WO2014084508A1 - 단백질과 Fc 도메인을 융합한 융합 단백질의 안정화용 조성물 - Google Patents

단백질과 Fc 도메인을 융합한 융합 단백질의 안정화용 조성물 Download PDF

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박순재
김성규
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for stabilizing a fusion protein of a protein having a physiological activity and an Fc domain, and to a method for stabilizing a fusion protein of a protein and an Fc domain using a composition containing an ammonium salt or an ammonium salt and succinate. It is about.
  • Antibody drugs which are used for the treatment of diseases, are biopharmaceuticals with high-level bioprocessing technology such as cell line production technology, cell culture technology, and purification technology.
  • a fusion protein (TNFR: Fc etanercept) prepared by fusing an extracellular ligand binding portion of a human p75 tumor necrosis factor receptor to the Fc domain of human IgG1 is used to treat rheumatoid arthritis.
  • TNFR Fc etanercept
  • Regulatory peptide, 170, 2011 have attempted to increase the half-life in the body by fusing physiologically active substances such as hGH and EPO to the Fc domain (KR10-2008-7018012).
  • a substance that binds to the domain has been used as a drug for the treatment of wet macular degeneration (WAMD).
  • a fusion protein has a problem in that its structure is large and complex, forming an aggregation caused by physical instability. Factors causing such aggregation exist in various ways during the production and storage of proteins.
  • aggregation may occur due to one or more of the following factors.
  • pH, salt type, salt concentration, temperature, contact with air, stirring speed, etc. which are not optimal conditions, may be affected, and the concentration condition of the protein may be influenced when formulated.
  • the passage of the filter and agitation may affect the buffer exchange, and during storage, temperature change, pH change, contact with air, and agitation may affect the aggregation phenomenon.
  • agglomeration may occur when the formulation containing the protein is exposed to light, and the material of the packaging container may also cause agglomeration (Hamada, H. et al., Current Pharmaceutical Biotechnology , 10: 400). , 2009).
  • the main cause of the aggregation phenomenon in buffer fusion proteins occurs when the hydrophobic sites of the antibody protein are exposed due to structural changes.
  • the aggregation of the hydrophobic sites of the protein molecules to form agglomerates, the coagulation formed in this way may occur in an irreversible form covalent bond between the antibody proteins (Hamada, H. et al., Current Pharmaceutical Biotechnology , 10: 348 , 2009).
  • aggregated fusion proteins or antibody proteins generally have reduced activity or lose activity over time.
  • these proteins when these proteins are aggregated, they have antigenicity that was not shown in the non-aggregated state, and when injected into the human body, they may cause the production of antibodies (antidrug antibodies, ADA). Therefore, there is an urgent need for a method for reducing such aggregation of fusion proteins and for a stable formulation of fusion proteins with reduced levels of aggregation (Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Biotechnology: Pharmaceutical Aspects Volume XI, 2010, pp 271-291).
  • Amphiphilic polymers such as, for example, amino acids (US4362661A, US7648702) such as arginine, lysine, proline, histidine, glycine, polysorbate based surfactants, polyethylene glycols, polyethylene glycols (PEG) or polyvinylpyrrolidone (PVP) Polysaccharides such as dextran, monosaccharides or disaccharides (US5945098A) such as sucrose, maltose and trehalose are used.
  • amino acids such as arginine, lysine, proline, histidine, glycine
  • PEG polyethylene glycols
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • Polysaccharides such as dextran, monosaccharides or disaccharides (US5945098A) such as sucrose, maltose and trehalose are used.
  • the stability thereof is generally lower than that of the produced antibody protein, so that a tendency to form aggregates is stronger than that of other proteins or antibody proteins.
  • a surfactant such as polysorbate
  • the present inventors have confirmed that the composition containing ammonium salt or ammonium salt and succinate can increase its stability to facilitate long-term storage by inhibiting aggregation of the protein and the fusion protein of the Fc domain, and the present invention To complete.
  • An object of the present invention is to provide a stabilizing composition capable of increasing the stability of a fusion protein by inhibiting aggregation of a protein having a physiological activity and a fusion protein of an Fc domain, and a method for stabilizing an Fc-fusion protein using such a composition. .
  • Another object of the present invention to provide a composition for the prevention and treatment of diseases comprising the stabilizing composition.
  • the present invention provides a composition for stabilizing the Fc-fusion protein containing the ammonium salt, or ammonium salt and succinate, and a composition for preventing and treating diseases comprising the same.
  • the present invention provides a method of stabilizing the fusion protein by adding ammonium salt, or ammonium salt and succinate to the composition containing the Fc-fusion protein.
  • FIG. 1 shows Etanercept (fusion protein of the water-soluble portion of the TNF receptor with the Fc domain) of various types of excipients (arginine (Arg), EDTA, glycine (Gly), histidine (His), hydroxypropylcyclodextrin (HP) Cyclodextrin), ammonium chloride, polyethylene glycol (PEG), proline (Pro), sucrose (Sucrose), trehalose (Trehalose), polysorbate 20) stored in a formulation solution containing for 1 week at 50 °C, the aggregation of etanercept This is the result of measuring the degree.
  • excipients arginine (Arg), EDTA, glycine (Gly), histidine (His), hydroxypropylcyclodextrin (HP) Cyclodextrin
  • Ammonium chloride ammonium chloride
  • PEG polyethylene glycol
  • Pro proline
  • sucrose Sucrose
  • Tehalose Tetra
  • Figure 2 shows etanercept various excipients (arginine (Arg), proline (Pro), 50 mM ammonium chloride, 100 mM ammonium chloride, 200 mM ammonium chloride, sucrose, polysorbate 20, hydroxypropylcyclodextrin ( HPcD)) is stored in the formulation solution containing for 1 week at 50 °C after measuring the degree of aggregation of etanercept.
  • Figure 3 is a result of measuring the degree of aggregation of etanercept after storage of etanercept for 4 weeks at 37 °C in a formulation containing ammonium chloride.
  • Arg arginine
  • AmCl ammonium chloride
  • AmSul ammonium sulfate
  • Am + Lys Ammonium Chloride + Lysine
  • Am + EDTA Ammonium Chloride + EDTA
  • 4 and 5 is a formulation solution containing etanercept for 14 days at 45 °C Arginine, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium chloride and lysine, ammonium chloride and EDTA, ammonium chloride and polysorbate 20, ammonium chloride and sucrose It is the result of measuring the degree of aggregation of etanercept after storage at.
  • AmSul ammonium sulfate
  • Am # + Lys ammonium chloride #% + lysine
  • FIG. 6 shows etanercept stored at 45 ° C. for 5 days in various buffers including sodium ammonium chloride (Sodium Phosphate, Sodium Succinate, Sodium Citrate, Histidine) It is a result of measuring the aggregation degree of etanercept after.
  • sodium ammonium chloride Sodium Phosphate, Sodium Succinate, Sodium Citrate, Histidine
  • Figure 7 is a result of measuring the degree of aggregation of etanercept after the composition of etanercept prepared by varying the pH of the succinic acid buffer solution containing ammonium chloride at 45 °C for 5 days.
  • AmCl Ammonium Chloride
  • AmCl + Lys Ammonium Chloride + Lysine
  • fusion protein and protein of the Fc domain refers to a fusion protein in the form of a protein fused to the Fc domain, which is a constant region of the antibody, wherein the protein is the amino acid of several amino acids formed by peptide bonds (peptide)
  • polypeptide a polypeptide is used in the same sense as an oligopeptide having a low molecular weight and a protein having a high molecular weight. Therefore, in the present invention, a “fusion protein of a protein and an Fc domain” refers to a “fusion protein of a polypeptide and an Fc domain”. Has the same meaning.
  • protein is a protein or polypeptide exhibiting any physiological activity, but the type is not limited, but preferably a soluble portion of various receptors such as TNF-receptor, VEGF receptor, GLP-1 analog (GLP) -1 analog and its derivatives, flt3 ligand, CD40 ligand, erythropoietin, thrombopoietin, thrombopoietin, calcitonin, calcitonin, Fas ligand, ligand for receptor activation of NF-kappa B (RANKL), tumor necrosis Factor (TNF) -related apoptosis inducing ligand (TRAIL), thymus storoma-derived lymphopoietin, granulocyte growth promoting glycoprotein, granulocyte-macrophage growth promoting glycoprotein, mast cell growth factor, stem cell Growth factor, epidermal growth factor, RANTES, growth hormone, insulin, insulin
  • the soluble portion of the receptor in the present invention means an extracellular ligand-binding domain of the receptor, or a region including an extracellular ligand-binding portion and an additional transmembrane domain. .
  • Fc domain refers to the constant region of the antibody, preferably, but not limited to the Fc domain of human IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 as well as human IgG1 can be used, IgG1, IgG2 , May include some or all of the CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain, hinge region of IgG3 and IgG4, and may preferably include a CH2 domain, a CH3 domain and a hinge region except for the CH1 domain. .
  • the fusion protein of the protein of the present invention and the Fc domain may be prepared and obtained by a general method used in the art.
  • residues other than fusion proteins may be removed through one or more processes selected, such as by centrifugation, ultrafiltration and / or chromatographic procedures.
  • the present invention provides a composition for stabilizing a fusion protein of a protein and an Fc domain containing an ammonium salt.
  • ammonium salt refers to a salt formed by combining ammonia and an acid, and may be represented by the general formula NH 4 X (X is a monovalent acid group).
  • X is a monovalent acid group.
  • ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate and ammonium nitrate may be used, but is not limited thereto.
  • the ammonium salt may be used at a concentration of 5 to 500 mM selected from ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • an ammonium salt having a concentration of 12.5 to 200 mM was used, but even when a small amount of ammonium salt of 12.5 mM or less or an ammonium salt of 200 mM or more is used, there is an effect of inhibiting aggregation of the fusion protein.
  • the ammonium salts of the present invention effectively inhibit aggregation of fusion proteins of polypeptides and Fc domains.
  • the extracellular ligand binding portion of the human p75 tumor necrosis factor receptor is stored in an ammonium chloride or ammonium sulfate solution when the fusion protein is fused to the Fc domain of human IgG1, the fusion protein is not stored in the ammonium salt solution. Compared to that, the degree of aggregation was reduced by about 80% (Fig. 1, Fig. 2).
  • the composition for stabilizing the fusion protein of the protein and the Fc domain according to the present invention may further include a succinate, the succinate contains a fusion protein of the protein and the Fc domain of the present invention
  • a succinate contains a fusion protein of the protein and the Fc domain of the present invention
  • the succinate is added to a concentration of 5 to 200 mM, more preferably 20 to 30 mM, as well as sodium succinate, various succinates known in the art can be used.
  • the succinate buffer is adjusted to have a pH of 5.5 to 6.5, more preferably to pH 6.0 to 6.3. When the pH is less than or equal to 5.5 or more than 6.5, aggregation of the fusion protein is increased, and thus, it is preferable that the pH is within the above range.
  • sodium phosphate, sodium succinate, sodium citrate, and histidine buffers are additionally added to ammonium chloride excipients that have been shown to suppress aggregation of fusion proteins.
  • the formulation using sodium succinic acid as a buffer was significantly lower than the formulation using sodium phosphate as a buffer currently used in the commercial etanercept (trade name Enbrel) at pH 6.5. It was confirmed. In addition, it was confirmed that the formulation with sodium succinate exhibited better aggregation inhibition than the formulation with other buffers at pH 6.0 (FIG. 6).
  • amino acids are known as substances which inhibit the aggregation of proteins, and among them, basic amino acids are excellent in role as anti-aggregation agents.
  • arginine is used as an anticoagulant (US 7648702 B2)
  • a formulation for stabilizing Fc modified antibodies with a combination of lysine, arginine, histidine and sugar, acid buffer and polysorbate US 20100254985 Patents have been reported.
  • anionic buffers such as sugars such as trehalose, sucrose, mannitol, maltose, phosphate, and citrate.
  • the surfactant is attached to the denatured and exposed hydrophobic sites of the protein to increase the solubility to prevent aggregation, typically polysorbate Muromonab, Abciximab, Rituximab, Daclizimab, Alemtuzumab, Adalimumab, Bevacizumab, Natalizumab, etc. Is used in the formulation of antibody proteins.
  • At least one excipient selected from basic amino acids, sugars and surfactants may be additionally used in the composition for stabilizing the fusion protein of the protein and the Fc domain according to the present invention. have.
  • arginine, lysine, histidine and the like may be used at a concentration of 1 to 50 mM, and as sugar, sucrose, trehalose, mannitol, maltose and the like at a concentration of 0.5 to 10% w / v,
  • surfactant Triton, Tween, and Pluronic substances may be used at a concentration of 0.001 to 0.1% w / v, but are not limited thereto. Excipients that can be used in the art to inhibit can be used without limitation.
  • the present invention provides a method of stabilizing a fusion protein of a protein and an Fc domain by adding an ammonium salt to a composition containing a fusion protein of a protein and an Fc domain, the composition further comprising succinate.
  • the succinate may be added at a concentration of 5 to 200 mM in the form of a buffer of pH 5.5 to 6.5.
  • the ethanercept and the protein which are commercially available arthritis therapeutics, were expressed in CHO cells, and then purified by high purity.
  • the ammonium salt according to the present invention is effective in inhibiting the aggregation of the fusion protein and stabilizing the formulation thereof.
  • the use of the ammonium salt according to the present invention in comparison with arginine used for preventing aggregation of etanercept products In this case, it was confirmed that the aggregation inhibitory effect of the fusion protein is more excellent (Example 2).
  • the present invention provides a composition for treating arthritis, containing a fusion protein and an ammonium salt in which the extracellular ligand binding portion of the human p75 tumor necrosis factor receptor is fused to the Fc domain of human IgG1.
  • TNFR Fc
  • Fc formulation means a formulation containing etanercept protein
  • This experiment was performed to compare the effects of excipients that inhibit aggregation of TNFR: Fc. Specifically, the experiment is to determine whether the difference in the aggregation phenomenon of TNFR: Fc stored at 50 °C according to the type of excipient. Except for arginine, an aqueous solution prepared by the same formulation as used in Amgen's Enbrel product was added and each excipient was added (final concentration was 25 mg / ml Etanercept, 0.66% w / v sucrose, 65 mM sodium chloride, 17 mM sodium phosphate, hydrogen ion concentration 6.4) The degree of aggregation after storage at 50 °C was compared.
  • the final concentration of excipient used in each aqueous solution was 25 mM arginine, 100 mM proline, 80 mM histidine, 100 mM glycine, 0.2 M ammonium chloride, 10 mM EDTA, 20% w / v sucrose, 20% w / v trihalose , 10% w / v polyethylene glycol, 0.04% w / v polysorbate 20, 0.1% w / v hydroxypropylcyclodextrin, and the degree of aggregation of TNFR: Fc was measured using SEC-HPLC.
  • Protein was injected into TSK-gel G3000SWXL (7.8 X 300 mm) HPLC column (TOSOH, Japan) under buffer mobile phase conditions of 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.15 M sodium chloride, 0.05% w / v sodium azide and 280 Protein peaks were detected at nm.
  • polysorbate 20 as a surfactant component, hydroxypropylcyclodextrin, amphiphilic polymer polyethylene glycol, EDTA as a metal ion removing agent, arginine as an amino acid-based excipient, proline, histidine, glycine and the like do not inhibit aggregation at all.
  • sucrose and trihalose which are sugar-based excipients, had better anti-agglomeration effects than other excipients.
  • almost all TNFR: Fc was aggregated, whereas only about 50% of the protein was changed to the aggregated form when ammonium chloride was used as the excipient.
  • this experiment was performed using TNFR: Fc. This experiment was performed to compare the degree of aggregation when arginine, an excipient used to inhibit aggregation of TNFR: Fc, and other excipients were used.
  • Excipients selected for comparison are proline, ammonium chloride, sucrose, polysorbate 20 and hydroxypropylcyclodextrin.
  • a negative control except for arginine at a final concentration of 10 mg / ml TNFR: Fc, 1% w / v sucrose, 100 mM sodium chloride, 25 mM sodium phosphate, hydrogen ion concentration of 6.4, and a positive control containing 25 mM arginine were prepared.
  • the excipients were replaced with 100 mM proline, 50-200 mM ammonium chloride, 20% w / v sucrose, 0.04% w / v polysorbate 20, and 0.1% w / v hydroxypropylcyclodextrin, respectively. Each was tested. Each formulation was stored at 50 ° C. for 1 week in the same manner as in Example 1. SEC-HPLC was used in the same manner as in Example 1 to determine the aggregation phenomenon.
  • the experiment was performed by modifying the experiment temperature to 37 °C in order to further demonstrate the aggregation inhibitory effect of the ammonium chloride excipient proved to be effective at high temperature.
  • This experiment was carried out to demonstrate the effect of inhibiting aggregation by the combination of ammonium sulfate, an ammonium salt other than ammonium chloride, with other excipients generally known to be capable of inhibiting protein aggregation.
  • the final concentration was 4 weeks at 37 ° C.
  • Stabilizing buffer composition without excipients for suppressing aggregation negative control
  • formulation with 25 mM arginine positive control
  • Formulations containing lysine were used. Each formulation was stored at 37 ° C. for 4 weeks. The aggregation inhibitory effect was observed using SEC-HPLC as in Example 1.
  • TNFR Fc in combination with ammonium chloride and ammonium sulfate, and other excipients generally known to have protein aggregation inhibitory effects.
  • Agglutination inhibitory effects of ammonium salts were observed in formulation solutions of 50 mg / ml TNFR: Fc stored at 45 ° C. under 1% w / v sucrose, 100 mM sodium chloride, 25 mM sodium phosphate, and stabilization buffer at pH 6.4. It was.
  • Stabilization buffer composition without agglutination inhibitor negative control
  • formulation containing arginine at a final concentration of 25 mM positive control
  • formulation containing 12.5 mM, 25 mM, 50 mM respectively, at a final concentration of ammonium chloride
  • 25 Formulations containing mM ammonium sulfate, 25 mM ammonium chloride and 25 mM lysine or 5% w / v sucrose formulations containing 50 mM ammonium chloride and 25 mM lysine or 5% w / v sucrose
  • the aggregation inhibitory effect was observed using SEC-HPLC as in Example 1.
  • composition containing ammonium salts or ammonium salts and succinate salts according to the present invention effectively inhibits the aggregation of Fc-fusion proteins, and thus enables long-term storage of the fusion proteins, and thus are widely used in the medical field using Fc-fusion proteins. Can be used.

Abstract

본 발명은 생리활성을 가지는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물에 관한 것으로, 암모늄염 또는 암모늄염과 숙신산염(succinate)를 함유하는 조성물을 이용하여 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암모늄염, 또는 암모늄염과 숙신산염을 함유하는 조성물은 Fc-융합 단백질의 응집을 효과적으로 억제하므로, 상기 융합 단백질의 장기간 보관을 가능하게 하기 때문에, Fc-융합 단백질을 이용한 의료 분야에 광범위하게 사용될 수 있다.

Description

단백질과 Fc 도메인을 융합한 융합 단백질의 안정화용 조성물
본 발명은 생리활성을 가지는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물에 관한 것으로, 암모늄염 또는 암모늄염과 숙신산염(succinate)를 함유하는 조성물을 이용하여 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
질환의 치료목적으로 사용되고 있는 항체의약품은 세포주 제작기술, 세포배양 기술, 정제 기술 등 고난이도의 생물공정 기술이 적용되는 바이오의약품으로서 기존의 약물보다 뛰어난 약효 및 안전성이 입증됨에 따라 나날이 그 수요가 증가하고 있다. 예를 들면, 인간 p75 종양괴사인자 수용체(human tumor necrosis factor receptor)의 세포외 (extracellular) 리간드 결합부를 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합하여 제조된 융합 단백질(TNFR:Fc 에타너셉트(etanercept)가 류마티스 관절염 치료제로 사용되고 있으며, 이외에도 생리 활성 물질의 체내 반감기를 증가시키기 위하여, GLP-1R 작용제(agonist)에 Fc 도메인이 융합된 융합 단백질을 당뇨병 치료제로 개발하고자 하는 시도가 있었으며 (US2004-0558627; Chung, H.S. et al., Regulatory peptide, 170, 2011), hGH, EPO 등의 생리활성 물질을 Fc 도메인에 융합하여 체내 반감기를 증가시키고자 한 시도가 있었다 (KR10-2008-7018012). 또한 최근에는 VEGF 수용체와 Fc 도메인과 결합한 물질 (aflibercept) 이 습성 황반 변성 (WAMD) 치료제로 허가 받아서 사용되고 있다.
그러나, 상기와 같은 융합 단백질은 그 구조가 크고 복잡하여, 물리적 불안정성에 의해 발생하는 응집 (aggregation)을 형성한다는 문제점이 있다. 이러한 응집을 유발하는 요인은 단백질의 생산 및 보관 과정에서 다양하게 존재한다.
예를 들면 아래의 요인들 중 한가지 이상의 요인들로 인하여 응집이 발생할 수 있다. 정제 시에는, 최적의 조건이 아닌 pH, 염 종류, 염 농도, 온도, 공기와의 접촉, 교반 속도 등이 영향을 미치며, 제형화 시에는 단백질의 농축 조건이 영향을 미칠 수 있다. 그리고 완충액 교환 시에는 필터 통과, 교반 등이 영향을 미치며, 저장 시에는 온도변화, pH 변화, 공기와의 접촉, 교반 등이 응집 현상에 영향을 미칠 수 있다. 그 외에도 단백질을 포함한 제형이 빛에 노출되는 경우에도 응집이 발생할 수 있으며, 포장용기의 재질도 응집을 발생하게 하는 원인이 될 수 있다 (Hamada, H. et al., Current Pharmaceutical Biotechnology, 10:400, 2009).
완충액 융합 단백질에서 나타나는 응집 현상의 가장 주된 원인은 구조 변화로 인하여 항체 단백질의 소수성 부위가 노출되는 경우 발생한다. 즉, 단백질 분자의 소수성 부위가 모여서 응집이 형성되는 것으로, 이렇게 형성된 응집은 항체 단백질 간에 공유 결합이 발생하여 비가역적인 형태로 진행되기도 한다 (Hamada, H. et al., Current Pharmaceutical Biotechnology, 10:348, 2009).
상기와 같은 이유로 응집된 융합 단백질 또는 항체 단백질은 대체로 활성이 감소되거나 시간이 지남에 따라 활성을 잃어버린다. 또한 이들 단백질은 응집되는 경우, 응집되지 않은 상태에서는 나타내지 않던 항원성을 갖게 되어 인체에 주사할 경우 항체(antidrug antibody, ADA)의 생성을 유발시킬 수 있다. 따라서 이와 같은 융합 단백질의 응집을 감소시키는 방법 및 감소된 응집 수준을 갖는 융합 단백질의 안정화된 제형에 대한 필요성이 절실한 상황이다 (Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Biotechnology: Pharmaceutical Aspects Volume XI, 2010, pp 271-291).
이러한 목적으로 응집을 방지하는 부형제를 첨가하거나 pH 또는 완충액 (buffer) 조성을 조절하는 방법이 시도된 예가 있다. 항체 단백질의 소수성 그룹이 분자의 표면으로 노출되어 소수성 그룹끼리 결합을 함으로서 발생하는 경우, 응집을 방지하는 부형제로는 노출된 소수성 그룹을 안정화할 수 있는 방법이 활용된다. 예를 들면 아르기닌, 라이신, 프롤린, 히스티딘, 글라이신 등과 같은 아미노산 (US4362661A, US7648702), 폴리소르베이트 기반 계면활성제, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)나 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 양친매성 고분자, 덱스트란과 같은 다당체, 수크로오스, 말토즈, 트레할로즈 등의 단당 또는 이당류 (US5945098A)가 사용된 예가 있다.
그러나, 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 경우에는, 일반적으로 생성되는 항체 단백질보다 그 안정성이 더욱 떨어져 응집체를 형성하려고 하는 경향이 기타의 단백질 또는 항체 단백질보다 강하다. 이러한 Fc-융합 단백질의 응집 현상을 방지하기 위하여 폴리소르베이트와 같은 계면활성제를 가하여 제형이 제조된 예가 있다(Steven J. Shire et al., Biotechnology: Pharmaceutical Aspects, Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, XI:115, 2010).
이에, 본 발명자들은 암모늄염, 또는 암모늄염과 숙신산염(succinate)를 함유하는 조성물이 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 응집을 억제하여 장기간 보관이 용이하도록 그 안정성을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 생리 활성을 가지는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 응집을 억제하여 융합 단백질의 안정성을 높일 수 있는 안정화용 조성물 및 그러한 조성물을 이용하여 Fc-융합 단백질을 안정화시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 안정화용 조성물을 포함하는 질병의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암모늄염, 또는 암모늄염과 숙신산염을 함유하는, Fc-융합 단백질의 안정화용 조성물 및 이를 포함하는 질병의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또 다른 형태로서, Fc-융합 단백질을 함유하는 조성물에 암모늄염, 또는 암모늄염과 숙신산염을 가하여 상기 융합 단백질을 안정화시키는 방법을 제공한다.
도 1은 에타너셉트(Etanercept) (TNF 수용체의 수용성 부분과 Fc 도메인의 융합 단백질)를 다양한 종류의 부형제 (아르기닌(Arg), EDTA, 글리신(Gly), 히스티딘(His), 하이드록시프로필사이클로덱스트린 (HP Cyclodextrin), 염화암모늄, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 프롤린 (Pro), 수크로오스 (Sucrose), 트레할로스 (Trehalose), 폴리소르베이트 20)가 포함된 제형용액에서 1주일간 50℃에서 보관한 후, 에타너셉트의 응집 정도를 측정한 결과이다.
도 2는 에타너셉트를 다양한 종류의 부형제(아르기닌(Arg), 프롤린(Pro), 50 mM의 염화암모늄, 100 mM의 염화암모늄, 200mM의 염화암모늄, 수크로오스, 폴리소르베이트 20, 하이드록시프로필사이클로덱스트린(HPcD))가 포함된 제형용액에서 1주일간 50℃에서 보관한 후 에타너셉트의 응집 정도를 측정한 결과이다.
도 3은 37℃에서 4 주간 에타너셉트를 염화암모늄을 함유하는 제형에서 보관한 후 에타너셉트의 응집 정도를 측정한 결과이다..
Arg : 아르기닌, AmCl : 염화암모늄, AmSul : 황산암모늄,
Am+Lys : 염화 암모늄 + 라이신, Am+EDTA : 염화 암모늄 + EDTA,
Am+Polysorabate 20 : 염화 암모늄 + 폴리소르베이트 20
Am+Sucrose : 염화 암모늄 + 수크로오스
도 4 및 도 5는 45℃에서 14일간 에타너셉트를 아르기닌, 염화암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄 및 라이신, 염화암모늄 및 EDTA, 염화암모늄 및 폴리소르베이트 20, 염화암모늄 및 수크로오즈를 함유하는 제형용액에서 보관한 후 에타너셉트의 응집 정도를 측정한 결과이다.
Arg : 아르기닌, AmCl ＃ : 염화암모늄 ＃％
AmSul : 황산암모늄, Am ＃ + Lys : 염화암모늄 ＃％ + 라이신,
Am ＃ + Suc : 염화암모늄 ＃％ + 수크로오스
도 6은 에타너셉트를 염화암모늄염을 포함하는 다양한 종류의 완충액(소디움포스페이트(Sodium Phosphate), 소디움숙신산(Sodium Succinate), 소디움시트레이트(Sodium Citrate), 히스티딘(Histidine))에서 5일간 45℃에서 보관한 후, 에타너셉트의 응집 정도를 측정한 결과이다.
도 7은 에타너셉트를 염화암모늄을 포함하는 염산숙신산 완충액의 pH를 달리하여 만든 조성물들을 5일간 45℃에서 보관한 후, 에타너셉트의 응집 정도를 측정한 결과이다.
도 8은 에타너셉트를 염화암모늄과 라이신을 포함하는 염화숙신산 완충액의 조성물에 5, 14일간 45℃에서 보관한 후, 에타너셉트의 응집 정도를 측정한 결과이다. Enbrel : 시판 중인 에타너셉트(엔브렐) 제형
AmCl : 염화암모늄, AmCl + Lys : 염화암모늄 + 라이신
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서, “단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질"은 항체의 불변 영역인 Fc 도메인에 단백질이 융합된 형태의 융합 단백질을 의미하며, 여기서 단백질은 수 개의 아미노산이 펩티드(peptide) 결합으로 형성된 아미노산의 중합체를 의미하는 것으로, 폴리펩티드는 분자량이 작은 올리고 펩티드 및 분자량이 큰 단백질과 같은 의미로 사용된다. 따라서, 본 발명에서 “단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질”은 “폴리펩티드와 Fc 도메인의 융합 단백질”과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서 “단백질”은 임의의 생리 활성을 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드로 그 종류가 제한되지 않으나 바람직하게는 TNF-수용체, VEGF 수용체 등의 다양한 수용체의 수용성 부분(soluble portion), GLP-1 유사체 (GLP-1 analog) 및 그 유도체, flt3 리간드, CD40 리간드, 에리스로포이에틴 (erythropoietin), 쓰롬보포이에틴 (thrombopoietin), 칼시토닌 (calcitonin), Fas 리간드, NF-kappa B의 수용체 활성용 리간드 (RANKL), 종양괴사인자(TNF)-관련 아폽토시스(apoptosis) 유도 리간드(TRAIL), 흉선 스토로마 유래 림포포이에틴 (lymphopoietin), 과립구 증식 촉진 당단백질, 과립구-대식세포 증식 촉진 당단백질, 비만 세포 성장 인자, 줄기 세포 성장 인자, 표피 성장 인자, RANTES, 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀 (insulinotropin), 인슐린 유사 성장 인자, 부갑상선 호르몬 (parathyroid hormone), 인터페론, 신경 성장 인자, 글루카곤, 인터루킨 1~18, 증식 촉진 당단백질, 림포톡신-β, 종양괴사인자(TNF), 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor), 온코스타틴-M 및 세포 표면 분자 ELK 및 Hek에 대한 다양한 리간드 (예컨대, 에파(eph-)관련 키나아제 또는 LERKS 등에 대한 리간드) 중에서 선택한 것이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간 p75 종양괴사인자 수용체(p75 TNF receptor)의 세포외 리간드 결합부가 사용될 수 있다.
본 발명에서의 수용체의 수용성 부분(soluble portion)은 수용체의 세포외 리간드 결합부(extracellular ligand-binding domain), 또는 세포 외 리간드 결합부와 추가적으로 막통과 영역(transmembrane domain)을 포함하는 영역을 의미한다.
본 발명에서, “Fc 도메인”은 항체의 불변영역을 의미하는 것으로, 인간 IgG1의 Fc 도메인이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 IgG1 뿐 아니라 IgG2, IgG3 및 IgG4도 사용될 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 영역 (hinge region) 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 CH1 도메인을 제외한 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법으로 제조 및 수득 될 수 있다. 세포 내에서 융합 단백질을 생산하는 경우, 융합 단백질 이외의 잔여물은 원심분리, 한외여과 및/또는 크로마토그래피 과정 등에서 선택된 하나 이상의 공정을 통해 제거될 수 있다.
본 발명은 일 관점에서, 암모늄염을 함유하는, 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “암모늄염”은 암모니아와 산이 화합하여 생기는 염을 의미하는 것으로, 일반식 NH4X(X는 1가의 산기)으로 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다양한 종류의 염은 단백질의 용해도를 변화시키는데 (Kunz, W. et al., Curr. Opin. Coll. Interface Sci., 9:1937, 2004), 단백질의 용해도 정도는 표면장력의 증가와 관련이 있다. 표면장력을 가장 크게 증가시키며 단백질의 안정성을 증가시키는 양이온은 NH4 +이다. 그러나, 아직까지 암모늄염을 이용하여 융합 단백질의 응집을 억제하거나 융합 단백질을 함유하는 조성물을 안정화한 예는 없었다. 본 발명자들은, 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 암모늄염을 함유하는 수용액에서 보관하는 경우 융합 단백질의 응집이 효과적으로 억제되는 것을 발견하였는바, 본 발명은 암모늄염을 함유하는, 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 암모늄염은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄 중에서 선택되는 것을 5 내지 500 mM의 농도로 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, 12.5 내지 200 mM 농도의 암모늄염을 사용하였으나, 12.5 mM 이하의 소량의 암모늄염을 사용하거나 200 mM 이상의 암모늄염을 사용하는 경우에도 융합 단백질의 응집 억제 효과가 존재한다. 따라서, 본 발명의 암모늄염은 폴리펩티드와 Fc 도메인의 융합 단백질의 응집을 효과적으로 억제한다. 본 발명의 다른 실시예에서는, 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질을 염화암모늄 또는 황산암모늄 용액에서 보관하였을 때, 암모늄염 용액에서 보관하지 않은 융합 단백질에 비하여 그 응집 정도가 약 80%까지 감소한다는 것을 확인하였다 (도 1, 도 2).
또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물은 숙신산염(succinate)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 숙신산염은 본 발명의 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 함유하는 조성물의 pH(수소이온농도)를 조절하여 융합단백질의 응집을 더욱 감소시키기 위한 완충제 기능을 수행한다.
상기 숙신산염은 5 내지 200 mM, 더 바람직하게는 20 내지 30 mM 농도가 되도록 첨가되며, 소디움숙신산(sodium succinate) 뿐 아니라, 당업계에 공지된 다양한 숙신산염이 사용될 수 있다. 상기 숙신산염을 포함하는 조성물에 있어, 숙신산염 완충제는 pH가 5.5 내지 6.5가 되도록 조절하며, 더 바람직하게는 pH 6.0 내지 6.3으로 조절한다. pH가 5.5 이하가 되거나 6.5 이상이 되면 융합 단백질의 응집이 증가하므로, 상기 범위 내에서 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 실시예에서, 융합 단백질의 응집 억제 효과가 입증된 염화암모늄 부형제에 소디움포스페이트 (sodium phosphate), 소디움숙신산(sodium succinate), 소디움시트레이트(sodium citrate), 히스티딘(histidine) 완충액를 추가로 첨가하여 단백질 응집효과의 차이를 확인하였으며, 그 결과, 소디움숙신산을 완충제로 사용한 제형이 pH 6.5에서 현재 시판 중인 에타너셉트(상품명 Enbrel) 제형에 사용하고 있는 소디움포스페이트를 완충제로 사용한 제형보다 응집형성이 확연히 낮음을 확인하였다. 또한 pH 6.0에서 다른 완충제를 사용한 제형보다 소디움숙신산염을 사용한 제형이 우수한 응집 억제 현상을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다 (도 6). 또한, 소디움숙신산 완충액의 효과를 극대화하기 위해 여러 pH로 조절하여 응집 억제 효과를 관찰한 결과, 소디움숙신산 완충액의 pH가 낮을수록 응집형성이 낮음을 확인하였으며, pH 6.0 및 pH 6.3에서 시판중인 에타너셉트 제형(비교제형)에 비해 응집형성이 확연히 적은 것을 확인할 수 있었다 (도 7).
한편, 아미노산은 단백질의 응집을 억제하는 물질로서 알려져 있으며 그 중에서도 염기성 아미노산은 응집 방지제로서 역할이 우수하다. 류마티스 관절염 치료제인 에타너셉트의 경우에 아르기닌이 응집방지제로 사용되고 (US 7648702 B2) 또한, 라이신, 아르기닌, 히스티딘과 당, 산성완충액, 폴리소르베이트의 조합으로 Fc 변형 항체를 안정화하는 제형 (US 20100254985)의 특허가 보고 된 바 있다. 이외에도 트레할로즈, 수크로오스, 만니톨, 말토즈 등의 당, 포스페이트, 사이트레이트 등의 음이온성 완충액를 사용한 예가 있다. 또한, 계면활성제는 단백질의 변성되어 노출된 소수성 부위에 부착하여 용해도를 증가시킴으로 응집을 방지할 수 있는 바, 대표적으로 폴리소르베이트가 Muromonab, Abciximab, Rituximab, Daclizimab, Alemtuzumab, Adalimumab, Bevacizumab, Natalizumab 등의 항체 단백질 제형에 사용되고 있다.
따라서, 본 발명에 따른 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물에는 융합 단백질의 응집을 더욱 감소시키기 위하여 바람직하게는, 염기성 아미노산, 당 및 계면활성제 중에서 선택되는 1종 이상의 부형제가 추가로 사용할 수 있다.
염기성 아미노산으로는 아르기닌, 라이신, 히스티딘 등을 1 내지 50 mM의 농도로 사용할 수 있으며, 당으로는 수크로오즈, 트레할로즈, 만니톨, 말토즈 등을 0.5 내지 10 % w/v의 농도로, 계면활성제로는 트리톤(Triton), 트윈(Tween), 플루로닉(Pluronic) 계열의 물질을 0.001 내지 0.1 % w/v의 농도로 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 융합 단백질 또는 항체 단백질의 응집을 억제하기 위하여 당 업계에서 사용될 수 있는 부형제라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 소디움숙신산염 완충액와 암모늄이온 성분 그리고 염기성 아미노산을 조합하여 응집 억제 효과를 관찰한 결과, 염화암모늄, 숙신산염 및 라이신이 추가된 조성물의 경우, 에타너셉트 제형(비교제형)에 비해 응집형성의 정도가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 8).
본 발명은 다른 관점에서, 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 함유하는 조성물에 암모늄염을 가하여 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법을 제공하며, 상기 조성물에는 숙신산염(succinate)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 숙신산염은 pH가 5.5 내지 6.5의 완충제 형태로 5 내지 200 mM 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질로는 시중에서 구입할 수 있는 관절염 치료제인 에타너셉트와 단백질을 CHO 세포에서 발현시킨 후, 이를 고순도로 정제하여 수득한 것을 사용하였다. 본 발명에 따른 암모늄염이 상기 융합 단백질의 응집을 억제하여 그 제형을 안정화시키는데 효과적인지 실험을 수행한 결과, 에타너셉트 제품의 응집 방지를 위하여 사용하는 아르기닌 (Arginine)에 비하여 본 발명에 따른 암모늄염을 사용하는 경우, 융합 단백질의 응집 억제효과가 더욱 우수하다는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 2).
이에 따라, 본 발명은 바람직한 예로서, 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 것인 융합단백질과 암모늄염을 함유하는 관절염 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1
단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질로는, 에타너셉트 단백질을 사용하여 본 실험을 수행하였다. 본 발명에서의 “TNFR:Fc”는 에타너셉트 단백질을 의미하며, “TNFR:Fc 제형”은 에타너셉트 단백질을 포함하는 제형을 의미한다.
본 실험은, TNFR:Fc의 응집을 억제하는 부형제들의 효과를 비교하기 위하여 수행한 것이다. 구체적으로, 부형제의 종류에 따라 50℃에서 보관한 TNFR:Fc의 응집현상의 차이가 발생하는지를 확인하기 위한 실험이다. 아르기닌을 제외하고는 미국 Amgen사의 Enbrel 제품에서 사용된 것과 동일한 제형의 용액을 만든 후 각각의 부형제를 첨가하여 제조한 수용액을 (최종농도는 25 mg/ml Etanercept, 0.66% w/v 수크로즈, 65 mM 염화나트륨, 17 mM 소디움포스페이트, 수소이온농도 6.4) 50℃에서 보관한 후 나타난 응집정도를 비교하였다. 각 수용액에서 사용된 부형제의 최종 농도는 25 mM 아르기닌, 100 mM 프롤린, 80 mM 히스티딘, 100 mM 글라이신, 0.2 M 염화암모늄, 10 mM EDTA, 20% w/v 수크로오스, 20% w/v 트리할로즈, 10% w/v 폴리에틸렌글리콜, 0.04% w/v 폴리소르베이트 20, 0.1% w/v 하이드록시프로필사이클로덱스트린이었으며, TNFR:Fc의 응집정도는 SEC-HPLC를 이용하여 측정하였다. 단백질을 50mM 소디움포스페이트(pH 6.8), 0.15M 염화나트륨, 0.05% w/v 소디움아자이드의 완충용액 이동상 조건하에서 TSK-gel G3000SWXL (7.8 X 300 mm) HPLC column(TOSOH, Japan)에 주입한 후 280 nm에서 단백질 피크를 검출하였다. TNFR:Fc의 응집체는 주 피크보다 앞서 칼럼에서 용출이 되며, 응집체의 피크 면적과 주 피크의 면적을 비교하여 응집 정도를 계산하였다.
1주일간 50℃에 보관한 결과, TNFR:Fc 단백질의 응집 현상은 부형제의 종류에 따라 크게 상이함을 알 수 있었다. 냉장 조건인 4℃에서 보관한 단백질 (응집 방지 부형제가 없는 대조군)에서는 거의 응집 현상이 나타나지 않은 반면, 50℃에서는 부형제의 종류에 관계없이 거의 대부분의 단백질들이 응집 형태로 변화하였다 (도 1). 그 중에서도, 계면활성제 성분인 폴리소르베이트 20, 하이드록시프로필사이클로덱스트린이나 양친매성 고분자인 폴리에틸렌글리콜, 금속이온 제거제인 EDTA, 아미노산 계열 부형제인 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 글라이신 등은 응집현상을 전혀 억제하지 못하였다(도 1). 그러나 당 계열 부형제인 수크로오스, 트리할로즈는 다른 부형제보다 조금 나은 응집 형성 방지 효과가 있었다. 또한, 타 부형제들의 경우에서는 거의 대부분의 TNFR:Fc가 응집되는데 반하여, 염화암모늄을 부형제로 사용한 경우에는 약 50%의 단백질만이 응집 형태로 변화한 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 가혹 조건에서 TNFR:Fc의 응집 현상이 암모늄염의 사용에 의하여 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다.
실시예 2
단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질로, TNFR:Fc를 사용하여 본 실험을 수행하였다. 본 실험은, TNFR:Fc의 응집을 억제하기 위하여 사용되고 있는 부형제인 아르기닌 (Arginine)과 타 부형제를 사용한 경우의 응집 정도를 비교하기 위하여 수행한 것이다.
비교 대상으로 선택한 부형제는 프롤린, 염화암모늄, 수크로오즈, 폴리소르베이트 20과 하이드록시프로필사이클로덱스트린이다. 최종 농도 10 mg/ml의 TNFR:Fc, 1% w/v 수크로오스, 100mM 염화나트륨, 25mM 소디움포스페이트, 수소이온농도 6.4의 아르기닌을 제외한 음성 대조약과, 25mM 아르기닌이 포함된 양성 대조약을 제조하였다. 그리고 음성 대조약에 부형제가 각각 100mM 프롤린, 50~200 mM 암모늄클로라이드, 20 % w/v 수크로오스, 0.04% w/v 폴리소르베이트 20, 0.1 % w/v 하이드록시프로필사이클로덱스트린로 대치된 제형을 각각 시험하였다. 각각의 제형들은 실시예 1과 동일하게 50℃에서 1주일간 보관하였다. 응집 현상을 알아보기 위하여 실시예 1과 동일하게 SEC-HPLC 를 사용하였다.
TNFR:Fc를 50℃에서 1주일간 보관한 결과, 아르기닌이 포함된 제형에서는 약 10% 정도의 응집 현상이 발견되었다 (도 2). 그러나, 다른 아미노산인 프롤린은 응집방지 효과가 미미하였으며 항체 단백질의 제형에 많이 포함되는 응집 방지제인 폴리소르베이트 20, 하이드록시프로필사이클로덱스트린 (HPCD)도 응집 방지 효과가 거의 없었음을 알 수 있었다. 그러나 대표적인 단백질 안정화제인 수크로오스의 경우에는 과량 (20% w/v)을 첨가한 경우에는 응집 방지효과가 아르기닌의 경우보다 우수하였다. 실시예 1에서 탁월한 안정화 효과를 보인 염화암모늄은 첨가되는 농도가 증가할수록 응집 방지 효과도 증가함을 확인할 수 있었으며 (도 2 참조), 50mM의 염화암모늄을 사용한 경우, 25 mM의 아르기닌을 사용한 경우보다 응집 억제 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3
본 실시 예에서는 고온에서 응집 억제 효과가 입증된 염화암모늄 부형제의 응집 억제 효과를 더욱 자세히 입증하기 위하여 실험 온도를 37℃로 수정하여 실험을 수행하였다. 본 실험은, 부형제로는 염화암모늄 이외의 암모늄염인 황산암모늄과 일반적으로 단백질 응집 억제 능력이 있다고 알려진 타 부형제와의 조합에 의한 응집 억제 효과를 입증하기 위하여 수행한 것이다. 구체적으로, 최종 농도가 25 mg/ml의 TNFR:Fc, 1% w/v 수크로오스, 100mM 염화나트륨, 25mM 소디움포스페이트, 수소이온농도 6.4의 안정화 완충액 조건에서 각각의 부형제를 첨가한 후 37℃에서 4 주 보관 후 실험을 수행하였다.
응집 억제를 위한 부형제가 들어가 있지 않은 안정화 완충액 조성 (음성 대조제형), 최종 농도가 25 mM의 아르기닌이 포함된 제형 (양성 대조제형), 50 mM의 염화암모늄이 포함된 제형, 25 mM의 황산암모늄, 50 mM의 염화암모늄과 1 mM의 EDTA, 50 mM의 염화암모늄과 0.1% w/v의 폴리소르베이트 20, 50 mM의 염화암모늄과 5% w/v의 수크로오스, 50 mM의 염화암모늄과 25mM의 라이신이 포함된 제형들을 사용하였다. 각각의 제형들은 37℃에서 4주간 보관하였다. 응집 억제 효과는 실시예 1에서와 마찬가지로 SEC-HPLC 를 사용하여 관찰하였다.
표 1 에타너셉트를 염화암모늄을 함유하는 제형에서 37℃, 4주간 보관한 후 에타너셉트의 응집 정도를 측정한 결과
％ Aggregation
Week 0 1 2 4
Control 0.3 1.3 1.4 3.1
Arg 1.1 1.4 3.1
AmCl 1.1 13.3 2.7
AmSul 1.0 1.3 2.7
Am＋Lys 0.9 1.3 2.4
Am＋EDTA 1.6 2.8 5.2
Am＋Tween 1.6 2.7 4.9
Am＋Sucrose 1.0 1.2 2.4
TNFR:Fc를 37℃에서 4주간 보관한 결과, 암모늄염을 포함하는 제형들이 단백질의 응집현상을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었으며 황산암모늄도 염화암모늄과 유사하게 응집을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 흥미롭게도 EDTA, 폴리소르베이트 20과 같은 부형제는 염화암모늄과 조합하여 사용하였을 시, 음성 대조제형보다 응집현상이 더욱 많이 발생하였으나 수크로오스 및 라이신을 염화암모늄과 조합하여 사용한 경우에는 염화암모늄만 단독으로 사용한 경우에 비하여 응집 정도가 더욱 감소된 것을 확인할 수 있었다 (도 3 및 표 1).
실시예 4
본 실험은, 융합 단백질의 응집 억제 효과가 입증된 염화암모늄 부형제의 농도별 억제 효과를 알아보기 위한 것으로 37℃보다 고온에서 수행하였다. 본 실험에서는 TNFR:Fc의 미세한 응집 현상의 차이를 확실히 알아보기 위하여 온도를 45℃로 설정하여 실험을 수행하였다.
구체적으로, 염화암모늄과 황산암모늄, 그리고 일반적으로 단백질 응집 억제 효과가 있다고 알려진 타 부형제와의 조합에 따른 TNFR:Fc의 응집 억제 효과를 알아보기 위하여 본 실험을 수행하였다. 최종 농도가 50 mg/ml의 TNFR:Fc를 1% w/v 수크로오스, 100mM 염화나트륨, 25mM 소디움포스페이트, 수소이온농도 6.4의 안정화 완충액 조건에서 45℃에 보관한 제형 용액에서 암모늄염의 응집 억제 효과를 관찰하였다.
응집 억제 부형제가 포함되어 있지 않은 안정화 완충액 조성 (음성 대조제형), 최종 농도 25mM의 아르기닌이 포함된 제형 (양성 대조제형), 최종 농도 염화암모늄이 각각 12.5 mM, 25 mM, 5 0mM 들어간 제형, 25 mM의 황산암모늄, 25 mM의 염화암모늄 및 25mM의 라이신 또는 5% w/v의 수크로오스가 포함된 제형, 50 mM의 염화암모늄 및 25 mM의 라이신 또는 5% w/v의 수크로오스가 포함된 제형들을 45℃에서 2주일간 보관한 뒤, 응집 정도를 관찰하였다. 응집 억제 효과는 실시예 1에서와 마찬가지로 SEC-HPLC 를 사용하여 관찰하였다.
표 2 에타너셉트를 염화암모늄을 농도별로 함유하는 제형에서 45℃, 14일 동안 보관한 후 에타너셉트의 응집 정도를 측정한 결과
％ Aggregation
Day 0 3 7 14
Control 0.9 2.2 3.7 4.6
Arg 1.9 3.2 3.8
AmCl 12.5 2.3 3.5 4.4
AmCl 25 2.1 3.2 4.0
AmCl 50 1.8 3.0 3.7
AmSul 1.7 3.0 3.6
Am25＋Lys 1.7 2.8 3.5
Am25＋Suc 1.6 2.9 3.5
Am50＋Lys 1.5 2.6 3.0
Am50＋Suc 1.8 2.6 3.1
본 실험 결과, 암모늄염이 포함된 제형의 경우, 농도에 따라 아르기닌을 포함하는 제형과 동일하거나 더 우수한 응집 억제 현상을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 일반적으로 단백질 응집 억제 효과가 있다고 알려진 다른 부형제 (라이신, 수크로오스)와 염화암모늄 또는 황산암모늄을 조합하여 사용하는 경우, 더욱 우수한 응집 억제 효과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다 (도 4, 도 5 및 표 2).
실시예 5
본 실험은, 융합 단백질의 응집 억제 효과가 입증된 염화암모늄 부형제의 효과를 극대화하기 위해 여러 종류의 완충액으로 만든 제형 용액을 45℃에 보관하여 응집 억제 효과를 관찰하였다.
구체적으로, 일반적으로 단백질 제형에 많이 사용하는 소디움포스페이트 (sodium phosphate), 소디움숙신산(sodium succinate), 소디움시트레이트(sodium citrate), 히스티딘(histidine) 완충액 내에서의 단백질 응집효과의 차이를 보기 위해 시험하였다. 최종 농도가 50 mg/ml의 TNFR:Fc를 100mM 염화나트륨, 50mM 염화암모늄, 25mM의 각각의 위 네 가지 종류의 완충액의 조건에서 pH 6.0과 pH 6.5의 두 가지 조건에서 45℃에 보관한 제형 용액에서 응집 억제 효과를 관찰하였다.
응집 억제 효과는 실시예 1에서와 마찬가지로 SEC-HPLC를 사용하여 관찰하였다.
본 실험 결과, 소디움숙신산을 완충제로 사용한 제형이 pH 6.5에서 다른 완충제를 사용한 제형보다 응집형성이 확연히 낮음을 확인하였다. 현재 시판중인 Enbrel 제형에 사용하고 있는 소디움포스페이트를 완충제로 사용한 제형이 여타의 제형보다 응집형성이 많았다. 또한 pH 6.0에서 다른 완충제를 사용한 제형보다 소디움숙신산을 사용한 제형이 조금 더 우수한 응집 억제 현상을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).
실시예 6
본 실험은, 융합 단백질의 응집 억제 뛰어난 소디움숙신산 완충액의 효과를 극대화하기 위해 여러 pH로 조절한 소디움숙신산 완충액으로 만든 제형용액을 45℃에 보관하여 응집 억제 효과를 관찰하였다.
구체적으로, 소디움숙신산 (Sodium Succinate) 완충액 중 pH에 따른 단백질 응집효과의 차이를 보기 위해 시험하였다. 최종 농도가 50 mg/ml의 TNFR:Fc를 100 mM 염화나트륨, 50 mM 염화암모늄, 25 mM의 소디움숙신산 완충제액의 조건에서 pH 6.0, 6.3, 6.5, 7.0의 네 가지 조건에서 45℃에 보관한 제형 용액에서 응집 억제 효과를 관찰하였다.
응집 억제 효과는 실시예 1에서와 마찬가지로 SEC-HPLC를 사용하여 관찰하였다.
본 실험 결과, 소디움숙신산염 완충액의 pH가 낮을수록 응집형성이 낮음을 확인하였으며, pH 6.0 및 pH 6.3에서 시판중인 에타너셉트 제형(비교제형) 보다 응집형성이 적은 것을 확인할 수 있었다 (도 7).
실시예 7
본 실험은, 융합 단백질의 응집 억제 뛰어난 소디움숙신산 완충액와 암모늄이온 성분 그리고 염기성 아미노산을 조합하였을 때 응집 억제 효과가 더 뛰어남을 확인하기 위해 각 성분을 조합하여 만든 제형용액을 45℃에 보관하여 응집 억제 효과를 관찰하였다.
구체적으로, 소디움숙신산 (Sodium Succinate) 완충액, 염화암모늄, 라이신을 조합하여 단백질 응집효과의 차이를 보기 위해 시험하였다. 최종 농도가 50 mg/ml의 TNFR:Fc를 100 mM 염화나트륨, 50 mM 염화암모늄, 25 mM 라이신, 25 mM의 소디움숙신산염 완충제액의 조건에서 45℃에 보관한 제형 용액에서 응집 억제 효과를 0, 5, 10 및 15일 동안 관찰하였다.
응집 억제 효과는 실시예 1에서와 마찬가지로 SEC-HPLC를 사용하여 관찰하였다.
본 실험 결과, 염화암모늄, 숙신산염 및 라이신이 추가된 조성물의 경우, Enbrel 제형(비교제형) 보다 응집형성이 적은 것을 확인하였다 (도 8).
본 발명에 따른 암모늄염, 또는 암모늄염과 숙신산염을 함유하는 조성물은 Fc-융합 단백질의 응집을 효과적으로 억제하므로, 상기 융합 단백질의 장기간 보관을 가능하게 하기 때문에, Fc-융합 단백질을 이용한 의료 분야에 광범위하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (32)

  1. 암모늄염을 함유하는, 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 숙신산염(succinate)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 숙신산염은 5 내지 200 mM 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는융합 단백질의 안정화용 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 숙신산염은 pH는 5.5 내지 6.5의 완충액 역할을 수행하는 것을 특징으로 하는융합 단백질의 안정화용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암모늄염은 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는융합 단백질의 안정화용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 암모늄염은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는융합 단백질의 안정화용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 암모늄염은 5 내지 500 mM의 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는융합 단백질의 안정화용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 것을 특징으로 하는융합 단백질의 안정화용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 안정화용 조성물은 부형제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 부형제는 염기성 아미노산, 당 및 계면활성제 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 부형제는 수크로오스 또는 라이신, 또는 둘 다 인것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 안정화용 조성물.
  12. 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 함유하는 조성물에 암모늄염을 가하여 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 숙신산염을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 숙신산염은 5 내지 200 mM 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 숙신산염은 pH는 5.5 내지 6.5의 완충액 형태로 첨가되는 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 암모늄염은 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 암모늄염은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 암모늄염은 5 내지 500 mM의 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 융합 단백질은 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 것인 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 안정화용 조성물은 부형제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 부형제는 염기성 아미노산, 당 및 계면활성제 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 부형제는 수크로오스 또는 라이신, 또는 둘 다 인것을 특징으로 하는 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질을 안정화시키는 방법.
  23. 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질과 암모늄염을 함유하는 관절염 치료용 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 숙신산염을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 숙신산염은 5 내지 200 mM 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 숙신산염은 pH는 5.5 내지 6.5의 완충액 형태로 첨가되는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
  27. 제23항에 있어서, 상기 암모늄염은 단백질과 Fc 도메인의 융합 단백질의 응집을 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
  28. 제23항에 있어서, 상기 암모늄염은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
  29. 제23항에 있어서, 상기 암모늄염은 5 내지 500 mM의 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
  30. 제23항에 있어서, 상기 조성물은 부형제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 부형제는 염기성 아미노산, 당 및 계면활성제 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 부형제는 수크로오스 또는 라이신, 또는 둘 다 인것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
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