WO2014076341A1 - Microorganismo aislado de leche materna y de heces de un lactante, y su uso como probiótico - Google Patents

Microorganismo aislado de leche materna y de heces de un lactante, y su uso como probiótico Download PDF

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WO2014076341A1
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milk
cect
probiotic
dairy products
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Margarita MEDINA FERNÁNDEZ-REGATILLO
Eva RODRÍGUEZ MÍNGUEZ
Angela PEIROTÉN HERRERO
Juan Luis ARQUÉS OROBÓN
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Instituto Nacional De Investigación Y Tecnología Agraria Y Alimentaria (Inia)
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism of the species Bifidobacterium breve that has been isolated from breast milk and feces of an infant fed with said breast milk. It also refers to the use of said microorganism as a probiotic material and a composition comprising said microorganism.
  • Bifidobacteria are part of the human intestinal microbiota considered as beneficial for health. Some strains of this genus are used as probiotic microorganisms in food products because their efficacy in the balance of healthy intestinal microbiota is demonstrated, as well as their effectiveness in inhibiting or retarding the growth of potentially pathogenic bacteria.
  • probiotic microorganisms A fundamental property for probiotic microorganisms to carry out their beneficial effect is that they, once ingested, can reach the intestinal mucosa in such a number and with such vitality that they are able to persist and / or colonize the intestine. For this reason, it is necessary that these probiotic microorganisms resist the low pH of the stomach and bile salts of the intestine.
  • probiotic microorganisms The selection of probiotic microorganisms is usually performed by in vitro studies of survival to gastrointestinal conditions. In this way, information is obtained about the ability of bacteria to resist low stomach pH and the presence of bile salts. However, such studies do not ensure the in vivo ability of the selected microorganisms to resist gastrointestinal transit.
  • Breast milk is described as the origin of the bifidobacteria that colonize the intestine of the newborn infant, so obtaining isolates from this source is particularly interesting to obtain probiotic material that can be used in dairy products and with a good chance of resist in vivo gastrointestinal transit.
  • obtaining strains of bifidobacteria isolated from breast milk is very low due to the difficulty of obtaining such isolates (Mart ⁇ n et al. 2009; Solis et al. 2010).
  • it is known that the viability of bifidobacteria in dairy products that contain them is limited, as well as the number and diversity of commercially available strains.
  • the cultivation of bifidobacteria in milk requires very long incubation times, anaerobic conditions, low redox potential and growth promoters such as milk hydrolysates (Gomes et al. 1998), caseinomacropeptides (Janer et al. 2004) or yeast extract (Zacar ⁇ as et al. 201 1).
  • growth promoters such as milk hydrolysates (Gomes et al. 1998), caseinomacropeptides (Janer et al. 2004) or yeast extract (Zacar ⁇ as et al. 201 1).
  • the addition of growth factors in milk may result in a deterioration of the quality of the fermented product due to the production of acetic acid or the contribution of unwanted flavors.
  • the new isolates For use in the food industry, in particular, the dairy industry, it would be desirable for the new isolates to be cultivable, as well as conservable under refrigeration and freezing conditions until consumption. In addition, it would be desirable for its milk growth capacity to allow biomass to be obtained for industrial use. On the other hand, isolated strains should not cause a deterioration of the perceived quality perception in the final product.
  • a first objective of the present invention is to provide a microorganism isolated from a breast milk and feces of an infant fed with said breast milk, capable of being transmitted from the milk to the intestine, and which consists of a strain of the species Bifidobacterium breve, deposited with the number CECT 8178 in the "Spanish Type Culture Collection" of Valencia, Spain.
  • the deposit has been made by the applicant of the present application in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the recognition of the deposit of microorganisms for the purpose of the patent procedure.
  • a second objective of the present invention is the use of said microorganism as a probiotic material, preferably as a probiotic material in the preparation and / or preparation of dairy products and their derivatives.
  • a third objective of the present invention is to provide a composition comprising said microorganism, preferably, a composition comprising said microorganism and at least one product to ingest, preferably a food product.
  • said food product is a product selected from a group comprising milk and milk products, such as, for example, infant formula milks or infant formula.
  • the strain of the present invention can be applied in food preparations that include, instead of milk and milk products, other food products such as cereals and derivatives, soups and other products marketed in the form of dehydrates; fermented meats, juices, beverages or fruit derivatives, and / or foods for specific nutritional uses.
  • it could also be part of pharmaceutical preparations in which it was ingested in the form of capsules, pills or powder, for use in diets, food supplements, or formulas for oral or enteral nutrition.
  • the new strain claimed has the advantage that it combines good probiotic properties with good technological properties for use in the food industry, in particular for its use in the preparation and preparation of dairy products and their derivatives.
  • strain CECT 8178 inoculated in milk ability of strain CECT 8178 inoculated in milk to survive gastrointestinal conditions in vitro. moderate capacity of strain CECT 8178 to form exopolysaccharides. Ability of strain CECT 8178 to form biofilms in the presence of bile salts (Oxgall). ability of strain CECT 8178 inoculated in milk to retard the growth of pathogenic microorganisms of the genus Salmonella and Cronobacter.
  • CECT 8178 strain's ability to grow in milk without growth factors Ability of strain CECT 8178 inoculated in milk to resist conservation in refrigeration conditions. - ability of strain CECT 8178 to resist conservation under freezing conditions. ability of strain CECT 8178 inoculated in milk to survive lyophilization.
  • the new strain CECT 8178 is of human origin and has the advantage that it has been isolated from the mother's breast milk and the feces of her respective nursing son, both healthy individuals, having confirmed the identity of the isolates at strain level using the PFGE electrophoresis technique (Pulsed Field Gel Electrophoresis). This feature confirms the ability of the new strain CECT 8178 to be transmitted through milk, as well as its ability in vivo to survive the human intestinal tract.
  • PFGE electrophoresis technique Pulsed Field Gel Electrophoresis
  • the new strain CECT 8178 can be presented in the form of a biologically pure culture, in the form of viable cells or in the form of non-viable cells.
  • strain CECT 8178 was performed from a trial of fifteen samples of breast milk and feces of lactating babies of fifteen mother-child pairs. Samples were seeded directly on plates with RCA culture medium (Reinforced Clostridial
  • Agar in g / l yeast extract 3.0; meat extract 10.0; Tryptone 10.0; glucose 5.0; 1.0 soluble starch; 5.0 sodium chloride; sodium acetate 3.0; L-cysteine HCI 0.5; agar 15.0) and supplemented with 0.3 g / l of aniline blue, without the addition of antibiotics, which allowed recovery and differential growth of bifidobacteria.
  • Colonies were selected representing different morphologies typical of bifidobacteria. The purified isolates were maintained at a temperature of -80 ° C with 5% glycerol.
  • Bifidobacterium at the species and subspecies level was carried out by direct PCR amplification of the 16S rRNA gene, partial sequencing thereof (with 2-way readings) and sequence analysis by the identification service of Bacterial strains of the Spanish Type Culture Collection (CECT).
  • the isolates that presented the same species-level identification of each mother-child pair were differentiated at the strain level by the PFGE electrophoresis technique (Pulsed Field Gel Electrophoresis) with the restriction enzymes Spel and Xba.
  • the aforementioned electrophoresis was performed with a CHEF DRII brand equipment and the band profiles generated were analyzed using the Diversity Datábase Software program (Bio-Rad Laboratories) and grouped according to the UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages) method.
  • a PFGE profile was considered unique when one or more bands are different from another PFGE profile (Tenover et al. 1995).
  • the test carried out allowed four strains to be detected in 4 mother-child pairs.
  • strain CECT 8178 of the present invention shows the profiles of bands generated by PFGE with the Spel and Xba? Enzymes from various isolates.
  • Lane 1 shows the profile obtained with the reference strain Bifidobacterium animalis Bb12.
  • Lanes 2 and 3 show the profiles, which are identical, of the strain of the present invention, obtained from the isolates of feces of the nursing baby (lane 2) and of mother's breast milk (lane 3) with both enzymes .
  • the profiles, also identical, of the isolates of feces (lane 4) and breast milk (lane 5) of another mother-child pair are shown.
  • the strain identification was completed with the phenotypic characterization by carbohydrate fermentation of the API 50CH identification galleries of the Biomerieux brand system (see Table). The results of this characterization demonstrate that the fermentation profile of the new strain is broad, which favors the possibility of using said strain in the fermentation of different substrates. Antibiotic resistance
  • An antibiogram of the new strain CECT 8178 was carried out using antibiotic diffusion discs of the Oxoid brand. For this, 100 ⁇ of culture (approximately 7 log cfu / ml) was spread on the surface of RCA culture plates and discs with the following antibiotics were deposited: tetracycline (10 ⁇ g), chloramphenicol (10 ⁇ g), kanamycin (15 ⁇ g ), erythromycin (15 ⁇ g), rifampicin (30 ⁇ g) and vancomycin (30 ⁇ g). The plates were incubated 48 h, under anaerobic conditions, at 37 ° C, and the inhibition halos generated around the discs were measured.
  • the assay was carried out with the strain of the present invention and with two commercial reference strains. These are the commercial strains Bifidobacterium animalis Bb12 registered by Chr Hansen A / S and Bifidobacterium longum BB536 registered by Morinaga Milk Industry Co. LTD. These strains were isolated from capsules marketed by Morinaga Milk Industry Co. LTD under the Morinaga brand that contained the strain in a dehydrated form in the case of Bifidobacterium longum BB536, and from fermented milk with active Bifidus of the brand Hacendado in the case of Bifidobacterium animalis Bb12. Its isolation and identification was carried out according to the same procedure described in the previous section for strain CECT 8178.
  • Table 2 Antibiotic sensitivity of the new strain Bifidobacterium breve CECT 8178 and the Bifidobacterium animalis Bb12 and Bifidobacterium longum BB536 strains isolated from commercial products.
  • Tetra is tetracycline (10 ⁇ g)
  • Chlorine is chloramphenicol (10 ⁇ g)
  • Kan is kanamycin (15 ⁇ g)
  • Eri is erythromycin (15 ⁇ g)
  • Rif is rifampin (30 ⁇ g)
  • Van vancomycin (3 ⁇ g).
  • CECT 8178 combines good probiotic properties together with good technological properties that make it especially suitable for use as a probiotic material in the preparation and / or preparation of dairy products and its derivatives.
  • strain CECT 8178 is capable of growing in milk without the need for additives or growth promoters, its growth level being similar to that of the commercial reference strains Bifidobacterium animalis Bb12 and Bifidobacterium longum BB536.
  • the strain presents pleasant odors when grown in milk and yogurts made with commercial ferments.
  • strain CECT 8178 is resistant to conservation under refrigeration, freezing and freeze-drying conditions. Specifically, on the one hand, it has been observed that the strain is capable of resisting cold storage at 4 o C, inoculated in milk and in the presence of oxygen for a period exceeding 20 days.
  • the strain is able to resist freezing at -80 ° C inoculated in RCM broth (Reinforced Clostridial Medium in g / l: yeast extract 3.0; meat extract 10.0; tryptone 10.0; glucose 5.0; soluble starch 1.0; sodium chloride 5.0; sodium acetate 3.0; L-cysteine HCI 0.5; agar 5.0), for a period also exceeding 20 d .
  • RCM broth Reinforced Clostridial Medium in g / l: yeast extract 3.0; meat extract 10.0; tryptone 10.0; glucose 5.0; soluble starch 1.0; sodium chloride 5.0; sodium acetate 3.0; L-cysteine HCI 0.5; agar 5.0
  • said strain CECT 8178 can be used as a culture attached to the ferment.
  • the culture attached to the ferment is a culture that is not necessary for the fermented product to be obtained, although it will give the product an added value of probiotic character.
  • the strain of the present invention has adequate technological characteristics that favor its viability, its competitiveness and its survival at adequate levels in dairy products or fermented derivatives, constituting a viable alternative to the commercial probiotic reference strains mentioned above.
  • said strain CECT 8178 can be used as a probiotic material in dairy products or derivatives of chilled, frozen or freeze-dried dairy products.
  • said strain CECT 8178 is capable of retarding the growth of pathogenic microorganisms of the genus Salmonella and Cronobacter.
  • said strain can be included in a composition comprising a food product, such as, for example, a milk of infant formula, preferably a infant formula.
  • probiotic material will be understood as the material that defines FAO / WHO as a probiotic, that is, living microorganisms that administered under appropriate conditions confer benefits to the host.
  • a dairy product means a product that includes milk or a product derived from milk.
  • Refrigerated milk product means a preserved milk product at a temperature substantially equal to or less than 5 ° C for a period equal to or less than the preferred consumption of said product.
  • a frozen dairy product means a preserved dairy product at a temperature substantially equal to or below -18 ° C.
  • a freeze-dried dairy product means a dairy product that has undergone a process of freezing and subsequent dehydration.
  • a fermented dairy product means a dairy product that has undergone a process of lactic fermentation, such as yogurt or cheese.
  • Figure 1 shows the different PFGE profiles obtained with the Spel (a) and Xba ⁇ (b) enzymes of the strain of the present invention and the commercial strain Bifidobacterium animalis Bb12 from fecal isolates of a nursing baby and of breast milk from their respective mother (streets 2 and 3).
  • Figure 2 is a graphical representation showing the percentage of biofilm formation of the strain of the present invention and of the commercial reference strains Bifidobacterium animalis Bb12 and Bifidobacterium longum BB536 with respect to the Lactobacillus rhamnosus GG strain that acts as a positive control.
  • the representation includes the results of the test performed on a TSBm medium in the presence of bile salts (oxgall) and on a TSBm medium in the absence of bile salts.
  • the tests presented below demonstrate the in vitro ability of the new strain to survive passage through the human gastrointestinal tract in the baby, as well as the strain's probiotic potential to interfere with the growth of pathogenic bacteria. In the same tests, the strain's ability to survive in milk in the absence of growth factors and to grow at the level of the reference strains used in the dairy industry is demonstrated. On the other hand, the tests demonstrate the resistance of the new strain to the conditions of refrigeration and freezing, as well as its total survival after lyophilization in milk. All these characteristics confirm the new strain as a strain with technological aptitudes of high interest in the dairy industry.
  • the growth in milk of the new strain was studied without the addition of growth factors or promoters.
  • the new strain CECT 8178 was grown on plates with RCA culture medium.
  • the cells obtained were resuspended in milk and inoculated in 10% reconstituted skimmed milk powder. Then, they were incubated at 37 ° C, for 24 h, under anaerobic conditions.
  • the new strain CECT 8178 was able to grow in milk without the need for growth factors.
  • the level of growth was similar to that of the reference commercial strains, in particular, practically identical to that of the strain Bifidobacterium animalis Bb 12 isolated from a commercial probiotic product of the Hacendado brand.
  • the new strain CECT 8178 was grown on plates with RCA culture medium and the cells obtained were resuspended in milk and incubated at 37 ° C, for 24 h, under anaerobiosis conditions. The grown cultures were stored at 4 ° C for 28 days (28 d). As can be seen in the attached Table 4, after 14 days (14 d) of cold storage, the population of the new CECT 8178 strain was reduced to a lesser extent (0.69 decimal logarithmic units) than that of commercial strains of reference (1, 13 and 1, 17 decimal logarithmic units). After 28 days of incubation, the population of the new strain was reduced similarly to that of the reference strain Bifidobacterium longum BB536, of the Morinaga brand.
  • the new strain CECT 8178 was grown on plates with culture medium at 37 ° C and for 48 h, under anaerobic conditions.
  • the cells obtained were resuspended in RCM with 5% glycerol.
  • Cell suspensions were stored at -80 ° C for 21 days.
  • Lyophilization survival test and conservation stability under refrigeration conditions The stability of the lyophilization strain in milk and its preservation at 6 o C temperature, under aerobic conditions, was studied.
  • the new strain CECT 8178 was grown on plates with RCA culture medium, and the obtained cells were resuspended in skim milk, frozen at -80 ° C and lyophilized for 24 h in a Cryodos freeze dryer. of the Telstar brand. Lyophilized cultures were stored at 6 ° C for 21 days.
  • the yogurts were made with the ⁇ -Flex X16 "ferments of the CHR HANSEN brand according to the protocol described for small-scale fabrications for these ferments.
  • the ferments of the said brand include strains of bacteria of the Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus species.
  • the new probiotic strain was grown in milk and inoculated at 6 log cfu / ml at the same time as commercial ferments. Controlled yogurts without probiotic were made simultaneously and with the probiotic commercial strain Bifidobacterium animalis Bb12 isolated from a commercial probiotic product of the Hacendado brand.
  • the new strain Bifidobacterium breve CECT 8178 presented pleasant odors when grown in milk and in yogurts made with commercial ferments.
  • a moderate decrease (0.6 decimal logarithmic units) of Streptococcus thermophilus was observed in yogurt made with the new strain as an attached crop, although its levels remained well above the minimum of 7 log cfu / ml established in the Quality Standard for Yogurt by Royal Decree 179/2003 (see Table 7).
  • the capacity of the strain CECT 8178 inoculated in milk to survive the passage through the gastrointestinal tract simulated by the consecutive exposure of the culture of the strain in milk as it passes through the stomach and then through the intestine.
  • the passage through the stomach was simulated by 1% inoculation of the milk culture in PBS buffer (Phosphate-Buffered Saline pH 7.4, in mM: NaCI 137; KCI 2.7, Na 2 HP0 4 8; KH 2 P0 4 2), adjusted to pH 3, and incubated at 37 ° C for 1 hour, and then this suspension was re-coupled (1%) in PBS buffer with 0.15% bile salts (oxgall), adjusted to pH 8 and incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • PBS buffer Phosphate-Buffered Saline pH 7.4, in mM: NaCI 137; KCI 2.7, Na 2 HP0 4 8; KH 2 P0 4 2
  • the new strain CECT 8178 survived the passage through the 100% in vitro gastrointestinal tract as well as the commercial strain Bifidobacterium animalis Bb12.
  • the commercial strain Bifidobacterium longum BB536 showed, however, under the conditions used in this trial, a sharp decrease in its levels after the simulated process.
  • the effect of the new strain CECT 8178 on the survival of enteric Salmonella serovar Enteritidis CECT 4300 or Cronobacter sakazakii CECT 585 in milk was studied.
  • the new 1% strain in the milk was grown for 24 h at 37 ° C, under anaerobic conditions.
  • the pathogen under study was added at approximately 3 log cfu / ml.
  • the cocultures were incubated 24 h, under anaerobic conditions, at 37 ° C.
  • the counts of the pathogens and the new strain were performed at 0 h and 24 h, in TSA medium (Tryptic Soy Agar in g / l: pancreatic digested casein 15.0 s papaic digested soybean meal 5,0; 5.0 sodium chloride; agar 15.0) and RCA, respectively.
  • the levels of bifidobacteria in milk after culturing for 24 h at 37 ° C were 6.68 ⁇ 1.65 log cfu / ml for strain CECT 8178, 7.46 ⁇ 0.02 log cfu / ml for Bifidobacterium animalis Bb12 and 7.88 ⁇ 0.17 log cfu / ml for Bifidobacterium longum BB536.
  • Table 9 Growth in Salmonella Enteritidis CECT 4300 and Cronobacter sakazakii CECT 858 milk in coculture with the new CECT 8178 strain. The growth is expressed as a decimal logarithm of colony forming units per ml of culture (log cfu / ml).
  • S. Enteritidis count log cfu / ml
  • log cfu / ml log cfu / ml (mean ⁇ SD)
  • biofilms by symbiotic bacterial communities in the mucus of the intestinal epithelium provides multiple benefits to the organism, such as promoting digestion of the lumen's food contents or strengthening host defenses (Bollinger et al. 2007).
  • TSB Tryptic Soy Broth in g / l: pancreatic digested casein 15.0 s papaic digested soybean meal 5.0; Sodium chloride 5.0
  • TSBm protein-peptone
  • oxgall bile salts
  • exopolysaccharide production test The production of exopolysaccharides is a property of interest in probiotic bacteria since it is associated with the ability to interfere with pathogens in adhesion to the human intestinal mucus and with immunomodulatory activity. On the other hand, the production of exopolysaccharides could contribute to cellular protection and therefore to a better bacterial survival to technological processes or digestion.

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Abstract

Microorganismo aislado de una leche materna y de heces de un lactante alimentado con dicha leche materna, que consiste en una cepa de la especie Bifidobacterium breve, depositada con el número CECT 8178 en la "Colección Española de Cultivos Tipo" de Valencia, España. Uso del microorganismo como material probiótico en la elaboración y/o preparación de productos lácteos y sus derivados. La cepa de la presente invención ha sido aislada de una leche materna y de heces de un lactante alimentado con dicha leche materna.

Description

MICROORGANISMO AISLADO DE LECHE MATERNA Y DE HECES DE UN LACTANTE,
Y SU USO COMO PROBIÓTICO
La presente invención se refiere a un microorganismo de la especie Bifidobacterium breve que ha sido aislado de leche materna y de heces de un lactante alimentado con dicha leche materna. También se refiere al uso de dicho microorganismo como material probiótico y a una composición que comprende dicho microorganismo.
Antecedentes de la invención
Las bifidobacterias forman parte de la microbiota intestinal humana considerada como beneficiosa para la salud. Algunas cepas de este género se emplean como microorganismos probióticos en productos alimentarios por quedar demostrada su eficacia en el equilibrio de la microbiota intestinal saludable, así como su eficacia en la inhibición o retraso del crecimiento de bacterias potencialmente patógenas.
Una propiedad fundamental para que los microorganismos probióticos puedan llevar a cabo su efecto beneficioso es que los mismos, una vez ingeridos, puedan alcanzar la mucosa intestinal en tal número y con tal vitalidad que sean capaces de persistir y/o colonizar el intestino. Por este motivo, es necesario que estos microorganismos probióticos resistan el pH bajo del estómago y las sales biliares del intestino.
La selección de microorganismos probióticos se realiza habitualmente mediante estudios in vitro de supervivencia a las condiciones gastrointestinales. De este modo, se obtiene información acerca de la capacidad de las bacterias de resistir el bajo pH del estómago y la presencia de sales biliares. Sin embargo, dichos estudios no aseguran la capacidad in vivo de los microorganismos seleccionados de resistir al tránsito gastrointestinal.
La leche materna se describe como el origen de las bifidobacterias que colonizan el intestino del recién nacido lactante, por lo que la obtención de aislados procedentes de esta fuente es particularmente interesante para obtener material probiótico susceptible de ser empleado en productos lácteos y con buenas probabilidades de resistir in vivo el tránsito gastrointestinal. Sin embargo, la obtención de cepas de bifidobacterias aisladas de leche materna es muy escasa debido a la dificultad de obtención de dichos aislados (Martín et al. 2009; Solis et al. 2010). Por otro lado, es conocido que la viabilidad de las bifidobacterias en los productos lácteos que las contienen es limitada, así como el número y diversidad de cepas disponibles comercialmente. En efecto, son numerosos los estudios que demuestran que las bifidobacterias presentan características tecnológicas inferiores a las bacterias lácticas tradicionalmente usadas en productos lácteos. De hecho, existe un consenso generalizado sobre la falta de capacidad de las cepas de bifidobacterias para crecer en leche (Prasanna et al. 2012). En particular, se ha comprobado que muchas cepas de bifidobacterias poseen un crecimiento muy lento en leche debido a una reducida actividad proteolítica, lo que dificulta enormemente su aplicación en productos lácteos fermentados (Yonezawa et al. 2010). Además, el cultivo de bifidobacterias en leche requiere tiempos muy largos de incubación, condiciones anaerobias, bajo potencial redox y promotores de crecimiento tales como hidrolizados de leche (Gomes et al. 1998), caseinomacropéptidos (Janer et al. 2004) o extracto de levadura (Zacarías et al. 201 1). Sin embargo, la adición de factores de crecimiento en la leche puede repercutir en un deterioro de la calidad del producto fermentado por la producción de ácido acético o por el aporte de sabores no deseados.
A la vista de lo expuesto, se considera relevante el aislamiento y caracterización de nuevas cepas de microorganismos probióticos del grupo de las bifidobacterias con buenas propiedades tecnológicas para su empleo en la industria alimentaria, en particular, para su empleo en la elaboración y preparación de productos lácteos y sus derivados.
Para su uso en la industria alimentaria, en particular, la industria láctea, sería deseable que las nuevas cepas aisladas fueran cultivables, así como conservables en condiciones de refrigeración y congelación hasta su consumo. Además, sería deseable que su capacidad de crecimiento en leche permitiera la obtención de biomasa para uso industrial. Por otro lado, las cepas aisladas no deberían producir un deterioro de la percepción de calidad esperada en el producto final.
Descripción resumida de la invención
Un primer objetivo de la presente invención es proporcionar un microorganismo aislado de una leche materna y de heces de un lactante alimentado con dicha leche materna, capaz de transmitirse de la leche al intestino, y que consiste en una cepa de la especie Bifidobacterium breve, depositada con el número CECT 8178 en la "Colección Española de Cultivos Tipo" de Valencia, España. El depósito ha sido efectuado por el solicitante de la presente solicitud de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patentes.
Un segundo objetivo de la presente invención consiste en el uso de dicho microorganismo como material probiótico, preferiblemente, como material probiótico en la elaboración y/o preparación de productos lácteos y sus derivados. Un tercer objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición que comprende dicho microorganismo, preferiblemente, una composición que comprende dicho microorganismo y por lo menos un producto para ingerir, preferiblemente un producto alimentario.
Ventajosamente, dicho producto alimentario es un producto seleccionado de un grupo que comprende leche y productos derivados de la leche, como por ejemplo, leches de fórmula infantil o leches maternizadas.
La cepa de la presente invención puede aplicarse en preparados alimenticios que incluyan, en lugar de leche y productos lácteos, otros productos alimentarios como cereales y derivados, sopas y otros productos comercializados en forma de deshidratados; carnes fermentadas, zumos, bebidas o derivados de frutas, y/o alimentos para usos nutricionales específicos. Además, también podría formar parte de preparados farmacéuticos en los que se ingiriera en la forma de cápsulas, pastillas o en polvo, para emplear en dietas, en suplementos alimenticios, o fórmulas para nutrición oral o enteral.
La nueva cepa reivindicada presenta la ventaja de que combina unas buenas propiedades probióticas con unas buenas propiedades tecnológicas para su empleo en la industria alimentaria, en particular, para su empleo en la elaboración y preparación de productos lácteos y sus derivados.
Por lo que se refiere a las propiedades probióticas, los experimentos realizados confirman las siguientes características:
capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche de sobrevivir a las condiciones gastrointestinales in vitro. capacidad moderada de la cepa CECT 8178 para formar exopolisacáridos. capacidad de la cepa CECT 8178 de formar biofilms en presencia de sales biliares (Oxgall). capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche de retrasar el crecimiento de microorganismos patógenos del género Salmonella y Cronobacter.
Por lo que se refiere a las propiedades tecnológicas, los experimentos realizados confirman las siguientes características: capacidad de la cepa CECT 8178 de crecer en leche sin factores de crecimiento. capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche de resistir la conservación en condiciones de refrigeración. - capacidad de la cepa CECT 8178 de resistir a la conservación en condiciones de congelación. capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche de sobrevivir a la liofilización.
Otra ventaja importante de la cepa de la presente invención radica en el hecho de que ha sido aislada de una leche materna y de heces de un lactante alimentado con dicha leche materna. En particular, la nueva cepa CECT 8178 es de origen humano y presenta la ventaja de que ha sido aislada de la leche materna de una madre y de las heces de su respectivo hijo lactante, ambos individuos sanos, habiendo sido confirmada la identidad de los aislados a nivel de cepa mediante la técnica de electroforesis PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis). Esta característica permite confirmar la capacidad de la nueva cepa CECT 8178 de transmitirse a través de la leche, así como su capacidad in vivo de sobrevivir al tracto intestinal humano.
La nueva cepa CECT 8178 puede presentarse en forma de cultivo biológicamente puro, en forma de células viables o en forma de células no viables.
Aislamiento e identificación
El aislamiento de la cepa CECT 8178 se realizó a partir de un ensayo de quince muestras de leche materna y heces de bebés lactantes de quince pares madre-hijo. Las muestras fueron sembradas directamente en placas con medio de cultivo RCA (Reinforced Clostridial
Agar en g/l: extracto de levadura 3,0; extracto de carne 10,0; triptona 10,0; glucosa 5,0; almidón soluble 1 ,0; cloruro sódico 5,0; acetato de sodio 3,0; L- cisteína HCI 0,5; agar 15,0) y suplementadas con 0,3 g/l de azul de anilina, sin la adición de antibióticos, lo que permitió la recuperación y el crecimiento diferencial de bifidobacterias. Se seleccionaron colonias que representaban distintas morfologías típicas de bifidobacterias. Los aislados purificados se mantuvieron a una temperatura de -80° C con 5% de glicerol.
La identificación de Bifidobacterium a nivel de especie y subespecie se realizó mediante la amplificación directa por PCR del gen del 16S rRNA, secuenciación parcial del mismo (con lecturas en las 2 direcciones) y análisis de las secuencias por el servicio de identificación de cepas bacterianas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
Los aislados que presentaron la misma identificación a nivel de especie de cada par madre- hijo se diferenciaron a nivel de cepa mediante la técnica de electroforesis PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) con las enzimas de restricción Spel y Xba\. La citada electroforesis se realizó con un equipo de la marca CHEF DRII y los perfiles de bandas generados se analizaron mediante el programa Diversity Datábase Software (Bio-Rad Laboratories) y se agruparon según el método UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages). Un perfil de PFGE se consideró único cuando una o más bandas son diferentes de otro perfil de PFGE (Tenover et al. 1995). El ensayo realizado permitió detectar cuatro cepas en 4 pares madre-hijo. Una de estas cepas es la cepa CECT 8178 de la presente invención. En la Figura 1 se observan los perfiles de bandas generados mediante PFGE con las enzimas Spel y Xba\ a partir de diversos aislados. La calle 1 muestra el perfil obtenido con la cepa de referencia Bifidobacterium animalis Bb12. Las calles 2 y 3 muestran los perfiles, que son idénticos, de la cepa de la presente invención, obtenidos a partir de los aislamientos de heces del bebé lactante (calle 2) y de leche materna de su madre (calle 3) con ambas enzimas. Del mismo modo se muestran los perfiles, también idénticos, de los aislados de heces (calle 4) y leche materna (calle 5) de otro par madre-hijo. La identificación de la cepa se completó con la caracterización fenotípica mediante la fermentación de carbohidratos de las galerías de identificación de API 50CH del sistema de la marca Biomerieux (ver Tablal). Los resultados de esta caracterización demuestran que el perfil de fermentación de la nueva cepa es amplio, lo que favorece la posibilidad de utilizar dicha cepa en la fermentación de distintos sustratos. Resistencia a antibióticos
Se llevó a cabo un antibiograma de la nueva cepa CECT 8178 empleando discos de difusión de antibióticos de la marca Oxoid. Para ello, se extendieron 100 μΙ de cultivo (aproximadamente 7 log ufc/ml) sobre la superficie de placas con cultivo RCA y se depositaron discos con los siguientes antibióticos: tetraciclina (10 μg), cloranfenicol (10 μg), kanamicina (15 μg), eritromicina (15 μg), rifampicina (30 μg) y vancomicina (30 μg). Las placas se incubaron 48 h, en condiciones de anaerobiosis, a 37° C, y se midieron los halos de inhibición generados alrededor de los discos.
Tabla 1. Caracterización fenotípica mediante fermentación de carbohidratos.
" SUSTRATO API 50CH B. breve CECT 8178
CONTROL GLICEROL
ERITRITOL
D-ARABINOSA
L-ARABINOSA
RIBOSA +
D-XILOSA -
L-XILOSA -
ADONITOL - β-METIL-D-XILOSIDO -
GALACTOSA +
GLUCOSA +
FRUCTOSA +
MAÑOSA +
SORBOSA -
RAMNOSA -
DULCITOL -
INOSITOL -
MANITOL -
SORBITOL -
METIL-D-MANÓSIDO -
METIL-D-GLUCÓSIDO +
N ACETIL GLUCOSAMINA +
AMIGDALINA +
ARBUTINA -
ESCULINA +
SALICILINA +
CELOBIOSA +
MALTOSA +
LACTOSA +
MELIBIOSA +
SACAROSA +
TREHALOSA +
INULINA -
MELICITOSA +
RAFINOSA +
ALMIDÓN +
GLICÓGENO +
XILITOL +
GENTIBIOSA +
D-TURANOSA +
D-LIXOSA +
D-TAGATOSA +
L-FUCOSA -
D-FUCOSA +
D-ARABITOL -
L-ARABITOL -
GLUCONATO -
2-CETO-GLUCONATO -
5-CETO-GLUCONATO -
Los resultados se interpretaron según los niveles de corte propuestos por Charteris et al. (1998) y demostraron que la nueva cepa CECT 8178 es sensible a la mayoría de los antibióticos de interés clínico al igual que otras dos cepas comerciales de referencia ensayadas en el mismo antibiograma (ver Tabla 2 adjunta).
El ensayo se llevó a cabo con la cepa de la presente invención y con dos cepas comerciales de referencia. Se trata de las cepas comerciales Bifidobacterium animalis Bb12 registrada por Chr Hansen A/S y Bifidobacterium longum BB536 registrada por Morinaga Milk Industry Co. LTD. Estas cepas fueron aisladas de cápsulas comercializadas por Morinaga Milk Industry Co. LTD con la marca Morinaga que contenían la cepa de forma deshidratada en el caso de Bifidobacterium longum BB536, y de leche fermentada con Bifidus activo de la marca Hacendado en el caso de Bifidobacterium animalis Bb12. Su aislamiento e identificación se realizó según el mismo procedimiento descrito en el apartado anterior para la cepa CECT 8178.
Tabla 2.- Sensibilidad a antibióticos de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 y las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales. En esta tabla; Tetra es tetraciclina (10 μg), Clor es cloranfenicol (10 μg), Kan es kanamicina (15 μg), Eri es eritromicina (15 μg), Rif es rifampicina (30 μg) y Van es vancomicina (3 μg).
Antibióticos
Cepa Origen Tetra Clor Kan Eri Rif Van
B. breve CECT 8178 Leche materna + + + + +
R animalis Bb12 comercial - + + + +
R longum BB536 comercial + + + + +
Descripción detallada de la invención
Tal y como se ha comentado en el apartado anterior, se ha observado que la CECT 8178 combina unas buenas propiedades probióticas junto con unas buenas propiedades tecnológicas que la hacen especialmente apta para ser empleada como material probiótico en la elaboración y/o preparación de productos lácteos y sus derivados.
En particular, por lo que se refiere a sus propiedades tecnológicas, se ha observado que la cepa CECT 8178 es capaz de crecer en leche sin necesidad de aditivos o promotores de crecimiento, siendo su nivel de crecimiento similar al de las cepas comerciales de referencia Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536. Además, la cepa presenta olores agradables al cultivarse en leche y en yogures fabricados con fermentos comerciales.
Los ensayos realizados también han permitido demostrar que la cepa CECT 8178 es resistente a la conservación en condiciones de refrigeración, congelación y liofilización. En concreto, por un lado, se ha observado que la cepa es capa de capaz de resistir a la conservación en frío a 4o C, inoculada en leche y en presencia de oxígeno durante un período superior a 20 días. Por otro lado, se ha observado que la cepa es capaz de resistir a la congelación a -80° C inoculada en caldo RCM (Reinforced Clostridial Médium en g/l: extracto de levadura 3,0; extracto de carne 10,0; triptona 10,0; glucosa 5,0; almidón soluble 1 ,0; cloruro sódico 5,0; acetato de sodio 3,0; L- cisteína HCI 0,5; agar 5,0), durante un periodo también superior a 20 d. Finalmente, también se ha demostrado que la cepa es capaz de sobrevivir a la liofilización inoculada en leche y al almacenamiento del liófilo por periodos superiores a 20 d.
Gracias a su buena capacidad de crecimiento en leche, según una realización, dicha cepa CECT 8178 puede ser empleada como cultivo adjunto al fermento.
El cultivo adjunto al fermento es un cultivo que no es necesario para que el producto fermentado se obtenga, aunque conferirá al producto un valor añadido de carácter probiótico. La cepa de la presente invención presenta unas características tecnológicas adecuadas que favorecen su viabilidad, su competitividad y su supervivencia en niveles adecuados en productos lácteos o derivados fermentados, constituyendo una alternativa viable a las cepas comerciales probióticas de referencia anteriormente mencionadas.
De igual modo, gracias a la capacidad de resistir a las condiciones de refrigeración, congelación y liofilización, ventajosamente, dicha cepa CECT 8178 puede ser empleada como material probiótico en productos lácteos o derivados de productos lácteos refrigerados, congelados o liofilizados. Por lo que se refiere a sus propiedades probióticas, se ha observado que la cepa CECT 8178 es capaz de retrasar el crecimiento de microorganismos patógenos del género Salmonella y Cronobacter. Gracias a ello, según una realización, dicha cepa puede ser incluida en una composición que comprenda un producto alimentario, como por ejemplo, una leche de fórmula infantil, preferiblemente, una leche maternizada.
En la presente invención por material probiótico se entenderá el material que define la FAO/WHO como probiótico, es decir, microorganismos vivos que administrados en condiciones adecuadas confieren beneficios al hospedador.
Por producto lácteo se entenderá un producto que incluye leche o un producto derivado de la leche.
Por producto lácteo refrigerado se entenderá un producto lácteo conservado a una temperatura sustancialmente igual o inferior a 5°C durante un periodo igual o inferior al de consumo preferente de dicho producto.
Por producto lácteo congelado se entenderá un producto lácteo conservado a una temperatura sustancialmente igual o inferior a - 18°C.
Por producto lácteo liofilizado se entenderá un producto lácteo que ha sido sometido a un proceso de congelación y posterior deshidratación.
Por producto lácteo fermentado se entenderá un producto lácteo que ha sido sometido a un proceso de fermentación láctica, como por ejemplo, un yogur o un queso. Breve descripción de las figuras
Para mejor comprensión de cuanto se ha expuesto se acompañan unos dibujos en los que, esquemáticamente y tan sólo a título de ejemplo no limitativo, se representa un caso práctico de realización.
En dichos dibujos;
La Figura 1 muestra los distintos perfiles de PFGE obtenidos con las enzimas Spel (a) y Xba\ (b) de la cepa de la presente invención y la cepa comercial Bifidobacterium animalis Bb12 a partir de los aislados de heces de un bebé lactante y de la leche materna de su respectiva madre (calles 2 y 3). La Figura 2 es una representación gráfica que muestra el porcentaje de formación de biofilms de la cepa de la presente invención y de las cepas comerciales de referencia Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 respecto de la cepa Lactobacillus rhamnosus GG que actúa de control positivo. La representación incluye los resultados del ensayo efectuado en un medio TSBm en presencia de sales biliares (oxgall) y en un medio TSBm en ausencia de sales biliares.
Descripción de ensayos A continuación se exponen distintos ensayos los cuales deben interpretarse como un medio auxiliar para la mejor comprensión de la invención y no como limitaciones al objeto de la misma.
En estos ensayos se han empleado como cepas de referencia las cepas comerciales Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536, obtenidos a partir de productos comerciales de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente.
Los ensayos que se presentan a continuación demuestran la capacidad in vitro de la nueva cepa de sobrevivir el paso por el tracto gastrointestinal humano en el bebé, así como el potencial probiótico de la cepa de interferir sobre el crecimiento de bacterias patógenas. En los mismos ensayos se demuestra la capacidad de la cepa de sobrevivir en leche en ausencia de factores de crecimiento y de crecer al nivel de las cepas de referencia empleadas en la industria láctea. Por otro lado, los ensayos demuestran la resistencia de la nueva cepa a las condiciones de refrigeración y congelación, así como su total supervivencia tras la liofilización en leche. Todas estas características confirman la nueva cepa como una cepa con aptitudes tecnológicas de alto interés en la industria láctea.
Ensayo de crecimiento en leche
Se estudió el crecimiento en leche de la nueva cepa sin la adición de factores o promotores de crecimiento.
Para llevar a cabo este ensayo, la nueva cepa CECT 8178 se creció en placas con medio de cultivo RCA. Las células obtenidas se resuspendieron en leche y se inocularon en leche desnatada en polvo reconstituida al 10%. A continuación, se incubaron a 37°C, durante 24 h, en condiciones de anaerobiosis.
Tal y como se muestra en la Tabla 3 adjunta, la nueva cepa CECT 8178 fue capaz de crecer en leche sin necesidad de factores de crecimiento. El nivel de crecimiento fue similar al de las cepas comerciales de referencia, en particular, prácticamente idéntico al de la cepa Bifidobacterium animalis Bb 12 aislado a partir de un producto probiótico comercial de la marca Hacendado.
Tabla 3. Crecimiento de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 inoculada en leche a 37°C durante 24 h en condiciones de anaerobiosis. El crecimiento se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales se incluyen como cepas de referencia.
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Ensayo de estabilidad a la conservación en condiciones de refrigeración
Se estudió la estabilidad de la cepa durante el almacenamiento en leche a 4°C en condiciones aerobias.
Para llevar a cabo el ensayo, la nueva cepa CECT 8178 se creció en placas con medio de cultivo RCA y las células obtenidas se resuspendieron en leche y se incubaron a 37°C, durante 24 h, en condiciones de anaerobiosis. Los cultivos crecidos se conservaron a 4°C durante 28 días (28 d). Tal y como puede verse en la Tabla 4 adjunta, tras 14 días (14 d) de conservación en frío, la población de la nueva cepa CECT 8178 se redujo en menor medida (0,69 unidades logarítmicas decimales) que la de las cepas comerciales de referencia (1 , 13 y 1 , 17 unidades logarítmicas decimales). Al cabo de 28 días de incubación, la población de la nueva cepa se redujo de modo similar al de la cepa de referencia Bifidobacterium longum BB536, de la marca Morinaga. Tabla 4. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 inoculada en leche en presencia de oxígeno y conservada a 4°C. Medidas efectuadas a los 14 días y 28 días de conservación. La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia. log ufc/ml (media ± DS)
Cepa Origen 0 h 14 d 28 d
B. breve CECT 178 Leche materna 6,89±0,21 6,20±0, 13 5,05±0, 18
R animalis Bb12 comercial 7,69±0, 10 6,56±0,04 6,74±0,08
R longum BB536 comercial 7,42±0,04 6,25±0,05 5,02±0,07
Ensayo de estabilidad a la conservación en condiciones de congelación
Se estudió la estabilidad de la cepa durante la congelación a -80°C en caldo RCM.
Para llevar a cabo el ensayo, la nueva cepa CECT 8178 se creció en placas con medio de cultivo a 37°C y durante 48 h, en condiciones de anaerobiosis. Las células obtenidas se resuspendieron en RCM con 5% de glicerol. Las suspensiones celulares se almacenaron a -80°C durante 21 días.
Tal y como puede verse en la Tabla 5 adjunta, la estabilidad de las tres cepas ensayadas fue buena, con descensos en todos los casos inferiores a una unidad logarítmica después de 21 días de conservación a -80° C.
Tabla 5. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 inoculada en caldo RCM con 5% de glicerol y conservada a -80°C. Medidas efectuadas a los 21 días de conservación. La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia. log ufc/ml (media ± DS) Cepa Origen O h 21 d
B. breve CECT 8178 Leche materna 7, 19±0, 12 6,25±0, 1 1 B. animalis Bb12 comercial 9, 14±0,03 9,01 ±0,06 B. longum BB536 comercial 5,37±0,32 4,84±0,30
Ensayo de supervivencia a la liofilización y estabilidad a la conservación en condiciones de refrigeración Se estudió la estabilidad de la cepa a la liofilización en leche y a su conservación a 6o C de temperatura, en condiciones aerobias.
Para llevar a cabo el ensayo, la nueva cepa CECT 8178 se creció en placas con medio de cultivo RCA, y las células obtenidas se resuspendieron en leche desnatada, se congelaron a -80° C y se liofilizaron durante 24 h en un liofilizador de Cryodos de la marca Telstar. Los cultivos liofilizados se conservaron a 6°C de temperatura durante 21 días.
Tal y como se desprende de los resultados de la tabla 6, el proceso de liofilización no afectó la viabilidad de la nueva cepa que mantuvo estables los niveles iniciales. Los recuentos del cultivo liofilizado se mantuvieron constantes después del almacenamiento del liófilo durante 21 días a 6°C. Tabla 6. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 en leche tras liofilización y conservación a 6°C. Medidas efectuadas a los 21 días de conservación. La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia.
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Ensayo de evaluación del olor en leche y en yogur elaborado con fermentos comerciales
Se evaluó el olor de la nueva cepa en leche en polvo reconstituida al 10%, incubada a 37°C durante 24 h, en condiciones de anaerobiosis. También se evaluó el olor de la nueva cepa en yogur elaborado conjuntamente con la cepa y fermentos comerciales, a las 24 h de su elaboración. La evaluación del olor de la leche fermentada y los yogures se llevó a cabo por un panel de catadores empleando una escala hedónica. Los yogures se elaboraron con los fermentos Ύο-Flex X16" de la marca CHR HANSEN según el protocolo descrito para las fabricaciones a pequeña escala para estos fermentos. Los fermentos de la citada marca incluyen cepas de bacterias de las especies Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus. La nueva cepa probiótica se hizo crecer en leche y se inoculó a 6 log ufc/ml al mismo tiempo que los fermentos comerciales. Se elaboraron simultáneamente yogures controles sin probiótico y con la cepa comercial probiótica Bifidobacterium animalis Bb12 aislada de un producto comercial probiótico de la marca Hacendado.
A la vista de los resultados del ensayo, la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 presentó olores agradables al cultivarse en leche y en yogures fabricados con fermentos comerciales. Se observó un descenso moderado (0,6 unidades logarítmicas decimales) de Streptococcus thermophilus en yogur elaborado con la nueva cepa como cultivo adjunto, aunque sus niveles permanecieron muy por encima del mínimo de 7 log ufc/ml establecido en la Norma de Calidad para el yogur por el Real Decreto 179/2003 (ver Tabla 7).
Tabla 7. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 empleada como adjunta al fermento en la elaboración de yogur. La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). a) Recuento de CECT 8178 al finalizar la fermentación; b) Recuento de las bacterias del fermento comercial sin y con la cepa CECT 8178. a) log ufc/ml (media ± DS)
B. breve CECT 8178 al final de la fermentación 0 h 5 h
6,85±0,05 4,91 ±0,35 b) log ufc/ml (media ± DS)
Cepas del fermento comercial sin y con CECT 8178 0 h 5 h
L. bulgaricus 2,92±0,31 4,76±0,03
L. bulgarícus+B. breve CECT 8178 4,65±0, 16
S. thermophilus 7,34±0,35 9, 14±0,09
S. thermophilus+B. breve CECT 8178 8,55±0,24
Ensayo de superviviencia a la digestión simulada
Se estudió la capacidad de la cepa CECT 8178 inoculada en leche para sobrevivir al paso por el tracto gastrointestinal, simulado mediante la exposición consecutiva del cultivo de la cepa en leche al paso por el estómago y posteriormente por el intestino. El paso por el estómago se simuló mediante la inoculación al 1 % del cultivo en leche a tampón PBS (Phosphate-Buffered Saline pH 7,4, en mM: NaCI 137; KCI 2,7, Na2HP04 8; KH2P04 2), ajustado a pH 3, e incubado a 37°C durante 1 hora y, a continuación, esta suspensión se reinoculó (al 1 %) en tampón PBS con sales biliares (oxgall) al 0, 15%, ajustado a pH 8 y se incubó a 37°C durante 1 hora.
Tal y como se desprende de los resultados de la Tabla 8 adjunta, la nueva cepa CECT 8178 sobrevivió al paso por el tracto gastrointestinal in vitro al 100% al igual que la cepa comercial Bifidobacterium animalis Bb12. La cepa comercial Bifidobacterium longum BB536 presentó, sin embargo, en las condiciones empleadas en este ensayo, un fuerte descenso en sus niveles tras el proceso simulado.
Este ensayo confirma in vitro la capacidad in vivo de la cepa objeto de patente, atribuida de forma natural por su origen (par madre-hijo) para sobrevivir el paso por el tracto gastrointestinal humano.
Tabla 8. Supervivencia de la nueva cepa Bifidobacterium breve CECT 8178 tras la digestión simulada como exposición consecutiva a PBS a pH 3 (37°C/1 h) y PBS con oxgall al 0, 15% a pH 8 (37°C/1 h). La supervivencia se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia.
Recuento de viables (media ± DS)
Cepa Origen 0 h 2 h
B. breve CECT 8178 Leche materna 8,70±0, 18 8,71 ±0,20
R animalis Bb12 comercial 9,36±0, 10 9,34±0,06
R longum BB536 comercial 9,25±0,08 4,06±0,37
Ensayo de inhibición del crecimiento de patógenos
Se estudió el efecto de la nueva cepa CECT 8178 sobre la supervivencia de Salmonella entérica serovar Enteritidis CECT 4300 o Cronobacter sakazakii CECT 585, en leche. Para llevar a cabo el ensayo, se creció la nueva cepa al 1 % en la leche durante 24 h a 37°C, en condiciones de anaerobiosis. A continuación, se añadió el patógeno en estudio a aproximadamente 3 log ufc/ml. Los cocultivos se incubaron 24 h, en condiciones de anaerobiosis, a 37°C. Los recuentos de los patógenos y de la nueva cepa se realizaron a las 0 h y 24 h, en medio TSA (Tryptic Soy Agar en g/l: digerido pancreático de caseína 15,0s digerido papaico de harina de soja 5,0; cloruro sódico 5,0; agar 15,0) y RCA, respectivamente.
Tal y como se desprende de la Tabla 9 adjunta, a las 24 h de cocultivo a 37°C, se registró un descenso significativo del crecimiento de las cepas patógenas en la leche adicionada con las bifidobacterias. La nueva cepa CECT 8178 dio lugar a una disminución del crecimiento de los patógenos entéricos Salmonella Enteritidis y Cronobacter sakazakii por lo que podría actuar como un sistema de barrera adicional en el intestino ante la presencia eventual de dichos patógenos.
Los niveles de las bifidobacterias en leche tras su cultivo durante 24 h a 37°C fueron de 6,68±1 ,65 log ufc/ml para la cepa CECT 8178, 7,46±0,02 log ufc/ml para Bifidobacterium animalis Bb12 y 7,88±0, 17 log ufc/ml para Bifidobacterium longum BB536.
Tabla 9. Crecimiento en leche de Salmonella Enteritidis CECT 4300 y Cronobacter sakazakii CECT 858 en cocultivo con la nueva cepa CECT 8178. El crecimiento se expresa como logaritmo decimal de unidades formadoras de colonias por mi de cultivo (log ufc/ml). a) Recuento de Salmonella Enteritidis y b) Recuento de Cronobacter sakazakii. Las cepas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente, se incluyen como cepas de referencia. a) Recuento de S. Enteritidis (log ufc/ml) log ufc/ml (media ±DS)
Cepa 0 h 24 h
S. Enteritidis 3, 14±0,36 8,63±0,40
S. Enteritidis+ B. breve CECT 8178 6,30±1 ,42
S. Enteritidis + B. animalis Bb12 5,86±1 ,43
S. Enteritidis + B. longum BB536 4,31 ±1 ,01 b) Recuento de C. sakazakii (log ufc/ml) log ufc/ml (media ±DS)
Cepa 0 h 24 h
C. sakazakii 3,32±0,36 9,21 ±0,39
C. sakazakii + B. breve CECT 8178 6,94±1 ,57
C. sakazakii + B. animalis Bb12 4,58±0,85
C. sakazakii + B. longum BB536 3,88±0,44 Ensayo de formación de biofilms
La formación de biofilms por comunidades bacterianas simbióticas en el mucus del epitelio intestinal proporciona múltiples beneficios al organismo, tales como promover la digestión de los contenidos alimentarios del lumen o el fortalecimiento de las defensas del huésped (Bollinger et al. 2007).
En este ensayo se evaluó la capacidad de la nueva cepa probiótica para formar biofilms en placas de microtiter. La cepa se creció por duplicado en placas de agar RCA que se incubaron en condiciones de anaerobiosis a 37°C, durante 48 h. Las bacterias crecidas se resuspendieron en 1 mi de TSB (Tryptic Soy Broth en g/l: digerido pancreático de caseína 15,0s digerido papaico de harina de soja 5,0; Cloruro sódico 5,0) suplementado con 20 g/l de proteosa-peptona (TSBm), y en 1 mi de TSBm suplementado con 0,2% de sales biliares (oxgall). A partir de estas suspensiones se inocularon 8 réplicas en pocilios de las placas de microtiter con 200 microlitros.
Paralelamente, se estudió la capacidad de formación de biofilms de las cepas probióticas Bifidobacterium animalis Bb12 y Bifidobacterium longum BB536 aisladas de productos comerciales probióticos de las marcas Hacendado y Morinaga, respectivamente. Lactobacillus rhamnosus GG, marca registrada por Valió Ltd y aislada a partir de leche fermentada Kaiku Actif de la marca Kaiku, Corporación Alimentaria, S.L, se incluyó como control positivo de formación de biofilms y la cepa Bifidobacterium pseudolongum INIA P2, perteneciente a la colección de cultivos bacterianos del Dpto. de Tecnología de Alimentos del INIA, como control negativo. Las placas se incubaron a 37°C, en condiciones de anaerobiosis durante 48 h, y se cuantificó la capacidad para formar biofilms mediante tinción con cristal violeta y medición posterior de la densidad óptica en los pocilios a 570 nm.
En la Figura 2 se muestran los porcentajes de formación de biofilms respecto de la cepa empleada como control positivo (100%). En ausencia de sales biliares (oxgall), sólo la cepa probiótica Lactobacillus rhamnosus GG (control positivo) y Bifidobacterium animalis Bb12 formaron biofilms. En presencia de sales biliares (oxgall), se observó un incremento importante en la formación de biofilms en todas las cepas ensayadas, y sobre todo en la cepa objeto de patente donde se observó una capacidad superior a la de las bifidobacterias comerciales ensayadas.
Este ensayo confirma la capacidad de la cepa reivindicada para formar biofilms in vitro en presencia de sales biliares, presentes en el intestino en las cantidades empleadas en el estudio (0,2%), por lo que, potencialmente, este hecho posibilitaría su implantación o su supervivencia prolongada en el intestino. Ensayo de producción de exopolisacáridos La producción de exopolisacáridos es una propiedad de interés en bacterias probióticas ya que se asocia con la capacidad de interferir con patógenos en la adhesión al mucus intestinal humano y con la actividad inmunomoduladora. Por otra parte, la producción de exopolisacáridos podría contribuir a la protección celular y por tanto a una mejor supervivencia bacteriana a los procesos tecnológicos o a la digestión.
En este ensayo se llevó a cabo una observación macroscópica de la producción de exopolisacáridos, evaluándose la capacidad de formar exopolisacáridos como "carácter ropy" al crecer en medios sólidos suplementados con azúcares (por carácter o fenotipo "ropy" se define la capacidad de las cepas para formar hilos al levantar la masa celular crecida sobre un medio de cultivo sólido con un asa de siembra). Para ello, se hizo crecer la nueva cepa en agar MRS (Man Rogosa Sharpe en g/l: proteosa peptona n° 3 10,0; extracto de carne 8,0; extracto de levadura 4,0; glucosa 20,0; monoleato de sorbitán 1 mi; fosfato dipotásico 2,0; acetato de sodio 5,0; citrato de amonio 2,0; sulfato de magnesio 0,2; sulfato de manganeso 0,05; agar 13,0; pH final 6,4) y TSA (Tryptic Soy Agar en g/l: digerido pancreático de caseína 15,0; digerido papaico de harina de soja 5,0; cloruro sódico 5,0; agar 15,0) con 20 g/l de proteosa-peptona, suplementados con sacarosa al 5% o lactosa al 5%.
De la observación, se desprende que la nueva cepa, al igual que la cepa comercial Bifidobacterium animalis Bb12, es mucosa. Se observa en ambas una capacidad moderada para formar exopolisacáridos (fenotipo "ropy") que es más marcada en presencia de sacarosa que con lactosa. La cepa comercial Bifidobacterium longum BB536 no presentó este carácter en los medios y condiciones estudiados.
La capacidad para producir polisacáridos favorecería la permanencia de la nueva cepa en el intestino.
A pesar de que se ha hecho referencia a una realización concreta de la invención, es evidente que el experto en la materia podrá introducir variantes o modificaciones, o substituir los detalles mencionados por otros técnicamente equivalentes, sin apartarse del ámbito de protección definido por las reivindicaciones adjuntas.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Microorganismo aislado de una leche materna y de heces de un lactante alimentado con dicha leche materna, que consiste en una cepa de la especie Bifidobacterium breve, depositada con el número CECT 8178 en la "Colección Española de Cultivos Tipo" de Valencia, España.
2. Microorganismo según la reivindicación 1 , en el que dicha cepa ha sido aislada de la leche materna de una madre de origen humano y de las heces de su respectivo hijo lactante.
3. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha cepa se presenta en forma de un cultivo biológicamente puro.
4. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha cepa se presenta en forma de células viables.
5. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha cepa se presenta en forma de células no viables.
6. Uso del microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores como material probiótico.
7. Uso del microorganismo según la reivindicación 6, como material probiótico en la elaboración y/o preparación de productos lácteos y sus derivados.
8. Uso del microorganismo según la reivindicación 7, como material probiótico en productos lácteos, o derivados de productos lácteos, refrigerados.
9. Uso del microorganismo según la reivindicación 7 como material probiótico en productos lácteos, o derivados de productos lácteos, congelados.
10. Uso del microorganismo según la reivindicación 7 como cultivo adjunto al fermento en productos lácteos y/o derivados de productos lácteos.
1 1. Uso del microorganismo según la reivindicación 7 como material probiótico en productos lácteos, o derivados de productos lácteos, liofilizados.
12. Composición que comprende un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
13. Composición según la reivindicación 12, que comprende por lo menos un producto alimentario.
14. Composición según la reivindicación 13, en el que dicho producto alimentario es seleccionado de un grupo que comprende leche y productos derivados de la leche.
15. Composición según la reivindicación 14, en el que dicho producto alimentario es una leche de fórmula infantil, preferiblemente, una leche maternizada.
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