式。 "肠胃外施用"包括例 如皮下注射、静脉注射、腹膜内、肌内注射、胸骨内注射和输注。注射制剂（ §卩， 无菌注射水性或油性悬浮液） 可以根据已知的技术利用合适的分散剂、 湿润剂 和 /或悬浮剂配制。
在另一实施方式中， 本发明包括局部剂量形式。 "局部施用"包括例如经 皮施用（诸如经由透皮贴剂或离子电渗疗法装置)、眼内施用或者鼻内或吸入施 用。 用于局部施用的组合物还包括例如局部凝胶、 喷雾剂、 软膏和乳膏。 局部 制剂可以包括可增强有效成分经过皮肤或其他受侵袭区域的吸收或穿透的化 合物。当本发明的化合物通过经皮装置施用时，施用可以利用贮药库 (reservoir) 和多孔膜型的贴片或者固体基质类型的贴片完成。用于此种目的的典型制剂包 括凝胶、 水凝胶、 洗剂、 溶液、 乳膏、 软膏、 丸衣粉、 敷料、 泡沫剂、 膜、 皮 肤贴片、 糯米纸囊剂 (wafers)、 埋植剂、 海绵、 纤维、 绷带和微乳剂。 还可以 使用脂质体。 典型的载体包括醇、 水、 矿物油、 液体石蜡、 白矿脂、 甘油、 聚 乙二醇和丙二醇。可以引入穿透促进剂- 参见例如 J Pharm Sci, 88(10), 955-958， Finnin and Morgan(October 1999) 0 适合局部施用于眼的制剂包括例如滴眼剂， 其中本发明的化合物被溶解或 悬浮在合适的载体中。适合眼部或耳部施用的典型制剂可以是微粉化悬浮液滴 剂形式或者可以是等渗、 pH经调整的无菌盐水中的溶液的形式。 适合眼部及 耳部应用的其他制剂包括软膏等。
生物可降解（ 即， 可吸收的凝胶海绵、 胶原） 和非生物降解性（ 即， 硅酮) 埋植剂、糯米纸囊剂、镜片 (lenses) 和微粒或囊状系统 (vesicular systems), 诸如 niosomes 或脂质体。 聚合物， 诸如交联聚丙烯酸、 聚乙烯醇、 透明质酸、 纤维 素聚合物（例如， 羟丙基甲基纤维素、 羟乙基纤维素或甲基纤维素） 或杂多糖 聚合物（ 例如， 琼脂糖胶)， 可以与防腐剂（ 诸如氯苄垸铵） 掺和在一起。 此类 制剂也可以通过离子电渗疗法递送。
对于鼻内施用或通过吸入施用， 本发明的活性化合物以溶液或悬浮液形式 从由患者挤压或泵送的泵式喷雾容器方便地递送， 或者作为喷雾剂形式利用合 适的推进剂从加压容器或喷雾器方便地递送。适合鼻内施用的制剂通常以干粉 形式（ 单独的， 作为混合物， 例如， 以含乳糖的干掺合物， 或者作为混合的组 分颗粒， 例如， 与磷脂（ 诸如卵磷脂)） 从干粉吸入器施用， 或者作为喷雾剂从 加压容器、 泵、 喷雾器、 雾化器（优选利用电动水力学的雾化器， 以产生细雾) 或喷洒器施用， 利用或不利用合适的推进剂，诸如 1， 1， 1， 2- 四氟乙烷或 1， 1， 1 , 2， 3， 3， 3- 七氟丙垸。 关于鼻内应用， 粉剂可包含生物粘合剂， 例如， 壳聚糖或环糊精。
在另一实施方式中， 本发明包括直肠剂量形式。 此种直肠剂量形式可以是 例如栓剂的形式。可可脂是传统的栓剂基质，但是可以适当地使用各种备选物。
还可以采用制药领域己知的其他载体材料和施用方式。本发明的药物组合 物可以通过药剂学中任一种熟知的技术来制备， 诸如有效配制和施用步骤。 关 于有效配制和施用步骤的上述考虑在本领域是熟知的且描述于标准教科书中。 药物的酉己制例如在 Hoover, John E，， Remington ' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. , Easton, Pennsylvania, 1975 ； Liberman et al.， Eds., Pharmaceutical Dosage Forms , Marcel Decker, New York, N.Y. , 1980 ；禾口 Kibbe et al.， Eds.， Handbook of Pharmaceutical Excipients(3rd Ed.)， American Pharmaceutical Association, Washington, 1999 中进行了讨论。
同时施用
本发明的化合物可以单独或者与其他治疗剂结合使用， 以治疗多种病症或 疾病状态。 本发明的化合物和其他治疗剂可以同时（ 在同一剂型中或在单独的 剂型中） 或顺序施用。
两种或更多种化合物 "联合"施用是指两种化合物施用时间足够接近， 以 至一种化合物的存在影响另一种的生物效应。 两种或更多种化合物可以同时、 并存或顺序施用。 另外， 同吋施用可以通过在施用前混合化合物进行， 或者通 过在相同时间点但在不同解剖位置或者利用不同施用途径来进行。
措辞 "共同施用"、 "共施用"、 "同时施用"及 "同时地施用"指联合施用 化合物。
试剂盒
本发明还包括适合用于执行上述治疗方法的试剂盒。 在一个实施方式中， 所述试剂盒含包含一种或更多种本发明化合物的第一剂量形式和剂量容器， 该 剂量的量足以实施本发明的方法。
在另一实施方式中， 本发明的试剂盒包括一种或更多种本发明化合物。 本发明化合物可用在制备抑制 p53-MDM2蛋白相互作用的药物方面。 本发明化合物及其盐类具有良好的抗肿瘤活性， 多个化合物高于阳性对照 药 nUtlin-3， 因此本发明化合物及其盐类可以用于制备抗肿瘤药物。
本发明化合物及其盐类具有良好的抗炎活性， 因此本发明化合物及其盐类 可以用于制备抗炎药物。 具体实施方式
以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用 于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 如《分子 克隆： 实验室手册》 （New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的条件或厂商提供的条件进行。
实施例 1 : 2- -4-苯基 -4-氧代 -2-丁烯酸甲酯的制备
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将 29.2 g (0.2 mol) 草酸二乙酯、 12.0 g (0.1 mol) 苯乙酮混合液缓慢滴入 2 mol/L的甲醇钠 /甲醇溶液中， 溶液慢慢变成黄色， 有固体析出。 滴毕， 机械搅 拌下， 70°C加热 2-3小时， 停止加热， 冷却至室温， 将反应液倒入 2 L水中， 充分溶解后滤除不溶物。 滤液用浓盐酸调节 pH 至 3-4， 冰水浴下搅拌 1-2小 吋， 析出大量淡黄色固体， 抽滤、 用清水洗净得到淡黄色固体， 冷冻干燥得纯 品 15.0 g， 收率 72.8%。
Ή NMR (300 MHz, OMSO-d6) δ: 14.83 (bar, 1H)， 8.06 (d， 2W, J = 7.5 Hz), 7.70 (t, 1H, J=7.1 Hz), 7.57 (d, 2H, J=7.5 Hz), 7.11 (s， 1H), 3.85(s, 3H). ESI-MS (m/z): 207.29 [M+ 1]+.
实施例 2: 2-(3-(l /-咪唑)丙基)异吲哚 -1，3-二酮
Figure imgf000013_0001
将 2.0 g 60%的氢化钠与 2.7 g 咪唑投入 25 mL茄形瓶中，加入 50 mL DMF
40°C搅拌 1.5小时后将 5.4 g 2-(3-溴丙基)异吲哚 -1，3-二酮加入反应瓶中， 搅拌 30分钟后加热至 80°C， 反应过夜， TLC显示反应完全， 停止反应， 加水， 乙 酸乙酯萃取， 无水硫酸钠干燥有机相。 快速制备色谱分离 (CH2C12: CH3OH = 100:1)得到白色固体 1.18 g， 收率 24.7%。
Ή NMR (300 MHz, DMSO- 6) δ: 7.86 (m, 4H), 7.62 (s, 1H), 7.18 (s， 1H), 6.86 (s, 1H), 4.00 (t, 2H, J ΊΛ Hz), 3.53 (t, 1H， J = 6.8 Hz), 2.01 (m, 2H). ESI-MS (m/z): 255.27 [M + 1]+.
实施例 3: 3-(1 -咪唑)丙胺的制备
Figure imgf000013_0002
将 1.0 g 2-(3-(1//-咪唑)丙基)异吲哚 -1，3-二酮与 0.50 g 80%的水合肼加入 60 mL 乙醇中， 加热回流 12 小时， 冷却， 滤除析出的白色固体， 再将滤液浓缩 至 20 mL后加入 4 mol/L的盐酸 10 mL, 然后加热至 50°C 30分钟， 滤除析出 的白色固体，将滤液冷却至 0°C，加 KOH固体至溶液 pH 10-12，有固体析出， 加水溶解析出的固体后用二氯甲垸萃取， 干燥有机相， 蒸干得到无色液体 220 mg， 收率 44.8%。
Ή NMR (300 MHz, DMSO-c6) δ: 7.48 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 4.00 (t, 2H, J= 6.9 Hz), 2.70 (t, 1H， J= 6.8 Hz), 1.90 (m, 2H). ESI-MS (m/z): 126.35 [M + 1]+.
实施例 4: l-(3-(l -咪唑）丙基) -4-苯甲酰基 -5-(4-溴苯基 )-3-羟基 -17 -吡咯
Figure imgf000014_0001
将 1.80 g对溴苯甲醛与 1.25 g 3-(l/ -咪唑)丙胺加入 10 mL 1,4-二氧六环中， 室温搅拌 30分钟后将 2.06 g用 5 mL 1，4-二氧六环溶解的 2-羟基 -4-苯基 -4-氧代 -2-丁烯酸甲酯缓慢滴入反应瓶中， 慢慢的有少量固体析出， 滴毕， 室温反应 24小时。反应液变成粘稠状， 加水稀释后有大量固体产生， 抽滤得到淡黄色固 体， 用甲醇重结晶得到白色固体 2.40 g， 收率 64.5%。
Ή NMR (300 MHz, DMSO-c 6) δ: 8.20 (s, 1H)， 7.70 (d， 2H, J = 6.9 Hz), 7.46 (m, 3H), 7.36 (m, 3H), 7.30 (m, 2H), 7.15 (s, IH), 5.46 (s, IH), 3.95 (m, 2H)， 3.51 (m， 1H)， 2.61 (m, IH), 1.83 (m, 2H). ESI-MS (m/z): 468.92 [M + 实施例 5: 5-(3-(1 -咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-3-苯基 -4,5-二氢吡咯【3，4-cl吡唑 -6(1 -酮
Figure imgf000014_0002
将 0.5g实施例 4的产物与 0.69g 80%水合肼混合， 用 5ml 醋酸溶解， 加热 至回流， 反应 6小时后 TLC显示反应完全， 快速制备色谱分离 (CH2C12: CH3OH = 100:4)得到淡黄色固体 0.14 g， 收率 28.2%。
Ή NMR (300 MHz, DMSO-c 6) δ: 14.04 (s, IH), 7.62 (s, IH), 7.47-7.53 (m, 4H), 7.21-7.36 (m， 5H), 7.15 (s, 1H)， 6.87 (s， IH), 6.02 (s, 1H)， 3.95 (m， 2H), 3.58 (m, IH), 2.66 (m, IH), 1.88 (m, 2H). ESI-MS (m/z): 462.31 [M + 1]+.
实施例 6~31 :
将 2 mmol溴代烷烃与 2 mmol碳酸钾， 加入到 1 mmol 实施例 5的 5 mL乙醇 溶液中， 80°C 下搅拌 6小时后 TLC显示反应完全， 快速制备色谱分离 (CH2C12: CH3OH = 100:2) 得到白色或淡黄色固体， 收率 35.4〜67.9%。
表 1 实施例 6〜31化合物结构、 名称、 氢谱及质谱数据
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Chiralcel AD-H column 25 cmxO.46 cm (CH3OH, 2.5 mL/min, UV detection at 220 nm)。 （如： 陈德妙等， 《分析化学》 2007年第 01期： 75-78 ) 如： 如： 实施例 12和 30
实施例 12的一对光学异构体：
(+)-5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )小苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1 /)-酮， mp: 79-80 C. *H NMR (600 MHz, DMSO- ) δ: 7.60 (s 1H)， 7.53 (d, 2H J = 8.4 Hz), 7.43-7.49 (m, 2H), 7.23-7.40(m, 10H), 7.14 (s IH), 6.87 (s IH), 6.02 (s, IH), 5.56 (d, 2H, J = 5.4 Hz), 3.96 (m 2H), 3.60 (m IH), 2.68 (m IH), 1.89 (m, 2H). ESI-MS (m/z): 552.43 [M+H] +. [a]D = +58.6° (c = 2.31 in CH3OH).
(-)-5-(3-(1 /-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-苄基 -3-苯基 -4 5-二氢吡咯 [3 4-c]吡 唑 -6(1 )-酮， mp: 77-79 °C. Ή NMR (600 MHz, OMSO-d6) δ: 7.60 (s 1H)， 7.55 (d 2U, J = 8.4 Hz), 7.43-7.49 (m, 2H), 7.23-7.40(m, 10H), 7.14 (s IH), 6.87 (s IH), 6.02 (s, IH), 5.56 (d, 2U, J = 5.4 Hz), 3.96 (m, 2H), 3.60 (m, IH), 2.68 (m IH), 1.89 (m, 2H). ESI-MS (m/z): 552.50 [M+H] +. [a]D = -57.6° (c = 2.21 in CH3OH). 实施例 30的一对光学异构体：
(+)-5-(3-(1 /-咪唑）丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-对氟苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡唑 -6(1 )-酮. mp: 82-83 ° C. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ： 7.61 (s, IH), 7.53 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.48-7.50 (m, 4H), 7.21-7.30 (m 7H), 7.15 (s, IH), 6.88 (s, 1H), 6.02 (s， 1H)， 5.55 (d， 2H, J = 4.8 Hz), 3.96 (m， 2H), 3.60 (m, 1H), 2.67 (m, 1H), 1.90 (m， 2H). ESI-MS (m/z): 570.51 [M+H] +. [a]D = +94.9° (c = 1.26 in CH3OH).
(-)-5-(3-(1/ -咪唑）丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-对氟苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡唑 -6(1/ )-酮. mp: 81-82 ° C. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ： 7.60 (s, 1H), 7.53 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.48-7.50 (m， 4H), 7.21-7.30 (m， 7H), 7.14 (s， 1H), 6.87 (s, 1H)， 6.01 (s, 1H), 5.54 (d, 2H， J = 4.8 Hz), 3.96 (m, 2H), 3.60 (m， 1H)， 2.67 (m, 1H), 1.90 (m, 2H). ESI-MS (m/z): 570.46 [M+H] +. [a]D = -85.6。 (c = 1.24 in CH3OH). 实施例 32: 荧光偏振法测定 p53-MDM2蛋白结合抑制活性
用与 MDM2残基 1-1 18结合的 p53来测定 MDM2的抑制活性。 这种复合 物的已公开的晶体结构 (Kussie等， Science 274： 948-953(1996))证实含有 p53 结合位点的片断， 并且我们已经解析了 p53肽类似物 MPRFMDYWEGLN的 X-衍射结构（Bottger 等， J.Mol.Biol. 269:744-756(1997)).本实例使用 5-FAM-( -A)-(P-A)-FM- Aib-pY-(6-Cl-DL-Trp)-E-Ac3c-LN-NH2 (PMDM6-F)， 其 d达到了 1 nM。
将 5 μL试验化合物、 MDM2 (10 nM)与 PMDM6-F (10 nM) (buffer: 100 mM 磷酸三钾， pH 7.5 ; lOO g/mL BGG; 0.02% 叠氮钠)加入 96孔黑色平底酶标 板中至终体积 125 L， 室温孵育 2小时后， 用 Biotek -Synergy 2读取荧光偏振 值。 用 Gmphpad Prism绘制曲线， 计算得蛋白结合抑制常数 ( )。 本发明化合 物其范围在 0.015 μΜ至>100 μΜ不等。
将高活性的化合物 nutlin-3 ( Shanghai Haoyuan Chemexpress) 以同样的条 件配成阳性对照品溶液。
试验结果见表 2，其中，样品是指相应实施例中制备的吡咯酮类化合物（例 如实施例 5 即： 5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c] 吡唑 -6(1 /)-酮。
表 2 测试化合物对 p53-MDM2蛋白相互作用抑制常数 (单位： μΜ) 样品名称 样品名称 Ki (μΜ) 实施例 5 47.42 实施例 19 0.06 实施例 6 0.17 实施例 20 ― 实施例 7 ― 实施例 21 16.02 实施例 8 3.82 实施例 22 1.9 实施例 9 6.78 实施例 23 0.28 实施例 10 ― 实施例 24 2.51 实施例 11 ― 实施例 25 2.48 实施例 12 0.25 实施例 26 0.96 实施例 13 0.11 实施例 27 121.74 实施例 14 0.23 实施例 28 0.72 实施例 15 10.8 实施例 29 0.49 实施例 16 0.66 实施例 30 0.08 实施例 17 13.24 实施例 31 28.16 实施例 18 56.5 nutlin-3 0.09 以上实验结果表明， 本发明的大多数化合物具有较好的 P53-MDM2 蛋白 相互作用抑制活性， 多个化合物优于或相当于阳性对照药 mitlin-3。 实施例 33: LPS诱导的 RAW264.7细胞体外抗炎实验
细胞株选用 RAW264.7 (小鼠巨噬细胞， ATCC #TIB-71 )进行实验， 由第 二军医大学药学院生药教研室冻存和传代。 培养液为 DMEM+10%FBS+双抗。
样品配制： 用 DMSO (Merck) 溶解后， 加入 PBS (-)配成 lOOO g/ml的溶 液或均匀的混悬液， 然后用含 DMSO的 PBS (-)稀释。
将 RAW264.7细胞用 0.25%胰酶消化， 收集细胞， 吹打均匀， 加入培养基 将细胞浓度调整至 1 X 106 cell/mL，将细胞接种至 96孔板，每孔 ΙΟΟμΙ,于 37°C、 5%C02条件下过夜。 次日弃去培养液， 加入 lOOuL含 2 g/mL LPS的培养基， 培养 lh后加入 ΙΟΟμΙ配置好的各个浓度的药物， 于 37°C， 5%C02条件下培养 24hc 吸取培养上清液 lOOuL于 96孔板， 每孔再加入 lOOuL Griess试剂， 漩涡 振荡使之混匀， 室温避光静置 30min， 用酶标仪于 540nm波长处 OD值。 将上 清液弃去， 向每孔中加入含 2 mg/mL MTT的细胞培养液， 于 37°C、 5%C02 条件下培养 4h， 弃去上清， 加入 200uL的 DMSO将紫色结晶溶解， 用酶标仪 于 570nm下测波长处 OD值。 计算半数抑制浓度 IC5()。
试验结果见表 3，其中，样品是指相应实施例中制备的吡咯酮类化合物（例 实施例 8 即： 5-(3-(1 -咪唑)丙基 HK4-溴苯基 )小烯丙基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡唑 -6(1/ )-酮。
表 3 测试化合物对巨噬细胞 RAW 264.7抗炎活性 (单位： g/ml)
样品名称
实施例 8 14.1
实施例 9 12.5
实施例 12 6.9
实施例 13 3 1.0
实施例 23 20.0
实施例 28 135.0
实施例 31 >200
以上实验结果表明， 本发明的化合物具有较好的抗炎活性， 可作为良好的 抗炎剂。 实施例 34: 肿瘤细胞增殖抑制试验
对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验， 试验方法采用常规的 MTT 法 （如吕秋军主编 《新药药理学研究方法》， 化学工业出版社， 2007: 242-243 )。
细胞株选用天然表达野生型 p53的 A549 (人肺腺癌细胞)、 和天然 p53缺 失的 NCI-H1299 (人肺腺癌细胞）、 U20S (人骨肉瘤细胞）、 Saos-2 (人成骨 肉瘤细胞）进行对照实验， 由上海医药工业研究院药理实验室冻存和传代。 培 养液为 DMEM+10%FBS+双抗。
MTT溶液配制： 称取 MTT 0.5克， 溶于 100 ml的磷酸缓冲液 （PBS ) 或 无酚红的培养基中， 用 0.22μηι滤膜过滤以除去溶液里的细菌， 放 4。C 避光保 存。
样品配制： 用 DMSO (Merck) 溶解后， 加入 PBS (-)配成 lOOO g/ml的溶 液或均匀的混悬液， 然后用含 DMSO的 PBS (-)稀释。
将高活性的化合物 nutlin-3以同样的条件配成阳性对照品溶液。 MTT法。 96孔板每孔加入浓度为 5-6χ 104个 /ml的细胞悬液 100μ1， 置 37°C， 5% C02培 养箱内。 24h后， 加入样品液， ΙΟμΙ/孔， 设双复孔， 37°C， 5% C02作用 72h。 每孔加入 5mg/ml的 MTT溶液 20μ1，作用 4h后加入溶解液， ΙΟΟμΙ/孔， 置培养 箱内，溶解后用 ΜΚ-2全自动酶标仪测 570nm OD值。计算半数抑制浓度 IC5o。
试验结果见表 4， 其中， 样品是指相应实施例中制备的吡咯酮类化合物（例 实施例 5即： 5-(3-(1 -咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡唑 -6(1 )-酮。
表 4 测试化合物对肿瘤细胞 A549(wt-p53)和 H1299(p53 null)的半数抑制浓度
IC5()(单位： g/ml)
A549(wt-p53) H 1299(p53 null) 编号
ic50 IC50
100 g/ml时 IC% lOO g/ml时
( g/ml) ( g/ml)
实施例 5 10.99 100 1 1.84 100 实施例 6 9.65 100 9.83 100 实施例 7 10.92 100 10.75 100 实施例 8 > 100 17.26 >100 16.06 实施例 9 12.67 98.72 34.35 100 实施例 10 1 1.50 100 14.84 100 实施例 11 > 100 28.1 1 >100 13.34 实施例 12 20.32 100 18.42 100 实施例 13 14.45 100 12.70 100 实施例 14 16.94 100 16.50 100 实施例 15 >100 29.38 >100 14.18 实施例 16 13.85 100 16.02 100 实施例 17 8.04 100 1 1.04 100 实施例 18 2.92 100 3.93 100 实施例 19 2.61 100 1.55 100 实施例 20 14.71 100 >100 7.26 实施例 21 1 1.73 100 10.47 100 实施例 22 10.86 100 12.00 100 实施例 23 10.51 100 9.97 100 实施例 24 5.63 100 3.13 89.95 实施例 25 8.75 100 2.34 100 实施例 26 > 100 26.24 >100 30.47 实施例 27 21.21 100 13.76 86.52 实施例 28 73.05 55.59 49.92 68.85 实施例 29 > 100 25.55 17.20 92.66 实施例 30 3.31 100 1 .36 100 实施例 31 > 100 26.41 > 100 18.86 nutlin-3 12.09 100 4.34 100 表 5 测试化合物对肿瘤细胞 U20S和 Saos- -2的半数抑制浓度 IC5。(单位： μδ/ΐΉΐ)
编号 U20S Saos— 2 实施例 5 24.38 26.91 实施例 6 32.71 17.49 实施例 7 22.82 18.64 实施例 8 > 100 >100 实施例 9 39.43 29.91 实施例 10 28.28 28.96 实施例 11 > 100 > 100 实施例 12 36.78 33.19 实施例 13 34.01 25.32 实施例 14 35.43 54.18 实施例 15 > 100 >100 实施例 16 37.15 31.03 实施例 17 20.59 22.67 实施例 18 20.49 6.26 实施例 19 5.72 2.49 实施例 20 > 100 > 100 实施例 21 27.67 18.45 实施例 22 17.63 20.05 实施例 23 25.22 22.71 实施例 24 3.39 3.6
实施例 25 7.91 2.28 实施例 26 > 100 >100 实施例 27 3 1 .97 3 1.35 实施例 28 > 100 87
实施例 30 2.09 5.08 nutlin-3 12.76 4.14 以上实验结果表明， 本发明的大多数化合物具有良好抗肿瘤活性， 多个化 合物高于阳性对照药 nutlin-3 , 可作为良好的抗肿瘤剂。 实施例 35: 光学异构体的体外抗肿瘤活性
参照实施例 34的实验方法测试光学异构体的体外抗肿瘤活性。
细胞株选用天然表达野生型 p53的 A549 (人肺腺癌细胞)、 和天然 p53缺 失的 NCI-H1299 (人肺腺癌细胞）、 U2 0S (人骨肉瘤细胞）、 Saos-2 (人成骨 肉瘤细胞） 进行对照实验， 由上海医药工业研究院药理实验室冻存和传代。 实验结果如表 6:
表 6 光学异构体的活性
IC50 ( g/ml)
样品名称
A549 H1299 U2 OS Saos-;
(+)-实施例 12 8.60 1.26 2.90 4.23
(-) -实施例 12 6.64 1.59 1.25 1.32 实施例 12 14.98 4.90 12.24 15.02
(+)-实施例 30 5.79 1.31 1.32 1.26
(-) -实施例 30 6.44 1.30 1.33 1.30 实施例 30 5.77 1.63 1.42 1.12 nutlin-3 8.38 12.20 2.18 1.97 以上实验结果表明， 本发明化合物的光学异构体也都具有良好抗肿瘤活性， 也高于阳性对照药 nutlin-3, 可作为良好的抗肿瘤剂。 实施例 36: 实施例 12、 19、 23和 30化合物对人体肺癌 A549裸鼠移植瘤体内 的药效研宄
实验方法：
1实验动物： BALB/C裸鼠， 来源： 中国科学院上海实验动物中心， 生产许可 证号： SCXK2003-0003 , 性别： 雄性， 体重： 18-20g, 每组动物数： 6只
2样品配制：
实验化合物加入一滴盐酸， 用生理盐水溶解至所需浓度。
3试验方法：
取 A549肿瘤细胞悬浮液皮下植入小鼠的右腋窝区域，接种后 13日，待荷 瘤小鼠肿瘤体积长至 120mm3左右， 将肿瘤生长较好的动物进行随机分组 （治 疗组 6只， 对照组 10只） ， 并开始给药， 给药方案如下：
1 ) Control (生理盐水） ， 灌胃， 剂量 25mg/kg， 14天； 2) 化合物 DOX， 静脉注射， 剂量 10mg/kg， 1天；
3 ) 实施例 12、 19、 23和 30化合物， 灌胃， 剂量 200mg/kg， 14天； 之后每四天对肿瘤体积及小鼠体重进行监测， 肿瘤体积 （tumor volume, TV) 计算公式为： TV(mm3) 二长径 (a)x短径 (b)2/2。 29 天后处死小鼠， 解剖取瘤块 进行数据分析。 肿瘤抑制率计算公式为： RTVtum。 RTVe。ntrolx lOO%， RTV是相 对肿瘤体积。
4试验结果
表 7实施例 12、 19、 23和 30化合物对人体肺癌 A549裸鼠移植瘤的体内药效 组别 剂量 给药方案 动物数 肿瘤抑制率
Control 25mg/kg ipx l4 10
DOX 1 Omg/kg ivx l 6 53.25% 实施例 12 200mg/kg igx l 4 6 52.43% 实施例 19 200mg/kg igx l4 6 41.42% 实施例 23 200mg/kg igx l4 6 40.92% 实施例 30 200mg/kg igx l 4 6 31.86% 从体内抑瘤结果可知，实施例 12具有和对照药物 DOX相近的体内抗肿瘤 活性， 且其在有效剂量下， 对动物的体重影响小。 综上， 因此本发明化合物及其盐类可以用于制备 p53-MDM2 蛋白相互作 用小分子抑制剂。 以上显示和描述了本发明的基本原理、 主要特征和本发明的优点。 本行业 的技术人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还 会有各种变化和改进， 这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1、 一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋体、 顺反异构体以及任 意组合或其药用盐， 结构如 I )所示：
权
Figure imgf000027_0001
其中， 是氢、 低级烷基、 低级烷氧基、 低级链烯基、 环烷基、 三唑环、 芳基、 杂芳基、 饱和或部分不饱和杂环、 芳垸基或杂芳基垸基；
书
R2是氢、 低级垸基、 低级烷氧基、 低级链烯基、 环垸基、 三唑环、 芳基、 杂芳基、 饱和或部分不饱和杂环、 芳烷基或杂芳基烷基；
R3是氢、 羟基、 氨基、 任选取代的胺基、 低级烷基、 卤素、 类卤素、 低 级垸氧基、 低级链烯基、 硝基、 羟基亚胺烷基、 三唑环、 邻间对位取代或二 取代的芳基、 邻间对位取代或二取代的杂芳基、 邻间对位取代或二取代的饱 和或部分不饱和杂环；
是氢、 低级烷基、 卤素、 类卤素、 低级卤代垸基、 低级垸氧基、 低级 链烯基、 环垸基、 硝基、 叠氮基、 羧基或烷氧基羰基、 羟基、 氟取代低级烧 氧基、 羟基取代低级垸基、 羧基或酯基取代低级垸基、 酰胺基、 低级酰胺基 ：院基、 羟基亚胺烷基、 芳基、 杂芳基、 饱和或部分不饱和杂环、 芳垸基或杂 芳基烷基、 -NHRa， 其中 Ra是氢、 低级垸基、 低级卤代烷、 邻间对位取代或 二取代芳基、 邻间对位取代或二取代芳胺基、 饱和或部分不饱和杂环、 邻间 对位取代或二取代芳烷基或杂芳基垸基；
n为 1至 6之间的整数；
X是独立地氧或硫原子；
所述低级垸基为含 1 至 8个碳原子直链或支链垸基； 低级垸氧基为含 1 至 8个碳原子直链或支链烷氧基； 低级卤代垸基为含 1至 3个卤原子取代的 低级垸基。
2、 根据权利要求 1所述的一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋 体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 其特征在于， 式（I )中
Rl， R2所述芳基， 杂芳基是指取代的芳基， 取代的杂芳基。 所述的取代 是指被下列一个或多个基团取代： 氢， 卤素， 羟基， 硝基， 氨基， 氰基， 羧 基， 低级烷基， 低级垸氧基， 低级链烯基；
R3， R4所述的取代是指被下列一个或多个基团取代： 氢， 卤素， 羟基， 硝基， 氨基， 氰基， 羧基， 低级垸基， 低级烷氧基， 低级链烯基；
所述低级垸基为含 1至 7个碳原子直链或支链垸基。
3、 根据权利要求 1所述的一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋 体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 其特征在于， 式（I )中
1 ,是苯基、 对氟苯基、 对氯苯基、 对溴苯基、 对碘苯基、 对硝基苯基、 对羟基苯基、 对甲氧基苯基、 对甲基苯基、 邻氟苯基、 邻氯苯基、 邻溴苯基、 邻碘苯基、 邻硝基苯基、 邻羟基苯基、 邻甲氧基苯基、 间氟苯基、 间氯苯基、 间溴苯基、 间碘苯基、 间硝基苯基、 间羟基苯基、 间甲氧基苯基， 或二氯苯 基；
是苯基、 对氟苯基、 对氯苯基、 对溴苯基、 对碘苯基、 对硝基苯基、 对羟基苯基、 对甲氧基苯基、 对甲基苯基、 对叔丁基苯基、 萘基、 邻氟苯基、 邻氯苯基、 邻溴苯基、 邻碘苯基、 邻硝基苯基、 邻羟基苯基、 邻甲氧基苯基、 间氟苯基、 间氯苯基、 间溴苯基、 间碘苯基、 间硝基苯基、 间羟基苯基、 间 甲氧基苯基、 二甲基苯基、 二氯苯基、 噻吩基、 呋喃基、 吡啶基， 或邻氯吡 啶基；
R3是氯、 溴、 咪唑基， 或吡啶基；
是氢、 甲基、 乙基、 丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 正戊基、 正己 基、 正庚基、 正辛基、 叔丁基、 烯丙基、 丙炔基、 环丁基、 环戊基、 环己基、 苄基、 对氟苄基、 邻氟苄基、 间氟苄基、 乙酸乙酯基、 丙酸乙酯基、 丁酸乙 酯基、 乙酸基、 丙酸基， 或丁酸基；
n为 1至 3之间的整数。
4、 根据权利要求 1所述的一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋 体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 其特征在于， 式（I )中
R>是苯基； R2是对溴苯基；
R3是咪唑基；
R4是氢、 低级垸基、 卤素、 类卤素、 低级卤代垸基、 低级垸氧基、 低级 链烯基、 环烷基、 硝基、 叠氮基、 羧基或垸氧基羰基、 羟基、 氟取代低级垸 氧基、 羟基取代低级垸基、 羧基或酯基取代低级垸基、 酰胺基、 低级酰胺基 垸基、 羟基亚胺烷基、 芳基、 杂芳基、 饱和或部分不饱和杂环、 芳垸基或杂 芳基垸基、 -NHRa， 其中 Ra是氢、 低级烷基、 低级卤代垸、 邻间对位取代或 二取代芳基、 邻间对位取代或二取代芳胺基、 饱和或部分不饱和杂环、 邻间 对位取代或二取代芳垸基或杂芳基垸基；
所述低级垸基为含 1至 7个碳原子直链或支链烷基。
5、 根据权利要求 4所述的一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋 体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 其特征在于， 式（I )中
n为 1至 3之间的整数。
6、 根据权利要求 4所述的一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋 体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 其特征在于， 式（I )中
X是氧。
7、 根据权利要求 1所述的一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋 体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 其特征在于， 式 （ I ) 化合物选 自以下化合物：
5-(3-(1/ -咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡唑 -6(l )- 酮、
5-(3-(1 /-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-甲基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡唑 -6(1/7)-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-正丁基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1/7)-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-烯丙基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1 ^)-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-炔丙基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1/ )-酮、
5-(3-(1//-咪唑)丙基) - 4-(4-溴苯基 )小环己基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1 )-酮、 5-(3-(1//-咪唑〕丙基) -4-(4-溴苯基) - 1-正辛基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]口比 唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1/ -咪唑〕丙基) -4-(4-溴苯基) - 1-苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡唑
-6(1//)-酮、
5-(3-(1/ -咪唑〕丙基) -4-(4-溴苯基) - 1-异丙基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1 -咪唑〕丙基) _4-(4-溴苯基) - 1-环丁基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]口比 唑 -6(1 /)-酮、
5-(3-(1 /-咪唑; 1丙基) -4-(4-溴苯基) - 1 -正庚基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]口比 唑 -6(1/ )-酮、
5-(3-(1//-咪唑; >丙基) -4-(4-溴苯基) - 1-环戊基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]口比 唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1/ -咪唑; >丙基) -4-(4-溴苯基 )- 1-正丙基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(1/^)-酮、
5-(3-(1/ -咪唑: >丙基：) -4-(4-溴苯基) - 1-乙基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡唑
-6(1//)-酮、
5-(3-(1//-咪唑: >丙基：) -4-(4-溴苯基) - 1-正戊基 -3-苯基 -4，5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6 1/7)-酮、
5-(3-(1/ -咪唑: >丙基) -4-(4-溴苯基) - 1-正己基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -6(：1//)-酮、
5-(3-(1/ -咪唑: >丙基) -4-(4-溴苯基) - 1-异丁基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1/ -咪唑 )丙基: 1-4-(4-溴苯基)小(2- (四氢 -2//-吡喃) -2-羟乙基 )-3-苯基
-4,5-二氢吡咯 [3，4-( ：]吡唑 -6(1/7)-酮、
5-(3-(1/ -咪唑: >丙基) -4-(4-溴苯基) - 1 -(2-羟乙基 )-3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c] 吡唑 -6(1//)-酮、
5-(3-(1 -咪唑 )丙基) -4-(4-溴苯基) -•1-邻氟苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c] 吡唑 -6(1 )-酮、
5-(3-(1 -咪唑、 )丙基) _4-(4-溴苯基) - .1-叔丁基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -6(1//)-酮、
2-(5-(3-(1 -咪唑)丙基) -4-(4-溴苯 1)-6氧代 -3-苯基 -5,6-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -1(4 /)乙酸乙酯、
4-(5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-6氧代 -3-苯基 -5,6-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -1 4 )丁酸乙酯、
3- (5-(3-(1//-咪唑)丙基 )-4_(4-溴苯基 )-6氧代 -3-苯基 -5,6-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -1(4/ )丙酸乙酯、
4- (5-(3-(1 -咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-6氧代 -3-苯基 -5,6-二氢吡咯 [3,4-c]吡 唑 -1(4//)丁酸、
5- (3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-对氟苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c] 吡唑 -6(1/ )-酮、
3-(5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-6氧代 -3-苯基 -5,6-二氢吡咯 [3，4-c]吡 唑 -1(4/ )丙酸、
(+)-5-(3-(1 /-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基)小苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c] 吡唑 -6(1//)-酮、
(-)-5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1 -苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c] 吡唑 -6(1/ )-酮、
(+)-5-(3-(1//-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-对氟苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3，4-c]吡唑 -6(1/7)-酮， 或
(-)-5-(3-(1 /-咪唑)丙基) -4-(4-溴苯基 )-1-对氟苄基 -3-苯基 -4,5-二氢吡咯 [3,4-c]吡唑 -6(1//)-酮。
8、 根据权利要求 1-7所述的一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消 旋体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 其特征在于， 所述的药用盐为 有机酸盐或无机酸盐。
9、 根据权利要求 8所述的一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋 体、 顺反异构体以及任意组合或其药用盐， 其特征在于， 无机酸是指盐酸、 硫酸、 磷酸、 二磷酸、 氢溴酸或硝酸； 有机酸是指乙酸、 马来酸、 富马酸、 酒石酸、 琥珀酸、 乳酸、 对甲苯磺酸、 水杨酸或草酸。
10一种如权利要求 1-7所述的吡咯酮类化合物的制备方法， 包括如下步骤：
( 1 ) 通过各种 2-羟基 -4-苯基 -4-氧代 -2-丁烯酸甲酯、 相应的醛与相应的胺在 1,4-二氧六环中进行三组分反应得到吡咯酮基本母核；
(2 ) 通过与肼环合得到吡咯酮并吡唑母核；
( 3 ) 通过取代反应得到取代的吡咯酮并吡唑类化合物。 11、 一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋体、 顺反异构体以及 任意组合或其药用盐， 在制备 P53-MDM2/X蛋白相互作用小分子抑制剂中的 应用。
12、 一种吡咯酮类化合物， 包括其光学异构体、 外消旋体、 顺反异构体以及 任意组合或其药用盐， 在制备抗肿瘤药物或抗炎药物中的应用。
13、 如权利要求 11或 12所述的应用， 其特征在于， 所述的吡咯酮类化合物 为权利要求 1-7所述的吡咯酮类化合物。
14、 根据权利要求 12所述应用， 其特征在于， 其中的肿瘤是指食道、 胃、 肠、 直肠、 口腔、 咽、 喉、 肺、 结肠、 乳腺、 子宫、 子宫内膜、 卵巢、 前列腺、 睾丸、 膀胱、 肾、 肝、 胰腺、 骨、 结缔组织、 皮肤、 眼、 脑和中枢神经系统 部位发生的癌症， 或甲状腺癌、 白血病、 霍金氏病、 淋巴瘤、 骨髓瘤。
15、 根据权利要求 14所述应用， 其特征在于， 其中的肿瘤是指肺癌和骨癌。
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