WO2014095891A1 - Procédé de détection de trichophytons et de pathologies associée - Google Patents

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WO2014095891A1
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protease
subtilisin
seq
trichophyton
leucine aminopeptidase
Prior art date
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PCT/EP2013/076939
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André Jomard
Bruno Mehul
Olivier Roye
Gilbert Laffet
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Galderma Research & Development
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Publication date
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
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    • G01N2333/958—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from fungi

Definitions

  • the present invention relates to the detection of the presence of fungi of the genus Trichophyton in humans or animals, in the skin and superficial body growths.
  • the invention relates to a method for detecting trichophytons, comprising a step of determining the presence in a sample of skin or integument of at least one protease selected from five particular proteases.
  • the subject of the invention is also specific monoclonal antibodies directed against these proteases and a diagnostic kit containing them.
  • Trichophytons are parasitic fungi that develop on the skin, scalp or nails and cause dermatophytosis in humans or animals. In humans, for example, trichophytons may be responsible for cir - cular herpes on the skin, ringworm on the scalp, kerion or trichophytic sycosis on the beard and onychomycosis on the nails.
  • fungal infections of the skin or superficial body growths may be due to fungal agents other than trichophyton, such as yeasts, molds or other dermatophytes, and in this case the treatment must be different.
  • fungal agents other than trichophyton such as yeasts, molds or other dermatophytes
  • the treatment must be different.
  • they can be confused with other pathologies or traumatisms of the skin or integuments.
  • clinical signs of nail dystrophy such as Psoriasis, trauma, nail tumor, lichen planus and bacterial infection resemble onychomycosis and can be confusing.
  • the invention therefore relates to the use of at least one protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin - like protease 6, subtilisin - like protease 7, leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2, for the detection of the presence, in a sample of skin or human or animal dander, of at least one trichophyton.
  • the invention provides a method for detecting the presence of at least one trichophyton, comprising a step of determining the presence in a sample of skin or dander derived from a human being or an animal susceptible of to be infected with a trichophyton, of at least one protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7, leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2.
  • Trichophyton sought and detected are involved in pathologies of the skin and / or superficial body growths.
  • dander in the sense of the invention is meant any protective epidermal productions, annexes or integuments, containing a high percentage of keratin such as hair, hair and nails.
  • the presence of at least one of these proteases at the level of the skin or integuments is specific only to the presence of trichophytons.
  • This determination can be made by a variety of means that can be used for rapid, easy to use, and trichophyton - specific diagnostic tools, thus enabling effective and targeted treatment to be implemented in a very short time. Two means are particularly suitable, determination by mass spectrometry and immuno-detection.
  • the invention also relates to a monoclonal antibody directed against dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6 or leucine aminopeptidase 2 or a fragment of this antibody capable of binding respectively to dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6 or leucine aminopeptidase 2, and a kit comprising such an antibody.
  • Figure 1 describes the limit of quantification of dipeptidyl peptidase V.
  • the invention thus relates to the use of at least one protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7, leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2, for the detection of the presence, in a sample of skin or human or animal dander, of at least one trichophyton involved in a mycoin of the skin and / or superficial body growths.
  • protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7, leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2
  • this use consists of the implementation of a method for detecting the presence of at least one trichophyton involved in a mycoin of the skin and / or superficial body growths, comprising a step of determining the presence in a sample of skin or integument derived from a human being or from an animal likely to be infected by a trichophyton, at least one protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7 , leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2.
  • the determination of the presence of at least one of the proteases is carried out in vitro from a sample of skin or integuments, but reflects the presence of this protease in vivo at the level of the skin or integuments of the person where the animal from which the sample was taken.
  • the samples used for the implementation of the invention are obtained by any suitable means.
  • the sample is a nail sample, it is preferably obtained by scraping the nail bed or by piercing the nail with a micro chigno. This latter method of sampling is described in US Pat. No. 7,848,799.
  • the sample comes from a mycotic lesion of the skin, it is preferably obtained by scraping with the aid of a curette.
  • the presence in the sample of at least one protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin - like protease 6, subtilisin - like protease 7, leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2 is synonymous infection with at least one trichophyton.
  • proteases secreted specifically by trichophytons playing a role in the digestion of keratins and which, according to the invention, are found in the skin and integuments infected by at least one trichophyton.
  • the use according to the invention is suitable for the detection of any trichophyton involved in a mycosis of the skin and / or superficial body growths in humans or animals, in particular Trichophyton bullosum, Trichophyton circonvolutum, Trichophyton concentricum, Trichophyton eboreum, Trichophyton equinum, Trichophyton eriotrephon, Trichophyton fischeri, Trichophyton gourvilii, Trichophyton interdigital, Trichophyton Kanei, Trichophyton krajdenii, Trichophyton longifusum, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton phaseoliforme, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton soudanense, Trichophyton sp .
  • Trichophyton sp. FSU 10097 Trichophyton sp. IFM 411 72, Trichophyton sp. LM 10725, terrestrial Trichophyton, Trichophyton thuringiense, Trichophyton tonsurans, Trichophyton vanbreuseghemii, Trichophyton verrucosum, Trichophyton violaceum and Trichophyton yaoundei, regardless of the strain if there are several.
  • the use according to the invention is particularly suitable for the detection of interdigital Trichophyton and / or Trichophyton rubrum, even more preferably of Trichophyton rubrum, whatever the strain.
  • the detection of the presence of trichophytons by the determination of at least one protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7, leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2 according to the invention can in particular be used for the screening, the therapeutic monitoring and / or the diagnosis of a pathology in humans or animals, in particular of a myco linked to a trichophyton infection.
  • the invention also relates to at least one protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7, leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2, for use in a screening method. , for therapeutic monitoring and / or diagnosis of a pathology related to infection with at least one trichophyton,
  • the invention is particularly directed to the detection, therapeutic monitoring and / or diagnosis of onychomycosis.
  • the invention also targets at least one protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7, leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2, for use in a screening method. , therapeutic monitoring and / or diagnosis of onychomycosis.
  • therapeutic monitoring is meant the use according to the invention and more particularly the method for detecting the presence of trichophytons in a sample of skin or appendages of a human being or an animal to follow the evolution of treatment of trichophyton infection.
  • the use according to the invention and more particularly the method for detecting the presence of trichophytons in a sample of skin or appendages of a human being or of an animal comprises a step of determining the the presence of at least one protease selected from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7, leucine aminopeptidase 1 and leucine aminopeptidase 2, by quantitative mass spectrometry (MRM - "Multip Reaction") Monitoring) ".
  • MRM quantitative mass spectrometry
  • the MRM method allows the detection and the quantification of a given protein in a complex mixture, using a mass spectrometer which makes it possible to target the peptides of a given protein and to detect only these for the quantify.
  • the mass spectrometry analyzes are preferably carried out with different mass spectra essentially in MS / MS mode coupled upstream to nano-HPLC.
  • the peptide assay can also be performed with a different (ionizing) source of the MALDI type. According to the invention, this step consists in particular of identifying by quantitative mass spectrometry at least one of the peptide sequences belonging to one of said proteases, preferably one of the following peptide sequences:
  • Sequences 1 to 5 are specific for dipeptidyl peptidase V
  • sequence 6 is specific for leucine aminopeptidase 2
  • sequences 7 to 9 are specific for leucine aminopeptidase 1
  • sequences 10 to 14 are specific for subtilisin-like protease 6 and the sequence is specific for the subtilisin-like protease 7.
  • the detection of at least one of the peptide sequences belonging to dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7, leucine aminopeptidase 1 or leucine aminopeptidase 2 is specific for the presence of a trichophyton. in the sample and therefore a pathology related to the presence of this trichophyton.
  • This method makes it possible to detect the trichophytons present with high sensitivity, high specificity, and high selectivity. According to another advantage, it also makes it possible to quantify the proteases detected and therefore to quantify the trichophytons present in the sample.
  • the use according to the invention and more particularly the method for detecting the presence of trichophytons in a sample of skin or appendages of a human being or an animal comprises the use of an immunoassay for determining the presence in the sample of at least one of the proteases chosen from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6, subtilisin-like protease 7, leucine aminopeptidase 1 or leucine aminopeptidase 2, preferably at least one of the proteases chosen from dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6 and leucine aminopeptidase 2.
  • this immunological test comprises the use of at least one monoclonal antibody directed against dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6 or leucine aminopeptidase 2 or a fragment of this antibody capable of binding respectively to the dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6 or leucine aminopeptidase 2.
  • This antibody can especially be used to detect and identify the presence of dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6 or leucine aminopeptidase 2 by an immuno-detection system such as, for example, a liquid-phase immuno-detection (ELISA for example ) or in the semi-solid phase or a method based on a lateral flow system ("lateral flow system").
  • an immuno-detection system such as, for example, a liquid-phase immuno-detection (ELISA for example ) or in the semi-solid phase or a method based on a lateral flow system ("lateral flow system").
  • ELISA liquid-phase immuno-detection
  • lateral flow system Similar systems are already known, for example, for the rapid diagnosis of Group A streptococcal streptococci (Streptatest).
  • this method makes it possible to detect the presence of trichophytons with high sensitivity and high specificity.
  • this process can be implemented by all and allows to get a result quickly, usually in 15 minutes.
  • the invention also relates to monoclonal antibodies directed against dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6 or leucine aminopeptidase 2 or a fragment of these antibodies capable of binding dipeptidyl, respectively.
  • These antibodies are obtained by conventional methods from rodent inoculation, for example, dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6 or leucine. aminopeptidase 2.
  • the proteins or fragments of these purified or recombinant proteins obtained by genetic engineering are used as immunogens.
  • the invention provides a diagnostic kit for a pathology of the skin and / or integuments related to infection with at least one trichophyton, comprising at least one monoclonal antibody directed against dipeptidyl peptidase V, subtilisin -like protease 6 or leucine aminopeptidase 2 or fragment of this antibody capable of binding respectively to dipeptidyl peptidase V, subtilisin-like protease 6 or leucine aminopeptidase 2.
  • it is a kit for the rapid diagnosis of onychomycosis.
  • the invention is now exemplified by nonlimiting tests, illustrating the invention and showing in particular its high specificity with regard to the detection of the presence of trichophytons in infected subjects. Some tests were performed by mass spectrometry and others by immuno - detection from nail or skin samples.
  • the samples obtained from human nails are obtained by scraping the nail bed of patients suffering from onychomycosis or other onychopathies.
  • the proteins were extracted and solubilized in a solution containing 50 mM ammonium bicarbonate and 0.1% nonionic detergent ALS-400 (ref Proteabio) which is compatible with mass spectrometry analysis. .
  • the extraction was carried out with stirring in a Thermo mixer (Eppendorf) at a speed of 1400 rpm and at 4 ° C for 2 hours.
  • the supernatant containing the solubilized proteins was recovered by centrifugation (at 14000 rpm, at 4 ° C, for 10 minutes).
  • the insoluble debris was removed by filtration through a 0.22 ⁇ filter (Millipore, Billerica, U.S. UFC30GVNB) by centrifugation at 14000 rpm at 4 ° C for 10 minutes.
  • the western blot analyzes are carried out after the separation of the proteins in SDS-PAGE, according to the following protocol:
  • the membrane is scanned for detection in the infrared (Odyssey LI-COR, Germany).
  • the mass spectrometry analyzes were carried out with a triple quad, QSTAR® XL (APPLIED BIO SYSTEMS), essentially in MS / MS mode coupled upstream to nano-HPLC.
  • Sample preparation for mass spectrometric analysis includes a step of reducing and alkylating protein disulfide bridges, followed by an enzymatic digestion step (trypsin is currently the most commonly used). The peptides obtained by digestion are then analyzed by mass spectrometry.
  • Enzymatic digestion can be done either directly in the gel: “in-gel” digestion or in solution.
  • “gel” digestion the proteins are separated beforehand in SDS-PAGE.
  • the digestion in solution makes it possible to digest all the proteins from the same protein fraction. This method is generally used in cases where the samples are weakly complex or are not compatible with SDS-PAGE separation.
  • the combination of SDS-PAGE and in-gel digestion shows the advantage of denaturing and separating proteins and thus limiting the influence of very abundant proteins which, by steric hindrance, hinder analysis by mass spectrometry.
  • Trypsin was used to "cut" the protein (s) into peptides which will then be analyzed by mass spectrometry.
  • Trypsin specifically hydrolyzes the peptide bond on the C-terminal side after the amino acids lysine and arginine (Lys-Xaa or Arg-Xaa) if the next amino acid is not a proline.
  • the amount of trypsin was used in ratios (enzyme / substrate) of between 1: 1 and 1: 100 in order to avoid autolysis of trypsin in the case of a too high concentration of enzyme or incomplete hydrolysis. proteins in the case of trypsin concentration too low.
  • the digestion in solution with trypsin was carried out in an enzyme / protein ratio of between 1/100 and 1/10 from a solution of trypsin (1 mg / ml) previously diluted in a 1 mM HC1 solution. . Incubation was performed at 37 ° C overnight with shaking.
  • the gel pieces were covered with 200 ⁇ l of 120 mM ammonium bicarbonate with 40% acetonitrile (ACN) and incubated at 37 ° C for 30 minutes. The solutions have been eliminated.
  • ACN acetonitrile
  • the HPLC system (LC Packing / DIONEX) is composed of an Ultimate pump with a divider allowing to deliver a nano flow (of the order of 200 nanoL / min.), A sample injector Famo s (also configurable in 96 well plate) and a Switchos pump allowing a pre - concentration of the samples as well as the elimination of the salts which can hinder the detection by mass spectrometry.
  • the mobile phase is composed of a phase A (95 vo lumes of water, 5 volumes of ACN and 0. 1 volume of formic acid) and a phase B (95 vo lumes of ACN, 5 vo lumes of water and 0. 1 volume of formic acid) with a flow rate of 200 nL / min following a gradient for the separation of the peptides.
  • the chromatographic separation is carried out on an Atlantis C 18 column, Waters (75 ⁇ x 15 cm) with a particle size of 3 ⁇ .
  • Pre-concentration of the sample is carried out on a C 1 8 LcPaking column 5 mm long, 300 ⁇ in diameter and with a particle size of 5 ⁇ .
  • the pre-concentration mobile phase is composed of a phase C (97 vol water, 3 volumes of ACN and 0. 1 volume of formic acid) with a flow rate of 30 ⁇ / ⁇ .
  • the valve is tilted 3 minutes after the injection.
  • the injection volume is ⁇ ⁇ , but can be, depending on the type of analysis, increased to 10 ⁇ ,.
  • the mass spectrometer is composed of a nano electrospray source (nanoESI), whose needle voltage is between 1000 and 2000 V set during calibration.
  • the resolution is between 1 1000 and 13000 at mass 879.9 amu (atomic mass unit) (during calibration), the level of curtain gas (curtain gas) is 30. All spectra have been acquired in ion reflector mode positive.
  • the quadrupole analyzer was used to fragment the argllion cell with argon. Fragmentation is performed for ions larger than 400 amu and smaller than 1200 amu with a state of charge between 2 and 3 amu and whose abundance is greater than 10 counts. These ions are excluded for 20 seconds after acquisition and for a window of 4.0 amu, the number of scans acquired for each MS / MS is 1 or 2. The duration of the runs varies from 80 minutes to 90 minutes depending on the samples and controls Quality is performed approximately every 10 runs by injections of digest of glutamate dehydrogenase at a concentration of 50 femtomo. If the glutamate dehydrogenase digest is identified on more than 5 significant peptides using the Mascot software, the analyzes are considered valid.
  • proteases sought are:
  • DDPIV dipeptidyl peptidase IV
  • DDPV dipeptidyl peptidase V
  • subtilisin-like protease 4 (SUB4)
  • subtilisin-like protease 6 (SUB6)
  • subtilisin-like protease 7 (SUB7)
  • LAP2 leucine aminopeptidase 2
  • proteases are not present in traumatized nails, not infected with a trichophyton.
  • proteases sought are:
  • DDPIV dipeptidyl peptidase IV
  • DDPV dipeptidyl peptidase V
  • subtilisin-like protease 4 (SUB4)
  • subtilisin-like protease 6 (SUB6)
  • subtilisin-like protease 7 (SUB7)
  • LAP 1 leucine aminopeptidase 1
  • LAP2 leucine aminopeptidase 2
  • M14A metallocarboxypeptidase
  • the dipeptidyl peptidase V specific for Trichophyton rubrum (Uniprot code of the sequence: Q9UW98) was obtained in the form of a recombinant protein and then purified.
  • the clones were selected according to the protocol of the kit
  • Antibody pair buffer kit (InVitrogen, ref CNB0011):
  • MAXISORP plates are incubated with DPPV at a concentration of 2 ⁇ g / mL diluted in ASSAY BUFFER, deposition of 50 ⁇ l per well 3 h at 37 ° C. with shaking at 300 rpm.
  • Peroxidase (rabbit anti-mouse) diluted with ASSAY BUFFER at 100 ⁇ / well, and incubate for 30 min at room temperature with shaking at 300 rpm.
  • Dipeptidyl peptidase V was used at the concentration of 2 ⁇ / ⁇ ⁇ .
  • the positive control consists of the serum that was used to immunize mice to obtain clones (at a dilution of 1/1000 in saturation buffer).
  • White corresponds to the condition without clones.
  • MAXISORP plates are incubated with the capture antibody (non-biotinylated) in PBS at a concentration of 2 ⁇ g / mL overnight at 4 ° C and 37 ° C. Saturation of the plate with 150 ⁇ . of ASSAY BUFFER, then incubation for 3h at 37 ° C with shaking at 300 rpm
  • the first "capture” antibody is absorbed on the bottom of the 96-well plate (Greiner) at the concentration of 2 ⁇ g / ml.
  • the DPPV protein is used at a concentration of 0.2 ⁇ g / ml.
  • the second antibody coupled to biotin (revealing antibody) is used at the concentration of 0.01 g / ml.
  • the pair of antibodies comprising as capture antibody clone 8H4B11B12C10 and as detection antibody clone 6C4B12F12D9 is the most promising for the realization of the sandwich ELISA and was retained.
  • Dipeptidyl peptidase V was assayed from various biological samples from nail infected with Trichophyton rubrum, but also from nail infected with other pathogens. In addition, nail samples showing negative mycology (psoriasis, trauma), as well as healthy skin were also used Protein extraction was performed as previously described.
  • the detection of DPPV in the biological samples was performed as described for the standard range (using the DPPV purified recombinant protein).
  • the total protein concentration in the biological samples was determined by the Bradford method.
  • the concentration of DPPV obtained by assay and expressed in ⁇ g / mL was normalized with respect to the total protein concentration determined by the Bradford method and expressed in ⁇ g of DPPV / mg of total protein.
  • the data show the good sensitivity of the ELISA test and a high specificity (only samples containing Trichophyton are positive in ELISA).

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Abstract

L'objet de l'invention est un procédé de détection de la présence d' au moins un trichophyton impliqué dans une mycose de la peau et des phanères, comprenant une étape de détermination de la présence dans un échantillon de peau ou de phanère issu d'un être humain ou d'un animal susceptible d' être infecté par un trichophyton, d' au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2. L 'invention vise également spécifiquement un anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2, et un kit contenant cet anticorps.

Description

Procédé de détection de trichophytons et de pathologies associées
La présente invention se rapporte à la détection de la présence de champignons du genre Trichophyton chez l' être humain ou l ' animal, au niveau de la peau et des phanères.
L 'invention vise en particulier un procédé de détection de trichophytons, comprenant une étape de détermination de la présence dans un échantillon de peau ou de phanère, d' au moins une protéase choisie parmi cinq protéases particulières. L ' invention a également pour objet spécifique des anticorps monoclonaux dirigés contre ces protéases et un kit de diagnostic en contenant.
Les trichophytons sont des champignons parasites qui se développent sur la peau, le cuir chevelu ou les ongles et provoquent chez l 'homme ou l ' animal des dermatophytoses. Chez l ' homme par exemple, les trichophytons peuvent être responsables de l 'herpès ciriné sur la peau, de la teigne tondante sur le cuir chevelu, du kérion ou du sycosis trichophytique sur la barbe et de l ' onychomycose sur les ongles.
Ces maladies sont très gênantes et peuvent provoquer d' autres complications patho logiques graves. Leurs aspects inesthétiques et parfois handicapants peuvent également avoir des effets psychosociaux négatifs importants pour les personnes qui en sont atteintes.
Il existe actuellement des moyens thérapeutiques pour traiter les patho logies provoquées par des trichophytons chez l 'homme ou l ' animal, mais ces traitements sont étroitement liés à la justesse du diagnostic posé.
Or, les mycoses de la peau ou des phanères peuvent être dues à des agents fongiques autres que des trichophytons, comme des levures, des moisissures ou d' autres dermatophytes, et dans ce cas le traitement devra être différent. De plus, elles peuvent être confondues avec d' autres pathologies ou traumatismes de la peau ou des phanères. Par exemple, les signes cliniques de dystrophie des ongles comme le psoriasis, le trauma, la tumeur unguéale, le lichen plan et l ' infection bactérienne ressemblent à des onychomycoses et peuvent être sources de confusion.
Il est donc essentiel de pouvoir poser un diagnostic précis, une inexactitude engendrant la mise en place d'une solution thérapeutique inefficace.
Aujourd' hui, il existe différents outils de diagnostic, mais aucun n' est satisfaisant. Pour l ' onychomycose notamment, on connaît six outils différents (Rothmund et al., 2012), dont deux sont couramment utilisés : l 'observation directe, dont l ' incertitude conduit inévitablement à des erreurs de diagnostic, et la mise en culture de l ' agent pathogène qui est un procédé long, peu pratique et non accessible à tous . Il existe également un immuno-kit produit par la société NIS SHO CORPORATION, qui présente l ' avantage d' être rapide et facile d'utilisation, mais qui manque de sensibilité et surtout de spécificité . En effet, la détection des dermatophytes est réalisée par l 'utilisation d'un anticorps détectant un polysaccharide présent sur la paroi cellulaire des trichophytons, mais également sur celle de nombreux autres dermatophytes.
II subsiste donc un besoin pour une solution permettant de détecter rapidement, facilement et spécifiquement la présence de trichophytons sur la peau ou les phanères, et en particulier sur les ongles, palliant les inconvénients des outils de diagnostic actuels .
C ' est l' objectif de la présente invention qui se propose, pour y répondre, d'utiliser au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin- like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2.
L 'invention vise donc l 'utilisation d' au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour la détection de la présence, dans un échantillon de peau ou de phanère humain ou animal, d' au moins un trichophyton. En particulier, l ' invention vise un procédé de détection de la présence d' au moins un trichophyton, comprenant une étape de détermination de la présence dans un échantillon de peau ou de phanère issu d'un être humain ou d'un animal susceptible d ' être infecté par un trichophyton, d ' au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2.
Les trichophytons recherchés et détectés sont impliqués dans des patho logies de la peau et/ou des phanères .
Par phanères au sens de l ' invention, on entend toutes productions épidermiques protectrices, annexes ou téguments, contenant un fort pourcentage de kératine comme les poils, les cheveux et les ongles .
Avantageusement, la présence d' au moins une de ces protéases au niveau de la peau ou des phanères, est spécifique uniquement de la présence de trichophytons . Cette détermination peut être faite par différents moyens pouvant faire l' obj et d' outils de diagnostic rapides, faciles d'utilisation, et spécifiques des trichophytons, permettant ainsi la mise en place d 'un traitement efficace et ciblé dans un délai très court. Deux moyens sont particulièrement adaptés, la détermination par spectrométrie de masse et l ' immuno-détection.
Pour mettre en œuvre ce deuxième moyen, selon un obj et particulier, l ' invention vise également un anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou un fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2, ainsi qu'un kit comprenant un tel anticorps.
La figure 1 décrit la limite de quantification de la dipeptidyl peptidase V.
L'invention est maintenant décrite en détail.
L 'invention se rapporte donc à l'utilisation d' au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour la détection de la présence, dans un échantillon de peau ou de phanère humain ou animal, d' au moins un trichophyton impliqué dans une myco se de la peau et/ou des phanères .
Préférentiellement cette utilisation consiste en la mise en œuvre d 'un procédé de détection de la présence d' au moins un trichophyton impliqué dans une myco se de la peau et/ou des phanères, comprenant une étape de détermination de la présence dans une échantillon de peau ou de phanère issu d'un être humain ou d'un animal susceptible d' être infecté par un trichophyton, d' au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2.
La détermination de la présence d' au moins une des protéases est réalisée in vitro à partir d'un échantillon de peau ou de phanères, mais reflète la présence de cette protéase in vivo au niveau de la peau ou des phanères de la personne ou l ' animal sur lequel on a prélevé l ' échantillon.
Les échantillons utilisés pour la mise en œuvre de l' invention sont obtenus par tout moyen adapté. Lorsque l ' échantillon est un échantillon d 'ongle, il est préférentiellement obtenu par grattage du lit de l ' ongle ou par perçage de l' ongle à l ' aide d'une micro chigno le. Cette dernière méthode de prélèvement est notamment décrite dans le brevet US7, 848 ,799. Lorsque l ' échantillon provient d'une lésion mycosique de la peau, il est préférentiellement obtenu par grattage à l ' aide d'une curette.
Selon l' invention, la présence dans l ' échantillon d' au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, est synonyme d'une infection par au moins un trichophyton. En effet il s ' agit de protéases sécrétées spécifiquement par les trichophytons jouant un rôle dans la digestion des kératines, et qui, selon l 'invention, se retrouvent au niveau de la peau et des phanères infectés par au moins un trichophyton. L 'utilisation selon l ' invention est adaptée pour la détection de tout trichophyton impliqué dans une mycose de la peau et/ou des phanères chez l' homme ou l ' animal, en particulier Trichophyton bullosum, Trichophyton circonvolutum, Trichophyton concentricum, Trichophyton eboreum, Trichophyton equinum, Trichophyton eriotrephon, Trichophyton fischeri, Trichophyton gourvilii, Trichophyton interdigitale, Trichophyton kanei, Trichophyton krajdenii, Trichophyton longifusum, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton phaseoliforme, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton soudanense, Trichophyton sp. CZ-2011, Trichophyton sp. FSU 10097, Trichophyton sp. IFM 411 72, Trichophyton sp. LM 10725, Trichophyton terrestre, Trichophyton thuringiense, Trichophyton tonsurans, Trichophyton vanbreuseghemii, Trichophyton verrucosum, Trichophyton violaceum et Trichophyton yaoundei, quelle que soit la souche s 'il en existe plusieurs .
L 'utilisation selon l' invention est tout particulièrement adaptée à la détection de Trichophyton interdigitale et/ou Trichophyton rubrum, encore plus préférentiellement de Trichophyton rubrum, quelle que soit la souche.
La détection de la présence de trichophytons par la détermination d' au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin- like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2 selon l' invention, peut notamment être utilisée pour le dépistage, le suivi thérapeutique et/ou le diagnostic d'une pathologie chez l ' homme ou l ' animal, en particulier d'une myco se liée à une infection par trichophyton.
L'invention est également relative à au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour son utilisation dans une méthode de dépistage, de suivi thérapeutique et/ou de diagnostic d'une patho logie liée à une infection par au moins un trichophyton,
Il peut s ' agir par exemple pour l ' homme de l ' herpès ciriné, de la teigne tondante, du kérion, du syco sis trichophytique ou d'une onychomyco se . L 'invention vise tout particulièrement le dépistage, le suivi thérapeutique et/ou le diagnostic d 'une onychomycose.
Ainsi, l'invention vise également au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour son utilisation dans une méthode de dépistage, de suivi thérapeutique et/ou de diagnostic d'une onychomycose.
Par suivi thérapeutique, on entend l'utilisation selon l'invention et plus particulièrement le procédé de détection de la présence de trichophytons dans un échantillon de peau ou de phanères d'un être humain ou d'un animal pour suivre l'évolution d'un traitement de l'infection par trichophyton.
Selon une première variante, l'utilisation selon l' invention et plus particulièrement le procédé de détection de la présence de trichophytons dans un échantillon de peau ou de phanères d'un être humain ou d'un animal, comprend une étape de détermination de la présence d' au moins une protéase choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin- like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, par spectrométrie de masse quantitative (MRM - « Multip le Reaction Monitoring) » .
La méthode MRM permet la détection et la quantification d'une protéine donnée dans un mélange complexe, à l ' aide d'un spectromètre de masse qui permet de cibler les peptides d'une protéine donnée et de ne détecter que ceux-ci pour les quantifier. Les analyses en spectrométrie de masse sont préférentiellement réalisées avec différents spectres de masse essentiellement en mode MS/MS couplé en amont à une nano-HPLC . Le dosage des peptides peut également être réalisé avec une source (ionisante) différente de type MALDI . Selon l' invention, cette étape consiste en particulier à identifier par spectrométrie de masse quantitative au moins une des séquences peptidiques appartenant à une desdites protéases, préférentiellement une des séquences peptidiques suivantes :
- SEQ ID n° l : LSVAEGVGLFNVLQEK
- SEQ ID n°2 : ALVSHDGTFVGS SK
- SEQ ID n°3 : GGVGIWISDAK
- SEQ ID n°4 : INFVGYGQSTTK
- SEQ ID n° 5 : TLYVTAEDHATGK
- SEQ ID n° 6 : AAGAIVYNNVPGSLAGTLGGLDK
- SEQ ID n°7 : VSFGIITDNVNANLTK
- SEQ ID n°8 : LIVGFVTELAK
- SEQ ID n°9 : HANAVNAMIATLSK
- SEQ ID n° 10 : KPGGTTYYYDPSAGK
- SEQ ID n° l l : MANDVIQSPGEGTTGK
- SEQ ID n° 12 : VLDCDGSGSNSGVIK
- SEQ ID n° 13 : ADFSNYGAVVDVYAPGK
- SEQ ID n° 14 : SVMNMSLGGPR
- SEQ ID n° 15 : QMAIDVIQNPGASTTSK
Les séquences 1 à 5 sont spécifiques de la dipeptidyl peptidase V, la séquence 6 est spécifique de la leucine aminopeptidase 2, les séquences 7 à 9 sont spécifiques de la leucine aminopeptidase 1 , les séquences 10 à 14 sont spécifiques de la subtilisin-like protease 6 et la séquence 15 est spécifique de la subtilisin-like protease 7.
La détection d' au moins une des séquences peptidiques appartenant à la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 ou la leucine aminopeptidase 2, est spécifique de la présence d'un trichophyton dans l ' échantillon et par conséquent d'une patho logie liée à la présence de ce trichophyton. Ce procédé permet de détecter les trichophytons présents avec une haute sensibilité, une haute spécificité, et une haute sélectivité . Selon un autre avantage, il permet également de quantifier les protéases détectées et par conséquent de quantifier les trichophytons présents dans l ' échantillon.
Selon une autre variante, l 'utilisation selon l 'invention et plus particulièrement le procédé de détection de la présence de trichophytons dans un échantillon de peau ou de phanères d'un être humain ou d'un animal, comprend la mise en œuvre d'un test immuno logique permettant de déterminer la présence dans l ' échantillon, d' au moins une des protéases choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 ou la leucine aminopeptidase 2, préférentiellement au moins une des protéases choisie parmi la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 et la leucine aminopeptidase 2.
De façon particulièrement adaptée, ce test immunologique comprend l 'utilisation d' au moins un anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou un fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2.
Cet anticorps peut notamment être utilisé pour détecter et identifier la présence de la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 par un système d' immuno détection comme par exemple une immuno-détection en phase liquide (ELISA par exemple) ou en phase semi-solide ou une méthode basée sur un flow de so lution latéral (« latéral flow System ») . Des systèmes analogues sont déj à connus par exemple pour le diagnostic rapide des angines à streptocoque bêta-hémo lytique du groupe A (Streptatest) .
Comme la spectrométrie de masse, ce procédé permet de détecter la présence de trichophytons avec une haute sensibilité et une haute spécificité. Avantageusement, ce procédé peut être mis en œuvre par tous et permet d' obtenir un résultat rapidement, généralement en 15 minutes.
Pour mettre en œuvre ce procédé, l ' invention a également pour obj et des anticorps monoclonaux dirigés contre la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou un fragment de ces anticorps capables de se lier respectivement à la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2. Ces anticorps sont obtenus par des procédés classiques à partir de l 'ino culation à un rongeur par exemple, de dipeptidyl peptidase V, de subtilisin-like protease 6 ou de leucine aminopeptidase 2. Les protéines ou des fragments de ces protéines purifiées ou recombinantes obtenues par génie génétique sont utilisés en tant qu' immunogènes .
Selon un dernier objet, l ' invention vise un kit de diagnostic d'une pathologie de la peau et/ou des phanères liée à une infection par au moins un trichophyton, comprenant au moins un anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptidyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, il s ' agit d'un kit pour le diagnostic rapide de l 'onychomycose.
L 'invention est à présent exemplifiée par des essais non limitatifs, illustrant l' invention et montrant en particulier sa haute spécificité en regard de la détection de la présence des trichophytons chez des suj ets infectés . Certains essais ont été réalisés par spectrométrie de masse et d' autres par immuno-détection à partir d' échantillons d' ongle ou de peau.
I . Protocoles d' analyse des échantillons applicables aux différents essais
1. 1 Extraction des protéines Les échantillons de peau saine humaine sont obtenus par biopsie et constituent un contrôle négatif permettant de vérifier l ' absence de DPPV.
Les échantillons issus d 'ongles d'humains sont obtenus par grattage du lit de l' ongle de patients atteints d' onychomycoses ou atteints d' autres onychopathies.
Pour chaque échantillon : les protéines ont été extraites et so lubilisées dans une solution contenant 50 mM de bicarbonate d' ammonium et 0 , 1 % de détergeant non ionique ALS-400 (ref Proteabio) qui est compatible avec l ' analyse en spectrométrie de masse. L ' extraction a été effectuée sous agitation dans un Thermo mixer (Eppendorf) à une vitesse de 1400 rpm et à 4°C pendant 2 heures . Le surnageant contenant les protéines solubilisées a été récupéré par centrifugation (à 14000 rpm, à 4°C , pendant 1 0 minutes) . Les débris inso lubles ont été éliminés par filtration à travers un filtre de 0,22 μιη (Millipore, Billerica, États-Unis, réf : UFC30GVNB), par centrifugation à 14000 rpm, à 4°C, pendant 1 0 minutes.
1.2 Immuno-détection : Western Blot
Les analyses en western blot sont effectuées après la séparation des protéines en SDS-PAGE, selon le protocole suivant :
1 . Transfert des protéines depuis le gel sur une membrane de nitrocellulose avec le système iBlot™ Gel Transfer Device (Invitrogen, US) .
2. Humidification de la membrane avec du PBS l x pendant 5 minutes.
3. Blocage des sites non spécifiques de la membrane avec le tampon de blo cage Odyssey pendant une heure à température ambiante (0,4 ml/cm2) .
4. Dilution de l ' anticorps primaire (sérum total anti-protéases) dans le tampon de blo cage Odyssey (LI-COR Bio sciences, Allemagne) au 1 : 3000. Incubation sous agitation douce pendant toute la nuit.
5. Lavage de la membrane avec du PB S I X contenant 0, 1 % de Tween-20 pendant 10 minutes. (3 lavages successifs) . 6. Dilution de l ' anticorps secondaire marqué à l ' IRDye 800CW au 1 : 5000 dans le tampon de blo cage Odyssey à l ' abri de la lumière.
7. Incubation pendant 60 minutes à l ' abri de la lumière
8. Lavage de la membrane, à l ' abri de la lumière, avec du PBS I X contenant 0, 1 % de Tween-20 pendant 10 minutes. 3 lavages .
9. Lavage de la membrane, à l ' abri de la lumière, avec du PBS I X afin d' éliminer le Tween-20.
10. La membrane est scannée pour la détection dans l' infrarouge (Odyssey LI-COR, Allemagne) .
1.3 Spectrométrie de masse
Les analyses en spectrométrie de masse ont été réalisées avec un triple quad, QSTAR® XL (APPLIED BIO SYSTEMS), essentiellement en mode MS/MS couplé en amont à une nano-HPLC .
La préparation des échantillons pour l ' analyse en spectrométrie de masse comprend une étape de réduction et d ' alkylation des ponts disulfures des protéines, suivi d'une étape de digestion enzymatique (la trypsine étant couramment la plus utilisée) . Les peptides obtenus par digestion sont ensuite analysés en spectrométrie de masse.
La digestion enzymatique peut se faire, soit directement dans le gel : digestion « in-gel », soit en so lution. Avec la digestion « in- gel », les protéines sont préalablement séparées en SDS-PAGE . Par contre, la digestion en so lution permet de digérer toutes les protéines à partir d'une même fraction protéique. Cette méthode est généralement utilisée dans les cas où les échantillons sont faiblement complexes ou ne sont pas compatibles avec une séparation en SDS- PAGE. La combinaison du SDS-PAGE et la digestion in-gel, montre l ' avantage de dénaturer et séparer les protéines et de limiter ainsi l' influence des protéines très abondantes qui, par encombrement stérique, gênent l ' analyse en spectrométrie de masse.
Le choix de la méthode de digestion dépend principalement de la quantité et de la complexité de l ' échantillon à analyser. Digestion directe en solution :
Pour les échantillons protéiques, en préalable à la digestion par la trypsine, une réduction suivie d'une alkylation des ponts disulfures a été effectuée. Cette étape a été réalisée à l ' aide d'un agent réducteur, le dithiothréito l (DTT, Sigma Aldrich) et d'un agent alkylant, l 'iodoacétamide. Dans un premier temps, les échantillons cliniques ont été incubés dans une solution tampon de 100 mM de bicarbonate d'ammonium en présence de 10 mM de dithiothréito l à 56°C pendant 45 minutes sous agitation, puis incubés avec 55 mM d' iodoactamide pendant 30 minutes à température ambiante à l ' abri de la lumière.
La trypsine a été utilisée afin de « découper » la ou les protéine(s) en peptides qui seront ensuite analysés en spectrométrie de masse.
La trypsine hydrolyse spécifiquement la liaison peptidique du côté C-terminal après les acides aminés lysine et arginine (Lys- | -Xaa ou Arg- | -Xaa) si l ' acide aminé suivant n' est pas une proline. La quantité de trypsine a été utilisée dans des ratios (enzyme/substrat) compris entre 1 / 1 0 et 1 / 100 afin d ' éviter une autolyse de la trypsine dans le cas d'une concentration trop forte en enzyme ou une hydro lyse incomplète des protéines dans le cas d'une concentration en trypsine trop faible.
La digestion en so lution par la trypsine a été réalisée dans un ratio enzyme/protéine compris entre 1 / 100 et 1 / 1 0 à partir d' une so lution de trypsine ( 1 mg/ml) diluée préalablement dans une solution 1 mM HC1. L 'incubation a été réalisée à 37°C pendant toute la nuit sous agitation.
Digestion « in gel » :
En préalable à la digestion « in gel », une réduction suivie d'une alkylation des ponts disulfures dans les échantillons cliniques a été effectuée selon le protocole décrit dans la partie de « Digestion directe en solution » . La digestion « in gel » s ' est déroulée selon les étapes suivantes : 1 . Les bandes d'intérêt ont été découpées à partir d'un gel, en sections égales de taille 1 - 1 ,5 mm en utilisant un scalpel, en prenant soin d'inclure uniquement le gel co loré.
2. Les morceaux de gel coupés ont été placés dans un tube plastique de 2 ml (Eppendorf, France) .
3. Les morceaux de gel ont été couverts avec 200 μΐ de 120 mM bicarbonate d'ammonium avec 40% d' acétonitrile (ACN) puis incubés à 37°C pendant 30 minutes. Les so lutions ont été éliminées.
4. L'étape 3 a été répétée une fois.
5. Les morceaux de gel ont été séchés au SpeedVac (Eppendorf,
France) pendant 15 minutes .
6. La so lution de trypsine (0,6 μg) a été ajoutée dans le tube contenant les morceaux de gel. La quantité d'enzyme ajoutée a été ajustée afin de recouvrir le gel.
7. Environ 50 μΐ de 40 mM bicarbonate d'ammonium contenant
9%> d'ACN ont été ajoutés dans le tube afin de recouvrir les morceaux de gel.
8. L 'incubation a été réalisée à 37°C pendant toute la nuit.
9. Après l ' incubation, la so lution contenant les peptides a été transférée dans un nouveau tube.
10. 50 μΐ de la solution 50% d'ACN contenant 0. 1 % acide formique ont été ajoutés dans le tube contenant les morceaux de gel à 37°C pendant 30 minutes sous agitation. Le surnageant a été ensuite combiné avec la so lution récupérée dans l ' étape 9. Cette étape a été renouvelée.
1 1 . La so lution contenant les peptides extraits a été filtrée par centrifugation à 1 750 rpm pendant 2 minutes en utilisant un filtre Ultrafree-MC 0, 22 μηι (Millipore, États-Unis) afin d' enlever les morceaux de gels résiduels .
12. Le filtrat récupéré dans l ' étape 1 1 a été évaporé au
SpeedVac (Eppendorf Concentrator 5301 , France) pendant 60 minutes .
13. 20 μΐ de la solution 3 % ACN contenant 0, 1 % acide formique ont été ajoutés dans le tube puis la so lution a été transférée dans un tube spécial pour l ' analyse en spectrométrie de masse. 1-4 Couplage Nano HPLC - QSTAR® XL (MS/MS)
Le système HPLC (LC Packing/DIONEX) est composé d'une pompe Ultimate disposant d'un diviseur permettant de délivrer un nano débit (de l 'ordre de 200 nanoL/min.), d'un inj ecteur d' échantillons Famo s (configurable également en plaque 96 puits) et d'une pompe Switchos permettant une pré-concentration des échantillons ainsi que l ' élimination des sels pouvant nuire à la détection en spectrométrie de masse.
La phase mobile est composée d'une phase A (95 vo lumes d'eau, 5 volumes d'ACN et 0. 1 volume d'acide formique) et d'une phase B (95 vo lumes d'ACN, 5 vo lumes d'eau et 0. 1 volume d'acide formique) avec un débit de 200 nL/min en suivant un gradient pour la séparation des peptides . La séparation chromatographique est effectuée sur une colonne Atlantis C 1 8 , Waters (75 μιη x 15 cm) d'une granulométrie de 3 μπι.
Une pré-concentration de l ' échantillon est effectuée sur une co lonne C 1 8 LcPaking de 5 mm de longueur, de 300 μιη de diamètre et d'une granulométrie de 5 μιη. La phase mobile de pré-concentration est composée d'une phase C (97 vo lumes d' eau, 3 volumes d'ACN et 0. 1 vo lume d'acide formique) avec un débit de 30 μί/ηιίη. Le basculement de la vanne se fait 3 min après l' inj ection. Le vo lume d' inj ection est de Ι μί, mais peut être, selon le type d' analyse, augmenté à 10 μΐ,.
Spectrométrie de masse :
Le spectromètre de masse est composé d'une source nano electrospray (nanoESI), dont la tension de l ' aiguille se situe entre 1000 et 2000 V réglée lors de la calibration. La résolution est située entre 1 1000 et 13000 à la masse 879.9 amu (atomic mass unit) (lors de la calibration), le niveau de curtain gas (gaz rideau) est de 30. Tous les spectres ont été acquis en mode réflecteur des ions positifs.
L ' analyseur quadripolaire a été utilisé pour faire de la fragmentation dans la cellule de co llision par l ' argon. La fragmentation est effectuée pour des ions plus grands que 400 amu et plus petits que 1200 amu avec un état de charge compris entre 2 et 3 amu et dont l ' abondance est supérieure à 10 counts. Ces ions sont exclus durant 20 secondes après acquisition et pour une fenêtre de 4.0 amu, le nombre de scans acquis pour chaque MS/MS est de 1 ou 2. La durée des runs varie de 80 mn à 90 mn selon les échantillons et des contrôles qualité sont effectués environ tous les 10 runs par des inj ections de digest de glutamate déshydrogénase à une concentration de 50 femtomo les. Si le digest de glutamate déshydrogénase est identifié sur p lus de 5 peptides significatifs à l ' aide du logiciel Mascot, les analyses sont considérées comme valides .
Le logiciel Analyst QS 1 .0 (Applied Biosystems) a été utilisé pour l ' acquisition des données et pour le contrôle des instruments .
II .Essais réalisés par immuno-détection
Des essais ont été réalisés pour montrer la spécificité de la détection des protéases utiles selon l' invention, en particulier en regard d' autres protéases connues pour être sécrétées par un trichophyton {Trichophyton rubrum) susceptibles d ' être présentes dans les échantillons.
Ces essais ont été réalisés par Western Blot à partir d' échantillons :
- d' ongles infectés par Trichophyton rubrum chez des personnes atteintes d' onychomycose, et
- d' ongles traumatisés.
Les protéases recherchées sont :
- la dipeptidyl peptidase IV (DDPIV),
- la dipeptidyl peptidase V (DDPV)
- la subtilisin-like protease 3 (SUB3),
- la subtilisin-like protease 4 (SUB4),
- la subtilisin-like protease 6 (SUB6),
- la subtilisin-like protease 7 (SUB7),
- la leucine aminopeptidase 2 (LAP2), et
- la métallocarboxypeptidase (M 14A)
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous : Protéases Détectée en western blot Détectée en western blot dans les ongles infectés dans les ongles
par T. rubrum traumatisés
DPPIV NON NON
DPPV OUI NON
SUB3 NON NON
SUB4 NON NON
SUB6 OUI NON
SUB7 OUI NON
LAP2 OUI NON
M 14A NON NON
Ces résultats montrent que seules les protéases DPPV, SUB6, SUB7, et LAP2 sont détectées par western blot dans les ongles infectés par un trichophyton.
De plus, on constate que ces protéases ne sont pas présentes dans les ongles traumatisés, non infectés par un trichophyton.
D ' autres essais ont été réalisés pour montrer la spécificité de la présence des protéases DPPV, SUB6, SUB7,et LAP2 au niveau des ongles infectés par un trichophyton, en regard d' autres échantillons de peau ou d' ongles non infectés par un trichophyton.
Ces essais ont été réalisés par western-blot à partir d' échantillons :
- d' ongles infectés par Trichophyton rubrum chez des personnes atteintes d' onychomycose
- de peau saine
- du stratum corneum de peau saine humaine (couches de l ' épiderme superficielles)
- d' ongles traumatisés et
- d' ongles atteints de psoriasis.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci- dessous : Protéases ongles Peau saine Peau saine ongles Psoriasis infectés par (biopsies) stratum traumatisés atteinte de
T. rubrum corneum l'ongle
DPPV OUI NON NON NON NON
SUB6 OUI NON NON NON NON
SUB7 OUI NON NON NON NON
LAP2 OUI NON NON NON NON
Ces résultats montrent encore la spécificité de la présence des protéases DPPV, SUB6 , SUB7, et LAP2 dans des échantillons d'ongles infectés par un Trichophyton.
III . Essais réalisés par spectrométrie de masse quantitative Des essais complémentaires ont été réalisés pour montrer la spécificité de la détection des protéases utiles selon l' invention avec un autre moyen de détermination.
Ces essais ont été réalisés par spectrométrie de masse à partir d' échantillons :
- d' ongles infectés par Trichophyton rubrum chez des personnes atteintes d' onychomycose, et
- d' ongles traumatisés.
Les protéases recherchées sont :
- la dipeptidyl peptidase IV (DDPIV),
- la dipeptidyl peptidase V (DDPV),
- la subtilisin-like protease 3 (SUB3),
- la subtilisin-like protease 4 (SUB4),
- la subtilisin-like protease 6 (SUB6),
- la subtilisin-like protease 7 (SUB7),
- la leucine aminopeptidase 1 (LAP 1 ),
- la leucine aminopeptidase 2 (LAP2), et
- la métallocarboxypeptidase (M 14A) .
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci- dessous : Protéases Détectée en Détectée en spectrométrie spectrométrie de masse de masse dans les ongles dans les ongles infectés traumatisés
par T. rubrum
DPPIV NON NON
DPPV OUI NON
SUB3 NON NON
SUB4 NON NON
SUB6 OUI NON
SUB7 OUI NON
LAP l OUI NON
LAP2 OUI NON
M 14A NON NON
Ces résultats montrent que seules les protéases DPPV, SUB6, SUB7, LAP2 et LAP l sont détectées par spectrométrie de masse dans les ongles infectés par un trichophyton en regard d' autres protéases connues pour être sécrétées par un trichophyton tel que Trichophyton rubrum .
De plus, on constate que ces protéases DPPV, SUB6, SUB7, LAP2 et LAP l ne sont pas présentes dans les ongles traumatisés, non infectés par un trichophyton.
D ' autres essais ont été réalisés pour montrer la spécificité de la présence d'une des protéases utiles selon l ' invention, à savoir SUB6, au niveau des ongles infectés par un trichophyton, en regard d'ongles infectés par d' autres dermatophytes, présentant d' autres patho logies ou traumatisés.
Ces essais ont été réalisés par spectrométrie de masse à partir d' échantillons d' ongles présentés dans le tableau suivant :
Echantillons d'ongles Nombre de suj ets
Trichophyton rubrum 30
Trauma (mycologie négative) 10
Trichophyton rubrum + mélanine 2
Trichophyton interdigitalis 5
Scytalidium dimidiatum 4
Fusarium 2 Aspergillus 1
Psoriasis Onychopathy (mycologie négative) 2
Onychogriffose (mycologie négative) 1
Les séquences recherchées par spectrométrie de masse reflétant présence de SUB6 sont :
- SEQ ID n° l l : MANDVIQSPGEGTTGK
- SEQ ID n° 12 : VLDCDGSGSNSGVIK
Les résultats obtenus pour la détection de SUB6 échantillons sont présentés dans le tableau ci-après :
Figure imgf000021_0001
Ces résultats confirment encore que la détection de la protéase SUB6 est spécifique de la présence d' au moins un trichophyton dans l ' échantillon testé. IV - Immunodetection (ELISA) de la dipeptidyl peptidase V.
La dipeptidyl peptidase V spécifique à Trichophyton rubrum (code Uniprot de la séquence : Q9UW98) a été obtenue sous forme de protéine recombinante puis purifiée.
L'analyse en gel SDS-PAGE de la dipeptidyl peptidase V recombinante après purification montre que cette protéine est sous la forme d'une protéine unique non dégradée de masse moléculaire apparente d'environ 80 kDa.
La forme purifiée non dénaturée de la dipeptidyl peptidase V a servi d'antigène pour la production d'anticorps monoclonaux chez la souris selon un processus classique (Eurogentec, France) selon le processus décrit dans https://secure.eurogentec.com/EGT/files/Pro- monoclon DEV-0409-V2.pdf; ou selon la référence Kohler G, Milstein C, (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. (5517):495-7.)
La sélection des clones s'est effectuée selon le protocole du kit
« antibody pair buffer kit » (InVitrogen, ref CNB0011):
Brièvement, des plaques MAXISORP sont incubées avec DPPV à une concentration de 2μg/mL dilué en ASSAY BUFFER, dépôt de 50μ1 par puits.3h à 37°C en agitant à 300 rpm.
Lavage de la plaque 4 fois par WASH BUFFER, 200 μΕ/puit.
Ajouter la solution contenant l'anticorps à tester dilué dans l'ASSAY BUFFER au 1 :1000 à raison de 50μί par puits et incuber 2 heures à 37°C en agitant à 300 rpm.
Lavage de la plaque 4 fois par WASH BUFFER, 200 μΕ/puit. Ajouter l'anticorps secondaire couplé à l'Horse Radish
Peroxydase (lapin anti-souris) dilué avec ASSAY BUFFER à raison de 100 μΕ/puits, et incuber 30 min à température ambiante en agitant à 300 rpm.
Lavage de la plaque 4 fois par WASH BUFFER, 200 μί/ 'puits. Ajouter ΙΟΟμί par puits de substrat enzymatique 3, 3', 5,5'- tetramethyl benzidine (TMB) jusqu'à l'apparition d'une coloration bleue et arrêter la réaction avec 50μί d'acide phosphorique 1M (stop buffer) 15 à 30 min.
Lire au spectrophotomètre à 450nm.
Plusieurs clones ont ainsi été obtenus et caractérisés. DPPV Tampon
Clones/ Ig Isotypes Delta DO
6C4B12F12D9
0.941 0.048 0.893
Gl ;Kappa
8H4B11B12C10
1.210 0.056 1.154
Gl ;Kappa
4A10F5A7D9F9
1.209 0.051 1.158
M; Kappa
4H6F11D12C12G11
1.328 0.049 1.279
G3; Kappa
2G12B10C11
1.362 0.049 1.313
G2a; Kappa
Témoin positif
0.571 0.055 0.516
(sérum)
Blanc 0.130 0.053 0.077
La dipeptidyl peptidase V (DPPV) a été utilisée à la concentration de 2μ§/ι ί. La différence de densité optique (delta DO) entre les clones mis en présence de la protéine DPPV et ceux mis en présence d'un tampon seul montre l'immuno réactivité des anticorps monoclonaux. Le témoin positif est constitué du sérum ayant servi à immuniser les souris pour l'obtention des clones (à la dilution de 1/1000eme dans du tampon de saturation). Le blanc correspond à la condition sans clones. Un test classique de type ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) en sandwich, basé sur l'utilisation de deux anticorps monoclonaux distincts et de la protéine recombinante a étév utilisé pour identifier les paires conjugué-biotine selon le protocole décrit dans le kit « antibody pair buffer kit » de chez InVitrogen (ref CNB0011):
Brièvement, des plaques MAXISORP sont incubées avec l'anticorps capture (non biotinylé) en PBS à la concentration de 2 μg/mL sur la nuit à 4°C et 37°C. Saturation de la plaque avec 150 μΐ. d'ASSAY BUFFER, puis incubation 3h à 37°C en agitant à 300 rpm
Lavage de la plaque 3 fois par WASH BUFFER à raison de 200 μΕ/puit.
Addition de l'antigène à une concentration de 4μg/mL, 2μg/mL, 0.5μg/mL, O.^g/mL, 0.05μg/mL, O.OO^g/mL, 0.005μg/mL, 0 μg/mL, dilué en ASSAY BUFFER, dépôt de 50μΙ, par puits.
Laisser3h à 37°C en agitant à 300 rpm.
Lavage de la plaque 4 fois par WASH BUFFER, 200 μΕ/puits.
Ajouter la solution du 2eme anticorps BUFFER, 200 μΐ/puits.
Ajouter la solution STREPAVIDIN-HRP à une dilution au l/1250ème avec ASSAY BUFFER à raison de 100 μΕ/puits, et incuber 30 min à température ambiante en agitant à 300 rpm.
Lavage de la plaque 4 fois par WASH BUFFER, 200 μΕ/ρυίίβ.
Ajouter ΙΟΟμί par puits de substrat enzymatique (TMB) jusqu'à l'apparition d'une coloration bleue et arrêter la réaction avec 50μ1 d'acide phosphorique 1M (stop buffer). 15 à 30 min.
Lire au spectrophotomètre à 450nm. Dans le cas de l'expérience ci-dessous, le protocole ELISA en sandwich suivant a été retenu : Le premier anticorps "capture" est absorbé sur le fond de la plaque 96 puits (Greiner) à la concentration de 2μg/mL. La protéine DPPV est utilisée à une concentration de 0.2μg/mL. Le second anticorps couplé à la biotine (anticorps de révélation) est utilisé à la concentration de 0.0^g/mL.
Le blanc est mesuré à une DO=0.06; le contrôle sans dipeptidyl peptidase V : DO=0.1 et le contrôle sans anticorps capture à une DO=0.07.
6C4B12 8H4B11 4H6F11 2G12B1 F12D9 B12C10 D12C12 0C11
Gll
6C4B12F12D9 1.8 0.14 0.12 -biotine 8H4B11B12C1 1.4 0.12 0.12 0-biotine
4H6F11D12C1 0.45 0.26 0.20 2G11-biotine
2G12B10C11- 0.23 0.16 0.19
biotine
Le couple d'anticorps comprenant comme anticorps de capture le clone 8H4B11B12C10 et comme anticorps de détection le clone 6C4B12F12D9 est le plus prometteur pour la réalisation de l'ELISA sandwich et a été retenu.
L'utilisation de différentes concentrations de DPPV dans la mise en place du test ELISA en sandwich a permis de déterminer la concentration la plus faible dosable (voir Fig. 1).
Au vu de la courbe standard pour la détection ELISA de la dipeptidyl peptidase V, la limite de quantification de la dipeptidyl peptidase V obtenue est de 0.00(^g/ml. Blanc: DO= 0.11; DPPV 0.00(^g/ml: DO= 0.4
La dipeptidyl peptidase V a été dosée à partir de divers échantillons biologique provenant d'ongle infectés par Trichophyton rubrum, mais également d'ongle infectés par d'autre pathogènes. De plus, des échantillons d'ongles montrant une mycologie négative (psoriasis, traumatisme), ainsi que de la peau saine ont été aussi utilisés L'extraction des protéines a été effectuée comme décrite précédemment.
La détection de la DPPV dans les échantillons biologiques a été effectuée comme décrite pour la gamme standard (utilisant la protéine recombinante purifiée DPPV). La concentration en protéine total dans les échantillons biologiques a été déterminée par la méthode de Bradford. La concentration en DPPV obtenue par dosage et exprimée en μg/mL a été normalisée par rapport à la concentration totale en protéines déterminée par la méthode de Bradford et exprimée en μg de DPPV/mg de protéines totales. protéine
DPPV totale DPPV
μ /ηι1 [mg/ml] ng/mg ng/mg
T rubrum 0.0444 3.43 13
0.0066 0.69 10 moyenne : 10
0.0010 0. 14 8
T interdigitalis 0.0293 1 .64 1 8
0.0037 0.33 1 1 moyenne : 15
0.0010 0.07 15
Trauma <0.0005 2.98 Non détectée
Scytalidium
dimidiatum <0.0005 1 .79 Non détectée
Fusarium <0.0005 1 .52 Non détectée
Aspergillus <0.0005 2.88 Non détectée
Psoriasis <0.0005 0. 1 8 Non détectée
Onychogriffo se <0.0005 4. 10 Non détectée
Peau saine <0.0005 2.63 Non détectée
Les données montrent la bonne sensibilité du test ELISA ainsi qu'une grande spécificité (seuls les échantillons contenant du Trichophyton sont positifs en ELISA).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection de la présence d' au moins un trichophyton, comprenant une étape de détermination de la présence dans un échantillon de peau ou de phanère issu d'un être humain ou d'un animal susceptible d' être infecté par un trichophyton, d ' au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin- like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2.
2. Procédé selon la revendication 1 , pour la détection de Trichophyton interdigitale et/ou Trichophyton rubrum .
3. Procédé selon l 'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l' échantillon est un échantillon d'ongle obtenu par grattage du lit de l ' ongle ou par perçage de l ' ongle à l' aide d'une micro chigno le.
4. Procédé selon l 'une des revendications précédentes, pour le dépistage, le suivi thérapeutique et/ou le diagnostic d'une pathologie liée à une infection par au moins un trichophyton.
5. Procédé selon l 'une des revendications précédentes, pour le dépistage, le suivi thérapeutique et/ou le diagnostic d 'une onychomyco se.
6. Procédé selon l 'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu' elle comprend la mise en œuvre d 'un test immuno logique permettant de déterminer la présence dans l ' échantillon, d' au moins une des protéases choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 et la leucine aminopeptidase 2.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisée en ce que le test immuno logique comprend l 'utilisation d' au moins un anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptyl peptidase V, la subtilisin- like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou un fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2.
8. Procédé selon l 'une des revendications 1 à 5 , caractérisée en ce qu' elle comprend une étape de détermination de la présence d' au moins une desdites protéases réalisée par spectrométrie de masse quantitative.
9. Procédé selon la revendication 8 , caractérisée en ce que l ' étape de détermination de la présence d' au moins une desdites protéases, consiste à identifier par spectrométrie de masse quantitative au moins une des séquences peptidiques appartenant à une desdites protéases .
10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que l ' étape de détermination de la présence d' au moins une desdites protéases, consiste à identifier par spectrométrie de masse quantitative au moins une des séquences peptidiques suivantes :
SEQ ID n° l : LSVAEGVGLFNVLQEK
SEQ ID n°2 : ALVSHDGTFVGS SK
SEQ ID n°3 : GGVGIWISDAK
SEQ ID n°4 : INFVGYGQSTTK
SEQ ID n° 5 : TLYVTAEDHATGK
SEQ ID n° 6 : AAGAIVYNNVPGSLAGTLGGLDK
SEQ ID n°7 : VSFGIITDNVNANLTK
SEQ ID n° 8 : LIVGFVTELAK
SEQ ID n°9 : HANAVNAMIATLSK
SEQ ID n° 10 : KPGGTTYYYDPSAGK
SEQ ID n° l l : MANDVIQSPGEGTTGK
SEQ ID n° 12 : VLDCDGSGSNSGVIK
SEQ ID n° 13 : ADFSNYGAVVDVYAPGK
SEQ ID n° 14 : SVMNMSLGGPR
SEQ ID n° 15 : QMAIDVIQNPGASTTSK
1. Anticorps monoclonal dirigé contre la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2 ou fragment de cet anticorps capable de se lier respectivement à la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6 ou la leucine aminopeptidase 2, susceptible d' être utilisé pour la mise en œuvre du procédé selon l 'une des revendications 1 à 7.
12. Kit de diagnostic d'une patho logie de la peau et/ou des phanères liée à une infection par au moins un trichophyton, caractérisé en ce qu' il comprend au moins un anticorps monoclonal selon la revendication 1 1 .
13. Kit de diagnostic de l 'onychomyco se, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps monoclonal selon la revendication 1 1.
14. Au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour son utilisation dans une méthode de dépistage, de suivi thérapeutique et/ou de diagnostic d 'une pathologie liée à une infection par au moins un trichophyton.
15. Au moins une protéase choisie parmi la dipeptyl peptidase V, la subtilisin-like protease 6, la subtilisin-like protease 7, la leucine aminopeptidase 1 et la leucine aminopeptidase 2, pour son utilisation dans une méthode de dépistage, de suivi thérapeutique et/ou de diagnostic d 'une onychomycose.
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