WO2014074012A1 - Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам - Google Patents

Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам Download PDF

Info

Publication number
WO2014074012A1
WO2014074012A1 PCT/RU2013/000394 RU2013000394W WO2014074012A1 WO 2014074012 A1 WO2014074012 A1 WO 2014074012A1 RU 2013000394 W RU2013000394 W RU 2013000394W WO 2014074012 A1 WO2014074012 A1 WO 2014074012A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microorganisms
nutrient medium
incubation
medium
sensitivity
Prior art date
Application number
PCT/RU2013/000394
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Виктор Вениаминович ТЕЦ
Георгий Викторович ТЕЦ
Original Assignee
Tets Viktor Veniaminovich
Tets Georgy Viktorovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tets Viktor Veniaminovich, Tets Georgy Viktorovich filed Critical Tets Viktor Veniaminovich
Priority to EP13853343.5A priority Critical patent/EP2918672B1/en
Priority to ES13853343T priority patent/ES2739905T3/es
Priority to PL13853343T priority patent/PL2918672T3/pl
Priority to US14/439,717 priority patent/US10221440B2/en
Publication of WO2014074012A1 publication Critical patent/WO2014074012A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

Definitions

  • the invention relates to means for determining the sensitivity of various microorganisms, including bacteria and fungi, causing diseases of people, animals, plants, as well as causing damage to food and industrial products, to antimicrobial substances - antibiotics and antiseptics, and can be used mainly , in medicine, as well as in veterinary medicine, agriculture and industry.
  • Known methods for determining sensitivity to antimicrobial agents include pre-isolation of a pure microorganism culture and its identification.
  • the method is also based on the preliminary selection of a pure culture of the alleged pathogen, followed by their exposure in the wells of the panel. Genetic methods can identify some of the studied genes antibiotic resistance in identified bacteria or directly in pathological material. This method is relatively fast, but so far it does not allow to fully assess the sensitivity to antimicrobial agents. This is due to the lack of knowledge of a significant part of microorganisms and, as a result, the lack of data on their genome and antibiotic sensitivity genes. The second reason is that even in known and cultured bacteria, resistance to one antimicrobial drug can be encoded by completely different genes, many of which are still not studied.
  • a known method for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances including the collection of biological material and the selection of a pure culture of the microorganism.
  • biological material is seeded on nutrient media that create favorable conditions for the growth of a particular microorganism, which is believed to cause disease or spoilage of products and materials. If the microorganism grows, carry out its identification.
  • a known method for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances including sampling biological material, cultivating the microorganisms contained therein in a nutrient medium containing no antimicrobial substance, introducing into the medium of the investigated antimicrobial substance and subsequent evaluation of the result; biological material is cultivated in sugar broth for at least two hours, after which standard disks with the studied antibiotics are introduced and incubated for at least two hours, the result is estimated by the degree of turbidity of the contents in the sample, assuming that the lower the turbidity, the higher the sensitivity of microorganisms to antibacterial substances, RU 2262533C2.
  • the present invention is based on the solution of the problem of increasing the accuracy of determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances.
  • a dense rich nutrient medium is used for the cultivation of microorganisms, the studied antimicrobial substance is introduced into the nutrient medium before the microorganisms are cultured in a concentration close to the maximum attainable at the place of collection of biological material, and microorganisms are inoculated into the nutrient medium, not containing an antimicrobial substance, while assessing the sensitivity of microorganisms to an antimicrobial substance is carried out after singing the phenomenon of visible growth of microorganisms in the control crop; Brucella agar or Columbia agar medium is used as a dense rich nutrient medium for bacterial incubation, and Saburo medium is used for incubation of fungi; human or animal blood serum
  • the claimed invention unlike the prototype and other known analogues, does not imply a determination of the sensitivity of certain microorganisms characteristic of a given disease in humans, animals, plants or damage and spoilage of products and materials.
  • a new principle underlying the claimed method is the fact that they try to grow, if possible, all microorganisms contained in the collected material and then determine which antimicrobial substance most effectively suppresses the totality of these microorganisms, without actually or presumably identifying these microorganisms , as is the case in known methods.
  • a dense rich nutrient medium allows you to grow the maximum number of different microorganisms contained in the sample, it is important that the antimicrobial substance under study is introduced into the nutrient medium before microorganisms are cultured. This ensures the prevention of changes in the total composition of microorganisms during the cultivation process compared to the starting material. It is important that the antimicrobial substance is introduced in a concentration close to the maximum achievable at the site of collection of biological material, and not in an arbitrary concentration, as is the case with the introduction of antimicrobial substances on standard disks.
  • the sensitivity of microorganisms is determined not by the degree of turbidity of the contents in the sample, which may be due to inhibition of microbes that are not pathogenic (harmful), but by the results of the appearance of visible growth of microorganisms in the control crop.
  • Example 1 Express determination of sensitivity to bacteria azithromycin, when sowing material obtained from a patient with an infection of the urinary system.
  • Culture medium dense, rich - brucella agar, enriched with horse serum and human and sheep erythrocytes. Azithromycin was preliminarily added to the medium at the maximum concentration in the urine of 4 ⁇ g / ml.
  • Material was sown in an amount of 0.2 ml in Petri dishes.
  • the control used a similar medium and cultivation conditions. Inoculation was incubated at a temperature of 37 ° C.
  • Example 2 Express determination of sensitivity to bacterial ampicillin, when sowing material obtained from an animal (dog) with a wound infection.
  • Culture medium Columbia agar enriched with horse serum with sheep erythrocytes, vitamins and amino acids. Apicillin was added on Wednesday at the maximum concentration attainable at the sampling site - 1 ⁇ g / ml.
  • Material from the wound was seeded with a swab on Wednesday in a Petri dish.
  • the control used the same medium and culture conditions without ampicillin.
  • Inoculation was incubated at a temperature of 37 ° C.
  • Example 3 The choice of an antiseptic for the destruction of household mold obtained from infected plaster.
  • Material for research pieces of affected plaster with signs of mold growth.
  • a suspension of plaster (0.5 g) was prepared in 1.0 ml of isotonic sodium chloride solution.
  • Culture medium Saburo agar, enriched with mineral components, is placed in three Petri dishes. The following preparations were preliminarily added on Wednesday: the first cup is an antiseptic Multicid, a hydrazine derivative of polyguanidine, a solvent of water in a final concentration of 0.5% (can be achieved without changing the properties of the plaster and similar materials - color, smell and mechanical properties); the second cup is antiseptics: Teflex is a complex of guanidine copolymers. The solvent is water (0.5%); the third cup is control without antiseptics.
  • the first cup is an antiseptic Multicid, a hydrazine derivative of polyguanidine, a solvent of water in a final concentration of 0.5% (can be achieved without changing the properties of the plaster and similar materials - color, smell and mechanical properties); the second cup is antiseptics: Teflex is a complex of guanidine copolymers. The solvent is water (0.5%); the third cup is control without antiseptics.
  • the material was seeded with a bacteriological loop.
  • Crops were cultivated at 30 ° C. The results were taken into account after 4, 6, 12, 20, 24 and 48 hours after sowing.
  • Example 4 The choice of antibiotic in the treatment of diseases of the respiratory system.
  • the material for the study is the sputum of the patient.
  • Culture medium Brucella agar enriched with horse serum and human red blood cells. Haemophilus influenzae bacteria were added to the environment, causing diseases of the respiratory system and promoting the growth of another pathogen - Streptococcus pneumoniae, which is very poorly cultivated under normal conditions. Levofloxacin was also added to the medium at a maximum concentration achievable in sputum - 10 ⁇ g / ml.
  • Freshly collected sputum of the patient was diluted 5 times in an isotonic sodium chloride solution, inoculated with 0.2 ml / cup with a spatula and incubated at a temperature of 37 ° C. The results were taken into account after 4, 6, 12, 20 and 24 hours after sowing.
  • Example 5 Express determination of sensitivity to a mixture of antibiotics gentamicin (acts mainly on aerobic bacteria) and metronidazole (active against anaerobic bacteria and microarophiles), when sowing material obtained from a patient with periodontal disease.
  • Material for research freshly collected detachable gingival pockets.
  • Nutrient medium Columbia agar medium enriched with sheep erythrocytes and horse serum was used for cultivation under aerobic conditions. To identify anaerobic microorganisms, Shedler agar containing sheep erythrocytes and serum was used. On Wednesday, 2 antibiotics were added: gentamicin (active against a wide range of aerobes) and metronidazole, which selectively acts on anaerobic bacteria.
  • the medium in plates N ° 1 and N ° la contains gentamicin; the medium in the JNS 2 and ⁇ "2a plates contains metronidazole; the medium in ⁇ ° 3 and ⁇ ° Za cups contains gentamicin and metronidazole; in cups JST "4 and JVT2 4 there is only a nutrient medium (control).
  • the detachable gingival pocket was diluted 5 times with isotonic raster sodium chloride, sowed at 0.05 ml / cup (inoculated with a spatula).
  • Crops were cultured for aerobes (cups 1-4) in a conventional thermostat and for anaerobes (cups 1a - 4a) in a thermostat under anaerobic conditions at 37 ° C for 48 - 72 hours.
  • To create anaerobic conditions used gas-generating packages. The results were taken into account after 4, 8, 12, 20, 24, and 48 hours after seeding (anaerobic bacteria are characterized by continued growth).
  • the inventive method in contrast to the prototype allows you to evaluate the sensitivity to a mixture of antimicrobial agents.
  • Example 6 Express determination of the sensitivity of fungi, pathogens of plants (powdery mildew) antifungal drugs.
  • Material for research washing off an isotonic solution of sodium chloride from the affected areas of the plant leaf, showing signs of fungal growth.
  • Culture medium Saburo agar, enriched with mineral components, is placed on a six-well plate. To prevent bacterial growth, 0.01 mg / L gentamicin was added to the agar. On Wednesday, the tested antifungal drugs were also added: 1st hole - propicanozole, in a final concentration of 1%; 2nd well - nystatin (0.4 mg / l); 3rd hole - control without antifungal drugs.
  • Crops were cultivated at 30 ° C. The results were taken into account after 6, 8, 12, 20, 24 and 48 hours after sowing.
  • IA Industry Applicability

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к средствам для определения чувствительности различных микроорганизмов, в том числе, бактерий и грибов, к антимикробным веществам. Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам включает забор биологического материала, инкубацию содержащихся в нем микроорганизмов на питательной среде, введение в питательную среду исследуемого антимикробного вещества с последующей оценкой результата. Для культивирования микроорганизмов используют плотную богатую питательную среду. Исследуемое антимикробное вещество вводят в питательную среду до начала культивирования микроорганизмов в концентрации, близкой к максимально достижимой в месте забора биологического материала. Оценку чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу осуществляют после появления видимого роста микроорганизмов в контрольном посеве. К питательной среде могут быть добавлены витамины, и/или аминокислоты, и/или пищевые добавки.

Description

Способ определения чувствительности микроорганизмов к
антимикробным веществам
Область техники
Изобретение относится к средствам для определения чувствительности различных микроорганизмов, в том числе, бактерий и грибов, вызывающих заболевания людей, животных, растений, а также являющихся причиной порчи пищевой и промышленной продукции, к антимикробным веществам - антибиотикам и антисептикам, и может быть использовано, преимущественно, в медицине, а также в ветеринарии, сельском хозяйстве и промышленности.
Предшествующий уровень техники Одной из наиболее серьезных проблем современной медицины, ветеринарии, растениеводства и промышленности является жизнедеятельность различных микроорганизмов, и прежде всего бактерий и грибов, приводящих к возникновению болезней и порче продуктов. Борьба с бактериями и грибами остается недостаточно эффективной вследствие быстрой изменчивости микроорганизмов, приводящей к появлению устойчивых форм, неумения выращивать значительное число микробов и отсутствием эффективных методов подбора противомикробного средства. В этой связи в первые 3-4 дня антимикробные препараты применяются эмпирически. В медицине и ветеринарии при этом используют антибиотики широкого спектра действия, число которых ограничено, вследствие чего, быстро формируется и распространяется устойчивость к ним, что приводит к осложнениям и не редко, к летальному исходу в медицине и ветеринарии и к необратимой порче и разрушению пищевой и промышленной продукции.
В этой связи быстрая и точная оценка чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам - антибиотикам и антисептикам остается актуальной и нерешенной проблемой.
Известные способы определения чувствительности к антимикробным препаратам включают предварительное выделение чистой культуры микроорганизма и её идентификацию.
Однако выделение чистой культуры микроорганизмов обусловливает ряд негативных последствий, прежде всего, потерю времени (48-96 часов). Кроме того, при наличии двух и более микроорганизмов часть из них не выделяется в виде чистой культуры. Следует также указать, что вообще не выделяются так называемые «пока не культивируемые» (not-yet-cultivated) микробы, которые по разным данным могут составлять до 90-95%. Трудности в работе с такими микробами связаны, прежде всего, с отсутствием методов их выделения, выращивания и идентификации. Последнее определяется организацией жизни бактерий в составе микробных сообществ - биопленок, которая определяет большую взаимозависимость микроорганизмов. Эти условия пока невоспроизводимы в лаборатории, см. Lewis К., Epstein S.S. Persisters, biofilms, and the problem of culturability. in incultivated microorganisms. In Series: Microbiology Monographs. Steinbuchel A. (ed.). Berlin / Heidelberg: Springer; 2009. 181-194. Epstein S.S. General model of microbial uncultivability in uncultivated microorganisms. In Series: Microbiology Monographs. Steinbuchel A. (ed.). Berlin / Heidelberg: Springer; 2009, c.c.131-150.
Известен способ, при котором антимикробные вещества определенным образом нанесены на полоски, см. Isenberg H.D. Essential Procedures for clinical Microbiology, ASM-Press, 1998, USA, c.c. 235-240. Метод серийных разведений включает засев чистой культуры на специальную жидкую среду Muller Hinton, в которую также добавлены антимикробные вещества (антибиотики) в разных концентрациях, см. Isenberg H.D. Essential Procedures for clinical Microbiology, ASM-Press 1998, USA, c.c. 216-223. Существуют способы полуавтоматического определения антибиотикочувствительности, при котором детекция проводится на специальном оборудовании (например, панели Vitec - 2 BioMerie). Однако в основе способа также лежит предварительное выделение чистой культуры предполагаемого возбудителя с последующей их экспозицией в лунках панели. Генетические методы позволяют выявлять некоторые изученные гены антибиотикоустойчивости у идентифицированных бактерий или прямо в патологическом материале. Данный метод является сравнительно быстрым, однако пока не позволяет полностью оценить чувствительность к антимикробным препаратам. Это связано с неизученностью значительной части микроорганизмов и, как следствие, отсутствием данных по их геному и генам антибиотикочувствительности. Вторая причина связана с тем, что даже у известных и культивируемых бактерий устойчивость к одному анитимикробному препарату может кодироваться совершенно различными генами, многие из которых по-прежнему остаются не изученными.
Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу, включающий забор биологического материала и выделение чистой культуры микроорганизма. Для выделения чистой культуры биологический материал засевают на питательные среды, которые создают благоприятные условия для роста определенного микроорганизма, который предположительно вызывает заболевания или порчу продуктов и материалов. В случае, если микроорганизм вырастает, осуществляют его идентификацию. После этого определяют его чувствительность к антимикробному веществу, для чего проводят засев выделенной чистой культуры микроорганизма на питательную среду Muller Hinton или аналогичную не богатую среду, не содержащую антимикробное вещество, наложение на поверхность засеянной микроорганизмами питательной среды бумажных дисков, пропитанных различными антимикробными веществами, инкубацию микроорганизмов на питательной среде в присутствии исследуемых антимикробных веществ с последующей оценкой результата, см. Isenberg H.D. Essential Procedures for clinical Microbiology, ASM-Press, 1998, USA, 1998, c.c. 208 - 215.
Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу (антибиотикам), включающий забор биологического материала, культивирование содержащихся в нем микроорганизмов на питательной среде, не содержащей антимикробное вещество, введение в среду исследуемого антимикробного вещества и последующую оценку результата; биологический материал культивируют в сахарном бульоне не менее двух часов, после чего вводят стандартные диски с исследуемыми антибиотиками и дополнительно инкубируют в течение не менее двух часов, результат оценивают по степени мутности содержимого в пробе, считая, что чем меньше мутность, тем выше чувствительность микроорганизмов к антибактериальным веществам, RU 2262533С2.
Недостатки данного способа, принятого за прототип настоящего изобретения, состоят в следующем:
- весьма низкая точность определения результатов, поскольку уменьшение мутности содержимого в пробе может быть связано с угнетением роста микробов, не являющихся теми возбудителями, чувствительность которых к антимикробному веществу исследуется;
- нахождение биологического материала в питательной среде, не содержащей антимикробное вещество продолжительное время (более двух часов) за счет избирательного роста некоторых микроорганизмов приводят к изменению общего состава микроорганизмов по сравнению с исходным материалом, что резко искажает результаты исследования;
- введение антимикробного вещества в питательную среду на стандартных дисках имеет смысл только в условиях выделенной чистой культуры, поскольку только для чистых культур установлены нормы величин зон угнетения роста микроорганизмов, которые позволяют оценить их чувствительность и устойчивость к данному антимикробному веществу. В данном способе, поскольку чистая культура микроорганизма не выделяется, невозможно учесть ни особенности микроорганизма, ни концентрацию антимикробного вещества, максимально возможную в месте выделения биологического материала;
- использование не богатой жидкой питательной среды не обеспечивает рост большей части микроорганизмов.
В основу настоящего изобретения положено решение задачи повышения точности определения чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу.
Раскрытие изобретения
Согласно изобретению в способе определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам, включающем забор биологического материала, инкубацию содержащихся в нем микроорганизмов на питательной среде, введение в питательную среду исследуемого антимикробного вещества с последующей оценкой результата, для культивирования микроорганизмов используют плотную богатую питательную среду, исследуемое антимикробное вещество вводится в питательную среду до начала культивирования микроорганизмов в концентрации, близкой к максимально достижимой в месте забора биологического материала, а также осуществляют контрольный посев микроорганизмов в питательную среду, не содержащую антимикробное вещество, при этом оценку чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу осуществляют после появления видимого роста микроорганизмов в контрольном посеве; в качестве плотной богатой питательной среды для инкубации бактерий используют среду бруцелла агар или среду Колумбия агар, а для инкубации грибов используют среду Сабуро; к питательной среде может быть добавлена сыворотка крови человека или животных и/или эритроциты; к питательной среде могут быть добавлены витамины, и/или аминокислоты, и/или пищевые добавки; питательная среда может дополнительно содержать микроорганизмы, способствующие при совместном культивировании росту исследуемых микроорганизмов; в питательную среду для инкубации грибов могут быть добавлены противобактериальные препараты; в питательную среду для инкубации бактерий могут быть добавлены противогрибковые препараты; инкубацию микроорганизмов могут осуществлять в аэробных условиях; инкубацию микроорганизмов могут осуществлять в анаэробных условиях; инкубацию могут осуществлять в присутствии одного или более дополнительных антимикробных веществ; питательную среду могут размещать в чашки Петри; питательную среду могут размещать на планшете из пластика или бумаги.
Заявителем не выявлены какие-либо технические решения, идентичные заявленному, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию «Новизна» («N»).
Заявленное изобретение в отличие от прототипа и других известных аналогов не предполагает определение чувствительности определенных микроорганизмов, характерных для данного заболевания человека, животных, растений или повреждения и порчи продуктов и материалов.
Новым принципом, положенным в основу заявленного способа, является то обстоятельство, что стараются вырастить по возможности все микроорганизмы, содержащиеся в забранном материале и затем определить, какое именно антимикробное вещество наиболее эффективно подавляет совокупность этих микроорганизмов, без того, чтобы реально или предположительно идентифицировать данные микроорганизмы, как это имеет место в известных способах.
То есть, для решения проблемы борьбы с источником заболеваний и порчи продуктов и материалов не требуется знать, что этот источник собой представляет, важно знать, какое средство позволяет устранить или уменьшить вредное воздействие этого источника.
Реализация отличительных признаков изобретения обеспечивает указанное выше принципиально новое свойство объекта изобретения и, соответствующий технический результат, состоящий в существенном повышении точности результатов исследования.
Плотная богатая питательная среда позволяет вырастить максимальное количество различных микроорганизмов, содержащихся в пробе, при этом важно, что исследуемое антимикробное вещество вводят в питательную среду до того, как осуществляется культивирование микроорганизмов. Это обеспечивает предотвращение изменения общего состава микроорганизмов в процессе культивирования по сравнению с исходным материалом. При этом важно, что антимикробное вещество вводится в концентрации, близкой к максимально достижимой в месте забора биологического материала, а не в произвольной концентрации, как это имеет место при введении антимикробного вещества на стандартных дисках. При этом оценку чувствительности микроорганизмов определяют не по степени мутности содержимого в пробе, что может быть связано с угнетением микробов, не являющихся патогенными (вредоносными), а по результатам появления видимого роста микроорганизмов в контрольном посеве.
Существенно новым в заявленном способе является то обстоятельство, что добавление в питательную среду некоторых микроорганизмов может способствовать при совместном культивировании с возбудителями болезней росту даже тех микроорганизмов в пробе, которые иначе являются «некультивируемыми». Указанные выше новые свойства заявленного способа обусловливают, по мнению заявителя, его соответствие требованию патентоспособности «Изобретательский уровень» («IS»). Краткое описание чертежей
В дальнейшем изобретение поясняется подробным описанием примеров его осуществления без ссылок на чертежи.
Лучший вариант осуществления изобретения
Реализация способа поясняется приведенными ниже примерами.
Пример 1. Экспресс определение чувствительности к азитромицину бактерий, при посеве материала, полученного у больного с инфекцией мочевыделительной системы.
Осуществляли забор биологического материала - мочи больного циститом.
Питательная среда: плотная, богатая - бруцелла агар, обогащенный лошадиной сывороткой и эритроцитами человека и барана. В среду предварительно добавили азитромицин в максимально достаточной в моче концентрации - 4 мкг/мл.
Материал высевали в количестве 0,2 мл в чашки Петри. В контроле использовали аналогичную среду и условия культивирования. Посев инкубировали при температуре 37°С.
Результат исследования. В контроле через 4-6 часов роста при температуре 37°С зарегистрировано образование газона. Таким образом, на плотной богатой питательной среде в контрольном посеве зарегистрирован рост большого числа разных неродственных бактерий, которые не дали роста в присутствии азитромицина, который может быть с успехом использован для лечения данного больного. При этом не потребовалось идентификация конкретных возбудителей и выделение чистой культуры. Ответ для назначения антибиотика был получен через 4 часа.
Пример 2. Экспресс определение чувствительности к ампициллину бактерий, при посеве материала, полученного у животного (собака) с раневой инфекцией.
Способ осуществляли аналогично описанному в примере 1. Материал для исследования: отделяемое из раны.
Питательная среда: агар Колумбия, обогащенный лошадиной сывороткой с эритроцитами барана, витаминами и аминокислотами. В среду добавлен апициллин в максимально достижимой в месте забора концентрации - 1 мкг/мл.
Материал из раны высеивали тампоном на среду в чашке Петри. В контроле использовали ту же среду и условия культивирования без ампициллина.
Посев инкубировали при температуре 37°С.
Результат исследования. В контроле через 4 - 6 часов роста при температуре 37°С зарегистрировано образование газона. На чашке с ампициллином рост бактерий не зарегистрирован.
Таким образом, на плотной богатой среде зарегистрирован рост большого числа разных неродственных бактерий, которые не давали роста в присутствии ампициллина, который может быть с успехом использован для лечения данного животного. При этом не потребовалась идентификация конкретных возбудителей и выделение чистой культуры. Ответ для назначения антибиотика был получен через 4 часа.
Пример 3. Выбор антисептика для уничтожения бытовой плесени, полученной из зараженной штукатурки.
Материал для исследования: кусочки пораженной штукатурки, имеющие признаки роста плесени. Готовили взвесь штукатурки (0,5 г) в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия.
Питательная среда: Сабуро агар, обогащенный минеральными компонентами, размещен в трех чашках Петри. В среду предварительно добавлены препараты: первая чашка - антисептик Мультицид, гидразиновое производное полигуанидина, растворитель вода в конечной концентрации 0,5 % (может быть достигнута без изменения свойств штукатурки и подобных материалов - цвета, запаха и механических свойств); вторая чашка - антисептики: Тефлекс - комплекс сополимеров гуанидина. Растворитель - вода (0,5 %); третья чашка - контроль без антисептиков.
Материал засевали бактериалогической петлей.
Посевы культивировали при 30°С. Учет результатов производили через 4, 6, 12, 20, 24 и 48 часов после засева.
Результаты. Через 6 часов культивирования рост зарегистрирован в контрольной чашке и в чашке, где агар содержал препарат Тефлекс. В чашках с Мультицидом рост отсутствовал. Плесень оказалась устойчивой к препарату Тефлекс и чувствительна к антисептику Мультицид. При этом не потребовалась идентификация конкретных возбудителей и выделение чистой культуры. Ответ для выбора антисептика был получен через 6 часов.
Пример 4. Выбор антибиотика при лечении заболеваний дыхательной системы.
Материал для исследования - мокрота больного.
Питательная среда: Бруцелла агар, обогащенный лошадиной сывороткой и эритроцитами человека. В среду добавлены Haemophilus influenzae бактерии, вызывающие заболевания дыхательной системы и способствующие росту другого возбудителя - Streptococcus pneumoniae, очень плохо культивируемого в обычных условиях. В среду был также добавлен левофлоксацин в максимальной концентрации, достижимой в мокроте - 10 мкг/мл.
Свежесобранную мокроту больного развели в 5 раз в изотоническом растворе хлорида натрия, засеяли по 0,2 мл/чашка шпателем и инкубировали при температуре 37°С. Учет результатов производили через 4, 6, 12, 20 и 24 часа после засева.
Результаты. В контроле через 4 часа при температуре 37°С зарегистрировано образование газона. На среде с добавлением левофлоксацина: через 4, 6, 12, 20 и 24 часа - отсутствие роста. По данным микроскопии: через 24 часа рота на мазках, приготовленных из бактерий, выросших в контрольном образце - более 12 морфотипов микроорганизмов; на среде с добавлением левофлоксацина - отсутствие роста. Таким образом предложенная технология позволяет быстро в течение 4 часов выбрать антибиотик, который будет ингибировать рост всех потенциальных возбудителей данной патологии, в том числе практически не культивируемых в обычных условиях. При этом не потребовалась идентификация конкретного возбудителя и выделение чистой культуры.
Пример 5. Экспресс определение чувствительности к смеси антибиотиков гентамицина (действует преимущественно на аэробные бактерии) и метронидазола (активен по отношению к анаэробных бактериям и микроарофилам), при посеве материала, полученного от больного с заболеванием пародонта.
Материал для исследования: свежесобранное отделяемое десневого кармана.
Питательная среда: для культивирования в аэробных условиях использовали среду Колумбия агар, обогащенный эритроцитами барана и лошадиной сывороткой. Для выявления анаэробных микроорганизмов использовали агар Шедлера, содержащий эритроциты барана и сыворотку. В среду были добавлены 2 антибиотика: гентамицин (активен против широкого спектра аэробов) и метронидазол, избирательно действующий на анаэробные бактерии. Среда в чашках N° 1 и N° la содержит гентамицин; среда в чашках JNS 2 и Ν« 2а содержит метронидазол; среда в чашках Ν° 3 и Ν° За содержит гентамицин и метронидазол; в чашках JST" 4 и JVT2 4 находится только питательная среда (контроль).
Отделяемое десневого кармана развели в 5 раз изотоническим растровом хлорида натрия, засеяли по 0,05 мл/чашка (засев шпателем). Посевы культвировали для аэробов (чашки 1 - 4) в обычном термостате и для анаэробов (чашки 1а - 4а) в термостате в анаэробных условиях при 37°С 48 - 72 часа. Для создания анаэробных условий использовали газогенерирующие пакеты. Учет результатов производили через 4, 8, 12, 20, 24 и 48 часов после засева (анаэробные бактерии характеризуются продолжительным ростом).
Результаты. В контроле в аэробных (через 4 часа) и анаэробных (через 8 часов) условиях роста при температуре 37°С зарегистрировано образование газона. В аэробных условиях в опытной чашке N° 3 содержит (гентамицин и метронидазол) рост отсутствовал на всем протяжении наблюдения. В анаэробных условиях через 8 часов в опытной чашке JSTs За (содержит гентамицин и метронидазол) рост отсутствовал. Микробный рост зарегистрирован в чашках N2N2 1, la, 2 и 2а. Полученные данные свидетельствуют об эффективности смеси гентамицина и метронидазола и наличии устойчивых клонов при использовании препаратов по отдельности.
Таким образом заявляемый способ в отличие от прототипа позволяет оценивать чувствительность к смеси антимикробных препаратов.
Пример 6. Экспресс определение чувствительности грибов, возбудителей заболевания растений (мучнистая роса)противогрибковым препаратам.
Материал для исследования: смыв изотонического раствора хлорида натрия с пораженных участков листа растения, имеющих признаки роста грибов. Питательная среда: Сабуро агар, обогащенный минеральными компонентами, размещен на планшете с шестью лунками. Для предотвращения роста бактерий в агар был добавлен гентамицин в количестве 0,01 мг/л. В среду также добавлены испытуемые противогрибковые препараты: 1-я лунка - пропиканозол, в конечной концентрации 1%; 2-ая лунка - нистатин (0,4 мг/л); 3-я лунка - контроль без противогрибковых препаратов.
Делали смыв с 4 см3 пораженного участка 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия. Материал засевали бактериалогической петлей.
Посевы культивировали при 30°С. Учет результатов производили через 6, 8, 12, 20, 24 и 48 часов после засева.
Результаты. Через 8 часов культивирования зарегистрирован рост в контрольной лунке и в лунке, где агар содержал препарат нистатин. В лунке с пропиканозолом рост отсутствовал. Плесень оказалась устойчивой к препарату нистатин. При этом не потребовалась идентификация конкретного возбудителя и выделение чистой культуры. Ответ для выбора противогрибкового препарата был получен через 8 часов.
Промышленная применимость
Для реализации изобретения используются известные материалы и оборудование, что обусловливает, по мнению заявителя, соответствие изобретения критерию «Промышленная применимость» («IA»).

Claims

Формула изобретения
1. Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам, включающий забор биологического материала, инкубацию содержащихся в нем микроорганизмов на питательной среде, введение в питательную среду исследуемого антимикробного вещества с последующей оценкой результата, отличающийся тем, что для культивирования микроорганизмов используют плотную богатую питательную среду, исследумое антимикробное вещество вводят в питательную среду до начала культивирования микроорганизмов в концентрации, близкой к максимально достижимой в месте забора биологического материала, а также осуществляют контрольный посев микроорганизмов в питательную среду, не содержащую антимикробное вещество, при этом оценку чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу осуществляют после появления видимого роста микроорганизмов в контрольном посеве.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве плотной богатой питательной среды для инкубации бактерий используют среду бруцелла агар или среду Колумбия агар, а для инкубации грибов используют среду Сабуро.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что к питательной среде добавляют сыворотку крови человека или животных и/или эритроциты.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что к питательной среде добавляют витамины, и/или аминокислоты, и/или пищевые добавки.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что питательная среда дополнительно содержит микроорганизмы, способствующие при совместном культивировании росту исследуемых микроорганизмов.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в питательную среду для инкубации грибов добавляют противобактериальные препараты.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в питательную среду для инкубации бактерий добавляют противогрибковые препараты,
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубацию микроорганизмов осуществляют в аэробных условиях.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубацию микроорганизмов осуществляют в анаэробных условиях.
10. Способ по п.1, отличающийся т е м , что инкубацию осуществляют в присутствии одного или более дополнительных антимикробных веществ.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что питательную среду размещают в чашки Петри.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что питательную среду размещают на планшете из пластика или бумаги.
PCT/RU2013/000394 2012-11-06 2013-05-13 Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам WO2014074012A1 (ru)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13853343.5A EP2918672B1 (en) 2012-11-06 2013-05-13 Method for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances
ES13853343T ES2739905T3 (es) 2012-11-06 2013-05-13 Método para determinar la sensibilidad de microorganismos a sustancias antimicrobianas
PL13853343T PL2918672T3 (pl) 2012-11-06 2013-05-13 Sposób określania wrażliwości drobnoustrojów na substancje przeciwdrobnoustrojowe
US14/439,717 US10221440B2 (en) 2012-11-06 2013-05-13 Method for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012147280 2012-11-06
RU2012147280/15A RU2505813C1 (ru) 2012-11-06 2012-11-06 Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014074012A1 true WO2014074012A1 (ru) 2014-05-15

Family

ID=49957781

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2013/000394 WO2014074012A1 (ru) 2012-11-06 2013-05-13 Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10221440B2 (ru)
EP (1) EP2918672B1 (ru)
ES (1) ES2739905T3 (ru)
PL (1) PL2918672T3 (ru)
RU (1) RU2505813C1 (ru)
WO (1) WO2014074012A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10266869B2 (en) 2013-11-28 2019-04-23 Viktor Veniaminovich Tets Device for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial drugs
US10745662B2 (en) 2015-06-23 2020-08-18 Viktor Veniaminovich Tets Nutrient medium for cultivating bacteria

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2505813C1 (ru) 2012-11-06 2014-01-27 Виктор Вениаминович Тец Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам
RU2603100C1 (ru) * 2015-10-29 2016-11-20 Светлана Владимировна Андреева Способ оценки эффективности антимикробного воздействия антисептиков на бактерии, существующие в форме биопленки
RU2626183C1 (ru) * 2016-03-30 2017-07-24 Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования Московский медицинский Медико-стоматологический Университет им. А.И. Евдокимова Министерства Здравоохранения Российской Федерации РФ (ГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ) Способ определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов в биопленке к антимикробным средствам
RU2621306C1 (ru) * 2016-06-07 2017-06-01 государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ оценки антибактериального действия антисептиков на микробные биопленки
EP3607093A4 (en) * 2017-04-03 2021-01-06 Helixbind, Inc. MICROBIAL INFECTION IDENTIFICATION METHODS AND DEVICES
RU2666257C1 (ru) * 2017-08-25 2018-09-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный научно-практический центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ определения чувствительности бактериальных гемокультур к антибиотикам
RU2687264C1 (ru) * 2018-08-02 2019-05-13 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва" Способ определения типа противомикробного действия соединения, обладающего антимикробной активностью
KR102560716B1 (ko) * 2020-11-16 2023-07-27 울산과학기술원 이미지 분석을 통한 항생제 감수성을 평가하는 방법
WO2022214965A1 (en) * 2021-04-05 2022-10-13 Victor Tets Products for regulation of eukaryotic and microbial cells growth

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1066598A (ja) * 1996-07-29 1998-03-10 Academia Sinica 迅速抗菌剤感受性試験法
RU2231554C2 (ru) * 2002-09-24 2004-06-27 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Способ определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии
RU2262533C2 (ru) 2003-05-20 2005-10-20 Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам при лечении гнойно-воспалительного заболевания
RU2319746C2 (ru) * 2006-04-05 2008-03-20 ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора Способ ускоренного определения чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2533088A (en) 1949-04-26 1950-12-05 Baltimore Biolog Lab Petri dish cover
RU2061032C1 (ru) 1994-04-13 1996-05-27 Александр Александрович Иванов Устройство для проведения микробиологических тестов
WO1996028570A1 (en) 1995-03-09 1996-09-19 Xechem, Inc. A rapid method of and diagnostic kit for the detection of microorganisms
US7122338B2 (en) 1995-11-14 2006-10-17 Biocontrol Systems, Inc. Method for quantification of biological material in a sample
US6984499B2 (en) * 1997-10-02 2006-01-10 Idexx Laboratories, Inc. Method and apparatus for concurrently detecting pathogenic organisms and antimicrobial susceptibility
US6280946B2 (en) * 1998-08-07 2001-08-28 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the universal detection of bacteria and eucarya
US6153400A (en) * 1999-03-12 2000-11-28 Akzo Nobel N.V. Device and method for microbial antibiotic susceptibility testing
US20030138874A1 (en) 2001-11-09 2003-07-24 Taintor Read Robert Method and kit for rapid concurrent identification and antimicrobial susceptibility testing of microorganisms from broth culture
WO2004050675A1 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 Read Robert Taintor Concurrent microorganism identification and susceptibilities from broth
US20080318268A1 (en) 2005-07-22 2008-12-25 Merle E Olson Devices and Methods for the Selection of Agents with Efficacy Against Biofilm
RU69066U1 (ru) 2007-06-04 2007-12-10 Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Орловский государственный аграрный университет" (ФГОУ ВПО Орел ГАУ) Чашка петри
BRPI0815321A2 (pt) 2007-08-31 2015-02-10 Statens Seruminstitut "composição, plataforma, kit uso de uma composição, método de diagnóstico, método de manufatura da composição, método de manufatura da plataforma, método de manufatura do kit"
WO2009152389A2 (en) * 2008-06-11 2009-12-17 Katzenelson Omer Y Systems and methods to perform inhibition diagnostic testing
WO2010048511A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 Becton, Dickinson And Company Antibiotic susceptibility profiling methods
US20110318814A1 (en) 2008-12-31 2011-12-29 Kshirsagar Manjiri T Methods, kits and systems for processing samples
CA2768735A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Innovotech, Inc. Testing of biofilm for anti-microbial agent susceptibility
BY7596U (ru) 2010-10-25 2011-10-30
RU127749U1 (ru) 2012-10-01 2013-05-10 Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) Шпатель для посева культур микроорганизмов на плотные питательные среды в чашке петри
RU2505813C1 (ru) 2012-11-06 2014-01-27 Виктор Вениаминович Тец Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам
JP6326058B2 (ja) 2012-11-13 2018-05-16 アジレント・テクノロジーズ・インクＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 制御された媒体流動上での三次元組織測定のための装置、インサート、および方法
CN203904353U (zh) 2014-05-04 2014-10-29 江苏益玛生物科技有限公司 带计数功能和防培养基脱落的培养皿

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1066598A (ja) * 1996-07-29 1998-03-10 Academia Sinica 迅速抗菌剤感受性試験法
RU2231554C2 (ru) * 2002-09-24 2004-06-27 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Способ определения эффективности антибиотика для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии
RU2262533C2 (ru) 2003-05-20 2005-10-20 Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам при лечении гнойно-воспалительного заболевания
RU2319746C2 (ru) * 2006-04-05 2008-03-20 ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора Способ ускоренного определения чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EPSTEIN S.S.: "Series: Microbiology Monographs", 2009, SPRINGER, article "General model of microbial uncultivability in uncultivated microorganisms", pages: 131 - 150
ISENBERG H.D.: "Essential Procedures for clinical Microbiology", 1998, ASM-PRESS, pages: 208 - 215
ISENBERG H.D.: "Essential Procedures for clinical Microbiology", 1998, ASM-PRESS, pages: 216 - 223
ISENBERG H.D.: "Essential Procedures for clinical Microbiology", 1998, ASM-PRESS, pages: 235 - 240
LEWIS K.; EPSTEIN S.S.: "Series: Microbiology Monographs", 2009, SPRINGER, article "Persisters, biofilms, and the problem of culturability in incultivated microorganisms", pages: 181 - 194

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10266869B2 (en) 2013-11-28 2019-04-23 Viktor Veniaminovich Tets Device for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial drugs
US10745662B2 (en) 2015-06-23 2020-08-18 Viktor Veniaminovich Tets Nutrient medium for cultivating bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
US20150284764A1 (en) 2015-10-08
US10221440B2 (en) 2019-03-05
EP2918672A4 (en) 2016-07-06
EP2918672B1 (en) 2019-05-08
PL2918672T3 (pl) 2019-10-31
EP2918672A1 (en) 2015-09-16
RU2505813C1 (ru) 2014-01-27
ES2739905T3 (es) 2020-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2505813C1 (ru) Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам
US20100119486A1 (en) Antibacterial treatment method
Kukhtyn et al. Bacterial biofilms formation of Cattle mastitis pathogens
CN110123806A (zh) 表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抗猪链球菌药物中的应用
CN110151752A (zh) 一种茶多酚类组合物及其在制备抗猪链球菌药物中的应用
US8524468B2 (en) Method for detecting the presence or absence of methicillin resistant staphylococcus aureus (MRSA) in a test sample
RU2388827C1 (ru) Способ определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью к сочетаниям антибактериальных препаратов
Ayitso et al. Antimicrobial Activities of Microorganisms Obtained from the gut of Macrotermes michaelseni in Maseno, Kenya
Kolchyk et al. Biofilms of pathogenic bacteria in pig industry
RU2451085C2 (ru) Способ определения антибактериальной активности аэробных споровых микроорганизмов bacillus subtilis
RU2337360C1 (ru) Способ определения бактериостатических свойств антител к факторам вирулентности burkholderia pseudomallei
RU2542484C1 (ru) Способ стимулирования роста сельскохозяйственных культур
JP2015188407A (ja) 微生物の培養方法
RU2738858C1 (ru) Способ выделения некультивируемых форм стафилококков
US20040031447A1 (en) Animal papilla disinfectants and method of improving microbial environment
Gowri et al. In-Vitro antimicrobial screening of naphthalene acetic acid compounds.
RU2733431C2 (ru) Способ контроля ингибирующих свойств в отношении бактериальной флоры питательной среды для выделения бруцелл
RU2485183C1 (ru) Способ диагностики кандидоза верхних дыхательных путей у работников агропромышленного комплекса
Capurro Diagnostic and epidemiological studies of staphylococci in bovine mastitis
RU2451294C1 (ru) Способ выбора местных антисептических средств в различные периоды ожоговой болезни
RU2603100C1 (ru) Способ оценки эффективности антимикробного воздействия антисептиков на бактерии, существующие в форме биопленки
Sgariglia et al. Bioassays on microorganisms: antifungal and antibacterial activities
UA120725C2 (uk) Спосіб визначення антибактеріальної активності меду відносно klebsiella pneumoniae
Michailov et al. Preliminary research of the inhibitory activity of Elixir-5® on pathogenic bacterial strains
UA131010U (uk) Спосіб визначення хворих та носіїв збудника staphylococcus aureus безпосередньо в умовах виробництва

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13853343

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14439717

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013853343

Country of ref document: EP