WO2014112898A1 - КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РЕЦЕПТОРОМ CD16a - Google Patents

КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РЕЦЕПТОРОМ CD16a Download PDF

Info

Publication number
WO2014112898A1
WO2014112898A1 PCT/RU2014/000015 RU2014000015W WO2014112898A1 WO 2014112898 A1 WO2014112898 A1 WO 2014112898A1 RU 2014000015 W RU2014000015 W RU 2014000015W WO 2014112898 A1 WO2014112898 A1 WO 2014112898A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
dihydro
trioxo
modified protein
thiazepine
Prior art date
Application number
PCT/RU2014/000015
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Викторович ДЕМИН
Сергей Евгеньевич ТКАЧЕНКО
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Биоинтегратор" (Ооо "Биоинтегратор")
Алла Хем, Ллс
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Биоинтегратор" (Ооо "Биоинтегратор"), Алла Хем, Ллс filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Биоинтегратор" (Ооо "Биоинтегратор")
Priority to CA2897629A priority Critical patent/CA2897629A1/en
Priority to CN201480003529.7A priority patent/CN104870428A/zh
Priority to AU2014207918A priority patent/AU2014207918B2/en
Priority to EP14740983.3A priority patent/EP2947074A4/en
Priority to KR1020157020861A priority patent/KR20150109383A/ko
Priority to EA201500506A priority patent/EA028617B1/ru
Priority to JP2015553677A priority patent/JP2016505629A/ja
Priority to US14/652,521 priority patent/US20150368261A1/en
Publication of WO2014112898A1 publication Critical patent/WO2014112898A1/ru

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/12Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D495/14Ortho-condensed systems
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/55131,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/55171,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/554Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having at least one nitrogen and one sulfur as ring hetero atoms, e.g. clothiapine, diltiazem
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1725Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a or C5a
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21Interferons [IFN]
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44Antibodies bound to carriers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545Heterocyclic compounds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • A61P35/02Antineoplastic agents specific for leukemia
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/04Immunostimulants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D281/00Heterocyclic compounds containing rings of more than six members having one nitrogen atom and one sulfur atom as the only ring hetero atoms
    • C07D281/02Seven-membered rings
    • C07D281/04Seven-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 4
    • C07D281/08Seven-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 4 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D281/12Seven-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 4 condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with two six-membered rings
    • C07D281/16[b, f]-condensed
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555Interferons [IFN]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the invention relates to medicine, in particular to oncology and immunology, to new compounds that bind to the CD16a receptor and their modified proteins (conjugates) used to induce gel-dependent cellular cytotoxicity and thus remove from the body a specific target i pyrnibi cells, for example, cancer cells or ayuimmune lymphocytes.
  • the invention also relates to a method for producing conjugates, pharmaceutical compositions and drugs. containing modified proteins (conjugates) for the treatment of cancer and autoimmune diseases.
  • the Fcyllla receptor belongs to the group of receptors responsible for the binding of Fc-fragmentite antibodies.
  • CD16a is extirpated on the surface of ⁇ -cells (killers) and macrophages and is responsible for the induction of antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), interacting with 1 ; a c-fragment of a cell-bound antibody.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • anopuse is one of the main mechanisms for the destruction of cancer cells from the body.
  • autoimmune diseases mediated by autoantibodies such as autoimmune polyendocrinopathy of the first type, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia, hemolytic disease of the newborn, and so on. That is, antibody-dependent cellular cytotoxicity can play both a positive and negative role in the development of pathological processes in the human body.
  • Autoimmune diseases are a group of diseases that develop as a result of the development of an immune response against healthy tissues of the body and lead to damage to these tissues.
  • immunosuppressants are used to treat autoimmune diseases, suppressing the body's immune system as a whole. Selectively suppressing an autoimmune response would allow the existing I BCHHO to reduce the incidence of treatment side effects.
  • Antibodies have long been used for targeted destruction of cancer cells. Examples include rituximab, trastuzumab. tseguximab and many other antibodies that have targets on the surface of cancer cells and act through compliment-dependent cytotoxicity and antibody-dependent cellular pitotoxicity.
  • ADC conjugate antibody-drug
  • Such conjugates provide targeted drug delivery to tumors and their accumulation inside cells, adding to the cytotoxic effect of antibodies the antitumor activity of cytotoxic or cytostatic drugs.
  • Examples of such conjugates are trastuzumab-DMl, an enhanced version of trastuzumab (Herceptin) (WO 201 169074) and a series of conjugates with auris gathia P (US 20120003248).
  • An alternative direction was the strengthening of the intrinsic cytotoxicity of antibodies by enhancing the interaction with receptors that cause cytotoxicity.
  • Roche has developed an obiputuzumab antibody with enhanced binding to the CD16a receptor. This effect is achieved by engineering glycosylation of antibodies.
  • Obinutuzumab has dozens of times stronger antibody-dependent cell cytotoxicity (WO 2005044859, HA 01 009).
  • Antibody-dependent cellular cytotoxicity is one of the main mechanisms of the cytotoxic effect of antibodies that bind to the antigen on the surface of the target cell via variable domains, while the constant part binds to the CD16a receptor on the surface of killer cells.
  • This intercellular contact leads to the secretion by killers of hierforins and granzymes.
  • the former form pores in the cell membrane of the target cell, while the latter activate caspases and other apoptosis molecules.
  • the CD 16a receptor is a member of a large family of Fc receptors that bind to the constant domain of an antibody and differ in localization, function, and affinity for the constant domain.
  • Alkyl means an aliphatic hydrocarbon linear or branched group with 1-12 carbon atoms in the chain. Branched means that the alkyl chain has one or more lower alkyl substituents.
  • Alkyl may have one or more identical or different substituents (“alkyl substituents”) including halogen, alkenyloxy, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, terocyclyl, aroyl, cyano, hydroxy, alkoxy, carboxy, alkynyloxy, aralkoxy, aryloxy, aryloxycarbnyl, alkylthio, hsteroaryl , aralkylthio, arylsulfonyl, alkylsulfoyl heteroaralkyloxy, anelated heteroarylcycloalkenyl, annelated heteroarylcycloalkyl, anelated heteroaryl heterocyclyl, anelated heteroaryl heterocyclyl,
  • annelated arylcycloalkyl annelated arylheroheoykenyl, annelated arylheterocyclyl, alkoxycarbonyl, aralkoxycarbopil, heteroaralkyloxycarbonyl or R k a R k fi a N-, R k a R k + i a NC ( ⁇ 0) -. R k a R k + t ⁇ NC (-S) -.
  • R k a R k + i a NS0 2 - where R k a and R + i d independently represent a “kneading amino groups ”, the meaning of which is defined in this section, for example, hydrogen aum, alkyl, aryl, aralkyl, hetroaral, il, heterocyclyl or heteroaryl, or R k + i a together with the N atom to which they are bonded form through R ⁇ ' 1 and R k + i J 4 - 7 membered heterocyclyl or heterocyclenyl.
  • Preferred alkyl groups are methyl, trifluoromethyl, cyclopropylmethyl, cyclopentylmethyl, egyl, n-nropyl, iso-iropyl, n-butyl, tert-butyl, n-pentyl, 3-pent pentyl, methoxyethyl, carboxymethyl, methoxycarbonylmethyl, ethoxycarbonylmethylmethyl yuxycarbonylmethyl and pyridylmethyloxycarbonylmethyl.
  • Alkyl means C n H 2 n + iNH - or (C n H 2n + i) (C n Il 2n + i) N - group in which alkyl is defined in this section.
  • Preferred alkylamino groups are methylamino, ethylamino, n-propylamino, iso-propylamino and n-butylamino.
  • “Ash Itelo” is a protein (immunoglobulin) synthesized by B-lymphocytes in the body in response to the ingestion of a foreign substance into it and having a specific affinity for this substance. They are an important factor in specific humoral immunity. Antibodies perform two functions: antigen-binding and effectorpuyu (cause one or another immune response).
  • “Autoantigens” - free molecules of substances or molecules in the composition of cells, organs and tissues, which are recognized under certain conditions by the immune system as foreign and, in connection with it, cause a cellular or humoral immune response from their body. These are, as a rule, normal proteins or protein complexes (as well as protein complexes with DNA or RNA), which are recognized by the immune system in patients with autoimmune diseases. Such antigens should not normally be recognized by the immune system, but due to genetic factors or environmental conditions, immunological tolerance to such antigens may be lost.
  • the so-called natural autoantigens can possess the properties of autoan gigens.
  • proteins the synthesis of which begins after the maturation of the immune system (sperm, milk); macromolecules of organs separated from the immune systems with a histohsmatic barrier; macromolecules in the nucleus and cytoplasm of cells; macromolecules with the presence of new foreign determinia and pynn due to the action of endogenous (immune complexes, necrosis, inflammation) or exogenous (temperature, chemicals, including drugs, microbes and their toxins, viruses, etc.) factors; embryonic proteins with renewable synthesis under certain conditions (for example, with tumors).
  • autoimmune diseases include, in particular, autoimmune polyendocrinopathy of the first type, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia, hemolytic disease of newborns, multiple sclerosis, autoimmune thyroiditis, etc.
  • Autoimmunity is a process and related diseases caused by the acquisition by the immune system of the ability to recognize the body's own antigens (autoantigens) and to respond to them by the formation of autoantibodies or autoimmune T lymphocytes.
  • An autoimmune process is a process and related diseases, the basis of which is tissue damage due to the effects of the interaction of autoantibodies or autoimmune T lymphocytes with autoantigens.
  • “Onyugag” is a protein modified with chemical compounds, an al igen, or an antibody. Conjugate formation is one of the important stages of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). During the formation of the conjugate, such an optimal method of introducing the chemical compound is selected so that the conjugate component, antigen or antibody, retains its biological activity — atheininity and antigen binding activity, respectively. The ability of foreign compounds and metabolites to enter conjugation reactions depends on the presence of certain functional groups in their molecules.
  • “Medicinal product (preparation)” a substance (or a mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition), in the form of tablets, capsules of injections, ointments and other goyuv forms intended for the restoration, correction or change of physiological functions in humans and animals, as well as for the treatment and prevention of diseases, diagnostics, anesthesia, contraception, cosmetology and other things.
  • “Receptors” (from the Latin recipere - to receive, to recognize) are biological macromolecules located on the cytoplasmic membrane of the cell or intracellular, capable of specifically interacting with a limited set of physiologically active substances (ligands) and transforming the basis of this interaction into a specific cellular answer.
  • Solna 1 s products of the addition of a solvent to dissolved substances; a special case of solvates is hydrates (solvent is water). Usually, solvags are formed in solution, but often (upon cooling the solution, evaporating a solution of 1 spruce, etc.) they can be obtained in the form of crystalline phases - crystalline solvates.
  • “Pharmaceutical composition” means a composition comprising an active component (modified protein) and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, solvents, diluents, carriers, excipients, distributing and perceiving means of delivery, such as preservatives, stabilizers, fillers, grinders, moisturizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, ⁇ spruce sweeteners, perfumes, flavor ators, antibacterial agents, fungicides, lubricants, prolonged delivery regulators, the choice and ratio of which depends on the nature and method of administration and dosage.
  • pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients such as preservatives, stabilizers, fillers, grinders, moisturizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, ⁇ spruce sweeteners, perfumes, flavor ators, antibacterial agents, fungicides, lubricants, prolonged delivery regulator
  • suspending agents examples include ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene, sorbitol and sorbitol ether, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar agar and tragacanth, as well as mixtures of these substances. Protection against the action of microorganisms can be provided with a variety of antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, sorbic acid and the like.
  • the composition may also include isocyanic agents, for example, sugars, sodium chloride and the like.
  • the prolonged action of the composition can be achieved using agents that slow down the absorption of the active principle, for example, aluminum monostatsarate and gelatin.
  • suitable carriers, solvents, diluents and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols, and also mixtures thereof, vegetable oils (such as olive oil) and injectable organic esters (such as tyloleate).
  • excipients are lactose, milk sugar, sodium citrate, calcium carbonate, calcium phosphate and the like.
  • choppers and dispensers are 1 starch. alginic acid and its salts, silicates.
  • lubricants are magnesium ci eapaT, sodium lauryl sulfate, talc, and high molecular weight polyethylene glycol.
  • a pharmaceutical composition for oral, sublingual, trandermal, intramuscular, intravenous, subcutaneous, local or rectal administration of the active principle, alone or in combination with another active principle, can be administered to animals and humans in a standard administration form, in the form of a mixture with traditional pharmaceutical carriers .
  • Suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, gelatine capsules, pills, powders, granules, chewing gums and oral solutions or suspensions, sublingual and traysbuccal administration forms, aerosols, implants, local, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous intranasal or intraocular administration forms and rectal administration forms.
  • Pharmaceutical compositions are generally prepared using standard procedures involving the mixing of the active compound with a liquid or finely divided solid carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable salt” means the relatively non-toxic organic and inorganic salts of the acids and bases of the present invention. These salts can be obtained in situ during the synthesis process. Isolation or purification of compounds or specially prepared. In particular, base salts can be prepared on the basis of the purified free base of the claimed compound and a suitable organic or inorganic acid. Examples of salts thus obtained are hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, bisulfates, phosphates, nitrates, acetates, oxalates, valsriates, oleates, and almitates.
  • Salts of the claimed acids can also be specially prepared by reaction of the purified acid with a suitable base, and metal and amine salts can be synthesized.
  • the metal salts include nafia, potassium, calcium, barium, zinc, magnesium, lithium, and aluminum, the most desirable of which are sodium and potassium salts.
  • Suitable inorganic bases from which metal salts can be obtained are hydroxide, carbonate, bicarbonate and nafium hydride, hydroxide and potassium bicarbonate, potash, lithium hydroxide, calcium hydroxide, maple hydroxide, zinc hydroxide.
  • organic bases from which salts of the claimed acids can be obtained amines and amino acids having an additional atomic basicity to form a stable salt, and suitable for medical use (in particular, they must have low toxicity) are selected.
  • Such amines include ammonia, methylamine, dimethylamine, three methylamine, n) guides n, diethylamines, triethylamine, bepsilamine, dibepsilamip, dicycloxylamino, iierazia, ethylpiperidine, tris (hydroxymethyl) aminomegan and the like.
  • tetraalkylammonium hydroxides for example, such as choline, trimethylammonium, tetraethylammonium and the like, can be used for salt formation.
  • amino acids the main amino acids can be used - lysine, ornithium and arginine.
  • An object of the present invention is to provide novel compounds and their modified proteins (conjugates) capable of interacting with the CD16a receptor used to induce antibody-dependent cellular cytotoxicity and thus remove a specific target group of cells, e.g., cancer cells or autoimmune lymphocytes, from the body.
  • conjugates capable of interacting with the CD16a receptor used to induce antibody-dependent cellular cytotoxicity and thus remove a specific target group of cells, e.g., cancer cells or autoimmune lymphocytes, from the body.
  • R1 represents (CH 3 ) 2 N-
  • R3 as a terminal substituent is unsubstituted aminoalkyl
  • a R4 represents H or CgC 3 alkyl.
  • R1 represents (SIc) 2 M or
  • More preferred compounds are:
  • the subject of this invention is a modified protein that is active against the CD16a receptor, co-encoded with a modifying compound having an affinity for the CD16a receptor selected from a compound of general formula 1 or 2.
  • a modified protein (konogat) active against the CD16a receptor obtained by reacting the protein with a modifying compound of general formula 1 or 2.
  • a modified protein derived from an antibody and a compound of general formula 1 or 2, wherein the antibody is rituximab, trastuzumab, or cetuximab.
  • a modified protein Kerat, which is rituximab modified with a compound of the general formula 1 or 2.
  • a modified protein Koin.iora i
  • trastuzumao modified with a compound of general formula 1 or 2.
  • a more preferred is also a modified protein (konyogat), which is cetuximab modified with a compound of the general formula 1 or 2.
  • a modified protein which is interferon alpha, modified by a compound of the general formula 1 or 2.
  • a modified protein (konyogat), which is the main myelin protein modified with a compound of the general formula 1 or 2.
  • a more preferred is also a modified protein (konyogat), which is a Clq compliment protein modified with a compound of general formula 1 or 2.
  • the subject of this invention is also a method for producing a modified protein (conjugate) according to which the protein is reacted with a compound of the general formula 1 or 2 dissolved in an organic solvent, for example, dimethyl sulfoxide, in the range of molar ratio from 1: 3 to 1: 100 in phosphate medium saline buffer solution (pH 7.4) at room temperature with constant stirring.
  • an organic solvent for example, dimethyl sulfoxide
  • a subject of the present invention is also a pharmaceutical composition active against the CD16a receptor, containing a therapeutically effective amount of a modified protein (konogat) and a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient.
  • Pharmaceutical compositions may include pharmaceutically acceptable ⁇ zhstsipisnty.
  • pharmaceutically acceptable excipients is meant pharmaceutical diluents, excipients and / or carriers.
  • the pharmaceutical composition, along with a modified protein (conjugate) obtained by reacting a protein with a modifying compound of the general formula 1 or 2, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, of the present invention may include other active substances, including those having anti-influenza activity, provided that they do not cause unwanted effects.
  • the carriers used in the pharmaceutical compositions of the present invention are carriers that are used in the pharmaceutical field to produce common forms, including oral, injection, and local forms.
  • the subject of this invention is also a medicament active in relation to the CD 16a receptor, in the form of tablets, capsules or injections, placed in a pharmaceutically acceptable package intended for the treatment of diseases caused by pathological cells, including a new modified protein (conjugate), or a new pharmaceutical composition in a therapeutically effective amount.
  • a pharmaceutically acceptable package intended for the treatment of diseases caused by pathological cells, including a new modified protein (conjugate), or a new pharmaceutical composition in a therapeutically effective amount.
  • the conjugates of the present invention can be used to treat the same diseases for which iconjugated mopoclonal antibodies are used as drugs of such like, low-grade or follicular non-Hodgkin's lymphoma, breast cancer. It is also known that the activity of antibodies against the CD 16a receptor is used to treat autoimmune or oncological diseases (RL Ferris, et al. J. Clinical Oncology, 2010, Oct 1, Vol. 28, No. 28: 4390-4399), including such as lymphoma (K.-N. Heider, et al.
  • the subject of the invention is a method of treating diseases caused by pathological cells that can be treated by indirect effects on CD 16a receptor, according to which a subject is administered therapist nical ⁇ an effective amount of the modified protein (conjugate) or pharmaceutical composition or medicament active towards CD 16a receptor.
  • a preferred method is the treatment of autoimmune or oncological diseases defined above in this section, including such as lymphoma. lymphatic leukemia or breast cancer.
  • Medicines may be administered orally or parenterally (e.g., intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically).
  • the clinical dosage of the modified protein (conjugate) or pharmaceutical composition or drug that is active against the CD 16a receptor in patients can be adjusted depending on the therapeutic effective in and bioavailability of the active ingredients in the body, their metabolic rate and excretion, and also depending on the age, sex and stage of the patient’s disease, while the daily dose in adults is usually 300 ⁇ 1200 mg, preferably 500 ⁇ 1000 mg in the case when the protein in the conjugates is It is ashtelo, and 0.01 ⁇ 100 mg, preferably 0.1 ⁇ 10 mg, when the protein in the conjugate is an autoantigen.
  • FIG. 1 Proton Math Resonance Spectrum (PMR Spectrum) 2.5-dioxopyrrolidin-1-yl ether (3-chlorobspzil) -5.5, 1 1 -trioxo-10, 1 1 -dihydro-5 // - dibenzo [0, /
  • FIG. 2 NMR spectrum of 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ether (4- ⁇
  • FIG. 3 PMR spectrum of 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ether 4 - ⁇ [10- (3-chlorobenzyl) -5.5, 1 1-trioxo-10.1 1-dihydro-5H-dibenzo [/>, / ] [1, 4] thiazepip-7-carbonyl] - amino ⁇ phenylcarboxylic acid 1 (3).
  • FIG. 4 LCMS spectrum of 2,5-dioxo-pyrrolidip-1-yl ether 3- [8- (3,4-dimethoxyphenylcarbamoyl) -5,5,1 1 -trioxo-5,1 1-dihydro-5J-dibenzo [6 ,
  • FIG. 6 NMR spectrum of 10- (3-chlorobenzyl) -5.5, 1 1 -trioxo-10, 1 1-dihydro-5 // - dibenzo [b, ⁇ [1, 4] thiazepine-8-carboxylic acid (2 -aminoethyl) -amide 1 (6).
  • FIG. 7 PMR spectrum of 10- ⁇ 4 - [(2-amipo-egylcarbamoyl) methyl] benzyl ⁇ -5.5, 1 1-trioxo-10.1 1-dihydro-5 // - dibenzo [b, 1] [1,4] thiazepi11-8-carboxylic acid of [3- (4-bsnzil-11 and pery din-1-yl) -propyl] -amide 1 (7).
  • FIG. 8 PMR spectrum of 2- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl) -tyl ether 10- (3-chlorobenzyl) -5.5.1 1 -trioxo-10.1 1- dihydro-5 // - dibenzo [b, 1] [1, 4] thiazspin-8-carboxylic acid 1 (8).
  • FIG. 9. PMR spectrum 10- (4 - ⁇ [2- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl) -ethylcarbamoyl] methyl ⁇ bsnzil) - 5.5.1 1 -trioxo - 10.1 1-dihydro-5H-dibenzo [b, 1] [1,4] thiazepine-8-carboxylic acid [3- (4-benzyl-piperidium-1-yl) propyl
  • FIG. 10 NMR spectrum of the compound L g - [2 - ( ⁇ L- (Me1 hydroxycarbonyl) -L ⁇ - [(1, 5-dimesoxy-1, 5-dioxopentan-2-yl) carbamoyl] -P-alanyl ⁇ amino) ethyl] - 10- (3-chlorobenzyl) -5.5, 1 1 - I dioxo-10.1 1-dihydrodibenzo [6
  • FIG. 11 NMR spectrum of the compound L g - [2 - ( ⁇ L- (Me1 hydroxycarbonyl) -L ⁇ - [(1, 5-dimesoxy-1, 5-dioxopentan-2-yl) carbamoyl] -P-alanyl ⁇ amino) ethyl] - 10- (3-chlorobenzyl) -5.5, 1 1 - I dioxo-10.1
  • FIG. 13 NMR spectrum of 4- [4- (dimethylamino) phenyl] -L g - (4- ⁇ 2 - [(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) oxy] -2-oxoethoxy ⁇ phenyl) -7.8, 9, 10-tetrahydro-4 // - [1] be11othieno [3,2-] pyrrolo [1, 2-a] [1, 4] diazepin-5 (6 //) - carboxamide 2 (2).
  • FIG. 14 LCMS spectrum of 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N- [4- (5- ⁇ [(3,4-dimethoxyphenyl) amino] carbonyl ⁇ -5,6,7,8,9,10-hexahydro 4 // - [1] benzothieno [3.2- /] 11irrolo [1,2-a] [1,4] diazepin-4-yl) phenyl] -L g- methylglycinate 2 (3).
  • FIG. 15 Chromatogram of conjugate P1 (1), on a TSK GEL SUPER SW3000 column.
  • Fig 16. Immuno-enzyme assay (ELISA) of the binding of rituximab conjugates to the CD 16a receptor. Dependence of optical density at a wavelength of 450 nm on the concentration of the conjugate introduced into ELISA.
  • Fig 17. Immuno-enzyme assay (ELISA) of binding of interferon (I) and KI1 conjugate (1) to the CD 16a receptor. Dependence of optical density at a wavelength of 450 nm on the concentration of the conjugate introduced into ELISA.
  • FIG. 18 Comparison of the efficacy of rituximab (P) and conjugate KP1 (1) in honor of antibody-dependent cytotoxicity.
  • FIG. 19 Comparison of the efficacy of rituximab (P) and conjugate P1 (2) in iccic antibody-dependent cytotoxicity.
  • Fig 20 Immuno-enzyme assay (ELISA) of the binding of rituximab (P). trastuzumab (T) and their conjugates KP1 (7), KT1 (7) by fire retardation to the CD 16a receptor.
  • ELISA Immuno-enzyme assay
  • Compound 5 was obtained in a yield of 70%. 50 g of compound 5 are dissolved in 500 ml of aqueous ammonia, dissolved and 80 g of dithionite are added in portions, after which the reaction mixture is refluxed for 1 hour. Then the reaction mixture is cooled, ammonia is evaporated on a steam evaporator and the aqueous solution is acidified with conc. hydrochloric acid to pi I – 1, stirred for 1 h, filtered the precipitate, washed with water, dried. Compound 6 was obtained in 60% yield. 45 g of compound 6 are added portionwise to 200 ml of polyphosphoric acid at 50 ° C, after which it is stirred for 10 hours at 90 ° C.
  • Extract 3x150 ml of aegilacetag the combined extracts are washed with concentrated Nal IC0 3 solution, dried, the solvent is evaporated on a rotary evaporator. Get the product 14 with a yield of 75%.
  • 1.9 g of compound 11 and 0.87 g of compound 14 are mixed in 50 ml of dioxane. They are stirred for 1 h, after which 1.2 ml of triethylamine and 0.89 g of phosphorus oxychloride are added. Stirred for 3 hours at 50 ° C, add 150 ml of water, the precipitated precipitate was filtered, washed with water, and dried. Get product 15 with a yield of 60%.
  • a mixture of 10.0 g of p-tolyluacetic acid, 13.0 g of N-bromosuccinimide and 0.1 g of 2,2'-azabisisobutyronitrile in 60 ml of carbon tetrachloride is refluxed for 4 hours.
  • the mixture is cooled to room temperature, poured into 100 ml of water, the precipitate is filtered off, sushag. It is dissolved in 50 ml of ethanol, 3.7 ml of thionyl chloride are added at 0 ° C, stirred overnight at room temperature, the solvent is evaporated.
  • the product is purified by column chromatography in the system choroform-methanol-triethylamine 10-1 - 1.
  • Receive compound 33 with a yield of 15%. 180 mg of compound 33 is dissolved in 20 ml of THF, 47 mg of ⁇ -hydroxysukiinimide and 84 mg of dipylohexylcarbodiimide are added with stirring under argon atmosphere. The mixture is stirred overnight at room temperature. the temperature is night, after which the precipitate is filtered off, the solution is evaporated, and flash chromatography is carried out on silica gel (eluate ethyl acetate). Compound 1 (5) was obtained in a yield of 50%. The PMR spectrum of compound 1 (5) is shown in FIG. 5.
  • Example 7 10- ⁇ 4 - [(2-amino-ethylcarbamoyl) methyl] benzyl ⁇ -5.5, 1 1 -trioxo-10, 1 1 - dihydro-5H- dibenzo [b, 1] [1, 4] thiazepine-8-carbopa sour ⁇ s [3- (4-bsnzil-pipsridi n-1 - yl) -propyl] -amide 1 (7) is prepared according to the following Scheme 7.
  • Example 9 10- (4 - ⁇ [2- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl) -gilcarbamoyl] methyl ⁇ benzyl) -5.5, 1 1 -trioxo 10, 1 1-dihydro-5 // - dibenzo [b, 1] [1, 41 hyazepine-8-carboxylic acid [3- (4-benzyl-piperidin-1-yl) -propyl] -amide 1 (9) receive according to the following Scheme 9.
  • Example 10 ⁇ Y- [2 - ( ⁇ L ⁇ - (Methoxycarbooyl) -L g - [(1, 5-dimethoxy-1, 5-dioxopsntan-yl) carbamoyl] -P-alanyl ⁇ amino) ethyl] -10 - (3-chlorobenzyl) -5.5, 1 1 -trioxo-10, 1 1-dihydrodibenzo [0. ] [1,4] thiazepine-7-carboxamide 1 (10) is prepared according to the following Scheme 10.
  • Hydrochloride 1 (10) * HC1 is obtained by adding to compound 1 (10) by dissolving in saturated ethyl acetate. The precipitated hydrochloride is filtered, dried, and purified by recrystallization. The hydrochlorides of the compounds obtained in examples 1-9 and 1 1 -14 are similarly prepared.
  • carbonyl ⁇ glutamine 1 (11) is prepared according to the following Scheme 1 1.
  • Example 15 The General method of obtaining modified proteins (conjugates).
  • the protein is modified with a substance of general formula 1 or 2 in a molar ratio of ⁇ ⁇ 1: 1 to 1: 100.
  • a portion of a substance of general formula 1 or 2 is dissolved in 50 ⁇ l of DMSO, then phosphate buffered saline (FSB, pH 7.4) is slowly added. and add a solution of protein in the FSB.
  • the final concentration of protein in the reaction mixtures was 1 mg / ml.
  • the reaction is carried out at room temperature for 20 hours with constant stirring.
  • the reaction mass is centrifuged, the filtrate is applied to Superdex 75 gel (GE, USA); carrier column height - 23 cm; mobile phase - FSB; flow rate - 57.3 cm / hour; the injection volume is 2.2% of the volume of the carrier.
  • Conyogate numbers are determined using HPLC on a Bio-Monolith Protein A affinity column (Agilent, USA).
  • C1 (1) is the Clq (C) compliment protein with compound 1 (1), in a ratio of 1: 10.
  • FIG. Figure 15 shows, for example, a chromatogram of Konogate P1 (1), indicating a basic substance content of more than 98%.
  • Example 16 The determination of the activity of conjugates on ⁇ wearing to the CD 16A receptor.
  • standard materials and equipment for enzyme immunoassay are used.
  • CD16a is sorbed into the wells of the 96-well plate from a solution of 3.3 ⁇ g / ml in 75 ⁇ l / well phosphate-buffered saline. Sorption was carried out at 4 ° C for 16 hours.
  • the CD 16a solution was removed from the plate, the loops were filled with a 2% BSA solution in PBS-P (150 ⁇ l / well).
  • the plates were incubated at 37 ° C for 2 hours and washed three times with FSB-P buffer (300 ⁇ l / well each time).
  • the 3ai CM tablet’s grooves were filled with 50 ⁇ l / well Konyogatmi solutions in FSB-P, in dilutions from 0.25 to 256 ⁇ g / ml. Each dilution of one konyogate in plate corresponds to three wells. To control nonspecific sorption of the samples, part of the wells were filled with a 2% BSA solution. The plate is incubated for one hour at 37 ° C in an ELISA shaker (rotation speed 180 rpm).
  • the tablet was washed five times with 300 ⁇ l / well of FSB-P and filled with a solution of protein modified with horseradish peroxidase (75 ⁇ l / well in working dilution, which is indicated in the description to immunoconjugate).
  • the plate is incubated for 30 minutes, washed n, once in 300 ⁇ l / vakov FSB-P and filled with a solution of ' GMB (100 ⁇ l / vaku).
  • the depth of the enzyme1 and the reaction were visually assessed and the latter was stopped by the addition of 50 ⁇ l / well of a 500 mM sulfuric acid solution.
  • the optical illosity in the wells of the plate is measured at room temperature at a wavelength of 450 nm. For oopaoo i Kn the results of the experiment use the program GraphPad Prism 5.0.
  • FIG. Figure 16 shows the dependences of the binding of some conagions with respect to the CD 16a receptor, from which the dissociation constants of the complexes of conjugates with the CD 16a receptor were calculated (Konyogag activity with respect to the CD 16a receptor - Kj).
  • the activity of rituximab conjugates is 10-100 times higher than the activity of unconjugated rituximab.
  • FIG. 17 shows the dependences of the binding of interferon alpha and conjugate of interferon alpha to compound 1 (1) with the CD16a receptor.
  • the activity of the conjugate of interferon is higher than the activity of unconjugated interferon alpha.
  • Example 17 The effectiveness of the conjugates in the test for antibody-dependent (rituximab-dependent) cell cytotoxicity.
  • the efficacy of rituximab equine horses compared with unconjugated rituximab was evaluated in TCC IC at antibody dependent cellular toxicity.
  • target cells were used CO20-positive cells of the Daudi line (B-cell lymphoma of Berkit).
  • effector cells pulirin peripheral mononuclear blood cells from 5 healthy donors isolated using the standard protocol are used.
  • Dilutions of the studied conjugates and rituximab were prepared in RPMI 1640 medium. 50 ⁇ l of the solutions of the studied conjugates and rituximab were placed in the wells of a 96-well round-bottom plate. Cells of the Daudi line resuscitate g in RPMI 1640 medium to a concentration of 8x10 5 cells / ml. 75 ⁇ l of the resulting cell suspension is added to the prepared rituximab solutions in a plate. The plate is incubated in a thermostat at a temperature of 37 ° C for 50 minutes.
  • the obtained samples were precipitated by centrifugation at 1200 rpm for 10 minutes. 50 ⁇ l of the supernatant were transferred to a new plate, where they were mixed with 50 ⁇ l of the reaction mixture (lactate dehydrogenase detection kit, Promega (USA), catalog number G1780). The resulting mixture was incubated at room temperature for 25 minutes, after which the reaction was stopped. Measure the absorption on a spot spectrophotometer at a wavelength of 490 im.
  • cytotoxicity,% 100 * (A - (S E -S T )) / (Hr-S T ),
  • A is the signal level in the mixture of effector cells and target cells
  • SE is the signal level of effector cells
  • ST is the signal level of target cells
  • Example 18 Obtaining konyogat rituximab KP1 (7) and tra.utumaba KT1 (7).
  • To 1.5 g of the sugar part of the antibody in a solution of 100 mm sodium acetate, 200 mm sodium chloride, pH 5.5 add 2.0 g of sodium periodate, incubated for 30 min at room temperature in the dark with stirring.
  • Example 19 Comparative activity of rituximab (P) and trastuzumab (T) and their conjugates P1 (7), CT1 (7) with respect to the CD 16a receptor.
  • the study of the binding of the obtained conjugates of trastuzumab and rituximab to the CD 16a receptor was carried out identically to example 17.
  • the activity of the konogates KP1 (7), T1 (7) with respect to the CD16a receptor is 1–2 orders of magnitude higher than the activity of modified rituximab (P), trastuzumab (T) (Table 3).
  • Table 3 The activity of (Ka) rituximab (P), trastuzumab (T) and their conogates KP1 (7), KT1 (7) with respect to the CD 16a receptor.
  • the invention can be used in medicine, veterinary medicine, biochemistry.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Nitrogen- Or Sulfur-Containing Heterocyclic Ring Compounds With Rings Of Six Or More Members (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и иммунологии. Предложены новые соединения общей формулы (1) или (2). обладающие сродством к CD16a. Предложены новые модифицированные белки, активные в отношении CD16a рецептора, выбранные из антитела или аутогена, конъюгированные модифицирующим соединением, выбранным из соединения общей формулы (1) или (2). усиливающие и направляющие антитело-зависимую клеточную цитотоксичность. Новые модифицированные белки (конъюгаты) могут быть использованы для уничтожения в организме определенной целевой группы клеток, например, раковых клеток или аутоиммунных лимфоцитов. Предложены также способы получения конъюгатов, фармацевтическая композиция и лекарственное средство, содержащие модифицированные белки для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний.

Description

КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ
С РЕЦЕПТОРОМ СШ ба
Область техники
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и иммунологии, к новым соединениям, связывающимся с CD16a рецептором, и модифицированным ими белкам (конъюгатам), используемым для индукции ан ги гело- зависимой клеточной цитотоксичности и удаления таким образом из организма определенной целевой i pyrnibi клеток, например, раковых клеток или ауюиммуниых лимфоцитов. Изобретение относится также к способу получения конъюгагов, фармацевтическим композициям и лекарственным средствам. содержащим модифицированные белки (конъюгаты), для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний.
Предшествующий уровень техники
Рецептор Fcyllla (CD 16а) принадлежит к группе рецепторов, отвечающих за связывание Fc-фрагмеита антител. CD16a эксирсссируется на поверхпосги Ν -клеток (киллеров) и макрофагов и отвечает за индукцию антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), взаимодействуя с 1;с-фрагментом связанного с клет кой антитела. ADCC, наряду с комплемент-зависимой цитоюксичностыо (CDC) и аноп юзом. является одним из основных механизмов уничтожения раковых клеток из организма. Он же является причиной опосредованных аутоантителами аутоиммунных заболеваний, гаких как аутоиммунная полиэндокринопатия первого типа, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения, гемоли тическая болезнь новорождённых и т.н. То есть антитело-зависимая клеточная цито токсичность может играть как положительную, так и отрицательную роль в развитии патологических процессов в организме человека.
Аутоиммунные заболевания - группа заболеваний, развивающихся вследствие выработки иммунного ответа против здоровых тканей организма и приводящих к повреждению этих тканей. В настоящее время для лечения аутоиммунных заболеваний используются иммуносупресанты, подавляющие иммунную систему организма в целом. Избирательное подавление аутоиммунного ответа позволило бы сущее I BCHHO снизить частоту побочных эффектов лечения. Антитела достаточно давно используются для направленного уничтожения раковых клеток. Примерами могут служить ритуксимаб, трастузумаб. цегуксимаб и многие другие антитела, имеющие мишени на поверхности раковых клеток и действующие через комплимент-зависимую цитотоксичиость и антитело-зависимую клеточную питотоксичность. Это позволяет использовать данные неконъюгироваииые моноклональпые антитела в качестве лекарственных средств для лечения рака, например, ритуксимаб - для лечения СО20-позитивной В-клеточной, низкозлокачествеппой или фолликулярной неходжкинской лимфомы, трастузумаб - для лечения развитого рака молочной железы. Успешное применение этих продуктов обусловлено не только их эффективностью, но и их очень хорошими профилями безопасности (Grillo-Lopez A.-J et al. Semin. Oncol., 26, 1999, pp. 66-73).
Все они принесли возможность нового вида терапии. Но, несмотря на ярко выраженную эффективность, примерно половина больных не отвечает на терапию ритуксимабом, а до 60% становятся резистентными при повторном применении. В свете успехов, связанных с этими лекарственными средствами, в настоящее время сущсствусг большая потребность в достижении более высокой специфической активности антител по сравнению с той, которая, как правило, обеспечивается при лечении с использованием неконъюгированных антител.
Это послужило причиной для усиления исследований направленного терапевтического эффекта антител к поверхностным антигенам. Первым направлением модификации антител стала разработка модифицированных белков (конъюгаюв) антитело-лекарственное средство (ADC) для локальной доставки цитотоксических или цитостатических средств, то есть лекарственных средств, уже используемых для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении злокачественной опухоли [Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4,975,278 ]. Такие конъюгаты обеспечивают направленную доставку лекарственного вещества к опухолям и их накопление внутри клеток, добавляя к цитотоксическому действию антител противоопухолевую активность цитотоксических или цитостатических лекарств. Примерами таких копъюгатов являются трастузумаб-DMl , усиленная версия трастузумаба (Герцептина) (WO 201 169074) и серия копъюгатов с аурис гатииами П (US 20120003248). Альтернативным направлением стало усиление собственной цитотоксичност антител посредством усиления взаимодействия с рецепторами, обуславливающими цитотоксичность. Компания Рош разрабо тала антитело обипутузумаб с усиленным связыванием с рецептором CD16a. Этот эффект достигается за счет инженерии гликозилирования антитела. Обинутузумаб обладает в деся 1 ки раз более сильной антитело-зависимой клеточной цитотоксичностыо (WO 2005044859, НА 01 009).
Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность - один из основных механизмов цитотоксического действия антител, которые связываются с антигеном на поверхности целевой клетки посредством вариабельных доменов, в то время как констан тная част ь связывается с CD16a рецептором на поверхности клеток киллеров. Этот межклеточный контакт приводит к секреции киллерами иерфоринов и гранзимов. Первые образуют поры в клеточной мембране таргетной клетки, а вторые активируют каспазы и другие молекулы апоптоза. CD 16а рецептор является членом большого семейства Fc-рецеторов, связывающихся с константным доменом антитела и различающихся локализацией, функцией и сродством к константному домену.
Раскрытие изобретения
Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании этого изобретения.
«Алкил» означает алифатическую углеводородную линейную или разветвленную группу с 1-12 атомами углерода в цепи. Разветвленная означает, что алкильиая цепь имеет один или несколько «низших алкильных» заместителей. Алкил может иметь один или несколько одинаковых или различных заместителей («алкильных заместителей») включая галоген, алкенилокси, циклоалкил, арил, гетероарил, тероциклил, ароил, циано, гидрокси, алкокси, карбокси, алкинилокси, аралкокси, арилокси, арилоксикарбнил, алкилтио, гстероарилтио, аралкилтио, арилсульфонил, алкилсульфоиилгетероаралкилокси, аинелированный гстероарилциклоалкенил, аннелированный гетероарилциклоалкил, аинелированный гетероарилгетероцикленил, аинелированный гетероарилгетероциклил, аннелированный арилциклоалкенил. аннелированный арилциклоалкил, аннелированный арилгегероиикленил, аннелированный арилгетероциклил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбопил, гетероаралкилоксикарбонил или Rk aRkf iaN-, Rk aRk+iaNC(^0)-. Rk aRk+t''NC(-S)-. Rk aRk+iaNS02-, где Rk a и R +id независимо друг от друга представля т собой «замес штели аминогруппы», значение которых определено в данном разделе, например, аюм водорода, алкил, арил, аралкил, гетсроарал ил, гетероциклил или ге1ероарил, или и Rk+ia вместе с атомом N, с которым они связаны, образуют через R^'1 и Rk+iJ 4 - 7 членный гетероциклил или гетероцикленил. Предпоч тительными алкильными группами являются метил, трифторметил, циклопропилметил, циклопентилметил, эгил, н-нропил, изо-иропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил, З-пент ил, метоксиэтил, карбоксиметил, метоксикарбонилмстил, этоксикарбонилмсгил, бензилоксикарбонилметил мс юкси- карбонилметил и пиридилметилоксикарбонилметил. Предпочтительными «алкильными заместителями» являются циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, гидрокси, алкокси, алкоксикарбонил, аралкокси, арилокси, алкилтио, гетероарилтио, аралкилтио, алкилсульфонил, арилсульфонил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбопил, гетероаралкилоксикарбонил или R^R^+^N-, Rk aRk+iaNC(=0)-, аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил.
«Аминоалкил» означает CnH2n+iNH- или (CnH2n+i)(CnIl2n+i)N- группу, в которой алкил определен в данном разделе. Предпочтительными алкиламино группами являются метиламино, этиламино, н-пропиламино, изо-пропиламино и н-бутиламино.
«Аш итело» - белок (иммуноглобулин), синтезируемый В-лимфо итами в организме в ответ на попадание в него чужеродного вещества и обладающий специфическим сродством к этому веществу. Они являются важнейшим фактором специфического гуморального иммунитета. Антитела выполняют две функции: антиген-связывающую и эффекторпую (вызывают тот или иной иммунный ответ).
«Аутоантигсны» - свободные молекулы веществ или молекулы в составе клеток, органов и тканей, которые распознаются при определённых условиях иммунной системой как чужеродные и в связи с гим вызывают клеточный или гуморальный иммунный ответ со стороны своего организма. Это, как правило, - нормальные белки или белковые комплексы (а также комплексы белков с ДНК или РНК), которые распознаются иммунной системой у пациентов с аутоиммунными заболеваниями. Такие антигены в норме не должны узнаваться иммунной системой, но, ввиду генетических факторов или условий окружающей среды, иммунологическая толерантность к таким антигенам может быть утеряна.
Свойствами аутоан гигенов могут обладать так называемые естественные аутоантигсны (секвестированные). К ним относят белки, синтез которых начинайся после созревания иммунной системы (сперма, молоко); макромолекулы органов, отделенных от иммунной системы гистогсматическим барьером; макромолекулы, входящие в сосшв ядер и цитоплазмы клеток; макромолекулы с наличием новых чужеродных детермииаитньгх i pynn вследствие действия эндогенных (иммунные комплексы, некроз, воспаление) или экзогенных (температура, химические вещества, в том числе лекарственные, микробы и их токсины, вирусы и др.) факторов; эмбриональные белки с возобновляющимся при определенных состояниях синтезом (напимер, при опухолях). Они могу г индуцировать иммунный ответ, приводящий к образованию аутоантител или сенсибилизированных Т- лимфоцитов и развитию аутоиммунных болезней. В результате начинается разви тие аутоиммунной реакции. Они могут приводить к развитию самых разнообразных аутоиммунных заболеваний. К ним в частности относятся аутоиммунная полиэндокринопатия первого типа, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения, гемолитическая болезнь новорождённых рассеянный склероз, аутоиммунный тиреоидит и др.
Аутоиммунитет - процесс и связанные с ним заболевания, обусловленные приобретением иммунной системой способности распознавать собственные антигены (аутоантигены) организма и реагировать на них образованием аутоантител или аутоиммунных Т-лимфоцитов. Аутоиммунный процесс— процесс и связанные с ними заболевания, основой которых является поражение тканей, обусловленное последствиями взаимодействия аутоантител или аутоиммунных Т-лимфоцитов с аутоантигенами.
« онъюгаг» - это модифицированный химическими соединениями белок, аш иген или антитело. Образование конъюгата - один из важных этапов проведения имунпо- ферментного анализа (ИФА). При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения химического соединения, чтобы компонент конъюгата, антиген или антитело, сохранял свою биологическую активность - ат игеиность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Способность чужеродных соединений и метаболитов вступать в реакции конъюгации зависит от наличия в их молекулах определенных функциональных групп.
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции), в виде таблеток капсул инъекций, мазей и др. гоювых форм предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилакшки болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. «Рецепторы» (от латинского recipere - получать, узнавать) предс тавляют собой биологические макромолекулы, расположенные на цитоплазма гической мембране клс ки или внутриклеточно, способные специфически взаимодействовать с ограниченным набором физиологически активных веществ (лигандов) и трансформировать сш нал об этом взаимодействии в определенный клеточный ответ.
«Сольна 1 ы» - продукты присоединения растворителя к растворенным веществам; частный случай сольватов - гидраты (растворитель - вода). Обычно сольвагы образуются в растворе, но нередко (при охлаждении раствора, испарении раствори 1 еля и др.) могут быть получены в виде кристаллических фаз - кристаллосольватов.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя активный компонент (модифицированный белок) и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсласти ι ели, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентони т, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как, парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включат ь также изоюнические агенты, например, сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностсарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носи телей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как тилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цшрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являю 1 ся крахмал. алгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются c i eapaT магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтилепгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевт ическая композиция для пероралыюго, сублингвального, транедермального, внутримышечного, внутривенного, нодкожпою, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблс 1 ки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и траисбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, транедермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальпые или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения. Фармацевтические композиции, как правило, получают с помощью стандартных процедур, предусматривающих смешение активного соединения с жидким или тонко измельченным твердым носителем.
«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе сиш еза. выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валсриаты, олеаты, иальмитаты. стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малсагы, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропиона1 ы, этансульфонагы, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные (Подробное описание свойсм! таких солей дано в Bcrgc S.M., ct al., "Pharmaceutical Salts" J. Pharm. Sci. 1977, 66: 1 -1 .). Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, при этом могут быть синтезирован ы соли металлов и аминов. К металлическим относятся соли нафия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из ко торых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид нафия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид мапшя, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быгь получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие дос 1 атомной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях (в частности, они должны обладать низкой токсичностью). К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, три метиламин, ') гидами н, диэтиламии, триэтиламин, бепзиламин, дибепзиламип, дициклогсксиламни, иииеразии, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)аминомеган и подобные им. Кроме ют, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как, холин, тстраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитии и аргинин.
Цель настоящего изобретения заключается в создании новых соединений и модифицированных ими белков (конъюгатов), способных взаимодейст овать с рецептором CD16a, используемым для индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности и удаления таким образом из организма определенной целевой группы клеток, например, раковых клеток или аутоиммунных лимфоцитов.
Поставленная цель достигается обнаруженными авторами новыми соединениями, обладающими сродством к CD16a рецептору, содержащими активированную группу способную присоединяться к аминогруппе белка, а именно новыми замещенными 5.5, 1 1 - триоксо-10,1 1-дигидро-5//-дибензо[0/][1,4]тиазепинами общей формулы 1 или 5,6, 7,8,9,10-гексагидро-4Я-[1]бензотиено[3,2-/|пирроло[ 1 ,2-а][1,4]диазсшшами общей формулы 2, или их фармацевтически приемлемыми солями или сольвагами,
Figure imgf000010_0001
в которых R1 представляет собой (CH3)2N-,
Figure imgf000011_0001
R2 представляет собой
Figure imgf000011_0002
где R3 в качестве концевого заместителя представляет собой незамещенный амииоалкил,
Figure imgf000011_0003
-NH2, О ~ , ~ или R4
a R4 представляет собой Н или СгС3алкил.
Предпочтительными являются соединения общей формулы 1, в коюрых R1 представляют собой:
Figure imgf000011_0004
Figure imgf000012_0001
Предпочтительными являются также соединения общей о мулы 2, в которых
R1 представляет собой (СИз)2М- или
Figure imgf000013_0001
a R2 п едставляет собой
Figure imgf000013_0002
Более предпочтительными соединениями являются:
2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир (3-хлорбензил)-5,5,1 1-триоксо-10,1 1-дигидро-5Я- дибензо[6, ][1,4]тиазепин-7-карбоновой кислоты 1(1),
2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир (4-{[ 10-(3-хлорбспзил)-5,5,1 1-триоксо- 10, 1 1 - дигидро-5Я-дибензо[6, |[1,4]тиазепин-7-карбопил]-амино}-фенокси)-уксусной кислоты 1(2),
2, 5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир 4-{[10-(3-хлорбензил)-5.5, 1 1-триоксо-10.1 1- дигидро-5Я-дибснзо[п, ][1,4]тиазепии-7-карбонил]-амино}-фенилкарбоновой кислоты ЦЗ),
2,5-диоксо-пирролидин-1 -иловый эфир 3-[8-(3,4-диметоксифенилкарбамоил)-5,5,1 1- триоксо-5,1 1-дигидро-дибензо[ 7, ][1 ,4]тиазепин- 10-илметил|-бензойной кислоты 1(4). 2,5-диоксо-пирролидин-1 -иловый эфир (4-{8-[3-(4-бснзилпипермдин-1-ил)- иропилкарбамоил]-5,5,1 1 -триоксо-5, 1 1 -дигидро-дибензо[6,/] [ 1 ,4]тиазспи н- 10-илме ι ил } - фенил)-уксусной кислоты 1 (5),
10-(3-хлорбензил)-5,5, 11 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5//-дибензо[Ь,1] f 1 ,4]тиазспин-8- карбоновой кислоты (2-аминоэтил)-амид 1(6),
10-{4-[(2-амино-этилкарбамоил)-метил]-бензил }-5,5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5Я- дибензо[Ь,1"][1,4|тиазепин-8-карбоновой кислоты [3-(4-бе1пил-пиперидин-1-ил)-иронил 1- амид 1(7),
2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)-этиловый эфир 10-(3-хлорбснзил)-5.5Л 1 - триоксо-10,1 1 -дигидро-5Я-дибензо[Ь,{][1,4]тиазспин-8-карбоиовой кислоты 1 (8), 10-(4-{ [2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол- 1 -ил)-этилкарбамоил]-мегил}-бс1пил)- 5.5, 1 1 - Ί риокео- 10, 1 1 -дигидро-5#-дибензо[Ь ] f 1 ,4 |Ί иазешш-8-карбоновой кислоты f 3-(4-беизил- пиперидии- 1 -ил)-пропил ]-а ид 1 (9),
N-[2-( {Лг-(метоксикарбоиил)-Л^-[( 1 ,5-диметокси- 1 ,5-диоксопентан-2-ил)карбамоил |-β- аланил }амино)этил]- 10-(3-хлорбензил)-5,5, 1 1 - гриоксо- 10, 1 1 - дигидродибензо[6. | [ 1 ,4 |тиазеиин-7-карбоксамид 1(10),
/V5-(2- { [(4-{ [7- { [[3-(4-бензилпиперидин- 1 -ил)пропил ](фенил )амино |-карбоиил } -5.5, 1 1 - триоксо-дибензо[/?, ][1 ,4 ]тиазеиин- 10(1 1 Я)-ил]метил} фенил)ацетил]-амипо } :н 1)- '2- { [( 1 ,3-дикарбоксипропил)амино]карбонил}глутамин 1 (11),
4-[4-(диметилами11о)фенил]-Л^(4-{[(2,5-диоксопирролидии-1 -ил)окси]карбонил} фенил)- 7,8,9,10-тетрагидро-4Я-[1]бензотиено[3,2-/]пирроло[ 1 ,2-а][ 1 ,4]диазепин-5(6Я)- карбоксамид 2(1),
4-[4-(диметиламино)фенил]-Л -(4-{2-[(2,5- диоксопирродидии- 1 -ил)окси |-2- оксоэтокси }фенил)-7,8,9, 10-тет рагидро-4Я-[1]бензотиепо[3,2-/]пирроло[ 1 ,2- а][1 ,4]диазепин-5(6Я)-карбоксамид 2(2),
2,5-диоксопирролидин-1 -ил Лг-[4-(5-{ [(3,4-диметоксифснил)амино]-карбоиил}- 5,6,7,8,9, 10-гексагидро-4Я-[ 1 ] бензотиено[ 3,2- ]пирроло[ 1 ,2-а] [ 1 ,4 ]диазе11ин-4-ил)фенил |- N-метилглицинат 2(3).
Авторы впервые обнаружили модифицированный белок (коныогат), активный в отношении CD 16а рецептора. Поэтому предметом данного изобретения являе г ся модифицированный белок, активный в отношении CD16a рецептора, коныогированный модифицирующим соединением, обладающим сродством к CD16a рецептору, выбранным из соединения общей формулы 1 или 2.
Более предпочтительным являе гся модифицированный белок (коныогат) активный по отношению к CD16a рецептору, полученный взаимодействием белка с модифицирующим соединением общей формулы 1 или 2.
Более предпочтительным является модифицированный белок (коныогат) полученный из антитела и соединения общей формулы 1 или 2, в ко тором антитело представляет собой ритуксимаб, трастузумаб, или цетуксимаб.
Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой ритуксимаб, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2. Более предпочштельным является также модифицированный белок (Koin.iora i ), представляющий собой трастузумао, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.
Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой цетуксимаб, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.
Более предпочтительным является также модифицированный белок (коиыога! ) полученный из аутоантигена и соединения общей формулы 1 или 2, в котором аутоантиген представляет собой интерферон альфа или главный белок миелина, или белок комплимента Clq.
Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой интерферон альфа, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.
Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой главный белок миелина, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.
Более предпочтительным является также модифицированный белок (коныогат), представляющий собой белок комплимента Clq, модифицированный соединением общей формулы 1 или 2.
Исследование сравнительной эффективности белков и их конъюгаюв по отношению к CD 16а рецептору показало, что коныогаты на 1-3 порядка активнее своих немодифицированных белков.
Предметом данного изобретения является также способ получения модифицированного белка (конъюгата) согласно которому подвергают взаимодействию белок с соединением общей формулы 1 или 2, растворенным в среде органического растворителя, например, диметилсульфоксиде, в интервале молярного сотпошения от 1 :3 до 1 : 100 в среде фосфатного солевого буферного раствора (рН 7.4) при комнатной температуре при постоянном перемешивании.
Предметом данного изобретения является также фармацевтическая композиция, активная но отношению к CD16a рецептору, содержащая модифицированного белок (коныогат) в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель или эксципиент. Фармацевтические композиции могут включать фармацевтически приемлемые жсциписнты. Под фармацевтически приемлемыми эксципиеитами подразумеваю тся применяемые в сфере фармацевтики разбави тели, вспомогательные агент ы и/или носители. Фармацев тическая композиция наряду с модифицированным белком (конъюгатом), полученным взаимодействием белка с модифицирующим соединением общей формулы 1 или 2, или его фармацевтически приемлемой солью или сольватм, по настоящему изобретению, может включать и другие активные субстанции, в том числе обладающие противогриппозной активностью, при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов.
При необходимости использования фармацевтической композиции но настоящему изобретению в клинической практике она может смешиваться с традиционными фармацевтическими носителями.
Носители, используемые в фармацевтических композиций по нас тоящему изобретению, представляют собой носители, которые применяются в сфере фармацевтики для получения распространенных форм, в том числе: пероральных, форм для инъекций, местных форм.
Предметом данного изобретения является также лекарственное средство, активное по отношению к CD 16а рецептору, в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку, предназначенное для лечения заболеваний, вызванных патологическими клетками, включающее в свой состав новый модифицированного белок (конъюгат), или новую фармацевтическую композицию в терапевтически эффективном количестве.
Поскольку при формировании конъюгага его компонент, антиген или ант и тело, сохраняют свою биологическую активность — антигенность и аитигенсвязывающую активность, соответственно, то конъюгаты по настоящему изобретению могут использоваться для лечения тех же заболеваний, для ко торых используются иеконъюгированные мопоклональпые антитела в качестве лекарственных средств таких как, низкозлокачественная или фолликулярная неходжкинская лимфома, рак молочной железы. Также известно, что активность антител по отношению к CD 16а рецептору используется для лечения аутоиммунных или онкологических заболеваний (R. L. Ferris, et al. J. Clinical Oncology, 2010, Oct 1 , Vol. 28, No 28: 4390-4399), в том числе таких как лимфома (К.-Н. Heider, et al. Blood, 201 1 , 1 18: 4159-4168) или лимфат ическая лейкемия (J. Λ. Bowels, et al. Blood, 2006, 108: 2648-2654). Предметом данного изобретения является способ лечения заболевания, вызванного патологическими клетками, которое можно лечить путем опосредованного воздействия на CD 16а рецептор, согласно которому субъекту вводят терапевт ически эффективное количество модифицированного белка (конъюгата), или фармацевтической композиции, или лекарственного средство, активных по отношению к CD 16а рецептору.
Предпочтительным является способ лечения аутоиммунных или онкологических заболеваний, определенных выше в данном разделе, в том числе таких, как лимфома. лимфатическая лейкемия или рак молочной железы.
Предпочтительным является также способ лечения аутоиммунной полиэндокринопатии первого типа.
Лекарственные средства могут вводиться перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшиино или местно). Клиническая дозировка модифицированного белка (конъюгата), или фармацевтической композиции, или лекарственного средства, активных по отношению к CD 16а рецептору, у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективное i n и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента, при этом суточная доза у взрослых обычно составляет 300 ~ 1200 мг, предпоч тительно - 500 ~ 1000 мг в случае, когда белок в конъюгатс представляет собой аш итело, и 0.01 ~ 100 мг, предпочтительно - 0,1 ~ 10 мг в случае, когда белок в конъюгате предешвляет собой аутоантиген. Поэтому во время приготовления фармацевтических композиций по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку препарата. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени (предпочтительно - от одного до шести раз). Лучший вариант осущес тлении изобрет ения
Изобретение поясняе 1 Ся следующими чертежами:
Фиг. 1. Спектр протонного матич ного резонанса (ПМР спектр) 2.5- диоксопирролидин- 1 -илового эфира (3-хлорбспзил)-5,5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5//- дибензо[0,/|[1 ,4|тиазенин-7-карбоновой кислот ы 1(1).
Фиг. 2. ПМР спектр 2,5-диоксопирролидин-1 -илового эфира (4-{ | 10-(3- хлорбензил)-5,5,1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5Я-дибензо[6,/] [1 ,4 |тиазепин-7-карбонил]- амшю}-фенокси)-уксусной кислоты 1(2).
Фиг. 3. ПМР спектр 2,5-диоксопирролидин-1 -илового эфира 4-{[10-(3- хлорбензил)-5,5, 1 1 -триоксо- 10,1 1 -дигидро-5Я-дибензо[/>,/] [ 1 ,4]тиазепип-7-карбонил ] - амино}-фенилкарбоновой кислоты 1(3).
Фиг. 4. LCMS спектр 2,5-диоксо-пирролидип-1 -илового эфира 3-[8-(3,4- диметоксифенилкарбамоил)-5,5,1 1 -триоксо-5,1 1 -дигидро-5Я-дибензо[6,/|[ 1 ,4]тиазспин- 10-илметил]-бензойной кислоты 1(4).
Фиг 5. ПМР спектр 2,5-диоксо-пирролидин- 1 -илового эфира (4-{8-[3-(4- бснзилпипермдин-1-ил)-пропилкарбамоил]-5,5,1 1-триоксо-5, 1 1-дигидро- дибензо[&, |[1 ,4]тиазепин-10-илметил}-фенил)-уксусной кислоты 1(5).
Фиг. 6. ПМР спектр 10-(3-хлорбензил)-5,5 ,1 1 -триоксо- 10, 1 1-дигидро-5//- дибензо[Ь,^[1 ,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты (2-аминоэтил)-амида 1(6).
Фиг. 7. ПМР спектр 10-{4-[(2-амипо-эгилкарбамоил)-метил]-бензил} -5,5, 1 1- триоксо-10,1 1-дигидро-5//-дибензо[Ь,1][1,4]тиазепи11-8-карбоновой кислоты [3-(4-бснзил- 11 и п ери дин- 1 -ил)-проп ил ] -амида 1 (7) .
Фиг. 8. ПМР спектр 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)- тилового эфира 10- (3-хлорбензил)-5,5,1 1 -триоксо- 10,1 1-дигидро-5//-дибензо[Ь,1][1 ,4]тиазспин-8-карбоновой кислоты 1(8).
Фиг. 9. ПМР спектр 10-(4-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1 -ил)- этилкарбамоил]-метил}-бснзил)- 5,5,1 1 -триоксо- 10,1 1-дигидро-5Я- дибензо[Ь,1][1,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты [3-(4-бензил-пиперидии-1 -ил)-пропил|- амида 1(9).
Фиг. 10. ПМР спектр соединения Лг-[2-({Л-(Ме1 оксикарбонил)-Л^-[( 1 ,5-димсгокси- 1 ,5-диоксопентан-2-ил)карбамоил]-Р-аланил}амино)этил]- 10-(3-хлорбензил)-5,5, 1 1 - I риоксо- 10,1 1 -дигидродибензо[6 | [ 1 ,4 ]тиазепин-7-карбоксамида 1(10). Фиг. 11. I1MP спектр ^5-(2-{ 1(4-{[7-{ [[3-(4-Вензил1 шперидин- 1 - ил)пропил](фенил)амино]карбонил}-5,5,1 1-триоксо-дибензо[0./1[1 ,4]тиазепии-10( 1 1 //)- ил]метил}фенил)аце1 ил]амиио}э 1ил)-Лг2-{[( 1 ,3-дикарбоксипропил)ами1ю |- карбонил}глутамина 1(11).
Фиг 12. LCMS спектр 4-[4-(диметиламино)фенил|-Лг-(4-{ 1(2,5-диоксопирролидин- 1-ил)окси]карбонил}фенил)-7, 8,9,10-тетрагидро-4//-[1]бензотиено[3,2-/1пирроло[ 1.2- я][ 1,4]диазепин-5(6Я)-карбоксамида 2(1).
Фиг. 13. ПМР спектр 4-[4-(диметиламино)фенил]-Лг-(4-{2-[(2,5- диоксопирролидин- 1 -ил)окси ]-2-оксоэтокси } фенил)-7,8,9, 10-тетрагидро-4//- [1]бе113отиено[3,2- ]пирроло[1 ,2-а][1 ,4]диазепин-5(6//)-карбоксамида 2(2).
Фиг. 14. LCMS спектр 2,5-диоксопирролидин-1 -ил N-[4-(5-{ [(3,4- диметоксифенил)-амино]карбонил}-5,6,7,8,9,10-гексагидро-4//-[1 ] бензотиено[3.2- /]11ирроло[1,2-а][1,4]диазепин-4-ил)фенил]-Лг-метилглицината 2(3).
Фиг. 15. Хроматограмма конъюгата Р1(1), на колонке TSK GEL SUPER SW3000.
Фиг 16. Имунно-ферментный анализ (ИФА) связывания конъюгатов ритуксимаба с CD 16a рецептором. Зависимость оптической плотности на длине волны 450 им от концентрации введенного в ИФА конъюгата.
Фиг 17. Имуиио-ферментный анализ (ИФА) связывания интерферона (И) и конъюгата КИ1(1) с CD 16а рецептором. Зависимость оптической плотности на длине волны 450 нм от концентрации введенного в ИФА конъюгата.
Фиг. 18. Сравнение эффективности ритуксимаба (Р) и конъюгата КР1(1) в честе антитело-зависимой цитотоксичности.
Фиг. 19. Сравнение эффективности ритуксимаба (Р) и конъюгата Р1 (2) в iccic антитело-зависимой цитотоксичности.
Фиг 20. Имунно-ферментный анализ (ИФА) связывания ритуксимаба (Р). трастузумаба (Т) и их конъюгатов КР1(7), КТ1(7) по огношепию к CD 16а рецептору.
Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают, данное изобретение.
Пример 1. 2,5-Диоксопирролидин-1 -иловый эфир (3-хлорбепзил)-5,5,1 1- фиоксо- 10,1 1-дигидро-5//-либензо[0,/Ц1 ,4] гиазепии-7-карбоновой кислоты 1 (1 ) получают по нижеследующей Схеме 1 .
Figure imgf000020_0001
К раствору 31.8 г КОН в 170 мл воды присыпают порциями 25 г соединения 4, после его растворения добавляют 30 г соединения 3 и перемешивают при 60° С в течение 15 ч. Затем реакционную смесь охлаждают, подкисляют 1 % соляной кисло той до рП=3, фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 5 с выходом 70%. Растворяют 50 г соединения 5 в 500 мл водного аммиака растворяют и порциями присыпают 80 г дитионита, после чего реакционную смесь кипятят с обрашым холодильником 1 ч. Затем реакционную смесь охлаждают, упаривают па ро торном испарителе аммиак, а водный раствор подкисляют конц. соляной кисло юй до pi I— 1 , перемешивают 1 ч, фильтруют осадок, промывают водой, сушат. Получают соединение 6 с выходом 60%. Добавляют порциями 45г соединения 6 к 200 мл полифосфорпой кислоты при 50°С, после чего перемешивают 10 ч при 90 °С. Выливают на 500 мл льда, фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 7 с выходом 60%. Растворяют 30 г соединения 7 в 500 мл уксусной кислоты, добавляют 70 мл 33% перекиси водорода, перемешивают ночь при 70°С. Затем охлаждают, уксусную кислоту упаривают на роторном испарителе, к остатку добавляют 600 мл воды. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 8 с выходом 70%. К раствору 22 г соединения 8 в 300 мл этанола прикапывают 8 мл хлористого тионила при 10°С, после чего смесь кипя тят 5 часов. Охлаждают, упаривают метанол па ро юрном испарителе, добавляют 300 мл воды. Выпавший осадок фильтрую т, промывают водой, сушат. Получают соединение 9 с выходом 90%. Растворяют 8.2 г соединения 9 в 80 мл ДМФА, добавляют 7 г поташа и после этого 5.2 г .к-хлорбен лхлорида. Смесь перемешивают при 50°С ночь, упаривают ДМФА на роторном испарителе, к остат ку добавляют 200 мл воды. Выпавший осадок фильтруют, промываю т водой, сушат. Получают соединение 10 с выходом 90%. Растворяют И г соединения 10 в 150 мл 50% водном этаноле, добавляют 2.7 г КОН и перемешивают ночь при комнатой leMncpaiype. После этого этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН=3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 11 с выходом 80%. Растворяют 1.8 г соединения 1 1 в 50мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 0.48г Ν-гидроксисукцинимида и 0.87г дициклогексилкарбо-диимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистя т флэш- хроматографией на силикагсле ( люент этилацет ат). Получают соединение 1 (1 ) с выходом 50%. Спекгр протонного магнитного резонанса (ПМР спектр) соединения 1(1) представлен на Фиг.1.
Пример 2. 2,5-Диоксопирролидин-1 -иловый эфир (4-{[10-(3-хлорбензил)-5,5,11- триоксо- 10, 11 -дигидро-5Я-дибензо|Д/] [ 1 ,4 |т иазеиин-7-карбонил]-амино } -феиокси)- уксусиой кислоты 1(2) получают по нижеследующей Схеме 2.
Figure imgf000022_0001
Схема 2. К суспензии 30 г no iaina в 200 мл ацетонитрила добавляют 15 г п-нитрофенола 12, перемешивают 1 ч, после чего прикапывают 19,8 г этилового эфира бромуксусной кислоты. Перемешивают ночь при 60°С, фильтруют, упаривают на роторном испарит еле. Полученный продукт 13 используют дальше без очистки. Растворяю ! 14.3 г соединения 13 в 200 мл 50% водной уксусной кислоты, нагревают до 70°С, после чего присыпаю т небольшими порциями 10 г железа так, чтобы смесь кипела. После э того перемешивают еще 15 мин, охлаждают, добавляют 500 мл воды. Экстрагируют 3x 150 мл эгилацетага. объединенные экстракты промывают концентрированным раствором Nal IC03, сушат, растворитель упаривают на роторном испарителе. Получают продукт 14 с выходом 75%. Смешивают в 50 мл диоксана 1.9 г соединения 11 и 0.87 г соединения 14. Перемешивают 1 ч, после чего добавляют 1.2 мл триэтиламина и 0.89 г хлорокиси фосфора. Перемешивают 3 ч при 50°С, добавляют 150 мл воды, выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают продукт 15 с выходом 60%. Растворяют 2.7 г соединения 15 в 20мл 50% водного этанола, добавляют 0.93 г LiOH и перемешиваю г ночь при комнатной температуре. После этого этанол упаривают па роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН^З. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Продукт очищают колоночной хроматографией в системе хророформ-метанол-триэтиламин 10- 1- 1. Получают продук ! 16 с выходом 1 1%. Растворяют 290 мг соединения 16 в 50 мл ТГФ. в атмосфере аргона при перемешивании добавляю т 58 г N-гидроксисукцинимида и 104 мг дициклогексилкарбо-диимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистят флэш- хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат). Получаю т продукт 1 (2) с выходом 50%. ПМР спектр соединения 1 (2) представлен на Фиг. 2.
Пример 3. 2,5-Диоксопирролидин- 1 -иловый эфир 4-{ [10-(3-хлорбепзил)-5,5.1 1 - триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5Я-дибензо [/),/] [ 1 ,4 |тиазепин-7-карбонил ] -амино } - фенилкарбоновой кислоты 1(3) получают по нижеследующей Схеме 3.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
Схема 3.
Растворяют 1 экв я-аминобснзойной кисло ты в трет-бу ι иловом спирт е и добавляют 1.1 экв HDC . Кипятят реакционную смесь 18 ч. Охлаждаем до 0°С, добавляют воду и экстрагируют диэтиловым эфиром. Упаренный органический слой пускаем следующую стадию без очистки. Получают продукт 17 с выходом 60%. Смешивают в 50 мл диоксапа 2.2 г соединения 11 и 0.85 г от/?е/и-бутилового эфира и-аминобспзойиой кислоты 17. Перемешивают 1 ч, после чего добавляют 1.4 мл триэтиламипа и 1.0 г хлорокиси фосфора. Перемешивают 3 ч при 50°С, добавляют 150 мл воды, выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают продукт 18 с выходом 60%. Соединение 18 растворяют в трифторуксусной кисло те и перемешиваю т ночь при 50°С. Реакционную массу упаривают досуха. Получаю т продукт 19 с выходом 88%, ко юрый использую т в следующую стадию без очистки. Растворяют 760 мг соединения 19 в 50 мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 1 60 мг Ν-ι идроксисукцииимида и 287 мг дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре, выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистят флэш- хроматографией на силикагеле (элюент - этилацетат). Получают проду 1(4) с выходом 50%. ПМР спектр соединения 1(4) представлен на Фиг. 3.
Пример 4. 2,5-Диоксо-иирролидин-1 -иловый эфир 3-[8-(3,4- димстоксифенилкарбамоил)-5,5,1 1 -триоксо-5,1 1-дигидро- дибе1по16,/][1.4]тиазешш- 10- илметил|-бензойной кислоты 1(4) получают по нижеследующей Схеме 4.
Figure imgf000025_0001
О
\
снз 1 (4)
Схема 4.
Кипятят 10 г 2,4-диметоксибензальдсгида и 9.2 г 3,4-диметоксианнлина в 150 мл толуола с насадкой дина-старка до прекращения выделения воды. После этго смесь охлаждают, упаривают толуол на роторном испарителе, полученный продукт 20 используют дальше без очистки. Растворяют соединение 20 в 100 мл метанола и при перемешивании присыпают 2.8 г боргидрида натрия, перемешивают при комнатной температуре еще 1ч, упаривают метанол на роторном испарителе, добавляют 100 мл воды, подщелачивают 10% раствором КОН до рН=9, экстрагируют хлористым метиленом, сушат, упаривают. Получают продукт 21 с выходом 80%. Смешивают в 50 мл диоксана 2.2 г соединения 9 и 3.0 г соединения 21. Перемешивают 1ч, после чего добавляют 5.5 мл триэтиламина и 2.0 г хлорокиси фосфора. Перемешивают 3 ч при 50°С, добавляют 150 мл воды, выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают продукт 22 с выходом 60%. Растворяют 3.0 г соединения 22 в 30 мл ДМФЛ. добавляют 1.7 г погаша и 1.3 г этил 3-бромметилбензоата. Смесь перемешиваю! при 50°С ночь, упаривают ДМФА в вакууме, к остатку добавляют 70 мл воды. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают продукт 23 с выходом 90%. Растворяют 3.0 г соединения 23 в 40 мл хлористого метилена, добавляют 1.4 г трифторуксусной кислоты и кипятят с обратным холодильником ночь. После этого смесь промывают конц. раствором NaHC03, сушат, упаривают хлористый мешлен. Чистят продукт колоночной хроматографией, элюсит хлороформ / метанол 40 / 1. Выход продукта 24 составляет 30%. Растворяют 0.9 г соединения 24 в 20 мл 50% водного этанола, добавляют 0.25 г LiOH и перемешивают ночь при комнатной l e iiepa i ype. После этого этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН=3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Продукт очищают колоночной хроматографией в системе хророформ-метанол- триэгиламип 10-1-1. Получают продукт 25 с выходом 20%. Растворяют 140мг соединения 25 в 20мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 42мг N- гидроксисукцинимида и 76мг дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистят флэш-хроматографией на силикагеле (элюент этилапстат). Получают продукт 1(4) с выходом 50%. LCMS спектр соединения 1(4): (М+1 = 670) представлен на Фиг. 4.
Пример 5. 2,5-Диоксо-пирролидии-1 -иловый эфир (4-{8-[3-(4-бснзилпипермдин- 1 -ил)-пропилкарбамоил]-5,5,1 1-триоксо-5,1 1-дигидро-дибензо[6,/|[ 1 ,4]тиазспин-10- илметил}-фенил)-уксусной кислоты 1(5) получают по нижеследующей Схеме 5.
Кипятят 3.8 г 2,4-диметоксибензальдегида и 5.3 г соединения 26 в 100 мл толуола с насадкой дина-старка до прекращения выделения воды. После этого смесь охлаждают, упаривают толуол на роторном испарителе. Полученный продукт 27 используют дальше без очистки. Растворяют соединение 27 в 50 мл метанола и при перемешивании присыпают 1.3 г боргидрида натрия, перемешивают при комнатной температуре еще 1 ч, упаривают метанол на роторном испарителе, добавляют 50 мл воды, подщелачивают 10% раствором КОН до рН=9, экстрагируют хлорист ым метиленом, сушат, упаривают. Получают соединение 28 с выходом 80%. Растворяют 2.4 г соединения 9 в 100 мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 1.0 г Ν-гидроксисукцинимида и 1.1 г дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого добавляют 3 г соединения 28 и перемешивают 6 ч при 60°С. Выпавший осадок отфильтровывают, магочный раствор упаривают на роторном испарителе. Остаток чистят колоночной хроматографией, элюент хлороформ:мс'1анол 19: 1. Получают соединение 29 с выходом 70%. Смесь 10.0 г п-толилуксусиой кислоты, 13.0 г N- бромсукцинимида и 0.1 г 2,2'-азабисизобутиронитрила в 60 мл четыреххлорисгого углерода кипятят с обратным холодильником 4 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры, выливают на 100 мл воды, выпавший осадок отфильтровывают, сушаг. Растворяют в 50 мл этанола, добавляют при 0°С 3.7 мл тионилхлорида, перемешивают ночь при комнатной температуре, упаривают растворитель.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Схема 5.
Получают соединение 30 с выходом 50%. Полученный продукт используют дальше без очистки. Растворяют 4.5 г соединения 29 в 50 мл ДМФА, добавляют 2.2 г поташа и после этого 2.0 г этилового эфира п-бромметилфенилуксусиой кислоты 30. Смесь перемешивают при 50°С ночь, упаривают ДМФЛ на роторном испарителе, к остатку добавляют 100 мл воды. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, суша . Получают соединение 31 с выходом 80%. Растворяют 3.5г соединения 31 в 40 мл хлористого метилена, добавляют 2.0 г трифторуксуспой кислоты и кипятят с обратным холодильником ночь. После этого смесь встряхивают несколько раз с коиц. раствором ЫаПСОз, сушат, упаривают хлористый метилен на роторном испари теле. Чистя т продукт колоночной хроматографией, элюент хлороформ / метанол 40 / 1. Получают соединение 32 с выходом 55%. Растворяют 1.6 г соединения 32 в 20 мл 50% водного эшнола, добавляют 0.29 г LiOII и перемешивают ночь при комнатной температуре. После этого этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН=3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Продукт очищают колоночной хроматографией в системе хророформ-метанол-триэтиламин 10-1 - 1. Получают соединение 33 с выходом 15%. Растворяют 180 мг соединения 33 в 20 мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 47 мг Ν-гидроксисукиинимида и 84 мг дипиклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, \ia i очный рас ι вор упаривают, чистят флэш - хроматографией на силикагсле (элюсит этилацетат). Получают соединение 1(5) с выходом 50%. ПМР спектр соединения 1 (5) представлен на Фиг. 5.
Пример 6. 10-(3-Хлорбензил)-5,5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5//- дибензо[Ь,1Ц 1 ,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты (2-аминоэтил)-амид 1 (6) получаю т по нижеслед ющей Схеме 6.
Figure imgf000031_0001
1 (6)
Схема 6.
Соединение 11 растворяют в хлороформе, добавляют 1.1 экв КДИ и перемешивают при комнатной температуре час, затем прибавляют бок-этилендиамин и перемешивают ночь при комнатной температуре. Промывают водой и органический слой упаривают. Чистим на колонке в элюен ге хлороформ-метанол 20: 1. Получают соединение 34 с выходом 70%.
Соединение 34 перемешивают в диоксане, насыщенном ПС1, при комнатой температуре 1 ч, осадок отфильтровывают. Получают соединение 1 (6) с выходом 78%. ПМР спектр соединения 1(6) представлен на Фиг. 6.
Пример 7. 10-{4-[(2-Амино-этилкарбамоил)-метил]-бензил } -5.5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 - дигидро-5Я- дибензо[Ь,1] [ 1 ,4 ]тиазепин-8-карбоповой кисло ι ы [ 3-(4-бснзил-пипсриди н- 1 - ил)-пропил]-амид 1(7) получают по нижеследующей Схеме 7.
Figure imgf000032_0001
1 (7)
Схема 7.
Соединение 35 растворяют в хлороформе, добавляю т 1 .1 зкв КДИ и перемешивают при комнатной температуре 1 ч, затем прибавляют бок-эгилендиамин и перемешивают ночь при комнатной температуре. Промывают водой и органический слой упариваем. Хроматографируют на силикагеле смесью хлороформа с метанолом (20: 1 ). Получают соединение 36 с выходом 70%. Соединение 36 перемешивают в диоксане насыщенном НС1 при комнатной температуре 1 ч, осадок отфильтровываем. Получают соединение 1(7) с выходом 78%. ПМР спектр соединения 1(7) представлен на Фиг. 7. Пример 8. 2-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)-эгилопый эфир 10-(3- хлорбензил)-5,5,1 l-ipiioKco-Ι ϋ,1 1-дигидро-5Я-дибс1по[Ь,1][1 ,4]тиазегшн-8-карбоновой кислоты 1 8) получают но нижеследующей Схеме 8.
Figure imgf000033_0001
Схема 8.
Соединения 37 и 11 растворяют в ТГФ в соотношении 1 : 1 и при перемешивании добавляют 1 э в дициклогексилкарбодиимида и 1 экв Et3N. Перемешивают ночь при 50°С. Охлаждают, выпавший осадок фильтруют, а маточник упаривают и чистят па HPLC. Получают соединение 1(8) с выходом 10%. ПМР спектр соединения 1(8) представлен на Фиг. 8.
Пример 9. 10-(4-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1 -ил)- гилкарбамоил]- метил } -бензил)-5,5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5//-дибензо[Ь,1] [ 1 ,41 гиазепин-8- карбоновой кислоты [3-(4-бензил-пиперидин-1-ил)-пропил]-амид 1(9) получают по нижеследующей Схеме 9.
Соединения 35 и 37 растворяют в ТГФ в соотношении 1 : 1 и при перемешивании добавляют 1 экв дициклогексилкарбодиимида и 1 экв Et3N. Перемешивают ночь при 50°С. Охлаждают, выпавший осадок фильтруют, а маточник упаривают и чистят па I 1PLC. Получают соединение 1 (9) с выходом 10%. ПМР спектр соединения 1 (9) представлен на Фиг. 9.
Figure imgf000034_0001
Схема 9.
Пример 10. ^У-[2-({Л^-(Метоксикарбоиил)-Лг-[(1 ,5-диметокси-1 ,5-диоксопснтан- ил)карбамоил]-Р-аланил } амино)этил]-10-(3-хлорбензил)-5.5, 1 1 -триоксо- 10, 1 1- дигидродибензо[0. ][1,4]тиазепин-7-карбоксамид 1(10) получают по нижеследующей Схеме 10.
Figure imgf000034_0002
38 39 40
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000035_0002
1(10)*HCI
Схема 10. К суспензии трифосгена (4.2 г, 0014 моль) в СН2С12 при 0°С медленно прикапывают раствор, состоящий из 1 1 г (0.038 моль) соединения 38 и 12.6 г (0.098 моль) DIPEA в СН2С12. Перемешивают смесь 30 минут при 0°С, затем добавляют одной порцией раствор 8.1 г (0.038 моль) соединения 39 и 10.8 г (0.084 моль) DIPEA в С1 СЬ. Затем перемешивают еще 15 мин, органический слой отделили, промыли водой и хроматографируюг на силикагеле CHCbj/McOH (98:2). Получают соединение 40 с выходом, 53%. Растворяют 6 г соединения 40 в этилацетате, добавляют 0.6 г Pd/C ( 10%). Смесь гидрируют в автоклаве при 2 атм 17 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упарили. Получают 5 г соединения 41 , которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки. К раствору 4.8 г (0.013 моль) соединения 41 в СН2С12 при комнатной температуре присыпали 2.6 г КДИ (0.016 моль). Через 2 часа добавляют 2.2 г (0.013 моль) бок-этилендиамина. Смесь перемешивают около 18 часов, разбавляют водой, продукт экстрагируют СН С12 и хроматографируют на силикагеле смесью СНС13/МеОН (99:1). Получают 4.4 г (66%) соединения 42. К раствору 4.4 г соединения 42 в диоксане добавляют 5 экв 3N НС1 в диоксане. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре, затем упаривают досуха. Получают соединение 43 с выходом 90%. Смешивают 0.8 г (0.002 моль) соединения 43, 0.85 г (0.002 моль) соединения 11. 0.4 г NEt3 (0.004 моль) и 0.4 г (0.002 моль) Л^-(димстиламинопропил)-Л^ '-этилкарбодиимида гидрохлорид в THF. Реакционную массу перемешивают при 60°С два дня. 3ai cM добавляют 0.5 г (0.012 моль) LiOH H20 и 2 мл воды. Через 24 часа добавляют 0.72 г (0.012 моль) уксусной кислоты. Реакционную массу упариваю i и очистили HPLC. Получают соединение 44 с выходом 7%. ПМР спектр соединения 1(10) представлен на Фиг. 10. Гидрохлорид 1(10)*НС1 получают добавлением к соединению 1(10) растворением в этилацетате, насыщенном ПО. Полученный в осадке гидрохлорид фильтруют, сушат, очищают перекристаллизацией. Аналогичным образом получают гидрохлориды соединений, полученных в примерах 1-9 и 1 1 -14.
Пример 11. N3-(2-{ [(4- { [7- { [ [3-(4-Беизилпиперидин- 1 -ил)пропил |(фенил )амино|- карбонил } -5,5, 1 1 -триоксо-дибензо[й ] [ 1 ,4]тиазепин- 10( 1 1 Я)-ил ]метил } фснил)ацетил |- амшю}этил)-Л^-{[(1 ,3-дикарбоксипропил)амино|карбонил}глутамин 1(11) получают по нижеследующей Схеме 1 1.
Смешивают 1.6 г (0.0024 моль) кислоты 35, 1 г (0.0024 моль) эфира 43, 0.5 г NEt3 (0.0048 моль) и 0.45 г (0.0024 моль) -(димстиламинопропил)-./У*Э1 илкарбодиимида гидрохлорид в THE. Реакционную массу перемешивают при 60°С два дня. Заюм, не выделяя продукт 45, добавляют 0.0144 моль, 0.6 г LiOH H20 и 2 мл воды. Через 24 ч добавляют 0.86 г (0.014 моль) уксусной кислоты. Реакционную массу упаривают и очистили HPLC. Получают соединение 1(11) с выходом 10%. П Р спектр соединения 1(11) представлен на Фиг.11.
Figure imgf000037_0001
Схема 11. Пример 12. 4-[4-(Диметиламшю)феш1л]- -(4-{ [(2,5-диоксоиирролидии-1 - ил)окси]карбонил}фенил)-7,8,9Л0-тетрагидро-4#-[1 ]бенз иено[3,2-/]пирроло[1.2- а|[ 1 ,4]диазепин-5(6#)-карбоксамид 2(1) получают по нижеследующей Схеме 12.
Figure imgf000038_0001
2(1 )
Схема 12.
Смесь 3.0 г соединения 46 и 1.7 г 4-диметиламинобен альдсгида в 40 мл этанола кипятят с обратным холодильником 10 ч, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют выпавший осадок. Осадок растворяют в 50 мл воды и подщелачивают 10% КОН до рН 10. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 47 с выходом 35%. Растворяют 0.6 г соединения 47 и 0.32 г этил 4- изоииапатобензоата в 30 мл диоксапа и перемешивают ночь при комнатной температуре. Выпавший осадок фильтруют. Получают соединение 48 с выходом 30%. Растворяют 140 мг соединения 48 в 5 мл 50% водного этанола, добавляют 32 мг LiOH и перемешивают ночь при комнатной температуре. Этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10% соляной кислотой до рН=3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 49 с выходом 60%. Рас пюряют 80 мг соединения 49 в 10 мл ТГФ, в атмосфере аргона при перемешивании добавляю т 22 мг N- гидроксисукцинимида и 39 мг дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистят флэш - хроматографией на силикагсле ( люент этилапетат). Получают соединение 2(1) с выходом 50%. LCMS спектр соединения 1(12) представлен на Фиг. 12 (М+1 ) = 624.
Пример 13. 4-[4-(Димстиламино)фенил]-. У-(4-{2-[(2,5- диоксопирролидин- 1 - ил)окси]-2-оксоэтокси}фенил)-7,8,9,10-тетрагидро-4Я-[1 ]бензотиено[3,2-: ]пирроло[ 1.2- а|[1 ,4]диа епин-5(6Я)-карбоксамид 2(2) получают по нижеследующей Схеме 13.
Figure imgf000039_0001
Схема 13, Растворяют в 30 мл диоксана 0.8 г соединения 50 и 0.5 г соединения 47 и перемешивают ночь при комнат ной температуре. Раствори тель упариваю т, ос таток чистят колоночной хроматографией. Элюент хлороформ - метанол 39: 1. Получаю т соединение 51 с выходом 5%. Растворяют 6 мг соединения 51 в 5 мл 50% водного этанола, добавляют 14 мг LiOH и перемешивают ночь при комнатной температуре. После этого этанол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляют 10%> соляной кислотой до рН 3. Выпавший осадок фильтруют, промываю т водой, сушат. Получают соединение 52 с выходом 60%. Растворяют 50 мг соединения 52 в К) мл ТГФ. в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 10 мг N-гидроксисукцинимида и 19 мг дипиклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтруют, маточный раствор упаривают, чистя т флэш - хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат). Получают соединение 1 (13) с выходом 50%. ПМР спектр соединения соединения 2(2) представлен на Фиг. 13.
Пример 14. 2,5-Диоксопирролидин-1 -ил Л-[4-(5-{ [(3,4-димстоксифенил)амино]- карбонил}-5,6,7,8,9, 10-гексагидро-4Я-[1 ] бензотиено[3,2-/]пирроло[1.2-«|[ 1 ,4 |диазепин- 4-ил)фенил]-/У-метилглицинат 2(3) получают по нижеследующей Схеме 14.
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
Смесь 1.68 г соединения 46 и 1.45 г соединения 53 в 25мл этанола кипятят с обратным холодильником 10 ч, охлаждают до комнатной температуры, филырую г выпавший осадок растворяют в 50 мл воды и подщелачивают 10% КОН до рП 10. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 54 с выходом 19%. Растворяют в 10 мл диоксана 0.54 г соединения 54 и 0.29 г диметоксианилина и перемешивают ночь при комнатной температуре. Рас пюритель упаривают, остаток чистят колоночной хроматографией. Элюент - хлороформ : метанол 39: 1. Получают соединение 55 с выходом 65%. Растворяют 500 мг соединения 55 в 5 мл 50% водного этанола, добавляют 32 мг LiOH и перемешивают ночь при комнатной температуре. Э танол упаривают на роторном испарителе, водный раствор подкисляю 10% соляной кислотой до рН 3. Выпавший осадок фильтруют, промывают водой, сушат. Получают соединение 56 с выходом 60%. Растворяют 360 мг соединения 56 в 10 мл ТГФ. в атмосфере аргона при перемешивании добавляют 71 мг N-гидроксисукцинимида и 127 мг дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают ночь при комнатной температуре ночь, после этого выпавший осадок фильтрую т, маточный раствор упариваю т, чистят флэш - хроматографией на силикагеле (элюент этилацетат). Получают соединение 2(3) с выходом 50%. LCMS спектр соединения 2(3) представлен на Фиг. 14 (М+1 ) - 684.
Пример 15. Общий способ получение модифицированных белков (конъюгатов). Белок модифицируют веществом общей формулы 1 или 2 в молярном соотношениии ο ι 1 : 1 до 1 : 100. Навеску вещества общей формулы 1 или 2 растворяю т в 50 мкл ДМСО, чатем медленно добавляют фосфатный солевой буферный раствор (ФСБ, рН 7,4) и добавляют раствор белка в ФСБ. Конечная концентрация белка в реакционных смесях составляла 1 мг/мл. Реакцию ведут при комнатой температуре в течение 20 ч при постоянном перемешивании. Реакционную массу центрифугируют, фильтрат наносят па гель Superdex 75 (GE, США); высота столба носителя - 23 см; подвижная фаза - ФСБ; скорость потока— 57,3 см/час; обьем инжекции— 2,2% от объёма носителя. Чис т коныогата определяют с использованием ВЭЖХ на аффинной колонке Bio-Monolith Protein A (Agilent, США).
По данному способу получены, в частности, конъюгаты:
КР1(1) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10,
Р1(2) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(2), в соотношении 1 : 100,
КР1(3) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(3), в соотношении 1 : 100,
Р1(4) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(4), в соотношении 1 : 100,
Р1(5) - ритуксимаба (Р) с соединением 1(5), в соотношении 1 : 10,
Р2(1) - ритуксимаба (Р) с соединением 2(1), в соотношении 1 : 100,
КЦ1(1) - цетуксимаба (Ц) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10,
И1(1) - интерферона альфа (И) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10,
КМ1(1) - белка миелина (Р) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10,
С1(1) - белка комплимента Clq (С) с соединением 1(1), в соотношении 1 : 10. На Фиг. 15 приведена для примера хроматограмма коныогата Р1(1), свидетельствующая о содержании основного вещества более 98 %.
Пример 16. Определение активности конъюгатов по о ι ношению к CD 16а рецептору. В эксперименте используют стандартные материалы и оборудование для иммуно- ферментного анализа. В лунки 96-и луночного планшета сорбируют CD16a из раствора 3,3 мкг/мл в фосфатпо-солевом буфере в объёме 75 мкл/лунку. Сорбцию вели при 4°С в течение 16 часов. Раствор CD 16а удаляют из планшета, лупки заполняли 2%-иым раствором БСА в ФСБ-П (150 мкл/лунку). Планшеты инкубируют при 37°С в течение 2 часов и трижды отмывали буфером ФСБ-П (каждый раз по 300 мкл/лунку). 3ai CM лупки планшета заполняли растворами коныогатми в ФСБ-П по 50 мкл/лунку, в разведениях от 0,25 до 256 мкг/мл. Каждому разведению одного коныогата в планшс1е соответствовало три лунки. Для контроля над неспецифической сорбцией образцов часть лунок заполняли 2%-пым раствором БСА. Планшет инкубируют один час при 37°С в шейкере для ИФА (скорость вращения 180 оборотов/мин). Планшет отмывали пять раз по 300 мкл/лунку ФСБ-П и заполняли раствором белка, модифицированного пероксидазой хрена (по 75 мкл/лунку, в рабочем разведении, которое указано в описании к иммуноконъюгату). Планшет инкубируют 30 минут, отмывали ия п, раз по 300 мкл/луику ФСБ-П и заполняли раствором 'ГМБ ( 100 мкл/луику). Визуально оценивали глубину протекания фермента1 ивпой реакции и останавливали последнюю добавкой 50 мкл/лунку 500 мМ раствора серной кисло . Измеряют оптическую илошость в лунках планшета при комнатной температуре на длине волны 450 нм. Для oopaoo i Kn результатов эксперимента используют программу GraphPad Prism 5.0.
На Фиг. 16 представлены зависимости связывания некоторых кон огагов по отношению к CD 16а рецептору, из которых рассчитаны (Таблица 1 ) константы диссоциации комплексов конъюгатов с CD 16а рецептором (активность коныогагов по отношению к CD 16а рецептору - Kj). Как видно из таблицы активность конъюгатов ритуксимаба в 10-100 раз выше активности неконъюгировашюго ритуксимаба.
Таблица 1. Активность (Ка) ритуксимаба и его конъюгатов по отношению к CD 16а рецептору.
Figure imgf000043_0001
На Фиг. 17 представлены зависимости связывания интерферона альфа и конъюгата интерферона альфа с соединением 1(1) с CD16a рецептором. Зависимосп, оптической плотности на длине волны 450 нм от концентрации введенного в ИФА конъюгата. Как видно из таблицы 2, активность конъюгата интерферона выше активности неконъюгировашюго интерферона альфа.
Таблица 2. Активность (Ка) интерферона альфа (И), и его конъюгата КИ1(1) по отношению к CD 16а рецептору.
Figure imgf000043_0002
Пример 17. Эффективность конъюгатов в тесте на антитело-зависимую (ритуксимаб-зависимую) клеточную цитотоксичность. Эффективность коныогагов ритуксимаба в сравнении с неконъюгированным ритуксимаба была оценены в TCC I C на антитело-зависимую клеточную токсичность. В качестве клеток-мишеней были использованы СО20-положительные клетки линии Daudi (В-клеточиая лимфома Беркита). В качестве эффекторных клеток используют пулироваиные периферические мононуклеарные клетки крови из 5 здоровых доноров, выделенные по стандартному протоколу.
Разведения исследуемых конъюгатов и ритуксимаба были приготовлены в среде RPMI 1640. 50 мкл растворов исследуемых конъюгатов и ритуксимаба были помещены в лунки 96-луиочного круглодонного планшета. Клетки линии Daudi ресусиеидирую г в среде RPMI 1640 до концентрации 8x105 клеток/мл. 75 мкл полученной клеточной суспензии добавляют к приготовленным растворам ритуксимаба в планшете. Планшет инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 50 минут. Добавляют 75 мкл суспензии клеток РВМС (размороженных непосредственно перед экспериментом) в лунки к клеткам Daudi в соотношении 50:1 (РВМС : клетки Daudi). В качес те контрольных растворов, добавляют среду RPMI 1640 (негативный контроль, содержавший только эффекторные клетки), а также 4% раствор Тритона Х-100 (положительный контроль, содержавший только клетки-мишени). Планшеты центрифугируют 3 минуты со скоростью 500 об/мин. Инкубирую т планшеты в термостате в течение 8 часов при 37°С.
После инкубации полученные образцы были осаждены центрифугированием при 1200 об/мин в течение 10 минут. 50 мкл супернатанта были перенесены в новый планшет, где были смешаны с 50 мкл реакционной смеси (набор для де!екции лактат дегидрогеназы, Promega (США), каталожный номер G1780). Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 25 минут, после чего реакцию останавливали. Измеряют поглощение па плашечном спектрофотометре при длине волны 490 им.
Цитотоксичность рассчитывалась по формуле (все величины в единицах оптической плотности):
цитотоксичность, % = 100*(А - (SE-ST))/(Hr-ST),
где А - уровень сигнала в смеси эффекторных клеток и клеток-мишеней;
SE - уровень сигнала эффекторных клеток;
ST - уровень сигнала клеток-мишеней;
НЕ - сигнал, соответствующий максимальному лизису клеток-мишеней. Результат измерения эффективности полученных кон огатов показан на примере коныогата КР1 (1) (Фиг. 18) CON 4564. Полученный конъюгат обладал усиленным ни готоксическим действием на клетки-мишени (Daudi). В частности, ~35%-иый лизис клеток достигается при концентрации ритуксимаба ~1 мкг/мл. в то же время, сходный цитотоксический эффект коныогата Р1(1) CON 4564 достигается при концсш рации -0,001 мкг/мл. Аналогичная зависимость наблюдается и в случае коныогата Р1 (2) (Фиг. 19). Таким образом, активность у копъюгатов ритуксимаба на 2-3 порядка выше, чем у ритуксимаба.
Пример 18. Получение коныогата ритуксимаба КР1(7) и трас.утумаба КТ1(7). К 1,5 г сахарной части антитела в растворе 100 мМ ацетата натрия, 200 мМ хлорида натрия, рН 5,5 добавляют 2,0 г периодата натрия инкубируют 30 мин при комнатной температуре в темноте при перемешивании. Растворяют 1200 мг соединения 1(7) в 4 мл DMSO. К раствору антитела добавляют 8,4 г гидрокарбоната натрия, затем по каплям добавляют 1230 мкл растворенного в DMSO соединения 1(7) и инкубируют 2 часа.
Очистку проводили на SP-Sepharose (колонка ХК26 GE) ступенчатым градиентом NaCl (буфер 1 : 25 мМ цитрат натрия, рН 4,5. Буфер 2: 25 мМ ц рат натрия, рН ~ 10, 270 мМ). Конъюгат антитела концентрируют в ячейке Amicon через мембрану Milliporc ( MWL 30000, cat. # PLTK07610) до конечной концен трации коныогата 10 мг/мл. После фильтрации в конъюгат добавляют полисорбат-80 до конечной концентрации коныогата КР1(7) или Т1 (7) 0,01%.
Пример 19. Сравнительная активность ритуксимаба (Р) и трастузумаба (Т) и их копъюгатов Р1(7), КТ1(7) по отношению к CD 16а рецептору. Изучение связывания полученных копъюгатов трастузумаба и ритуксимаба с рецептором CD 16а проводили идентично примеру 17.
Сравненительная эффективность и активность (Ка) по отношению к CD 16а рецептору ритуксимаба (Р), трастузумаба (Т) и их коныогатов КР1(7), Т1(7) в тесте антитело-зависимой цитотоксичности представлена на Фиг. 20.
Как видно из полученных данных активность коныогатов КР1(7), Т1(7) по отношению к CD16a рецептору на 1 -2 порядка выше активности нсмодифицированпых ритуксимаба (Р), трастузумаба (Т) (Таблица 3). Таблица 3. Активность (Ка) ритуксимаба (Р), трастузумаба (Т) и их коныогатов КР1 (7), КТ1(7) по отношению к CD 16а рецептору.
Figure imgf000046_0001
Промышленная применимость
Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии, биохимии.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение, обладающее сродством к CD 16а рецептору, предс тавляющее собой 5,5,1 1 -триоксо- 10, 1 1 -дигидро-5Я-дибензо[0! ][1,4]тиазепин общей формулы 1 или 5 ,6,7,8,9, 10-гексагидро-4//-[ 1 ]бсизотиено[3,2:/1пирроло| 1 ,2-а | [ 1 ,4 |диазеиин общей формулы 2, или его фармацевтически приемлемая соль,
Figure imgf000047_0001
в кото ом R1 выбран из группы, представляющей собой (CIl3)2N-,
Figure imgf000047_0002
R2 выбран из группы, представляющей собой
Figure imgf000047_0003
где R3 в качестве концевого заместителя представляет собой, -NII2,
Figure imgf000048_0001
a R4 представляет собой II или Ci-Сзалкил.
2. Соединение общей формулы 1 по п. 1, в котором R1 выбран из группы, включающей в себя:
Figure imgf000048_0002
R2 выбран из группы, включающей в себя:
Figure imgf000048_0003
Figure imgf000049_0001
где R4 = Н или С)-С3алкил.
3. Соединение общей формулы 2 по п.1, в котором
R1 представляет собой (CH3)2N- или
Figure imgf000049_0002
R2 выб ан из группы, включающей в себя:
Figure imgf000049_0003
4. Соединение по п.1, выбранное из группы, включающей в себя
2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир (3-хлорбензил)-5,5,11-триоксо-10,11-дигидро-5//- дибензоb,j\ [ 1 ,4 ]тиазепин-7-карбоновой кислоты,
2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир (4-{[10-(3-хлорбспзил)-5,5Л 1-1риоксо-10,11- дигидро-5//-дибснзо[6, |[1,4]тиазепин-7-карбонил]-амипо}-фенокси)-уксусной кисло п . 2,5-диоксопирролидин-1 -иловый эфир 4-{[10-(3-хлорбснзил)-5,5,11-фиоксо-10.11- дигидро-5^дибснзо[Л,/][1,4|тиазспин-7-карбонил|-амипо}-фенилкарбоиовой кислой,!. 2,5-диоксо-пирролидин-1-иловый эфир 3- [8-(3,4-диметоксифенилкарбамоил)-5,5,11- триоксо-5,11-дигидро- дибензо[ ][1,4]тиазепин-10-илметил]-бензойной кислоты, 2,5-диоксо-пирролидин-1 -иловый эфир (4-{8-[3-(4-бензилпипермдин-1-ил)- пропилкарбамоил] -5,5,11 -триоксо-5 , 1 1 -дигидро-дибензо[6,/] [ 1 ,4]тиазепин- 10-илметил } - фенил)-уксусной кислоты,
10-(3 -хлорбензил)-5,5 , 11 -триоксо- 10,11 - дигидро-5Я- дибензо [b,f] [ 1 ,4]тиазепин-8- карбоновой кислоты (2-аминоэтил)-амид,
10- {4- [(2-амино-этилкарбамоил)-метил] -бензил } -5 ,5 , 1 1 -триоксо- 10, 11 -дигидро-5Я- дибензо [b,f] [ 1 ,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты [3 -(4-бензил-пиперидин- 1 -ил)-пропил] - амид,
2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)-этиловый эфир 10-(3-хлорбензил)-5,5,1 1- триоксо- 10, 11 -дигидро-5Я- дибензо [b,f] [ 1 ,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты,
10-(4-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-пиррол-1-ил)-этилкарбамоил]-метил}-бензил)- 5,5,11- триоксо-10,11-дигидро-5Я-дибензо[Ь,. [1,4]тиазепин-8-карбоновой кислоты [3-(4-бензил- пиперидин- 1 -ил)-пропил]-амид,
N-[2-({N-(MeTOKCHKap6oHra)-N-[(l ,5-диметокси- 1 ,5-диоксопентан-2-ил)карбамоил]-р- аланил}амино)этил]-10-(3-хлорбензил)-5,5,1 1 -триоксо- 10,11- дигидродибензо[й ][1,4]тиазепин-7-карбоксамид,
N5-(2- { [(4- { [7- { [[3-(4-бензилпиперидин- 1 -ил)пропил](фенил)амино]-карбонил } -5,5, 11 - триоксо-дибензо [δ J [ 1 ,4]тиазепин- 10( 11 Я)-ил]метил } фенил)ацетил] -амино } этил)-^2- {[(1,3-дикарбоксипропил)амино]карбонил}глутамин,
4-[4-(диметиламино)фенил]-Лг-(4-{[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]карбонил}фенил)-
7,8,9,10-тетрагидро-4Я-[1]бензотиено[3,2: ]пирроло[1,2- ][1,4]диазепин-5(6Я)- карбоксамид,
4 - [4-(диметиламино)фенил ] -N-(4- { 2- [(2,5 - диоксопиррол и дин- 1 -ил)окси] -2- оксоэтокси } фенил)-7,8 ,9, 10-тетрагидро-4Я-[ 1 ]бензотиено [3 ,2- | пирроло[ 1 ,2- а][1,4]диазепин-5(6Я)-карбоксамид, и
2,5-диоксопирролидин-1-ил Лг-[4-(5-{[(3,4-диметоксифенил)амино]-карбонил}- 5,6,7,8,9,10-гексагидро-4Я-[1] бензотиено[3,2- ]пирроло[1,2-а][1,4]диазепин-4-ил)фенил]- N-метилглицинат.
5. Модифицированный белок, активный в отношении CD 16а рецептора, выбранный из антитела или аутоантигена, конъюгированного модифицирующим соединением, обладающим сродством к CD16a рецеп тору, выбранным из соединения общей формулы 1 или 2 по п. 1.
6. Модифицированный белок по п. 5, отличающийся тем, ч ю am тело представляет собой ри гуксимаб.
7. Модифицированный белок по п. 5, отличающийся тем, что антитело представляет собой трастузумаб.
8. Модифицированный белок но п. 5, отличающийся тем. чю ан титело представляет собой цетуксимаб.
9. Модифицированный белок по и. 5, отличающийся тем, что аушантиген представляет собой интерферон альфа.
10. Модифицированный белок по п. 5, отличающийся тем, что аутоантиген представляет собой главный белок миелина.
11. Модифицированный белок по п. 5, отличающийся тем, что аутоантиген представляет собой белок комплимента Clq.
12. Способ получения модифицированного белка по п. 5, согласно которому подвергают взаимодействию белок с соединением общей формулы 1 или 2 по п. 1. растворенным в среде органического растворителя, например, диметилсульфоксидс, в интервале молярного соотношения от 1 :3 до 1 : 100 в среде фосфашого солевого буферного раствора (рН 7.4).
13. Фармацевтическая композиция, активная по отношению к CD 16а рецепт ору, в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенная в фармацевтически приемлемую упаковку, содержащая модифицированный белок по п. 5 в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.
14. Лекарственное средство, активное по отношению к CD 16а рецептору, в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенное в фармаце тически приемлемую упаковку, предназначенное для лечения заболевания, вызванного патологическими кленами, включающее в свой состав модифицированный белок по н. 5 или фармацевтическую композицию по п. 13 в терапевтически эффективном количестве.
15. Способ лечения заболевания, вызванного патологическими клетками, которое можно лечить путем опосредованного воздействия па CD 16а рецептор, согласно которому субъекту вводят терапевтически эффективное количество модифицированного белка по п. 5, или фармацевтической композиции но п. 13, или лекарственного среде та по п. 14.
16. Способ по п. 15 лечения аутоиммунного или онкологического заболевания.
17. Способ по п. 16 лечения лимфомы, лимфатической лейкемии или рака молочной железы.
18. Способ по п. 16 лечения аутоиммунной полиэидокринопатии первого типа.
PCT/RU2014/000015 2013-01-16 2014-01-15 КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РЕЦЕПТОРОМ CD16a WO2014112898A1 (ru)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2897629A CA2897629A1 (en) 2013-01-16 2014-01-15 Conjugates and small molecules interacting with cd16a receptor
CN201480003529.7A CN104870428A (zh) 2013-01-16 2014-01-15 与cd16a受体相互作用的缀合物和小分子
AU2014207918A AU2014207918B2 (en) 2013-01-16 2014-01-15 Conjugates and small molecules which interact with the CD16a receptor
EP14740983.3A EP2947074A4 (en) 2013-01-16 2014-01-15 CONJUGATES AND MOLECULES OF LOW DIMENSIONS REACTING WITH THE CD16A RECEIVER
KR1020157020861A KR20150109383A (ko) 2013-01-16 2014-01-15 CD16a 수용체와 상호작용하는 결합체 및 소분자
EA201500506A EA028617B1 (ru) 2013-01-16 2014-01-15 КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РЕЦЕПТОРОМ CD16a
JP2015553677A JP2016505629A (ja) 2013-01-16 2014-01-15 CD16a受容体と相互作用する複合体及び小分子
US14/652,521 US20150368261A1 (en) 2013-01-16 2014-01-15 Conjugates and small molecules which interact with the cd16a receptor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013101884 2013-01-16
RU2013101884/04A RU2519546C1 (ru) 2013-01-16 2013-01-16 КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РЕЦЕПТОРОМ CD16а

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014112898A1 true WO2014112898A1 (ru) 2014-07-24

Family

ID=51209887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2014/000015 WO2014112898A1 (ru) 2013-01-16 2014-01-15 КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РЕЦЕПТОРОМ CD16a

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20150368261A1 (ru)
EP (1) EP2947074A4 (ru)
JP (1) JP2016505629A (ru)
KR (1) KR20150109383A (ru)
CN (1) CN104870428A (ru)
AU (1) AU2014207918B2 (ru)
CA (1) CA2897629A1 (ru)
EA (1) EA028617B1 (ru)
RU (1) RU2519546C1 (ru)
WO (1) WO2014112898A1 (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3116316B1 (en) 2014-03-13 2019-07-10 Indiana University Research and Technology Corporation Hepatitis b core protein allosteric modulators
TWI786639B (zh) 2015-09-15 2022-12-11 美商艾森伯利生物科學公司 B型肝炎核心蛋白質調節劑
CN109937201A (zh) 2016-09-15 2019-06-25 组装生物科学股份有限公司 乙型肝炎核心蛋白调节剂
TWI754702B (zh) * 2016-12-28 2022-02-11 德商Ucb製藥有限公司 (氮雜)吲哚-和苯並呋喃-3-磺醯胺類
CN110621672A (zh) 2017-03-02 2019-12-27 组装生物科学股份有限公司 环状磺酰胺化合物及其使用方法
EP3596070A1 (en) 2017-03-13 2020-01-22 Assembly Biosciences, Inc. Process for making hepatitis b core protein modulators
US11572370B2 (en) 2018-01-08 2023-02-07 Biohaven Therapeutics Ltd. CD16A binding agents and uses thereof

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
WO2005044859A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
RU2281947C1 (ru) * 2005-07-05 2006-08-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Исследовательский Институт Химического Разнообразия" Аннелированные карбамоилазагетероциклы, фокусированная библиотека, фармацевтическая композиция и способ получения
WO2007047737A1 (en) * 2005-10-17 2007-04-26 Acadia Pharmaceuticals Inc. Cb-1 modulating compounds and their use
US20090264300A1 (en) * 2005-12-01 2009-10-22 Nuevolution A/S Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries
EA013015B1 (ru) * 2005-03-15 2010-02-26 Менарини Интернешнл Оперейшнз Люксембург С.А. N-ГИДРОКСИАМИДЫ, ω-ЗАМЕЩЕННЫЕ ТРИЦИКЛИЧЕСКИМИ ГРУППАМИ, КАК ИНГИБИТОРЫ ГИСТОНДЕАЦЕТИЛАЗЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ФОРМАХ
WO2010081173A2 (en) * 2009-01-12 2010-07-15 Cytomx Therapeutics, Llc Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
US20110124599A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. 2,4-Pyrimidinediamine Compounds and Prodrugs and Their Uses
WO2011069074A2 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Genentech, Inc. Methods of treating metastatic breast cancer with trastuzumab-mcc-dm1
US20120003248A1 (en) 2003-11-06 2012-01-05 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0510790D0 (en) * 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
WO2008036139A2 (en) * 2006-06-07 2008-03-27 The Regents Of The University Of California Inhibitors of mshc and homologs thereof, and methods of identifying same
US9040508B2 (en) * 2008-12-08 2015-05-26 Vm Pharma Llc Compositions of protein receptor tyrosine kinase inhibitors

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
WO2005044859A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
EA015009B1 (ru) 2003-11-05 2011-04-29 Гликарт Биотехнологи Аг АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
US20120003248A1 (en) 2003-11-06 2012-01-05 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
EA013015B1 (ru) * 2005-03-15 2010-02-26 Менарини Интернешнл Оперейшнз Люксембург С.А. N-ГИДРОКСИАМИДЫ, ω-ЗАМЕЩЕННЫЕ ТРИЦИКЛИЧЕСКИМИ ГРУППАМИ, КАК ИНГИБИТОРЫ ГИСТОНДЕАЦЕТИЛАЗЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ФОРМАХ
RU2281947C1 (ru) * 2005-07-05 2006-08-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Исследовательский Институт Химического Разнообразия" Аннелированные карбамоилазагетероциклы, фокусированная библиотека, фармацевтическая композиция и способ получения
WO2007047737A1 (en) * 2005-10-17 2007-04-26 Acadia Pharmaceuticals Inc. Cb-1 modulating compounds and their use
US20090264300A1 (en) * 2005-12-01 2009-10-22 Nuevolution A/S Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries
WO2010081173A2 (en) * 2009-01-12 2010-07-15 Cytomx Therapeutics, Llc Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
US20110124599A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. 2,4-Pyrimidinediamine Compounds and Prodrugs and Their Uses
WO2011069074A2 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Genentech, Inc. Methods of treating metastatic breast cancer with trastuzumab-mcc-dm1

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERGE S.M. ET AL.: "Pharmaceutical Salts", J.PHARM.SCI., vol. 66, 1977, pages 1 - 19, XP002675560, DOI: doi:10.1002/jps.2600660104
DATABASE REGISTRY [online] 1 July 2008 (2008-07-01), XP055263669, accession no. STN Database accession no. 1031967-34-6 *
DATABASE REGISTRY 29 July 2008 (2008-07-29), accession no. 031571-30-1 *
GRILLO-LOPEZ A.-J ET AL., SEMIN. ONCOL., vol. 26, 1999, pages 66 - 73
J. A. BOWELS ET AL., BLOOD, vol. 108, 2006, pages 2648 - 2654
K.-H. HEIDER ET AL., BLOOD, vol. 118, 2011, pages 4159 - 4168
NICULESCU; DUVAZ; SPRINGER, ADV. DRUG DEL. REV., vol. 26, 1997, pages 151 - 172
PAYNE, G., CANCER CELL, vol. 3, 2003, pages 207 - 212
R. L. FERRIS ET AL., J. CLINICAL ONCOLOGY, vol. 28, no. 28, 1 October 2010 (2010-10-01), pages 4390 - 4399
See also references of EP2947074A4
SYRIGOS; EPENETOS, ANTICANCER RESEARCH, vol. 19, 1999, pages 605 - 614
TRAIL ET AL., CANCER IMMUNOL. IMMUNOTHER., vol. 52, 2003, pages 328 - 337

Also Published As

Publication number Publication date
AU2014207918B2 (en) 2017-06-08
CA2897629A1 (en) 2014-07-24
AU2014207918A1 (en) 2015-06-11
EP2947074A1 (en) 2015-11-25
EP2947074A4 (en) 2016-06-29
EA201500506A1 (ru) 2015-08-31
US20150368261A1 (en) 2015-12-24
EA028617B1 (ru) 2017-12-29
KR20150109383A (ko) 2015-10-01
CN104870428A (zh) 2015-08-26
JP2016505629A (ja) 2016-02-25
RU2519546C1 (ru) 2014-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014112898A1 (ru) КОНЪЮГАТЫ И МАЛЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РЕЦЕПТОРОМ CD16a
AU2013296627B2 (en) Deuterated ibrutinib
WO2018188641A1 (zh) 一种mor激动剂与kor激动剂的药物组合物及其用途
KR20170068597A (ko) 브로모도메인 저해제
WO2019109937A1 (zh) Kor激动剂与mor激动剂联合在制备治疗疼痛的药物中的用途
JP2021519308A (ja) 転写活性化タンパク質のイミダゾピペラジン阻害剤
CN112839944B (zh) 用于治疗狂犬病的化合物及其方法
CZ63799A3 (cs) Spirocyklické metalloproteázové inhibitory
WO2017023994A1 (en) Small molecule based antibody-recruiting compounds for cancer treatment
EP3307068A1 (en) Mct4 inhibitors for treating disease
WO2021061894A1 (en) Erk5 degraders as therapeutics in cancer and inflammatory diseases
US20130338372A1 (en) Substituted Imidazoline Compounds
JPWO2020032105A1 (ja) 光学活性な架橋型ピペリジン誘導体
CN103664734B (zh) 杂环羟肟酸类化合物及其药用组合物和应用
EP4159736A1 (en) Novel tricyclic aromatic heterocyclic compound and preparation method therefor, pharmaceutical composition and use thereof
US9193699B2 (en) Apoptosis inducing compounds
US20230312588A1 (en) Imidazopiperazine inhibitors of transcription activating proteins
CA3233083A1 (en) Small molecules for dot1l degradation and uses thereof
WO2023133284A2 (en) Compounds and methods for treating friedreich's ataxia
WO2023133260A2 (en) Chemical targeting swi/snf related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4 (smarca4) and use in diffuse intrinsic pontine glioma (dipg)
CN115260168A (zh) N-烷基取代芳基异喹啉酮化合物,其制备方法及药物组合物和应用
JP2022526979A (ja) Atp競合性akt阻害剤gdc-0068とe3リガーゼリガンドとの結合によるaktの分解および使用方法
NZ738078B2 (en) Mct4 inhibitors for treating disease

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14740983

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201500506

Country of ref document: EA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014207918

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20140115

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14652521

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2897629

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014740983

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015553677

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20157020861

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A