WO2014122058A1 - Method for colouring cell samples for microscopy - Google Patents

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WO2014122058A1
WO2014122058A1 PCT/EP2014/051761 EP2014051761W WO2014122058A1 WO 2014122058 A1 WO2014122058 A1 WO 2014122058A1 EP 2014051761 W EP2014051761 W EP 2014051761W WO 2014122058 A1 WO2014122058 A1 WO 2014122058A1
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WO
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staining
solution
cell sample
weight
cell
Prior art date
Application number
PCT/EP2014/051761
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German (de)
French (fr)
Inventor
Gabriela Altmann
Oliver Lade
Lance Anthony Ladic
Saskia Rausch
Original Assignee
Siemens Aktiengesellschaft
Siemens Healthcare Diagnostics Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Siemens Aktiengesellschaft, Siemens Healthcare Diagnostics Inc. filed Critical Siemens Aktiengesellschaft
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Definitions

  • the present invention relates to a method of staining cell samples for microscopy, an aqueous staining solution for use in the method, and the use of the staining aqueous solution for staining cell samples.
  • Staining methods for the staining of cell preparations have long been used in microscopy to visualize animal or plant cell and tissue constituents and to allow identification and differentiation of such tissues. Staining methods are widely used, among others, in histology, cytology and microbiology.
  • Hematoxylin-eosin staining is a standard staining technique for staining cell preparations for microscopy. It serves to differentiate different tissue structures in the microscopic picture by means of two different single stains and is one of the most common routine staining methods for morphological examinations. With the aid of HE staining, pathological changes in biopsies and surgical specimens can be examined.
  • the HE stain plays u.a. in the diagnosis of early detection of cancer, for example, for the early detection of oral carcinoma or cervical cancer.
  • HE staining the cell samples are first stained with hematoxylin after fixation on a slide (Ii staining). Hematoxylin stains all of the acidic or ba ⁇ sophilen structures blue, particular nuclei with the DAR deoxyribonucleic acid contained in (DNA) and the somen enriched ribo- rough endoplasmic reticulum (RER). After H staining, the nuclei initially appear reddish brown due to the low pH of the staining solution. By increasing the pH, the hue turns into the typical blue violet (blueing); this is effected by means of flushing in freshwater ⁇ ser with neutral pH, for example, tap water.
  • E staining eosin staining
  • Eosin stains all acidophilic or basic (eosinophilic) structures red, which mainly includes the cytoplasmic proteins.
  • Eosin G also called Eosin Y
  • Eosin B is used.
  • a standard protocol for performing HE staining involves the following steps:
  • hematoxylin staining for example, acid hematoxylin according to Ehrlich or acidic hemalaun according to Mayer is used.
  • the staining solution contains: hematoxylin, Natriumj odat, potash alum ⁇ , chloral hydrate, hydrochloric acid, 0.1% strength ammonia solution, sodium bicarbonate and citric acid.
  • the staining solution contains: hematoxylin, isopropanol 96%, glycerol, potassium alum, acetic acid, sodium iodate, sodium bicarbonate and ammonia solution
  • the eosin solution is prepared by dissolving Eosin G or B in distilled or demineralized water.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for staining cell samples, by which cell samples can be stained quickly and without the use of hazardous or health-endangering substances.
  • the object is achieved by a method for staining cell samples according to claim 1 and the use of a dyeing solution according to claim 12.
  • the method according to the invention for staining cell samples for microscopy comprises the following steps:
  • the staining solution invention comprises hematoxylin, sodium umjodat, potassium aluminum sulfate dodecahydrate and Zitronen Text ⁇ re.
  • the staining solution contains no chloral hydrate.
  • the inventors of the present invention were able to show that using the method according to the invention, the stained ⁇ cell samples surprisingly even without additional dewatering and fixation steps, after the second Entfär ⁇ tion step, over a longer period
  • a dye solution could be provided that does not require the addition of health-hazardous chloral hydrate and, surprisingly, a dyeing entspre ⁇ accordingly comprises the processes known from the prior art, staining solutions, and is stable over a longer period, and as can be ⁇ derver Listet.
  • the method according to the invention minimizes expenditure, time and risk potential as well as the need for technical and personal protective equipment.
  • the process poses no disposal problems because no hazardous ingredients are used. It is therefore also applicable to less well trained medical personnel.
  • the method according to the invention comprises a plurality of method steps whose advantageous embodiments are described below with reference to the attached FIGURE.
  • step Sl (a) applying the cell sample to a substrate
  • a carrier material ⁇ As support material any comes for microscopy suitable carrier material in Be ⁇ costume.
  • a transparent carrier material is ver ⁇ turns.
  • a slide is used as the carrier material.
  • any slide as it is familiar to those skilled in microscopy can be used.
  • Slide can be made of any material, preferably it consists of a plastic or glass, more preferably glass.
  • a cell sample any cell sample can be used. It may be a bacterial, plant, animal or human cell sample, preferably a human cell sample. Preferably, it is a cell sample of the oral mucus ⁇ skin, the mucous membrane of the cervix uteri, or the mucosa of vulva, more preferably a sample of the oral mucus ⁇ skin, in particular squamous the oral mucosa.
  • the cell sample contains carcinoma cells.
  • the cell sample can be obtained by any method known to those skilled in the art, preferably by brush biopsy.
  • the cell sample is applied to the substrate by, for example, painting the sample on the substrate.
  • the fixation of the cell sample on the carrier material is carried out by drying the cell sample.
  • the duration of the drying is preferably 0.5 to 10 minutes, particularly preferably 1 to 5 minutes, very particularly preferably 1.5 to 2.5 minutes, in particular 2 minutes.
  • the drying is preferably carried out at a temperature of 10 ° C - 30 ° C, more preferably 15 ° C - 25 ° C, most preferably 22 ° C.
  • An additional fixation of the cells toomme ⁇ sponding preferably takes place on the slide using commercially available fixing solutions.
  • An alcoholic Fixierlö ⁇ solution is preferably used, particularly preferably a fixing solution contained ⁇ th ethanol.
  • the fixation can be done using 1-2 spray sizes of Merckofix® fixation spray from Merck, Darmstadt, Germany.
  • step (b) staining the cell sample by means of a first staining solution;
  • step (Sl) to the carrier material applied ⁇ cell sample is then stained in step 2 by means of a first staining solution.
  • any commercial dyeing solution known to those skilled in the art may be used to stain cells.
  • An aqueous solution is preferably used containing toxylin hematoma, as commonly used by those skilled in the HE staining and is ⁇ be written in the art, more preferably the hematoxylin solution contains no chloral hydrate, is especially preferred according to the invention an aqueous Dyeing solution as disclosed in the present specification.
  • the dyeing is preferably carried out by dipping the carrier into the object ⁇ staining solution.
  • the slide is 0.2 - 5 min, particularly ⁇ vorzugt be 0.5 - 2.5 min, most preferably 0.75 - 2 minutes, in particular 1 min dipped into the first dye solution.
  • step S3 After staining the cell sample by means of a first staining solution, in step S3, a first decolorization of the im
  • Step S2 stained cells.
  • the decolorization takes place by means of water, preferably not by rinsing with running water, more preferably by immersing the support material in a vessel with water.
  • any fresh water can be used with a pH in the neutral range, preferably water is ⁇ used. If the deinking by means of water is not sufficient, can be decolored with an aqueous sodium hydrogen carbonate bicarbonate solution ⁇ optional.
  • aqueous solution of sodium hydrogencarbonate a solution of sodium hydrogen carbonate in water is used, preferably a solution with 0.01 - 1% by weight sodium bicarbonate, preferably 0.05 Sonders be ⁇ -.. 0.5% by weight, very particularly before ⁇ Trains t 0.075 - 0.25% by weight, in particular with 0.1% by weight
  • the decolorization preferably takes place over a period of 1 second (sec) - 5 min, more preferably 10 sec - 2.5 min, very particularly preferably 20 sec - 1 min, in particular 30 sec.
  • step S3 cell sample is stained at step S4 with ⁇ means of a second staining solution.
  • ⁇ means of a second staining solution.
  • any commercial dyeing solution known to the person skilled in the art can be used for staining cells.
  • a ⁇ membered aq solution preferably containing eosin used as commonly used by those skilled in the HE staining, particularly forthcoming yakt an eosin solution containing 0.05 - 1 g eosin, very particularly ⁇ preferred 0.1 - 0.5 g eosin, in particular 0.3 g eosin in 100 ml of water.
  • Eosin G also called Eosin Y
  • Eosin B is used, preferably Eosin G.
  • distilled or demineralized water is used for the eosin solution.
  • Glycerol may preferably be added to the eosin solution, more preferably 1 to 25 ml of water per 100 ml of water are replaced by glycerol, very particularly preferably 5 to 20 ml, in particular 10 to 15 ml, particularly preferably 13 ml.
  • the eosin solution is preferably added per 100 ml total volume 0.01-1 g of sodium chloride, more preferably 0.05-0.5 g, most preferably 0.1 g.
  • the dyeing is preferably carried out by dipping the carrier in the second object ⁇ staining solution.
  • the slide is 0.2 - 5 min, particularly ⁇ vorzugt be 0.5 - 2.5 min, most preferably 0.75 - 2 minutes, in particular 1 min immersed in the second dye solution.
  • step S5 After staining the cell sample in step (S4) by means of a second staining solution, a second decolorization of the cell sample takes place in step S5.
  • the decolorization takes place by means of water, preferably not by rinsing with running water, more preferably by immersing the support material in a vessel with water.
  • any fresh water having a pH in the neutral range may be used, but tap water is preferably used.
  • the decolorization is preferably carried out over a period of 1 second to 5 minutes, particularly preferably 10 seconds to 2.5 minutes, very particularly preferably 20 seconds to 1 minute, in particular 30 seconds.
  • decolorizing 100 - 2000 ml of water verwen- det particularly preferably 200 - 1000 ml, especially before Trains t ⁇ 250-750 ml, in particular 500 ml.
  • step S3 water For decolorizing the ver ⁇ applied already in step S3 water can be used again.
  • the inventive method comprises, after Ver ⁇ method step S5 no fixation and dehydration steps with alcoholic solutions, particularly preferably, the he ⁇ invention process according to the process step S5 no fixation and dehydration steps, especially before ⁇ Trains t, the method according to the invention by the procedural ⁇ rens intimid on S5 no further steps more and ends.
  • the drive by the inventive Ver ⁇ stained cell samples are rungs- without additional drainage and fixing steps, stable over a longer period.
  • the cells remain stable even at higher temperatures around 40 ° C over a period of over two weeks.
  • the staining solution invention comprises hematoxylin, sodium umjodat, potassium aluminum sulfate dodecahydrate and Zitronen Text ⁇ re.
  • the staining solution according to the invention contains no chloral hydrate.
  • the staining solution preferably contains no further components than hematoxylin, sodium iodate, potassium aluminum sulfate dodecahydrate and citric acid.
  • the dyeing solution according to the invention is preferably prepared by dissolving the components in water, more preferably in distilled or demineralized water.
  • Hematoxylin is preferred in an amount of 0.01-10
  • % More preferably 0.01 - 5 wt.%, In particular 0.02 -. 2% by weight, particularly preferably 0.03 -. 1% by weight, particularly preferably 0.05 insbesonde ⁇ re -. 0.5 wt. %, in particular 0.1% by weight, in each case based on the total weight of the dyeing solution used.
  • Sodium iodate is preferably used in an amount of 0.001-2% by weight, more preferably 0.005-1.5% by weight, in particular 0.01-1% by weight, particularly preferably 0.015-0.5% by weight, particularly particularly preferably 0.018 0.1% by weight, in particular 0.02% by weight, based in each case on the total weight of the dyeing solution.
  • Potassium aluminum sulfate dodecahydrate is preferably used in an amount of 0.1-20% by weight, more preferably 1-10% by weight, in particular 2-8% by weight, particularly preferably 3-7% by weight, in particular particularly 4-6 % By weight, in particular 5% by weight, in each case based on the total weight of the dyeing solution.
  • Citric acid is preferably used in an amount of 0.01-5% by weight, more preferably 0.05-2.5% by weight, in particular 0.075-1% by weight, particularly preferably 0.08-0.5% by weight, in particular, particularly preferably 0.1% by weight, based in each case on the total weight of the dyeing solution.
  • the staining solution according to the invention can be used for staining of cell samples, for example for the diagnosis of carcinoma cells Kar ⁇ .
  • the staining solution according to the invention is preferably used in the process OF INVENTION ⁇ to the invention, particularly preferred as the first dye solution.
  • the coloring solution according to the invention surprisingly achieved even without the addition of chloral hydrate a coloring power according to the known prior art solutions Rheinlö ⁇ and is stable over a long period of time and can be reused.
  • Squamous cell epithelial cells obtained by brush biopsy were applied to a glass slide.
  • the cells were dried by drying the cells on the slide for 2 min at room temperature (20 ° C).
  • a hematoxylin (H) staining was Immersing the slide for 1 minute in 300 ml of the use solution ⁇ carried out according to Example. 1
  • the staining solution was placed in a dyeing trough (PMP) from Th. Geyer Gmbh, Renningen, Germany (measuring 80 mm ⁇ 100 mm ⁇ 70 mm (width ⁇ length ⁇ height).)
  • the slide was stained by means of a staining rack made by Th. Geyer Gmbh, with horizontal bottom for 20 slides, immersed in the solution.
  • an eosin (E) staining by immersing the slide for 1 minute in 300 ml of the eosin solution was carried out ge ⁇ Telss Example 2.
  • the staining solution was placed in a staining dish (PMP) the company Th. Geyer Gmbh, Germany (with dimensions of 80 mm x 100 mm x 70 mm (width x length x height) placed in front ⁇ .
  • the slide was by means of an accessory staining of Th. Geyer Gmbh, with horizontal bottom for 20 slides, immersed in the solution.
  • the comparison of the staining solution according to the invention according to Example 1 with hematoxylin-staining solutions of the prior art shows that the staining solution according to the invention comprises a dyeing ⁇ power according to the processes known from the prior art dyeing solutions and is stable over a long period of time and can be reused.
  • the comparison of the cell sample stained in Example 3 by means of the method according to the invention with a cell sample stained by a method according to the prior art shows that the method according to the invention significantly reduces the time required and the number of method steps, and nevertheless leads to stained cell samples. which are stable over a longer period.

Abstract

The invention relates to a method for colouring cell samples for microscopy, comprising several steps, namely applying (S1) the cell sample to a support material; colouring (S2) the cell sample by means of a first colouring solution; first decolouring (S3) the cell sample; colouring (S4) the cell sample by means of a second colouring solution; and second decolouring (S5) the cell sample.

Description

Beschreibung description
Verfahren zum Anfärben von Zellproben für die Mikroskopie Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anfärben von Zellproben für die Mikroskopie, eine wässrige Färbelösung zur Verwendung in dem Verfahren, sowie die Verwendung der wässrigen Färbelösung zum Anfärben von Zellproben. Färbemethoden für die Anfärbung von Zellpräparaten werden seit Langem in der Mikroskopie eingesetzt, um tierische oder pflanzliche Zell- und Gewebebestandteile sichtbar zu machen und eine Identifizierung und Differenzierung derartiger Gewebe zu ermöglichen. Färbemethoden finden weite Verbreitung un- ter anderem, in der Histologie, Zytologie und Mikrobiologie. The present invention relates to a method of staining cell samples for microscopy, an aqueous staining solution for use in the method, and the use of the staining aqueous solution for staining cell samples. Staining methods for the staining of cell preparations have long been used in microscopy to visualize animal or plant cell and tissue constituents and to allow identification and differentiation of such tissues. Staining methods are widely used, among others, in histology, cytology and microbiology.
Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) ist eine Standardfärbemethode für die Anfärbung von Zellpräparaten für die Mikroskopie. Sie dient der Unterscheidung verschiedener Gewe- bestrukturen im mikroskopischen Bild anhand von zwei verschiedenen Einzelfärbungen und ist eine der am weitesten verbreiteten Routinefärbemethoden für morphologische Untersuchungen. Mit Hilfe der HE-Färbung können krankhafte Veränderungen in Biopsien und Operationspräparaten untersucht wer- den. Hematoxylin-eosin staining (HE staining) is a standard staining technique for staining cell preparations for microscopy. It serves to differentiate different tissue structures in the microscopic picture by means of two different single stains and is one of the most common routine staining methods for morphological examinations. With the aid of HE staining, pathological changes in biopsies and surgical specimens can be examined.
Die HE-Färbung spielt u.a. in der Diagnostik zur Krebsfrüherkennung eine wichtige Rolle, beispielsweise zur Früherkennung von Mundhöhlenkarzinomen oder Zervixkarzinomen . The HE stain plays u.a. in the diagnosis of early detection of cancer, for example, for the early detection of oral carcinoma or cervical cancer.
Bei der HE-Färbung werden die Zellproben nach Fixierung auf einem Objektträger zunächst mit Hämatoxylin gefärbt (Ii- Färbung) . Hämatoxylin färbt alle sauren beziehungsweise ba¬ sophilen Strukturen blau, insbesondere Zellkerne mit der dar- in enthaltenen Desoxyribonukleinsäure (DNA) und das mit Ribo- somen angereicherte raue endoplasmatische Retikulum (rER) . Nach der H-Färbung erscheinen die Zellkerne zunächst rötlichbraun aufgrund des niedrigen pH-Wertes der Färbelösung. Durch Erhöhung des pH-Wertes schlägt der Farbton in das typische Blauviolett um (Bläuen) ; dies wird mittels Spülen in Süßwas¬ ser mit neutralem pH-Wert z.B. Leitungswasser bewirkt. In HE staining, the cell samples are first stained with hematoxylin after fixation on a slide (Ii staining). Hematoxylin stains all of the acidic or ba ¬ sophilen structures blue, particular nuclei with the DAR deoxyribonucleic acid contained in (DNA) and the somen enriched ribo- rough endoplasmic reticulum (RER). After H staining, the nuclei initially appear reddish brown due to the low pH of the staining solution. By increasing the pH, the hue turns into the typical blue violet (blueing); this is effected by means of flushing in freshwater ¬ ser with neutral pH, for example, tap water.
Anschließend folgt die Eosin-Färbung (E-Färbung) mit einer Eosin-Lösung. Eosin färbt alle acidophilen beziehungsweise basischen (eosinophilen) Strukturen rot, was vor allem die Zellplasmaproteine umfasst. Es wird Eosin G (auch als Eosin Y bezeichnet) oder Eosin B verwendet. This is followed by eosin staining (E staining) with an eosin solution. Eosin stains all acidophilic or basic (eosinophilic) structures red, which mainly includes the cytoplasmic proteins. Eosin G (also called Eosin Y) or Eosin B is used.
Durch weitere Spülschritte über Alkohollösungen in aufstei¬ gender Konzentration bis zu absolutem Alkohol wird das Wasser aus dem Gewebeschnitt verdrängt. Schließlich wird der entwäs¬ serte Schnitt in einem organischen Lösungsmittel wie bei¬ spielsweise Xylol geklärt. By further rinsing steps over alcohol solutions in aufstei ¬ gender concentration up to absolute alcohol, the water is displaced from the tissue section. Finally, the entwäs ¬ serte section is clarified in an organic solvent such as xylene at ¬ game.
Ein Standardprotokoll zur Durchführung der HE-Färbung umfasst folgende Schritte: A standard protocol for performing HE staining involves the following steps:
(1) Fixierung der zu untersuchenden Zellen auf dem Objektträger mittels 1-2 Spraystöße eines alkoholischen Fixiersprays (1) Fixation of the cells to be examined on the slide by means of 1-2 sprays of an alcoholic fixative spray
(2) Hämatoxylin-Färbung (H-Färbung) 1-2 min  (2) Hematoxylin staining (H staining) 1-2 min
(3) Entfärbung 3 min, unter laufenden warmen Wasser  (3) discoloring for 3 min, under running warm water
(4) Entfärbung 2 min, unter laufenden kalten Wasser  (4) decolorization 2 min, under running cold water
(5) Entfärbung 1 min, mit destilliertem oder demineralisier- tem Wasser  (5) Decolorization for 1 min, with distilled or demineralized water
(6) Eosin-Färbung (E-Färbung) 2-3 min  (6) Eosin staining (E staining) 2-3 min
(7) Entwässerung / Fixierung mit 70 % Ethanol  (7) drainage / fixation with 70% ethanol
(8) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 90 % Ethanol  (8) Drainage / fixation for 3 minutes with 90% ethanol
(9) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 96 % Ethanol  (9) Drainage / fixation for 3 minutes with 96% ethanol
(10) Entwässerung / Fixierung 2 mal 5 min mit 100 % Ethanol (10) drainage / fixation 2 times 5 min with 100% ethanol
(11) Entwässerung / Fixierung 2 mal 10 min mit 100% Xylol Die Gesamtdauer des Verfahrens liegt bei über 45 min und bei der Entfärbung unter laufendem Wasser in Schritt (3) und (4) werden 3 bis 12 Liter Wasser verwendet. Im Stand der Technik sind verschiedene Färbelösungen zur Anwendung bei der HE-Färbung bekannt. (11) drainage / fixation 2 times 10 min. With 100% xylene The total duration of the process is over 45 minutes and in the decolorization under running water in step (3) and (4) 3 to 12 liters of water are used. The prior art discloses various staining solutions for use in HE staining.
So sind aus Godwin Avwioro, „Histochemical uses of haematoxy- lin - a review", JPCS Vol (1), 2011; und dem Standardverfah- ren (SOP „Standard operating procedure") Rüegg und Meinen,Godwin Avwioro, "Histochemical uses of haematoxylin-a review", JPCS Vol (1), 2011, and the Standard Operating Procedure (SOP), Rüegg and Meinen,
„Histopathology in Hematoxylin & Eosin stained muscle secti- ons", SOP_ID: MDC1A_M.1.2.004, in TREAT-NMD / CURE CMD veröffentlicht, HE-Färbelösungen und -verfahren bekannt. Hämatoxylin-Färbung "Histopathology in Hematoxylin & Eosin Stained Muscle Sections", SOP_ID: MDC1A_M.1.2.004, published in TREAT-NMD / CURE CMD, known for HE staining solutions and methods Hematoxylin staining
Zur Hämatoxylin-Färbung wird beispielsweise saures Hämatoxy- lin nach Ehrlich oder saures Hämalaun nach Mayer verwendet.  For hematoxylin staining, for example, acid hematoxylin according to Ehrlich or acidic hemalaun according to Mayer is used.
Hämalaun nach Mayer: Hämalaun to Mayer:
Die Färbelösung enthält: Hämatoxylin, Natriumj odat , Kali¬ alaun, Chloralhydrat , Salzsäure 0.1 %ig, Ammoniaklösung, Natriumhydrogencarbonat und Zitronensäure. The staining solution contains: hematoxylin, Natriumj odat, potash alum ¬, chloral hydrate, hydrochloric acid, 0.1% strength ammonia solution, sodium bicarbonate and citric acid.
Hämatoxylin nach Ehrlich: Hematoxylin according to Ehrlich:
Die Färbelösung enthält: Hämatoxylin, Isopropanol 96%ig, Gly- cerin, Kalialaun, Essigsäure, Natriumj odat , Natriumhydrogencarbonat und Ammoniaklösung The staining solution contains: hematoxylin, isopropanol 96%, glycerol, potassium alum, acetic acid, sodium iodate, sodium bicarbonate and ammonia solution
Eosinfärbung eosin staining
Eosinlösung: eosin:
Die Eosin-Lösung wird durch Lösen von Eosin G oder B in destilliertem oder demineralisiertem Wasser hergestellt.  The eosin solution is prepared by dissolving Eosin G or B in distilled or demineralized water.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Färbeprotokolle haben den Nachteil, dass sie Färbelösungen nutzen, die gifti- ge/gesundheitsgefährdende Stoffe enthalten und mehrere Fi¬ xier- und Entwässerungsschritte mit giftigen und brennbaren Alkoholen aufweisen. Durch die vielen verschiedenen durchzu- führenden Schritte sind diese Protokolle zeitlich aufwendig und komplex. Außerdem besteht bei der Durchführung der Färbung a) ein Gesundheitsrisiko für das medizinische Personal durch die verwendeten gesundheitsgefährdenden Lösungen und b) ein Bedarf für geeignete technische und persönliche Schutz¬ vorkehrungen (z.B. Abzug, Chemikalienlager, Schutzkleidung, Handschuhe, Schutzbrille) . The processes known from the prior art staining protocols have the drawback that they use dyeing solutions containing of toxic ge / hazardous substances and have a plurality of Fi ¬ xier- and drainage steps of toxic and flammable alcohols. Due to the many different leading these protocols are time consuming and complex. Furthermore, with the implementation of staining a) a health hazard to medical staff by the used hazardous solutions and b) a need for appropriate technical and personal protective ¬ precautions (eg hood, chemical storage, protective clothing, gloves, goggles).
Um die Nutzung mikroskopischer Diagnostikverfahren, z.B. zur Krebsfrüherkennung, auch für weniger gut geschultes medizinisches Personal in einer schlecht ausgestatteten Umgebung, beispielsweise in entlegenen Gebieten, die über eine schlechte medizinische Infrastruktur verfügen, nutzbar zu machen, sind einfache Protokolle notwendig, die durch Vermeidung ge- fährlicher Chemikalien ein geringes Gefährdungspotential für die Anwender besitzen, keine Entsorgungsprobleme auslösen und darüber hinaus weniger zeitaufwendig und komplex sind. To facilitate the use of microscopic diagnostic procedures, e.g. For cancer screening, even for less well-trained medical staff in a poorly equipped environment, for example in remote areas that have a poor medical infrastructure, harnessing simple protocols is necessary, which, by avoiding hazardous chemicals, poses little threat to the health of the population Users have no disposal problems and are also less time-consuming and complex.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zum Anfärben von Zellproben zu Verfügung zu stellen, durch das Zellproben schnell und ohne Verwendung von gefährlichen oder gesundheitsgefährdeten Stoffen angefärbt werden können . The object of the present invention is therefore to provide a method for staining cell samples, by which cell samples can be stained quickly and without the use of hazardous or health-endangering substances.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Anfärben von Zellproben gemäß Patentanspruch 1 und die Verwendung einer Färbe lösung gemäß Patentanspruch 12 gelöst. The object is achieved by a method for staining cell samples according to claim 1 and the use of a dyeing solution according to claim 12.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Anfärben von Zellproben für die Mikroskopie umfasst die folgenden Schritte: The method according to the invention for staining cell samples for microscopy comprises the following steps:
(a) Aufbringen der Zellprobe auf ein Trägermaterial(a) applying the cell sample to a substrate
(b) Färben der Zellprobe mittels einer ersten Färbelö¬ sung; (b) staining of the cell sample by means of a first Färbelö ¬ solution;
(c) Entfärben der Zellprobe;  (c) decolorizing the cell sample;
(d) Färben der Zellprobe mittels einer zweiten Färbelö¬ sung; und (d) dyeing the cell sample by means of a second Färbelö ¬ solution; and
(e) Entfärben der Zellprobe; wobei das Verfahren nach dem Verfahrensschritt (e) keine Fi¬ xier- und Entwässerungsschritte mit alkoholischen Lösungen aufweist . Die erfindungsgemäße Färbelösung enthält Hämatoxylin, Natri- umjodat, Kaliumaluminiumsulfat-dodecahydrat und Zitronensäu¬ re. Die Färbelösung enthält kein Chloralhydrat . (e) decolorizing the cell sample; wherein the method after the method step (e) has no Fi ¬ xier- and dehydration steps with alcoholic solutions. The staining solution invention comprises hematoxylin, sodium umjodat, potassium aluminum sulfate dodecahydrate and Zitronensäu ¬ re. The staining solution contains no chloral hydrate.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung konnten zeigen, dass bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die angefärb¬ ten Zellproben überraschenderweise auch ohne zusätzliche Ent- wässerungs- und Fixierungsschritte, nach dem zweiten Entfär¬ bungsschritt, über einen längeren Zeitraum The inventors of the present invention were able to show that using the method according to the invention, the stained ¬ cell samples surprisingly even without additional dewatering and fixation steps, after the second Entfär ¬ tion step, over a longer period
stabil bleiben. to stay stable.
Darüber hinaus konnte eine Färbelösung bereitgestellt werden, die ohne den Zusatz von gesundheitsgefährlichem Chloralhydrat auskommt und überraschenderweise eine Färbeleistung entspre¬ chend den aus dem Stand der Technik bekannten Färbelösungen aufweist und über einen längeren Zeitraum stabil ist und wie¬ derverwendet werden kann. Furthermore, a dye solution could be provided that does not require the addition of health-hazardous chloral hydrate and, surprisingly, a dyeing entspre ¬ accordingly comprises the processes known from the prior art, staining solutions, and is stable over a longer period, and as can be ¬ derverwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren minimiert Aufwand, Zeit und Gefährdungspotential sowie den Bedarf an technischer und per- sönlicher Schutzausrüstung. Außerdem bereitet das Verfahren keine Entsorgungsprobleme, da keine gesundheitsgefährdenden Inhaltsstoffe verwendet werden. Es ist daher auch von weniger gut geschultem medizinischen Personal anwendbar. Erfindungsgemäßes Verfahren The method according to the invention minimizes expenditure, time and risk potential as well as the need for technical and personal protective equipment. In addition, the process poses no disposal problems because no hazardous ingredients are used. It is therefore also applicable to less well trained medical personnel. Inventive method
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst mehrere Verfahrens¬ schritte deren vorteilhafte Ausgestaltungen im Folgenden in Bezug auf die beigefügte Figur beschrieben sind. The method according to the invention comprises a plurality of method steps whose advantageous embodiments are described below with reference to the attached FIGURE.
(a) Aufbringen der Zellprobe auf ein Trägermaterial Zunächst wird die zu untersuchende Zellprobe auf ein Träger¬ material im Schritt Sl aufgebracht. Als Trägermaterial kommt jegliches für die Mikroskopie geeignete Trägermaterial in Be¬ tracht. Dem Fachmann sind derartige Trägermaterialen geläu- fig. Vorzugsweise wird ein transparentes Trägermaterial ver¬ wendet . (a) applying the cell sample to a substrate First, the cell sample to be examined is applied to a carrier material ¬ in step Sl. As support material any comes for microscopy suitable carrier material in Be ¬ costume. The person skilled in the art is familiar with such carrier materials. Preferably, a transparent carrier material is ver ¬ turns.
Bevorzugt wird als Trägermaterial ein Objektträger verwendet. Als Objektträger kann ein beliebiger Objektträger wie er dem Fachmann zur Mikroskopie geläufig ist verwendet werden. DerPreferably, a slide is used as the carrier material. As a slide any slide as it is familiar to those skilled in microscopy can be used. Of the
Objektträger kann aus einem beliebigen Material bestehen, bevorzugt besteht er aus einem Kunststoff oder Glas, besonders bevorzugt aus Glas. Als Zellprobe kann jede beliebige Zellprobe verwendet werden. Es kann sich um eine bakterielle, pflanzliche, tierische oder humane Zellprobe handeln, bevorzugt um eine humane Zellprobe. Bevorzugt handelt es sich um eine Zellprobe der Mundschleim¬ haut, der Schleimhaut der Cervix uteri oder der Schleimhaut der Vulva, besonders bevorzugt um eine Probe der Mundschleim¬ haut, insbesondere der Plattenepithelzellen der Mundschleimhaut . Slide can be made of any material, preferably it consists of a plastic or glass, more preferably glass. As a cell sample any cell sample can be used. It may be a bacterial, plant, animal or human cell sample, preferably a human cell sample. Preferably, it is a cell sample of the oral mucus ¬ skin, the mucous membrane of the cervix uteri, or the mucosa of vulva, more preferably a sample of the oral mucus ¬ skin, in particular squamous the oral mucosa.
Bevorzugt enthält die Zellprobe Karzinomzellen. Preferably, the cell sample contains carcinoma cells.
Die Zellprobe kann mit jedem dem Fachmann geläufigen Verfahren gewonnen werden, bevorzugt mittels Bürstenbiopsie . The cell sample can be obtained by any method known to those skilled in the art, preferably by brush biopsy.
Die Zellprobe wird beispielsweise durch Abstreichen der Probe auf dem Trägermaterial auf dieses aufgebracht. The cell sample is applied to the substrate by, for example, painting the sample on the substrate.
Die Fixierung der Zellprobe auf dem Trägermaterial erfolgt durch Trocknen der Zellprobe. Die Dauer der Trocknung beträgt vorzugsweise 0,5 - 10 min, besonders bevorzugt 1 - 5 min, ganz besonders bevorzugt 1,5 - 2,5 min, insbesondere 2 min. Die Trocknung erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 10 °C - 30°C, besonders bevorzugt 15 °C - 25 °C, ganz besonders bevorzugt 22°C. Bevorzugt erfolgt eine zusätzliche Fixierung der zu untersu¬ chenden Zellen auf dem Objektträger mittels handelsüblicher Fixierlösungen. Bevorzugt wird eine alkoholische Fixierlö¬ sung verwendet, besonders bevorzugt eine Fixierlösung enthal¬ ten Ethanol. Beispielsweise kann die Fixierung mittels 1-2 Spraystößen des Merckofix® Fixationssprays der Firma Merck, Darmstadt, Deutschland erfolgen. The fixation of the cell sample on the carrier material is carried out by drying the cell sample. The duration of the drying is preferably 0.5 to 10 minutes, particularly preferably 1 to 5 minutes, very particularly preferably 1.5 to 2.5 minutes, in particular 2 minutes. The drying is preferably carried out at a temperature of 10 ° C - 30 ° C, more preferably 15 ° C - 25 ° C, most preferably 22 ° C. An additional fixation of the cells to investi ¬ sponding preferably takes place on the slide using commercially available fixing solutions. An alcoholic Fixierlö ¬ solution is preferably used, particularly preferably a fixing solution contained ¬ th ethanol. For example, the fixation can be done using 1-2 spray sizes of Merckofix® fixation spray from Merck, Darmstadt, Germany.
(b) Färben der Zellprobe mittels einer ersten Färbelösung; Die in Schritt (Sl) auf dem Trägermaterial aufgebrachte Zell¬ probe wird nun im Schritt 2 mittels einer ersten Färbelösung angefärbt. Zum Färben kann jede dem Fachmann bekannte, handelsübliche Färbelösung zum Anfärben von Zellen verwendet werden. Bevorzugt wird eine wässrige Lösung enthaltend Häma- toxylin verwendet, wie sie der Fachmann bei der HE-Färbung üblicherweise verwendet und sie im Stand der Technik be¬ schrieben ist, besonders bevorzugt enthält die Hämatoxylin- Lösung kein Chloralhydrat , ganz besonders bevorzugt wird eine erfindungsgemäße wässrige Färbelösung verwendet, wie sie in der vorliegenden Beschreibung offenbart ist. (b) staining the cell sample by means of a first staining solution; In step (Sl) to the carrier material applied ¬ cell sample is then stained in step 2 by means of a first staining solution. For dyeing, any commercial dyeing solution known to those skilled in the art may be used to stain cells. An aqueous solution is preferably used containing toxylin hematoma, as commonly used by those skilled in the HE staining and is ¬ be written in the art, more preferably the hematoxylin solution contains no chloral hydrate, is especially preferred according to the invention an aqueous Dyeing solution as disclosed in the present specification.
Die Färbung erfolgt vorzugsweise durch Eintauchen des Objekt¬ trägers in die Färbelösung. Vorzugsweise wird der Objektträger 0,2 - 5 min, besonders be¬ vorzugt 0,5 - 2,5 min, ganz besonders bevorzugt 0,75 - 2 min, insbesondere 1 min in die erste Färbelösung eingetaucht. The dyeing is preferably carried out by dipping the carrier into the object ¬ staining solution. Preferably, the slide is 0.2 - 5 min, particularly ¬ vorzugt be 0.5 - 2.5 min, most preferably 0.75 - 2 minutes, in particular 1 min dipped into the first dye solution.
(c) Erstes Entfärben der Zellprobe (c) First decolorization of the cell sample
Nach dem Färben der Zellprobe mittels einer ersten Färbelösung erfolgt im Schritt S3 ein erstes Entfärben der im After staining the cell sample by means of a first staining solution, in step S3, a first decolorization of the im
Schritt S2 angefärbten Zellen. Das Entfärben erfolgt mittels Wasser, bevorzugt nicht durch das Spülen mit fließendem Wasser, besonders bevorzugt durch Eintauchen des Trägermaterials in ein Gefäß mit Wasser. Step S2 stained cells. The decolorization takes place by means of water, preferably not by rinsing with running water, more preferably by immersing the support material in a vessel with water.
Zum Entfärben kann jegliches Süsswasser mit einem pH-Wert im neutralen Bereich verwendet werden, bevorzugt wird Leitungs¬ wasser verwendet. Sollte das Entfärben mittels Wasser nicht ausreichend sein, kann optional auch mit einer wässrigen Natriumhydrogencarbo¬ natlösung entfärbt werden. For decolorizing any fresh water can be used with a pH in the neutral range, preferably water is ¬ used. If the deinking by means of water is not sufficient, can be decolored with an aqueous sodium hydrogen carbonate bicarbonate solution ¬ optional.
Als wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung wird eine Lösung von Natriumhydrogencarbonat in Wasser verwendet, bevorzugt eine Lösung mit 0,01 - 1 Gew.% Natriumhydrogencarbonat, be¬ sonders bevorzugt mit 0,05 - 0,5 Gew.%, ganz besonders bevor¬ zugt mit 0,075 - 0,25 Gew.%, insbesondere mit 0,1 Gew.% As the aqueous solution of sodium hydrogencarbonate, a solution of sodium hydrogen carbonate in water is used, preferably a solution with 0.01 - 1% by weight sodium bicarbonate, preferably 0.05 Sonders be ¬ -.. 0.5% by weight, very particularly before ¬ Trains t 0.075 - 0.25% by weight, in particular with 0.1% by weight
Natriumhydrogencarbonat, bezogen auf das Gesamtgewicht der Natriumhydrogencarbonatlösung . Sodium hydrogencarbonate, based on the total weight of the sodium bicarbonate solution.
Vorzugsweise erfolgt das Entfärben über einen Zeitraum von 1 Sekunde (sec.) - 5 min, besonders bevorzugt 10 sec. - 2,5 min., ganz besonders bevorzugt 20 sec. - 1 min., insbesondere 30 sec. The decolorization preferably takes place over a period of 1 second (sec) - 5 min, more preferably 10 sec - 2.5 min, very particularly preferably 20 sec - 1 min, in particular 30 sec.
Bevorzugt werden zum Entfärben 100 - 2000 ml Wasser verwendet, besonders bevorzugt 200 - 1000 ml, ganz besonders bevor¬ zugt 250 - 750 ml, insbesondere 500 ml. Are preferred for decolorizing 100 - used 2000 ml of water, more preferably 200 - 1000 ml, especially before Trains t ¬ 250-750 ml, in particular 500 ml.
(d) Färben der Zellprobe mittels einer zweiten Färbelösung (D) staining the cell sample by means of a second staining solution
Die in Schritt S3 entfärbte Zellprobe wird im Schritt S4 mit¬ tels einer zweiten Färbelösung angefärbt. Zum Färben kann je- de dem Fachmann bekannte, handelsübliche Färbelösung zum Anfärben von Zellen verwendet werden. Bevorzugt wird eine wäss¬ rige Lösung enthaltend Eosin verwendet, wie sie der Fachmann bei der HE-Färbung üblicherweise verwendet, besonders bevor- zugt eine Eosin-Lösung enthaltend 0.05 - 1 g Eosin, ganz be¬ sonders bevorzugt 0.1 - 0.5 g Eosin, insbesondere 0.3 g Eosin in 100 ml Wasser. Es wird Eosin G (auch als Eosin Y bezeichnet) oder Eosin B verwendet, bevorzugt Eosin G. The decolorized in step S3 cell sample is stained at step S4 with ¬ means of a second staining solution. For dyeing, any commercial dyeing solution known to the person skilled in the art can be used for staining cells. A ¬ membered aq solution preferably containing eosin used as commonly used by those skilled in the HE staining, particularly forthcoming zugt an eosin solution containing 0.05 - 1 g eosin, very particularly ¬ preferred 0.1 - 0.5 g eosin, in particular 0.3 g eosin in 100 ml of water. Eosin G (also called Eosin Y) or Eosin B is used, preferably Eosin G.
Bevorzugt wird für die Eosin-Lösung destilliertes oder demi- neralisiertes Wasser verwendet. Preferably, distilled or demineralized water is used for the eosin solution.
Bevorzugt kann der Eosin-Lösung Glycerin zugesetzt werden, besonders bevorzugt werden pro 100 ml Wasser 1 - 25 ml Wasser durch Glycerin ersetzt, ganz besonders bevorzugt 5 - 20 ml, insbesondere 10 - 15 ml, insbesondere bevorzugt 13 ml. Glycerol may preferably be added to the eosin solution, more preferably 1 to 25 ml of water per 100 ml of water are replaced by glycerol, very particularly preferably 5 to 20 ml, in particular 10 to 15 ml, particularly preferably 13 ml.
Bevorzugt werden der Eosin-Lösung pro 100ml Gesamtvolumen 0,01 - 1 g Natriumchlorid zugegeben, besonders bevorzugt 0,05 - 0,5 g, ganz besonders bevorzugt 0,1 g. Die Färbung erfolgt vorzugsweise durch Eintauchen des Objekt¬ trägers in die zweite Färbelösung. The eosin solution is preferably added per 100 ml total volume 0.01-1 g of sodium chloride, more preferably 0.05-0.5 g, most preferably 0.1 g. The dyeing is preferably carried out by dipping the carrier in the second object ¬ staining solution.
Vorzugsweise wird der Objektträger 0,2 - 5 min, besonders be¬ vorzugt 0,5 - 2,5 min, ganz besonders bevorzugt 0,75 - 2 min, insbesondere 1 min in die zweite Färbelösung eingetaucht. Preferably, the slide is 0.2 - 5 min, particularly ¬ vorzugt be 0.5 - 2.5 min, most preferably 0.75 - 2 minutes, in particular 1 min immersed in the second dye solution.
(e) Zweites Entfärben der Zellprobe (e) second decolorization of the cell sample
Nach dem Färben der Zellprobe in Schritt (S4) mittels einer zweiten Färbelösung erfolgt im Schritt S5 ein zweites Entfärben der Zellprobe. After staining the cell sample in step (S4) by means of a second staining solution, a second decolorization of the cell sample takes place in step S5.
Das Entfärben erfolgt mittels Wasser, bevorzugt nicht durch das Spülen mit fließendem Wasser, besonders bevorzugt durch Eintauchen des Trägermaterials in ein Gefäß mit Wasser. Zum Entfärben kann jegliches Süsswasser mit einem pH-Wert im neutralen Bereich verwendet werden, bevorzugt wird jedoch Leitungswasser verwendet. Vorzugsweise erfolgt das Entfärben über einen Zeitraum von 1 sec. - 5 min, besonders bevorzugt 10 sec. - 2,5 min., ganz besonders bevorzugt 20 sec. - 1 min., insbesondere 30 sec. The decolorization takes place by means of water, preferably not by rinsing with running water, more preferably by immersing the support material in a vessel with water. For decolorizing, any fresh water having a pH in the neutral range may be used, but tap water is preferably used. The decolorization is preferably carried out over a period of 1 second to 5 minutes, particularly preferably 10 seconds to 2.5 minutes, very particularly preferably 20 seconds to 1 minute, in particular 30 seconds.
Bevorzugt werden zum Entfärben 100 - 2000 ml Wasser verwen- det, besonders bevorzugt 200 - 1000 ml, ganz besonders bevor¬ zugt 250 - 750 ml, insbesondere 500 ml. Are preferred for decolorizing 100 - 2000 ml of water verwen- det, particularly preferably 200 - 1000 ml, especially before Trains t ¬ 250-750 ml, in particular 500 ml.
Zum Entfärben kann das bereits in Verfahrensschritt S3 ver¬ wendete Wasser nochmals verwendet werden. For decolorizing the ver ¬ applied already in step S3 water can be used again.
Bevorzugt weist das erfindungsgemäße Verfahren nach dem Ver¬ fahrensschritt S5 keine Fixier- und Entwässerungsschritte mit alkoholischen Lösungen auf, besonders bevorzugt weist das er¬ findungsgemäße Verfahren nach dem Verfahrensschritt S5 keine Fixier- und Entwässerungsschritte auf, ganz besonders bevor¬ zugt weist das erfindungsgemäße Verfahren nach dem Verfah¬ rensschritt S5 keinerlei weiteren Verfahrensschritte mehr auf und ist beendet. Überraschenderweise sind die durch das erfindungsgemäße Ver¬ fahren gefärbten Zellproben auch ohne zusätzliche Entwässe- rungs- und Fixierungsschritte, über einen längeren Zeitraum stabil. So bleiben die Zellen auch bei höheren Temperaturen um die 40 °C über einen Zeitraum von über zwei Wochen stabil. Preferably, the inventive method comprises, after Ver ¬ method step S5 no fixation and dehydration steps with alcoholic solutions, particularly preferably, the he ¬ invention process according to the process step S5 no fixation and dehydration steps, especially before ¬ Trains t, the method according to the invention by the procedural ¬ rensschritt on S5 no further steps more and ends. Surprisingly, the drive by the inventive Ver ¬ stained cell samples are rungs- without additional drainage and fixing steps, stable over a longer period. Thus, the cells remain stable even at higher temperatures around 40 ° C over a period of over two weeks.
Erfindungsgemäßes Färbelösung Dyeing solution according to the invention
Die erfindungsgemäße Färbelösung enthält Hämatoxylin, Natri- umjodat, Kaliumaluminiumsulfat-dodecahydrat und Zitronensäu¬ re. Die erfindungsgemäße Färbelösung enthält kein Chloral- hydrat . Bevorzugt enthält die Färbelösung keine weiteren Komponenten als Hämatoxylin, Natriumj odat , Kaliumaluminiumsulfat- dodecahydrat und Zitronensäure. Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Färbelösung durch Lösen der Komponenten in Wasser, besonders bevorzugt in destilliertem oder demineralisiertem Wasser, hergestellt. The staining solution invention comprises hematoxylin, sodium umjodat, potassium aluminum sulfate dodecahydrate and Zitronensäu ¬ re. The staining solution according to the invention contains no chloral hydrate. The staining solution preferably contains no further components than hematoxylin, sodium iodate, potassium aluminum sulfate dodecahydrate and citric acid. The dyeing solution according to the invention is preferably prepared by dissolving the components in water, more preferably in distilled or demineralized water.
Hämatoxylin wird bevorzugt in einer Menge von 0,01 - 10 Hematoxylin is preferred in an amount of 0.01-10
Gew.%, besonders bevorzugt 0,01 - 5 Gew.%, insbesondere 0,02 - 2 Gew.%, insbesondere bevorzugt 0,03 - 1 Gew.%, insbesonde¬ re besonders bevorzugt 0,05 - 0,5 Gew.%, im speziellen 0,1 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt . %, More preferably 0.01 - 5 wt.%, In particular 0.02 -. 2% by weight, particularly preferably 0.03 -. 1% by weight, particularly preferably 0.05 insbesonde ¬ re -. 0.5 wt. %, in particular 0.1% by weight, in each case based on the total weight of the dyeing solution used.
Natriumjodat wird bevorzugt in einer Menge von 0,001 - 2 Gew.%, besonders bevorzugt 0,005 - 1,5 Gew.%, insbesondere 0,01 - 1 Gew.%, insbesondere bevorzugt 0,015 - 0,5 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 0,018 - 0,1 Gew.%, im spe- ziellen 0,02 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt. Sodium iodate is preferably used in an amount of 0.001-2% by weight, more preferably 0.005-1.5% by weight, in particular 0.01-1% by weight, particularly preferably 0.015-0.5% by weight, particularly particularly preferably 0.018 0.1% by weight, in particular 0.02% by weight, based in each case on the total weight of the dyeing solution.
Kaliumaluminiumsulfat-dodecahydrat wird bevorzugt in einer Menge von 0,1 - 20 Gew.%, besonders bevorzugt 1 - 10 Gew.%, insbesondere 2 - 8 Gew.%, insbesondere bevorzugt 3 - 7 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 4 - 6 Gew.%, im speziellen 5 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt . Zitronensäure wird bevorzugt in einer Menge von 0,01 - 5 Gew.%, besonders bevorzugt 0,05 - 2,5 Gew.%, insbesondere 0,075 - 1 Gew.%, insbesondere bevorzugt 0,08 - 0,5 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 0,1 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt. Potassium aluminum sulfate dodecahydrate is preferably used in an amount of 0.1-20% by weight, more preferably 1-10% by weight, in particular 2-8% by weight, particularly preferably 3-7% by weight, in particular particularly 4-6 % By weight, in particular 5% by weight, in each case based on the total weight of the dyeing solution. Citric acid is preferably used in an amount of 0.01-5% by weight, more preferably 0.05-2.5% by weight, in particular 0.075-1% by weight, particularly preferably 0.08-0.5% by weight, in particular, particularly preferably 0.1% by weight, based in each case on the total weight of the dyeing solution.
Die erfindungsgemäße Färbelösung kann zur Anfärbung von Zellproben verwendet werden, beispielsweise zur Diagnose von Kar¬ zinomzellen . Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Färbelösung in dem erfin¬ dungsgemäßen Verfahren verwendet, besonders bevorzugt als erste Färbelösung. The staining solution according to the invention can be used for staining of cell samples, for example for the diagnosis of carcinoma cells Kar ¬. The staining solution according to the invention is preferably used in the process OF INVENTION ¬ to the invention, particularly preferred as the first dye solution.
Die erfindungsgemäße Färbelösung erreicht überraschenderweise auch ohne den Zusatz von Chloralhydrat eine Färbeleistung entsprechend der aus dem Stand der Technik bekannten Färbelö¬ sungen und ist über einen längeren Zeitraum stabil und kann wiederverwendet werden. The coloring solution according to the invention surprisingly achieved even without the addition of chloral hydrate a coloring power according to the known prior art solutions Färbelö ¬ and is stable over a long period of time and can be reused.
Beispiele Beispiel 1 Examples Example 1
Hämatoxylin Lösung  Hematoxylin solution
Benötigte Chemikalien : Required chemicals:
Hämatoxylin, Natriumj odat , Kaliumaluminiumsulfat- dodecahydrat , Zitronensäure, Eosin  Hematoxylin, sodium iodate, potassium aluminum sulfate dodecahydrate, citric acid, eosin
• Stocklösung : • Stock solution:
1 g Hämatoxylin wird in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst und es werden 0,2 g Natriumj odat und 50 g Natriumaluminiumsulfat-dodecahydrat zugegeben.  1 g of hematoxylin is dissolved in 1 liter of distilled water and 0.2 g of sodium iodate and 50 g of sodium aluminum sulfate dodecahydrate are added.
• Gebrauchslösung: • working solution:
In 100 ml der Stocklösung werden 0.1 g Zitronensäure gelöst.  In 100 ml of the stock solution, 0.1 g of citric acid are dissolved.
Beispiel 2 Example 2
• Eosinlösung:  • eosin solution:
Es werden 0,3 g Eosin in 87 ml destilliertem Wasser gelöst und anschließend 13 ml Gycerin und 0,1 g NaCl zugesetzt. Beispiel 3  0.3 g of eosin are dissolved in 87 ml of distilled water and then 13 ml of glycerol and 0.1 g of NaCl are added. Example 3
Mittels Bürstenbiopsie gewonnenen Plattenepithelzellen der Mundschleimhaut wurden auf einen Glasobjektträger aufgebracht . Die Zellen wurden durch Antrocknen der Zellen auf dem Objektträger für 2 min bei Raumtemperatur (20 °C) getrocknet. Anschließend wurde eine Hämatoxylin (H) Färbung durch Eintau- chen des Objektträgers für 1 Minute in 300 ml der Gebrauchs¬ lösung gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die Färbelösung wurde in einem Färbetrog (PMP) der Firma Th. Geyer Gmbh, Renningen, Deutschland (mit den Maßen 80 mm x 100 mm x 70 mm (Breite x Länge x Höhe) vorgelegt. Der Objektträger wurde mittels eines Färbegestells der Firma Th. Geyer Gmbh, mit horizontalem Boden für 20 Objektträger, in die Lösung eingetaucht. Squamous cell epithelial cells obtained by brush biopsy were applied to a glass slide. The cells were dried by drying the cells on the slide for 2 min at room temperature (20 ° C). Subsequently, a hematoxylin (H) staining was Immersing the slide for 1 minute in 300 ml of the use solution ¬ carried out according to Example. 1 The staining solution was placed in a dyeing trough (PMP) from Th. Geyer Gmbh, Renningen, Germany (measuring 80 mm × 100 mm × 70 mm (width × length × height).) The slide was stained by means of a staining rack made by Th. Geyer Gmbh, with horizontal bottom for 20 slides, immersed in the solution.
Anschließend erfolgte eine Entfärbung durch Eintauchen des Objektträgers in ein Glasgefäß mit 500 ml Leitungswasser für 30 Sekunden. This was followed by decolorization by immersing the slide in a glass jar with 500 ml of tap water for 30 seconds.
Anschließend wurde eine Eosin (E) Färbung durch Eintauchen des Objektträgers für 1 Minute in 300 ml der Eosinlösung ge¬ mäß Beispiel 2 durchgeführt. Die Färbelösung wurde in einem Färbetrog (PMP) der Firma Th. Geyer Gmbh, Deutschland (mit den Maßen 80 mm x 100 mm x 70 mm (Breite x Länge x Höhe) vor¬ gelegt. Der Objektträger wurde mittels eines Färbegestells der Firma Th. Geyer Gmbh, mit horizontalem Boden für 20 Objektträger, in die Lösung eingetaucht. Subsequently, an eosin (E) staining by immersing the slide for 1 minute in 300 ml of the eosin solution was carried out ge ¬ Mäss Example 2. Fig. The staining solution was placed in a staining dish (PMP) the company Th. Geyer Gmbh, Germany (with dimensions of 80 mm x 100 mm x 70 mm (width x length x height) placed in front ¬. The slide was by means of an accessory staining of Th. Geyer Gmbh, with horizontal bottom for 20 slides, immersed in the solution.
Anschließend erfolgte eine zweite Entfärbung durch Eintauchen des Objektträgers für 30 Sekunden in das Glasgefäß mit 500 ml Leitungswasser, welches bereits für die erste Entfärbung verwendet wurde. This was followed by a second decolorization by immersing the slide for 30 seconds in the glass vessel with 500 ml of tap water, which was already used for the first decolorization.
Der Vergleich der erfindungsgemäßen Färbelösung gemäß Beispiel 1 mit Hämatoxylin-Färbelösungen aus dem Stand der Technik zeigt, dass die erfindungsgemäße Färbelösung eine Färbe¬ leistung entsprechend den aus dem Stand der Technik bekannten Färbelösungen aufweist und über einen längeren Zeitraum stabil ist und wiederverwendet werden kann. Der Vergleich der in Beispiel 3 mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens angefärbten Zellprobe mit einer Zellprobe die nach einem Verfahren gemäß den Stand der Technik angefärbt wurde, zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren den Zeitaufwand und die Anzahl der Verfahrensschritte deutlich minimiert, und trotzdem zu gefärbten Zellproben führt, die über einen längeren Zeitraum stabil sind. The comparison of the staining solution according to the invention according to Example 1 with hematoxylin-staining solutions of the prior art shows that the staining solution according to the invention comprises a dyeing ¬ power according to the processes known from the prior art dyeing solutions and is stable over a long period of time and can be reused. The comparison of the cell sample stained in Example 3 by means of the method according to the invention with a cell sample stained by a method according to the prior art shows that the method according to the invention significantly reduces the time required and the number of method steps, and nevertheless leads to stained cell samples. which are stable over a longer period.

Claims

Patentansprüche Patent claims
1. Verfahren zum Anfärben von Zellproben (Biopsieproben) für die Mikroskopie umfassend folgende Schritte: 1. Method for staining cell samples (biopsy samples) for microscopy comprising the following steps:
(a) Aufbringen (Sl) der Zellprobe auf ein Trägermaterial ; (a) applying (Sl) the cell sample to a carrier material;
(b) Färben (S2) der Zellprobe mittels einer ersten Färbelösung; (b) staining (S2) the cell sample using a first staining solution;
(c) Erstes Entfärben (S3) der Zellprobe; (c) First destaining (S3) of the cell sample;
(d) Färben (S4) der Zellprobe mittels einer zweiten (d) staining (S4) of the cell sample using a second one
Färbelösung; und staining solution; and
(e) Zweites Entfärben (S5) der Zellprobe; dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren nach dem Verfahrensschritt S5 keine Fixier- und Entwässerungsschritte mit alkoholischen Lösungen aufweist. (e) Second destaining (S5) of the cell sample; characterized in that the method after method step S5 does not have any fixing and dewatering steps with alcoholic solutions.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren nach dem fünften Verfahrensschritt (S5) keine Fixier- und Entwässerungsschritte aufweist. 2. The method according to claim 1, characterized in that the method after the fifth method step (S5) has no fixing and dewatering steps.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fixierung der Zellproben auf dem Trägerma- terial mittels einer alkoholischer Fixierlösung erfolgt. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the cell samples are fixed on the carrier material using an alcoholic fixing solution.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren keine Entfärbungsschrit¬ te unter fließendem Wasser aufweist. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the method has no decolorization steps under running water.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellproben um Oberflä- chenepithelzellen der Mundschleimhaut handelt. 5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the cell samples are surface epithelial cells of the oral mucosa.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass die Zellproben mittels Bürstenbiopsie gewonnen wurden. 6. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the cell samples were obtained by means of brush biopsy.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als erste Färbelösung eine Hämatoxy- lin enthaltende Färbelösung verwendet wird. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that a staining solution containing hematoxylin is used as the first staining solution.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch kennzeichnet, dass die erste Färbelösung kein Chloral hydrat enthält. Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the first coloring solution does not contain chloral hydrate.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge- kennzeichnet, dass als erste Färbelösung eine Lösung ge¬ mäß einem der Ansprüche 12 bis 14 verwendet wird. 9. The method according to one of claims 1 to 8, characterized in that a solution according to one of claims 12 to 14 is used as the first coloring solution.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass als zweite Färbelösung eine Eosin enthaltende Färbelösung verwendet wird. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that a coloring solution containing eosin is used as the second coloring solution.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, zum in 11. The method according to any one of claims 1 to 10, for in
vitro Nachweis von Karzinomzellen. vitro detection of carcinoma cells.
12. Wässrige Färbelösung zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 enthaltend Hämatoxy- lin, Natriumj odat , Kaliumaluminiumsulfat-dodecahydrat und Zitronensäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Fär¬ belösung kein Chloralhydrat enthält. 12. Aqueous coloring solution for use in a method according to one of claims 1 to 11 containing hematoxylin, sodium iodate, potassium aluminum sulfate dodecahydrate and citric acid, characterized in that the coloring solution does not contain chloral hydrate.
13. Wässrige Färbelösung gemäß Anspruch 12, wobei die Färbe¬ lösung 0,01 - 10 Gew.% Hämatoxylin, 0,001 - 2 Gew.% Natriumj odat, 0,1 - 20 Gew.% Kaliumaluminiumsulfat- dodecahydrat , und 0,01 - 5 Gew.% Zitronensäure enthält. 13. Aqueous staining solution according to claim 12, wherein the staining solution contains 0.01 - 10% by weight of hematoxylin, 0.001 - 2% by weight of sodium iodate, 0.1 - 20% by weight of potassium aluminum sulfate dodecahydrate, and 0.01 - 5 Contains% by weight of citric acid.
14. Wässrige Färbelösung gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei die Färbelösung als erste Färbelösung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-11 verwendet wird. 14. Aqueous coloring solution according to claim 12 or 13, wherein the coloring solution is used as a first coloring solution in a method according to any one of claims 1-11.
15. Verwendung der Färbelösung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 zum Anfärben von Zellproben, bevorzugt von 15. Use of the staining solution according to one of claims 11 to 13 for staining cell samples, preferably from
Oberflächenepithel zellen . Surface epithelial cells.
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