WO2014126127A1 - ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物及びその有効成分のスクリーニング方法 - Google Patents

ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物及びその有効成分のスクリーニング方法 Download PDF

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annexin
peptide receptor
formyl peptide
inhibitor
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理一郎 阿部
奈央 齋藤
清水　宏
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    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related diseases.
  • a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease particularly Stevens Johnson syndrome, or toxic epidermal necrosis can be treated.
  • Drug eruption refers to skin eruption that occurs in response to drugs, and all drugs can cause drug eruptions. Severe drug eruptions that are life-threatening due to drug eruptions are called severe drug eruptions, the most severe form of which is Stevens-Johnson Syndrome (hereinafter sometimes referred to as SJS) and addictive.
  • SJS Stevens-Johnson Syndrome
  • Epidermal necrosis Toxic epidermal necrolysis; hereinafter sometimes referred to as TEN
  • TEN is a very poor prognosis characterized by high fever and extensive necrosis of epidermal cells.
  • SJS severe mucosal eruptions and erythema of the skin are seen in the transmucosal areas such as the lips, ocular mucosa, and vulva, and erosion, blistering, and peeling of the body surface are 10% or less of the body surface area.
  • SJS is said to be caused by viruses other than drugs, but most of them are caused by drugs.
  • TEN also includes subtypes that have migrated from SJS, the symptoms of which are similar to SJS, but are more severe than SJS as a whole, and erosion, blistering, and epidermal detachment are seen in more than 10% of the body surface area. Further, symptoms appear not only in the skin and mucous membranes but also in the eyes, and blindness may occur, and the mortality rate of TEN is 20 to 25% (Non-patent Document 1).
  • Drugs that cause SJS and TEN include cefdinir, a cephem antibiotic, antiepileptic drugs (eg, zonisamide, carbamazepine, and phenobarbital), or non-steroidal anti-inflammatory drugs. It is said that there are more than 1100 types of drugs that cause this.
  • the most important and best treatment is to immediately discontinue the administration of the presumed cause when initial symptoms such as fever and rash are observed.
  • the initial symptoms of SJS and TEN are similar to the symptoms of normal drug eruption that only appears as a skin rash. If SJS and TEN are not diagnosed, drug discontinuation may be delayed and the symptoms may become severe.
  • the treatment after the administration of the causative drug is discontinued includes systemic administration of corticosteroids, plasma exchange therapy, or administration of immunoglobulins, and topical antibiotic preparations for the skin surface, external adrenal cortex Hormone preparations are used.
  • these treatment methods are symptomatic treatments and not the fundamental treatment of SJS and TEN.
  • an object of the present invention is to analyze the mechanism of occurrence of severe mucosal eruption and erythema on the skin, erosion on the body surface, blisters, and epidermis peeling, and provide a pharmaceutical composition for radical treatment for those symptoms. That is. Moreover, it is providing the method of screening the active ingredient of the said pharmaceutical composition.
  • the present inventor surprisingly found that the symptoms of these diseases caused the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1. It was found to be caused by mediated necroptosis.
  • the present inventors have found that formyl peptide receptor 1-induced necroptosis can be suppressed by an inhibitor of formyl peptide receptor 1 or an annexin A1 inhibitor.
  • formyl peptide receptor 1-induced necroptosis can also be suppressed by an inhibitor of necroptosis caused by the binding of TNF and TNF receptor, which are the triggers of conventional necroptosis. .
  • composition for preventing or treating formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related diseases comprising as an active ingredient a substance that suppresses necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1 object,
  • the inhibitory substance is an annexin A1 inhibitor, formyl peptide receptor 1 inhibitor, RIP (Receptor-interacting protein) 1 inhibitor, RIP (Receptor-interacting protein) 3 inhibitor, and two or more thereof
  • the pharmaceutical composition according to [1] which is a substance selected from the group consisting of a mixture, [3]
  • the pharmaceutical composition according to [1] or [2], wherein the necroptosis-related disease is Stevens-Johnson Syndrome or toxic epidermal necrosis
  • the inhibitor is an annexin A1 inhibitor, it is an anti-annexin A1 antibody, and when it is a formyl peptide receptor 1 inhibitor, it is a formyl peptide receptor 1 antibody,
  • the pharmaceutical composition according to [2] or [3], which is necrostatin 1 in some cases and siRNA when it is a RIP3 inhibitor [5] A necroptosis inducing agent comprising a substance that binds to formyl peptide receptor 1 and induces necroptosis as an active ingredient, [6] The necroptosis inducing agent according to [5], wherein the inducer is fMLP, [7] Contacting formyl peptide receptor 1 or a variant thereof with a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1 in the presence of a test substance, and binding of the receptor or variant thereof to the ligand or agonist Detecting the inhibitory activity of the test substance against the above, or detecting the inhibitory activity of the test substance on necroptosis induced by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1.
  • the formyl peptide receptor 1 variant is (1) a partial peptide of a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a polypeptide that induces necroptosis by binding to annexin A1 (2) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a partial peptide thereof, comprising annexin A1 and A polypeptide that induces necroptosis by binding, (3) a peptide consisting of an amino acid sequence having a homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of 80% or more, or a partial peptide thereof, comprising annexin A1 A polypeptide that induces necroptosis by binding to, or (4) said (1)-( ), A fusion polypeptide that induces necroptosis by binding to annexin A1, and according to any one of [7] to [10] Screening
  • the ligand or agonist of the formyl peptide receptor 1 is fMLP or a derivative thereof, or annexin A1 or a variant thereof, and the annexin A1 variant is (1) an amino acid represented by SEQ ID NO: 4
  • formyl peptide receptor 1 interacts with Gle-Ala-Trp-Phe, which is a peptide of annexin A1 (Non-patent Document 2). Further, it has been reported that necroptosis is induced by the binding of TNF and TNF receptor (Non-patent Documents 3 and 4). However, it was not known at all that formyl peptide receptor 1 and annexin A1 acted on necroptosis signaling and induced necroptosis. In the present specification, “formyl peptide receptor 1-induced necroptosis” means necroptosis induced by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1.
  • a method for preventing or treating a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease [15]
  • the inhibitor is an annexin A1 inhibitor, a formyl peptide receptor 1 inhibitor, a RIP (Receptor-interacting protein) 1 inhibitor, a RIP (Receptor-interacting protein) 3 inhibitor, and two or more thereof
  • the formyl peptide receptor 1-induced necrop according to [14] or [15], wherein the necroptosis-related disease is Stevens-Johnson Syndrome or toxic epidermal necrosis A method for preventing or treating tosis-related diseases, [17]
  • the inhibitor is an annexin A1 inhibitor, it is an anti-annexin A1 antibody, and when it is a formyl peptide receptor 1 inhibitor, it is a formyl peptid
  • the method for preventing or treating a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease according to [14] or [15], which is necrostatin 1 in some cases and siRNA in the case of a RIP3 inhibitor , [18] Inhibitor of necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1, for use in the treatment (method) of a formyl peptide receptor 1 induced necroptosis related disease, [19]
  • the inhibitor is an annexin A1 inhibitor, a formyl peptide receptor 1 inhibitor, a RIP (Receptor-interacting protein) 1 inhibitor, a RIP (Receptor-interacting protein) 3 inhibitor, and two or more thereof
  • the necroptosis-suppressing substance according to [18] which is a substance selected from the group consisting of a mixture, [20]
  • the inhibitor of necroptosis according to [18] or [19], wherein the necroptosis-related disease
  • the inhibitory substance includes an annexin A1 inhibitor, a formyl peptide receptor 1 inhibitor, a RIP (Receptor-interacting protein) 1 inhibitor, a RIP (Receptor-interacting protein) 3 inhibitor, and two or more thereof Use of a necroptosis-suppressing substance according to [22], which is a substance selected from the group consisting of a mixture, [24] Use of the inhibitor of necroptosis according to [22] or [23], wherein the necroptosis-related disease is Stevens-Johnson Syndrome or toxic epidermal necrosis,
  • necroptosis inhibitor Use of the necroptosis inhibitor according to [22] or [23], which is necrostatin 1 in some cases and siRNA when it is a RIP3 inhibitor, [26] Use of an inhibitor of necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1 for the prevention or treatment of a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease, [27] The inhibitor is an annexin A1 inhibitor, a formyl peptide receptor 1 inhibitor, a RIP (Receptor-interacting protein) 1 inhibitor, a RIP (Receptor-interacting protein) 3 inhibitor, and two or more thereof Use of a necroptosis-suppressing substance according to [26], which is a substance selected from the group consisting of a mixture, [28] Use of the inhibitor of necroptosis according to [26] or [27], wherein the necroptosis-related disease is Stevens-Johnson Syndrome or toxic epidermal necrosis, And
  • a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease for example, Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrosis
  • an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease can be screened.
  • necroptosis inducing agent of the present invention and the method for screening active ingredients thereof necroptosis can be induced in cancer cells expressing formyl peptide receptor 1 and used for the treatment of cancer. Furthermore, it can be used for the study of diseases caused by formyl peptide receptor 1-induced necroptosis, and can be used for the development of therapeutic agents for those diseases.
  • composition for the treatment of necroptosis-related diseases inhibits necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1. It contains an inhibitory substance as an active ingredient and treats formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related diseases.
  • Formyl Peptide Receptor 1 is one of the molecules that induce necroptosis that is suppressed by the pharmaceutical composition of the present invention. That is, necroptosis is induced by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1.
  • Human FPR1 is a G protein-coupled receptor (hereinafter sometimes referred to as GPCR) in which 350 amino acids have a structure that penetrates the cell membrane seven times.
  • the bacterial defense ligand fMLP N-formylmethionyl leucylphenylalanine; For-Met-Leu-Phe
  • FPR1 FPR1 to produce a neutrophil bioprotective function, such as ROS production.
  • FPR2 FPR-like1; FPRL1
  • FPR3 FPR-like2; FPRL2
  • FRP2 has 69% homology to FPR1.
  • the formyl peptide receptor 1 that is inhibited by the formyl peptide receptor 1 inhibitor which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, has the ability to bind to annexin A1 and can induce necroptosis.
  • the protein which consists of an amino acid represented by sequence number 2 can be mentioned.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of human formyl peptide receptor 1
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the base sequence of human formyl peptide receptor 1.
  • the formyl peptide receptor 1 is not limited to the human formyl peptide receptor 1 as described above, but includes the mammalian formyl peptide receptor 1.
  • Examples of mammals include humans, monkeys, dogs, cats, ferrets, cows, horses, goats, sheep, guinea pigs, hamsters, gerbils, mice, and rats.
  • the mammalian formyl peptide receptor 1 is described from another viewpoint.
  • 1 to 70 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted.
  • an annexin comprising an amino acid sequence having a homology of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • Annexin A1 is one of the molecules that induces necroptosis that is suppressed by the pharmaceutical composition of the present invention. Specifically, necroptosis is induced by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1.
  • Annexin A1 is a protein belonging to the annexin family and has been suggested to be associated with autoimmune diseases.
  • the annexin family is a protein family having a structure in which a characteristic sequence consisting of about 70 amino acid residues (annexin repeat) is repeated 4 or 8 times, and widely exists from vertebrates to protists. Currently, vertebrate annexins are classified from A1 to A13.
  • Annexin A1 suppressed by an annexin A1 inhibitor which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, is limited as long as it has the ability to bind to formyl peptide receptor 1 and can induce necroptosis.
  • a protein consisting of 346 amino acids represented by SEQ ID NO: 4 can be mentioned.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of human annexin A1
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the base sequence of the region encoding human annexin A1.
  • Annexin A1 is not limited to human annexin A1 as described above, and includes mammalian annexin A1.
  • mammals examples include humans, monkeys, dogs, cats, ferrets, cows, horses, goats, sheep, guinea pigs, hamsters, gerbils, mice, and rats.
  • annexin A1 of mammals are described from another viewpoint, (1) an amino acid sequence in which 1 to 70 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 A polypeptide that induces necroptosis by binding to formyl peptide receptor 1, or (2) an amino acid sequence that is 80% or more homologous to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, A polypeptide that induces necroptosis by binding to peptide receptor 1.
  • Tumor Necrosis Factor binds to Tumor Necrosis Factor Receptor (TNF-R) to form complex I in the cell.
  • TNF-R Tumor Necrosis Factor Receptor
  • TNF-R-induced necroptosis caspase-independent necroptosis
  • FPR1-induced necroptosis Formyl peptide receptor 1-induced necroptosis that can be suppressed by the pharmaceutical composition of the present invention is caused by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1.
  • necroptosis is necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1 instead of binding of TNF and TNF-R.
  • the necroptosis is necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1 instead of binding of TNF and TNF-R.
  • it does not exclude the occurrence of TNF and TNF-R binding.
  • the FPR1-induced necroptosis is suppressed by Nec-1, which is an inhibitor of RIP1 kinase, and RIP3 siRNA, as shown in the Examples.
  • necrosis using signal transduction of TNF-induced necrosis may be used.
  • the cell in which FPR1-induced necrosis is induced is not limited as long as it is a cell in which FPR1 is expressed.
  • adrenocortical cells astrocytes, endothelial cells, epithelial cells, fibroblasts , Hepatocytes, immature dendritic cells, Kupffer cells, macrophages, microglia cells, monocytes, neuroblastoma cells, neutrophils, platelets, cancer cells, ocular conjunctival cells, and skin cells, Skin cells (eg, keratinocytes), hepatocytes, or eye conjunctival cells are preferred.
  • the tissue in which the FPR1-induced necrosis is induced is not limited as long as it is a tissue in which FPR1 is expressed.
  • necroptosis-inhibiting substance which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited as long as it suppresses formyl peptide receptor 1-induced necroptosis, but it is an annexin A1 inhibitor, formyl peptide receptor. 1 inhibitor, RIP (Receptor-interacting protein) 1 inhibitor, RIP (Receptor-interacting protein) 3 inhibitor, or a combination of two or more of these substances, annexin A1 inhibitor, formyl Peptide receptor 1 inhibitors or combinations thereof are preferred. This is because necroptosis induced by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1 can be specifically suppressed.
  • annexin A1 inhibitor is not limited as long as it suppresses necroptosis induced by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1, but for example, annexin A1 is a substance that inhibits annexin A1 activity. Examples thereof include a substance that binds and inhibits the binding to FPR1, and a substance that inhibits the expression of annexin A1. Specific examples include compounds, proteins (for example, anti-annexin A1 antibody), peptides, DNA aptamers, RNA aptamers, or siRNAs that inhibit annexin A1.
  • Formyl peptide receptor 1 inhibitor is not limited as long as it suppresses necroptosis induced by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1, but it inhibits, for example, the activity of formyl peptide receptor.
  • Examples thereof include a substance, a substance that binds to formyl peptide receptor and inhibits the binding to annexin A1, and a substance that inhibits expression of formyl peptide receptor.
  • Specific examples include compounds (eg, formyl peptide receptor antagonists), proteins (eg, anti-formyl peptide receptor antibodies), peptides, DNA aptamers, RNA aptamers, or siRNAs that inhibit formyl peptide receptors. .
  • the formyl peptide receptor 1 antagonist is not limited, for example, CDCA, CHIPS, Coronavirus, 229E peptides, Coronavirus peptides, Cyclosporine A, Cyclosporine H, DCA, Ebola peptides, Mention may be made of FLFLF, Spinorphin, and tBOC, and derivatives thereof having formyl peptide receptor 1 antagonist activity.
  • the RIP1 inhibitor is not limited as long as it suppresses necroptosis induced by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1.
  • the RIP1 inhibitor binds to RIP1, an agent that inhibits RIP1 activity.
  • examples include substances that inhibit the binding to RIP3, formation of complex IIb, and substances that inhibit the expression of RIP1.
  • Specific examples include compounds, proteins (eg, anti-RIP1 antibodies), peptides, DNA aptamers, RNA aptamers, or siRNAs that inhibit annexin A1, inhibit formyl peptide receptors, and the like.
  • necrostatin 1 As an example of the RIP1 kinase inhibitor, necrostatin 1 (Necrostain-1; hereinafter sometimes referred to as Nec-1) is known. Nec-1 is represented by the following formula: By inhibiting RIP1 kinase, necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1 can be suppressed.
  • the RIP3 inhibitor is not limited as long as it suppresses necroptosis caused by formyl peptide receptor 1 and annexin A1, but for example, a substance that inhibits RIP3 activity, binding to RIP3 and binding to RIP1, Examples include substances that inhibit the formation of complex IIb and substances that inhibit the expression of RIP3. Specific examples include compounds, proteins (for example, anti-RIP3 antibodies), peptides, DNA aptamers, RNA aptamers, or siRNA that inhibit annexin A1. RIP3 is sometimes referred to as RIP3 kinase.
  • the anti-annexin A1 antibody, anti-formyl peptide receptor antibody, anti-RIP1 antibody, or anti-RIP3 antibody that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention has an antibody that specifically binds to each protein or an antigen binding site thereof. Although it is an antibody fragment and is not limited as long as it can suppress the expression or function of the protein, respectively, a mouse monoclonal antibody, a chimeric antibody thereof, a CDR grafted antibody, or a human type antibody is preferable. .
  • a monoclonal antibody can be prepared by a known method except that each protein is used as an immunizing antigen.
  • the monoclonal antibody can be prepared according to the method of Koehler and Milstein (Nature 256: 495-497, 1975). it can.
  • As a protein that is an immunizing antigen all or part of a peptide consisting of an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 can be used.
  • an antigen purified from a biological sample a recombinant antigen prepared by genetic engineering, a chemically synthesized partial peptide, or the like can be used.
  • a recombinant antigen expressed in E. coli or yeast it can be used as a fusion antigen with another protein such as SOD or TrpE in order to facilitate expression.
  • His-Tag or the like can be bound and expressed.
  • DNA encoding a mouse heavy chain variable region domain and light chain variable region domain is linked to DNA encoding a constant region polypeptide of a human antibody, and this is incorporated into an expression vector and introduced into a host. And can be obtained.
  • the origin of the heavy chain variable region domain and the light chain variable region domain and the constant region polypeptide used in the chimerized antibody is not particularly limited as long as it is a human antibody.
  • the heavy chain variable region of mouse IgG Chimeric antibodies can be obtained with domains and light chain variable region domains and human IgM or IgG constant region polypeptides.
  • the CDR-grafted antibody is, for example, a graft obtained by replacing the complementarity determining region (CDR) of a mouse antibody with, for example, the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • oligonucleotides were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody had an overlapping portion at the end. It is synthesized from nucleotides by PCR.
  • the obtained DNA can be obtained by ligating with DNA encoding the human antibody C region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it.
  • the origin of the complementarity-determining region used in the CDR-grafted antibody and the polypeptide of the framework region and constant region is not particularly limited as long as it is a human antibody.
  • the complementarity-determining region of mouse IgG and human A CDR-grafted antibody can be obtained by using the IgM or IgG framework region and constant region polypeptides.
  • an antigen-binding fragment of a CDR-grafted antibody can be obtained from a mouse complementarity determining region and a human IgM or IgG framework region.
  • human antibody means an antibody obtained from a transgenic animal into which a human antibody gene has been introduced, and a monoclonal antibody that can be obtained by cell fusion of human antibody-producing cells with myeloma cells. To do.
  • siRNA Annexin A1 siRNA, formyl peptide receptor siRNA, RIP1 siRNA, or RIP3 siRNA siRNA that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention has a double-stranded RNA portion, and mRNA of each gene. Is not limited as long as it can be cleaved via RNA interference.
  • siRNA that can be cleaved via RNA interference in the target mRNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 (Si-41) or 11 (si-42), which is RIP3 mRNA. it can.
  • the length of the double-stranded RNA portion is 15 to 40 bases, preferably 15 to 30 bases, more preferably 15 to 25 bases, still more preferably 19 to 25 bases, and most preferably 19 to 21 bases as a base. .
  • the antisense RNA sequence of double-stranded RNA is not limited as long as it can hybridize with mRNA of each gene in cells.
  • specific examples of antisense RNA of RIP3 include UUACGUUAACAACAGUUC (SEQ ID NO: 10) and UGGUUUUCUAUGGUUCUCC (SEQ ID NO: 12) in the target mRNA region.
  • the sense RNA sequence of the double-stranded RNA portion is not limited as long as it can be hybridized with an antisense RNA sequence in a cell.
  • specific examples of the antisense RNA of RIP3 include GAACUGUUUGUUAACGUAA (SEQ ID NO: 9) or GGAGAACCAUAGAAAACCA (SEQ ID NO: 11) in the target mRNA region 1.
  • siRNA of the present invention includes a double-stranded nucleotide in which the end of the double-stranded RNA portion is smooth, and such siRNA exhibits sufficient RNAi activity.
  • a double-stranded oligonucleotide comprising a double-stranded RNA portion and an overhang at the 3 ′ end of the sense strand and / or the antisense strand to form a protruding end Is also included.
  • the overhang portion include base sequences such as ug-3 ', uu-3', tg-3 ', and tt-3'.
  • RNA short hairpin RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • sequence of the hairpin loop include UUCAGAGA, CUUCCUGUCA (SEQ ID NO: 17), CCACC, CUCGAG, CCACACC, UUCAGAGA, AUG, CCC, CTTCCTGTCAGA (SEQ ID NO: 18), and UUCG RNA.
  • the siRNA used in the pharmaceutical composition of the present invention can also be obtained by incorporating a gene into a vector.
  • the vector is a vector for expressing siRNA capable of suppressing the expression of MUC5AC mRNA in a mammalian cell, and if the siRNA can be efficiently expressed in the cell, the vector serving as the backbone is It is not particularly limited.
  • the backbone vector include plasmid vectors, linear double-stranded DNA vectors, and viral vectors such as adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, and lentivirus vectors.
  • Formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease is as long as necroptosis induced by formyl peptide receptor 1 and annexin A1 is involved.
  • Non-limiting examples include Stevens Johnson Syndrome (SJS) and Toxic Epidermal Necrosis (TEN).
  • SJS which is a subject for prevention and treatment of the pharmaceutical composition of the present invention, is associated with formyl peptide receptor 1-induced necroptosis.
  • the cause of SJS is often due to drugs such as cefdinir, a cephem antibiotic, antiepileptic drugs (for example, zonisamide, carbamazepine, and phenobarbital), or nonsteroidal anti-inflammatory drugs, but also other viral infections.
  • drugs such as cefdinir, a cephem antibiotic, antiepileptic drugs (for example, zonisamide, carbamazepine, and phenobarbital), or nonsteroidal anti-inflammatory drugs, but also other viral infections.
  • TEN which is a target for prevention and treatment of the pharmaceutical composition of the present invention, is associated with formyl peptide receptor 1 and annexin A1-induced necroptosis. Most of the causes of TEN are caused by drugs. However, as long as formyl peptide receptor 1-induced necroptosis is related as in SJS, it is not limited to those caused by drugs.
  • the mortality rate of TEN is said to be 20-30%, which is a disease with a very high mortality rate.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can contain any one of the above active ingredients, and can contain two or more in any combination.
  • the active ingredient is a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease alone or preferably together with a normal carrier or diluent that can be pharmaceutically or veterinarily acceptable.
  • a normal carrier or diluent that can be pharmaceutically or veterinarily acceptable.
  • the said active ingredient can be used in order to manufacture the pharmaceutical composition for the treatment or prevention of a formyl peptide receptor 1 induced necroptosis related disease.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and for example, powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, extracts, or pills. Or parenteral preparations such as injections, external solutions, ointments, suppositories, topical creams, or eye drops.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes, for example, sodium alginate, starch, corn starch, sucrose, lactose, glucose, mannitol, carboxymethylcellulose, dextrin, polyvinylpyrrolidone, crystalline cellulose, soybean lecithin, sucrose, fatty acid ester, talc, stearic acid Excipients such as magnesium, polyethylene glycol, magnesium silicate, anhydrous silicic acid, or synthetic aluminum silicate, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, fluidity promoters, diluents, preservatives, coloring It can be produced according to a conventional method using an agent, a fragrance, a corrigent, a stabilizer, a humectant, an antiseptic, an antioxidant, or the like.
  • Excipients such as magnesium, polyethylene glycol, magnesium silicate, anhydrous silicic acid, or synthetic aluminum silicate, binders, disintegrants, surfactants, lubricants
  • parenteral administration methods include injection (subcutaneous, intravenous, etc.) or rectal administration. Of these, the injection is most preferably used.
  • a water-soluble solvent such as physiological saline or Ringer's solution
  • a water-insoluble solvent such as vegetable oil or fatty acid ester
  • an isotonic agent such as glucose or sodium chloride
  • Solubilizers, stabilizers, preservatives, suspending agents, or emulsifiers can be optionally used.
  • the antitumor agent of the present invention may be administered using a sustained release preparation technique using a sustained release polymer or the like.
  • the active ingredient in the present invention can be incorporated into a pellet of ethylene vinyl acetate polymer and the pellet can be surgically implanted into the tissue to be treated or prevented.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but can contain the active ingredient in the present invention in an amount of 0.01 to 99% by weight, preferably 0.1 to 80% by weight. .
  • the dosage in the case of using the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately determined according to the type of illness, the age, sex, weight, symptom of the patient, or the administration method, orally or parenterally. Can be administered as a whole.
  • the pharmaceutical composition for treating a necroptosis-related disease (particularly, a necroptosis-inhibiting substance) can be used in a method for preventing or treating a neptoposis-related disease. . Therefore, the method for preventing or treating a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease according to the present invention provides a substance that suppresses necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1 as a formyl peptide receptor. An effective amount is administered to a subject to be treated for a body 1-induced necroptosis-related disease.
  • the administration route, dose, and administration interval of the necroptosis-inhibiting substance can be appropriately determined according to the type of disease, the patient's age, sex, weight, symptom level, administration method, and the like.
  • necroptosis inhibitor for use in the treatment of necroptosis related diseases
  • the pharmaceutical composition for treating a necroptosis related disease (particularly a necroptosis inhibitor) It can be used in a prophylactic or therapeutic method. Therefore, the substance that suppresses necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1 of the present invention is for use in a method for preventing or treating formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related diseases. Is.
  • the amount used in the prevention or treatment of the necroptosis-inhibiting substance can be appropriately determined according to the type of disease, the patient's age, sex, weight, degree of symptoms, administration method, and the like.
  • necroptosis-inhibiting substance for the manufacture of a medicament for treating a necroptosis-related disease
  • the pharmaceutical composition for treating a necroptosis-related disease (in particular, a necroptosis-inhibiting substance) It can be used for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of neptoposis-related diseases. Therefore, the use of the present invention is a drug for preventing or treating a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease, which is a substance that suppresses necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1. Use for manufacturing.
  • the content of the necroptosis-inhibiting substance in the preventive or therapeutic drug can be appropriately determined according to the type of disease, the patient's age, sex, weight, degree of symptoms, administration method, and the like.
  • necroptosis-inhibiting substance for treatment of necroptosis-related disease
  • the pharmaceutical composition for treating necroptosis-related disease can be used for treatment. Therefore, the use of the present invention is to prevent or treat a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease using a substance that suppresses necroptosis induced by binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1. Is use.
  • the fee for use in the prevention or treatment of the necroptosis-inhibiting substance can be appropriately determined according to the type of illness, patient age, sex, weight, symptom severity, administration method, and the like.
  • necroptosis inducing agent of the present invention contains a substance that binds to formyl peptide receptor 1 and induces necroptosis as an active ingredient.
  • the necroptosis inducing agent of the present invention may contain one kind of substance that induces necroptosis, or may contain two or more kinds in combination. Further, it may be contained together with the carrier, and the carrier may not be contained only with the active ingredient.
  • the substance that induces necroptosis is not limited, but is a compound having necroptosis inducing activity (agonist of formyl peptide receptor 1), protein (for example, anti-RIP1 antibody), peptide, DNA aptamer Or an RNA aptamer.
  • Examples of the formyl peptide receptor agonist include annexin A1, fMLPAc2-12, Ac9-25, Ac2-26, Annexin 1, Catthepsin G, HIV-1 T20 (DP178), HIV-1 T21 (DP107), HIV gp41 HSV gG-2p20, LL-37, SRSRY, WKYMVM, or WKYMVm peptide, and derivatives thereof having formyl peptide receptor 1 agonist activity, preferably annexin A1 or fMLP .
  • FMLP FMLP
  • the fMLP is formyl-Met-Leu-Phe (N-formylmethionyl leucylphenylalanine), and is the first compound identified as a ligand (agonist) that binds to FPR1.
  • fMLP causes induction of chemotaxis, granule mobilization, and production of reactive oxygen metabolites in neutrophils.
  • the formyl peptide receptor 1 to which the necroptosis inducing agent of the present invention binds is described in detail in the above-mentioned “[1] Pharmaceutical composition for treatment of necroptosis-related diseases”.
  • Annexin A1 which is an active ingredient, is also described in detail in the aforementioned “[1] Pharmaceutical composition for treatment of necroptosis-related diseases”.
  • the necroptosis-inducing agent can be used as a necroptosis-inducing composition or a necroptosis-inducing pharmaceutical composition.
  • Those described in “Pharmaceutical compositions for treatment of necroptosis-related diseases” can be used.
  • the necroptosis-inducing agent of the present invention can be used for the treatment of malignant tumors by specifically inducing formyl peptide receptor 1-induced necroptosis in malignant tumors. More specifically, by treating the malignant tumor expressing the formyl peptide receptor 1 with the agonist or the like, neptosis can be specifically induced in the malignant tumor to treat the tumor. Examples of malignant tumors expressing formyl peptide receptor 1 include malignant melanoma.
  • Screening method for substances that suppress necroptosis tests formyl peptide receptor 1 or a variant thereof and a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1.
  • a step of contacting in the presence of a substance a step of detecting an inhibitory activity of the test substance for binding of the receptor or a variant thereof and the ligand or agonist, or binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1. Detecting the induction inhibitory activity of the test substance against necroptosis.
  • the method for screening a substance that suppresses necroptosis according to the present invention is a substance that suppresses necroptosis using a formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, or a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1 as a screening tool. Is to select. Therefore, the step of bringing the test substance into contact with any of these screening tools is performed.
  • the method for screening a substance that suppresses necroptosis according to the present invention selects a substance that inhibits FPR1-induced necroptosis.
  • FPR1-induced necroptosis eg, cell damage
  • FPR1-induced necroptosis process eg, signal transduction
  • the contact step (1) is a step of bringing the formyl peptide receptor 1 or a variant thereof into contact with the ligand or agonist of the formyl peptide receptor 1 in the presence of a test substance.
  • contacting formyl peptide receptor 1 or a variant thereof and a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1 in the presence of a test substance means “formyl peptide receptor 1 or a variant thereof”, “ It includes not only an embodiment in which three of the “formyl peptide receptor 1 ligand or agonist” and “test substance” are simultaneously contacted, but also an embodiment in which two of the three are contacted first and the remaining one is in contact. .
  • test substance is not limited as long as it can contact the screening tool formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, or a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1, for example, contact step (a) , (B), and (c).
  • the contact step (a) is a step in which the formyl peptide receptor 1 or a modified form thereof, the formyl peptide receptor 1 ligand or agonist, and the test substance are simultaneously contacted.
  • the contacting step (b) is a step of bringing the formyl peptide receptor 1 or a variant thereof into contact with the test substance, and bringing the mixture into contact with the ligand or agonist of the formyl peptide receptor 1.
  • the contact step (c) is a step in which a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1 is contacted with a test substance, and the mixture is contacted with formyl peptide receptor 1 or a variant thereof.
  • the test substance may inhibit the function by binding to formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, or a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1, and formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, or formyl peptide
  • the function may be inhibited by contact with a ligand or agonist of receptor 1.
  • the test substance may induce inhibition by an allosteric effect.
  • the test substance acts on a site other than the active center (for example, the structure of formyl peptide receptor 1 or the like or a ligand or the like may be changed, and their functions may be inhibited.
  • Formyl Peptide Receptor 1 or Modified Cell Expressing Cells As the formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, those expressed in cells can be used. Cells expressing formyl peptide receptor 1 or a variant thereof are not limited as long as necroptosis is induced by binding to annexin A1, but are isolated from, for example, SJS patients and TEN patients. Primary cells established may be used, or established subculture cells may be used. Moreover, you may use the recombinant cell which integrated the gene of the formyl peptide receptor 1 or its modification. Production of genetically modified cells can be performed according to a conventional method. The type of cell is not particularly limited.
  • adrenal cortex cells astrocytes, endothelial cells, epithelial cells, fibroblasts, hepatocytes, immature dendritic cells, Kupffer cells, macrophages, microglia cells, single cells Spheres, neuroblastoma cells, neutrophils, platelets, cancer cells, conjunctival cells of the eyeball, and skin cells (eg, keratinocytes), but skin cells (eg, keratinocytes), hepatocytes, or eyeballs Conjunctival cells are preferred.
  • the gene of formyl peptide receptor 1 or a variant thereof used for the production of a genetically modified cell is not limited as long as it can induce necroptosis.
  • (1) represented by SEQ ID NO: 2 (2) a polypeptide that induces necroptosis by binding to annexin A1 and (2) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence in which amino acids (preferably 1 to 50, more preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 20, most preferably 1 to 10 amino acids) have been deleted, substituted and / or inserted Or a partial peptide thereof, which induces necroptosis by binding to annexin A1 (3) a peptide consisting of an amino acid sequence having a homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of 80% or more, or a partial peptide thereof, which binds to annexin A1 to cause necroptosis.
  • the detection step in the method for screening a substance that suppresses necroptosis comprises a step of detecting the inhibitory activity of the test substance against the binding of the receptor or a variant thereof and the ligand or agonist (hereinafter, detection of binding inhibition).
  • a step of detecting the induction inhibitory activity of the test substance against necroptosis induced by the binding of formyl peptide receptor 1 and annexin A1 (hereinafter sometimes referred to as an induction inhibition detection step).
  • the binding inhibition detection step is not limited as long as it detects inhibition of binding between a receptor or a variant thereof and a ligand or agonist, and the test substance is a substance that suppresses necroptosis.
  • the induction inhibition detection step is not limited as long as it detects inhibition of FPR1-induced necroptosis induction, but detection of inhibition of FPR1-induced necroptosis (for example, cell damage), Or detection of inhibition of the process of FPR1-induced necroptosis (eg, signal transduction).
  • inhibition of necroptosis may be detected together with detection of binding inhibition. That is, inhibition of FPR1-induced necroptosis (for example, cell damage) or inhibition of FPR1-induced necroptosis process (for example, signal transduction) may be detected.
  • the detection of the inhibition of necroptosis induction is not limited as long as it can be detected that the induction of necroptosis is inhibited. For example, it may be morphologically detected that the induction of necroptosis is inhibited in the cell.
  • the binding of formyl peptide receptor 1 or a variant thereof and a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1 is decreased, the formation of complex I is decreased, and the activity of RIP1 kinase is reduced. It is also possible to detect inhibition of necroptosis by detecting a decrease, no phosphorylation of RIP1, RIP1, or a decrease in the formation of complex IIb containing RIP1 and RIP3. is there.
  • Detection of inhibition of necroptosis induction in the detection step is preferably compared with control.
  • a control a negative control in which no test substance is added to the screening system can be used.
  • necroptosis is induced, so that it becomes easier to detect whether or not the test substance inhibited the induction of necroptosis. That is, when the induction of necroptosis is inhibited as compared with the negative control, it becomes easy to judge that the test substance has necroptosis induction inhibitory activity.
  • a positive control to which a substance that inhibits necroptosis induction is added may be used as a control.
  • substances that inhibit necroptosis induction include CDPR, CHIPS, Coronavirus, 229E peptides, Coronavirus peptides, Cyclosporine A, Cyclosporine H, DCA, Ebola peptids, which are antagonists of FPR1 , Spinorphin, and tBOC can be used.
  • An anti-FPR1 antibody or an anti-annexin A1 antibody can also be used.
  • Formyl peptide receptor 1 or a modified form thereof is the formyl peptide receptor 1 described in the column of “[1] Pharmaceutical composition for treatment of necroptosis-related diseases”. Can be used.
  • a formyl peptide receptor 1 variant can be used. The variant is not limited as long as it can bind to annexin A1 and induce formyl peptide receptor 1-induced necroptosis.
  • polypeptide that induces necroptosis by binding to annexin A1 (2) 1 to 70 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (preferably 1 A polypeptide comprising an amino acid sequence having a deletion, substitution, and / or insertion of -50, more preferably 1-30, still more preferably 1-20, most preferably 1-10 amino acids A polypeptide that induces necroptosis by binding to annexin A1, (3) SEQ ID NO: 2 A peptide consisting of an amino acid sequence having a homology with the amino acid sequence represented by 80% or more, or a partial peptide thereof, wherein the polypeptide induces necroptosis by binding to annexin A1, or (4) Examples thereof include a fusion polypeptide comprising any one of 1) to (3), which induces necroptosis by binding to annexin A1.
  • the fusion polypeptide is, for example, one obtained by fusing another peptide (protein) to the N-terminal, C-terminal, or N-terminal and C-terminal of any of the polypeptides (1) to (3).
  • protein a peptide that can be usually used as fusion peptides (proteins) can be used without limitation, and examples thereof include GST, TrpE, and His Tag.
  • Ligand or agonist of formyl peptide receptor 1 >> The ligand or agonist of formyl peptide receptor 1 used in the method for screening a substance that suppresses necroptosis of the present invention is not limited as long as it binds to formyl peptide receptor 1 and can induce necroptosis.
  • Annexin A1 that can be used in the method for screening a substance that inhibits necroptosis according to the present invention is the use of annexin A1 described in the above-mentioned column of “[1] Pharmaceutical composition for treatment of necroptosis-related diseases”. it can.
  • annexin A1 variants can be used. The variant is not limited as long as it can bind to formyl peptide receptor 1 to induce formyl peptide receptor 1-induced necroptosis.
  • the fusion polypeptide is, for example, one obtained by fusing another peptide (protein) to the N-terminal, C-terminal, or N-terminal and C-terminal of any of the polypeptides (1) to (3).
  • protein a peptide that can be usually used as fusion peptides (proteins) can be used without limitation, and examples thereof include GST, TrpE, and His Tag.
  • the amino acid substitution of the mutant peptide variant that can be used in the present invention is preferably a conservative substitution.
  • conservative substitution means the replacement of one or several amino acid residues with another chemically similar amino acid residue. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can be made by such substitutions are known in the art for each amino acid. Examples of nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, and the like.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine, and the like.
  • Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • test substance that can be applied to the screening method of the present invention is not particularly limited.
  • various known compounds including peptides registered in chemical files, combinatorial chemistry techniques [Terrett, N. K. et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)] or a group of compounds obtained by conventional synthetic techniques, phage display method [Felici, F. et al, J. Mol. Biol., 222, 301 -310 (1991)] etc. applied to random peptides, siRNA, antibodies that bind to formyl peptide receptor 1, antibodies that bind to annexin A1, or antibodies that bind to ligand of formyl peptide receptor 1 Can be used.
  • culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants or marine organisms, or animal tissue extracts can be used as test substances for screening.
  • a derivative obtained by chemically or biologically modifying a test substance selected by the screening method of the present invention can be used.
  • the screening method for the necroptosis inducing substance of the present invention comprises (1) a step of bringing a formyl peptide receptor 1 or a variant thereof into contact with a test substance, and ( 2) detecting necroptosis induced by formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, including.
  • the method for screening a necroptosis-inducing substance of the present invention is to select a substance that induces necroptosis using the formyl peptide receptor 1 or a variant thereof as a screening tool. Therefore, the step of bringing the test substance into contact with any of these screening tools is performed.
  • the screening method for a necroptosis-inducing substance of the present invention selects a substance that induces FPR1-induced necroptosis. Therefore, depending on the test substance, FPR1-induced necroptosis or FPR1-induced necroptosis is selected. A step of detecting that the process of tosis is induced is performed. Specifically, a ligand or agonist of FPR1 can be selected by a screening method for a necroptosis inducer.
  • the contact step (1) is not limited as long as the test substance can contact with the formyl peptide receptor 1 which is a screening tool or a variant thereof.
  • the test substance may induce FPR1-induced necroptosis by binding to formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, or an FPR1 induced necrop by contacting formyl peptide receptor 1 or a variant thereof.
  • Tosis may be induced, and FPR1-induced necroptosis may be induced by acting on a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1 or a precursor thereof.
  • Formyl Peptide Receptor 1 or Modified Cell Expressing Cells As the formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, those expressed in cells can be used. As the cells expressing formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, those described in the above-mentioned column of “[3] Screening method for substances inhibiting necroptosis” can be used.
  • the detection step in the screening method for a necroptosis inducer of the present invention is a step of detecting necroptosis induced by formyl peptide receptor 1 or a variant thereof. Detection of necroptosis is not limited as long as it can be detected that necroptosis has been induced. For example, the induction of necroptosis in a cell may be detected morphologically.
  • the detection of necroptosis induction in the detection step is preferably compared with a control.
  • a control a positive control in which a substance that induces necroptosis is added to the screening system may be used.
  • Substances that induce necroptosis include Annexin A1, fMLP and its derivatives, Ac2-12, Ac9-25, Ac2-26, Annexin 1, Catthepsin G, HIV-1 T20 (DP178), HIV-1 T21 (DP107 ), HIV gp41, HSV gG-2p20, LL-37, SRSRY (SEQ ID NO: 19), WKYMVM (SEQ ID NO: 20), or WKYMVm peptide (SEQ ID NO: 20).
  • a negative control in which no test substance is added to the screening system can be used. In the negative control, since necroptosis is not induced, it becomes easier to detect whether or not the test substance induced necroptosis.
  • the formyl peptide receptor 1 or a variant thereof, a test substance, and the like in the screening method for a necroptosis-inducing substance of the present invention are described in the section of “[3] Screening method for substances inhibiting necroptosis”. Can be used.
  • the screening method for a substance that induces or suppresses necroptosis of the present invention can also be performed using a screening kit.
  • the screening kit includes formyl peptide receptor 1 or a variant thereof.
  • a screening kit for a substance that induces or suppresses necroptosis may include formyl peptide receptor 1 or a modified form thereof in a state expressed in cells.
  • the screening kit for a substance that suppresses necroptosis may further contain a ligand or agonist of formyl peptide receptor 1.
  • FIG. 1a shows a micrograph and an electron micrograph of hematoxylin-eosin staining of the epidermis of SJS / TEN patients and ODSR patients.
  • PBMC peripheral blood cells
  • ODSR normal drug eruption
  • a drug that causes SJS is added at a concentration that becomes positive in DLST, cultured in cRPMI medium for 5 days, and further added with the same concentration of drug and stimulated with the culture supernatant (SJSsup And ODSRsup) were recovered.
  • Epidermal cells SJS-keratinocyte; SJS-K and ODSR-keratinocyte; ODSR-K
  • SJS-keratinocyte SJS-K
  • ODSR-K ODSR-keratinocyte
  • ODSR-K ODSR-keratinocyte
  • 5% of the above SJSsup or ODSRsup was added to the obtained SJS-K and ODSR-K1 ⁇ 10 5 cells, and after 8 hours, the cytotoxicity was examined by trypan blue staining.
  • the culture supernatant of the SJS patient (SJSsup) induced necrosis on the epidermal cells (SJS-K) derived from the SJS patient, but was usually toxic to the epidermal cells (ODSR-K) derived from the drug eruption patient. Not shown ( Figure 1b).
  • the culture supernatant (ODSRsup) of a normal drug eruption patient showed no cytotoxicity in either SJS-K or ODSR-K.
  • SJSsup SJS patient culture supernatant
  • Example 1 suppression of the cytotoxic activity of the culture supernatant (SJSsup) of PBMC of SJS patients by anti-annexin A1 antibody was examined. From two SJS patients (SJS # 1 and SJS # 2), the culture supernatant (SJS # 1sup and SJS # 2supp) and epidermal cells (SJS # 1-K and SJS # 2-K) was obtained. To each culture supernatant, 5 ⁇ g / mL of an annexin antibody (BD Transduction Laboratories, NJ USA) was added, and the mixture was gently stirred at 4 ° C. overnight. Protein G beads (Dynal) were added, stirred at 4 ° C.
  • annexin antibody BD Transduction Laboratories, NJ USA
  • Example 2 suppression of cytotoxicity by the culture supernatant was examined by Nec-1, which is a specific inhibitor of necroptosis.
  • Necrostatin 1 Nec-1; Enzo Life Sciences 50 ⁇ M was added to the culture supernatant (SJS # 1sup and SJS # 2supp) obtained in Example 1, and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • cytotoxicity to epidermal cells SJS # 1-K and SJS # 2-K was examined.
  • caspase inhibitors that specifically inhibit apoptosis were also added to the culture supernatant in the same manner as necrostatin 1 to induce cytotoxicity.
  • the effect on Cytotoxicity was completely suppressed by Nec-1, a specific inhibitor of necroptosis.
  • caspase inhibitors did not suppress the cytotoxicity of SJS-K (FIG. 4). Therefore, skin cell damage in SJS patients was thought to be due to necroptosis induced by the binding of FPR1 and annexin A1.
  • Example 3 the inhibition of necroptosis by annexin A1 was examined by knocking down the expression of RIP3 involved in necroptosis using siRNA.
  • the sequence of siRNA is as follows. Si-41: Sense: GAACUGUUUGUUAACGUAAtt (SEQ ID NO: 13) Antisense: UUACGUUAACAACAGUUCtg (SEQ ID NO: 14) Si-42: Sense: GGAGAACCAUAGAAAAAACCAtt (SEQ ID NO: 15) Antisense: UGGUUUUCUAUGGUUCUCta (SEQ ID NO: 16) The portion written in lower case is the overhang sequence.
  • Example 4 the induction of necroptosis (FPR1-induced necroptosis) by FPR1 and annexin A1 by fMLP, which is an agonist of FPR1, was examined.
  • FPR1-induced necroptosis FPR1-induced necroptosis
  • fMLP annexin A1 by FPR1
  • SJS-K epidermal cells
  • 0 nM, 0.05 nM, 0.5 nM, 5 nM, 50 nM, or 500 nM of fMLP was added, and cytotoxicity was observed after 8 hours. Investigated by staining.
  • fMLP induced necroptosis in a dose-dependent manner (FIG. 6).
  • Example 5 necrostatin 1 (Nec-1), a specific inhibitor of necroptosis, was examined to suppress the induction of necroptosis by fMLP.
  • Nec-1 necrostatin 1
  • 50 ⁇ M of Nec-1 was added to the experimental system to which 5 nM of fMLP was added, and the cytotoxicity was similarly examined by trypan blue staining.
  • caspase inhibitors zIED-fmk (RDsystems) 20 ⁇ M and zVAD-fmk (RDsystems) 50 ⁇ M were added to examine cytotoxicity.
  • induction of necroptosis by fMLP was inhibited by Nec-1, but not by zIED-fmk and zVAD-fmk (FIG. 7).
  • Example 6 it was examined whether the induction of necroptosis by the culture supernatant (SJSsup) of an SJS patient was suppressed by an anti-FPR1 antibody.
  • SJS patient culture supernatant (SJSsup) was added to 5% of SJS patient-derived epidermal cells (SJS-K) prepared in the same manner as in Experimental Example 1.
  • anti-FPR1 antibody was added at 0 ⁇ g / mL, 0.3 ⁇ g / mL, 3.0 ⁇ g / mL, or 30 ⁇ g / mL, and cytotoxicity was examined by trypan blue staining.
  • the induction of necroptosis by SJSsup was inhibited in a dose-dependent manner by the anti-FPR1 antibody (FIG. 8).
  • Example 7 as an example of the screening cell of the present invention, a cell in which an FPR1 gene was introduced into a Hela cell was established. A full length cDNA of human FPR1 was synthesized and cloned into the XhoI site and KpnI site of pcDNA3.1 / Zeo vector (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) To obtain pcDNA3.1 / Zeo-FPR1 plasmid. Hela cells were transfected with pcDNA3.1 / Zeo-FPR1 plasmid using transfection reagent Fugene 6 (Roche, Indianapolis, Ind.), And cells incorporating human FPR1 were selected using Zeocin (Invitrogen). . FIG. 9 shows a photograph in which the expression of FPR1 in the obtained FPR1-introduced Hela cells (S-4) was confirmed by the fluorescent antibody method.
  • Example 8 In this example, the induction of necroptosis by fMLP and the inhibition of necroptosis by fMLP on FPR1-introduced Hela cells were examined. The procedure of Example 4 or 5 was repeated except that the epidermal cells (SJS-K) were changed to FPR1-introduced Hela cells. Necroptosis was also induced by fMLP in FPR1-introduced Hela cells, and the necroptosis was suppressed by Nec-1 (FIG. 10).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can prevent or treat formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related diseases (eg, Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrosis).
  • the screening method of the present invention can screen for active ingredients of a pharmaceutical composition for treating a formyl peptide receptor 1-induced necroptosis-related disease.
  • the necroptosis-inducing agent of the present invention and the method for screening active ingredients thereof can be used for the study of diseases caused by formyl peptide receptor 1-induced necroptosis, and are useful for the development of therapeutic agents for those diseases. be able to.
  • this invention was demonstrated along the specific aspect, the deformation

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Abstract

　本発明の目的は、重症の粘膜疹及び皮膚の紅斑、体表のびらん、水疱、及び表皮剥離が発生するメカニズムを解析し、それらの症状に対する根本的な治療用医薬組成物を提供することである。また、前記医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法を提供することである。　前記課題は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を有効成分として含む、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬組成物、及びホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法によって解決することができる。

Description

ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物及びその有効成分のスクリーニング方法
　本発明は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬組成物に関する。本発明によれば、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患、特にはスティーブンス・ジョンソン・シンドローム、又は中毒性表皮壊死症を治療することができる。
　薬疹とは、薬物に反応してできる皮疹をいい、すべての薬物は薬疹を引き起こす可能性がある。薬疹によって生命に危険を及ぼすような重症な薬疹を重症薬疹といい、その最重症型であるスティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome；以下、ＳＪＳと称することがある）及び中毒性表皮壊死症（Toxic epidermal necrolysis；以下、ＴＥＮと称することがある）は、高熱と広範な表皮細胞の壊死を特徴とする、非常に予後の悪い疾患である。ＳＪＳでは、口唇、眼粘膜、外陰部などの皮膚粘膜移行部で重症の粘膜疹及び皮膚の紅斑が見られ、体表のびらん、水疱、表皮剥離は体表面積の１０％以下である。ＳＪＳは、薬物以外のウイルスが原因のものもあると言われているが、その多くは薬物を原因とするものである。ＴＥＮにはＳＪＳから移行したサブタイプも含まれ、その症状はＳＪＳと類似であるが全体としてＳＪＳより重篤であり、体表面積の１０％以上でびらん、水疱、表皮剥離が見られる。また、皮膚や粘膜だけではなく目にも症状が現れ、失明することもあり、ＴＥＮの致死率は２０～２５％とされている（非特許文献１）。
　ＳＪＳ及びＴＥＮの原因となる薬剤としては、セフェム系の抗生物質であるセフジニル、抗てんかん薬（例えば、ゾニサミド、カルバマゼピン、及びフェノバルビタール）、又は非ステロイド性抗炎症薬が挙げられるが、これら以外にも原因となる薬物は１１００種類以上あるといわれている。
　ＳＪＳ及びＴＥＮの治療としては、発熱や発疹等の初期症状を認めた場合に、原因と推定される医薬品の投与を直ちに中止することが最も重要で最良の治療法であるといわれている。しかしながら、ＳＪＳ及びＴＥＮの初期症状は、皮疹のみ出現する通常薬疹の症状と似ており、ＳＪＳ及びＴＥＮと診断されない場合、薬物の投与中止が遅れ、症状が重篤になることもある。そして、原因の医薬品の投与を中止した後の治療方法としては、副腎皮質ホルモン剤の全身投与、血漿交換療法、又は免疫グロブリンの投与、及び皮膚面に対しては外用抗生物質製剤、外用副腎皮質ホルモン製剤が用いられている。しかしながら、これらの治療方法は対症療法であり、ＳＪＳ及びＴＥＮの根本的な治療ではなかった。
「ジャーナル・オブ・アメリカン・アカデミー・オブ・デマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」２０１２年（米国）、第６６巻、ｐ、９９５－１００３ 「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」２０１０年（米国）、第２８５巻、p.１４３３８－１４３４５ 「カレント・オピニオン・イン・セル・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」２０１０年（英国）、第２２巻、ｐ．２６３－２６８ 「ネイチャー・レビューズ・モリキュラー・セル・バイオロジー（ＮＡＴＵＲＥ　ＲＥＶＩＥＷＳ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＯＧＹ）」２０１０年（英国）、第１１巻、ｐ．７００－７１４
　前記のように、スティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症は、その多くが薬剤の副作用によって起こるものと考えられているが、その症状が発生するメカニズムは、全く解明されていなかった。
　従って、本発明の目的は、重症の粘膜疹及び皮膚の紅斑、体表のびらん、水疱、及び表皮剥離が発生するメカニズムを解析し、それらの症状に対する根本的な治療用医薬組成物を提供することである。また、前記医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法を提供することである。
　本発明者は、スティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症の発症のメカニズムについて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、これらの疾患の症状が、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合を介したネクロプトーシスによって起こることを見出した。そして、ホルミルペプチド受容体１の阻害剤、又はアネキシンＡ１の阻害剤によって、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを抑制できることを見出した。更に、驚くべきことに、従来のネクロプトーシスのトリガーであるＴＮＦ及びＴＮＦ受容体の結合によって起きるネクロプトーシスの阻害剤によっても、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを抑制できることを見出した。
　また、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合を指標として、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを抑制する物質をスクリーニングできることを見出した。
　本発明は、こうした知見に基づくものである。
　従って、本発明は、
［１］ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を有効成分として含む、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬組成物、
［２］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［１］に記載の医薬組成物、
［３］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［１］又は［２］に記載の医薬組成物、
［４］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［２］又は［３］に記載の医薬組成物、
［５］ホルミルペプチド受容体１と結合し、ネクロプトーシスを誘導する物質を有効成分として含む、ネクロプトーシス誘導剤、
［６］前記誘導物質が、ｆＭＬＰである、［５］に記載のネクロプトーシス誘導剤、
［７］ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる工程と、前記受容体又はその改変体と前記リガンド又はアゴニストとの結合に対する前記試験物質の阻害活性を検出する工程若しくはホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスに対する前記試験物質の誘導阻害活性を検出する工程、とを含む、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法、
［８］前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が、細胞に発現したものである、［７］に記載のスクリーニング方法、
［９］（１）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と、試験物質とを接触させる工程、及び（２）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体によって誘導されるネクロプトーシスを検出する工程、を含むホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法、
［１０］前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が、細胞に発現したものである、［９］に記載のスクリーニング方法、
［１１］前記ホルミルペプチド受容体１改変体が、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）～（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、である、［７］～［１０］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［１２］前記細胞が、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（４）前記（１）～（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、のいずれかをコードするポリヌクレオチド、を含む［８］又は［１０］に記載のスクリーニング方法、及び
［１３］前記ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストが、ｆＭＬＰ若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ１若しくはその変異体であって、前記アネキシンＡ１変異体が（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）～（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチドである、［７］又は［８］に記載のスクリーニング方法、
に関する。
　なお、ホルミルペプチド受容体１と、アネキシンＡ１のペプチドであるＧｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｐｈｅが相互作用することは報告されている（非特許文献２）。また、ネクロプトーシスがＴＮＦとＴＮＦ受容体との結合によって誘導されることが報告されている（非特許文献３及び４）。しかしながら、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１によって、ネクロプトーシスのシグナル伝達が作動し、ネクロプトーシスが誘導されることは、全く知られていなかった。
　本明細書において、「ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス」とは、ホルミルペプチド受容体１とアネキシンＡ１との結合によって誘導されるネクロプトーシスを意味する。
　また、本明細書は、
［１４］ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療対象に、有効量投与することを特徴とする、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法、
［１５］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［１４］に記載の、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法、
［１６］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［１４］又は［１５］に記載のホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法、
［１７］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［１４］又は［１５］に記載のホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法、
［１８］ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療（方法）における使用のための、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスの抑制物質、
［１９］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［１８］に記載のネクロプトーシスの抑制物質、
［２０］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［１８］又は［１９］に記載のネクロプトーシスの抑制物質、
［２１］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［１８］又は［１９］に記載のネクロプトーシスの抑制物質、
［２２］ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬の製造のための、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２３］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［２２］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２４］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［２２］又は［２３］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２５］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［２２］又は［２３］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２６］ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療のための、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２７］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［２６］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２８］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［２６］又は［２７］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、及び
［２９］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［２６］又は［２７］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
を開示する。
　本発明の医薬組成物によれば、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患（例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症）を予防又は治療することができる。また、本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法によれば、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物の有効成分をスクリーニングすることができる。本発明のネクロプトーシス誘導剤及びその有効成分のスクリーニング方法によれば、ホルミルペプチド受容体１を発現した癌細胞にネクロプトーシスを誘導し、癌の治療に用いることができる。更に、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを原因とする疾患の研究に用いることができ、それらの疾患の治療薬の開発に役立てることができる。
ＳＪＳ／ＴＥＮ患者及びＯＤＳＲ患者の表皮のヘマトキシリン・エオジン染色を行った顕微鏡写真、及び電子顕微鏡写真である（ａ）。ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）のＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）に対する細胞障害性を示したグラフである（ｂ）。ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）のＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）に対する細胞障害性の容量依存性を示したグラフである（ｃ）。ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）のＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）に対する細胞障害性が、ＳＪＳ患者間において交叉することを示したグラフである（ｄ）。 ＳＪＳ患者と健常人の表皮細胞（ａ）、及びＳＪＳ患者の病変部、ＳＪＳ患者の非病変部、通常薬疹病変部におけるアネキシンＡ１（ｂ）及びホルミルペプチド受容体１（ｃ）の発現を示した蛍光顕微鏡写真である。 ＳＪＳ患者のＰＢＭＣの培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の細胞障害性が、上清からアネキシンを除去することで細胞障害能が抑制されることを示したグラフである。 ＳＪＳ患者のＰＢＭＣの培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の細胞障害性が、ネクロプトーシスの特異的阻害剤であるＮｅｃ－１により抑制されることを示したグラフである。 ＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）のＲＩＰ３遺伝子を、ＲＩＰ３のｓｉＲＮＡにより、ノックダウンすることにより、ＳＪＳ患者のＰＢＭＣの培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の細胞障害性が、抑制されることを示したグラフである。 ｆＭＬＰが、ＦＰＲ１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシス（ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス）のアゴニストとして作用することを示したグラフである。 ｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導が、ネクロプトーシスの阻害剤であるＮｅｃ－１によって阻害されることを示したグラフである。 ｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導が、抗ＦＰＲ１抗体によって抑制されることを示したグラフである。 ＦＰＲ１遺伝子導入Ｈｅｌａ細胞のＦＰＲ１の発現を確認した蛍光顕微鏡写真である。 ＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞に対するｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導、及びｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導のＮｅｃ－１による抑制を示したグラフである。
［１－１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物
　本発明のネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を有効成分として含み、そしてホルミルペプチド受容体１誘導性のネクロプトーシス関連疾患を治療するものである。
《ホルミルペプチド受容体１》
　ホルミルペプチド受容体１（以下、ＦＰＲ１と称することがある）は、本発明の医薬組成物によって抑制されるネクロプトーシスを誘導する分子の１つである。すなわち、ホルミルペプチド受容体１と、アネキシンＡ１との結合によって、ネクロプトーシスが誘導される。
　ヒトのＦＰＲ１は、３５０個のアミノ酸が、細胞膜を７回貫通する構造を取るＧタンパク質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲと称することがある）である。好中球においては、ＦＰＲ１に細菌由来のリガンドであるｆＭＬＰ（Ｎホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン；Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）が結合することにより、好中球の生体防御機能、例えばＲＯＳの産生、及び白血球の走化、を誘導することが知られている。また、ＦＰＲ１のホモログとしてＦＰＲ２（ＦＰＲ－ｌｉｋｅ１；ＦＰＲＬ１）及びＦＰＲ３（ＦＰＲ－ｌｉｋｅ２；ＦＰＲＬ２）が知られており、ＦＲＰ２はＦＰＲ１に対して６９％の相同性を有している。
　本発明の医薬組成物の有効成分であるホルミルペプチド受容体１阻害物質が抑制するホルミルペプチド受容体１は、アネキシンＡ１との結合能を有し、且つネクロプトーシスを誘導することのできる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば配列番号２で表されるアミノ酸からなるタンパク質を挙げることができる。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ヒトのホルミルペプチド受容体１のアミノ酸配列であり、配列番号１で表される塩基配列はヒトのホルミルペプチド受容体１の塩基配列である。ホルミルペプチド受容体１は、前記のようにヒトのホルミルペプチド受容体１に限定されるものではなく、哺乳動物のホルミルペプチド受容体１を含む。哺乳動物としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、フェレット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、マウス、又はラットを挙げることができる。これらの哺乳動物のホルミルペプチド受容体１を別の観点から記載すると、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～７０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチドである。
《アネキシンＡ１》
　アネキシンＡ１は、本発明の医薬組成物によって抑制されるネクロプトーシスを誘導する分子の１つである。具体的には、ホルミルペプチド受容体１と、アネキシンＡ１との結合によって、ネクロプトーシスが誘導される。
　アネキシンＡ１は、アネキシンファミリーに属するタンパク質であり、自己免疫疾患との関連が示唆されている。アネキシンファミリーは約７０アミノ酸残基から成る特徴的な配列（アネキシンリピート）が４回又は８回繰り返された構造を持つタンパク質ファミリーで、脊椎動物から原生生物まで広く存在する。現在、脊椎動物のアネキシンはＡ１～Ａ１３まで分類されている。
　本発明の医薬組成物の有効成分であるアネキシンＡ１阻害物質が抑制するアネキシンＡ１は、ホルミルペプチド受容体１との結合能を有し、且つネクロプトーシスを誘導することのできる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば配列番号４で表される３４６アミノ酸からなるタンパク質を挙げることができる。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、ヒトのアネキシンＡ１のアミノ酸配列であり、配列番号３で表される塩基配列はヒトのアネキシンＡ１をコードする領域の塩基配列である。アネキシンＡ１は、前記のようにヒトのアネキシンＡ１に限定されるものではなく、哺乳動物のアネキシンＡ１を含む。哺乳動物としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、フェレット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、マウス、又はラットを挙げることができる。これらの哺乳動物のアネキシンＡ１を別の観点から記載すると、（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～７０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチドである。
《ネクロプトーシス》
　従来のネクロプトーシスにおいては、腫瘍壊死因子（Tumour Necrosis Factor；ＴＮＦ）が、腫瘍壊死因子受容体（Tumour Necrosis Factor Receptor；ＴＮＦ－Ｒ）に結合することにより、細胞内に複合体Ｉが形成される。この複合体はある条件下でＲＩＰ１及びＲＩＰ３を含む複合体ＩＩｂを形成し、カスパーゼ非依存性のネクロプトーシス（以下、ＴＮＦ－Ｒ誘導性ネクロプトーシスと称することがある）が起きる。
　本発明の医薬組成物が抑制することのできるホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス（以下、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスと称することがある）は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスである限りにおいて、限定されるものではない。すなわち、前記ネクロプトーシスは、ＴＮＦ及びＴＮＦ－Ｒの結合に代えて、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスである。しかしながら、実質的にホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１によるネクローシスである限りにおいて、ＴＮＦ及びＴＮＦ－Ｒの結合が起きていることを排除するものではない。
　前記ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスは、実施例に示すようにＲＩＰ１キナーゼの阻害剤であるＮｅｃ－１、及びＲＩＰ３のｓｉＲＮＡによって抑制される。従って、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合以降のネクロプトーシスを起こすメカニズムは、ＴＮＦ誘導性ネクロプトーシスと同じシグナル伝達を用いているものと考えられる。従って、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスにおいて、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１との結合以降の細胞内シグナルに関しては、ＴＮＦ誘導性ネクローシスのシグナル伝達を用いたネクローシスでもよい。
　前記ＦＰＲ１誘導性ネクローシスが誘導される細胞は、ＦＰＲ１が発現している細胞である限りにおいて、限定されるものではないが、例えば副腎皮質細胞、星状細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、未成熟樹状細胞、クッパー細胞、マクロファージ、ミクログリア細胞、単球、神経芽腫細胞、好中球、血小板、癌細胞、眼球の結膜細胞、及び皮膚細胞を挙げることができるが、皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）、肝細胞、又は眼球の結膜細胞が好ましい。前記ＦＰＲ１誘導性ネクローシスが誘導される組織も、ＦＰＲ１が発現している組織である限りにおいて、限定されるものではないが、例えば副腎、骨髄、結腸、中枢神経系、目、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胎盤、脾臓、又は皮膚を挙げることができるが、皮膚が好ましい。
《ネクロプトーシス抑制物質》
　本発明の医薬組成物の有効成分であるネクロプトーシス抑制物質は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、又はそれらに属する物質の２つ以上の組み合わせを挙げることができるが、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、又はそれらの組み合わせが好ましい。ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを特異的に抑制できるからである。
《アネキシンＡ１阻害物質》
　前記アネキシンＡ１阻害物質は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、例えばアネキシンＡ１の活性を阻害する物質、アネキシンＡ１に結合してＦＰＲ１との結合を阻害する物質、アネキシンＡ１の発現を阻害する物質を挙げることができる。具体的には、例えばアネキシンＡ１を阻害する、化合物、タンパク質（例えば、抗アネキシンＡ１抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、又はｓｉＲＮＡを挙げることができる。
《ホルミルペプチド受容体１阻害物質》
　前記ホルミルペプチド受容体１阻害物質は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、例えばホルミルペプチド受容体の活性を阻害する物質、ホルミルペプチド受容体に結合してアネキシンＡ１との結合を阻害する物質、ホルミルペプチド受容体の発現を阻害する物質を挙げることができる。具体的には、ホルミルペプチド受容体を阻害する、化合物（例えばホルミルペプチド受容体アンタゴニスト）、タンパク質（例えば、抗ホルミルペプチド受容体抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、又はｓｉＲＮＡを挙げることができる。
（ホルミルペプチド受容体１のアンタゴニスト）
　前記ホルミルペプチド受容体１アンタゴニストは限定されるものではないが、例えば、ＣＤＣＡ、ＣＨＩＰＳ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、２２９Ｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　Ａ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　Ｈ、ＤＣＡ、Ｅｂｏｌａ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＦＬＩＰｒ、ＨＩＶ－２　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ｓｏｐｒｏｐｙｌｕｒｅｉｄｏ－ＦＬＦＬＦ、Ｓｐｉｎｏｒｐｈｉｎ、及びｔＢＯＣ、並びにこれらの誘導体であってホルミルペプチド受容体１アンタゴニスト活性を有するものを挙げることができる。
《ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質》
　前記ＲＩＰ１阻害物質は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、例えばＲＩＰ１の活性を阻害する物質、ＲＩＰ１に結合してＲＩＰ３との結合、複合体ＩＩｂの形成を阻害する物質、ＲＩＰ１の発現を阻害する物質を挙げることができる。具体的には、例えばアネキシンＡ１を阻害する、ホルミルペプチド受容体を阻害する、化合物、タンパク質（例えば、抗ＲＩＰ１抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、又はｓｉＲＮＡを挙げることができる。
（ネクロスタチン１）
　前記ＲＩＰ１キナーゼ阻害物質の例として、ネクロスタチン１（Necrostain-1；以下、Ｎｅｃ－１と称することがある）が知られている。Ｎｅｃ－１は、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 で表される化合物であり、ＲＩＰ１キナーゼを阻害することにより、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制することができる。
《ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質》
　前記ＲＩＰ３阻害物質は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１によるネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、例えばＲＩＰ３の活性を阻害する物質、ＲＩＰ３に結合してＲＩＰ１との結合、複合体ＩＩｂの形成を阻害する物質、ＲＩＰ３の発現を阻害する物質を挙げることができる。具体的には、例えばアネキシンＡ１を阻害する、化合物、タンパク質（例えば、抗ＲＩＰ３抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、又はｓｉＲＮＡを挙げることができる。なお、ＲＩＰ３はＲＩＰ３キナーゼと称されることもある。
（抗体）
　本発明の医薬組成物に用いることのできる抗アネキシンＡ１抗体、抗ホルミルペプチド受容体抗体、抗ＲＩＰ１抗体、又は抗ＲＩＰ３抗体は、それぞれのタンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメントであって、且つそれぞれタンパク質の発現又は機能を抑制することができる限り、限定されるものではないが、マウスのモノクローナル抗体、又はそのキメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、若しくはヒト型抗体が好ましい。
　モノクローナル抗体は、免疫抗原としてそれぞれのタンパク質を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能であり、例えばＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５－４９７，１９７５）に従って、作成することができる。免疫抗原であるタンパク質は、配列番号２、４、６、又は８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部のペプチドを用いることができる。具体的には、生体試料から精製した抗原、遺伝子工学的に作成した組換え抗原、又は化学的に合成した部分ペプチドなどを用いることが可能である。大腸菌や酵母などで発現させる組換え抗原を用いる場合は、発現を容易にするため、他のタンパク質、例えば、ＳＯＤやＴｒｐＥとの融合抗原とすることも可能である。また、精製を容易にするため、Ｈｉｓ－Ｔａｇなどを結合させて発現させることもできる。
　キメラ抗体は、例えばマウスの重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインをコードするＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域のポリペプチドをコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。キメラ化抗体に用いる重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメイン、並びに定常領域のポリペプチドの由来は、ヒトの抗体であれば特に限定されるものではなく、例えばマウスのＩｇＧの重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインとヒトのＩｇＭ、又はＩｇＧの定常領域のポリペプチドとにより、キメラ抗体を得ることができる。
　ＣＤＲグラフト化抗体は、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、例えばヒト抗体の相補性決定領域と入れ替え、移植したものである。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ＣＤＲグラフト化抗体に用いる相補性決定領域、並びにフレームワーク領域及び定常領域のポリペプチドの由来は、ヒトの抗体であれば特に限定されるものではなく、例えばマウスのＩｇＧの相補性決定領域とヒトのＩｇＭ、又はＩｇＧのフレームワーク領域及び定常領域のポリペプチドとにより、ＣＤＲグラフト化抗体を得ることができる。また、マウスの相補性決定領域とヒトのＩｇＭ、又はＩｇＧフレームワーク領域とにより、ＣＤＲグラフト化抗体の抗原結合性断片を得ることができる。
　また、本明細書において、「ヒト型抗体」は、ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物から得られる抗体、及びヒトの抗体産生細胞をミエローマ細胞と細胞融合させて得ることのできるモノクローナル抗体を意味する。
（ｓｉＲＮＡ）
　本発明の医薬組成物に用いることのできるアネキシンＡ１のｓｉＲＮＡ、ホルミルペプチド受容体のｓｉＲＮＡ、ＲＩＰ１のｓｉＲＮＡ、又はＲＩＰ３のｓｉＲＮＡのｓｉＲＮＡは、二重鎖のＲＮＡ部分を有し、それぞれの遺伝子のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することができる限り限定されるものではない。
　例えば、ＲＩＰ３のｍＲＮＡである配列番号９（Ｓｉ－４１）又は１１（ｓｉ－４２）で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域において、ＲＮＡ干渉を介して開裂することができるｓｉＲＮＡを挙げることができる。
　二重鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５～４０塩基、好ましくは１５～３０塩基、より好ましくは１５～２５塩基、更に好ましくは１９～２５塩基、最も好ましくは１９～２１塩基である。
　二重鎖ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ配列は、それぞれの遺伝子のｍＲＮＡに細胞内でハイブリダイズできるものであれば、限定されない。例えばＲＩＰ３のアンチセンスＲＮＡとしては、具体的には標的ｍＲＮＡ領域におけるＵＵＡＣＧＵＵＡＡＣＡＡＡＣＡＧＵＵＣ(配列番号１０)又はＵＧＧＵＵＵＵＣＵＡＵＧＧＵＵＣＵＣＣ(配列番号１２)を挙げることができる。また、二重鎖ＲＮＡ部分のセンスＲＮＡ配列は、アンチセンスＲＮＡ配列と細胞内でハイブリダイズすることのできるＲＮＡであれば、限定されない。例えば、ＲＩＰ３のアンチセンスＲＮＡとしては、具体的には標的ｍＲＮＡ領域１におけるＧＡＡＣＵＧＵＵＵＧＵＵＡＡＣＧＵＡＡ（配列番号９）又はＧＧＡＧＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＡＡＣＣＡ（配列番号１１）を挙げることができる。
　本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチドも含まれ、このようなｓｉＲＮＡは十分なＲＮＡｉ活性を示す。また、本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、突出末端を形成する二本鎖オリゴヌクレオチドも含まれる。前記オーバーハング部分は、ｕｇ－３’、ｕｕ－３’、ｔｇ－３’、ｔｔ－３’などの塩基配列を挙げることができる。
　本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ；以下、ｓｈＲＮＡと称する）が含まれる。ヘアピンループの配列としては、例えば、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ（配列番号１７）、ＣＣＡＣＣ、ＣＵＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡ（配列番号１８）、又はＵＵＣＧのＲＮＡを挙げることができる。
　本発明の医薬組成物に用いるｓｉＲＮＡは、ベクターに遺伝子を組込んで得ることもできる。ベクターは、哺乳動物細胞内でＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの発現を抑制することのできるｓｉＲＮＡを発現させるためのベクターであり、前記細胞内で効率良くｓｉＲＮＡを発現できるものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となるベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを挙げることができる。
《ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患》
　本発明の医薬組成物の予防又は治療対象である、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１により誘導されるネクロプトーシスが関与している限りにおいて、限定されるものではないが、例えばスティーブンス・ジョンソン・シンドローム（ＳＪＳ）、及び中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）を挙げることができる。
（スティーブンス・ジョンソン・シンドローム（Stevens-Johnson Syndrome））
　本発明の医薬組成物の予防及び治療対象であるＳＪＳは、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスが関連しているものである。ＳＪＳの原因は、セフェム系の抗生物質であるセフジニル、抗てんかん薬（例えば、ゾニサミド、カルバマゼピン、及びフェノバルビタール）、又は非ステロイド性抗炎症薬などの薬剤によるものが多いが、その他にウイルス感染、化学物質、又は悪性腫瘍が原因といわれるものがあるが、このような原因によって発症するＳＪＳも、本発明の医薬組成物の予防及び治療対象に含まれる。
（中毒性表皮壊死症）
　本発明の医薬組成物の予防及び治療対象であるＴＥＮは、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１誘導性ネクロプトーシスが関連しているものである。ＴＥＮの原因は、その多くが薬剤によるものであるが、ＳＪＳと同様にホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスが関連している限りにおいて、薬剤が原因のものに限定されない。ＴＥＮの致死率は２０～３０％といわれ、非常に致死率の高い疾患である。
　本発明の医薬組成物は、前記有効成分のいずれか１つを含有することもできるし、２つ以上を任意の組み合わせで含有することもできる。本発明においては、前記有効成分をそれ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療又は予防の必要な対象［例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］に有効量で投与することができる。また、前記有効成分は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療又は予防用医薬組成物を製造するために使用することができる。
　本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
　本発明の医薬組成物は、例えば、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
　非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
　また、本発明の抗腫瘍剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明における前記有効成分をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
　本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、本発明における前記有効成分を０．０１～９９重量％、好ましくは０．１～８０重量％の量で含有することができる。本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
［１－２］ネクロプトーシス関連疾患の治療方法
　前記ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物（特には、ネクロプトーシス抑制物質）は、ネクトプトーシス関連疾患の予防又は治療方法に用いることができる。従って、本発明のホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療対象に、有効量投与することを特徴とするものである。
　前記ネクロプトーシス抑制物質の投与経路、投与量、及び投与間隔などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
［１－３］ネクロプトーシス関連疾患の治療における使用のためのネクロプトーシス抑制物質
　前記ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物（特には、ネクロプトーシス抑制物質）は、ネクトプトーシス関連疾患の予防又は治療方法において用いることができる。従って、本発明のホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法における使用のためのものである。
　前記ネクロプトーシス抑制物質の予防又は治療における使用量などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
［１－４］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬の製造のためのネクロプトーシス抑制物質の使用
　前記ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物（特には、ネクロプトーシス抑制物質）は、ネクトプトーシス関連疾患の予防又は治療用医薬の製造のために用いることができる。従って、本発明の使用は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質の、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療用医薬の製造のための使用である。
　前記ネクロプトーシス抑制物質の予防又は治療用医薬における含有量などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
［１－５］ネクロプトーシス関連疾患の治療のためのネクロプトーシス抑制物質の使用
　前記ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物（特には、ネクロプトーシス抑制物質）は、ネクトプトーシス関連疾患の治療のために用いることができる。従って、本発明の使用は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質の、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療のための使用である。
　前記ネクロプトーシス抑制物質の予防又は治療における使用料などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
［２］ネクロプトーシス誘導剤
　本発明のネクロプトーシス誘導剤は、ホルミルペプチド受容体１と結合し、ネクロプトーシスを誘導する物質を有効成分として含むものである。本発明のネクロプトーシス誘導剤は、ネクロプトーシスを誘導する物質が１種類で含まれてもよく、２種類以上組み合わせて含まれてもよい。また、担体と一緒に含まれてもよく、有効成分のみで担体が含まれなくてもよい。
（ホルミルペプチド受容体１のアゴニスト）
　前記ネクロプトーシスを誘導する物質としては、限定されるものではないが、ネクロプトーシス誘導活性を有する化合物（ホルミルペプチド受容体１のアゴニスト）、タンパク質（例えば、抗ＲＩＰ１抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、又はＲＮＡアプタマーを挙げることができる。
　ホルミルペプチド受容体のアゴニストとしては、例えばアネキシンＡ１、ｆＭＬＰＡｃ２－１２、Ａｃ９－２５、Ａｃ２－２６、Ａｎｎｅｘｉｎ　１、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｇ、、ＨＩＶ－１　Ｔ２０　（ＤＰ１７８）、ＨＩＶ－１　Ｔ２１　（ＤＰ１０７）、ＨＩＶ　ｇｐ４１、ＨＳＶ　ｇＧ－２ｐ２０、ＬＬ－３７、ＳＲＳＲＹ、ＷＫＹＭＶＭ、又はＷＫＹＭＶｍ　ｐｅｐｔｉｄｅ、並びにこれらの誘導体であってホルミルペプチド受容体１アゴニスト活性を有するものを挙げることができるが、好ましくはアネキシンＡ１又はｆＭＬＰである。
（ｆＭＬＰ）
　前記ｆＭＬＰは、ｆｏｒｍｙｌ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ（Ｎホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン）であり、ＦＰＲ１に結合するリガンド（アゴニスト）として最初に同定された化合物である。ｆＭＬＰは、好中球において、走化性の誘導、顆粒の可動化（granule mobilization）、活性酸素代謝物の産生を引き起こす。
　本発明のネクロプトーシス誘導剤が結合するホルミルペプチド受容体１は、前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」において、詳しく説明されている。また、有効成分であるアネキシンＡ１も前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」において、詳しく説明されている。ネクロプトーシス誘導剤は、ネクロプトーシス誘導用組成物又はネクロプトーシス誘導用医薬組成物として用いることができるが、この場合の担体、投与剤形、又は投与方法などは、前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」に記載されたものを用いることができる。
　本発明のネクロプトーシス誘導剤は、悪性腫瘍に特異的にホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを誘導することによって、悪性腫瘍の治療に用いることができる。より具体的には、ホルミルペプチド受容体１を発現している悪性腫瘍に、前記アゴニストなどを作用させることによって、悪性腫瘍に特異的にネプロプトーシスを誘導し、腫瘍を治療することが可能である。
　ホルミルペプチド受容体１を発現している悪性腫瘍としては、例えば悪性黒色腫を挙げることができる。
［３］ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法
　本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる工程と、前記受容体又はその改変体と前記リガンド又はアゴニストとの結合に対する前記試験物質の阻害活性を検出する工程若しくはホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスに対する前記試験物質の誘導阻害活性を検出する工程、とを含む。
　本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、或いは、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストをスクリーニングのツールとして用い、ネクロプトーシスを抑制する物質を選択するものである。従って、試験物質を、これらのいずれかのスクリーニングツールと接触させる工程を行う。
　また、本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法は、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを阻害する物質を選択するものであり、従って試験物質によって、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合が阻害されること、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス（例えば、細胞の障害）が阻害されること、又はＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの過程（例えば、シグナル伝達）が阻害されることを検出する工程を行う。
《接触工程（１）》
　前記接触工程（１）は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる工程である。ここで、「ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる」とは、「ホルミルペプチド受容体１又はその改変体」、「ホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニスト」、及び「試験物質」の３つが同時に接触する態様のみでなく、３つのうちの２つを先に接触させ、更に残りの１つが接触する態様を含むものである。すなわち、試験物質が、スクリーニングツールであるホルミルペプチド受容体１又はその改変体、又はホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと接触できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば接触工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を挙げることができる。
　接触工程（ａ）は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと、試験物質とを同時に接触させる工程である。接触工程（ｂ）は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と試験物質とを接触させ、そしてその混合物をホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと接触させる工程である。接触工程（ｃ）は、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと試験物質とを接触させ、そしてその混合物をホルミルペプチド受容体１又はその改変体と接触させる工程である。
　試験物質は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、或いはホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと結合することによって機能を阻害してもよく、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、或いはホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと接触することによって機能を阻害するものでもよい。更に、試験物質はアロステリック効果により阻害を誘導するものでもよい。すなわち、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、又はホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストの活性中心に結合して機能を阻害するものではなく、活性中心以外の部位に試験物質が作用（例えば、結合）することによって、例えばホルミルペプチド受容体１等又はリガンド等の構造が変化し、そしてそれらの機能が阻害されるものでもよい。
《ホルミルペプチド受容体１又はその改変体発現細胞》
　前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体は、細胞に発現しているものを用いることができる。ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が発現している細胞は、アネキシンＡ１との結合により、ネクロプトーシスが誘導される限りにおいて、限定されるものではないが、例えばＳＪＳ患者、ＴＥＮ患者から分離された初代細胞を用いてもよく、樹立された継代細胞を用いてもよい。また、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体の遺伝子を組込んだ組換え細胞を用いてもよい。遺伝子組み換え細胞の作製は、常法に従って行うことができる。
　細胞の種類も特に限定されるものではないが、例えば副腎皮質細胞、星状細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、未成熟樹状細胞、クッパー細胞、マクロファージ、ミクログリア細胞、単球、神経芽腫細胞、好中球、血小板、癌細胞、眼球の結膜細胞、及び皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）を挙げることができるが、皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）、肝細胞、又は眼球の結膜細胞が好ましい。
　遺伝子組み換え細胞の作製に用いるホルミルペプチド受容体１又はその改変体の遺伝子は、ネクロプトーシスを誘導することができる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～７０個のアミノ酸（好ましくは、１～５０個、より好ましくは１～３０個、更に好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個のアミノ酸）が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（４）前記（１）～（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、のいずれかをコードするポリヌクレオチド、を挙げることができる。
《検出工程（２）》
　本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法における検出工程は、前記受容体又はその改変体と前記リガンド又はアゴニストとの結合に対する前記試験物質の阻害活性を検出する工程（以下、結合阻害検出工程と称することがある）、若しくはホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスに対する前記試験物質の誘導阻害活性を検出する工程（以下、誘導阻害検出工程と称することがある）である。
　前記結合阻害検出工程は、受容体又はその改変体と、リガンド又はアゴニストとの結合の阻害を検出し、その試験物質がネクロプトーシスを抑制する物質である限りにおいて、限定されるものではない。
　また、誘導阻害検出工程は、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの誘導の阻害を検出する限りにおいて、限定されるものではないが、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス（例えば、細胞の障害）の阻害の検出、又はＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの過程（例えば、シグナル伝達）の阻害の検出を含む。
　なお、前記結合阻害検出工程において、結合の阻害の検出ともに、ネクロプトーシスの阻害を検出してもよい。すなわち、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス（例えば、細胞の障害）の阻害、又はＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの過程（例えば、シグナル伝達）の阻害を検出してもよい。
　ネクロプトーシスの誘導の阻害の検出は、ネクロプトーシスの誘導が阻害されたことを検出できる限りにおいて限定されるものではない。例えば、細胞においてネクロプトーシスの誘導が阻害されたことを、形態的に検出してもよい。また、試験管内又は細胞において、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストとの結合が低下したこと、複合体Ｉの形成が低下したこと、ＲＩＰ１キナーゼの活性が低下したこと、ＲＩＰ１、ＲＩＰ１のリン酸化が認められないこと又はＲＩＰ１及びＲＩＰ３を含む複合体ＩＩｂの形成が低下したことなどを検出することによっても、ネクロプトーシスの阻害を検出することが可能である。
　前記検出工程におけるネクロプトーシス誘導の阻害の検出は、コントロールと比較することが好ましい。コントロールとしては、スクリーニング系に試験物質を添加しない陰性コントロールを用いることができる。陰性コントロールにおいては、ネクロプトーシスが誘導されるため、それと比較して試験物質がネクロプトーシスの誘導を阻害したか否かを検出することが容易になる。すなわち、陰性コントロールと比較してネクロプトーシスの誘導を阻害された場合、試験物質がネクロプトーシス誘導阻害活性を有していると判断することが容易になる。
　更に、コントロールとして、ネクロプトーシス誘導を阻害する物質を添加した陽性コントロールを用いてもよい。ネクロプトーシス誘導を阻害する物質としては、例えばＦＰＲ１のアンタゴニストであるＣＤＣＡ、ＣＨＩＰＳ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、２２９Ｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　Ａ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ　Ｈ、ＤＣＡ、Ｅｂｏｌａ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＦＬＩＰｒ、ＨＩＶ－２　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ｓｏｐｒｏｐｙｌｕｒｅｉｄｏ－ＦＬＦＬＦ、Ｓｐｉｎｏｒｐｈｉｎ、及びｔＢＯＣを用いることができる。また、抗ＦＰＲ１抗体、又は抗アネキシンＡ１抗体を用いることもできる。
《ホルミルペプチド受容体１又はその改変体》
　本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法で用いるホルミルペプチド受容体１は、前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」の欄に記載のホルミルペプチド受容体１を用いることができる。
　また、ホルミルペプチド受容体１以外に、ホルミルペプチド受容体１改変体を用いることができる。改変体は、アネキシンＡ１と結合して、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを誘導できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～７０個のアミノ酸（好ましくは、１～５０個、より好ましくは１～３０個、更に好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個のアミノ酸）が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）～（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチドを挙げることができる。
　前記融合ポリペプチドは、例えば前記（１）～（３）のいずれかのポリペプチドのＮ末、Ｃ末、又はＮ末及びＣ末に、他のペプチド（タンパク質）が融合したものである。他のペプチドとしては、通常融合ペプチド（タンパク質）として用いることのできるペプチドを限定せずに用いることができるが、例えばＧＳＴ、ＴｒｐＥ、又はＨｉｓ　Ｔａｇなどを挙げることができる。
《ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニスト》
　本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法で用いるホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストは、ホルミルペプチド受容体１と結合して、ネクロプトーシスを誘導できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えばアネキシンＡ１若しくはその改変体、ｆＭＬＰ若しくはその誘導体、Ａｃ２－１２、Ａｃ９－２５、Ａｃ２－２６、Ａｎｎｅｘｉｎ　１、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｇ、、ＨＩＶ－１　Ｔ２０　（ＤＰ１７８）、ＨＩＶ－１　Ｔ２１　（ＤＰ１０７）、ＨＩＶ　ｇｐ４１、ＨＳＶ　ｇＧ－２ｐ２０、ＬＬ－３７、ＳＲＳＲＹ、ＷＫＹＭＶＭ、又はＷＫＹＭＶｍ　ｐｅｐｔｉｄｅ、並びにこれらの誘導体を挙げることができるが、特にはアネキシンＡ１若しくはその改変体、又はｆＭＬＰ若しくはその誘導体が好ましい。
　これらの物質は、ホルミルペプチド受容体１と結合して、ホルミルペプチド受容体１誘導性のネクロプトーシスを起こすことができる。
《アネキシンＡ１又はその改変体》
　本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法で用いることのできるアネキシンＡ１は、前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」の欄に記載のアネキシンＡ１を用いることができる。
　また、アネキシンＡ１以外に、アネキシンＡ１改変体を用いることができる。改変体は、ホルミルペプチド受容体１と結合して、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを誘導できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば、（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～７０個のアミノ酸（好ましくは、１～５０個、より好ましくは１～３０個、更に好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個のアミノ酸）が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）～（３）のいずれかのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチドを挙げることができる。
　前記融合ポリペプチドは、例えば前記（１）～（３）のいずれかのポリペプチドのＮ末、Ｃ末、又はＮ末及びＣ末に、他のペプチド（タンパク質）が融合したものである。他のペプチドとしては、通常融合ペプチド（タンパク質）として用いることのできるペプチドを限定せずに用いることができるが、例えばＧＳＴ、ＴｒｐＥ、又はＨｉｓ　Ｔａｇなどを挙げることができる。
　本発明に用いることのできる変異ペプチドの改変体のアミノ酸置換は保存的置換が好ましい。本明細書において「保存的置換」とは、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術［Terrett, N. K. ら, Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)］又は通常の合成技術によって得られた化合物群、ファージ・ディスプレイ法［Felici, F. ら, J. Mol. Biol., 222, 301-310 (1991)］などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、ｓｉＲＮＡ、ホルミルペプチド受容体１に結合する抗体、アネキシンＡ１に結合する抗体、又はホルミルペプチド受容体１のリガンドに結合する抗体を用いることができる。また、例えば微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された試験物質を、化学的又は生物学的に修飾した誘導体を用いることができる。
［４］ネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法
　本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法は、（１）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と、試験物質とを接触させる工程、及び（２）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体によって誘導されるネクロプトーシスを検出する工程、
を含む。
　本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体をスクリーニングのツールとして用い、ネクロプトーシスを誘導する物質を選択するものである。従って、試験物質を、これらのいずれかのスクリーニングツールと接触させる工程を行う。
　また、本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法は、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを誘導する物質を選択するものであり、従って試験物質によってＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス、又はＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの過程が誘導されることを検出する工程を行う。具体的には、ネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法によって、ＦＰＲ１のリガンド又はアゴニストを選択することが可能である。
《接触工程（１）》
　前記接触工程（１）は、試験物質が、スクリーニングツールであるホルミルペプチド受容体１又はその改変体と接触できる限りにおいて、限定されるものではない。
　試験物質は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と結合することによってＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを誘導してもよく、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と接触することによってＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを誘導してもよく、更にホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニスト、若しくはそれらの前駆体に作用してＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを誘導してもよい。
《ホルミルペプチド受容体１又はその改変体発現細胞》
　前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体は、細胞に発現しているものを用いることができる。ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が発現している細胞は、前記「［３］ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法」の欄に記載のものを用いることができる。
《検出工程（２）》
　本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法における検出工程は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体によって誘導されるネクロプトーシスを検出する工程である。
　ネクロプトーシスの検出は、ネクロプトーシスが誘導されたことを検出できる限りにおいて限定されるものではない。例えば、細胞においてネクロプトーシスが誘導されたことを、形態的に検出してもよい。また、試験管内又は細胞において、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と試験物資が結合したこと、複合体Ｉが形成されたこと、ＲＩＰ１キナーゼの活性が上昇したこと、ＲＩＰ１、ＲＩＰ１のリン酸化が認められたこと、又はＲＩＰ１及びＲＩＰ３を含む複合体ＩＩｂが形成されたことなどを検出することによっても、ネクロプトーシスの誘導を検出することが可能である。
　前記検出工程におけるネクロプトーシス誘導の検出は、コントロールと比較することが好ましい。
　コントロールとしては、スクリーニング系にネクロプトーシスを誘導する物質を添加した、陽性コントロールを用いてもよい。ネクロプトーシスを誘導する物質としては、アネキシンＡ１、ｆＭＬＰ及びその誘導体、Ａｃ２－１２、Ａｃ９－２５、Ａｃ２－２６、Ａｎｎｅｘｉｎ　１、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｇ、ＨＩＶ－１　Ｔ２０　（ＤＰ１７８）、ＨＩＶ－１　Ｔ２１　（ＤＰ１０７）、ＨＩＶ　ｇｐ４１、ＨＳＶ　ｇＧ－２ｐ２０、ＬＬ－３７、ＳＲＳＲＹ（配列番号１９）、ＷＫＹＭＶＭ（配列番号２０）、又はＷＫＹＭＶｍ　ｐｅｐｔｉｄｅ（配列番号２０）、を挙げることができる。
　また、コントロールとしては、スクリーニング系に試験物質を添加しない陰性コントロールを用いることができる。陰性コントロールにおいては、ネクロプトーシスが誘導されないため、それと比較して試験物質がネクロプトーシスを誘導したか否かを検出することが容易になる。
　本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法における、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、及び試験物質等は、前記「［３］ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法」の欄に記載のものを用いることができる。
　本発明のネクロプトーシスを誘導又は抑制する物質のスクリーニング方法は、スクリーニングキットを用いて行うことも可能である。この場合、スクリーニングキットは、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体を含むものである。ネクロプトーシスを誘導又は抑制する物質のスクリーニングキットは、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体を、細胞に発現した状態で含んでもよい。また、ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニングキットは、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストを更に含んでもよい。
　ネクロプトーシスを誘導又は抑制する物質のスクリーニングキットに含むことのできる、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体発現細胞、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニスト、或いはアネキシンＡ１又はその改変体は、前記「［３］ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法」及び「［４］ネクロプトーシスを誘導する物質のスクリーニング方法」の欄に記載のものを用いることができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実験例１》
　本実験例１では、ＳＪＳ患者の末梢血細胞（ＰＢＭＣ）から分泌される液性分子の解析を、通常薬疹（ＯＤＳＲ）患者の末梢血細胞（ＰＢＭＣ）から分泌される培養上清と比較することによって行った。
　図１ａは、ＳＪＳ／ＴＥＮ患者及びＯＤＳＲ患者の表皮のヘマトキシリン・エオジン染色を行った顕微鏡写真、及び電子顕微鏡写真を示したものである。ＳＪＳ／ＴＥＮ患者では、皮膚の病変部に表皮細胞の細胞死が認められる。
　ＳＪＳ患者及びＯＤＳＲ患者の末梢血から単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、ファイコールにより分離した。２ｘ１０５cellのＰＢＭＣに、ＳＪＳの原因である薬剤をＤＬＳＴで陽性となった濃度で加えて、ｃＲＰＭＩ培地で５日培養し、更に同じ濃度の薬剤を加えて刺激した後の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ及びＯＤＳＲｓｕｐ）を回収した。
　ＳＪＳ患者及びＯＤＳＲ患者から、表皮細胞（ＳＪＳ－ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＳＪＳ－Ｋ、及びＯＤＳＲ－ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＯＤＳＲ－Ｋ）をディスパーゼを用いて分離し培養した。得られたＳＪＳ－Ｋ及びＯＤＳＲ－Ｋ１ｘ１０５cellに対して、前記のＳＪＳｓｕｐ又はＯＤＳＲｓｕｐを５％添加して、８時間後に、細胞障害性をトリパンブルーの染色によって調べた。
　ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）は、ＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）に対して壊死を誘導したが、通常薬疹患者由来の表皮細胞（ＯＤＳＲ－Ｋ）に対しては毒性を示さなかった（図１ｂ）。また、通常薬疹患者の培養上清（ＯＤＳＲｓｕｐ）は、ＳＪＳ－Ｋ、及びＯＤＳＲ－Ｋのいずれにも、細胞障害性は示さなかった。また、ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の添加を、０．１％～１５％まで変化させると、壊死が容量依存的に誘導された（図１ｃ）。
　更に、３人のＳＪＳ患者（ＳＪＳ＃１、ＳＪＳ＃２、及びＳＪＳ＃３）について、同様に培養上清（ＳＪＳ＃１ｓｕｐ、ＳＪＳ＃２ｓｕｐ、及びＳＪＳ＃３ｓｕｐ）及び表皮細胞（ＳＪＳ＃１－Ｋ、ＳＪＳ＃２－Ｋ、及びＳＪＳ＃３－Ｋ）を調製し、それぞれの培養上清を、それぞれの表皮細胞に添加して、細胞障害性を調べた。その結果、培養上清の細胞障害性は、ＳＪＳ患者間において、交叉して観察された（図１ｄ）。
　これらのことから、ＳＪＳ患者のＰＢＭＣからＳＪＳ－Ｋの細胞壊死を誘導する細胞外液性因子が分泌されること、ＳＪＳ－Ｋには前記液性因子に対する受容体が特異的に発現していることが考えられた。
《実験例２》
　本実験例では、ＳＪＳ患者のＰＢＭＣから分泌される液性因子を解析した。具体的には、実験例１で得られたＳＪＳｓｕｐ及びＯＤＳＲｓｕｐを、液体クロマトグラフ－タンデム型質量分析機（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、比較分析した。その結果、ＳＪＳｓｕｐ及びＯＤＳＲｓｕｐで、多くのタンパク質の相違が見られた。それらの異なるタンパク質の１つとして、アネキシンＡ１が見出された。
《実験例３》
　本実験例では、ＳＪＳ患者から分離された表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）及びＳＪＳ患者の組織における、アネキシンＡ１及びその受容体であるホルミルペプチド受容体１の発現を調べた。
　検体として、ＳＪＳ患者の表皮細胞（ＳＪＳ）、及び健常人の表皮細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）について、抗ＦＰＲ１抗体（Lifespan, Seattle, WA）を用いて蛍光抗体法により、ＦＰＲ１の発現を調べた。その結果、ＳＪＳ患者の表皮細胞（ＳＪＳ）において、ＦＰＲ１の発現が確認された（図２ａ）。更に、ＳＪＳ患者の病変部（ＳＪＳ　ｌｅｓｉｏｎ）及び非病変部（ｎｏｎ－ｌｅｓｉｏｎ　ｓｋｉｎ）、並びに通常薬疹の患者の皮膚（ＯＤＳＲ　ｌｅｓｉｏｎ）の組織切片を準備した。それぞれの検体を、抗アネキシンＡ１抗体（Lifespan, Seattle, WA）、及び抗ＦＰＲ１抗体（Lifespan, Seattle, WA）を用いて蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
　その結果、ＳＪＳ患者の病変部（ＳＪＳ　ｌｅｓｉｏｎ）において、アネキシンＡ１及びホルミルペプチド受容体１の発現が亢進していた（図２ｂ及びｃ）。
《実施例１》
　本実施例では、抗アネキシンＡ１抗体による、ＳＪＳ患者のＰＢＭＣの培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の細胞傷害活性の抑制について検討した。
　２人のＳＪＳ患者（ＳＪＳ＃１、及びＳＪＳ＃２）から、実験例１と同様の操作により、培養上清（ＳＪＳ＃１ｓｕｐ、及びＳＪＳ＃２ｓｕｐｐ）及び表皮細胞（ＳＪＳ＃１－Ｋ、及びＳＪＳ＃２－Ｋ）を得た。それぞれの培養上清に、抗アネキシン抗体（BD Transduction Laboratories, NJ USA）５μｇ／ｍＬを添加し、４℃、一昼夜ゆっくりと攪拌した。プロテインＧビーズ（Ｄｙｎａｌ社）を添加し、４℃で２時間攪拌し、プロテインＧビーズを除去したものを、培養上清として用い、細胞障害性を調べた。
　その結果、抗アネキシン抗体で処理された培養上清（ＳＪＳ＃１　ｓｕｐ　Ａｎｘ　ｄｅｐｌｅｔ、及びＳＪＳ＃２　ｓｕｐ　Ａｎｘ　ｄｅｐｌｅｔ）は、２人のＳＪＳ患者の表皮細胞（ＳＪＳ＃１－Ｋ、及びＳＪＳ＃２－Ｋ）に対して、細胞障害性を示さなかった（図３）。
　ＳＪＳ患者における細胞障害性は、アネキシンＡ１及びその受容体であるＦＰＲ１によって誘導されているものと考えられ、この細胞障害性は、抗アネキシン抗体によって抑制された。
《実施例２》
　本実施例では、ネクロプトーシスの特異的阻害剤であるＮｅｃ－１による、培養上清による細胞障害性の抑制を検討した。
　実施例１で得られた培養上清（ＳＪＳ＃１ｓｕｐ、及びＳＪＳ＃２ｓｕｐｐ）にネクロスタチン１（Ｎｅｃ－１；Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）５０μＭを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。この培養上清を用いて、表皮細胞（ＳＪＳ＃１－Ｋ、及びＳＪＳ＃２－Ｋ）への細胞障害性を調べた。また、アポトーシスを特異的に阻害するカスパーゼ阻害剤（ｚＩＥＤ－ｆｍｋ（ＲＤｓｙｓｔｅｍｓ社）２０μＭ及びｚＶＡＤ－ｆｍｋ（ＲＤｓｙｓｔｅｍｓ社）５０μＭ）についても、ネクロスタチン１と同様に培養上清に添加し、細胞障害性への影響を調べた。
　ネクロプトーシスの特異的阻害剤であるＮｅｃ－１により細胞障害性は完全に抑制された。しかしながら、カスパーゼの阻害剤（ｚＩＥＤ－ｆｍｋ、ｚＶＡＤ－ｆｍｋ）は、ＳＪＳ－Ｋの細胞障害性は抑制されなかった（図４）。
　従って、ＳＪＳ患者における皮膚の細胞障害は、ＦＰＲ１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスによるものと考えられた。
《実施例３》
　本実施例では、ネクロプトーシスに関与するＲＩＰ３の発現を、ｓｉＲＮＡを用いてノックダウンすることにより、アネキシンＡ１によるネクロプトーシスの阻害について検討した。ｓｉＲＮＡの配列は、以下の通りである。
Ｓｉ－４１：
センス：ＧＡＡＣＵＧＵＵＵＧＵＵＡＡＣＧＵＡＡｔｔ（配列番号１３）
アンチセンス：ＵＵＡＣＧＵＵＡＡＣＡＡＡＣＡＧＵＵＣｔｇ（配列番号１４）
Ｓｉ－４２：
センス：ＧＧＡＧＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＡＡＣＣＡｔｔ（配列番号１５）
アンチセンス：ＵＧＧＵＵＵＵＣＵＡＵＧＧＵＵＣＵＣＣｔａ（配列番号１６）
小文字で記載した部分がオ－バーハングの配列である。
　前記のＳｉ－４１、及びＳｉ－４２のＳＪＳ患者の表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）へのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　ＭＡＸ　ｒｅｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ　ｍｅｄｉｕｍを用い、添付のプロトコールに従って行った。ｓｉＲＮＡの濃度は、４０ｐｍｏｌｅとした。
　ｓｉＲＮＡが導入された表皮細胞は、培養上清によるネクロプトーシスが抑制され、ＲＩＰ３のｓｉＲＮＡにより、アネキシンＡ１によるネクロプトーシスが抑制されることが確認された(図５ａ)。なお、ＳＪＳ／ＴＮＴ患者（ＳＪＳ／ＴＮＴ）及び通常薬疹患者（ＯＤＳＲ）の表皮におけるＲＩＰ３の発現を蛍光抗体法によって確認した。その結果、ＳＪＳ／ＴＮＴ患者の病変部においてはＲＩＰ３の発現が亢進していた（図５ｂ）。
《実施例４》
　本実施例では、ＦＰＲ１のアゴニストであるｆＭＬＰによる、ＦＰＲ１及びアネキシンＡ１によるネクロプトーシス（ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス）の誘導について検討した。
　実験例１と同様に調製した表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）に、ｆＭＬＰを０ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、又は５００ｎＭ添加して、８時間後に細胞障害性を、トリパンブルーの染色によって調べた。その結果、ｆＭＬＰは容量依存的に、ネクロプトーシスを誘導した（図６）。
《実施例５》
　本実施例では、ネクロプトーシスの特異的阻害剤であるネクロスタチン１（Ｎｅｃ－１）による、ｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導の抑制を検討した。
　前記実施例４において、ｆＭＬＰを５ｎＭ添加した実験系に、Ｎｅｃ－１を５０μＭ添加して、同様に細胞障害性をトリパンブルーの染色によって調べた。また、コントロールとして、カスパーゼ阻害剤であるｚＩＥＤ－ｆｍｋ（ＲＤｓｙｓｔｅｍｓ社）２０μＭ及びｚＶＡＤ－ｆｍｋ（ＲＤｓｙｓｔｅｍｓ社）５０μＭを添加して、細胞障害性を調べた。その結果、ｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導は、Ｎｅｃ－１によって阻害されたが、ｚＩＥＤ－ｆｍｋ及びｚＶＡＤ－ｆｍｋによっては、阻害されなかった（図７）。
《実施例６》
　本実施例では、ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）によるネクロプトーシスの誘導が、抗ＦＰＲ１抗体によって抑制されるかを調べた。
　実験例１と同様に調製したＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）に、ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）を５％添加した。それに、抗ＦＰＲ１抗体を０μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、３．０μｇ／ｍＬ、又は３０μｇ／ｍＬ添加して、細胞障害性をトリパンブルーの染色によって調べた。その結果、ＳＪＳｓｕｐによるネクロプトーシスの誘導は、抗ＦＰＲ１抗体によって、容量依存的に阻害された（図８）。
《実施例７》
　本実施例では、本発明のスクリーニング用の細胞の例として、Ｈｅｌａ細胞にＦＰＲ１遺伝子を導入した細胞の樹立を行った。
　ヒトＦＰＲ１の全長のｃＤＮＡを合成し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）のＸｈｏＩサイト及びＫｐｎＩサイトにクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ－ＦＰＲ１プラスミドを得た。トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ６（Roche, Indianapolis, IN）を用いて、Ｈｅｌａ細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ－ＦＰＲ１プラスミドをトランスフェクションし、Ｚｅｏｃｉｎ（Invitrogen）を用いて、ヒトＦＰＲ１が組込まれた細胞を選択した。
　得られたＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞（Ｓ－４）におけるＦＰＲ１の発現を蛍光抗体法で確認した写真を図９に示す。
《実施例８》
　本実施例では、ＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞に対するｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導、及びｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導のＮｅｃ－１による抑制を検討した。
　表皮細胞（ＳＪＳ－Ｋ）をＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞に変更したことを除いては、実施例４又は５の操作を繰り返した。
　ＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞に対しても、ｆＭＬＰによりネクロプトーシスが誘導され、そのネクロプトーシスは、Ｎｅｃ－１によって抑制された（図１０）。
　本発明の医薬組成物は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患（例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症）を予防又は治療することができる。また、本発明のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物の有効成分をスクリーニングすることができる。本発明のネクロプトーシス誘導剤及びその有効成分のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを原因とする疾患の研究に用いることができ、それらの疾患の治療薬の開発に役立てることができる。
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims (17)

  1. 　ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を有効成分として含む、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
  2. 　前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
  5. 　ホルミルペプチド受容体１と結合し、ネクロプトーシスを誘導する物質を有効成分として含む、ネクロプトーシス誘導剤。
  6. 　前記誘導物質が、ｆＭＬＰである、請求項５に記載のネクロプトーシス誘導剤。
  7. 　ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる工程と、前記受容体又はその改変体と前記リガンド又はアゴニストとの結合に対する前記試験物質の阻害活性を検出する工程若しくはホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスに対する前記試験物質の誘導阻害活性を検出する工程、とを含む、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法。
  8. 　前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が、細胞に発現したものである、請求項７に記載のスクリーニング方法。
  9. （１）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と、試験物質とを接触させる工程、及び
    （２）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体によって誘導されるネクロプトーシスを検出する工程、
    を含むホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法。
  10. 　前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が、細胞に発現したものである、請求項９に記載のスクリーニング方法。
  11. 　前記ホルミルペプチド受容体１改変体が、
    （１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）～（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、
    である、請求項７～１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  12. 　前記細胞が、
    （１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（４）前記（１）～（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、
    のいずれかをコードするポリヌクレオチド、を含む請求項８又は１０に記載のスクリーニング方法。
  13. 　前記ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストが、ｆＭＬＰ若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ１若しくはその変異体であって、前記アネキシンＡ１変異体が
    （１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）～（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチドである、請求項７又は８に記載のスクリーニング方法。
  14. 　ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質の、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬の製造への使用。
  15. 　前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、請求項１４に記載の使用。
  16. 　前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、請求項１４又は１５に記載の使用。
  17. 　前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、請求項１４又は１５に記載の使用。
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