WO2014129490A1 - 尿中メガリン測定値から糸球体濾過量を推定する方法 - Google Patents

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邦弘 山縣
昭 樋渡
正大 萩原
寛之 黒澤
吉朗 平山
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    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine

Definitions

  • the present invention relates to a method for estimating glomerular filtration rate from urinary megalin measurement values.
  • ESKD End-Stage-kidney disease
  • CKD is a risk factor for cardiovascular disease (CVD).
  • CVD cardiovascular disease
  • CKD cardiovascular disease
  • GFR glomerular filtration rate
  • Urinary megalin is a substance found in connection with renal diseases, and a simple means of examining renal damage by measuring urinary megalin has been disclosed (Patent Documents 1 and 2).
  • Megalin also known as Glycoprotein 330 (gp330) or Low Density Lipoprotein (LDL) -receptor relate protein 2 (LRP2), is a glycoprotein with a molecular weight of approximately 600 kDa expressed in the proximal tubular epithelial cells of the kidney ( Non-patent documents 1, 2).
  • Non-patent Document 3 membrane-bound full-length megalin and Soluble-Form (fragment containing extracellular region) lacking the intracellular region.
  • An object of the present invention is to provide a method for estimating GFR without using serum creatinine.
  • the present inventors have found that there is a high correlation between the urinary megalin excretion amount and the estimated glomerular filtration rate (eGFR) of a renal disease patient, and measuring urinary megalin.
  • the present inventors have found that the glomerular filtration rate (GFR) can be estimated non-invasively with high accuracy, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A method of estimating glomerular filtration rate from the measured value of urinary megalin.
  • GFR glomerular filtration rate
  • the present invention is a method for estimating glomerular filtration rate (GFR) with high accuracy from the measured value of urinary megalin in a subject.
  • Full-length human megalin consists of the 26th to 4655th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of human megalin.
  • the first to 25th sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are signal peptide sequences.
  • the amino acid sequence of human megalin is disclosed in NCBI (National Center for Biotechnology Information) Accession No .: NP_004516 (RefSeq protein ID: 126012573).
  • Human megalin is a single transmembrane glycoprotein composed of three regions: an extracellular region, a transmembrane region, and an intracellular region.
  • a region consisting of the 26th to 4424th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is referred to as the extracellular region of human megalin.
  • a region consisting of amino acids 4447 to 4655 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is referred to as an intracellular region of human megalin.
  • a region consisting of amino acids 4425 to 4446 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is called a transmembrane region of human megalin.
  • the extracellular region fragment of human megalin is a fragment that includes a part or all of the extracellular region and that means a part or all of the region consisting of the 26th to 4424th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Examples of the human megalin extracellular region fragment lacking the intracellular region include a fragment consisting of the 26th to 4361th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. This fragment is the remaining extracellular region-side fragment generated in the process of forming a primary cleavage product consisting of the amino acid sequence from 4362 to 4655 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Furthermore, examples of the human megalin extracellular region fragment lacking the intracellular region include a fragment consisting of the 4362th to 4437th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. This fragment is the remaining extracellular region-containing fragment formed in the above-mentioned secondary cleavage product formation process, consisting of the amino acid sequence from the 4438th to the 4655th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • megalin excreted in urine is measured.
  • the megalin to be measured may be full-length megalin, extracellular region megalin, or intracellular region megalin.
  • extracellular region megalin is measured.
  • urine as a specimen may be obtained from any subject.
  • the method for collecting urine is not limited, but it is preferable to use early morning urine or occasional urine.
  • the amount of urine necessary for the test method of the present invention is about 10 to 200 ⁇ L.
  • the test method of the present invention may be performed simultaneously with a conventional general urine test.
  • the treatment of urine which is a specimen, can be performed by adding a treatment solution to the collected urine and mixing it.
  • the treatment solution may be any solution as long as it can adjust urine pH, mask urine sediment and / or solubilize megalin.
  • a chelating agent, a surfactant, etc. are added to the buffer solution.
  • the added solution is illustrated.
  • the buffer solution and the chelating agent may be any known one, and the surfactant is preferably a nonionic surfactant.
  • the treatment liquid include a solution containing 0.2 M EDTA and 10% (Vol./Vol.) Triton X-100 in 2 M Tris-HCl (pH 8.0).
  • a urine sample solution can be obtained by adding 10 ⁇ L of the treatment solution to 90 ⁇ L of a urine sample and mixing them.
  • Immunological methods include, for example, immunostaining (including fluorescent antibody method, enzyme antibody method, heavy metal labeled antibody method, radioisotope labeled antibody method), separation by electrophoresis and fluorescence, enzyme, radioisotope, etc.
  • a urine sample solution is added to a microtiter plate on which an anti-megalin antibody is solid-phased to cause an antigen-antibody reaction, and then an enzyme-labeled anti-megalin antibody is added to cause an antigen-antibody reaction, followed by washing. Then, it reacts with the enzyme substrate and develops color, and the absorbance is measured to detect megalin in urine, and the urinary megalin concentration can be calculated from the measured value.
  • fluorescence may be measured after an antigen-antibody reaction using a fluorescently labeled anti-megalin antibody.
  • the anti-megalin antibody used in the immunological technique may be an antibody that can recognize and detect human megalin.
  • the anti-megalin antibody used in the present invention may be a known antibody or an antibody developed in the future.
  • the anti-megalin antibody may be, for example, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and includes a chimeric antibody, a humanized antibody, or a binding activity fragment thereof.
  • the region of megalin to be recognized is not limited, and an antibody that recognizes an extracellular region and an antibody that recognizes an intracellular region can be used. These antibodies may be labeled with an enzyme or a fluorescent dye. Two or more types of anti-megalin antibodies may be used.
  • Two or more kinds of anti-megalin antibodies are preferably antibodies that are used in the sandwich method and recognize different epitopes.
  • an antibody against the extracellular region megalin can be used as the anti-megalin antibody.
  • the anti-megalin antibody from the 26th amino acid of SEQ ID NO: 26 in the extracellular region of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • Two or more types of antibodies that recognize different epitopes among the epitopes present in the region between the second amino acids (LBD1) can be used.
  • the urinary megalin value is a measured value of urinary megalin and may be the urinary megalin concentration itself, but the urinary megalin concentration relates to a urinary component that is stably excreted in the urine. It may be a value corrected with a value (urinary component value).
  • urine creatinine is particularly preferable, and it is preferable to correct the urinary megalin concentration with the urine creatinine concentration.
  • the urinary creatinine concentration is considered to be almost constant for one individual regardless of the disease because the production of creatinine depends on the amount of muscle.
  • a method of correcting the amount of the intended urinary component by the amount per 1 g of creatinine is generally used. It becomes possible to compare urine components per gram.
  • the value obtained by correcting the urinary megalin concentration with the urinary creatinine concentration is called urinary megalin excretion (MEG / Cre) and can be calculated by the following equation.
  • the urinary megalin measurement value is associated with the glomerular filtration rate, and the glomerular filtration rate is estimated from the urinary megalin measurement value based on the association.
  • GFR glomerular filtration rate
  • creatinine clearance can also be used.
  • eGFR estimated glomerular filtration rate
  • eGFR estimated glomerular filtration rate
  • R 2 (R is a correlation coefficient) is 0.3 or more, preferably 0.4 or more.
  • eGFR is an estimated value of GFR, and urinary megalin excretion has a high correlation with eGFR, so GFR can be estimated with high accuracy from urinary megalin excretion.
  • the GFR estimated by the method of the present invention is likely to be close to the actual GFR, and in this respect, it can be said that the GFR can be estimated with a high probability by the method of the present invention.
  • an equation representing the relationship between the urinary megalin measurement value and the eGFR may be obtained by regression analysis.
  • EGFR can be estimated from the excretion.
  • GFR can be estimated by estimating eGFR.
  • the present invention measures the urinary megalin measurement value and eGFR or GFR of a plurality of subjects, obtains a regression equation showing the relationship between the megalin measurement value and eGFR or GFR by regression analysis, and determines the eGFR or GFR from the urinary megalin measurement value. It also includes a method of obtaining a calculation formula for estimating.
  • eGFR estimation formula is for Japanese, but eGFR can be estimated from serum creatinine level and age regardless of race. Therefore, GFR can be estimated from urinary megalin excretion regardless of race.
  • the urinary megalin measurement value is associated with the glomerular filtration rate measured using inulin clearance or the glomerular filtration rate measured using creatinine clearance, and the glomerular filtration rate is determined from the urinary megalin measurement value based on the association. Can also be estimated.
  • Example 1 Measurement of urinary megalin excretion amount Monoclonal antibody against human megalin extracellular region (anti-extracellular region megalin monoclonal antibody) is used to excrete fragments containing human megalin extracellular region (extracellular region megalin) into urine.
  • the anti-extracellular region megalin monoclonal antibody is a mouse monoclonal antibody that recognizes an epitope present in the region (LBD1) between the 26th amino acid and the 314th amino acid of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • LBD1 region between the 26th amino acid and the 314th amino acid of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Measurement was evaluated using anti-human megalin LBD1 monoclonal antibody A and anti-human megalin LBD1 monoclonal antibody B that recognize two different epitopes in LBD1.
  • Ethylenediamine-N, N, N', N'-tetraacetic acid is abbreviated as EDTA
  • 10 % (vol./vol.) Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether hereinafter, Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether is referred to as Triton X-100
  • 10 ⁇ L of pH 8.0 solution 10 ⁇ L of pH 8.0 solution
  • 100 ⁇ L of the mixed solution are mixed.
  • Anti-human megalin LBD1 monoclonal antibody A-immobilized microtiter plate (FluoroNunc TM Module F16 Black-Maxisorp TM Surface plate, manufactured by Nalge Nunc International) was added to the wells. Leave at 37 ° C for 1 hour, then remove the urine sample solution added to the wells by decantation, add TBS-T to the wells of the microtiter plate at 200 ⁇ L / well, and remove TBS-T by decantation. T was removed and washing was performed. This washing process was performed three times in total. Thereafter, an ALP-labeled anti-human megalin LBD1 monoclonal antibody B (0.5 ng / mL) solution was added at 100 ⁇ L / well.
  • an ALP-labeled anti-human megalin LBD1 monoclonal antibody B 0.5 ng / mL
  • ALP-labeled anti-human megalin LBD1 monoclonal antibody B was prepared in a labeled antibody diluent. Leave at 37 ° C for 1 hour, then remove the ALP-labeled antibody solution added to the well by decantation, add TBS-T to the well of the microtiter plate at 200 ⁇ L / well, and decant TBS-T was removed and washed. This washing process was performed a total of 4 times. Thereafter, Assay Buffer was added to the well of the microtiter plate at 200 ⁇ L / well, and the Assay Buffer was removed by decantation and washed. This washing step was performed twice.
  • CDP-Star (registered trademark) Chemiluminescent Substrate for Alkaline Phosphatase Ready-to-Use (0.4 mM) with Emerald-II (TM) Enhancer (ELISA-Light (TM) System: Applied Biosystems)
  • TM Emerald-II
  • TM Enhancer
  • TM ELISA-Light
  • ALP As an enzyme reaction substrate solution, it was added at 100 ⁇ L / well and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes in the dark. Immediately thereafter, the accumulated luminescence intensity for 1 second in this well was measured, and the measured value was used as an index for measurement evaluation of urinary megalin.
  • Microplate Luminometer Centro LB960 and MicroWin2000 software (Berthold) were used.
  • Urinary megalin excretion (pmol / g) 100 x Urinary megalin concentration (pM) ⁇ Urinary creatinine concentration (mg / dL)
  • Example 2 Relationship between urinary megalin excretion and estimated glomerular filtration rate (eGFR)
  • concentration of megalin in 45 patients with renal disease was measured to determine the urinary megalin excretion.
  • eGFR was calculated using the following estimation formula issued in March 2008 from the Japanese Nephrological Society Project “Japanese GFR Estimation Formula”.
  • eGFR (mL / min / 1.73m 2 ) 194 ⁇ Cr -1.094 ⁇ Age -0.287 (Cr is serum creatinine level, Age is age) (If the subject is female, multiply by 0.739)
  • AMG ⁇ 1-microglobulin
  • BMG ⁇ 2-microglobulin
  • NAG N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminidase
  • urinary megalin is a marker capable of estimating eGFR with high accuracy despite being a proximal tubule injury marker.
  • GFR can be estimated with high accuracy by measuring urinary megalin according to the present invention.
  • inspection method of this invention is urine, unlike the conventional method, it can test

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Abstract

　本発明は、簡便且つ非侵襲的に糸球体腎機能を推測する方法を提供することを課題とする。　本発明者らは上記課題を解決するために、腎疾患患者の尿中メガリン排泄量とeGFRに高い相関関係があることを見出し、尿中メガリン測定することにより非侵襲的にGFRを高い確率で推定することが可能であることを見出し、本発明を完成した。

Description

尿中メガリン測定値から糸球体濾過量を推定する方法
　本発明は、尿中メガリン測定値から糸球体濾過量を推定する方法に関する。
　透析や移植を必要とするend-Stage kidney disease(ESKD)患者は世界中で増え続けており、1990～2000年の10年間でESKD患者は43万人から106.5万人に増加したが、2008年には少なくとも165万人程度に増加している。2011年には日本の維持透析患者数は約30万人となり、人口100万人当たりの患者では2126人であり、世界第2位である。慢性腎臓病(CKD)は世界中で増え続けるESKDの予備軍であり、米国の2000年のCKD患者数は成人人口の13.07%(2561万人)と推測されている。日本の2005年のCKD患者数は成人人口の12.9%(1330万人)であり、CKD予備軍も含めると2,000万人にもなるとされている。また、CKDは心血管疾患(CVD)の危険因子であり、欧米のCKDにおいては、透析導入される患者数よりもCVDにより死亡する患者のほうが多く、わが国においてもCKDはCVDの危険因子である。しかし、CKD患者がそれぞれの進行過程に合った、適切な治療をきちんと行えば、透析導入や心疾患で死亡する人数を大幅に減らすことが可能であると考えられる。そのためには適切な評価方法が必要であり、既存の検査方法で正確に腎機能を評価できるのが糸球体濾過量(GFR)である。糸球体濾過量とは、単位時間当たりに腎臓のすべての糸球体により濾過される血漿量のことをいう。腎不全等により腎機能が低下している場合、糸球体での濾過能が低下しているため、GFRを測定することで腎機能低下の程度を知ることができる。正確なGFRを求めるにはイヌリンを用いたイヌリンクリアランス測定法が推奨されているが、イヌリンクリアランスの測定は煩雑なため、臨床の場ではクレアチニンを用いたクレアチニンクリアランスや推算糸球体濾過量(eGFR)が用いられている。しかし、クレアチニンクリアランスやeGFRを求めるには血清クレアチニン値が必要である。血清クレアチニンの検査は侵襲的であり患者負担が大きい。そこで、非侵襲的にGFRが推定できれば患者にとって有益である。
　腎疾患に関連して見られる物質として尿中のメガリンがあり、尿中メガリンを測定することによる、簡便な腎障害の検査手段が開示されている（特許文献１、２）。
　Glycoprotein330(gp330)あるいはLow Density Lipoprotein(LDL)-receptor relate protein 2(LRP2)としても知られるメガリン(Megalin)は、腎臓の近位尿細管上皮細胞に発現する分子量が約600kDaの糖タンパク質である（非特許文献１、２）。
　メガリンは腎臓の近位尿細管上皮細胞を用いた細胞培養実験において、膜結合型の完全長メガリンと、細胞内領域を欠いたSoluble-Form（細胞外領域含有フラグメント）の二種類が存在していることが知られており（非特許文献３）、尿中の完全長ヒトメガリン、細胞外領域、細胞内領域を測定する方法も報告されている（特許文献３）。
国際公開ＷＯ２００２／０３７０９９号 国際公開ＷＯ２０１０／１２６０５５号 国際公開ＷＯ２０１０／１２６０４３号
Christensen E.I. , Willnow T.E. (1999) J. Am. Soc. Nephrol. 10 , 2224-2236 Zheng G , McCluskey R.T. et al. (1994) J. Histochem. Cytochem. 42 , 531-542 Flavia F.J. , Julie R.I. et al. (1998) Kidney. International. 53 , 358-366
　本発明は、血清クレアチニンを使用せずにGFRを推定する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために、腎疾患患者の尿中メガリン排泄量と推算糸球体濾過量（eGFR）の間に高い相関関係があることを見出し、尿中メガリンを測定することにより非侵襲的に糸球体濾過量（GFR）を高い精度で推定することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　尿中メガリン測定値から糸球体濾過量を推定する方法。
[２]　尿中メガリン測定値と糸球体濾過量を関連付け、該関連付けに基づいて、尿中メガリン測定値から糸球体濾過量を推定する、[１]の糸球体濾過量を推定する方法。
[３]　尿中メガリン測定値と糸球体濾過量の関連付けを回帰分析により行う、[１]又は[２]の糸球体濾過量を推定する方法。
[４]　尿中メガリン測定値が尿中クレアチニン濃度により補正して得られる尿中メガリン排泄量である、[１]～[３]のいずれかの糸球体濾過量を推定する方法。
[５]　糸球体濾過量がイヌリンクリアランスから求められることを特徴とする[１]～[４]のいずれかの糸球体濾過量を推定する方法。
[６]　糸球体濾過量がクレアチニンクリアランスから求められることを特徴とする[１]～[４]のいずれかの糸球体濾過量を推定する方法。
[７]　糸球体濾過量が推算糸球体濾過量から求められることを特徴とする[１]～[４]のいずれかの糸球体濾過量を推定する方法。
[８]　尿中メガリンが尿中細胞外領域メガリンである[１]～[７]のいずれかの糸球体濾過量を推定する方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-030206号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明の尿中メガリン測定値より糸球体濾過量（GFR）を推定する方法により、侵襲的な検査を用いて測定され、あるいはeGFRとして推算されていたGFRを非侵襲的に推定することが可能となる。
腎疾患患者の尿中メガリン排泄量とeGFRとの関係を示す図である。（実施例2、比較例） 腎疾患患者のα1-ミクログロブリンとeGFRとの関係を示す図である。（比較例） 腎疾患患者のβ2-ミクログロブリンとeGFRとの関係を示す図である。（比較例） 腎疾患患者の腎疾患患者のN-アセチルβ-D-グルコサミニダーゼとeGFRとの関係を示す図である。（比較例）
　本発明は被験者の尿中メガリン測定値から高い精度で糸球体濾過量（GFR：glomerular filtration rate）を推定する方法である。
　完全長ヒトメガリンは、配列番号２に示すアミノ酸配列の第26番目から第4655番目のアミノ酸配列からなる。配列番号１には、ヒトメガリンの塩基配列を示す。配列番号２に示すアミノ酸配列の第１番目から第25番目の配列は、シグナルペプチドの配列である。ヒトメガリンのアミノ酸配列は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のAccession No.：NP_004516 (RefSeq protein ID：126012573)に開示されている。ヒトメガリンは細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域の３領域から構成されている一回膜貫通型糖タンパク質である。配列番号２に示すアミノ酸配列の第26番目から4424番目のアミノ酸からなる領域をヒトメガリンの細胞外領域という。また、配列番号２に示すアミノ酸配列の第4447番目から第4655番目のアミノ酸からなる領域をヒトメガリンの細胞内領域という。同様に配列番号２に示すアミノ酸配列の第4425番目から4446番目のアミノ酸からなる領域をヒトメガリンの膜貫通領域という。ヒトメガリンの細胞外領域フラグメントは、細胞外領域の一部または全部を含み、且つ配列番号２に示すアミノ酸配列の第26番目から第4424番目のアミノ酸からなる領域の一部または全部を意味するフラグメントをいい、細胞内領域を欠いている。細胞内領域を欠いたヒトメガリン細胞外領域フラグメントとして、配列番号２に示すアミノ酸配列の第26番目から第4361番目のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙げられる。該フラグメントは、前記の配列番号２に示すアミノ酸配列の第4362番目から第4655番目のアミノ酸配列からなる一次切断産物形成過程にて生じた残りの細胞外領域側フラグメントである。さらに、細胞内領域を欠いたヒトメガリン細胞外領域フラグメントとして、配列番号２に示すアミノ酸配列の第4362番目から第4437番目のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙げられる。該フラグメントは、配列番号２に示すアミノ酸配列の第4438番目から第4655番目のアミノ酸配列からなる、前述の二次切断産物形成過程において生じた残りの細胞外領域含有フラグメントである。
　本発明においては、尿中に排泄されたメガリンを測定する。測定するメガリンは完全長のメガリン、細胞外領域のメガリン、細胞内領域のメガリンのいずれでも良い。好ましくは細胞外領域メガリンを測定する。本明細書において、検体である尿は、いかなる被験者から得られたものであってもよい。尿の採取方法は問わないが、早朝尿または随時尿を用いることが好ましい。また、本発明の検査方法に必要な尿の量は10～200μＬ程度である。本発明の検査方法は、従来の一般的な尿検査と同時に行われてもよい。
　検体である尿の処理は、採取された尿に処理液を添加して混合することにより行うことができる。処理液は、尿のpH調整、尿沈渣のマスキングおよび／またはメガリンの可溶化が可能なものであればいかなるものであってもよいが、好ましくは、緩衝液にキレート剤、界面活性剤などを添加した溶液が例示される。緩衝液、キレート剤は、公知のものであればいずれであってもよく、界面活性剤は、非イオン界面活性剤を用いることが好ましい。処理液としては、例えば２M Tris-HCl（pH8.0）に、0.2M EDTAと10％（Vol./Vol.）TritonX-100を含む溶液が例示される。かかる処理液10μＬを、尿検体90μＬに添加して混合することにより、尿試料溶液を得ることが可能である。
　尿試料溶液からメガリンを検出する方法は様々な方法が考えられる。メガリンの検出方法の一例として、免疫学的手法が挙げられる。免疫学的手法は、例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素などによる検出方法とを組み合わせた方法（ウエスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法（LA：Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay）、イムノクロマト法などにより行うことができるが、ELISA法またはLA法を用いることが好ましい。定量性の観点からELISA法のうちサンドイッチ法を用いることが好ましい。サンドイッチ法では、抗メガリン抗体を固相化したマイクロタイタープレートに尿試料溶液を添加し、抗原・抗体反応をさせ、さらに酵素標識した抗メガリン抗体を添加し、抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定して尿中のメガリンを検出すると共に、その測定値から尿中メガリン濃度を算出することができる。また、蛍光標識した抗メガリン抗体を用いて、抗原・抗体反応をさせた後に蛍光を測定してもよい。
　免疫学的手法において用いられる抗メガリン抗体は、ヒトメガリンを認識し検出しうる抗体であればよい。本発明において用いられる抗メガリン抗体は、公知のものであってもよく、また今後開発される抗体であってもよい。特に限定されないが、抗メガリン抗体として、例えばモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよく、キメラ抗体やヒト化抗体、あるいはこれらの結合活性断片などが挙げられる。また、認識するメガリンの領域も限定されず、細胞外領域を認識する抗体も細胞内領域を認識する抗体も用いることができる。これらの抗体は酵素や蛍光色素で標識化されていてもよい。また、２種類以上の抗メガリン抗体を用いてもよい。２種類以上の抗メガリン抗体は、上記のサンドイッチ法に用いられ、互いに異なるエピトープを認識する抗体であることが好ましい。例えば、抗メガリン抗体として、細胞外領域メガリンに対する抗体を用いることができ、具体的には、抗メガリン抗体として、配列番号２に示すアミノ酸配列の細胞外領域内の配列番号26番目のアミノ酸から314番目のアミノ酸の間の領域（LBD1）に存在するエピトープのうち異なるエピトープを認識する２種類以上の抗体を用いることができる。
　本発明において、尿中のメガリン値とは、尿中メガリン測定値であり、尿中メガリン濃度自体であってもよいが、尿中メガリン濃度を、尿中に安定に排泄される尿中成分に関する値（尿中成分値）で補正した値であってもよい。
　尿中成分としては、特に尿中クレアチニンが好ましく、尿中クレアチニン濃度により尿中メガリン濃度を補正することが好ましい。尿中クレアチニン濃度はクレアチニンの産生が筋肉の量に依存することから、一個体に対して疾患にかかわらずほぼ一定であると考えられている。尿中成分の検査においては、尿の希釈や濃縮の影響を回避するため、クレアチニン１ｇ当りの量により目的とする尿中成分の量を補正する手法が一般的に用いられており、これによりクレアチニン単位グラム当たりの尿中成分を比較することが可能になる。尿中メガリン濃度を、尿中クレアチニン濃度により補正して得られる値は、尿中メガリン排泄量（MEG/Cre）と称し、以下の式により算出することができる。
＜式＞　MEG/Cre：尿中メガリン排泄量（pmol/gCre）＝100×尿中メガリン濃度（pM）÷尿中クレアチニン濃度（mg/dL）
　本発明の方法においては、尿中メガリン測定値と糸球体濾過量を関連付け、該関連付けにより尿中メガリン測定値から糸球体濾過量を推定する。
　糸球体濾過量（GFR）は、厳密に測定するにはイヌリンクリアランスを用いるが、クレアチニンクリアランスを用いることもできる。さらに、糸球体濾過量として、推算糸球体濾過量（eGFR)を用いることもできる。
　推算糸球体濾過量(eGFR：estimated glomerular filtration rate）は、日本腎臓学会プロジェクト「日本人のGFR推算式」より2008年3月に出された推算式により、年齢と血清クレアチニン値から以下の式により推算することができる。
eGFR(mL/min/1.73m2)=194×Cr-1.094×Age-0.287（Crは血清クレアチニン値、Ageは年齢）（被験体が女性の場合は0.739を乗ずる）
　この式で推算したeGFRと上記のpmol/gCreで表される尿中メガリン排泄量との間に正の相関がある。例えば、尿中メガリン排泄量が0～100pmol/gCre、eGFRが0～150mL/min/1.73m2)の範囲でR2（Rは相関係数）は、0.3以上、好ましくは0.4以上であり、尿中メガリン排泄量が高い程、eGFRも高くなる。eGFRはGFRの推算値であり、尿中メガリン排泄量はeGFRと高い相関を有するので、尿中メガリン排泄量から高い精度でGFRを推定することができる。本発明の方法により推定されるGFRは実際のGFRと近似している可能性が高く、その点で本発明の方法により高い確率でGFRを推定することができるということもできる。
　尿中メガリン測定値と糸球体濾過量を関連付けるには、例えば、尿中メガリン測定値とeGFRの間の関係を表す式を回帰分析により求めればよく、求めた回帰式に基づいて、尿中メガリン排泄量からeGFRを推算することができる。eGFRを推算することにより、GFRを推算することができる。本発明は、複数の被験体の尿中メガリン測定値とeGFR又はGFRを測定し、回帰分析によりメガリン測定値とeGFR又はGFRの関係を示す回帰式を求め、尿中メガリン測定値からeGFR又はGFRを推算するための計算式を得る方法も包含する。
　上記のeGFRの推算式は日本人を対象としているが、eGFRは人種に拘わらず血清クレアチニン値及び年齢から推算することができる。従って、人種に拘わらず尿中メガリン排泄量からGFRを推定することができる。
　また、尿中メガリン測定値とイヌリンクリアランスを用いて測定した糸球体濾過量又はクレアチニンクリアランスを用いて測定した糸球体濾過量とを関連付け、該関連付けに基づいて尿中メガリン測定値から糸球体濾過量を推定することもできる。
　尿中メガリン測定値から推定されるGFRが低下しているほど、腎機能が低下していることを示し、本発明の方法により推定したGFRに基づいて腎機能が低下した患者の治療方法等を決定することができる。
　以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
（実施例１）尿中メガリン排泄量の測定
　ヒトメガリン細胞外領域に対するモノクローナル抗体（抗細胞外領域メガリンモノクローナル抗体）を用いてヒトメガリン細胞外領域を含有するフラグメント（細胞外領域メガリン）の尿中排泄量を測定した。抗細胞外領域メガリンモノクローナル抗体とは、配列番号２に示すアミノ酸配列の配列番号26番目のアミノ酸から314番目のアミノ酸の間の領域（LBD1）に存在するエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体である。LBD1中の異なる二つのエピトープを認識する抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Ａと抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Ｂを用いて測定評価した。抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Ａ固相化マイクロタイタープレートと、ALP（アルカリフォスファターゼ）標識化抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Ｂを用いて、尿中のヒトメガリン細胞外領域含有フラグメントを測定した。
　先ず、尿90μLと2M Tris-HCl,0.2M Ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acid(以下、Ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acidをEDTAと略す),10%(vol./vol.) Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether（以下、Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl EtherをTriton X-100と称する）、pH8.0溶液10μLを混合し、該混合液100μLを抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Ａ固相化マイクロタイタープレート（FluoroNunc（商標） Module F16 Black-Maxisorp（商標） Surface plate , Nalge Nunc International社製）のウェルへ加えた。37℃で1時間放置し、その後、ウェルに加えておいた尿サンプル溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、TBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるTBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計３回行った。その後、ALP標識化抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Ｂ(0.5ng/mL)溶液を100μL/ウェルで加えた。ALP標識化抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Ｂは標識抗体希釈液にて調製した。37℃で1時間放置し、その後、ウェルに加えておいたALP標識化抗体溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、TBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるTBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計4回行った。その後、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、Assay Bufferを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるAssay Bufferの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計2回行った。次に、ウェルへCDP-Star（登録商標） Chemiluminescent Substrate for Alkaline Phosphatase Ready-to-Use (0.4mM) with Emerald-II(商標） Enhancer(ELISA-Light(商標) System：Applied Biosystems社製)をALP酵素反応基質溶液として、100μL/ウェルで加え、37℃、30分遮光放置した。その後直ちに、本ウェルの1秒間の積算発光強度を測定し、測定値を尿中メガリンの測定評価の指標とした。化学発光強度の測定には、Microplate Luminometer Centro LB960とMicroWin2000 software(Berthold社製)を用いた。検量線の標準品としては、腎臓から抽出したNative-ヒトメガリンを使用した。尿中メガリン濃度を尿中クレアチニン濃度により補正した尿中メガリン排泄量を、以下の式から算出した。
＜式＞　MEG/Cre：尿中メガリン排泄量（pmol/g）＝100×尿中メガリン濃度（pM）÷尿中クレアチニン濃度（mg/dL）
(実施例２）尿中メガリン排泄量と推算糸球体濾過量（eGFR）との関係
　実施例１の方法により腎疾患患者45例のメガリン濃度を測定し、尿中メガリン排泄量を求めた。また、日本腎臓学会プロジェクト「日本人のGFR推算式」より2008年3月に出された以下の推算式を用いてeGFRを求めた。
eGFR(mL/min/1.73m2)=194×Cr-1.094×Age-0.287（Crは血清クレアチニン値、Ageは年齢）（被験体が女性の場合は0.739を乗ずる）
　尿中メガリン排泄量とeGFRとの関係を図１に示す。図１より尿中メガリン排泄量とeGFRには高い相関関係(R2=0.4266)があることがわかった。つまり、尿中メガリンからeGFRを推定することが可能になる。
（比較例）他の腎疾患マーカーとeGFRと関係
　実施例１の方法により腎疾患患者45例の尿中メガリン排泄量を測定し、尿中メガリン排泄量を求めた。また、日本腎臓学会プロジェクト「日本人のGFR推算式」より2008年3月に出された推算式を用いてeGFRを求めた。
　さらに、尿中メガリンと同様な近位尿細管障害マーカーであるα1-ミクログロブリン(AMG)、β2-ミクログロブリン(BMG)、N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ(NAG)の測定を行なった。上記に示したAMG、BMG、NAGは尿中マーカーなので尿中クレアチニンで補正を行なう。AMG、BMG、NAGは市販のキットを用いて測定した。
　eGFRとAMG、BMG、NAGとの関係を、それぞれ図２、３及び４に示す。
　実施例２及び比較例の結果より、尿中メガリンを含む4種類の尿中マーカーで最もeGFRと相関関係が高いのは尿中メガリンであった。つまり、近位尿細管障害マーカーであるにも関わらず、eGFRを高い精度で推定することが可能なマーカーは尿中メガリンである。
　上記説明したとおり、本発明により尿中メガリンを測定することでGFRを高い精度で推定することが可能である。また、本発明の検査方法の試料は尿であるため、従来法と違い非侵襲的に検査を行なうことができ、患者の身体的負担を軽減することができ、有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (8)

  1. 　尿中メガリン測定値から糸球体濾過量を推定する方法。
  2. 　尿中メガリン測定値と糸球体濾過量を関連付け、該関連付けに基づいて、尿中メガリン測定値から糸球体濾過量を推定する、請求項１記載の糸球体濾過量を推定する方法。
  3. 　尿中メガリン測定値と糸球体濾過量の関連付けを回帰分析により行う、請求項１又は２に記載の糸球体濾過量を推定する方法。
  4. 　尿中メガリン測定値が尿中クレアチニン濃度により補正して得られる尿中メガリン排泄量である、請求項１～３のいずれか１項に記載の糸球体濾過量を推定する方法。
  5. 　糸球体濾過量がイヌリンクリアランスから求められることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の糸球体濾過量を推定する方法。
  6. 　糸球体濾過量がクレアチニンクリアランスから求められることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の糸球体濾過量を推定する方法。
  7. 　糸球体濾過量が推算糸球体濾過量から求められることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の糸球体濾過量を推定する方法。
  8. 　尿中メガリンが尿中細胞外領域メガリンである請求項１～７のいずれか１項に記載の糸球体濾過量を推定する方法。
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