CH669670A5 - - Google Patents
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Description
BESCHREIBUNG DESCRIPTION
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Anfärben der DNS lebender Säugetierzellen und auf nach diesen Verfahren behandeltes Material. Insbesondere wird durch das erfindungs-gemässe Verfahren ein einmaliges Mittel zur Sichtbarmachung von 1. der Vorkerne von lebenden pronucleären Zellen, einschliesslich Eizellen und einzelliger befruchteter Eier, 2. der verdichteten DNS in den Kopfteilen von Spermatozoen und 3. der Zellkerne von im Stadium von ihrer implantationsfähigen Phase befindlichen Embryonen. Die Sichtbarmachung von genetischem Material in diesen Arten von lebenden Zellen ist für die weitere Untersuchung und für die Entwicklung von in vitro Befruchtung und Reifung, Gen- und Zellkernübertragungsmöglichkeiten und nachfogendem Clonen von Embryonen von Haustieren von Bedeutung. Bisher konnten Vorkerne und Sper-mien-DNS in lebenden oder lebensfähigen Säugetierzellen, mit Ausnahme von denjenigen von Nagetieren und Menschen, bei denen das Cytoplasma dieser Zellen durchsichtig ist, nicht gesehen werden. Bei reiferen Embryonen kann der Bereich der Zellkerne etwas deutlicher sichtbar sein, durch die geringere Zell-grösse wird jedoch die Sichtbarmachung der individuellen Zellkerne unmöglich gemacht. The invention relates to methods for staining the DNA of living mammalian cells and to material treated by these methods. In particular, the method according to the invention provides a unique means of visualizing 1. the pronuclei of living pronuclear cells, including oocytes and unicellular fertilized eggs, 2. the compressed DNA in the head parts of spermatozoa and 3. the cell nuclei in the stage of their implantable phase embryos. The visualization of genetic material in these types of living cells is important for further investigation and for the development of in vitro fertilization and maturation, gene and nucleus transfer possibilities and subsequent cloning of embryos from pets. Previously, nuclei and sperm DNA could not be seen in living or viable mammalian cells, except for those of rodents and humans, where the cytoplasm of these cells is transparent. In more mature embryos, the area of the cell nuclei may be more clearly visible, but the smaller cell size makes it impossible to visualize the individual cell nuclei.
Im Bereich der Landwirtschaft, insbesondere der Viehzucht, werden fortgesetzt Versuche durchgeführt, eine Verbesserung der Gentechnik und der Auswahltechniken zu erreichen. In the field of agriculture, especially cattle breeding, attempts are continuing to improve genetic engineering and selection techniques.
Unter besonderem Bezug auf Milchvieh konnte beispielsweise eine bemerkenswerte Zunahme der Milchproduktion aufgrund der in grossem Ausmass durchgeführten Verwendung von genetisch überlegenen Erzeugern und der künstlichen Besamung festgestellt werden. Milchkühe erzeugen heute nahezu zwei Mal soviel Milch wie vor 30 Jahren. Eine weitere genetische Verbesserung kann durch Multiplikation von überlegenen oder durch Clonen genetisch manipulierten Embryonen erreicht werden. Embryonen können geclont werden, indem man 1, Vorkerne oder Zellkerne in einer befruchteten Eizelle durch Spendervorkerne oder durch Zellkerne von mehrzelligen Embryonen in einem Frühstadium ersetzt oder 2. ein wertvolles Gen in den Vorkernen oder den Zellkern überträgt. With particular reference to dairy cattle, for example, a remarkable increase in milk production was observed due to the large scale use of genetically superior producers and artificial insemination. Dairy cows produce almost twice as much milk today as they did 30 years ago. A further genetic improvement can be achieved by multiplying superior embryos or genetically manipulated by cloning. Embryos can be cloned by replacing 1, pre-nuclei or cell nuclei in a fertilized egg cell with donor pre-nuclei or with cell nuclei of early multicellular embryos or 2. transferring a valuable gene in the pre-nuclei or the cell nucleus.
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
3 3rd
669 670 669 670
Zur Durchführung einer Genübertragung ist es notwendig, dass die Vorkerne oder Zellkerne der Empfängerzelle sichtbar sind, so dass die gewünschten Gensequenzen enthaltenden DNS-Fragmente direkt mittels Mikromanipulatortechnik in einen der Vorkerne oder den Zellkern übertragen werden können. Andererseits erfordert die Zellkernübertragung, dass der Zellkern oder die männlichen oder weiblichen Vorkerne sichtbar sind, so dass sie von der befruchteten Zelle im Austausch mit einem Zellkern der gewünschten Clon-Linie entfernt werden können. Techniken, wie diese, welche die Manipulation von genetischem Material einschliessen, wurden im Zuge von Forschungsarbeiten mit Mäuseembryonen entwickelt, bei denen das Cytoplasma der Vorkerne und der Embryozellen durchsichtig ist, und eine Sichtbarmachung des Kernmaterials in lebenden Zellen durch Lichtmikroskopie erlauben. To carry out a gene transfer, it is necessary that the pre-nuclei or cell nuclei of the recipient cell are visible, so that the DNA fragments containing the desired gene sequences can be transferred directly into one of the pre-nuclei or the cell nucleus using micromanipulator technology. On the other hand, nuclear transfer requires that the nucleus or the male or female pronuclei be visible so that they can be removed from the fertilized cell in exchange for a nucleus of the desired clone line. Techniques such as these, which involve the manipulation of genetic material, have been developed in the course of research work with mouse embryos, in which the cytoplasm of the nuclei and the embryo cells is transparent and allow the nuclear material to be visualized in living cells by light microscopy.
Die Situation bei Rinder- und Schweinegameten sowie bei Zellen von Vorimplantierten Embryonen ist davon vollkommen verschieden. Das Cytoplasma dieser Zellen ist dicht und körnig und enthält dicke Lipidtröpfchen. Das genetische Material ist verdeckt und kann durch Lichtmikroskopie nicht sichtbar gemacht werden. Herkömmliche Zellkernfärbungen sind keine Vitalfärbungen, d.h. sie erfordern, dass die Zellen vor dem Anfärben fixiert und geklärt werden. Rinder- und Schweinegameten sowie Zellen von im Stadium von ihrer implantationsfähigen Phase befindlichen Embryonen wurden normalerweise in fixierten, geklärten und nicht lebenden Proben untersucht. The situation with cattle and pig gametes and with cells from pre-implanted embryos is completely different. The cytoplasm of these cells is dense and granular and contains thick lipid droplets. The genetic material is hidden and cannot be made visible by light microscopy. Conventional cell staining is not vital staining, i.e. they require the cells to be fixed and cleared before staining. Bovine and swine gametes, as well as cells from embryos in the stage of their implantable phase, were normally examined in fixed, cleared and non-living samples.
Wie im vorhergehenden erläutert, erfordern Verbesserungen in bezug auf die Gentechnik, wie beispielsweise die Übertragung von Genen oder Zellkernmaterial, die selektive Anfärbung des nucleären oder pränucleären Materials in lebenden Vorkernen oder embryonalen Zellen. Diese Techniken werden, zusammen mit einer Reihe von labormässigen Versuchsaufgaben, durch das erfindungsgemässe Verfahren möglich gemacht, durch welches ein Verfahren zum Sichtbarmachen geschaffen wird, welches die notwendige Selektivität gewährleistet und auf lebende Zellen angewendet werden kann. As discussed above, improvements in genetic engineering, such as the transfer of genes or nuclear material, require the selective staining of the nuclear or prenuclear material in living pre-nuclei or embryonic cells. These techniques, together with a number of laboratory test tasks, are made possible by the method according to the invention, by means of which a method for making visible is created which ensures the necessary selectivity and can be applied to living cells.
Die hierin beschriebene Technik ermöglicht es, die männlichen und weiblichen Vorkerne in lebenden Säugetierzellen sichtbar zu machen, sogar im Falle solcher Arten, bei denen durch die Dichte des Zellcytoplasmas normalerweise die Vorkerne verdeckt werden. Die Sichtbarmachung von Vorkernen in lebenden Zellen ist bisher nicht beschrieben worden, mit Ausnahme für die Zellen von Nagetieren und Menschen. Durch das Verfahren wird ausserdem ein Mittel zur Sichtbarmachung des nucleären Materials von vielzelligen Embryonen geschaffen, indem ermöglicht wird, die Zahl der in einem sich entwickelnden Embryo vorhandenen Zellen nach jeder Teilung zu bestimmen, sowie das genetische Material für die Gen- und Kernübertragung zu manipulieren. The technique described herein makes it possible to visualize the male and female pronuclei in living mammalian cells, even in the case of species in which the pronuclei are normally obscured by the density of the cell cytoplasm. The visualization of pre-nuclei in living cells has not been described so far, with the exception of the cells of rodents and humans. The method also provides a means of visualizing the nuclear material of multicellular embryos by enabling the number of cells in a developing embryo to be determined after each division and by manipulating the genetic material for gene and nuclear transmission.
Die Sichtbarmachung wird erreicht, indem man lebende Zellen der Einwirkung eines Färbemittels oder Farbstoffes aussetzt, welche für die doppelstrangige DNS spezifisch sind, aber die weitere Lebensfähigkeit der Zelle nicht ausschliessen. Es werden fluoreszierende Färbemittel, wie DAPI oder bis-Benzimidazolverbindungen, verwendet. Das Färbemittel wird dem Kulturmedium zugesetzt, welches Gameten, einzellige befruchtete Eier oder vielzellige Embryonen enthält. Nach der Inkubation, welche nur eine kurze Zeit, wie einige Minuten, durchgeführt werden muss, kann das genetische Material sichtbar gemacht werden, indem man es ultraviolettem Licht aussetzt. The visualization is achieved by exposing living cells to the action of a colorant or dye which are specific for the double-stranded DNA, but which do not exclude the further viability of the cell. Fluorescent colorants such as DAPI or bis-benzimidazole compounds are used. The colorant is added to the culture medium, which contains gametes, unicellular fertilized eggs or multicellular embryos. After the incubation, which only needs to be carried out for a short time, such as a few minutes, the genetic material can be visualized by exposing it to ultraviolet light.
Die pronucleären oder nucleären Strukturen erscheinen als gefärbte Bereiche innerhalb des Cytoplasmas. Die Intensität schwankt von sehr blass bis zu heller Fluoreszenz. The pronuclear or nuclear structures appear as colored areas within the cytoplasm. The intensity varies from very pale to bright fluorescence.
Eine allgemeine Aufgabe der vorliegenden Erfindung be-5 steht darin, labortechnische Forschungsaufgaben zu ermöglichen und zu erleichtern, wie beispielsweise Gen- und Kernübertragungstechniken, sowie Untersuchungen der Muster und des Fortschreitens der Reifung und Befruchtung von Eizellen in vitro sowie von Embryokulturen. A general object of the present invention is to enable and facilitate laboratory research tasks, such as gene and nuclear transmission techniques, and to study the patterns and progression of egg maturation and fertilization in vitro and embryo cultures.
io Eine der wesentlichen Aufgaben der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Sichtbarmachung der Vorkerne von lebenden pronucleären Säugetierzellen zu schaffen. One of the essential objects of the invention is to provide a method for visualizing the pronuclei of living pronuclear mammalian cells.
Eine mehr spezifische Aufgabe besteht darin, die Sichtbarmachung der männlichen und weiblichen DNS oder von Vor-i5 kernen von lebenden Säugetiergameten und einzelligen befruchteten Eiern, insbesondere von Rindern und Schweinen, zu erlauben. A more specific task is to allow the visualization of the male and female DNA or precuclear of living mammalian gametes and unicellular fertilized eggs, especially cattle and pigs.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein ähnliches Verfahren zu schaffen, welches die Sichtbarmachung von 20 Kernmaterial von vielzelligen Embryonen erlaubt. Another object of the invention is to provide a similar method which allows the visualization of 20 core material from multicellular embryos.
Eine damit in Verbindung stehende Aufgabe besteht darin, ein Mittel zur differenzierten Anfärbung von genetischem Material und den Cytoplasmainhalten zu schaffen. One related task is to provide a means for differentiating genetic material and cytoplasmic contents.
Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird eine Färbe-25 technik geschaffen, die eine differenzierte Anfärbung bestimmten genetischen Materials erlaubt, welches niemals zuvor in lebenden Zellen sichtbar war. Die für diese Verfahren verwendeten fluoreszierenden Färbemittel bewirken eine selektive Färbung des genetischen Materials der Zellen, ohne dass es 30 erforderlich wäre, die Zellen zu fixieren oder einer Klärung zu unterwerfen. Die Selektivität dieser Anfärbetechnik schafft ein machtvolles Forschungswerkzeug, welches weiterhin die Erforschung von Befruchtung, embryonaler Entwicklung und Gen-und Kernübertragung in Haustierembryonen erleichtert. 35 Die für das vorliegende Verfahren in Betracht kommenden Färbemittel können zur selektiven Anfärbung des genetischen Materials beliebiger Arten verwendet werden. Von höchstem Wert ist dieses Verfahren jedoch bei solchen Arten, bei denen die cytoplasmatischen Materialien (z.B. Lipide) das pronucleäre 40 oder nucleare Material im lebenden Zustand verdecken. Beispiele von beträchtlichem Interesse und beträchtlicher Bedeutung für die industrielle Viehzucht sind Rinder und Schweine. Es wird angenommen, dass sich das Verfahren auf andere Forschungen oder andere Haustiere gut anwenden lässt. 45 Es wurde gefunden, dass bestimmte fluoreszierende Färbemittel, wie sie für das vorliegende Verfahren zur Verwendung kommen in zweifacher Hinsicht nützlich sind, und zwar hinsichtlich der Selektivität des Anfärbens und hinsichtlich der fortgesetzten Lebensfähigkeit der Zellen. Fluoreszierende Fär-50 bemittel, die sogenannte «Vitalfärbemittel» darstellen, d.h. Färbemittel, die keine Fixierung und Klärung der Zellen erfordern und die kontinuierliche Entwicklung der Zelle nicht behindern, sind für das vorliegende Verfahren brauchbar. Darüber hinaus sollte das Färbemittel einem Typ angehören, der in die 55 Zelle einverleibt und von der doppelstrangigen DNS in lebenden Keim- oder Embryonalzellen aufgenommen wird. The method according to the invention creates a staining technique which allows a differentiated staining of certain genetic material which has never been visible in living cells before. The fluorescent stains used for these processes selectively stain the genetic material of the cells without it being necessary to fix the cells or to subject them to clarification. The selectivity of this staining technique creates a powerful research tool that further facilitates research into fertilization, embryonic development and gene and nuclear transmission in pet embryos. 35 The coloring agents which can be used for the present process can be used for the selective coloring of the genetic material of any kind. However, this method is of the greatest value in those species in which the cytoplasmic materials (e.g. lipids) mask the pronuclear or nuclear material in the living state. Examples of considerable interest and importance for industrial cattle breeding are cattle and pigs. It is believed that the method can be applied well to other research or other pets. 45 It has been found that certain fluorescent stains, as used in the present method, are useful in two ways, in terms of the selectivity of the staining and in terms of the continued viability of the cells. Fluorescent dyes, which are so-called «vital dyes», i.e. Colorants that do not require cell fixation and clarification and that do not impede the continuous development of the cell are useful in the present method. In addition, the stain should be of a type that is incorporated into the 55 cell and is taken up by the double-stranded DNA in living germ or embryonic cells.
Als besonders nützlich für das vorliegende Verfahren haben sich Färbemittel erwiesen, die zu der Klasse der Benzimidazol-fluorenzfarbstoffe gehören. Diese Klasse von Verbindungen hat 60 die folgende Grundstruktur: Colorants belonging to the class of benzimidazole fluorescent dyes have proven to be particularly useful for the present process. This class of connections has the following basic structure:
669 670 669 670
4 4th
Eine Reihe von Färbemitteln dieser Klasse ist von Hoechst AG, Frankfurt (BRD) erhältlich. Zu Verbindungen dieser Klasse zählen: A number of colorants of this class are available from Hoechst AG, Frankfurt (FRG). Compounds in this class include:
Hoechst Nr. R R' Hoechst No. R R '
32020 CH3-N( -Cl 32020 CH3-N (-Cl
32021 CH3-N< -och3 33258 CH3-N( -OH 33342 CH3-N< -oc2h5 33662 c2h5-NC -och3 32021 CH3-N <-och3 33258 CH3-N (-OH 33342 CH3-N <-oc2h5 33662 c2h5-NC -och3
ch3 ch3
34580 CH3-N< -N< 34580 CH3-N <-N <
ch3 ch3
38312 H-Cn -Cl 38312 H-Cn -Cl
38317 H-C< -NH2 38317 H-C <-NH2
Untersuchungen von S.A. Latt et al., «Spectral Studies on 33258 Hoechst and Related Bisbenzimidazole Dyes Useful for Fluorescent Detection of Deoxyribonucleic Acid Synthesis» in Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 23 (1976), Seiten 24-33, zeigen die Ähnlichkeit der oben aufgeführten Verbindungen und offenbaren, dass diese Verbindungen zum Nachweis der Synthese von DNS in somatischen Zellen nützlich sind. Investigations by S.A. Latt et al., "Spectral Studies on 33258 Hoechst and Related Bisbenzimidazole Dyes Useful for Fluorescent Detection of Deoxyribonucleic Acid Synthesis" in Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 23 (1976), pages 24-33, show the similarity of the compounds listed above and disclose that these compounds are useful for the detection of the synthesis of DNA in somatic cells.
Die folgenden Beispiele zeigen, dass die Färbemittel Hoechst Nr. 33258 und 33342 für das erfindungsgemässe Verfahren verwendbar sind. Der chemische Name des Färbemittels Hoechst Nr. 33258 ist 2-2-(4-HydroxyphenyI)-6-benzimidazolyl-6-(l-me-thyl-4-piperazyl)-benzimidazol. Der chemische Name des Färbemittels Hoechst Nr. 33342 ist 2-2-(4-Äthoxyphenyl)-6-benzimid-azolyl-6-(l-äthyl-4-piperazyl)-benzimidazol. Es wird erwartet, dass die verwandten bis-Benzimidazolverbindungen ebefalls sämtlich für eine selektive Sichtbarmachung von genetischem Material in lebenden Keim- oder Embryonalzellen verwendbar sind. The following examples show that the colorants Hoechst No. 33258 and 33342 can be used for the process according to the invention. The chemical name of the colorant Hoechst No. 33258 is 2-2- (4-HydroxyphenyI) -6-benzimidazolyl-6- (l-methyl-4-piperazyl) -benzimidazole. The chemical name of Hoechst No. 33342 is 2-2- (4-ethoxyphenyl) -6-benzimide-azolyl-6- (l-ethyl-4-piperazyl) -benzimidazole. The related bis-benzimidazole compounds are also expected to all be useful for selectively visualizing genetic material in living germ or embryonic cells.
Von den beiden tatsächlich untersuchten Verbindungen übertraf das Färbemittel Hoechst Nr. 33342 das Färbemittel Hoechst Nr. 33258 bedeutend und ist demnach das bevorzugte Reagens. Es wurde jedoch bemerkt, dass die Zellen verschiedener Arten unterschiedliche Färbemittel mit unterschiedlichem Wirkungsgrad aufnehmen. So wurde beispielsweise Hoechst Nr. 33258 von Mäuseembryonen schnell aufgenommen, während die Aufnahme bei Rinderembryonen sehr langsam erfolgte. Of the two compounds actually tested, Hoechst # 33342 colorant significantly outperformed Hoechst # 33258 color, and is therefore the preferred reagent. However, it has been noticed that the cells of different types absorb different stains with different efficiency. For example, Hoechst No. 33258 was quickly taken up by mouse embryos, whereas the uptake by cattle embryos was very slow.
Es wird erwartet, dass andere fluoreszierende Färbemittel, welche den oben erwähnten Anforderungen genügen, d.h. DNS-bindende Fluorokrome, die für Vitalfärbungen verwendet werden können, für das vorliegende Verfahren ebenso gut verwendbar sind. Ein Beispiele hierfür ist DAPI (4' 6-Diamidino-2--phenylindol), wobei die Verwendbarkeit jedoch nicht auf diese Verbindungen beschränkt ist. Other fluorescent colorants are expected to meet the requirements mentioned above, i.e. DNA-binding fluorocromes that can be used for vital staining can also be used for the present method. An example of this is DAPI (4'6-diamidino-2-phenylindole), but the usability is not restricted to these compounds.
Das Verfahren, durch welches das genetische Material in Gameten- oder Embryozellen angefärbt wird, umfasst im wesentlichen die folgenden Verfahrensstufen: Behandeln der Zellen mit einem geeigneten fluoreszierenden Färbemittel, Inkubation des so erhaltenen Materials und Bestrahlung mit ultrviolet-tem Licht. Die Dosierung des Färbemittels und die Dauer der Inkubation können variiert werden, in Abhängigkeit vom verwendeten Farbstoff und dem Zweck, für welchen die Sichtbarmachung erwünscht ist. The process by which the genetic material is stained in gamete or embryo cells essentially comprises the following process steps: treating the cells with a suitable fluorescent stain, incubating the material thus obtained and irradiating it with ultraviolet light. The dosage of the colorant and the duration of the incubation can be varied depending on the dye used and the purpose for which the visualization is desired.
Bei der Anwendung dieser Färbetechnik wurden keine falschen positiven Ergebnisse erhalten. Das bedeutet, dass bei diesem Verfahren keine anderen Materialien als nucleäre oder pronucleäre DNS in merklicher Weise angefärbt werden. Es wurde jedoch festgestellt, dass im Überschuss mit Färbemittel behandelte Zellen eine gewisse Hintergrundfärbung zeigen. Weiterhin wurde gefunden, dass das Verfahren zu einigen falschen Negativwerten führt, d.h. dass einige Zellen keine Fluoreszenz zeigen, bei denen mittels anderer Methoden festgestellt wurde, No false positive results were obtained using this dyeing technique. This means that no materials other than nuclear or pronuclear DNA are markedly stained in this process. However, it was found that cells treated with excess stain show some background staining. Furthermore, it was found that the method leads to some false negatives, i.e. that some cells do not show fluorescence that were determined using other methods,
dass sie Zellkerne oder Vorkerne enthalten. Es wird jedoch nicht angenommen, dass dieser Sachverhalt die Nützlichkeit dieser Färbemethode unter Laborbedingungen oder in kommerziellem Rahmen behindert oder beeinträchtigt. that they contain cell nuclei or pre-nuclei. However, this is not believed to hinder or affect the utility of this staining method under laboratory or commercial conditions.
Eizellen (Oocyten), einzellige befruchtete Eier oder Embryonen im Stadium vor der implantationsfähigen Phase werden von geschlechtsreifen weiblichen Tieren mit Hilfe konventioneller Methoden, durch die die Gesundheit der Zellen bewahrt wird, gewonnen. Spermazellen (Spermatozoen) werden aus dem Ejakulat geschlechtsreifer männlicher Tiere oder aus exzidierten Hoden, Nebenhoden oder Teilen des männlichen Leitungssystems erhalten. Keimzellen oder Gameten (Oocyten und Spermatozoen) sind haploide Zellen, welche sich unter Bildung eines befruchteten Eies vereinigen. Das befruchtete Ei, welches die männlichen und weiblichen Vorkerne enthält, unterliegt dann einer Konjugation der Gameten (Verschmelzung der männlichen und weiblichen Vorkerne zur Erzeugung eines Zygotenker-nes) worauf eine Reihe von Zellteilungen erfolgt. Während der Embryo eine Reihe von mitotischen Teilungen durchmacht, durchläuft er eine Entwicklung über die Morulaphase zur Bla-stocytenphase, wenn eine Gewebedifferenzierung und Spezialisierung stattfindet. Letzten Endes führt dies zur Bildung des Fötus und der Placenta, welche implantationsfähig sind und in die Uteruswandung implantiert werden. Egg cells (oocytes), unicellular fertilized eggs or embryos in the stage before the implantable phase are obtained from sexually mature female animals using conventional methods that ensure the health of the cells. Sperm cells (spermatozoa) are obtained from the ejaculate of sexually mature male animals or from excised testes, epididymis or parts of the male conduit system. Germ cells or gametes (oocytes and spermatozoa) are haploid cells that combine to form a fertilized egg. The fertilized egg, which contains the male and female nuclei, is then subject to conjugation of the gametes (fusion of the male and female nuclei to produce a zygotic nucleus), whereupon a number of cell divisions occur. As the embryo undergoes a series of mitotic divisions, it goes through the mora phase to the blastocyte phase when tissue differentiation and specialization take place. Ultimately, this leads to the formation of the fetus and placenta, which are implantable and are implanted in the uterine wall.
Im Brennpunkt des Interesses stehen der Embryo im Stadium vor der implantationsfähigen Phase sowie die Keimzellen und einzelligen befruchteten Eier. Diese sehr frühen Zellstadien sind das Objekt intensiver Forschungsanstrengungen. Die oben beschrieben Gen- und Kernübertragungstechniken verwenden befruchtete Eizellen und Embryonalzellen im Frühstadium. Die Technik hat sich ausserdem als nützlich für andere embryologische Forschungen erwiesen. The focus of interest is the embryo in the stage before the implantable phase as well as the germ cells and unicellular fertilized eggs. These very early cell stages are the subject of intensive research efforts. The gene and nuclear transmission techniques described above use fertilized egg cells and early embryonic cells. The technique has also proven useful for other embryological research.
So ermöglicht sie beispielsweise den Forschern, die Entwicklung von in vitro befruchteten Eiern zu studieren, z.B. die Symmetrie von Kern- und Cytoplasmateilung, das Auftreten eines einzelnen Kernes in jedem Blastomer, die Zahl der Zellen im Embryo nach jeder Teilung usw. Darüber hinaus ist sie für das Stadium der Gesundheit und der Beweglichkeit von Spermatozoen nützlich. For example, it enables researchers to study the development of eggs fertilized in vitro, e.g. the symmetry of nuclear and cytoplasmic division, the appearance of a single nucleus in each blastomer, the number of cells in the embryo after each division, etc. It is also useful for the stage of health and motility of spermatozoa.
Die Keim- oder Embryonalzellen werden bevorzugt in einem Kulturmedium untergebracht, welches geeignet ist, die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten. Das im Einzelfall für eine gegebene Anwendung zu bevorzugende Kulturmedium, z.B. für Zellen einer besonderen Art oder in einem besonderen Entwicklungsstadium, ist einem Fachmann bekannt. Verschiedene geeignete Medien sind in den Beispielen angegeben. Spermien können in Samen, in Samen mit herkömmlichen Auszugsmitteln, wie Eiweiss oder Milch oder in einem Kulturmedium untersucht werden. The germ or embryonic cells are preferably housed in a culture medium which is suitable for maintaining the health and viability of the cells. The culture medium to be preferred for a given application, e.g. for cells of a special kind or in a special stage of development is known to a person skilled in the art. Various suitable media are given in the examples. Sperm can be examined in semen, in semen with conventional extracting agents such as protein or milk or in a culture medium.
Das Färbemittel wird bevorzugt in Form einer Lösung verwendet. Dies erlaubt eine genauere Einstellung der Dosierung und ermöglicht den Einsatz des Färbemittels in stark verdünnter Form. Es wird angenommen, dass niedrigere Dosierungen weniger Neigung zeigen, eine genetische Schädigung der Zelle zu verursachen. The colorant is preferably used in the form of a solution. This allows the dosage to be set more precisely and enables the coloring agent to be used in a highly diluted form. It is believed that lower doses show less tendency to cause genetic damage to the cell.
Eine Stammlösung des Färbemittels kann unter Verwendung -, eines beliebigen geeigneten Lösungsmittels hergestellt werden. A stock solution of the colorant can be prepared using any suitable solvent.
Dies bedeutet, dass jedes Lösungsmittel für das Färbemittel verwendbar ist, welches die lebenden Zellen nicht in schädlicher Weise beeinflusst. Als Beispiele sind zu nennen (ohne Ein5 This means that any solvent that does not adversely affect the living cells can be used for the colorant. Examples are (without Ein5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
5 5
669 670 669 670
schränkung auf die genannten Medien oder Lösungsmittel): Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS), TALP (Thyrode-Albumin-Lactat-Pyruvat)-Medium, Whittens Medium und Eagles Medium, oder andere Medien oder Lösungsmittel, welche mit der Fortsetzung der Lebensfähigkeit der Zellen verträglich sind. Die Stammlösung des Färbemittels sollte vorzugsweise bei Kühlschranktemperaturen aufbewahrt werden, vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 0°C bis 4°C, um die Möglichkeit einer Verunreinigung zu vermindern. Es sollte jedoch beachtet werden, dass ein Einfrieren im allgemeinen nicht wünschenswert ist, da dies eine Ausfällung der Salze aus der Lösung verursacht. restriction to the named media or solvents): Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), TALP (Thyrode-Albumin-Lactate-Pyruvate) medium, Whittens Medium and Eagles Medium, or other media or solvents which are compatible with the continuation of cell viability are. The stock solution of the colorant should preferably be stored at refrigerator temperatures, preferably at temperatures from about 0 ° C to 4 ° C, to reduce the possibility of contamination. However, it should be noted that freezing is generally not desirable as this will cause the salts to precipitate out of solution.
Die Stärke (Konzentration) der Färbemittelstammlösung kann gewünschtenfalls variiert werden. Dabei gilt, dass eine stärkere Lösung genetisches Material in kürzerer Zeit anfärben wird, während eine schwächere Lösung eine längere Inkubationsdauer erfordert, bis das Material fluoresziert. Darüber hinaus verändert sich die Geschwindigkeit der Färbemittelaufnahme mit der jeweiligen Spezies, so verlangen beispielsweise Rinder- und Schweinezellen eine wesentlich längere Inkubationsdauer als Mäusezellen. Wie oben angegeben, werden niedrigere Dosierungen des Färbemittels bevorzugt, um die Gesundheit und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewahren. The strength (concentration) of the colorant stock solution can be varied if desired. It is true that a stronger solution will stain genetic material in a shorter time, while a weaker solution requires a longer incubation period until the material fluoresces. In addition, the speed of dye uptake changes with the respective species, for example cattle and pig cells require a much longer incubation period than mouse cells. As indicated above, lower dosages of the colorant are preferred to preserve the health and viability of the cells.
Wird beispielsweise eine so kleine Menge wie 1 ßl einer Stammlösung, welche 20 Hg Färbemittel je ml DPBS enthält, in 49 (il eines einzelligen Mäuseembryonen enthaltenden Mediums (50 (xl Gesamtvolumen) verwendet, so ist das Ergebnis eine ausgeprägte Fluoreszenz von Vorkernen und wenigstens einem polaren Körper innerhalb von 15 Minuten. Werden einzellige Rinderembryonen und eine Stammlösung mit einem Gehalt von 20 Hg/ml Färbemittel verwendet, wobei die Dosierung 2 jj.1 Stammlösung auf 48 )xl Nährmedium, welches die Embryonen enthält, beträgt, so kommt es innerhalb von 30 Minuten zu einer Fluoreszenz von polaren Körpern, während die Vorkerne für 1 bis 2 Stunden nicht sichtbar sind. Wie unter Bezug auf die Beispiele gesehen werden kann, können die Dosis und die Inkubationsdauer variiert werden, sofern dies aufgrund verschiedener experimenteller oder anderer Zwecke erwünscht ist. If, for example, an amount as small as 1 μl of a stock solution, which contains 20 Hg of colorant per ml of DPBS, is used in 49 (μl of a medium containing single-cell mouse embryos (50 (μl total volume), the result is a pronounced fluorescence of pre-nuclei and at least one polar body within 15 minutes If single-celled bovine embryos and a stock solution containing 20 Hg / ml colorant are used, the dosage being 2 jj.1 stock solution per 48) xl nutrient medium, which contains the embryos, then it occurs within 30 minutes to fluorescence from polar bodies while the nuclei are not visible for 1 to 2 hours As can be seen from the examples, the dose and incubation period can be varied if desired for various experimental or other purposes .
Die angefärbten Strukturen können unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden, indem man sie ultraviolettem Licht aussetzt, wobei Licht mit einer erregenden Wellenlänge bei annähernd 350 nm und einer Emission bei annähernd 460 nm als nützlich befunden wurden. Zellkerne und Vorkerne escheinen als gefärbte blaue Bereiche innerhalb des Zellcytoplasmas. Spermien besitzen keine diskreten Vorkerne; die DNS befindet sich in dichter Packung im Kopfteil des Spermiums, wo sie mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens sichtbar gemacht werden kann. Dort, wo auf Vorkerne Bezug genommen wird, ist die DNS der Spermien eingeschlossen, sofern nicht anderweitig angegeben. In Abhängigkeit von der von der DNS aufgenommenen Färbemittelmenge, welche eine Funktion der Dosis und der Zeit ist, variert die Intensität von sehr schwach bis zu strahlender Fluoreszenz. The stained structures can be visualized under the microscope by exposing them to ultraviolet light, where light with an exciting wavelength at approximately 350 nm and emission at approximately 460 nm has been found useful. Nuclei and nuclei appear as colored blue areas within the cell cytoplasm. Sperm have no discrete pronuclei; the DNA is in a tight packing in the head of the sperm where it can be made visible using the present method. Where sperm nuclei are referenced, the sperm DNA is included unless otherwise stated. Depending on the amount of colorant absorbed by the DNA, which is a function of the dose and the time, the intensity varies from very weak to radiant fluorescence.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der in den Patentansprüchen definierten Erfindung, ohne diese zu beschränken. Die in den Beispielen verwendeten Stammlösungen und Kulturmedien werden wie nachfolgend angegeben hergestellt: The following examples serve to illustrate the invention as defined in the patent claims, without restricting it. The stock solutions and culture media used in the examples are prepared as follows:
Herstellung von Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) Manufacture of Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)
Dulbecco's phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS) wurde wie folgt hergestellt: Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) was made as follows:
Lösung 1 8,00 g NaCl Solution 1 8.00 g NaCl
0,20 g KCl 0.20 g KCl
1,15 g Na2PÖ4~ 1.15 g Na2PÖ4 ~
0,20 g kh2po4 0.20 g kh2po4
800,00 ml deionisiertes, destilliertes Wasser 800.00 ml of deionized, distilled water
Lösung 2 0,10 g KCI2 Solution 2 0.10 g KCI2
100,00 ml deionisiertes, destilliertes Wasser 100.00 ml of deionized, distilled water
Lösung 3 0,10gMgCl2 5 100,00 ml deionisiertes, destilliertes Wasser Solution 3 0.10gMgCl2 5 100.00 ml deionized, distilled water
Jede Lösung wurde getrennt in einem Autoklaven einer Dampferhitzung bei 120°C bis 125°C während 20 Minuten unterworfen und danach gekühlt. Die drei Lösungen wurden in 10 einem Messkolben mit einem Liter Fassungsvermögen gemischt und das Gesamtvolumen mit in einem Autoklaven erhitzten deionisierten, destillierten Wasser auf einen Liter eingestellt. Die DPBS-lösung wurde auf annähernd 4°C gekühlt. Each solution was separately steamed in an autoclave at 120 ° C to 125 ° C for 20 minutes and then cooled. The three solutions were mixed in 10 volumetric flasks with a liter capacity and the total volume was adjusted to one liter with deionized, distilled water heated in an autoclave. The DPBS solution was cooled to approximately 4 ° C.
Bei Verwendung der DPBS zum Waschen von Zellen, wur-15 den zu jeweils 100 ml DPBS zuerst 5 mg (0,1 ml) Gentamycin-sulfat-Stammlösung zugegeben. Die Gentamycin-Stammlösung enthielt 50 mg Gentamycin-S04 je ml NaCl. When using the DPBS to wash cells, 5 mg (0.1 ml) of gentamycin sulfate stock solution were first added to each 100 ml of DPBS. The gentamycin stock solution contained 50 mg gentamycin-S04 per ml NaCl.
^ Herstellung von Färbemittel-Stammlösungen ^ Production of colorant stock solutions
Färbemittel-Stammlösungen unter Verwendung von Hoechst Nr. 33342 wurden mit den folgenden Konzentrationen hergestellt: Colorant stock solutions using Hoechst No. 33342 were prepared at the following concentrations:
25 10 g/ml DPBS 20 g/ml DPBS 60 g/ml DPBS 25 10 g / ml DPBS 20 g / ml DPBS 60 g / ml DPBS
Färbemittel-Stammlösungen unter Verwendung von Hoechst 30 Nr. 33258 wurden mit den folgenden Konzentrationen hergestellt: Colorant stock solutions using Hoechst 30 No. 33258 were prepared at the following concentrations:
10 g/ml DPBS 20 g/ml DPBS 10 g / ml DPBS 20 g / ml DPBS
35 35
Die Färbemittel-Stammlösungen wurden bei 4°C aufbewahrt. The colorant stock solutions were stored at 4 ° C.
Herstellung von 'TALP (Tyrode-Albumin-Lactat-Pyruvat)-Me-40 dium Preparation of 'TALP (Tyrode-Albumin-Lactate-Pyruvate) -Me-40 dium
Die Herstellung von Stammlösung zur Verwendung bei der Bereitung von TALP-Medium wurde wie folgt vorgenommen: The preparation of stock solution for use in the preparation of TALP medium was carried out as follows:
Bestandteil component
Menge amount
In In
NaCl 9,210 g 1,0 1 H20 NaCl 9.210 g 1.0 1 H20
KCl 1,237 g 100 ml H20 KCl 1.237 g 100 ml H20
CaCl2 (2H20) 1,332 g 100 ml H20 CaCl2 (2H20) 1.332 g 100 ml H20
MgCl2 (6H20) 2,436 g 100 ml H20 MgCl2 (6H20) 2.436 g 100 ml H20
NaHCCh 1,403 g + 1 mg Phenolrot 100 ml H2O NaHCCh 1.403 g + 1 mg phenol red 100 ml H2O
Glucose 5,310 g 100 ml H2O Glucose 5.310 g 100 ml H2O
Na-Lactat 1,0 ml DL-Milchsäure * Na lactate 1.0 ml DL-lactic acid *
NaH2P04(H20) 28,0 mg ** NaH2P04 (H20) 28.0 mg **
Anmerkungen: Remarks:
* DL-Milchsäure, Natriumsalz als 60% Sirup (Sigma Chemical Co.). Die 1,0 ml Milchsäuresirup wurden in die 35 ml H2O gespühlt, bis sie in Lösung waren. Ein Tropfen Phenolrot wurde zugegeben. Der pH wurde mit NaOH auf annähernd 7,4 eingestellt (wobei in Überschuss zugegebenes NAOH durch Hinzufügen eines sehr kleinen Tropfens Lac-tat korrigiert werden kann). * DL-lactic acid, sodium salt as 60% syrup (Sigma Chemical Co.). The 1.0 ml lactic acid syrup was rinsed into the 35 ml H2O until they were in solution. A drop of phenol red was added. The pH was adjusted to approximately 7.4 with NaOH (NAOH in excess can be corrected by adding a very small drop of Lac-tat).
** Die 28 mg NaH2P04 (H20) wurden mit 10 ml der wie oben beschrieben hergestellten Glucosestammlösung vermischt. ** The 28 mg NaH2P04 (H20) were mixed with 10 ml of the glucose stock solution prepared as described above.
669 670 669 670
6 6
Die Bestandteile für jede Stammlösung wurden gemischt, sterilfiltriert (Porenweite 0,2 (im) in sterile Flaschen abgefüllt und bei etwa 4°C gekühlt. The ingredients for each stock solution were mixed, sterile filtered (pore size 0.2 (im)) into sterile bottles and cooled at about 4 ° C.
Das TALP-Medium wurde vor dem Gebrauch durch Mischen der folgenden Mengen von Stammlösungen zubereitet: The TALP medium was prepared before use by mixing the following amounts of stock solutions:
Stamm tribe
Stamm-Kon- Trunk con
Konz, im Konz, im
Menge amount
zentration centering
Medium medium
NaCl NaCl
157,0 mM 157.0 mM
114,00 mM 114.00 mM
ad 100 ml ad 100 ml
KCl KCl
166,0 mM 166.0 mM
3,16 mM 3.16 mM
1,90 ml 1.90 ml
CaCl2 (2H20) CaCl2 (2H20)
120,0 mM 120.0 mM
2,00 mM 2.00 mM
1,70 ml 1.70 ml
MgCl2 (6H2O) MgCl2 (6H2O)
120,0 mM 120.0 mM
0,50 mM 0.50 mM
0,41 ml 0.41 ml
NaHCOs NaHCOs
167,0 mM 167.0 mM
25,00 mM 25.00 mM
15,00 ml 15.00 ml
NaH2P04 (H20) NaH2P04 (H20)
20,5 mM 20.5 mM
0,35 mM ) 0.35 mM)
zusam- together
Glucose glucose
295,0 mM 295.0 mM
5,00 mM j 5.00 mM j
- 1,70 ml men - 1.70 ml men
Na-Lactat Na lactate
150,0 mM 150.0 mM
10,00 mM 10.00 mM
6,70 ml 6.70 ml
Die angegebenen Mengen wurden mit NaCl vermischt, wobei genügend NaCl verwendet wurde, um ein Endvolumen von 100 ml zu erhalten. Dann wurden 6,5 mg Penicillin (100 IE/ml) und 1,0 mg Phenolrot zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde in sterile Flaschen steril filtriert (Porenweite 0,22 um). The indicated amounts were mixed with NaCl using enough NaCl to give a final volume of 100 ml. Then 6.5 mg penicillin (100 IU / ml) and 1.0 mg phenol red were added. The mixture obtained was sterile filtered in sterile bottles (pore size 0.22 µm).
Am Tag des Gebrauchs wurde das TALP-Medium in Abhängigkeit von dem vorgesehenen Verwendungszweck, wie folgt ergänzt: On the day of use, depending on the intended use, the TALP medium was supplemented as follows:
1. Medium für Befruchtung 1. Medium for fertilization
6 mg Rinderserum Albumin (BSA), fettsäurefrei, und 10 |xl Natrium-Pyruvat-Stammlösung je ml TALP wurden zugegeben und einer Sterilfiltration unterworfen (BSA from Sigma Chemical Co.) oder 6 mg bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free, and 10 | xl sodium pyruvate stock solution per ml TALP were added and subjected to sterile filtration (BSA from Sigma Chemical Co.) or
2. Nährmedium für Reifung 2. Culture medium for maturation
Zu 4,5 ml TALP wurden 500 1 Rinderfötusserum (10%), 50 (xl NA-Pyruvat-Stammlösung und 10 mg FSH/ml TALP zugegeben und einer Sterilfiltration unterworfen. 500 l of bovine fetus serum (10%), 50 (xl of NA pyruvate stock solution and 10 mg of FSH / ml of TALP were added to 4.5 ml of TALP and subjected to sterile filtration.
Herstellung von Whittens's Medium Manufacture of Whittens's Medium
Bestandteil component
Menge amount
NaCl NaCl
514,0 mg 514.0 mg
KCl KCl
36,0 mg kh2po4 36.0 mg kh2po4
16,0 mg 16.0 mg
MgS04 (7H20) MgS04 (7H20)
29,0 mg 29.0 mg
NaHCO NaHCO
190,0 mg 190.0 mg
Na-Pyruvat Na pyruvate
3,5 mg 3.5 mg
Ca-Lactat (5H2O) Ca lactate (5H2O)
53,0 mg 53.0 mg
Glucose glucose
100,0 mg 100.0 mg
K Penicillin K penicillin
8,0 mg 8.0 mg
Streptomycin so4 Streptomycin so4
5,0 mg 5.0 mg
Das Medium wurde zubereitet, indem die aufgeführten Bestandteile in einen 100 ml Messkolben eingebracht wurden. Danach wurden 0,37 ml 60% Natriumlactatsirup (Sigma Chemical Co.) und 0,1 ml 1% Phenolrot zugegeben. Das Endvolumen wurde mit entionisiertem, destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Dann wurde das Medium einer Sterilfiltration unterworfen (Porenweite 0,22 |im) und bei 4°C aufbewahrt. Am Tage des Gebrauchs wurde das. Medium durch Rinderserum Albumin (BSA) von Sigma Chemical Co. ergänzt, indem 1,5 mg BSA je ml Medium zugesetzt wurden. The medium was prepared by placing the listed components in a 100 ml volumetric flask. Then 0.37 ml of 60% sodium lactate syrup (Sigma Chemical Co.) and 0.1 ml of 1% phenol red were added. The final volume was made up to 100 ml with deionized, distilled water. The medium was then subjected to sterile filtration (pore size 0.22 μm) and stored at 4 ° C. On the day of use, the medium was supplemented with bovine serum albumin (BSA) from Sigma Chemical Co. by adding 1.5 mg BSA per ml medium.
Beispiel I Example I
In diesem Beispiel wurden Mäuseembryonen verwendet um die Spezifität des Färbematerials für genetisches Material in lebenden einzelligen Embryonen nachzuweisen, da die Vorkerne dieser Spezies im ungefärbten Zustand sichtbar sind. Die Embryonen wurden von geschlechtsreifen weiblichen Mäusen erhalten, die in der vorangehenden Nacht befruchtet worden waren. Durch Entfernung der Cervix wurden die Tiere getötet, die Ovarien und Eileiter freigelegt und die einzelligen Embryonen gewonnen, indem man sie im Eileiter als vorgewölbten Bereich feststellte und die Eileiterwandung mit feinen Nadeln und feinen Scheren punktierte. Die Cumuluszellen wurden entfernt, indem man auf den freigelegten Bereich des Eileiters 100-200 jil Hyaluronidase-Lösung (10 mg/ml DPBS) aufbrachte und dort 10 Minuten lang verweilen liess. Die einzelligen Embryonen wurden durch Pipettieren gewonnen und 3 Mal in einer Lösung von 3 mg Rinderserum-Albumin pro ml DPBS gewaschen, bevor sie in Whitten's Medium eingetragen wurden. Das Rinderserum-Albumin wurde von Sigma Chemical Co. erhalten. Einzelne Tropfen Whitten's Medium wurden in einer Petrischale plaziert. Die Tropfen wurden ausgestrichen, um sie zum Anhaften an der Platte zu bringen, worauf sie mit Öl beschichtet wurden. Die einzelligen Vorkerne wurden dann in den Tropfen untergebracht. Die Vorkerne wurden mit Hilfe der Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, bevor sie unter Anwendung des erfin-dungsgemässen Verfahrens angefärbt wurden. In this example, mouse embryos were used to demonstrate the specificity of the staining material for genetic material in living unicellular embryos, since the nuclei of these species are visible in the undyed state. The embryos were obtained from sexually mature female mice that had been fertilized the previous night. The animals were killed by removing the cervix, the ovaries and fallopian tubes exposed and the unicellular embryos obtained by identifying them in the fallopian tube as a bulging area and puncturing the wall of the fallopian tube with fine needles and fine scissors. The cumulus cells were removed by placing 100-200 ml of hyaluronidase solution (10 mg / ml DPBS) on the exposed area of the fallopian tube and lingering there for 10 minutes. The unicellular embryos were collected by pipetting and washed 3 times in a solution of 3 mg bovine serum albumin per ml DPBS before they were placed in Whitten's medium. The bovine serum albumin was obtained from Sigma Chemical Co. Individual drops of Whitten's Medium were placed in a petri dish. The drops were streaked to adhere to the plate and then coated with oil. The unicellular pronuclei were then placed in the drops. The pre-cores were made visible with the aid of light microscopy before they were stained using the method according to the invention.
Für dieses Beispiel wurde eine Färbemittelstammlösung von Hoechst Nr. 33342, Konzentration 20 |ig/ml, verwendet. Es war erwünscht, den einzelligen Embryonen Dosen der Färbemittelstammlösung von 0,1 (il, 2 p.1, 5 (il oder 10 (il bei einem Gesamtmedium-Embryo-Färbemittel-Volumen von 50 (il je Tropfen zuzugeben. Es war deshalb notwendig die Tropfen, welche Medium und Embryo enthielten, in einer Grösse aufzubringen, welche die Anpassung der gewünschten Färbemitteldosierung ermöglichte. D. h. für eine Färbemitteldosis von 1 [il betrug die Medium/Embryomenge 49 (U> bei einer Färbemitteldosis von 2 (il dementsprechend 48 (iL Die Embryonen wurden bei 37°C, bei einem pH von 7,2 in einem Gemisch von 5% CO2 in Luft gefärbt. Sie wurden in dem Färbemittel belassen, während sie sichtbar gemacht wurden. Die Vorkerne und polaren Körper der einzelligen Mäussembryonen wurden unter Verwendung eines Nikon Epifluoreszenzzusatzgerätes Nr. TMD-ED für Inverted Microscope DIAPHOT-TMP (Nikon) sichtbar gemacht. Dieses System verwendet eine Hochdruckquecksilberdampflampe. Die verwendeten UV-Filter wurden von Nikon erhalten. Dieses System erlaubt die gleichzeitige Sichtbarmachung mit Licht und Fluoreszenz, so dass es möglich war, die Fluoreszenzbereiche, wie die Vorkerne und polaren Körper, positiv zu identifizieren. Sämtliche 66 in dieser Weise angefärbten Embryonen zeigten bestimmte Fluoreszenz sowohl von Vorkernen als auch von wenigstens einem polaren Körper innerhalb von 15 Minuten seit Beginn der Einwirkung des Färbemittels, unabhängig von der Dosierung. Häufig wurde nur ein polarer Körper sichtbar, während der zweite polare Körper im Laufe der Zeit degenerierte. Danach wurden 24 einzellige Mäuseembryonen in der gleichen Weise wie oben beschrieben angefärbt, wobei nur die niedrige Dosis verwendet wurde (1 (il Färbemittellösung für 1 Tropfen von 49 (il Medium/Embryo). Von diesen 24 Embryonen, zeigten 23 eine Fluoreszenz innerhalb von 5 Minuten nach dem Anfärben. For this example, a colorant stock solution from Hoechst No. 33342, concentration 20 μg / ml, was used. It was desirable to add 0.1 (il, 2 p.1, 5 (il, or 10 (il for a total medium embryo stain volume of 50 (il per drop) to the unicellular embryos. This was necessary apply the drops, which contained medium and embryo, in a size which made it possible to adjust the desired dose of dye, i.e. for a dye dose of 1 [il the medium / embryo amount was 49 (U> with a dye dose of 2 (il accordingly 48 (iL. The embryos were stained at 37 ° C, pH 7.2 in a mixture of 5% CO2 in air. They were left in the colorant while they were being visualized. The cores and polar bodies of the unicellular mouse embryos were visualized using a Nikon Inverted Microscope DIAPHOT-TMP (Nikon) Nikon Epifluorescence Accessory No. TMD-ED, which uses a high pressure mercury vapor lamp and the UV filters used were obtained from Nikon. This system allowed the simultaneous visualization with light and fluorescence, so that it was possible to positively identify the fluorescence areas, such as the nuclei and polar bodies. All 66 embryos stained in this way showed certain fluorescence from both pre-nuclei and from at least one polar body within 15 minutes since the start of the stain, regardless of the dosage. Often only one polar body became visible, while the second polar body degenerated over time. Thereafter, 24 unicellular mouse embryos were stained in the same manner as described above using only the low dose (1 (il stain solution for 1 drop of 49 (il medium / embryo). Of these 24 embryos, 23 showed fluorescence within 5 Minutes after staining.
Beispiel II Example II
Die Arbeitsvorgänge von Beispiel I wurden wiederholt, wobei einzellige Hamsterembryonen und eine Dosierung von 10 fj.1 Färbemittellösung bei einem Gesamttropfenvolumen von 50 p.1 verwendet wurden. Der erste polare Körper zeigte nach 5 Minuten, nachdem er dem Färbemittel ausgesetzt war, eine Färbung. Die Vorkerne zeigten bis zu einer Einwirkungszeit von 30 Minu5 The procedures of Example I were repeated using unicellular hamster embryos and a dosage of 10 fj.1 colorant solution for a total drop volume of 50 p.1. The first polar body stained 5 minutes after being exposed to the colorant. The pronuclei showed an exposure time of up to 30 minutes
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
7 7
669 670 669 670
ten keine Fluoreszenz. Um eine vollständige Sichtbarmachung der beiden Vorkerne und wenigstens eines polaren Körpers in jedem Ei sichtbar zu machen, wurden bis zu 45 Minuten Einwirkungsdauer benötigt. Wie in Beispiel 1 wurden nicht immer beide polaren Körper angefärbt. no fluorescence. It took up to 45 minutes of exposure to make the two nuclei and at least one polar body visible in each egg. As in Example 1, both polar bodies were not always stained.
Beispiel III Example III
Die Arbeitsvorgänge von Beispiel I wurden wiederholt, wobei reife Rinderoocyten, einzellige und zweizeilige Embryonen verwendet wurden. Die Ovarien wurden aus einem Schlachthaus erhalten. Die Oocyten wurden aus den Follikeln abgesaugt. Die Cumuluszellen wurden vor dem Anfärben mit Hyaluronidase und Pipettieren, wie in Beispiel I, entfernt. Einige der gewonnenen Oocyten wurden, wie unten beschrieben wird, zum Anfärben und einige zur in vitro Befruchtung verwendet. Die Oocyten wurden während 24 Stunden bei 39° C in einem TALP-Nährmedium inkubiert und dann zusammen mit durch Ejakulation gewonnenem Bullensamen in TALP-Nährlösung zur Befruchtung inkubiert. Einzellige befruchtete Einzellen wurden nach der 24 Stunden dauernden Inkubation gewonnen, in DPBS-Gentamycin-Lösung gewaschen und erneut in frischer TALP-Nährlösung suspendiert. Zweizeilige Embryonen wurden in der gleichen Weise präpariert, wobei die Gewinnung nach 48 Stunden dauernder Inkubation mit Sperma und Nährlösung vorgenommen wurde. Danach wurden sie gewaschen und erneut in frischer Nährlösung suspendiert. The procedures of Example I were repeated using mature bovine oocytes, unicellular and biliary embryos. The ovaries were obtained from a slaughterhouse. The oocytes were aspirated from the follicles. The cumulus cells were removed before staining with hyaluronidase and pipetting as in Example I. Some of the oocytes obtained were used for staining as described below and some for in vitro fertilization. The oocytes were incubated for 24 hours at 39 ° C in a TALP nutrient medium and then incubated together with ejaculated bull semen in TALP nutrient solution for fertilization. Single-cell fertilized single cells were obtained after the 24-hour incubation, washed in DPBS-gentamycin solution and resuspended in fresh TALP nutrient solution. Two-line embryos were prepared in the same way, the recovery being carried out after 48 hours of incubation with sperm and nutrient solution. They were then washed and resuspended in fresh nutrient solution.
Für dieses Beispiel wurde eine Färbemittelstammlösung verwendet, welche 20 |tg Hoechst Nr. 33342 je ml DPBS enthielt. Die Arbeitsvorgänge von Beispiel I wurden wiederholt, wobei Färbemitteldosierungen von 2 |al und 5 |il Färbemittel je 50 (xl Gesamtvolumen/Medium-Embryo-Färbemittel verwendet wurden. Die Färbemittel-Kultur-Mischungen wurden bei 39° C inkubiert, auf Objektträgern befestigt und mit Deckgläsern abgedeckt. Die so hergestellten Präparate wurdén unter Umgebungsbedingungen sichtbar gemacht. Innerhalb von 30 Minuten, nachdem das Färbemittel zugegeben worden war, waren polare Körper sichtbar. Die Vorkerne der Oocyten und einzelligen Embryonen und die Kerne der zweizeiligen Embryonen waren nach 1 bis 2 Stunden oder mehr sichtbar. For this example a colorant stock solution was used which contained 20 tg Hoechst No. 33342 per ml DPBS. The procedures of Example I were repeated using doses of 2 | al and 5 | il stains of 50 (xl total volume / medium embryo stain). The stain-culture mixtures were incubated at 39 ° C, mounted on slides and The preparations thus prepared were visualized under ambient conditions. Within 30 minutes after the colorant had been added, polar bodies were visible. The nuclei of the oocytes and unicellular embryos and the nuclei of the two-line embryos were after 1 to 2 hours or more visible.
Die angefärbten Zellen wurden dann montiert, fixiert und geklärt, um eine Überprüfung des vorhandenen Chromatins zu ermöglichen. Die Objektträger mit den angefärbten Embryonen und Oocyten wurden in Entwicklerschalen, welche annähernd 40 ml Eisessig: Aethanol (1:3 (Volumen/Volumen)) untergebracht und über Nacht bei Raumtemperatur zur Klärung stehen gelassen. Chromatin wurde mit 1%-iger (Gewicht/Volumen) Aceto-Orceinlösung (1 % Orcein-Farbstoff in 40:60 Wasser-Essigsäurelösung) angefärbt. Das Chromatin wurde durch Lichtmikroskopie unter Verwendung einer Nemarsky- und Phasenoptik sichtbar gemacht. The stained cells were then assembled, fixed and clarified to allow the chromatin present to be checked. The slides with the stained embryos and oocytes were placed in developer dishes containing approximately 40 ml of glacial acetic acid: ethanol (1: 3 (volume / volume)) and left overnight at room temperature for clarification. Chromatin was stained with 1% (w / v) aceto-orcein solution (1% orcein dye in 40:60 water-acetic acid solution). The chromatin was visualized by light microscopy using Nemarsky and phase optics.
Es wurde gefunden, dass annähernd 15 % der Oocyten und frühen einzelligen Embryonen Metaphase-Platten oder Vorkerne enthielten, obgleich sie keine Fluoreszenz nach der Behandlung mit den bis-Benzimidazolfärbemittel zeigten. Bei den zweizeiligen Embryonen wurden keine Beispiele festgestellt, bei denen die Kerne keine Fluoresdzenz zeigten. Das Färbemittel ergab keinerlei falschen Positivwerte. Bei allen Embryonen, die eine Fluoreszenz zeigten, wurde festgestellt, dass sie Chromatin enthalten, wenn sie nach der zweiten Methode untersucht wurden. Das Chromatin war in einer der folgenden Form vorhanden: Approximately 15% of the oocytes and early unicellular embryos were found to contain metaphase plates or pronuclei, although they showed no fluorescence after treatment with the bis-benzimidazole stain. No examples were found in the two-line embryos in which the nuclei showed no fluorescence. The colorant showed no false positive values. All embryos that showed fluorescence were found to contain chromatin when examined by the second method. The chromatin was present in one of the following forms:
(1) Gestreute oder Metaphaseplatten für Oocyten (einschliesslich Keimbläschen bei unreifen Oocyten), (2) Vorkerne bei befruchteten Einzellen, (3) Zellkerne bei Embryonalzellen oder (4) verdichtete Spermienkopfteile, welche in den Oocyten eingedrungen waren, bei denen jedoch keine normale Dekon-densation zur Bildung des männlichen Vorkerns stattgefunden hatte. (1) Scattered or metaphase plates for oocytes (including vesicles in immature oocytes), (2) pre-nuclei in fertilized single cells, (3) cell nuclei in embryonic cells or (4) densified sperm head parts that had penetrated the oocytes, but in which no normal decon -densation for the formation of the male pronucleus had taken place.
Beispiel IV Example IV
Die grundlegenden Arbeitsvorgänge von Beispiel III wurden widerholt, wobei Schweineoocyten, einzellige befruchtete Eier und zweizeilige und vierzellige Embryonen verwendet wurden. Die Oocyten wurden von trächtigen Sauen durch chirurgische Spülung der Eileiter gewonnen und in TALP-Nährlösung suspendiert. Wie in Beispiel I wurde eine Färbemittelstammlösung von Hoechst Nr. 33342 mit einer Konzentration von 60 g/ml verwendet. Die Dosierungen betrugen 0,1 jxl, 5 |xl und 10 (j,l je 50 |xl Gesamtvolumen des Gemisches aus Medium, Embryo und Färbemittel. Diese Mischungen wurden während 3 Stunden bei 39° C inkubiert. Die Metaphaseplatten und polaren Körper der Oocyten, die nicht befruchtet worden waren, und die befruchteten Eier zeigten eine sehr ausgeprägte Färbung, während das Erscheinungsbild der Vorkerne weniger ausgeprägt war. Darüber hinaus zeigten Spermienkopfteile, die die umgebenden Schichten der Oocyten durchdrungen hatten, eine Fluoreszenz. Die Zellkerne zweizeiliger und vierzelligen Embryonen zeigten eine sehr ausgeprägte Fluoreszenz. Es wurde gefunden, dass eine Dosierung von 10 |il eine starke Hintergrundfärbung erzeugte. The basic procedures of Example III were repeated using pig oocytes, unicellular fertilized eggs and two-line and four-cell embryos. The oocytes were obtained from pregnant sows by surgically rinsing the fallopian tubes and suspended in TALP nutrient solution. As in Example I, a colorant stock solution from Hoechst No. 33342 was used at a concentration of 60 g / ml. The doses were 0.1 jxl, 5 | xl and 10 (j, l each 50 | xl total volume of the mixture of medium, embryo and colorant. These mixtures were incubated for 3 hours at 39 ° C. The metaphase plates and polar bodies of the oocytes that had not been fertilized, and the fertilized eggs showed a very pronounced coloration, while the appearance of the pronuclei was less pronounced, and sperm head parts that had penetrated the surrounding layers of the oocytes showed fluorescence, and the cell nuclei showed two-row and four-cell embryos very pronounced fluorescence, it was found that a dose of 10 μl produced a strong background staining.
Die angefärbten Zellen wurden montiert, fixiert und einer Klärung unterworfen, wie in Beispiel III beschrieben, mit der Ausnahme, dass sie in Eisessig/Äthanol während 48 Stunden einer Klärung unterworfen wurden. Die Ergebnisse waren ähnlich denjenigen in Beispiel III. Ungefähr 40 % der Oocyten und einzelligen Embryonen zeigten keine Fluoreszenz, obgleich keine falschen positiven Werte beobachtet wurden. Die vielzelligen Embryonen wurden routinenmässig mit dem Hoechst Färbemittel angefärbt. The stained cells were assembled, fixed and subjected to clarification as described in Example III, except that they were clarified in glacial acetic acid / ethanol for 48 hours. The results were similar to those in Example III. About 40% of the oocytes and unicellular embryos showed no fluorescence, although no false positive values were observed. The multicellular embryos were routinely stained with the Hoechst stain.
Beispiel V Example V
Die Entwicklung von Embryonen, welche dem Hoechst Färbemittel Nr. 33342 ausgesetzt waren, wurden unter Verwendung von Mäuseembryonen im zweizeiligen Stadium und in der Mo-rulaphase untersucht. Die Embryonen wurden in der gleichen Weise erhalten und zubereitet wie in Beispiel I beschrieben. Sie wurden mit 10 nl Dosen einer Färbemittellösung (Konzentration 20 ng/ml) was eine Dosierung von 0,2 (ig je 50 (xl des gesamten Tropfenvolumens ergab, angefärbt. The development of embryos that were exposed to Hoechst stain no. 33342 was examined using mouse embryos in the two-line stage and in the morula phase. The embryos were obtained and prepared in the same manner as described in Example I. They were stained with 10 nl doses of a colorant solution (concentration 20 ng / ml), which gave a dosage of 0.2 (ig 50 (xl of the total drop volume).
Die Embryonen wurden der Einwirkung des Färbemittels während 15 Minuten unterworfen. Danach wurden die Embryonen 3 Mal in DPBS-Gentamycin gewaschen und in Whitten's Medium gezüchtet. The embryos were exposed to the dye for 15 minutes. The embryos were then washed 3 times in DPBS-gentamycin and grown in Whitten's medium.
Von 26 zweizeiligen Mäuseembryonen, die der Einwirkung des Färbemittels ausgesetzt waren, entwickelten sich 16 oder 65% bis zur Morulaphase. Dies steht im Vergleich mit 21 von 26 Kontrollversuchen (80 %) bei denen die Embryonen keinem Färbemittel ausgesetzt wurden, d.h. sie wurden während 15 Minuten mit einer Dosis von 10 1 DPBS allein inkubiert. Of 26 two-line mouse embryos that were exposed to the stain, 16 or 65% developed to the morula phase. This compares to 21 out of 26 control experiments (80%) in which the embryos were not exposed to any stain, i.e. they were incubated for 15 minutes with a dose of 10 1 DPBS alone.
Wenn in der Morulaphase befindliche Embryonen dem Färbemittel ausgesetzt wurden, entwickelten sich 23 von 44 (51 %) zu Blastocyten. Die Kontrollversuche (DPBS allein) zeigten eine Entwicklung zu Blastocyten von 23 von 31 (74 %). When embryos in the morula phase were exposed to the stain, 23 out of 44 (51%) developed into blastocytes. The control experiments (DPBS alone) showed a development to blastocytes of 23 out of 31 (74%).
Beispiel VI Example VI
Die grundlegenden Arbeitsgänge von Beispiel I wurden wiederholt, wobei Färbemittelstammlösungen (Hoechst Nr. 33258) von 10 |ig je ml und 20 |ig je ml verwendet wurden, um einzellige Mäuseembryonen anzufärben. Die Dosierungen betrugen 0,5 Hl und 10 nl auf ein Gesamtvolumen Medium-Embryo-Färbe-mittelpräparat von 50 jj.1. Die Embryonen wurden unter Umgebungsbedingungen während einer halben Stunde angefärbt, bevor sie untersucht wurden. Die Vorkerne und polaren Körper zeigten eine Fluoreszenz und wurden mittels Lichtmikroskopie wie in Beispiel I positiv identifiziert. Es wurde gefunden, dass die Dosis von 10 p.1 dieses Färbemittels nicht routinemässig eine Überfärbung oder Hintergrundfärbung verursachte. The basic procedures of Example I were repeated using stock dye solutions (Hoechst No. 33258) of 10 mg per ml and 20 mg per ml to stain single-cell mouse embryos. The doses were 0.5 Hl and 10 nl for a total volume of medium-embryo stain preparation of 50 years 1. The embryos were stained under ambient conditions for half an hour before being examined. The pronuclei and polar bodies showed fluorescence and were positively identified by means of light microscopy as in Example I. It was found that the 10 p.1 dose of this stain did not routinely cause overstaining or background staining.
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
669 670 669 670
Beispiel VII Example VII
Rinderspermatozoen wurden mit Hoechst Färbemittel Nr. 33342 angefärbt, um die Spermienbeweglichkeit und die Spurenmuster zu untersuchen. Frisch ejakulierte Bullensamen wurden mit DPBS gewaschen und zentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden in TALP-Medium suspendiert und der Einwirkung einer Färbemittelstammlösung (Hoechst Nr. 33342) mit einer Konzentration von 20 |Xg/ml und einer Dosierung von 3 fxl/50 fxl ausgesetzt. Die Mischung aus Medium, Sperma und Färbemittel wurde während 15 Minuten bei 39°C inkubiert und beobachtet. Bovine spermatozoa were stained with Hoechst stain no. 33342 to investigate sperm motility and trace patterns. Freshly ejaculated bull seeds were washed with DPBS and centrifuged. The resulting pellets were suspended in TALP medium and exposed to a colorant stock solution (Hoechst No. 33342) with a concentration of 20 | Xg / ml and a dosage of 3 fxl / 50 fxl. The mixture of medium, sperm and colorant was incubated at 39 ° C. for 15 minutes and observed.
Nach dem Anfärben wurden die fluoreszierenden Spermien unter Verwendung des Nikon Fluoreszenzsystems, beschrieben in Beispiel I, sichtbar gemacht. Im optischen System des Mikroskops wurde eine Kamera verwendet, um farbige Zeitraffer-photographien bei Expositionszeiten von 10 bis 20 Sekunden aufzunehmen. Die durch die fluoreszierende DNS erzeugten Spuren auf den entwickelten Photographien wurden analysiert, um Geschwindigkeit und Muster der Spermienbeweglichkeit zu analysieren. Die Arbeitsweise wurde wiederholt, wobei Cumu-lus-Oocyten-Komplexe dem Medium beigefügt wurden. Die erhaltene Photographie wurde analysiert, um die Wirkung dieser Zellen auf Spermienbeweglichkeit, -geschwindigkeit und -mu-ster festzustellen. After staining, the fluorescent sperm were visualized using the Nikon fluorescence system described in Example I. A camera was used in the optical system of the microscope to take colored time-lapse photographs at exposure times of 10 to 20 seconds. The traces created by the fluorescent DNA on the developed photographs were analyzed to analyze the speed and pattern of sperm motility. The procedure was repeated with cumulus-oocyte complexes added to the medium. The photograph obtained was analyzed to determine the effect of these cells on sperm motility, speed and pattern.
Beispiel VIII Example VIII
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um die Spaltung in Schweineembryonen verschiedener Phasen zu beobachten. Die Embryonen wurden aus den Fortpflanzungswegen von Sauen mit übermässig rascher Ovulation 48 bis 120 Stunden nach dem Einsetzen der Brunst gewonnen. Die Fortpflanzungswege wurden nach dem Schlachten gewonnen und im Laboratorium zum Entfernen der Embryonen gewaschen. Die so gewonnenen Embryonen lagen als einzellige Embryonen (48 Stunden) bis zu This example was carried out to observe the cleavage in pig embryos of different phases. The embryos were obtained from sows' reproductive pathways with excessively rapid ovulation 48 to 120 hours after the onset of oestrus. The reproductive pathways were obtained after slaughter and washed in the laboratory to remove the embryos. The embryos obtained in this way were up to 48 hours as single-cell embryos
, vielzelligen Morula-Embryonen (120 Stunden) vor. Nach zweimaligem Waschen in einer DPBS-BSA-Lösung, wurden die Embryonen entweder in Whitten's Medium (Kontrollversuch) kultiviert oder angefärbt und dann in Whitten's Medium kultiviert. 5 Für dieses Beispiel wurde die Färbemittelstammlösung (Hoechst Nr. 33342) mit einer Konzentration von 60 |i.g/ml verwendet. Die Embryonen wurden während einer Stunde bei 39° C in 1,5 oder 10 |il Färbemittellösung je 50 (j.1 inkubiert. Danach folgten drei je 30 Minuten dauernde Waschungen in sau-10 berem DPBS (1,5 mg/BSA/ml). Die gewaschenen Embryonen wurden während 24 Stunden in Whitten's Medium (1,5 mg/ BSA/ml) kultiviert und dann ausgewertet, um das Entwicklungsstadium festzustellen (Vollendung der Spaltungsteilung). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. , multicellular morula embryos (120 hours). After washing twice in a DPBS-BSA solution, the embryos were either cultured in Whitten's medium (control experiment) or stained and then cultured in Whitten's medium. 5 The colorant stock solution (Hoechst No. 33342) with a concentration of 60 | i.g / ml was used for this example. The embryos were incubated for one hour at 39 ° C. in 1.5 or 10 μl of staining solution 50 (each 1). This was followed by three washes in clean DPBS (1.5 mg / BSA / ml The washed embryos were cultured in Whitten's Medium (1.5 mg / BSA / ml) for 24 hours and then evaluated to determine the stage of development (completion of division), and the results are shown in Table 1.
15 15
TABELLE I TABLE I
Phase Dosis Phase dose
20 20th
Kontroll Control
1 ßl 1 ßl
5ßl lOfil 5 tablespoons of fil
versuch attempt
l-2-zellig l-2 cell
6/12(50%) 6/12 (50%)
- -
2/14(14%) 1/12(8.3%) 2/14 (14%) 1/12 (8.3%)
4-zellig 4-cell
28/36(77%) 28/36 (77%)
17/27(62%) 17/27 (62%)
14/37(37%) 14/37 (37%)
vielzellig multicellular
15/16(94%) 15/16 (94%)
- -
13/23(56%) 13/23 (56%)
25 25th
Die Prinzipien, bevorzugten Ausgestaltungen und Arbeitsweisen entsprechend der vorliegenden Erfindung, sind im vor-30 hergehenden beschrieben worden. Die beschriebenen Ausführungsformen dienen jedoch nur zur Erläuterung der Erfindung in nicht einschränkender Weise. Abwandlungen und Änderungen liegen im Bereich fachmännischen Könnens, ohne vom Erfindungsgedanken abzuweichen. The principles, preferred embodiments, and operations according to the present invention have been described in the foregoing. However, the described embodiments serve only to explain the invention in a non-restrictive manner. Modifications and changes are within the range of expert skill without deviating from the inventive idea.
v v
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