WO2014081113A1 - 아세트산-저항성 효모 스트레인 - Google Patents

아세트산-저항성 효모 스트레인 Download PDF

Info

Publication number
WO2014081113A1
WO2014081113A1 PCT/KR2013/008224 KR2013008224W WO2014081113A1 WO 2014081113 A1 WO2014081113 A1 WO 2014081113A1 KR 2013008224 W KR2013008224 W KR 2013008224W WO 2014081113 A1 WO2014081113 A1 WO 2014081113A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acetic acid
spp
yeast strain
yeast
strain
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/008224
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
최원자
김완기
Original Assignee
이화여자대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이화여자대학교 산학협력단 filed Critical 이화여자대학교 산학협력단
Publication of WO2014081113A1 publication Critical patent/WO2014081113A1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to an acetic acid-resistant yeast strain and a method for screening acetic acid resistance-related yeast genes using the same.
  • Acetic acid is one of the simplest naturally ly occurring carboxylic acids. Acetic acid is not only an important industrial compound but also most widely used as a food preservative to inhibit or prevent the growth of many microorganisms. These properties of acetic acid often cause problems as a normal end product of alcohol fermentation by Saccharomyces cerevisiae (5ac a / 7 es cerew ' s / ae). Accumulation of acetic acid to toxic levels in the growth medium can slow down fermentation by reducing ethanol yield (Gibson, et al., 2007).
  • acetic acid is one of the major inhibitory compounds resulting from the pretreatment of lignocellulosic substrates used to produce bioethane (Almeida, et al., 2007). Toxic effects of acetic acid are intracellular reduction of ⁇ , growth inhibition and apoptotic cell death (Gibson, et al., 2007; Ludovico, et al., 2001). Therefore, the development of Saccharomyces cerevisiae strains that can withstand the stress caused by acetic acid is very important in the field of ethanol fermentation.
  • gTME was first used to create strains resistant to increased ethane by inducing mutations in the TBPCTATA-binding protein encoded by the SPT15 gene, previously reported to be capable of growing fatal ethane at concentrations (Alper, et al., 2006). Although there is controversy about ethanol resistance obtained through gTME (Baerends, et al., 2009), we have successfully obtained strains with increased ethanol resistance using the same approach (Yang, et. al., 2011). Similarly, seen in this study. The inventors obtained two acetic acid-resistant strains by screening a library that overexpresses the SPT15 mutant allele.
  • the inventors have sought to develop industrially useful yeast strains that have acetic acid resistance.
  • the inventors constructed a mutated SPT15 gene using PCR-mediated random mutagenesis and transformed it into yeast to isolate the acetic acid-resistant transformed yeast strains, which contained high concentrations of acetic acid (eg, , 0.5% or 0.9%) to confirm that the present invention was completed. Accordingly, it is an object of the present invention to provide an acetic acid-resistant yeast strain.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing acetic acid-resistant yeast strain.
  • the present invention provides an acetic acid-resistant transformed strain comprising a mutated ScSPT15 gene.
  • the present inventors have tried to develop an industrially useful yeast strain having acetic acid resistance: ⁇ .
  • the inventors constructed the mutated SPT15 gene using PCR-mediated random mutagenesis and transformed it into yeast to isolate the acetic acid-resistant transformed yeast strains, which contained high concentrations of acetic acid (eg, 0.5% or 0.9%) was confirmed that it can grow.
  • Acetic acid is an organic compound (C3 ⁇ 4C00H) represented by the following formula (I), which is a major component of vinegar and has a unique sour taste and a characteristic odor:
  • Acetic acid is a compound that inhibits fermentation in the bioethanol production process, which has a detrimental effect on the growth and survival of yeast by the various stresses caused. Therefore, it is very important to develop strains resistant to acetic acid in the production of ethanol using yeast.
  • the present invention provides a modified yeast strain with increased acetic acid-resistance in yeast transformed with mutated ScSPT15.
  • a strain capable of growing is isolated / identified by culturing the yeast strain transformed with the mutated ScSPT15 in high concentration acetic acid.
  • acetic acid-resistant strains were selected by performing a growth assay of yeast strain at various concentrations of acetic acid (specifically 0-0.%).
  • the yeast strain transformed with the mutated ScSPT15 gene described above is highly acetic acid, more specifically 0-5% acetic acid, more specifically 0.3-1.5% acetic acid, even more specific. For example 0.4-1.2% acetic acid, and most specifically 0.5-0.9% acetic acid.
  • the yeast strain of the invention has an improved ability to reduce intracellular R0S levels.
  • the above-described yeast strains include Saccharomyces sp. Saccharomyces spp., Schizozosaccharomyces spp., Pichy ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Pichia spp. ), Papy ⁇ ⁇ ⁇ iPaff / a spp.), Kluyberomyces ⁇ UUuyveromyces spp.), Candida spp.), Talaromyces spp.), Brettanomyces spp.
  • the mutated ScSPT15 gene described above may be introduced into yeast cells as a plasmid.
  • the mutated ScSPT15 gene described above may be introduced into genomic DNA of yeast cells.
  • the mutated ScSPT15 gene of the present invention is disclosed in SEQ ID NO: 1 to 4 sequences.
  • the present invention provides a method of transfecting cells and genes infected by a recombinant vector or a transcript thereof comprising the mutated ScSPT15 gene. Provide the transformed cells.
  • the present invention is a mutated
  • a recombinant vector comprising the ScSPT15 gene or a transformant transformed with the mutated ScSPT15 protein described above.
  • the vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are described in Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), which is incorporated herein by reference.
  • the present invention provides cells infected by recombinant vectors or transcripts thereof comprising the mutated SPT15 gene described above and transformed cells by gene introduction.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the mutated SPT15 gene described above or a transformant transformed with the mutated SPT15 protein described above.
  • the recombinant vector of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 to 8 or a complementary nucleotide sequence thereof.
  • Vectors of the invention can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression.
  • the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic and eukaryotic cells as hosts.
  • prokaryotic cells include bacterial cells and archaea
  • eukaryotic cells include yeast cells, mammalian cells, plant cells, tortilla cells, stem cells, and gourds, most specifically yeast cells.
  • the recombinant vector of the present invention comprises (i) a nucleotide sequence encoding the above-described expression target of the present invention; And (ii) a promoter operably linked to the nucleotide sequence of (i) and acting on an animal cell to form an RNA molecule, and more specifically, (i) the above-described SEQ ID NO: 6 to Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or a complementary nucleotide sequence thereof; (ii) a promoter operably linked to the nucleotide sequence of (i) and acting on animal cells to form RNA molecules; And (iii) a recombinant expression vector comprising a 3'-non-detoxification site that acts in an animal cell to cause 3'-end polyadenylation of the RNA molecule.
  • the above-described expression target material is a mutated SPT15 protein, More specifically, but not limited to mutated SPT15 protein consisting of SEQ ID NO: 5 to 8 sequences.
  • promoter refers to a DNA sequence that regulates the expression of a coding sequence or functional RNA.
  • the expression-coding nucleotide sequence is operably linked to the promoter.
  • operatively linked means a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter sequence, a signal sequence, or an array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence; Whereby the regulatory sequence modulates the transcription and / or translation of the other nucleic acid sequence.
  • a strong promoter capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lac UV5 promoter, lpp promoter, ⁇ promoter, ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter recA Promoters, SP6 promoters, trp promoters, T7 promoters, etc.
  • the host cell used in the present invention is E., most specifically ⁇ coli DH5a.
  • E. coli7 ⁇ is used as a host cell, the promoter and operator site of the E.
  • vectors that can be used in the present invention include plasmids (eg, pRS316, pSClOl, Col El, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.) and phages (e.g., ⁇ gt4. -Such as Charon, ⁇ ⁇ , and M13) or ⁇ virus (eg SV40, etc.) can be produced.
  • a promoter that can be used is capable of regulating transcription of the expression target material of the present invention, a promoter derived from a yeast cell, a mammal.
  • Promoters derived from animal viruses and promoters derived from genomes of mammalian cells such as yeast (S. cerevisiae) GAPDH (G 1 ycer a 1 dehyde 3—phosphate dehydrogenase) promoter, yeast (S.
  • the expression construct used in the present invention includes a polyaninated sequence (e.g., a calcined hormone hormone terminator and a SV40 derived poly adenylated sequence).
  • the method of transporting the vector of the present invention into a host cell may use various methods known in the art, for example, if the host cell is a prokaryotic cell, the CaC12 method (Cohen, et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)), one method (Cohen, et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J; Mol.Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like. , Electroporation, lipofection, microinjection, gene bombardment, yeast globular / cell fusion used in YAC, Agrobacterium-mediated transformation used in plant cells Or the like can be used.
  • Production of transformed yeast cells using the recombinant expression vector of the present invention can be carried out by gene transfer methods commonly known in the art. For example, electroporation, the lithium acetate / DMS0 method (Hill, et al., (1991), DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.Nucleic Acids Res. 19, 5791), liposome-mediated transfer methods ( Wong, et al., 1980), retrovirus—mediated transfer method (Chen, et al., (1990), J. Reprod. Fert.
  • the expression constructs used in the present invention comprise a poly adenylation sequence (eg, a glial growth hormone terminator and a SV40 derived poly adenylation sequence).
  • a poly adenylation sequence eg, a glial growth hormone terminator and a SV40 derived poly adenylation sequence.
  • the method of transporting the vector of the present invention into a host cell may use various methods known in the art, for example, if the host cell is a prokaryotic cell, the CaC12 method (Cohere et al., Proc. Natl. Acac. Sci). USA, 9: 2110-2114 (1973)), one method (Cohen, et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like. Cases, electroporation, lipofection, microinjection, gene bombardment, yeast globular / cell fusion used in YAC, Agrobacterium-mediated transformation used in plant cells, etc. It can be carried out using.
  • Production of transformed yeast cells using the recombinant expression vector of the present invention can be carried out by gene transfer methods commonly known in the art. For example, electroporation, lithium acetate / DMS0 method (Hill, et al., (1991), DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19, 5791), liposome-mediated transfer methods ( Wong, et al., 1980), retrovirus-mediated transfer methods (Chen et al., (1990), J. Reprod. Fert.
  • PTE protein transduction domain
  • the protein transport domain mainly contains basic amino acid residues such as lysine / arginine, and serves to infiltrate the cell membrane with the fused proteins.
  • the protein transport domain (PTD) is specifically expressed in HIV-1 Tat protein, homeodomain of drosophila antennaefedia, HSV VP22 transcriptional regulator protein, MTS peptide derived from vFGF, penetratin, transpotane or Pep-1 peptide. Including but not limited to sequences derived.
  • the above-mentioned transformation is Saccharomyces sp., Shijiro caromyces spp., Pichia spp., Papia spp., Kluyveromyces spp., Candida spp., Talamirose spp. It is carried out in the yeast strain of Mrs., Pachysolene or Debariomises species, more specifically in Saccharomyces sp. Or Cloviberomyces spp., And most specifically in Saccharomyces cerevisiae.
  • the invention provides an acetic acid-resistant yeast strain comprising introducing the above-described mutated SPT15 gene copy into a yeast strain and / or mutating the endogenous SPT15 gene of the genome DNA of yeast cells. Provide a method.
  • the method of the present invention is directed to the mutated SPT15 gene of the present invention as described above.
  • the yeast strain of the present invention can be used for the large-scale identification of acetic acid resistance and / or sensitive yeast genes. More specifically, the identification comprises the steps of (i) performing transcriptome profiling from the transformed yeast strain of the invention and untransformed normal yeast; And (ii) comparing / analyzing the transcript profiles to identify large amounts of acetic acid resistant and / or sensitive yeast genes.
  • a comparison / analysis of transcript profiles is judged to be a gene that up-regulates acetic acid resistance when a signal of localization in the transformed yeast strain is detected at a fold increase of at least 1.5-fold than the normal yeast. If the signal is detected by a fold decrease of 1.5 times or more, it can be determined as a gene for down-regulating acetic acid resistance.
  • the present invention relates to an acetic acid-resistant transformed yeast strain comprising a mutated ScSPT15 gene.
  • Yeast strains of the invention are yeast strains that can grow in high concentration acetic acid, specifically 0.5-0.9% acetic acid.
  • 1 is a spot assay result showing increased acetic acid resistance.
  • Cells were incubated at 0D 600 of 1.0 in YPD liquid medium and 10-fold consecutively
  • FIG. 2 is a diagram showing the location of mutated SPT15 alleles. Plasmids were recovered and sequenced. Through comparison of the predicted amino acid sequence with SPT15wt, the position and sequence where the point mutation occurred are indicated by arrows and amino acids. Maps of structural domains are based on previously published literature (Alper, et al., 2006).
  • PSPT15-342 was transformed into BY4741 to obtain MRRC 3252 and MRRC 3253 strains, respectively, and then assayed for acetic acid sensitivity with the control strain MRRC 3247.
  • Cells were incubated at 0D 600 of 1.0 in YPD liquid medium. After treatment with 0.5% or 0.9% acetic acid (pH 4.5) for the indicated time, cell aliquots were obtained and appropriately distilled to grow on solid YPD plates. After counting the number of colonies, viability was expressed as a percentage relative to the value of 0 hours. All experiments were conducted in triplicates independent of each other. Symbol symbo 1: MRRC 3247, triangle; MRRC 3252, Won; And MRRC 3253, square.
  • 4 is a result showing the R0S accumulation. 4A shows the results of measuring intracellular R0S levels. MRRC 3247 (triangle), MRRC 3252 (circle) and MRRC
  • Exponential growth phase cultures of 3253 (square) strain were treated with Qf or 0.9% acetic acid (pH 4.5) at 30 ° C. for 24 hours. Samples are taken at the indicated time and the same number of live cells are stained with a R0S indicator dye (CM-H 2 DCFDA). Relative DCF fluorescence intensities are measured using NIH Image J, version 1.61 and expressed in AlKarbitrary units. The average of three independent values is presented. 4B shows the representative images obtained at 10 hours. 4C is a result representing an average value of fluorescence intensities expressed relative to the value of MRRC 3247 at 10 hours. The experiments were conducted in triplicates independent of each other.
  • yeast cells were cultured in YPD (1% yeast extract, 2Ph peptone and 2% glucose; and 1.5% agar when using solid plates) for non-selective proliferation and yeast for selective proliferation
  • YPD 1% yeast extract, 2Ph peptone and 2% glucose
  • agar when using solid plates
  • yeast for selective proliferation
  • Cells were cultured in YSCD (YSCD) medium [0.67% yeast nitrogen base without amino acid, amino acid supplement mixture, 2% textose; And 1.5% agar added when using a solid plate.
  • Acetic acid-containing medium was adjusted to 4.5.
  • Plasmid preparation, cloning and sequencing were performed as previously described (Sambrook J and Russell D, 2001).
  • the strain ⁇ H Esichia coli
  • DH5a was used as a host for plasmid preparation.
  • Intracellular R0S was CM-H 2 DCFDA (5,6-chlon) methyl-2 '7'-dichlorodihydrof luorescein diacetate; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) was used to measure according to the method described previously (Madeo, et al. 1999). Aliquots of yeast cells were obtained at various time points over a 24-hour incubation period. The cells were washed with 1 ml of distilled water and then incubated for 30 minutes with 10 ⁇ CM-H2DCFDA dissolved in 0.1 ml hosphate buffered saline (PBS). After washing with PBS, cells were visualized using a fluorescence microscope.
  • PBS 0.1 ml hosphate buffered saline
  • SPT15-M311, -AA313, -AA342 and -AA343 plasmids were recovered from MRRC 3248-3251, respectively. Sequencing results for each SPT15 allele showed that SPT15-AA3U is mutated to SPT15 0RF: H179Y, SPT15-AA313 is SPT15 0RF: K97R and A176V, and SPT15-AA342 is SPT15 0RF: R90C and F148S, and SPT15-AA343 SPT15 0RF: K120R The sequence was included (FIG. 2). Common mutations at certain positions have not been identified.
  • FIGS. 1-3 demonstrate that the presence of SPT15-AA311 or SPT15-342 ex is the only element responsible for increased resistance to acetic acid. Effect of accumulation of R0S in mutated SPT15 ex cells
  • R0S accumulated up to about 130 AU at a rate of 13 AUCarbitrary units / h for the first 10 hours, and then continued to decrease to 80 AU by 24 hours.
  • the R0S accumulation rate of the two acetic acid-resistant strains was about 4 AU / h for the first 10 hours and decreased to 20-30 AU by 24 hours.
  • Representative images of accumulated ROs were obtained at 10 hours (FIG. 4B) and their relative fluorescence intensities are shown in FIG. 4C.
  • Metabolic pathway engineering based on metabolomics confers acetic and formic acid tolerance to a recombinant xylose fermenting strain of Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact 10 , 2.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 돌연변이(mutation)된 ScSPT15 유전자를 포함하는 아세트산-저항성 형질변형 스트레인을 제공한다. 본 발명의 효모 스트레인은 고농도 아세트산, 구체적으로는 0.5-0.9% 아세트산에서 성장할 수 있는 효모 스트레인이다. 고농도의 아세트산에 내성을 보이는 스트레인을 발명함으로써 바이오에탄올 생산공정 시 발생하는 여러 스트레스에 저항성을 가진 소망하는 산물들(바이오매스)의 산업적 생산에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
아세트산-저항성 효모 스트레인 【기술분야】
본 특허출원은 2012년 11월 26일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 게 10-2012-0134805호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 아세트산-저항성 효모 스트레인 및 이를 이용한 아세트산 저항성 관련 효모 유전자의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
아세트산 (Acetic acid)은 가장 간단한 천연의 (natural ly occurring) 카르복실산들 중 하나이다. 아세트산은 중요한 산업 화합물일 뿐 아니라 많은 미생물의 성장을 억제 또는 예방하기 위한 식품 방부제로서 가장 널리 이용되고 있다. 이러한 아세트산의 특성은 종종 사카로마이세스 세레비지애 (5ac a/ 7 es cerew's/ae)에 의한 알코을 발효의 정상적인 최종 산물로서의 문제를 야기한다. 성장 배지 내 아세트산의 독성 레벨로의 축적은 에탄올 수율을 감소시켜 발효를 정체시킬 수 있다 (Gibson, et al., 2007). 또한， 아세트산은 바이오에탄을 생산에 이용되는 목질 섬유계 기질들 (lignocellulosic substrates)의 전처리로부터 초래되는 주요 억제 화합불들 충 하나이다 (Almeida, et al. , 2007).. 아세트산의 독성 효과들은 세포내 ρΗ의 감소, 성장 억제 및 아팝토시스성 세포 사멸을 포함한다 (Gibson, et al. , 2007； Ludovico, et al., 2001). 따라서， 아세트산에 의해 야기되는 스트레스에 견딜 수 있는 사카로마이세스 세레비지애 스트레인들의 개발은 에탄올 발효 분야에서 매우 중요하다.
최근까지 아세트산에 대해 증가된 저항성을 가지는 사카로마이세스 세레비지애 스트레인들을 개발하고자 하는 몇몇 시도들이 있었다. ¾이 파괴 (Zhang, et al., 2011)되거나 또는 Haal 과다발현 (Tanaka, et al., 2012)된 스트레인들은 0.6-0.7% 아세트산의 존재 하에서 개선된 세포 성장을 나타냈다. 에탄을 발효와 아세트산 저항성의 관련성에 있어서， 게놈 셔플링 (genome shuffling)에 의해 구축된 스트레인이 0.5% 아세트산의 존재 하에서 증가된 에탄올 생산을 나타냈다 (Zheng, et al . , 2011). 본 연구에서 아세트산 저항성 스트레인을 개발하기 위해, 본 발명자들은 gTME (global transcriptional machinery engineering^ 불리는 택일적 접근방법을 이용하였다.
gTME는 이전에 치명적인 에탄을 농도에서 자랄 수 있는 것으로 보고된 SPT15 유전자에 의해 인코딩되는 TBPCTATA-binding protein)의 돌연변이를 유발함으로써 증가된 에탄을 저항성을 가지는 스트레인을 창출하는 데 처음으로 이용되었다 (Alper, et al., 2006). 비록 gTME를 통해 획득된 에탄올 저항성에 대한 논란의 여지가 존재할 지라도 (Baerends, et al., 2009)， 본 발명자들은 동일한 접근방법을 이용하여 증가된 에탄올 저항성을 가지는 스트레인들을 성공적으로 얻었다 (Yang, et al . , 2011). 유사하게도, 본 연구에서 본. 발명자들은 SPT15 돌연변이 대립형질을 과다발현시키는 라이브러리를 스크리닝함으로써， 2개의 아세트산-저항성 스트레인들을 얻었다. 그 결과， 아세트산에 노출된 상기 스트레인들은 세포내 ROSCreactive oxygen species) 레벨의 현저한 감소를 보였다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 아세트산 저항성을 보유한 산업적으로 유용한 효모 스트레인을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 PCR-매개된 임의적 돌연변이유발법 (random mutagenesis)을 이용하여 돌연변이된 SPT15 유전자를 제작하고 이를 효모에 형질전환시켜 아세트산-저항성 형질변형 효모 스트레인을 분리하였으며， 이들이 고농도 아세트산 (예컨대, 0.5% 또는 0.9%)에서 성장할 수 있다는 것을 확인함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서， 본 발명의 목적은 아세트산-저항성 효모 스트레인을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 아세트산-저항성 효모 스트레인 제조방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다 .
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면，
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 돌연변이 (mutation)된 ScSPT15 유전자를 포함하는 아세트산-저항성 형질변형 스트레인을 제공한다. 본 발명자들은 아세트산 저항성을 보유한 산업적으로 유용한 효모 스트레인을 개발하： α자 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들은 PCR-매개된 임의적 돌연변이유발법을 이용하여 돌연변이된 SPT15 유전자를 제작하고 이를 효모에 형질전환시켜 아세트산-저항성 형질변형 효모 스트레인을 분리하였으며， 이들이 고농도 아세트산 (예컨대， 0.5% 또는 0.9%)에서 성장할 수 있다는 것을 확인하였다.
아세트산은 하기의 화학식 I으로 표시되는 유기 화합물 (C¾C00H)로, 식초의 주요 구성성분으로 독특한 신맛과 특 쏘는 냄새를 가진다:
Figure imgf000004_0001
아세트산은 바이오에탄올 생산 과정에 있어서 발효를 억제시키는 화합물로， 이에 의해 야기되는 여러 스트레스에 의해 효모의 성장 및 생존에 해로운 영향을 미친다. 따라서， 효모를 이용한 에탄올 생산에 있어서 아세트산에 대한 저항성을 가지는 스트레인을 개발하는 것이 매우 중요하다. 본 발명은 돌연변이된 ScSPT15로 형질전환된 효모에서 아세트산- 저항성이 증가€ 형질변형 효모 스트레인을 제공한다.
본 발명에 따르면， 돌연변이된 ScSPT15로 형질전환된 효모 스트레인을 고농도 아세트산에서 배양하여 성장이 가능한 스트레인을 분리 /동정한다. 본 발명에서는 다양한 농도의 아세트산 (구체적으로는 0- 0.%)에서 효모 스트레인의 성장 어세이 (spot assay)를 실시하여 아세트산- 저항성 스트레인들을 선택하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상술한 돌연변이된 ScSPT15 유전자로 형질전환된 효모 스트레인은 고농도 아세트산, 보다 구체적으로는 0-5% 아세트산， 보다 더 구체적으로는 0.3-1.5% 아세트산， 보다 더욱 더 구체적으로는 0.4-1.2% 아세트산， 그리고 가장 구체적으로는 0.5-0.9% 아세트산에서 성장할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 효모 스트레인은 세포내 R0S 레벨을 감소시킬 수 있는 개선된 능력을 가진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상술한 효모 스트레인은 사카로마이세스 종 Saccharomyces spp.), 시조사카로마이세스 ( Schi zosaccharomyces spp . ) , 피키 ό} ^{Pichia spp . ) , 파피 ό\ ^iPaff/a spp.), 클루이베로미세스 ^UUuyveromyces spp.)， 칸디다 종 {Candida spp.), 탈라로미세스 종 Talaromyces spp.), 브레타노미세스 ( Brettanomyces spp.), 파기솔렌 ^-(Pac ysolen spp. ) 또는 데바리오미세스 종 )ebaryomyces spp.) 효모 스트레인이며， 보다 구체적으로는 사카로마이세스 종이고, 가장 구체적으로는 사카로마이세스 u] τ 0] ( Sch i zosaccharomyces cerevisiae) °] .
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상술한 돌연변이된 ScSPT15 유전자는 플라스미드로 효모 세포에 도입될 수 있다. 또한， 본 발명의 일 구현예에 따르면， 상술한 돌연변이된 ScSPT15 유전자는 효모 세포의 지놈 (genomic) DNA에 도입될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이된 ScSPT15 유전자는서열목록 제 1서열 내지 게 4서열에 개시되어 있다.
또한, 본 발명은 상술한 돌연변이된 ScSPT15 유전자를 포함하는 재조합 백터 또는 그의 전사체에 의해 감염된 세포 및 유전자 도입에 의한 형질전환된 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 상술한 돌연변이된
ScSPT15 유전자를 포함하는 재조합 백터 또는 상술한 돌연변이된 ScSPT15 단백질에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다
본 발명의 백터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며， 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명은 상술한 돌연변이된 SPT15 유전자를 포함하는 재조합 백터 또는 그의 전사체에 의해 감염된 세포 및 유전자 도입에 의한 형질전환된 세포를 제공한다. 또한， 본 발명은 상술한 돌연변이된 SPT15 유전자를 포함하는 재조합 백터 또는 상술한 돌연변이된 SPT15 단백질에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 재조합 백터는 서열목록 제 5서열 내지 제 8서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 백터는 전형적으로 클로닝을 위한 백터 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다. 또한， 본 발명의 백터는 원핵세포 및 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어， 원핵세포는 박테리아 세포 및 고세균을 포함하며, 진핵세포는 효모세포, 포유동물세포, 식물세포, 곤층세포， 줄기세포 및 곰광이를 포함하고, 가장 구체적으로는 효모세포이다.
구체적으로는， 본 발명의 재조합 백터는 ( i ) 상술한 본 발명의 발현대상물질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (ii) 상기 ( i )의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 동물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함하며, 보다 구체적으로는 ( i ) 상술한 본 발명의 서열목록 제 6서열 내지 제 10서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴 레오타이드 서열; (ii) 상기 ( i )의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 동물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (iii) 동물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 재조합 발현백터를 포함한다.
구체적으로는， 상술한 발현대상물질은 돌연변이된 SPT15 단백질， 보다 구체적으로는 서열목록 제 5서열 내지 게 8서열로 이루어진 돌연변이된 SPT15 단백질을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "프로모터" 는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 제조합 발현백터에서 발현대상물질 -코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된 (operatively linked)" 은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터 서열， 시그널 서열， 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며， 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및 /또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명의 백터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대， tac 프로모터, lac 프로모터, lac UV5 프로모터， lpp 프로모터， ρίλ 프로모터, ρΐϊλ 프로모터， rac5 프로모터, amp 프로모터 recA 프로모터， SP6 프로머터， trp 프로모터， T7 프로모터, 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 보다 더 구체적으로는 , 본 발명에서 이용되는 숙주 세포는 E. 이며， 가장 구체적으로는^ coli DH5a이다. 또한， 숙주 세포로서 E. coli7\ 이용되는 경우， E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C. , J. Bacterid. , 158： 1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (ρίλ 프로모터， Herskowitz, I. and Hagen , D. , Ann. Rev. Genet., 14: 399- 445(1980))가조절부위로서이용될수있다. 한편 본발명에이용될수있는백터는당업계에서종종사용되는플라스미드 (예： pRS316 , pSClOl, Col El, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등)， 파지 (예: \gt4. λΒ, λ -Charon, λ Δζΐ 및 M13 등) 또^바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 백터가 진핵세포， 구체적으로는 효모 세포에 적용되는 경우， 이용될 수 있는 프로모터는, 본 발명의 발현대상물질의 전사를 조절할 수 있는 것으로서， 효모 세포에서 유래된 프로모터, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대， 효모 (S. cerevisiae) GAPDH ( G 1 ycer a 1 dehyde 3— phosphate dehydrogenase) 프로모터, 효모 (S. cerevisiae) GALl 내지 GAL10 프로모터， 효모 (Pichia pastoris) AOXl 또는 A0X2 프로모터， CMV cyt omega lo virus) 프로모터， 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터， SV40 프로모터， HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터 , EF1 알파 프로모터， 메탈로티오닌 프로모터， 베타 -액틴 프로모터， 인간 IL-2 유전자의 프로모터， 인간 IFN 유전자의 프로모터， 인간 IL-4 유전자의 프로모터， 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는， 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다 (예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).
본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있으며， 예를 들어 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaC12 방법 (Cohen, et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, et al. , Proc. Natl. Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)； 및 Hanahan, D. , J. Mol. Biol. , 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, et al. , Nucleic. Acids Res. , 16:6127- 6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으며， 진핵세포인 경우， 전기천공법 (electroporation), 리포펙션 (lipofection)， 마이크로인젝션， 유전자총 (particle bombardment), YAC에서 이용되는 효모 구형질체 /세포 융합, 식물세포에서 이용되는 아그로박테리움-매개된 형질전환 등을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현백터를 이용하여 형질전환된 효모 세포의 제조는 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전이방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어， 전기천공법 (electroporation), 리륨 아세테이트 /DMS0 방법 (Hill, et al., (1991)， DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19， 5791), 리포좀 -매개 전이방법 (Wong, et al. , 1980), 레트로바이러스—매개 전이방법 (Chen, et al., (1990)， J. Reprod. Fert. 41:173-182; opchick, et al . , (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos . In Transgenic Animals, ed. N.L. First & F.P. Haseltine, pp.275—293, GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 프로모터, 효모 (S. cerevisiae) GALl 내지 GAL10 프로모터, 효모 (Pichia pastoris) AOXl 또는 A0X2 프로모터, CMV cyt omega lo virus) 프로모터， 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터， SV40 프로모터， HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타 -액틴 프로모터， 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포특신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다 (예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).
본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaC12 방법 (Cohere et al . , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, et al. , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)； 및 Hanahan, D. , J. Mol . Biol. , 166 :557-580 (1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, et al. , Nucleic. Acids Res. , 16:6127- 6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으며, 진핵세포인 경우， 전기천공법 (electroporation), 리포펙션 (lipofection) , 마이크로인젝션， 유전자총 (particle bombardment ) , YAC에서 이용되는 효모 구형질체 /세포 융합， 식물세포에서 이용되는 아그로박테리움-매개된 형질전환 등을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현백터를 이용하여 형질전환된 효모 세포의 제조는 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전이방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어， 전기천공법 (electroporation), 리튬 아세테이트 /DMS0 방법 (Hill, et al . , (1991), DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19， 5791), 리포좀 -매개 전이방법 (Wong, et al., 1980), 레트로바이러스 -매개 전이방법 (Chenᅳ et al. , (1990), J. Reprod. Fert. 41:173-182; Kopchick, et al., (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos . In Transgenic Animals , ed. N.L. First & F.P. Haseltine, pp.275-293,
7 Boston; Butterworth-Heinemann; Lee, M.-R. and Shuman , R. (1990) Proc. 4th World Congr . Genet . Ap l. Livestock Prod. 16， 107-110) 등을 ᅳ이용하여 실시하며， 가장 구체적으로는 리튬 아세테이트 /DMS0 방법을 이용하여 실시한다.
한편， 본 발명의 발현대상물질 단백질을 유효성분으로써 유전자 도입에 이용하기 위해 발현대상물질 단백질이 효과적으로 세포 내로 침투할 수 있어야 한다. 예를 들어, 상술한 돌연변이된 ScSPT15 단백질을 유효성분으로 이용하는 경우， 단백질 운반' 도메인 (PTD: protein transduction domain)을 돌연변이된 ScSPT15 단백질에 부착시키는 것이 바람직하다. 즉， 유효성분으로서 본 발명의 돌연변이된 ScSPT15 단백질을 세포 내로 도입 (permeable peptide transduct ion)하기 위하여 단백질 운반 도메인 (PTE): protein transduction domain)을 상기 단백질과 융합하여 융합 단백질을 만든다. 상기 단백질 운반 도메인 (PTD)은 라이신 /아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포 내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 단백질 운반 도메인 (PTD)은 구체적으로는 HIV-1 Tat 단백질， 드로소필라 안테나페디아의 homeodomain, HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드ᅳ 페네트라틴, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상술한 형질전환은 사카로마이세스 종, 시조사카로마이세스 종， 피키아 종, 파피아 종， 클루이베로미세스 종， 칸디다 종， 탈라로미세스 종, 브레타노미세스 종， 파키솔렌 종 또는 데바리오미세스 종 효모 스트레인에서 실시하며， 보다 구체적으로는 사카로마이세스 종 또는 클루이베로미세스 종에서 실시하고， 가장 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지애에서 실시한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 돌연변이된 SPT15 유전자 카피를 효모 스트레인에 도입하는 단계 및 /또는 효모 세포의 지놈 DNA의 내인성 SPT15 유전자를 돌연변이시키는 단계를 포함하는 아세트산- 저항성 효모 스트레인 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 돌연변이된 SPT15 유전자의
8 돌연변이 과정을 공통적으로 포함하기 때문에, 둘 사이에 중복된 내용은 중복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다. 한편， 본 발명의 효모 스트레인은 아세트산 저항성 및 /또는 민감성 효모 유전자의 대규모 동정에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 동정은 ( i ) 본 발명의 형질전환된 효모 스트레인 및 형질전환되지 않은 정상 효모로부터 전사체 프로파일 (transcriptome profiling)을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 전사체 프로파일을 비교 /분석하는 단계를 실시함으로써, 아세트산 저항성 및 /또는 민감성 효모 유전자를 대량으로 동정할 수 있다. 예를 들어, 전사체 프로파일의 비교 /분석은 상기 정상 효모보다 상기 형질전환된 효모 스트레인에서 흔성화 시그널이 1.5배 이상의 증가 배수 (fold increase)로 검출되면 아세트산 저항성을 상향-조절하는 유전자로 판단되고, 상기 시그널이 1.5배 이상의 감소 배수 (fold decrease)로 검출되면 아세트산 저항성을 하향-조절하는 유전자로 판단될 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 돌연변이 (mutation)된 ScSPT15 유전자를 포함하는 아세트산-저항성 형질변형 효모 스트레인에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 효모 스트레인은 고농도 아세트산， 구체적으로는 0.5- 0.9%아세트산에서 성장할 수 있는 효모 스트레인이다.
(c) 고농도의 아세트산에 내성을 보이는 스트레인을 발명함으로써 바이오에탄올 생산공정 시 발생하는 여러 스트레스에 저항성을 가진 소망하는 산물들 (바이오매스)의 산업적 생산에 매우 유용하게 적용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 증가된 아세트산 저항성을 보여주는 스팟 어세이 결과이다. 세포는 YPD 액체 배지에서 1.0의 0D600까지 배양시키고 10배씩 연속적으로
9 회석하였다. 상기 세포의 분취액 (5 μΐ)이 적정 농도의 아세트산 (ρΗ 4.5)을 포함하는 YPD 플레이트에 스팟팅되어 30°C에서 20시간 또는 60시간 동안 배양하였다. 대조군 스트레인 (MRRC 3247)은 pSPT15wt를 BY4741 스트레인에 형질전화시켜 구축하였다.
도 2는 돌연변이된 SPT15 대립형질의 위치를 도식적으로 보여주는 도면이다. 플라스미드들이 회수되어 시퀀싱되었다. 예측된 아미노산 서열과 SPT15wt의 비교를 통해， 점 돌연변이가 발생한 위치 및 서열이 화살표 및 아미노산으로 표시된다. 구조적 도메인들의 맵은 이전에 공개된 문헌에 기초한다 (Alper, et al., 2006).
도 3은 아세트산 민감성을 보여주는 결과이다. PSPT15-M311 및
PSPT15-342를 BY4741에 형질전환시켜 각각 MRRC 3252 및 MRRC 3253 스트레인을 얻은 후， 대조군 스트레인 MRRC 3247과 함께 아세트산 민감성에 대해 어세이하였다. 세포는 YPD 액체 배지에서 1.0의 0D600까지 배양시켰다. 지정된 시간 동안 0.5% 또는 0.9% 아세트산 (pH 4.5)를 처리한 후 세포 분취액을 얻어 적절하게 회석시켜 고형 YPD 플레이트에서 성장시켰다. 콜로니의 수를 카운팅한 후, 생존율 (viability)은 0시간의 값에 대한 상대적인 백분율로서 표현되었다. 모든 실험은 서로 독립적인 3쌍 (triplicate)으로 실시하였다. 심볼 ( symbo 1 )： MRRC 3247, 삼각형; MRRC 3252, 원 ; 및 MRRC 3253, 사각형 .
도 4는 R0S 축적을 보여주는 결과이다. 도 4a는 세포내 R0S 레벨을 측정한 결과이다. MRRC 3247(삼각형)， MRRC 3252(원) 및 MRRC
3253(사각형) 스트레인의 지수 성장기 배양액에 Qf 또는 0.9% 아세트산 (pH 4.5)을 30°C에서 24시간 동안 처리하였다. 시료들은 지정된 시간에 취하고 동일한 수의 살아있는 세포가 R0S 지시 다이 (indicator dye; CM- H2DCFDA)로 염색되 ¾다. 상대적인 DCF 형광 강도는 NIH Image J , version 1.61를 이용하여 측정하고 AlKarbitrary units)으로 표현된다. 세 개의 서로 독립적인 값의 평균이 제시되었다. 도 4b는 10시간째에 얻은 대표적인 이미지들을 보여주는 결과이다. 도 4c는 10시간째의 MRRC 3247의 값에 대해 상대적으로 표현된 형광 강도의 평균값을 의미하는 결과이다. 실험들은 서로 독립적인 3쌍 (triplicate)으로 실시되었다.
10 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 .구체적으로 설명하기 위한 ,것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식올 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험재료 및 실험방법
효모 스트레인 및 배지
S. 세레비지애 BY474l «rfl his3A 1 Ieu2/ ) inetl5AO ura3A0)를: 발현 숙주 (transformation recipients)로 이용하였다. 특별히 언급되지 않는 한， 비-선택적 증식을 위해 효모 세포는 YPD(1% 효모 추출물， 2Ph 펩톤 및 2% 글루코오스; 및 고형 플레이트를 이용하는 경우, 1.5% 아가 첨가)에서 배양하였으며， 선택적 증식을 위해 효모세포는 YSCD(YSCD) 배지 [아미노산을 포함하지 않는 0.67% 효모 나이트로젠 베이스 (yeast nitrogen base) , 아미노산 보층 흔합물 (amino acid supplement mixture) , 2% 텍스트로오스; 및 고형 플레이트를 이용하는 경우， 1.5% 아가 첨가]에서 배양하였다. 아세트산 -포함 배지는 4.5로 맞추었다. 효모 형질전환
효모 형질전환을 위한 모든 플라스미드들은 RNA 절단 없이 수작업으로 제조되었다. DNA 농도는 알려진 농도의 대조군 DNA의 밴드 강도와 비교함으로써 대략적으로 측정하였다. DNAs 및 RNAs의 흔합물이 이전에 기재된 바와 같이 효모 형질전환에 이용하였다 (Gietz and Woods, 2002). 분자생물학적 방법
플라스미드 제조， 클로닝 및 시퀀싱은 이전에 기술된 것과 동일하게 실시하였다 (Sambrook J and Russell D, 2001). ^^균 {Escherichia coli) 스트레인인 DH5a는 플라스미드 제조를 위한 숙주로 이용하였다.
11 스팟 어세이
스팟 어세이를 위해, YSCD-Ura 배지에서 1.0의 광학밀도 (0D600)까지 성장한 세포의 분취액 (5 )이 10배씩 연속적으로 회석되어 적정 농도의 아세트산을 포함하는 고형 YPD 플레이트에 스팟팅 되었다. 상기 플레이트들이 2으60시간 동안 30°C에서 배양되었다. 민감성 어세이 (susceptibility assay)
0D600 값 1로 배양된 세포를 수득하여 적정 농도의 아세트산을 포함하는 신선한 YSCD-Ura 배지에 동일하게 분주하고 30°C에서 배양시켰다. 적절한 시간에, 분취액올 회석하여 고형 YSCD-Ura 플레이트에 풀레이팅 하였다. 세포 생존율을 시간에 따라 측정하고 상대적인 CFUCcolony forming units) 수로 표현하였다. 세포내 R0S의 측정
세포내 R0S는 CM-H2DCFDA(5,6-chlon)methyl-2' 7' - dichlorodihydrof luorescein diacetate; Molecular Probes, Eugene , OR, USA)를 이용하여 종래에 기재된 방법 (Madeo, et al. 1999)에 따라 측정하였다. 효모 세포의 분취액은 24시간의 배양 기간 동안 다양한 시간점에서 얻었다. 상기 세포들은 1 ml의 증류수로 세척한 후, 0.1 ml PBS( hosphate buffered saline)에 녹여진 10 μΜ CM-H2DCFDA와 30분 동안 배양시켰다. PBS로 세척한 후 세포들은 형광현미경을 이용하여 시각화되었다. 최종적으로， 100개 이상 세포들의 형광 강도는 NIH Image J , version 1.61(ht tp ://r sbweb. nih. gov/ ij /download, html )·§- 이용하여 측정하여 평균값을 얻었다. 실험결과
아세트산-저항성 스트레인들의 동정
본 발명자들의 이전 연구 (Yang, et al., 2011)에서 구축된 효모 SPT15 돌연변이 라이브러리에 대한 스크리닝을 통해 아세트산-저항성 스트레인들을 얻기 위해， 본 발명자들은 상기 라이브러리로부터 제조된 플라스미드들을 BY4741로 형질전환시켰다. 500만개의 CFU들이 0.7%
12 아세트산이 보층된 고형 YSCD— Ura 배지에 뿌려져 30°C에서 배양되었다. 본 발명자들은 수일 후 성장된 수십 개의 콜로니들로부터 가장 큰 콜로니 크기를 나타내는 4개의 스트레인들 (MRRC 3248-3251)을 선택하여 0, 0.5% 및 0.9% 아세트산을 포함하는 고형 YPD 배지를 이용한 아세트산 저항성에 대한 스팟 어세이에 이용하였다. 상기 4개의 콜로니들은 야생형 SPT15(SPT15wt) 유전자가 라이브러리 구축에 이용된 백터 (pRS316-GCYH2gR)에 클로닝된 대조군 플라스미드를 가지고 있는 대조군 스트레인인 MRRC3247보다 훨씬 더 좋은 성장능을 나타냈다 (도 1).
증가된 아세트산 저항성이 돌연변이된 SPT15의 존재에 의해 부여되는 지 여부를 확인하기 위해， MRRC 3248-3251들로부터 각각 pSPT15-M311, - AA313, -AA342 및 -AA343 플라스미드들이 회수되었다. 각 SPT15 대립형질에 대한 시퀀싱 결과, SPT15-AA3U는 SPT15 0RF:H179Y, SPT15-AA313는 SPT15 0RF:K97R 및 A176V, SPT15-AA342는 SPT15 0RF:R90C 및 F148S, 그리고 SPT15-AA343 SPT15 0RF:K120R에 돌연변이 서열을 포함하였다 (도 2). 특정 위치에서의 공통 돌연변이는 확인되지 않았다. 5/^7 5-^^^에서 보여지는 K의 R로의 대체가 어떻게 증가된 저항성을 부여하는 지는 불명확하다. 다른 2개의 클론들보다 더 우수한 저항성을 나타낸 2개의 클론들 (MRRC 3248 및 MRRC 3250)이 이후 실험을 위해 선택되었다. 본 발명자들은 pSPT15-AA311 및 pSPT15-AA342를 BY4741에 형질전환시켜 각각 MRRC 3252 및 MRRC 3253 스트레인을 얻었다. 대조군 스트레인인 MRRC 3247과 함께 스팟 어세이를 실시한 경우， MRRC 3252 및 MRRC 3253 스트레인은 MRRC 3248 및 MRRC 3250 스트레인에서 보여지는 아세트산 저항성과 동일한 정도의 저항성을 나타냈다 (결과를 보이지 않음). 따라서, MRRC 3252 및 MRRC 3253 스트레인의 증가된 아세트산 저항성은 돌연변이된 SPT15의 효과일 것으로 예측되었다.
상기 스팟 어세이 결과들은 민감성 어세이를 통해 추가적으로 확인되었다. MRRC 3247, MRRC 3252 및 MRRC 3253 스트레인 (1 x 107 세포)을 각각 0, 0.5% 및 0.9% 아세트산을 포함하는 YPD 배지에서 80 rpm의 교반 속도로 배양하면서 24시간까지 매시간 분취액을 취하여 고형 YPD 플레이트에 스프레딩 하였다. 이후， 생존 세포의 수를 나타내는 콜로니의 수를 카운팅하였다. 예상한 대로, MRRC 3252 및 MRRC 3253 스트레인들이
13 대조군 MRRC 3247 스트레인보다 더욱 높은 생존율을 나타냈다 (도 3). 상술한 도 1 내지 도 3의 결과들은 SPT15-AA311또는 SPT15- 342엑 존재가 아세트산에 대한 증가된 저항성을 담당하는 유일한 엘리먼트라는 것을 증명한다. 돌연변이된 SPT15엑 세포내 R0S의 축적 상의 효과
아세트산-저항성 사카로마이세스 세레비지애 스트레인들 증 일 개체군에서 세포내 R0S의 레벨이 대초군 스트레인과 비교하여 현저하게 감소하였다는 보고가 매우 최근에 있었다 (Zheng, et al . , 2011). 따라서 , 아세트산 저항성의 획득이 세포내 R0S 레벨의 감소시키는 능력과 밀접하게 연관되어 있고, 이를 통해 높은 레벨의 세포내 R0S에 의해 야기되는 다양한 손상들로부터 세포를 보호할 가능성이 매우 높다. 본 연구에서, 본 발명자들은 아세트산-저항성 스트레인들인 MRRC 3252 및 MRRC 3253이 세포내 R0S 레벨을 감소시킬 수 있는 개선된 능력을 가지는 지 여부를 조사하였다. 도 4a는 아세트산의 배지 첨가 (0.9%， pH 4.5) 후 24시간 동안 측정된 상대적인 R0S 축적의 프로파일을 보여준다. BY4741에 아세트산 처리한 후, R0S는 초기 10시간 동안 13 AUCarbitrary units)/h의 속도 (rate)로 약 130 AU까지 축적되었으며， 이후 24시간까지 80 AU로 지속적으로 감소하였다. 이와 대조적으로, 2개의 아세트산-저항성 스트레인들의 R0S 축적 비율은 초기 10시간 동안 약 4 AU/h였으며, 24시간까지 20-30 AU로 감소하였다. 축적된 R0S에 대한 대표적인 이미지들은 10시간째에 얻어졌으며 (도 4b)， 이들의 상대적인 형광 강도는 도 4c에 제시된다. 결과적으로, 아세트산-저항성 스트레인들에서 조사된 기간 동안 R0S의 축적 속도 및 농도는 대조군 스트레인들과 비교하여 현저하게 낮았는데, 이는 낮은 R0S 축적이 증가된 아세트산-저항성에 적어도 부분적으로 기여한다는 것을 의미한다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이몌 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
14 참고문헌
Gibson BR, Lawrence FM, Leclaire JPR, Powell CD & Smart KA (2007) Yeast responses to stresses associated with industrial brewery handling. FEMS Microbiol Rev 31： 535-569.
Almeida JRM, Tobias M, Anneli P, Barbel HH, Gunnar L & Marie FGG (2007) Increased tolerance and conversion of inhibitors in 1 ignocel lulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae. J Chem Techno 1 Biotechnol 82： 340-349.
Hong SP & Car Is이! M (2007) Regulation of Snf 1 protein kinase in response to environmental stress. J Biol Chem 282: 16838一 16845.
Tanaka , Ishii Y, Ogawa J & Shima J (2012) Over express ion of HAM gene encoding transcriptional activator enhances acetic acid tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol , vol . 78 no. 22: 8161-8163
Semchyshyn HM, Abrat 0B, Miedzobrodzki J, Inoue Y & Lushchak VI (2011) Acetate but not propionate induces oxidative stress in bakers' yeast Saccharomyces cerevisiae. Redox Rep 16: 1523.
Zheng D-Q, Wu X-C, Wang P-M, Chi X-Q, Tao X-L, Li P, Jiang X-H & Zhao Y-H (2011) Drug resistance marker- ided genome shuffling to improve acetic acid tolerance in Saccharomyces cerevisiae. J Ind Microbiol Biotechnol 38： 415-422.
Yang J, Bae JY, Lee YM, Kwon H, Moon H, Kang HA, Yee S, Kim W & Choi W (2011) Construct ion of strains with enhanced ethanol tolerance by mutagenesis of the TATA-binding protein gene and identification of novel genes associated with ethanol tolerance. Biotechnol Bioeng 108: 1776-1787.
Fujitomi K, Sanda T, Hasunuma T & Kondo A (2012) Deletion of the PH013 gene in Saccharomyces cerevisiae improves ethanol product ion from 1 ignocel lulosic hydrolysate in the presence of acetic and formic acids and furfural . Biosour Techno 1 111: 161-166.
Alper H, Moxley J, Nevoigt E, Fink GR & Stephanopoulos G (2006)
15 ITO O^ sreowccaocre c^vsw^ cmts to aOad crewhlmsriimirmlTsrel dtoclhfross in--- ,,, 30dooJ S ( Luoc Susavao Cote)vi P Mil MT Lea & CreRal M0021—
cees.oo Cerviiae Ml Billl38606.12592:-
2
2
l
Figure imgf000019_0001
1
response to acetic acid. Microbiology 147: 2409-2415.
Guaragnel la N, Antonacci L, Passarel la S, Marra E & Giannattasio S (2007) Hydrogen peroxide and superoxide anion production programmed cell death. Folia MicfobioT 52： 237-240.
Hasunuma T, Sanda T, Yamada R, Yoshimura K, Ishi i J & Itendo A (2011) Metabolic pathway engineering based on metabolomics confers acetic and formic acid tolerance to a recombinant xylose- ferment ing strain of Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact 10， 2.
Liu H, Yan M, Lai C, Xu L, Ouyang P (2010) gTME for improved xylose fermentat ion of Saccharomyces cerevisiae. Ap l Biochem Biotechnol . 160:574-582.
Liu H, Liu , Yan M, Xu L, Ouyang P (2011) gTME for improved adapt at ion of Saccharomyces cerevisiae to corn cob acid hydrolysate. Ap l Biochem Biotechnol . 164： 1150-1159.
17

Claims

【특허청구범위】
[청구항 1】
돌연변이 (mutation)된 ScSPT15 유전자를 포함하는 아세트산-저항성 형질변형 스트레인.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 효모 스트레인은 0-0.9%(v/v) 아세트산- 포함 배양 조건에서 성장할 수 있는 것을 특징으로 하는 효모 스트레인.
[청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 효모 스트레인은 0.5-0.9%(v/v) 아세트산- 포함 배양 초건에서 성장할 수 있는 것을 특징으로 하는 효모 스트레인.
【청구항 4】
제 1 항에 있어세 상기 효모 스트레인은 세포내 R0S 레벨을 감소시킬 수 있는 개선된 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 효모 스트레인.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서, 상기 효모 스트레인은 사카로마이세스 종 (Saccharomyces sp . ) , 시조入 ^|·로 σ]·01세스 종 (Schizosaccharomyces spp.), 피키아 종 (Pichia spp.), 파피아 종 (Paffia spp.), 클루이베로미세스 종 (Kluyveromyces spp.), 칸디다 종 (Candida spp.), 탈라로미세스 종 (Talaromyces spp.), 브레타노미세스 종 (Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종 (Pachysolen spp.) 또는 데바리오미세스 종 (Debaryomyces spp.) 효모 스트레인인 것을 흑징으로 하는 효모 스트레인.
【청구항 6】
제 5 항에 있어서， 상기 효모 스트레인은 사카로마이세스 종인 것을 특징으로 하는 효모 스트레인.
18
【청구항 7】
돌연변이된 (mutated) SPT15 유전자 카피를 효모 스트레인에 도입하는 단계 또는 효모 세포의 지놈 DNA의. 내인성 SPT15 유전자를 돌연변이시키는 단계를 포함하는 아세트산-저항성 효모 스트레인 제조방법.
【청구항 8】
제 7 항에 있어서, 상기 효모 스트레인은 0-0.9%(v/v) 아세트산- 포함 배양 조건에서 성장할 수 있는 것을 특징으로 하는 효모 스트레인 제조방법 .
【청구항 9】
제 8 항에 있어서， 상기 효모 스트레인은 0.5-0.9%(v/v) 아세트산- 포함 배양 조건에서 성장할 수 있는 것을 특징으로 하는 효모 스트레인 제조방법.
【청구항 10】
제 7 항에 있어서, 상기 효모 스트레인은 세포내 R0S 레벨을 감소시킬 수 있는 개선된 능력을 가지는 것을 특징으로 하는 효모 스트레인 제조방법.
【청구항 11】
제 7 항에 있어서， 상기 효모 스트레인은 사카로마이세스 ( Saccharomyces sp . ) ' 시조人 ^l "로口 1~이세스 ^{Schizosaccharomyces spp.), 피키아 ^iPichia spp.), 파피아 종 ¾///a spp.), 클루이베로미세스 종 Uduyveromyces spp.), 칸디다 종 Candida spp.), 탈라로미세스 종 Talaromyces spp.), 브레타노미세스 ^{Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종 iPachysolen spp.) 또는 데바리오미세스 종 U)ebaryomyces spp.) 효모 스트레인인 것을 특징으로 하는 효모 스트레인 제조방법.
19
PCT/KR2013/008224 2012-11-26 2013-09-11 아세트산-저항성 효모 스트레인 WO2014081113A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2012-0134805 2012-11-26
KR1020120134805A KR101605872B1 (ko) 2012-11-26 2012-11-26 아세트산-저항성 효모 스트레인

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014081113A1 true WO2014081113A1 (ko) 2014-05-30

Family

ID=50776257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/008224 WO2014081113A1 (ko) 2012-11-26 2013-09-11 아세트산-저항성 효모 스트레인

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101605872B1 (ko)
WO (1) WO2014081113A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6887149B2 (ja) * 2016-06-10 2021-06-16 国立大学法人北見工業大学 発酵阻害物質への耐性を有する新規ピキア属酵母

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120082138A (ko) * 2011-01-13 2012-07-23 고려대학교 산학협력단 바이오 에탄올 생산 향상용 ｔａｔａ 결합 단백질 ｓｐｔ3 와 15가 유전자 삽입된 형질전환체 및 그 균주를 이용한 에탄올 생성방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120082138A (ko) * 2011-01-13 2012-07-23 고려대학교 산학협력단 바이오 에탄올 생산 향상용 ｔａｔａ 결합 단백질 ｓｐｔ3 와 15가 유전자 삽입된 형질전환체 및 그 균주를 이용한 에탄올 생성방법

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALPER, HAL ET AL.: "Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production", SCIENCE, vol. 314, no. 5805, 2006, pages 1565 - 1568 *
KIM, NA-RAE ET AL.: "Mutations of the TATA-binding protein confer enhanced tolerance to hyperosmotic stress in Saccharomyces cerevisiae", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 97, 25 May 2013 (2013-05-25), pages 8227 - 8238 *
NEVOIGT, ELKE: "Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae", MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEW, vol. 72, no. 3, 2008, pages 379 - 412 *
YANG, JUNGWOO ET AL.: "Construction of Saccharomyces cerevisiae strains with enhanced ethanol tolerance by mutagenesis of the TATA-binding protein gene and identification of novel genes associated with ethanol tolerance", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 108, no. 8, 2011, pages 1776 - 1787 *
ZHENG, DAO-QIONG ET AL.: "Drug resistance marker-aided genome shuffling to improve acetic acid tolerance in Saccharomyces cerevisiae", JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 38, no. 3, 22 July 2010 (2010-07-22), pages 515 - 422 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140067502A (ko) 2014-06-05
KR101605872B1 (ko) 2016-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mira et al. Adaptive response and tolerance to weak acids in Saccharomyces cerevisiae: a genome-wide view
JP6831797B2 (ja) メチロトローフ酵母の遺伝子操作の発現構築物および方法
Tannous et al. Fungal attack and host defence pathways unveiled in near‐avirulent interactions of Penicillium expansum creA mutants on apples
Saloheimo et al. Activation mechanisms of the HACI‐mediated unfolded protein response in filamentous fungi
Lee et al. TUP1 disruption in Cryptococcus neoformans uncovers a peptide‐mediated density‐dependent growth phenomenon that mimics quorum sensing
Zhang et al. MoARG1, MoARG5, 6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae
KR20220004090A (ko) 헴-함유 단백질의 생산을 위한 균주 및 방법
US20150293076A1 (en) Cellular Reprogramming for Product Optimization
Ribas et al. The acetate uptake transporter family motif “NPAPLGL (M/S)” is essential for substrate uptake
Suda et al. Homologues and bioengineered derivatives of LtnJ vary in ability to form D-alanine in the lantibiotic lacticin 3147
Barhoom et al. Functional characterization of CgCTR2, a putative vacuole copper transporter that is involved in germination and pathogenicity in Colletotrichum gloeosporioides
Yokoyama et al. Homeobox transcription factor CoHox3 is essential for appressorium formation in the plant pathogenic fungus Colletotrichum orbiculare
Arentshorst et al. Identification of a conserved transcriptional activator-repressor module controlling the expression of genes involved in tannic acid degradation and gallic acid utilization in Aspergillus niger
US20100317115A1 (en) Methods, compositions and uses for enhancing chemical tolerance by microorganisms
WO2014081113A1 (ko) 아세트산-저항성 효모 스트레인
JPH10512447A (ja) ナンセンス媒介によるｍＲＮＡの崩壊機能非存在下における異種ポリペプチドの産生
Sellem et al. Regulation of aerobic energy metabolism in Podospora anserina by two paralogous genes encoding structurally different c-subunits of ATP synthase
CN110607312B (zh) 一种黄曲霉致病基因hsp90及其应用
Rodríguez et al. Phenotype testing, genome analysis, and metabolic interactions of three lactic acid bacteria strains existing as a consortium in a naturally fermented milk
US10961549B2 (en) Genes conferring tolerance to ethanol and high temperature for yeasts
CN115141787B (zh) 一种潜艇微生物传感器及其制备方法和应用
CN108676080B (zh) 出芽短梗霉碳响应转录因子Cat8及其重组表达载体和应用
Tang et al. The Gβ-like protein Bcgbl1 regulates development and pathogenicity of the gray mold Botrytis cinerea via modulating two MAP kinase signaling pathways
JP2018201508A (ja) グルタチオンストレス耐性酵母
KR20110118554A (ko) 에탄올―저항성 효모 균주 및 이의 유전자

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13857112

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13857112

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1