WO2014059502A1 - Processo de produção de enzimas com fungo filamentoso penicillium echinulatum para uso na hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica - Google Patents

Processo de produção de enzimas com fungo filamentoso penicillium echinulatum para uso na hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica Download PDF

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WO2014059502A1
WO2014059502A1 PCT/BR2013/000431 BR2013000431W WO2014059502A1 WO 2014059502 A1 WO2014059502 A1 WO 2014059502A1 BR 2013000431 W BR2013000431 W BR 2013000431W WO 2014059502 A1 WO2014059502 A1 WO 2014059502A1
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enzymes
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bagasse
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enzymatic
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PCT/BR2013/000431
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Inventor
José Geraldo DA CRUZ PRADELLA
Aldo José PINHEIRO DILLON
Maria Teresa BORGES PIMENTA
Roberto RULLER
George DE MORAES ROCHA
Fabio SQUINA
Priscila DA SILVA DELABONA
Daniela ALVES RIBEIRO
Marli Camassola
Laísa DOS REIS
Roselei Claudete FONTANA
Original Assignee
Fundação Universidade De Caxias Do Sul - Ucs
Centro Nacional De Pesquisa Em Energia E Materiais-Cnpem
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to a novel and inventive enzyme production process, more specifically to a process for the production of enzyme complex using the filamentous fungus Penicillium echinulatum to be preferably used in the enzymatic hydrolysis of bagasse biomass and sugarcane straw, pre-treated or untreated.
  • Modulation of said enzymatic complex is also described by considering its enzymatic activities, as well as other proteins relevant to enzymatic hydrolysis, secreted into the fermentation medium, by varying or combining any proportion of the biomass used.
  • Filamentous fungi their enzymes of the cellulolytic and hemicellulolytic complex play a central role in the production of biomolecules, such as ethanol, butanol, biodiesel, polylactate, polyhydroxyalkanoates, organic acids and solvents, which use lignocellulosic biomass as the main raw material.
  • biomolecules such as ethanol, butanol, biodiesel, polylactate, polyhydroxyalkanoates, organic acids and solvents, which use lignocellulosic biomass as the main raw material.
  • the enzymatic complex produced by this class of microorganisms has been used in the hydrolysis of the main components of the lignocellulosic biomass.
  • Several filamentous fungi may produce the enzymatic complex for the hydrolysis of lignocellulosic materials, such as Trichoderma, Penicillium and Aspergillus (Kadam, 1996, Bon et al., 2008).
  • the enzymes responsible for the depolymerization of lignocellulosic biomass can be divided into two major groups: cellulases and hemicellulases.
  • Cellulases are a group of enzymes that synergically catalyze the hydrolysis of cellulose and can be classified into three major groups:
  • CBH cellobiohydrolases
  • BG ⁇ -glycanases
  • the EDs internally and randomly attack the cellulose chains generating oligosaccharides with non-reducing terminals.
  • the CBH attack the non-reducing ends of the cellulose chains forming the disaccharide cellobiose, composed of two glucose units bound by covalent bonds of the glycosidic structure at the ⁇ 1-4 positions. Due to their attack specificity at the ends of the cellulose chain are also known as exoglicanases.
  • BG hydrolyzes cellobiose and other short chain cello-oligosaccharides to D-glucose (Thongekkaew et al., 2008).
  • hemicellulases comprise a complex family of enzymes (endoxylanase, exoxylanase and esterase) that hydrolyze hemicellulose in their main carbohydrates: xylose, arabinose, mannose, glucose and galactose (Jeffries, 1994; Wyman, 1996).
  • Enzymatic complexes of filamentous fungi are produced by a fermentation process, called submerged fermentation, and the production of the enzymatic complex is a key factor for the development of the technology and the production costs of ethanol from the lignocellulosic biomass (called second-generation ethanol) and its cost of production is directly linked to the price of this input (Himmel et al., 1999; Galbe et al., 2002; Pradella et al., 2009) .
  • US 6,566,112 describes a composition comprising cellulases obtained by Actinomycete.
  • Cellulase has a calculated molecular weight of approximately 36kD and has an optimum pH of 8 to 40 ° C and 7 to 60 ° C. Also described are the genes encoding said cellulase, a method for producing the cellulase and its application.
  • US 6,645,063 provides a method for the treatment of cellulosic materials by contacting the cellulosic material with a cellulase obtained from Thermomonospora fusca corresponding to E5 or one of its derivatives.
  • Particularly preferred methods include storage and cleaning with detergent in cotton fabrics, the production of paper products, as an additive for animal feed and in the production of food, starch, ethanol and sugar.
  • US 6,114,296 provides variants of a cellulase progenitor, such as, for example, a cellulase classified in family 45 such as Humicola insolens 43 kD endoglucanase, comprising a cellulose binding domain (CBD), a catalytically active domain (CAD), and a region linking the CBD and CAD (the linker region), wherein one or more amino acid residues of CBD, CAD, or the linker region is deleted or substituted by one or more amino acid residues and / or one or more amino acids are added to the linker region and / or other CBD is added at the opposite end of the CAD.
  • CBD cellulose binding domain
  • CAD catalytically active domain
  • the linker region the linker region
  • Such variants are useful, for example, in detergent compositions, for textile treatment, paper pulp processing, for animal feed, and dentistry denim.
  • a cellulase composition obtained from Bacillus sp., CBS 669.93 is disclosed in US 6,063,611, comprising a cellulase of approximately 63 kD molecular weight, a calculated isoelectric point of about 5 and an optimum CMC pH of about 6 to 40 ° C and 60 ° C and US 6,277,596 addresses a high throughput production system for proteins and peptides, especially a high throughput production system for cellulase in Trichoderma viride and similar filamentous fungi.
  • the regulatory sequence of the Trichoderma viride-derived cbhl cellulase gene gives high expression of target proteins.
  • the regulatory sequence can therefore be used for high yield expression of target proteins, especially cellulase.
  • 15 g / L of an endoglucanase derived from Humicola insolens was successfully produced with this regulatory sequence.
  • EP 1627050 describes variants of Humicola grisea Cel7A (CBH1.1), H. jecorina cbhl variant or S. thermophilium cbhl, nucleic acids encoding the same and methods for producing the same.
  • the variant cellulases have the amino acid sequence of a glycosylated 7A family hydrolase in which one or more amino acid residues are substituted.
  • EP 20060113064, EP1618182 and WO2004 / 016760 which address the microorganisms Humicola, Bacillus and Hyprocrea jecorina, respectively, are included in the prior art.
  • the application PI0902757-2 brings the process of producing cellulases of P. echinulatum, from biological material of cellulases that will be introduced into a biological vector. Some tests are performed to measure the endpglicanasic enzymatic activity of P. echinulatum produced heterologously, at different concentrations of substrates and different substrates, which do not cover the substrates of the present invention. However, the intention of the application is to verify the reaction rate curve by substrate concentration, and not to verify the modulation of the cocktail. In the document itself, it is stated that enzymatic activity has probably declined due to nutrient shortages or the metabolic stress of cells by limiting other cellular processes, competing for other substrates.
  • the document PI0703302-8 describes industrial processes involving the hydrolysis of sugarcane bagasse, including processes for the production of hydrolytic enzymes, more specifically, for the hydrolysis of sugarcane bagasse, for the production of additives comprising fermentable sugars obtained from the ethanol production processes. Also described is the submerged culture of Penicillium echinulatum lineage 9A02S1 (DSM18942), using sugarcane bagasse in natura and / or pretreated as carbon source. Said process is characterized by the use of sugarcane bagasse subjected to pretreatment in the range of 100-220 ° C for 5-20 minutes.
  • Application examples cover the use of a submerged fermentation process conducted in batch mode with 20 g / L bagasse pretreated by said pre-treatment methods and culture medium affording ammonium sulfate (1-2.8 g / L), urea (0.3 g / LO and soy protein (1-2.5 g / L) as sources of nitrogen.
  • the filamentous fungus Penicillium echinulatum produces enzymes of the cellulolytic complex and as such suffers from catabolic repression as described in the state of the art on this microorganism and on other filamentous fungi, producers of cellulolytic and hemicellulolytic enzymes and, therefore, it is impossible to obtain higher enzymatic bonds that allow the second generation ethanol production process.
  • the present invention seeks to overcome these drawbacks, adding improvements to the process, as well as ensuring efficacy and interest in industrial application.
  • enzymes are constituted of protein molecules and as such, they also require sources of nitrogen from the culture medium.
  • the sources of nitrogen are constituted of ammonium sulfate, urea, yeast extract and soybean meal, sources whose input is also effective once in the beginning of the process, because it is conducted in batch mode.
  • This method proved to be inconvenient to exert a high osmotic pressure in the cells of micro organimos due to the presence of high loads ion NH 4 + 'which is also recognized as a compound from a certain inhibitory concentration for microbial populations, which limits the maximum of protein synthesis.
  • the initial supply of these nitrogen sources should be limited, for the reasons given above.
  • the present invention overcomes all the drawbacks previously pointed out, adding improvements to the process, presenting a technical solution to problems of the prior art, as well as guaranteeing the effectiveness and interest in industrial application.
  • the process of the present invention comprises a high throughput process, preferably in batch-fed mode.
  • the present invention has the advantage of alleviating microorganisms from the deleterious effects of catabolic repression, osmotic pressure caused by components of the culture medium, inhibition from the NH 4 + ion, providing greater productivity to the system which is critical for production cost of the enzymes produced.
  • the preferred fungal strain used in the present patent application (Penicillium sp.) Has already been shown to produce an efficient enzyme complex for the cellulose. However, it is of great importance the greater speed of enzyme production using controlled methods of substrate supply and modulation of the enzymatic cocktail by the manipulation of the culture conditions that benefit different types of biomasses to be hydrolyzed.
  • step (iii) comprises the addition of carbon source and nitrogen in a controlled manner for modulation of said enzymes.
  • the filamentous fungus Penicillium echinulatum is selected from the group consisting of Penicillium echinulatum DSM 18942, Penicillium echinulatum S1M29 or mutants of these strains.
  • addition of the carbon source and nitrogen in a controlled manner is performed under the fed batch regime.
  • the step of preparing the inoculum comprises preparing an inoculum medium with saline solution, wherein said saline is a source of supplementation of the culture medium comprised of assimilable sources of nitrogen, phosphorus, magnesium , potassium, sulfur and oxygen and micro-elements such as manganese, cobalt, zinc, molybdenum, nickel, copper and boron, polysorbate 80, polypropylene glycol, antifoam and peptone and in that the addition of readily assimilable carbon sources is selected from the group consisting of glucose, sucrose, glycerol, or the combination thereof.
  • saline is a source of supplementation of the culture medium comprised of assimilable sources of nitrogen, phosphorus, magnesium , potassium, sulfur and oxygen and micro-elements such as manganese, cobalt, zinc, molybdenum, nickel, copper and boron, polysorbate 80, polypropylene glycol, antifoam and peptone and in that
  • the process further comprises the addition of microcrystalline cellulose.
  • the inoculum step is incubated at 28 to 30 ⁇ C and occurs in a multiplication tank in which the ratio of the volume of spore suspension to the volume of inoculum medium contained in said multiplication tank is from 0.05 to 0.10 and the multiplication time is from 24 to 48 hours.
  • the growth step comprises a growth medium with saline solution wherein said saline is a source of supplementation of the culture medium comprised of as well as the assimilable sources of nitrogen, phosphorus, magnesium, potassium, sulfur and oxygen and microelements such as manganese, cobalt, zinc, molybdenum, nickel, copper and boron, polysorbate 80, polypropylene glycol, antifoam, peptone, yeast extract, soybean and contain the addition of readily assimilable carbon sources selected from the group consisting of pre-treated bagasse, sucrose, sugar cane syrup or molasses, glycerol or glycerol-rich residues, or the combination thereof.
  • saline is a source of supplementation of the culture medium comprised of as well as the assimilable sources of nitrogen, phosphorus, magnesium, potassium, sulfur and oxygen and microelements such as manganese, cobalt, zinc, molybdenum, nickel, copper and boron, polysorbate 80
  • the growth step is performed in a Bioreactor operating at a temperature between 29 ° C - 30 ° C, impeller tip agitation speed between 15 and 100 cm / s; oxygen dissolved at a value between 15 and 40% air saturation; pH 5.0 to 6.0; ART value of fermentation medium below 0.5 g / L.
  • the induction step comprises introducing into said Bioreactor the Celufloc materials, in natura or pre-treated sugarcane bagasse, with the addition of saline, wherein said saline is source of supplementation of the culture medium consisting of assimilable sources of nitrogen, phosphorus, magnesium, potassium, sulfur and oxygen and micro-elements such as manganese, cobalt, zinc, molybdenum, nickel, copper and boron to induce the production of enzymes.
  • saline is source of supplementation of the culture medium consisting of assimilable sources of nitrogen, phosphorus, magnesium, potassium, sulfur and oxygen and micro-elements such as manganese, cobalt, zinc, molybdenum, nickel, copper and boron to induce the production of enzymes.
  • the induction step comprises supplementation with additional materials such as soybean meal or pectin, or industrial waste rich in pectin as orange juice and apple juice residues.
  • controlling the introduction of the nitrogen source in the growth and induction steps is effected based on the pH control which is accomplished by the addition of aqueous solution of NH 4 OH 2M to 4M or NH 3 in gaseous form.
  • the contents of the Bioreactor are immediately transferred to a hydrolysis reactor or to a holding tank.
  • the process further comprises a step of recovering the enzymes contained in the holding tank, wherein said recovery occurs by the addition to the holding tank suspension of a filter aid, such as diatomaceous earth or other auxiliary of filtration in the proportion of 1 to 10% w / v with subsequent processing and recovery of said enzymes present in the filtrate in a solids separation device, wherein the concentration of the enzymes contained in the filtrate or the supernatant of any such unit operations of separation of solids, be effected by precipitation of the enzymes by salting-out, ultrafiltration, lyophilization or spray drying.
  • a filter aid such as diatomaceous earth or other auxiliary of filtration in the proportion of 1 to 10% w / v
  • the concentration of the enzymes contained in the filtrate or the supernatant of any such unit operations of separation of solids be effected by precipitation of the enzymes by salting-out, ultrafiltration, lyophilization or spray drying.
  • the lignocellulosic biomass is selected from the group consisting of agricultural residues such as straw, corn cob, rice hull, wood waste, bagasse, sugar cane straw or combinations thereof.
  • Figure 1 Flowchart of the enzyme production process with the filamentous fungus Penicillium echinulatum for use in the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass.
  • Figure 2 Bar graph of the activity FPase by time, using the inbred bagasse biomass (INB), Celufloc (CE) Distilled Acid Bagasse (BAD), Hydrothermal Bagasse (BH) and Steam Explosed and Neglected Bagasse (DSB).
  • IB inbred bagasse biomass
  • CE Celufloc
  • BAD Distilled Acid Bagasse
  • BH Hydrothermal Bagasse
  • DSB Steam Explosed and Neglected Bagasse
  • Figure 4 Profile of proteins detected in the supernatant for cultures in batch mode (A), batch-fed 2 pulses ( ⁇ ) and batch-fed 4 pulses ( ⁇ ) in bioreactor.
  • FIG. 5 Variation FPase (closed symbols) and protein concentration (open symbols) with time for P. echinulatum cultivated by batch BED with pH - controlled NaOH ( ⁇ , 0) / batch pH controlled NH4OH ( ⁇ , ⁇ ) and batch-fed ( ⁇ , ⁇ ) in biorretor.
  • Figure 6 Relationship between cellulase biosynthesis (given by FPU / mL), xylanase ( ⁇ ) and ⁇ -glucosidase ( ⁇ ).
  • FIG 7 Variation of the enzymatic activity on filter paper (FPA) in IU / mL with time for P. echinulatum strain S1M29 cultivated in the discontinuous (A) and discontinuous-fed (B).
  • Figure 8 Kinetics of the release of total reducing sugars from pre-treated bagasse hydrolysis, P echinulatum cocktail using Celufloc 200 with C. source
  • Figure 9 Kinetics of carbohydrate release in pre-treated bagasse hydrolysis, P. echinulatum cocktail using BED as a source of C (glyc-P, glyc-P, xyl6_P, xil8_P) compared to commercial enzyme cocktail (glyc_CO, gly8_C0, xil6_CO, xil8_CO) .
  • the present invention relates to a high performance process for the production of an enzymatic complex by filamentous fungi, for example the filamentous fungus P. echinulatum intended for the enzymatic hydrolysis of biomass of bagasse and / or sugarcane straw -treated or not.
  • This process is carried out in a fed batch regime based on the controlled addition of carbon sources composed of bagasse and sugarcane straw and other substances for the induction of enzymes with the addition of nitrogen sources easily assimilated into bioreactor, operating by submerged fermentation.
  • enzyme complex is to be understood as at least one enzyme capable of catalyzing the hydrolysis of lignocellulosic materials, for example cellulases (eg endoglicanases, cellobiohydrolases, ⁇ -glycanases, among others) or hemicellulases (eg endoxylanase, exoxylanase, esterase, among others).
  • cellulases eg endoglicanases, cellobiohydrolases, ⁇ -glycanases, among others
  • hemicellulases eg endoxylanase, exoxylanase, esterase, among others.
  • Modulation of the activity of this enzyme complex and other relevant proteins is also described, secreted in the fermentation medium, by varying or combining in different proportions of carbon sources (biomass).
  • Modulation is understood to modify the conditions of the environment in which said complex will be obtained, to achieve the activities desired in the present invention.
  • the parameters which may modify the activity of said complex for example, but not restrictively, pH, temperature, carbon source, oxygen saturation percentage, stirring rate, among other conditions , which they deem to be defining this activity in this report.
  • the process of the present invention is carried out in a fed batch regime which is based on the controlled addition of carbon sources, consisting of saccharin and / or sugarcane bagasse conveniently or in natura, which are effective in the induction of the said enzymes in bioreactor that operates by submerged fermentation, with the control of the pH with an aqueous solution of NH 4 OH or in the form of liquid NH 3 , as source of nitrogen easily assimilable, promoting a high content of enzymatic activities and other proteins necessary for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials.
  • the present invention benefits the enzyme production process since, unlike the known technique on enzyme production with P. echinulatum, which operates in batches, the current description operates in batch-fed mode.
  • the present invention has the advantage of alleviating microorganisms from the deleterious effects of catabolic repression, osmotic pressure caused by the components of the culture medium, inhibition from the NH 4 + ions provided greater productivity to the system which is fundamental for minimization of the production cost of the enzymes produced.
  • Step I of preparation of the inoculum with spores of the fungus
  • step III comprises the addition of carbon source and nitrogen in a controlled manner for modulation of said enzymes.
  • Whose illustrative flow chart is represented, in an illustrative and non-restrictive way, in Figure 1.
  • the inoculum medium is prepared so that the microorganism suspension from that step can be transferred to Step II.
  • the medium used consists of a saline solution, wherein said solution saline is a source of supplementation of the culture medium consisting of assimilable sources of nitrogen, phosphorus, magnesium, potassium, sulfur and oxygen and microelements such as manganese, cobalt, zinc, molybdenum, nickel, copper and boron, polysorbate 80, preferably Tween 80, polypropylene glycol, preferably PPG 2000, peptone, an antifoam, preferably Antifoam B and others for balanced growth of the biomass. Additionally, it comprises the addition of readily assimilable carbon sources such as glucose, sucrose, glycerol or combinations thereof.
  • PPG 2000 Density Polypropylene glycol culture medium
  • Antifoam B Density Polypropylene glycol culture medium
  • the process may also benefit from adding to the culture medium of Step I a quantity of microcrystalline cellulose, Celufloc 200 TM (Celuflok Ind and Commerce, Brazil) which gives the mycelium a support surface and allows a dispersed development of the mycelium.
  • a quantity of microcrystalline cellulose Celufloc 200 TM (Celuflok Ind and Commerce, Brazil) which gives the mycelium a support surface and allows a dispersed development of the mycelium.
  • Step I is generally carried out in Erlemmeyer or Fernbach flasks followed by a step in Multiplier Tank, incubated at the appropriate temperature, with volume ratio of medium to total volume and frequency of shaking and sterile air insufflation that allow sufficient oxygenation of the medium to the development of the culture ( Figure 1 - Inoculum stage).
  • Step II growth, the microorganism suspension is transferred to Bioreactor ( Figure 1 - Bioreactor) with temperature, oxygen dissolved, pH and frequency of agitation at suitable levels and culture medium which aims to promote the dispersed growth of the mycelium without interfering in the induction capacity of the enzymes of interest of said process.
  • Bioreactor Figure 1 - Bioreactor
  • carbohydrates that are easily assimilated but which are neutral in terms of catabolic repression such as, but not limited to, sucrose, molasses, syrup or syrup of sugar cane or glycerol or industrial waste carbon sources.
  • This medium should be supplemented with readily assimilable sources of nitrogen, phosphorus, magnesium, potassium, sulfur and oxygen and of micro-elements such as manganese, cobalt zinc, molybdenum, nickel copper and boron and others for balanced growth of biomass .
  • PPG 2000 Densitol culture medium
  • an antifoam Antifoam B Dow Qu ⁇ mica do Brasil
  • low concentrations of the sugarcane, sugarcane bagasse or straw can be added at low concentrations conveniently pre-treated in such a way as to have a low lignin content, so that the growth of the mycelium occurs from dispersed form.
  • Step III enzyme complex induction, controls of temperature, dissolved oxygen, pH and stirring frequency are adjusted to appropriate levels of enzyme biosynthesis.
  • masses of carbon sources along the time of the fermentation run i.e. control of the addition of the carbon source is carried out to promote the induction of biosynthesis of the enzymatic complex of interest.
  • the sources of carbon used to achieve this effect are bagasse or sugarcane straw in natura or conveniently pretreated in such a way that they have low lignin content or lignocellulosic agricultural or industrial waste rich in cellulose.
  • lignin can cause two effects: a) inhibition by phenolic components of lignin itself and b) irreversible adsorption. Inhibition is largely overcome by the controlled input of materials rich in this compound; the irreversible adsorption is negligible against the amount of enzyme formed by the fungus. This adsorption is on the order of at most 100 mg of protein / g of lignin. Extruded bagasse, for example, has a maximum of 25% lignin.
  • the process of the present invention preferably utilizes about 100 g / L BEX (or higher) and preferably forms up to about 20 g / L protein total.
  • the reaction medium can be supplemented with other carbon sources for modulation of enzymatic activities, such as but not limited to, dried, ground sugarcane bagasse and conveniently classified, microcrystalline cellulose such as Celufloc 200 TM, commercial soybean meal, residual liquor from steam pre-treatment of xylose-rich lignocellulosic biomass and xylo-oligosaccharides, pectin and pectin-rich agricultural residues.
  • Stage III there should be no nitrogen limitation as readily assimilable nitrogen source such as NH 3 or NH 4 OH is introduced into the on demand bioreactor using the automatic pH control.
  • the content of the bioreactor is preferably cooled, and the enzymatic complex with hydrolytic activity of lignocellulosic biomass, which is the product of the process, is recovered.
  • the total mass of carbon source to be introduced is 20 to 80 kg of carbon source.
  • This charge should be introduced in installments every 12 to 48 hours, preferably every 6 to 12 hours, in the Bioreactor, with the maximum number of loads being 2 to 8 times.
  • 20 kg of carbon source should be introduced into the Bioreactor 2 times of 10 kg mass per charge, preferably every 6 to 12 hours; or 80 kg of carbon source must be introduced in 8 times of 10 kg each mass is preferably preferably every 6 to 12 hours, giving a total time of respectively 12-24 hours for the first case and 48-96 hours for the second.
  • step IV product recovery, the contents of the bioreactor, preferably but not necessarily refrigerated, are transferred to a Holding Tank ( Figure 1 - Holding Tank) provided with sufficient agitation to maintain the suspended mass.
  • a Holding Tank Figure 1 - Holding Tank
  • the product of the process which is the enzymatic complex with hydrolytic activity of lignocellulosic biomass, can be used as such to effect the hydrolysis of lignocellulosic biomass, or else, the content of the bioreactor at the end of Step III, described above, can be used integrally as such to effect the hydrolysis of lignocellulosic biomass in the Hydrolysis Reactor ( Figure 1 - Hydrolysis Reactor).
  • the enzyme complex present in the liquid phase can be recovered by conventional enzyme recovery methods.
  • the present invention has advantages of being able to modulate the enzymatic cocktail in its activities of cellulase, hemicellulases and accessory enzymatic activities, important for the hydrolysis of lignocellulosic material, such as beta glucosycosis and pectinase activities, by the addition previously established inducers of those enzymatic activities, such as, but not limited to, the culture medium components described in Table 2.
  • P. echinulatum strain DSM 18942 or its mutant M29 is kept in a refrigerator at 4 ⁇ C in sloped tubes containing PDA (potato dextrose Agar), herein referred to as the maintenance medium, and is pealed at every two months for its maintenance.
  • PDA potato dextrose Agar
  • Step I Preparation of the fungal spore inoculum
  • Fungal spores from the sloped tubes are scraped with platinum loop and sterilized water and 10 to 20 ⁇ l of the suspension are inoculated into about 20 ml of PDA contained in Petri dishes which are 10 cm in diameter and kept in an oven at 29 ° C for 7 days.
  • a spore suspension is prepared with sterile water and Tween 80 and transferred to inoculum Medium (Table 2) at a 10% v / v ratio of spore suspension by inoculum medium.
  • the inoculum medium is maintained in Erlenmeyer or Fernbach flasks at 28-30 ⁇ C at 200 RPM for 24 to 48 hours at a 10% v / v total volume ratio of the Erlenmeyer or Fernbach flasks.
  • the contents of the Erlenmeyer or Fernbach jars are examined for purity of the fermentation by optical microscopy and Gram standard staining. If no contamination occurs, the suspensions contained in the vials are collected in a sterile vial, referred to herein as the inoculation vial.
  • the Multiplication Tank is charged with 70% of its total volume with the Inoculum Medium described in Table 2 and is conveniently sterilized at 121 ° C for 20 to 30 minutes with superheated steam by conventional methods. After sterilization, the temperature is adjusted to 29-30 ° C and the oxygen concentration is maintained by conventional methods above 30% air saturation. Thereafter, the spore suspension is transferred from the inoculation vial under maximum asepsis conditions to the Multiplication Tank of Figure 1. The ratio of the volume of spore suspension to the volume of Inoculum Medium contained in the Tank of Multiplication is from 0.05 to 0.10. Biomass multiplication is then performed and after 24 to 48 h, Step I, preparation of the inoculum, is terminated.
  • the volume of the Multiplication Tank is preferably 10 to 30 times lower than the subsequent Stage II Bioreactor and alternatively the process performed in the Multiplication Tank described above may be repeated up to 3 times , in order to obey the ratio of 10 to 30 times between the Multiplication Tank and the Bioreactor represented in Figure 1.
  • Step II Growth of fungal mycelium
  • the Bioreactor of Figure 1 is loaded with 50% to 70% of its total volume with the Growth Medium described in Table 2 and is conveniently sterilized or sanitized by methods known in the art for maintenance of a satisfactory operation from the point of view of contaminations with microorganisms deleterious to the process.
  • the temperature is adjusted to 29-30 ⁇ ° C, as well as the stirring frequency, for a impeller tip speed of about 15 to 20 cm / sec and pH, for a set point of 5.0 to 6.0, but preferably to 6.0.
  • the pH is controlled throughout the Stage II with automatic injection in the middle of fermentation in aqueous H 2 S0 4 2M and 4M aqueous NH 4 OH or NH 3 in gaseous form.
  • the dissolved oxygen concentration of the fermentation medium is maintained by varying the frequency of agitation and / or flow of sterile air blown into the base of the Bioreactor of Figure 1, at a value of 15 to 40% or more of air saturation, but preferably above 30%.
  • the maximum value of the stirring frequency should not exceed 60 to 100 cm / s, preferably 70 cm / s.
  • Growth stage II is performed and is terminated after 24 to 48 hours.
  • the total reducing sugars value (ART) of the fermentation medium measured according to conventional methodology, for example, non-restrictively, by the method described in Pradella, 1980, should be below 1.0 g / L, preferably below 0.5 g / L.
  • Step III is started.
  • the pH value is controlled by automatic injection of aqueous solution of H 2 SO 4 2M to 4M and aqueous solution of NH 4 OH or NH 3 , which also promotes the controlled addition of that nitrogen source to gaseous form in the fermentation medium in the range of 5.0 to 6.0, preferably in 6.0.
  • the dissolved oxygen concentration of the fermenting medium is maintained by varying the frequency of agitation and / or sterile air flow insufflated in the base of the Bioreactor of Figure 1, at equal value or greater than 15 to 40% air saturation, but preferably above 30%.
  • the maximum value of the stirring frequency should not exceed 60 to 100 cm / s, preferably 70 cm / s.
  • the Induction Medium described in Table 2 which is composed of 20 to 80 kg / m 3 of Celufoc 200 TM or 20 to 80 kg / m 3 of sugarcane bagasse or straw -treated to obtain low lignin content is introduced into the Bioreactor ( Figure 1), according to a pre-established addition protocol, in such a way that: catabolic repression that occurs with filamentous fungi producing cellulolytic enzyme complexes is minimized minimized the effect of transfer of mass, heat and amount of movement that occurs when operating with solid materials suspended in liquid medium.
  • Such material is introduced into the Bioreactor, preferably into dry particles preferably preferably less than 50% moisture, more preferably below 20%, under suitable sanitary conditions.
  • the total mass of the carbon sources mentioned above is calculated according to the ratio of the concentration indicated in Table 3 and the useful volume of the Bioreactor ( Figure 1).
  • the total mass of carbon source to be introduced is 20 to 80 kg of carbon source.
  • This charge should be introduced in installments every 12 to 48 hours, preferably every 6 to 12 hours, in the Bioreactor, with the maximum number of loads being 2 to 8 times.
  • 20 kg of carbon source should be introduced into the Bioreactor in 2 times of 10 kg of mass in each load, preferably every 6 to 12 h; or 80 kg of carbon source should be introduced in 8 times of 10 kg of mass each load preferably every 6 to 12 h, giving a total time of respectively 12 to 24 h for the first case and 48 to 96 h for the second.
  • the carbon sources comprise in-spray bagasse, pectin and soybean meal which may be combined and preferably added, but not restrictively, simultaneously to the carbon sources specified above so that, at the end of Step III, the product of the PROCESS, which is the enzymatic complex with hydrolytic activity of lignocellulosic biomass, with enzymatic activities of, for example, PFase, ⁇ -glucosity, xylanase, arabinofurosidase and pectinase, measured by conventional methods described in the literature, at the levels required by the hydrolysis enzymatic activity of lignocellulosic biomass.
  • Step III, of induction is thus performed and after 96 to 144 hours, preferably but not restrictively, terminated.
  • the content of the Bioreactor preferably, can be transferred immediately to the Hydrolysis Reactor to proceed with the enzymatic hydrolysis of the suitably treated, state-of-the-art lignocellulosic biomass beforehand, contained in that Reactor ( Figure 1).
  • the enzymatic complex produced can be recovered from the liquid phase of the content of the Bioreactor.
  • the Bioreactor suspension is preferably cooled below room temperature and transferred to the Holding Tank ( Figure 1).
  • a filter aid may be added to the medium as a non-exclusive example, diatomaceous earth or other filter aid in the proportion of 1 to 10% w / v, preferably 1 to 2% w / v.
  • Solid Separation Equipment such as, but not limited to, "Nutsh” type filter, belt-drive “belt filter, basket centrifuge, pusher centrifuge “or a” decanter “centrifuge, or other known solid state separation process ( Figure 1 - Solid Separation Equipment)
  • Solid Separation Equipment such as, but not limited to, "Nutsh” type filter, belt-drive “belt filter, basket centrifuge, pusher centrifuge “or a” decanter “centrifuge, or other known solid state separation process ( Figure 1 - Solid Separation Equipment)
  • the filtrate or supernatant from any such solids separation operations which is composed of the product of the PROCESS, in sequence, may be formulated by adding stabilizers and alternatively concentrated by some known state-of-the-art technique, namely, but not limited to, precipitation of proteins by "salting-out” , ultrafiltration, lyophilization or spray drying.
  • the growth and induction steps are completed between 96 to 144 hours.
  • Bioreactor suspension is optionally cooled.
  • the strain of Penicillium echinulatum was cultivated using pre-treated sugarcane bagasse or in natura as a carbon source in submerged culture experiments with shaken flasks.
  • Maximum activity of filter paper (FPase) with values of 2.4 and 2.6 FPU / mL were obtained using bagasse treated with sodium hydroxide and steam explosion (BED) and hydrothermally pretreated bagasse (HB), respectively.
  • the maximum FPase for acid treated bagasse (BAD) and Celufloc 200, values were 1.3 and 1.6 FPU / mL, respectively, while in the case of bagasse the activity of the enzyme produced was lower ( ⁇ 0 , 4 FPU / ml).
  • Activity of xylanase and protein concentration showed similar trends, however greater ⁇ -glucosidase activity was obtained with Celufloc as carbon source.
  • Example 2 Assays with Celufloc 200 TM as source of C, strain DSM 18942:
  • P. echinulatum strain DSM 18942 was transferred to the modified inoculum medium as described in Step I.
  • the inoculum medium was transferred to a bioreactor containing 10 g / L Celufloc 200 cellulose.
  • PH control was performed with the automatic addition of an NH 4 OH: H 2 O 1: 3 (v: v) solution or by NaOH 2.
  • the pH was maintained at values greater than 5.0.
  • the temperature was maintained at 29 ° C and the oxygen dissolved in values greater than 30% using cascade control: Shake / air flow.
  • Celufloc 200 TM (Cel) was used as a carbon source for P echinulatum cultivation in batch mode and in batch-fed mode according to protocols a), b) and c) was almost fully consumed reaching FPase maximum of 0.81; 1.55 and 1.40 FPU / mL, respectively, at 143, 137 and 165 h of culture ( Figure 3). It can be said that increasing the amount of carbon source contributed to the system did not guarantee an increase in the enzyme titre. The 0 2 level dissolved for these assays was always above 30% saturation with no presumptive limitation of oxygen transfer in the system. Catabolic suppression of cellulase biosynthesis, as proposed for Trichoderma reesei (Ilmén et al., 1997), may have occurred, requiring, if this is the case, less strains and improved carbon input protocol.
  • the conversion factors of carbon source to enzyme expressed as the quotient of the FPU produced by the mass of Cel consumed (YFPU / C) were 40 FPU / g, respectively; 35 FPU / g and 38 FPU / g for the tests performed, suggesting no correlation with the form and amount of carbon source added.
  • the concentration of proteins detected in the supernatant increases similarly to FPase activity, for the three assays performed, however, after approximately 144 hours of cultivation, while the activity falls, the amount of proteins detected remains constant. The fall in cellulase activity suggests that the release of enzymes in the medium by the microorganism ceases.
  • Example 3 Bagasse exploded and deignified as source of C. strain D5M18942
  • P. echinulatum strain DSM 18942 was transferred to the inoculum medium and incubated as described.
  • the inoculum medium was transferred to the bioreactor containing induction medium supplemented with sucrose (7 g / L of exploded and decaffeinated bagasse and 3 g / L of sucrose).
  • the pH control was performed with automatic addition of an NH 4 OH: H 2 O 1: 3 (v: v) solution or by 2M NaOH.
  • the pH was maintained at values greater than 5.0.
  • the temperature was maintained at 29 ° C and the oxygen dissolved in values greater than 30% using cascade control: Shake / air flow.
  • the BED carbon source was consumed in about 150 h, reaching maximum FPFA of 1.3 FPU / mL and 1.5 FPU / mL for NaOH and NH 4 OH, respectively, at 120 and 3.7 FPU / mL for batch fed at 144 h ( Figure 5).
  • Calculated Y F pu / c values were, respectively, 87 FPU / g; 100 FPU / g and 120 FPU / g, far superior to that found with Celufloc 200
  • the strain of P. echinulatum S1M29 was grown in Celufloc culture medium with increasing concentrations of carbon source (2, 3 and 4% w / v) in benchtop bioreactor (Bioflo 115, New Brunswick Scientific, USA) at temperature controlled at 28 ° C, pH 6.0 and dissolved oxygen above 30% saturation of the culture medium with air. Samples were collected and the enzymatic activities of the fermented broth were measured. Two cultivation methods were used: discontinuous or batch regime (RD) and batch-fed or batch-fed regime (RDA). In the first (RD) the total carbon source charge was added at the beginning of the crop, in the second (RDA) the carbon source charge was distributed throughout the crop.
  • RD discontinuous or batch regime
  • RDA batch-fed or batch-fed regime
  • the supernatant from the batch-fed assay with initial concentration of 10 g / L Celufloc followed by 2 additions at 30 and 54 h of 30 g fermentation was used in the hydrolysis assay and compared with the commercial enzyme preparations Accelerase 1000 Genencor, Accelerase 1500 Genencor, Powercell 1% solution.
  • a 250 mL Erlenmeyer flask containing 3 g was prepared on a dry substrate basis of steam pre-treated bagasse substrate, 2 mL of 2% azide solution (20 g / L), 15 FPU of dry enzyme / g substrate (i.e. FPU), filling the volume to 100 mL with citrate buffer pH 4.8 - 5.0 mM.
  • the control consisted of a bottle without enzyme.
  • the filter paper activity was measured and calculated previously according to the method of Ghose (1987) for all the enzymatic complexes.
  • the flasks were shaken at 50 ° C and 150 RPM. Aliquots of 2 mL were withdrawn during the sampling period.
  • Figure 8 shows the kinetics of release of reducing sugars by the enzymatic complexes.
  • P. echinulatum strain DSM18942 was grown on a number of carbon sources, namely Celufloc (EC), bagasse in natura (BIN), hydrothermally treated bagasse (BH), steam blast bagasse (BEX), bagasse steam and subsequently delignified with hot NaOH for lignin removal (BED), bagasse treated with H 2 SO 4 and subsequently delignified with hot NaOH for lignin removal (BAD), Figure 2.
  • Table 1 shows the peaks of the enzymatic activities achieved.
  • Supernatants from these experiments were then subjected to a proteomic analysis of these supernatants effected by ALDI-TOF mass spectrometry to access the secretoma of P. echinulatum grown in those different carbon sources.
  • Table 5 summarizes the results of the proteomic analysis performed. It is quite obvious that it is possible to vary the composition of the enzymatic cocktail secreted by P echinulatum depending on the source of the inducing carbon used (Table 5). For example, when a large number of glycohydrolases (GH12, GH17 and GH3), xyliglucanases, xyliglucan hydrolases and beta-glycosides were detected in the secretoma of P. echinulatum (INB) or microcrystalline cellulose Celufloc (CE) .
  • INB glycohydrolase
  • CE microcrystalline cellulose Celufloc
  • the enzymatic cocktail of P. echinulatum can be modulated from the introduction into the induction phase of the enzyme complex of the carbon sources thus described, in different feeding methods, or a combination of these sources to obtain cocktails that privilege the required activities enzymes.
  • Table 1 Peak of enzymatic activities
  • Table 2 - Composition of media used per m 3 of culture medium.
  • pectin bran 2 to 8 kg of soybeans
  • Soybean meal 0.2 to 0.8 kg Saline solution (1> 100 L 100 L 100 to 200 L
  • the saline solution employed has the following composition in kg / m 3: KH 2 P0 4 20; (NH 4) 2 S0 4 14; urea 3; MgSO 4 .7H 2 0 3; CaCl 2 3; FeS0 4 .7H 2 0 0 05; ZnSO 4 .7H 2 O 0.014; MnSO 4 .H 2 0 0.016; CoCl 2 0 02.
  • the pH is adjusted to 5.3, the saline solution was sterilized by autoclaving at 121 ° C for 20 min and stored in a refrigerator until use.

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Abstract

A presente invenção refere-se a micro-organismos para produção de enzimas e um processo para a produção de complexo enzimático pelo fungo filamentoso P. echinulatum para ser utilizado na hidrólise enzimática de biomassa de bagaço e palha de cana-de-açúcar pré-tratados ou não. Também é descrita a modulação do referido complexo enzimático considerando suas atividades enzimáticas, bem como outras proteínas relevantes à hidrólise enzimática, secretadas ao meio de fermentação, mediante a variação ou combinação de qualquer proporção da biomassa utilizada.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ENZIMAS COM FUNGO FILAMENTOSO PENICILLIUM ECHINULATUM PARA USO NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE
BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a um processo de produção de enzimas novo e inventivo, mais especificamente a um processo para a produção de complexo enzimático utilizando o fungo filamentoso Penicillíum echínulatum para ser utilizado preferencialmente na hidrólise enzimática de biomassa de bagaço e palha de cana-de-açúcar, pré-tratados ou não.
Também é descrita a modulação do referido complexo enzimático considerando suas atividades enzimáticas, bem como outras proteínas relevantes à hidrólise enzimática, secretadas ao meio de fermentação, mediante a variação ou combinação de qualquer proporção da biomassa utilizada.
Antecedentes da Invenção
Os fungos filamentosos, suas enzimas do complexo celulolítico e hemicelulolítico desempenham papel central na produção de biomoléculas , tais como etanol, butanol, biodiesel, polilactato, polihidroxialcanoatos , ácidos orgânicos e solventes, os quais utilizam a biomassa lignocelulósica como matéria-prima principal.
0 complexo enzimático produzido por essa classe de micro-organimos tem sido utilizado na hidrólise dos principais componentes da biomassa lignocelulósica. Vários fungos filamentosos podem produzir o complexo enzimático para hidrólise de materiais lignocelulósicos , destacando-se entre eles Trichoderma , Penicillíum e Aspergillus (Kadam, 1996, Bon et al. , 2008) . As enzimas responsáveis pela despolimerização da biomassa lignocelulósica podem ser divididas em dois grandes grupos: celulases e hemicelulases .
As celulases constituem um grupo de enzimas que catalisam sinergicamente a hidrólise da celulose e podem ser classificadas em três grandes grupos:
(i) endoglicanases (ED) (EC. 3.2.1.4.);
(ii) celobiohidrolases (CBH) (EC. 3.2.1.91) e
(iii) β-glicanases (BG) (EC. 3.2.1.21).
As ED atacam internamente e randomicamente as cadeias da celulose gerando oligossacarideos com terminais não- redutores .
As CBH atacam os terminais não-redutores das cadeias da celulose formando o dissacarídeo celobiose, composto por duas unidades de glicose ligadas por ligações covalentes da estrutura glicosidicas nas posições β 1-4. Devido à sua especificidade de ataque aos terminais da cadeia de celulose são também conhecidas como exoglicanases .
As BG hidrolisam celobiose e outros celo- oligossacarideos de cadeia curta até D-glicose (Thongekkaew et al. , 2008) .
Em contrapartida as hemicelulases compõem uma família complexa de enzimas (endoxilanase, exoxilanase e esterase) que hidrolisam hemicelulose em seus principais carboidratos : xilose, arabinose, manose, glicose e galactose (Jeffries, 1994; Wyman, 1996).
Complexos enzimáticos de fungos filamentosos são produzidos por processo fermentativo, denominado fermentação submersa, sendo que a produção do complexo enzimático é fator chave para desenvolvimento da tecnologia de produção de etanol advindo de biomassa lignocelulósica (chamado de etanol de segunda geração) e seu custo de produção está diretamente ligado ao preço deste insumo (Himmel et al., 1999; Galbe et al., 2002; Pradella et al., 2009) .
A produção de celulases por fungos filamentosos em biorreatores submersos é dependente de uma série de variáveis ambientais que podem ser mais ou menos controláveis. Entre elas destacam-se a temperatura, o pH, a concentração de oxigénio dissolvido no meio fermentativo e a tensão de cisalhamento imposta pelos impelidores à massa de micélio . _
A concentração, a natureza, bem como a forma de adição das fontes de carbono tem profundo impacto no desempenho do processo de produção de celulases. Nesse sentido, alguns substratos foram testados por Mandeis e Reese (1957) como indutores para produção de enzimas celuloliticas e foi possível observar que a lactose e a celulose possuem ótimas capacidades de indução, enquanto que a celobiose não se mostrou eficaz na indução.
Mais tarde, Reese et al. (1969) confirmaram o caráter indutivo do complexo celulolítico por substratos relacionados, ou seja, indução por vários tipos de celulose ou por celuloses modificadas. Por outro lado, produtos da hidrólise como celobiose e glicose não produziram indução. Entretanto os autores argumentaram que a indução pode-se dar pela oferta de um produto de hidrólise modificado, como lactose ou um éster de celobiose, ou mesmo se o produto da hidrólise for disponibilizado lentamente.
É importante notar que os mecanismos de indução de celulase ainda não estão suficientemente elucidados.
Recentemente, Hartl et al. (2007) e Fekete et al. (2008) demonstraram que a via de metabolismo de β-D- galactose, um dos açúcares provenientes da hidrólise de lactose (que é formada pela condensação deste carboidrato com de D-glicose) , está associada em T. reeseí com a formação de celulase. Neste fungo a forma assimilável é o isômero oí-D-galactose e a ausência da atividade enzimática de mutarotase para interconversão da forma β na forma assimilável , estava associada à produção de celulase. O aumento da atividade desta enzima, conseguida pela clonagem de genes responsáveis pela sua síntese, deteriorou a produção celulase utilizando lactose (Fekete et al., 2008), parecendo confirmar a hipótese formulada por Reese et al. (1969) de que a disponibilização lenta de fonte de carbono induziria a atividade celulolítica .
Ilmén et al. (1997) demonstraram que glicose, utilizada como fonte de carbono, promovia bom crescimento de T. reesei QM9414, mas exercia uma forte repressão da síntese de celulases, agindo ao nível da transcrição dos genes que codificam essas enzimas, mesmo quando soforose era adicionada ao meio de cultura, a qual é um forte indutor da síntese dessas enzimas.
Entretanto, esses mesmos autores identificaram que tanto sorbitol quanto glicerol, fontes de carbono que promoviam igualmente bom crescimento deste fungo, não apresentaram um comportamento inibitório e que quando utilizadas em presença de indutores (celobiose, soforose ou celulose) não reprimiram a síntese de celulases (Ilmén et al., 1997). Sendo assim, é provável que glicerol, fonte de carbono abundante e de baixo custo, possa também ser utilizada como substrato para crescimento de T. reesei RUT C-30.
Outro micro-organismo promissor na produção de hidrolases é o fungo filamentoso Penicillium echinulatum, um fungo filamentoso isolado do inseto Anobium punctarum. Este fungo e seus mutantes (Dillon et al. 2006) tem mostrado boa atividade do complexo celulolitico em cultivos tanto por fermentação submersa quanto por fermentação semi- sólida (Camassola et al . 2004; Dillon et al . 2008; Dillon et al. 2007) e um bom balanço de atividades FPase e β- glicosidase (Martins et al., 2008 ) , . torna.ndo-o um candidato bastante promissor para produção industrial de celulases para uso na tecnologia de bioetanol de segunda geração (2G) . Experimentos em fermentação submersa em frascos agitados demonstraram valores da ordem de 1,5 FPU/mL e 0,5 UI de β-glicosidase /mL em 5 a 6 dias de cultivo em meio contendo celulose e/ou lactose (Sehnem et al., 2006).
Como substratos para produção de complexos celuloliticos obtidos por esses microorganismos, fontes lignocelulósicas naturais, tais como os resíduos agrícolas, têm sido empregadas. Essas biomassas têm a característica de serem abundantes no campo e seu potencial energético ainda pouco aproveitado.
Estes processos previamente comentados, os quais compõem o estado da técnica da presente invenção, estão descritos nos exemplos a seguir.
O documento US 6,566,112 descreve uma composição compreendendo celulases obtidas por Actinomiceto. A celulase tem um peso molecular calculado aproximado de 36kD e tem um pH ótimo de 8 a 40°C e de 7 a 60 °C. Também é descrito os genes que codificam a referida celulase, um método para produzir a celulase e sua aplicação.
0 US 6,645,063 fornece um método para o tratamento de materiais celulósicos mediante o contato do material celulósico com uma celulase obtida de Thermomonospora fusca correspondendo a E5 ou um dos seus derivados. Particularmente métodos preferíveis compreendem estocagem e limpeza com detergente em tecidos de algodão, a produção de produtos de papel, como um aditivo para a alimentação animal e na produção de alimentos, amido, etanol e açúcar.
O US 6,114,296 proporciona variantes de um progenitor celulase, tal como, por exemplo, uma celulase classificada na família 45 tal como a Humicola insolens 43 kD endoglucanase, compreendendo um domínio de ligação à celulose (CBD) , um domínio cataliticamente ativo (CAD) , e uma região ligando o CBD e CAD (a região ligante), em que um ou mais resíduos de aminoácidos da CBD, CAD, ou a região ligante é eliminado ou substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos e / ou um ou mais aminoácidos são adicionados à região ligante e / ou outra CBD é adicionado na extremidade oposta do CAD. Tais variantes são úteis, por exemplo, em composições de detergentes, para o tratamento têxtil, no processamento de pasta de papel, para a alimentação animal, e para a estonagem de jeans.
Uma composição de celulase obtida a partir de Bacillus sp., CBS 669.93 é descrita em US 6,063,611, compreendendo uma celulase de peso molecular de aproximadamente 63 kD, ponto isoelétrico calculado de cerca de 5 e um pH ótimo em CMC de cerca de 6 a 40 ° C e 60 ° C e o US 6,277,596 aborda um sistema de produção de alto rendimento para as proteínas e peptídeos, especialmente, um sistema de produção de alto rendimento para celulase em Trichoderma viride e fungos filamentosos similares. A sequência reguladora do gene celulase cbhl derivada de Trichoderma viride dá elevada expressão de proteínas alvo. A sequência reguladora pode, portanto, ser utilizado para expressão de alto rendimento de proteínas alvo, especialmente celulase. Em particular, 15 g / L de uma endoglucanase derivada a partir de Humicola insolens foi produzido com sucesso com esta sequência reguladora .
A EP 1627050 descreve variantes de Humicola grisea Cel7A (CBHl.l), H. jecorina cbhl variante ou S. thermophilium cbhl, ácidos nucléicos que codificam para o mesmo e métodos para produzir o mesmo. As celulases variantes têm a sequência de aminoácidos de uma hidrolase de glicosiloda família 7A em que um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos.
Ainda, compõem o estado da técnica os documentos EP 20060113064, EP1618182 e WO2004/016760 que abordam os microorganismos Humicola , Bacillus e Hyprocrea jecorina, respetivamente .
O pedido PI0902757-2 traz o processo de produção de celulases de P. echinulatum, a partir de material biológico de celulases que serão introduzidas em um vetor biológico. Alguns testes são realizados para medir a atividade enzimática endpglicanasica de P. echinulatum produzida de forma heteróloga, em diferentes concentrações de substratos e diferentes substratos, que não abrangem os substratos da presente invenção. Porém, a intenção do pedido é de verificar a curva de velocidade de reação por concentração de substrato, e não de verificar a modulação do coquetel . No próprio documento afirma-se que a atividade enzimática teve declínio provavelmente devido a escassez de nutrientes ou ao estresse metabólico das células por limitar outros processos celulares, competindo por outros substratos.
O documento PI0703302-8 descreve processos industriais envolvendo a hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar , incluindo processos para a produção de enzimas hidrolíticas , mais especificamente, para a hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar, destinados à produção de aditivos compreendendo açúcares fermentescíveis obtidos dos processos de produção de etanol. Também é descrito o cultivo submerso de Penicillium echinulatum linhagem 9A02S1 (DSM18942), sendo utilizado o bagaço de cana-de-açúcar in natura e/ou pré-tratado como fonte de carbono. Referido processo é caracterizado pelo uso de bagaço de cana-de- açúcar submetido ao pré-tratamento na faixa de 100-220°C durante 5-20 minutos. Exemplo de aplicação abordam o uso de um processo de fermentação submersa conduzido em modo batelada com 20 g/L de bagaço pré-tratado pelo ditos métodos de pré-tratamento e meio de cultura que aporta sulfato de amónio (1-2,8 g/L), ureia (0,3 g/LO e proteína de soja (1-2,5 g/L) como fontes de nitrogénio.
O fungo filamentoso Penicillium echinulatum produz enzimas do complexo celulolítico e como tal, sofre de repressão catabólica, conforme descrito no estado da arte sobre este micro-organismo e sobre outros fungos filamentosos, produtores de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas sendo, portanto, impossível a obtenção de títulos enzimáticos superiores que viabilizem o processo de produção de etanol de 2 a geração.
Neste sentido, também o processo de produção objeto da PI0703302-8, demonstrou-se inconveniente para a produção de etanol de 2a geração, pois a produtividade do sistema (dada como titulo de enzima/ volume de reação*tempo) é limitada pela quantidade de fonte de carbono possível de se carregar no reator de produção de enzima. Este processo de produção é em modo batelada, que permite uma quantidade máxima inicial de fonte de carbono que pode se disponibilizar ao micro-organismo . Acima desse limite de fonte de carbono, fenómenos biológicos bastante conhecidos, como a mencionada repressão catabólica, ou físicos, como a limitação à transferência de massa, calor e quantidade de movimento, interferem fortemente o processo de produção das enzimas, impossibilitando atingir títulos elevados de atividades celulolíticas , hemicelulolíticas e outras atividades importantes para a hidrólise enzimática dos materiais lignocelulósicos .
Destaca-se que a produtividade de celulases, hemicelulases e outras enzimas acessórias é de fundamental importância para se viabilizar a produção económica de biomoléculas , oriundas dos carboidratos (glicose, xilose e arabinose) , tais como hidrólise de materiais lignocelulósicos e, conforme exposto acima, ainda é um problema não resolvido no estado da arte.
Ademais, o método preconizado na PI0703302-8 que seria utilizado para pré-tratamento do bagaço de cana como fonte de carbono, além de não ser ideal para a produção de enzimas, ainda é prejudicial para essa tecnologia, uma vez que persiste uma quantidade bastante substancial de lignina remanescente no dito substrato. Isso ocorre, pois os métodos de tratamento a vapor com súbita descompressão, conhecidos como explosão a vapor, resultam em valores de lignina na biomassa pré-tratada acima de 20% em peso seco.
É bastante conhecido pelo estado da técnica que a lignina possui afinidade pelas enzimas celuloliticas , fenómeno designado como "adsorção improdutiva". Esse fenómeno adsorve irreversivelmente enzimas celuloliticas tornando-as indisponíveis para a biocatálise hidrolítica. Sendo assim, o uso do material preconizado pela PI0703302-8 é inadequado para biocatálise hidrolítica, visto que a lignina remanescente deve adsorver boa parte das enzimas produzidas. Isso tem sido demonstrado pelos inúmeros experimentos que temos realizado em particular com P. echinulatum e outros fungos filamentosos que produzem enzimas celuloliticas como, por exemplo, Trichoderma reesei RUT-C30 (Pereira et al. 2011; outros autores) .
Por outro lado, o documento PI0702162 "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE CELULASES E HEMICELULASES" avança sobre o estado da técnica, uma vez que preconiza o uso de fonte de carbono constituída de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratada de tal forma que a lignina residual do bagaço seja minimizada mitigando assim o efeito da "adsorção improdutiva". Entretanto ela é contraproducente do ponto de vista de desempenho do processo, assim como a PI0703302-8, pois a produtividade do sistema, dada como título de enzima/ volume de reação * tempo é limitada pela quantidade de fonte de carbono possível de se carregar no reator de produção de enzima. Isso ocorre principalmente devido ao processo de produção ser em modo batelada que permite uma quantidade máxima inicial de fonte de carbono que pode se disponibilizar ao micro-organismo acima da qual, fenómenos biológicos bastante conhecidos como a mencionada repressão catabólica ou físicos, como a limitação à transferência de massa, calor e quantidade de movimento, interferem fortemente no processo de produção das enzimas. Isso impossibilita que se atinja títulos elevados de atividades celulolíticas , hemicelulolíticas e outras atividades importantes para a hidrólise enzimática dos materiais lignocelulósicos .
Há de se destacar que nos processos de produção em modo batelada pode ocorrer o aumento da concentração de sais com a elevação da pressão osmótica, que provocam a deterioração dos micro-organismos . Assim, a presente invenção pretende superar estes inconvenientes, agregando melhorias ao processo, bem como garantindo a eficácia e interesse em aplicação industrial.
Adicionalmente, como já é de conhecimento público, enzimas se constituem de moléculas proteicas e como tal, também demandam do meio de cultura fontes de nitrogénio. No PI0703302-8 e PI0702162 as fontes de nitrogénio são constituídas de sulfato de amónio, ureia, extrato de levedo e farelo de soja, fontes cujo aporte também é efetivado de uma vez só no início do processo, por ser conduzido em modo batelada. Este método demonstrou ser inconveniente por exercer uma pressão osmótica elevada nas células dos micro- organimos devido a presença de altas cargas do íon NH4 +' que também é, reconhecidamente, um composto inibitório a partir de certa concentração para as populações microbianas, o que limita o máximo da síntese de proteína. Porquanto deve ser limitado o aporte inicial das ditas fontes de nitrogénio, pelas razões acima expostas.
Em adição, sabe-se atualmente que outras enzimas, diferentes de celulases, que catalisam sinergicamente a hidrólise da celulose, são também fundamentais para a efetiva hidrólise da biomassa, como por exemplo, as hemicelulases , esterases, as pectinases e outras proteínas não hidrolíticas , como aquelas que podem realizar a desestruturação das partes cristalinas das cadeias de celulose, como fazem as soleninas ( swollenin) (Arantes, et al. 2011) .
Dessa forma, persiste a necessidade de se desenvolver um processo que apresente maior produtividade de enzimas, capaz de prover enzimas celulolíticas , como também enzimas pertencentes ao grupo das hemicelulases, pectinases e outras ativídades acessórias. A maior produtividade sendo definida como a produção de mais enzima em um intervalo de tempo menor. Esse processo poderia efetivamente concorrer com a hidrólise dos materiais celulósicos e proporcionar um complexo enzimático habilitado na degradação eficiente da biomassa. Ainda, o presente trabalho apresenta como fonte de carbono biomassa com grande quantidade de lignina, o que, de acordo com o estado da técnica prejudicaria a produção de enzimas interessantes à hidrólise
Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui . novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica. Sumário da Invenção
Assim, a presente invenção supera todos os inconvenientes previamente apontados, agregando melhorias ao processo, apresentando uma solução técnica para problemas do estado da técnica, bem como garantindo a eficácia e interesse em aplicação industrial.
Na presente invenção, é apresentado um processo de produção de complexo enzimático executado sob regime de batelada alimentada baseado em método de adição controlada de fontes de carbono, constituídas de bagaço e/ou palha de cana-de-açúcar , pré-tratados ou não, e outras substâncias efetivas na indução de enzimas, mais especificamente, de enzimas celulolíticas , como também enzimas pertencentes ao grupo das hemicelulases , pectinases e outras atividades acessórias. Adicionalmente, na presente invenção, ocorre a adição controlada de fontes de nitrogénio facilmente assimiláveis em biorreator, que opera por fermentação submersa. Assim, o processo da presente invenção compreende um processo de alto desempenho de produção, preferencialmente em modo batelada-alimentada . Dessa maneira, a presente invenção tem a vantagem de aliviar os microrganismos dos efeitos deletérios da repressão catabólica, da pressão osmótica, causada pelos componentes do meio de cultura, da inibição proveniente do íon NH4 + proporcionando uma maior produtividade ao sistema que é fundamental para minimização do custo da produção das enzimas produzidas.
A linhagem preferencial de fungos utilizada no presente pedido de patente ( Penicillium sp.) já demonstrou produzir um complexo enzimático eficiente para a quebra da celulose. Entretanto, é de grande importância a maior velocidade de produção de enzimas usando métodos controlados de aporte dos substratos e modulação do coquetel enzimático pela manipulação das condições de cultivo que beneficia diferentes tipos de biomassas a serem hidrolisadas .
Figura ainda como um objetivo do presente invento a modulação enzimática em termos de suas atividades enzimáticas e outras proteínas, relevantes para a melhoria da hidrólise da biomassa, mediante a variação ou combinação em qualquer proporção das fontes de carbono, constituídas por bagaço e/ou palha de cana-de-açúcar, pré-tratados ou não, e ainda suplementados com outras fontes de carbono, efetivas na indução do complexo enzimático para o referido micro-organismo .
Portanto é um objeto da presente invenção, um processo de indução da produção de enzimas por fungo filamentoso Penicillium echinulatum compreendendo as etapas de:
(i) preparação de inoculo com esporos do fungo;
(ii) crescimento do micélio do fungo;
(iii) indução da produção de complexo enzimático; e
(iv) recuperação do complexo enzimático;
em que a etapa (iii) compreende a adição de fonte de carbono e nitrogénio de forma controlada para modulação das ditas enzimas.
Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, o fungo filamentoso Penicillium echinulatum é selecionado do grupo consistindo das linhagens Penicillium echinulatum DSM 18942, Penicillium echinulatum S1M29 ou mutantes destas linhagens. Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, a adição da fonte de carbono e nitrogénio de forma controlada é executada sob o regime de batelada alimentada .
Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, a etapa de preparação do inoculo compreende preparação de um meio de inoculo com solução salina, em que dita solução salina é fonte de suplementação do meio de cultura constituída de fontes assimiláveis de nitrogénio, fósforo, magnésio, potássio, enxofre e oxigénio e micro- elementos como, manganês, cobalto, zinco, molibdênio, níquel, cobre e boro, polisorbato 80, polipropileno glicol, antiespumante e peptona e por compreender a adição de fontes de carbono facilmente assimiláveis selecionadas do grupo consistindo de glicose, sacarose, glícerol, ou a combinação dos mesmos.
Em uma realização preferencial da presente invenção, o processo compreende adicionalmente a adição de celulose microcristalina .
Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, a etapa de inoculo é incubada a temperatura de 28 a 30°C e ocorre em um tanque de multiplicação em que a relação entre o volume de suspensão de esporos e o volume de meio de Inoculo contido no dito tanque de multiplicação é de 0,05 a 0,10 e o tempo de multiplicação ser de 24 a 48h.
Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, a etapa de crescimento compreende um meio de crescimento com solução salina em que dita solução salina é fonte de suplementação do meio de cultura constituída de fontes assimiláveis de nitrogénio, fósforo, magnésio, potássio, enxofre e oxigénio e micro-elementos como, manganês, cobalto, zinco, molibdênio, níquel, cobre e boro, polisorbato 80, polipropileno glicol, antiespumante, peptona, extrato de levedura, farelo de soja e conter a adição de fontes de carbono facilmente assimiláveis selecionadas do grupo que consiste de bagaço pré-tratado, sacarose, xarope ou melaço de cana-de-açúcar, glicerol ou resíduos ricos em glicerol, ou a combinação dos mesmos.
Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, a etapa de crescimento é efetuada em Biorreator que opera em temperatura entre 29°C - 30°C, velocidade de agitação da ponta do impelidor entre 15 e 100 cm/s; oxigénio dissolvido a um valor entre 15 e 40% de saturação do ar; pH de 5,0 a 6,0; valor de ART do meio em fermentação abaixo de 0,5 g/L.
Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, a etapa de indução compreende introdução no dito Biorreator dos materiais Celufloc, bagaço de cana-de-açúcar in natura ou pré-tratado, com adição de solução salina, em que dita solução salina é fonte de suplementação do meio de cultura constituída de fontes assimiláveis de nitrogénio, fósforo, magnésio, potássio, enxofre e oxigénio e micro- elementos como, manganês, cobalto, zinco, molibdênio, níquel, cobre e boro para induzir a produção de enzimas.
Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, a etapa de indução compreende suplementação com materiais adicionais como farelo de soja ou pectina, ou resíduos industriais ricos em pectina como resíduos de produção de suco de laranja e de maçã. Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, o controle da introdução da fonte de nitrogénio nas etapas de crescimento e de indução ser efetivada com base no controle de pH que é realizado pela adição de solução aquosa de NH40H 2M a 4M ou de NH3 em forma gasosa.
Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, ao término da etapa de indução, o conteúdo do Biorreator é imediatamente transferido para um reator de hidrólise ou para um tanque de espera.
Em uma realização preferencial da presente invenção, o processo compreende adicionalmente uma etapa de recuperação das enzimas contidas no tanque de espera, em que dita recuperação ocorre pela agregação à suspensão do tanque de espera de um auxiliar de filtração, como a terra diatomácea ou outro auxiliar de filtração na proporção de 1 a 10% p/v com posterior processamento e recuperação das ditas enzimas presentes no filtrado em um dispositivo de separação de sólidos, em que a concentração das enzimas contidas no filtrado ou no sobrenadante , de qualquer dessas operações unitárias de separação de sólidos, ser efetuada por precipitação das enzimas por efeito "salting-out", ultrafiltração, liofilização ou secagem por "spray-dryer" .
É ainda um objeto da presente invenção, o uso da enzima produzida pelo processo na hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica .
Em uma realização preferencial do uso da presente invenção, a biomassa lignocelulósica é selecionada do grupo consistindo de resíduos agrícolas como palha, sabugo de milho, casca de arroz, resíduos de madeira, bagaço, palha de cana-de-açúcar ou combinações dos mesmos. Breve Descrição das Figuras
Figura 1 - Fluxograma do processo de produção de enzimas com o fungo filamentoso Penicillium echinulatum para uso na hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica .
Figura 2 - Gráfico de barras da atividade FPase por tempo, utilizando as biomassa bagaço in natura (INB), Celufloc (CE) Bagaço Ácido Deslignifiçado (BAD) , Bagaço Hidrotérmico (BH) E Bagaço Explodido por vapor e Deslignifiçado (DSB) .
Figura 3a e 3b- Variação da concentração de celulose e de FPase com tempo para P. echinulatum cultivado com Celufloc™ 200 em modo batelada (À) , batelada-alimentada 2 pulsos (♦) e batelada -alimentada 4 pulsos (■) em biorreator.
Figura 4 - Perfil de proteínas detectadas no sobrenadante para os cultivos em modo batelada (A) , batelada-alimentada 2 pulsos (♦) e batelada -alimentada 4 pulsos (□) em biorreator.
Figura 5 - Variação de FPase (símbolos fechados) e concentração de proteína (símbolos abertos) com tempo para P. echinulatum cultivado com BED por batelada com pH controlado por NaOH (♦, 0) /batelada com pH controlado por NH4OH (■,□) e batelada-alimentada (Α,Δ) em biorretor.
Figura 6 - Relação entre biossíntese de celulase (dada por FPU/mL) , xilanase (□) e β-glucosidase (♦) .
Figura 7 - Variação da atividade enzimática sobre papel de filtro (FPA) em UI/mL com tempo para P. echinulatum cepa S1M29 cultivado nos regimes descontínuo (A) e descontínuo-alimentado (B) . Figura 8 - Cinética da liberação de açúcares redutores totais da hidrólise de bagaço pré-tratado, coquetel de P echinulatum usando Celufloc 200 com fonte de C.
Figura 9 - Cinética da liberação de carboidratos na hidrólise de bagaço pré-tratado, coquetel de P. echinulatum usando BED como fonte de C (glic6_P, glic8_P, xil6_P, xil8_P) comparado com coquetel enzimático comercial (glic6_CO, glic8_C0, xil6_CO, xil8_CO) .
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção refere-se a um processo de alto desempenho para produção de um complexo enzimático por fungos filamentosos, como por exemplo o fungo filamentoso P. echinulatum destinado à hidrólise enzimática de biomassa de bagaço e/ou palha de cana-de-açúcar pré-tratados ou não. Referido processo é executado em um regime de batelada alimentada baseado na adição controlada de fontes de carbono constituída de bagaço e palha de cana-de-açúcar e outras substâncias, para indução das enzimas com a posterior adição de fontes nitrogénio, facilmente assimiláveis em biorreator, operando por fermentação submersa .
No contexto da presente invenção, "complexo enzimático" deve ser entendido como pelo menos uma enzima capaz de catalisar a hidrólise de materiais lignocelulósicos , como por exemplo celulases (e.g. endoglicanases , celobiohidrolases , β-glicanases , entre outros) ou hemicelulases (e.g. endoxilanase, exoxilanase, esterase, entre outros).
Também é descrita a modulação da atividade deste complexo enzimático e outras proteínas relevantes, secretadas no meio de fermentação, por meio da variação ou combinação em diferentes proporções de fontes de carbono (biomassa) .
Entende-se por modulação a modificação das condições do meio em que dito complexo será obtido, para alcançar as atividades desejadas na presente invenção.
Entende-se por condições do meio, os parâmetros que possam modificar a atividade do dito complexo, como por exemplo, mas não restritivamente, pH, temperatura, fonte de carbono, porcentagem de saturação do ar por oxigénio, frequência de agitação, entre outras condições, que se julgarem definidoras de dita atividade em presente relatório. Vantajosamente foi verificado que alterando as condições ambientais é possível modificar o perfil enzimático agregando melhorias ao processo, o que torna a presente invenção economicamente viável, superando assim o estado da técnica.
Entende-se por diferentes proporções como, a quantidade necessária de aporte das fontes de carbono e nitrogénio, para se obter alto desempenho de produção, através do alcance de desejada velocidade de produção de enzimas e atividades enzimáticas.
O processo da presente invenção é executado em um regime de batelada alimentada que se baseia na adição controlada de fontes de carbono, constituída de bagaço e/ou palha de cana-de-açúcar pré-tratado de forma conveniente ou in natura, as quais são efetivas na indução das ditas enzimas em biorreator que opera por fermentação submersa, com o controle do pH com uma solução aquosa de NH4OH ou em forma de NH3 líquida, como fonte de nitrogénio facilmente assimilável, promovendo um alto teor de atividades enzimáticas e de outras proteínas necessárias para a hidrólise enzimática de matérias lignocelulósicas .
Além disso, a presente patente beneficia o processo de produção de enzima pois, diferente da técnica conhecida sobre a produção de enzima com P. echinulatum, que opera em meio batelada, a atual descrição opera em modo batelada- alimentada. Dessa maneira a presente invenção tem a vantagem de aliviar os microrganismos dos efeitos deletérios da repressão catabólica, da pressão osmótica, causada pelos componentes do meio de cultura, da inibição proveniente do íons NH4 + proporcionado uma maior produtividade ao sistema que é fundamental para minimização do custo da produção das enzimas produzidas.
De forma geral o processo da presente invenção é constituído pelas seguintes etapas:
- Etapa I, de preparação do inoculo com esporos do fungo;
- Etapa II, de crescimento do micélio do fungo;
- Etapa III, de indução do complexo enzimático; e
- Etapa IV, de recuperação do complexo enzimático.
em que a etapa III compreende a adição de fonte de carbono e nitrogénio de forma controlada para modulação das ditas enzimas. Cujo fluxograma ilustrativo está representado, de forma ilustrativa e não-restritiva, na Figura 1.
Em linhas gerais na Etapa I, o meio de inoculo é preparado, para que a suspensão de microrganismo dessa etapa possa ser transferida para a Etapa II. O meio utiliza constitui-se de uma solução salina, em que a dita solução salina é fonte de suplementação do meio de cultura constituída de fontes assimiláveis de nitrogénio, fósforo, magnésio, potássio, enxofre e oxigénio e microelementos como, manganês, cobalto, zinco, molibdênio, níquel, cobre e boro, polisorbato 80, preferencialmente Tween 80, polipropileno glicol, preferencialmente PPG 2000, peptona, um antiespumante , preferencialmente Antifoam B e de outros para que ocorra um crescimento balanceado da biomassa. Adicionalmente, compreende a adição de fontes de carbono facilmente assimiláveis como: glicose, sacarose, glicerol ou combinações dos mesmos.
Para melhor dispersão do micélio é importante agregação ao meio de cultura de polipropileno glicol, denominado PPG 2000 (Dow Química do Brasil) e um antiespumante, Antifoam B (Dow Química do Brasil) .
O processo também pode se beneficiar com adição ao meio de cultura da Etapa I de uma quantidade de celulose microcristalina, Celufloc 200™ (Celuflok Ind e Comercio, Brasil) o que confere ao micélio uma superfície de apoio e permite um desenvolvimento disperso do micélio.
A Etapa I geralmente é efetuada em Frascos Erlemmeyer ou Fernbach seguido de uma etapa em Tanque Multiplicador, incubados à temperatura adequada, com relação de volume de meio para volume total e frequência de agitação e insuflação de ar estéril que permitam oxigenação suficiente do meio para o conveniente desenvolvimento da cultura (Figura 1 - Etapa de inoculo) .
Na Etapa II, de crescimento, a suspensão de microorganismo é transferida para Biorreator (Figura 1- Biorreator) com controles de temperatura, oxigénio dissolvido, pH e frequência de agitação em níveis adequados e meio de cultura que tem como objetivo promover o crescimento disperso do micélio sem interferir na capacidade de indução das enzimas de interesse do mencionado processo.
Neste sentido, são utilizados como fonte de carbono, carboidratos facilmente assimiláveis, mas que seja neutro em termos de repressão catabólica como, por exemplo, mas não exclusivamente, sacarose, melaço, xarope ou calda de cana-de-açúcar ou glicerol ou resíduos industriais que contenham essas fontes de carbono.
Esse meio deve ser suplementado com fontes, facilmente assimiláveis de nitrogénio, fósforo, magnésio, potássio, enxofre e oxigénio e de micro-elementos como manganês, cobalto zinco, molibdênio, níquel cobre e boro e de outros para que ocorra um crescimento balanceado da biomassa. Para melhor dispersão do micélio é importante agregação ao meio de cultura polipropileno glicol denominado PPG 2000 (Dow Química do Brasil) e um antiespumante Antifoam B (Dow Química do Brasil). Alternativamente, durante a Etapa II, pode-se acrescentar em baixas concentrações ao meio de cultura, bagaço ou palha de cana-de-açúcar pré-tratada convenientemente de tal forma que possua baixo teor de lignina, para que o crescimento do micélio ocorra de forma dispersa .
Na Etapa III, de indução do complexo enzimático, os controles de temperatura, oxigénio dissolvido, pH e frequência de agitação são ajustados para níveis adequados de biossíntese das enzimas. Em seguida, são adicionadas ao Biorreator (Figura 1 - Biorreator) , de forma pré-ajustada, massas precisas de fontes de carbono ao longo do tempo da corrida de fermentação, ou seja, efetua-se o controle da adição da fonte de carbono, para a promoção da indução da biossintese do complexo enzimático de interesse. As fontes de carbono usadas para se conseguir esse efeito são bagaço ou palha de cana-de-açúcar in natura ou pré-tratada convenientemente, de tal forma que possuam baixo teor de lignina ou resíduos lignocelulósicos agrícolas ou industriais ricos em celulose.
O uso de lignina pode causar dois efeitos: a) inibição por componentes fenólicos da própria lignina e b) adsorção irreversível. A Inibição é amplamente superada, pelo aporte controlado de materiais ricos neste composto; a adsorção irreversível é irrisória frente à quantidade de enzima formada pelo fungo. Esta adsorção é da ordem de no máximo 100 mg de proteína / g de lignina. O bagaço explodido, por exemplo, tem no máximo 25% de lignina. Em uma realização preferencial do processo da presente invenção, devido a ser realizado em modo batelada alimentada, o processo da presente invenção preferencialmente utiliza cerca de 100 g/L de BEX (ou superior) e forma preferencialmente cerca de até 20 g/L de proteína total. Isto seria cerca de no máximo 25 g/L de lignina ou adsorção de 25 g lignina/l x 0,1 g proteína/g de lignina, ou seja, no máximo 2,5 g/l de proteína adsorvida num total de 20 g/L. O uso de material sem lignina poderia ser vantajoso neste aspecto. Porém o custo deste material (como por exemplo Celufloc 200) é muito superior ao do BEX (R$ 4/kg contra R$ 0,1/kg) compensando financeiramente em muitas ordens de grandeza a perda de proteína por adsorção. Durante a adição pré-ajustada dessas fontes de carbono, alternativamente, pode-se suplementar o meio reacional com outras fontes de carbono para modulação das atividades enzimáticas, como por exemplo, mas não exclusivamente, bagaço de cana-de-açúcar seco, moído e convenientemente classificado, celulose microcristalina como Celufloc 200 ™, farelo de soja comercial, liquor residual proveniente do pré-tratamento a vapor de biomassa lignocelulósica rico em xilose e xilo-oligossacarídeos , pectina e resíduos agrícolas ricos em pectina. Durante a Etapa III não deverá haver limitação de nitrogénio porquanto fonte de nitrogénio facilmente assimilável, como NH3 ou NH4OH, é introduzida no biorreator "on demand" (sob demanda) usando o controle automático de pH. Ao final da Etapa III, o conteúdo do biorreator é, preferencialmente, refrigerado, e o complexo enzimático com atividade hidrolítica de biomassa lignocelulósica, que é o produto do processo, é recuperado.
Por exemplo, em uma realização preferencial da presente invenção, se o volume útil do Biorreator é de 1 m3, a massa total de fonte de carbono a ser introduzida é de 20 a 80 kg de fonte de carbono. Essa carga deve ser introduzida parceladamente a cada 12 a 48 h, preferencialmente a cada 6 a 12 h, no Biorreator, perfazendo-se o número máximo de cargas de 2 a 8 vezes. Dessa maneira, de forma não restritiva no exemplo especificado, 20 kg de fonte de carbono devem ser introduzidos no Biorreator em 2 vezes de 10 kg de massa em cada carga, preferencialmente a cada 6 a 12 h; ou 80 kg de fonte de carbono devem ser introduzidos em 8 vezes de 10 kg de massa cada carga preferencialmente a cada 6 a 12 h, perfazendo-se um tempo total de, respectivamente, 12 a 24 h para o primeiro caso e 48 a 96 h, para o segundo.
Na etapa IV, de recuperação do produto, o conteúdo do biorreator, preferencialmente, mas não necessariamente refrigerado, é transferido para um Tanque de Espera (Figura 1 - Tanque de Espera) munido de agitação suficiente para manutenção da bxomassa em suspensão.
O produto do processo, que é o complexo enzimático com atividade hidrolitica de biomassa lignocelulósica, pode ser utilizado como tal para efetuar a hidrólise de biomassa lignocelulósica, ou ainda, o conteúdo do biorreator ao final da Etapa III, descrita anteriormente, pode ser usada integralmente como tal para efetuar a hidrólise de biomassa lignocelulósica no Reator de Hidrólise (Figura 1 - Reator de Hidrólise) . Alternativamente o complexo enzimático presente na fase liquida pode ser recuperado pelos métodos convencionais de recuperação de enzimas.
Diferente do estado da técnica, a presente invenção possui vantagens de poder modular o coquetel enzimático em suas atividades de celulase, hemicelulases e atividades enzimáticas acessórias, importantes para a hidrólise do material lignocelulósico, como são as atividades de beta- glucosidadese e pectinase, pela adição previamente estabelecida de indutores daquelas atividades enzimáticas, como por exemplo, mas não exclusivamente, os componentes de meio de cultura descritos na Tabela 2.
Exemplos - realizações preferenciais
Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.
Detalhadamente é descrito um processo em que P. echinulatum linhagem DSM 18942 ou seu mutante M29 são mantidos em geladeira, a 4°C, em tubos inclinados contendo PDA (potato dextrose Agar) , aqui denominado meio de manutenção, sendo realizado o seu repique a cada dois meses para sua manutenção.
Etapa I - Preparação do inoculo com esporos do fungo
Esporos do fungo provenientes dos tubos inclinados são raspados com auxílio de alça de platina e água esterilizada e 10 a 20 pL da suspensão são inoculados em cerca de 20 mL de PDA contidos em placas de Petri que possuem 10 cm de diâmetro e mantidos em estufa a 29°C por 7 dias. Uma suspensão de esporos é preparada com água esterilizada e Tween 80 e transferida para o Meio de inoculo (Tabela 2) a uma razão de 10% v/v de suspensão de esporos por Meio de inoculo. O Meio de inoculo é mantido em frascos Erlenmeyer ou Fernbach a 28-30°C a 200 RPM por 24 a 48 horas a uma razão de 10% v/v de volume total dos frascos Erlenmeyer ou Fernbach. Em seguida, o conteúdo dos frascos Erlenmeyer ou Fernbach é examinado quanto à pureza da fermentação por microscopia ótica e coloração standard de Gram. Em caso negativo de contaminação, as suspensões contidas nos frascos são reunidas em um frasco estéril, denominado aqui de frasco de inoculação.
Em paralelo às operações acima descritas, o Tanque de Multiplicação é carregado com 70% de seu volume total com Meio de Inoculo descrito na Tabela 2 e é convenientemente esterilizado a 121°C por 20 a 30 minutos, com vapor superaquecido, pelos métodos convencionais. Após a esterilização, a temperatura é ajustada a 29 - 30°C e a concentração de oxigénio é mantida, pelos métodos convencionais, acima de 30% de saturação do ar. Em seguida, é efetuada a transferência da suspensão de esporos do frasco de inoculação em condições de máxima assepsia, para o Tanque de Multiplicação da Figura 1. A relação entre o volume de suspensão de esporos e o volume de Meio de Inoculo contido no Tanque de Multiplicação é de 0,05 a 0,10. A multiplicação da biomassa é então realizada e após 24 a 48h a Etapa I, de preparação do inoculo, é finalizada. Para os fins a que se destina, o volume do Tanque de Multiplicação é, de preferência, 10 a 30 vezes menor que o Biorreator da etapa II subsequente e, alternativamente, o processo realizado no Tanque de Multiplicação acima descrito pode ser repetida até 3 vezes, para que se obedeça a relação de 10 a 30 vezes entre o Tanque de Multiplicação e o Biorreator representados na Figura 1.
Etapa II - Crescimento do micélio do fungo
Paralelamente à Etapa I, de preparação de inoculo, o Biorreator da Figura 1 é carregado com 50% a 70% de seu volume total com o Meio de Crescimento descrito na Tabela 2 e é convenientemente esterilizado ou sanitizado por métodos conhecidos pelo estado da arte para manutenção de uma operação satisfatória do ponto de vista de contaminações com micro-organismos deletérios ao processo.
Após a esterilização, a temperatura é ajustada a 29 - 30°C, assim como a frequência de agitação, para uma velocidade da ponta do impelidor de cerca de 15 a 20 cm/s e o pH, para um "set point" de 5,0 a 6,0, mas preferencialmente a 6,0. Em seguida, é feita a transferência asséptica do volume contido no tanque de Multiplicação para o Biorreator da Figura 1. O valor do pH é controlado durante toda a Etapa II com injeção automática no meio em fermentação de solução aquosa de H2S04 2M a 4M e solução aquosa de NH4OH ou NH3 em forma gasosa. A concentração de oxigénio dissolvido do meio em fermentação é mantida pela variação da frequência de agitação e/ou vazão de ar estéril insuflado na base do Biorreator da Figura 1, a valor igual ou superior a 15 a 40% de saturação do ar, mas preferencialmente acima de 30%. O valor máximo da frequência da agitação não deve ultrapassar 60 a 100 cm/s, preferencialmente 70 cm/s. A etapa II de crescimento é realizada e é finalizada após 24 a 48h. Preferencialmente, ao final dessa da etapa II o valor de açucares redutores totais (ART) do meio em fermentação, medido segundo metodologia convencional, por exemplo, de forma não restritiva, pelo método descrito em Pradella, 1980, deve ser abaixo de 1,0 g/L, preferencialmente abaixo de 0,5 g/L. Imediatamente após esse ponto, a Etapa III é iniciada .
Etapa III - Indução do complexo enzimático:
Durante toda essa etapa, o valor do pH é controlado com injeção automática de solução aquosa de H2S04 2M a 4M e solução aquosa de NH4OH ou NH3, que também promove a adição controlada dessa fonte de nitrogénio, em forma gasosa no meio em fermentação no valor de 5,0 a 6,0, preferencialmente em 6,0. A concentração de oxigénio dissolvido do meio em fermentação é mantida pela variação da frequência de agitação e/ou vazão de ar estéril insuflado na base do Biorreator da Figura 1, a valor igual ou superior a 15 a 40% de saturação do ar, mas preferencialmente acima de 30%. 0 valor máximo da frequência da agitação não deve ultrapassar 60 a 100 cm/s preferencialmente 70 cm/s.
Imediatamente depois de finalizada a Etapa II, o Meio de Indução descrito na Tabela 2 que é composto por 20 a 80 kg/m3 de Celufoc 200™ ou 20 a 80 kg/m3 de bagaço ou palha de cana-de-açúcar pré-tratados para se obter baixo teor de lignina é introduzido no Biorreator (Figura 1), segundo um protocolo de adição previamente estabelecido, de tal forma que: seja minimizada a repressão catabólica que se verifica com fungos filamentosos produtores de complexos enzimáticos celuloliticos , que seja minimizada o efeito de transferência de massa, calor e quantidade de movimento que ocorre quando se opera com materiais sólidos suspensos em meio liquido. Esse material é introduzido no Biorreator, de preferência em partículas secas com umidade de preferência, abaixo de 50%, mais preferencialmente ainda, abaixo de 20%, em condições sanitárias adequadas. A massa total das fontes de carbono acima mencionadas é calculada segundo a razão da concentração indicada na Tabela 3 e o volume útil do Biorreator (Figura 1) .
Por exemplo, de forma não restritiva, se o volume útil do Biorreator é de 1 m3, a massa total de fonte de carbono a ser introduzida é de 20 a 80 kg de fonte de carbono. Essa carga deve ser introduzida parceladamente a cada 12 a 48 h, preferencialmente a cada 6 a 12 h, no Biorreator, perfazendo-se o número máximo de cargas de 2 a 8 vezes. Dessa maneira, de forma não restritiva, no exemplo especificado, 20 kg de fonte de carbono devem ser introduzidos no Biorreator em 2 vezes de 10 kg de massa em cada carga, preferencialmente a cada 6 a 12 h; ou 80 kg de fonte de carbono devem ser introduzidos em 8 vezes de 10 kg de massa cada carga preferencialmente a cada 6 a 12 h, perfazendo-se um tempo total de, respectivamente, 12 a 24 h para o primeiro caso e 48 a 96 h, para o segundo.
Alternativamente as fontes de carbono compreendem bagaço in natura pulverizado, pectina e farelo de soja que podem ser combinados e adicionados, de preferência, mas de forma não restritiva, simultaneamente às fontes de carbono acima especificadas para que, ao final da Etapa III, seja produzido o produto do PROCESSO, que é o complexo enzimático com atividade hidrolitica de biomassa lignocelulósica, com atividades enzimáticas de, por exemplo, FPase, β-glucosidadse, xilanase, arabinofurosidase e pectinase, medidas pelos métodos convencionais descritos na literatura, em níveis requeridos pela hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica. A etapa III, de indução é, assim, realizada e após 96 a 144 h, preferencialmente, mas não restritivamente, finalizada.
Etapa IV - Recuperação do complexo enzimático
Ao término da Etapa de Indução, o conteúdo do Biorreator, de forma preferencial, pode ser imediatamente transferido para o Reator de Hidrólise para que se proceda à hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica convenientemente tratada, segundo o estado-da-arte e que está, de antemão, contida naquele Reator (Figura 1). Alternativamente, o complexo enzimático produzido pode ser recuperado da fase líquida do conteúdo do Biorreator. A suspensão do Biorreator é preferencialmente refrigerada abaixo da temperatura ambiente e transferida para o Tanque de Espera (Figura 1) . Alternativamente, antes da filtração, pode ser adicionado um auxiliar de filtração ao meio, como exemplo não exclusivo, terra diatomácea ou outro auxiliar de filtração na proporção de 1 a 10% p/v, preferencialmente de 1 a 2% p/v.
0 conteúdo do Tanque de Espera é então transferido para Equipamento de Separação de Sólidos como, por exemplo, mas não exclusivamente, filtro de bandejas do tipo "Nutsh", filtro de esteira tipo belt-drive" , centrífuga de cesto, centrífuga tipo "pusher" ou centrífuga "decanter", ou ainda outro processo de separação de sólidos conhecido pelo estado-da-arte (Figura 1 - Equipamento de Separação de Sólidos). Alternativamente, o filtrado ou o sobrenadante de qualquer dessas operações unitárias de separação de sólidos, que é constituído pelo produto do PROCESSO, em sequência, pode ser formulado agregando-se estabilizantes e, alternativamente, concentrado por alguma técnica conhecida do estado-da-arte, a saber, mas não exclusivamente, precipitação de proteínas por "salting- out", ultrafiltração, liofilização ou secagem em "spray- dryer" .
Vantajosamente, sob o ponto de vista industrial, as etapas de crescimento e indução são finalizadas entre 96 a 144 horas.
Além disso, ao término da etapa de indução a suspensão do Biorreator é opcionalmente refrigerada.
Exemplo 1 - Cultivo do Penicillium echinulatum
A cepa de Penicillium echinulatum foi cultivada utilizando bagaço da cana-de-açúcar pré-tratado ou in natura como fonte carbono em experimentos de cultura submersa com frasco agitado. Atividade máxima de papel de filtro (FPase) com valores de 2,4 e 2,6 FPU / mL foram obtidos usando bagaço tratado com hidróxido de sódio e explosão com vapor (BED) e bagaço hidrotermicamente pré- tratado (HB) , respectivamente. Atividades FPase máxima para bagaço tratado com ácido (BAD) e Celufloc 200, os valores encontrados foram de 1,3 e 1,6 FPU / mL, respectivamente, enquanto que em bagaço in natura a atividade da enzima produziada foi mais baixa (~ 0,4 FPU/mL) . Atividade de xilanase e concentração de proteína mostraram tendências semelhantes, no entanto maior atividade β-glucosidase foi obtida com Celufloc como fonte de carbono.
Microscopia eletrônica de varredura e medida das áreas de superfície dos substratos indicaram uma possível correlação entre a facilidade de acesso do micélio fúngico e partículas lignocelulósicas e a atividade FPase do caldo de fermentação.
A hidrólise enzimática de vapor sem pré-tratamento do bagaço (5% w / v) , utilizando o caldo de fermentação sobrenadante (10 FPU / g de biomassa) produziu um rendimento máximo de glucose de 15 g/L, o qual foi maior do que o obtido utilizando um complexo de celulase comercial. Os resultados mostraram que tanto a DSB e HB são potenciais fontes de carbono para cultura-submersa para produção da enzima lignocelulolíticos por Penicillium echinulatum .
Exemplo 2 - Ensaios com Celufloc 200™ como fonte de C, cepa DSM 18942:
A cepa de P. echinulatum DSM 18942 foi transferida para o meio de inoculo modificado conforme descrito na Etapa I. O meio de inoculo foi transferido para biorreator contendo 10 g/L de celulose Celufloc 200. O controle de pH foi realizado com adição automática de uma solução NH4OH:H20 1:3 (v:v) ou por NaOH 2 . O pH foi mantido em valores maiores que 5,0. A temperatura foi mantida em 29°C e o oxigénio dissolvido em valores superiores a 30% empregando controle cascata: Agitação/fluxo de ar.
Foram realizados 03 ensaios:
a) batelada com concentração inicial de Celufloc de 10 g/L;
b) batelada-alimentada com concentração inicial de Celufloc de 10 g/L seguida de 02 adições às 30 e 5 h de fermentação totalizando 30 g de Celufloc
c) batelada-alimentada com concentração inicial de Celufloc de 10 g/L seguida de 04 adições às 43, 70, 113 e
143 h totalizando 65 g de Celufloc.
Celufloc 200™ (Cel) foi utilizada como fonte de carbono para cultivo de P echinulatum em modo batelada e em modo batelada-alimentada segundo os protocolos a) , b) e c) foi quase que totalmente consumida atingindo FPase máximas de 0,81; 1,55 e 1,40 FPU/mL, respectivamente, às 143, 137 e 165 h de cultivo (Figura 3) . Pode-se afirmar que o aumento da quantidade de fonte de carbono aportado ao sistema não garantiu elevação do titulo enzimático. O nível de 02 dissolvido para esses ensaios sempre foi acima de 30% da saturação não havendo presumivelmente limitação de transferência de oxigénio no sistema. Repressão catabólica da biossíntese de celulase, como proposto para Tríchoderma reesei (Ilmén et al. 1997), eventualmente pode ter ocorrido, exigindo, se esse for o caso, linhagens menos sensíveis e protocolo de aporte de carbono mais aprimorado.
Considerando-se que não houve variação apreciável de volume, os fatores de conversão de fonte de carbono a enzima produzida, expressos como o quociente da FPU produzida pela massa de Cel consumida (YFPU/C) foram de, respectivamente, 40 FPU/g; 35 FPU/ g e 38 FPU/g para os ensaios realizados, não sugerindo correlação com a forma e quantidade de fonte de carbono adicionada. A concentração de proteínas detectada no sobrenadante (Figura 4) aumenta de maneira similar à atividade FPase, para os três ensaios realizados, no entanto, após aproximadamente 144 horas de cultivo, enquanto a atividade sofre queda, a quantidade de proteínas detectada permanece constante. A queda da atividade das celulases sugere que a liberação de enzimas no meio pelo micro-organismo cessa. Uma maior produção de proteínas é observada no ensaio com dois e quatro pulsos, uma vez que houve maior fornecimento de fonte de carbono. No entanto, os valores de concentração de proteína no sobrenadante de 04 pulsos não foram superiores em relação aos de 02 pulsos, indicando haver inibição da secreção de proteínas por excesso de aporte de substrato.
Exemplo 3 - Bagaço explodido e deslignifiçado como fonte de C. cepa D5M18942
A cepa de P. echinulatum DSM 18942 foi transferida para o meio de inoculo e incubado conforme descrito. O meio de inoculo foi transferido para biorreator contendo meio de indução suplementado com sacarose (7 g/L de bagaço explodido e deslignifiçado e 3 g/L de sacarose) . O controle de pH foi realizado com adição automática de uma solução NH4OH:H20 1:3 (v:v) ou por NaOH 2M. O pH foi mantido em valores maiores que 5,0. A temperatura foi mantida em 29°C e o oxigénio dissolvido em valores superiores a 30% empregando controle cascata: Agitação/fluxo de ar.
Foram realizados 03 ensaios:
a) batelada com concentração inicial de bagaço explodido e deslignifiçado de 10 g/L com controle de pH com solução NH4OH:H20 1:3 (v:v);
b) batelada com concentração inicial de bagaço explodido e deslignifiçado de 10 g/L com controle de pH com solução NaOH 2M;
c) batelada-alimentada com concentração inicial de bagaço explodido e deslignifiçado de 10 g/L seguida de 04 adições às 24, 48, 72 e 96 h totalizando 30 g bagaço explodido e deslignifiçado .
Bagaço pré-tratado por explosão a vapor e deslignifiçado (BED) foi utilizado como fonte de carbono para cultivo de P. echinulatum em biorreator conduzido em modo batelada e em modo batelada-alimentada. BED adicionado a 15g (10 g/L; Volume útil = 1,5 L) em modo batelada com controle de pH por adição de NH4OH ou NaOH, ou 30 g em modo batelada-alimentada admitida ao biorreator.
A fonte de carbono BED foi consumida em cerca de 150 h atingindo FPase máxima de 1,3 FPU/mL e 1,5 FPU/mL para NaOH e NH4OH, respectivamente, às 120 h e 3,7 FPU/mL, para batelada alimentada, às 144 h (Figura 5) . Valores de YFpu/c calculados foram de, respectivamente, 87 FPU/g; 100 FPU/ g e 120 FPU/g, muito superior ao encontrados com Celufloc 200
TM
Algo interessante é que a concentração de proteína secretada no sobrenadante está correlacionada com a atividade de FPase do caldo fermentado indicando alta seletividade durante a biossintese do CEC (Figura 5) . A secreção de xilanases e β-glucosidase parecem também estar coordenadas com a secreção de celulases e valores máximos dessas atividades foram, respectivamente, 90 UI/mL e 3,9 UI/mL (Figura 6) . A suplementação do meio de cultura e o aprimoramento do processo batelada-alimentada utilizando BED como fonte de carbono deve propiciar aumentos mais expressivos dos títulos enzimáticos.
Exemplo 4 - Ensaios com Celufloc 200™ como fonte de C, cepa S1M29:
A cepa de P. echinulatum S1M29 foi cultivada em meio de cultura Celufloc meio com concentrações crescentes de fonte de carbono (2, 3 e 4% p/v) , em biorreator de bancada (Bioflo 115, New Brunswick Scientific, EUA) com temperatura controlada em 28°C, pH de 6,0 e oxigénio dissolvido acima de 30% de saturação do meio de cultura com ar. Amostras foram retiradas e as atividades enzimáticas do caldo fermentado foram medidas. Foram utilizados dois métodos de cultivo: regime descontínuo ou batelada (RD) e regime descontínuo-alimentado ou batelada-alimentada (RDA) . No primeiro (RD) a carga total de fonte de carbono era adicionada no início do cultivo, no segundo (RDA) a carga de fonte de carbono foi distribuída ao longo do cultivo. A Figura 7 sumariza os resultados obtidos.
Como pode se observar os valores mais altos de FPA foram obtidos quando o fungo foi cultivado em regime descontínuo- alimentado (RDA). A atividade mais alta obtida foi de 8,3 UI/mL em 144h de cultivo com 4% p/v de Celufoc.
Exemplo 5 - Ensaios de hidrólise com o complexo enzimático produzido
O sobrenadante do ensaio em batelada-alimentada, com concentração inicial de Celufloc de 10 g/L, seguida de 02 adições às 30 e 54 h de fermentação de 30 g, foi utilizado em ensaio de hidrólise e comparado com os preparados enzimáticos comerciais Accelerase 1000 Genencor, Accelerase 1500 Genencor, Powercell solução 1%.
Foram utilizados Erlenmeyers de 250 mL contendo 3 g em base seca de substrato bagaço pré-tratado por explosão a vapor, 2 mL de solução de azida 2% (20g/L) , 15 FPU da enzima/g substrato seco (ou seja, 45 FPU) , completando o volume para 100 mL com tampão citrato pH 4,8 - .5,0 mM. O controle consistiu de um frasco sem enzima. A atividade de papel de filtro foi medida e calculada previamente conforme o método de Ghose (1987) para todos os complexos enzimáticos. Os frascos foram mantidos em shaker a 50°C e 150 RPM. Aliquotas de 2 mL foram retiradas durante o período de amostragem. As amostras foram centrifugadas a 5000 RPM por 5 minutos e o sobrenadante foi analisado para determinação dos açúcares redutores pelo método do DNS (MILER, 1959) e cromatografia líquida (HPLC Dionex Ultimate 3000 coluna Aminex HPX-87P 300 mm X , 8 mm X 9 pm, temperatura 80°C, fluxo 0,6 mL/min, detector IR).
A Figura 8 mostra a cinética de liberação de açúcares redutores pelos complexos enzimáticos.
No ensaio de hidrolise de bagaço pré-tratado, o complexo enzimático que apresentou os melhores resultados foi o Powercell comercial. O sobrenadante de P. echinulatum apresentou resultados similares às demais enzimas comerciais testadas. As amostras finais foram submetidas à cromatografia liquida e foi verificada apenas a presença de glicose nos sobrenadantes de todas as amostras, com exceção do controle, que não apresentou picos no cromatograma.
Em outro experimento o coquetel enzimático produzido por P. echinulatum em meio usando BED como fonte de carbono apresentou também desempenho semelhante de coquetel enzimático comercial de T. reesei (Figura 9) mostrando virtualmente o mesmo desempenho de hidrólise de bagaço explodido para dois níveis distintos de carga enzimática. Exemplo 6 - Caracterização do complexo enzimático produzido
O complexo enzimático de P. echinulatum pode ser modulado de acordo com a necessidade e para isso foi realizado uma série de experimentos para demonstrar essa possibilidade. P. echinulatum cepa DSM18942 foi cultivada em várias fontes de carbono, a saber, Celufloc (CE) , bagaço in natura (BIN) , bagaço tratado hidrotermicamente (BH) , bagaço tratado por explosão a vapor (BEX) , bagaço tratado por explosão a vapor e subsequentemente deslignifiçado com NaOH à quente para remoção de lignina (BED) , bagaço tratado com H2S04 e subsequentemente deslignifiçado com NaOH à quente para remoção de lignina (BAD) , Figura 2. Estes experimentos foram realizados em mesa agitadora a 29°C e 200 rpm, incubados por 144h até que os picos das atividades enzimáticas fossem alcançados, com meio de cultura apresentado na Tabela 3. Os materiais assim preparados foram analisados quanto à sua composição de celulose, hemicelulose, lignina e outros e os resultados estão apresentados na Tabela 2.
A Tabela 1 apresenta os picos das atividades enzimáticas atingidas. Os sobrenadantes desses experimentos foram então submetidos a uma análise da proteômica destes sobrenadantes efetivadas por espectrometria de massa por ALDI-TOF para acessar o secretoma de P. echinulatum cultivado naquelas diferentes fontes de carbono.
A Tabela 5 sumariza os resultados da análise de proteômica realizada. Fica bastante evidente que é possível variar a composição do coquetel enzimático secretado por P echinulatum dependendo da fonte de carbono indutora utilizada (Tabela 5) . Por exemplo, quando foi utilizado bagaço in natura (INB) ou celulose microcristalina Celufloc (CE) um grande número de enzimas glicohidrolases das famílias GH12, GH17 e GH3 respectivamente, xiliglucanases , xiliglucano hidrolases e beta-glicosidades foram detectadas no secretoma de P. echinulatum. Quando foi utilizado INB foram detectadas arabinofuranosidase, pectinases, esterases e monooxigenases , respectivamente famílias GH62, PL4, CEI e GH61, todas proteínas acessórias extremamente importantes para se obter uma eficiente hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos . Por outro lado, ao desejar privilegiar a síntese de celulases propriamente ditas como as celobiohidrolases e endoglucanases (família GH6) o uso de bagaços pré-tratados , como o BED, HB e BAD, é mais conveniente, como mostra claramente os resultados expostos na Tabela 5.
Dessa maneira, o coquetel enzimático de P. echinulatum pode ser modulado a partir da introdução na fase de indução do complexo enzimático as fontes de carbono assim descritas, em diferentes métodos de alimentação, ou uma combinação dessas fontes para obter coquetéis que privilegiam as requeridas atividades enzimáticas. Tabela 1: Pico das atividades enzimáticas
Figure imgf000043_0001
Tabela 2- Composição dos meios utilizados: por m3 de meio de cultura.
Meio de Meio de Meio de
Composição
Inoculo Crescimento Indução
Celulose Celufloc
10 kg 20 a 80 kg 200™ (3)
Bagaço de cana- de-açúcar pré- 10 a 20 kg 20 a 80 kg tratado (3>
Sacarose, xarope
3 a 6 kg de
ou melaço de
cana -de -açúcar
Glicose 10 kg -
Bagaço in natura,
pectina, farelo 2 a 8 kg de soja
Extrato de
0,3 a 0,6 kg
levedura
Peptona 1 kg
Farelo de soja 0,2 a 0,8 kg Solução salina (1> 100 L 100 L 100 a 200 L
Tween 80 1 L 1 L
PPG 2000 1 L 1 L
Antifoam B 0, 1 L 0,1 L
A solução salina empregada tem a seguinte composição em kg/m3: KH2P04 20; (NH4)2S04 14; uréia 3; MgSO4.7H20 3; CaCl2 3; FeS04.7H20 0, 05; ZnSO4.7H20 0,014; MnSO4.H20 0, 016; CoCl2 0, 02. O pH é ajustado para 5,3, a solução salina foi esterilizada em autoclave a 121°C por 20 min e estocada em geladeira até o uso.
^-pç . açucares redutores totais.
(3> Vide composição na Tabela 3
Tabela 3 - Composição das fontes de carbono utilizadas, em
% da massa seca.
Figure imgf000044_0001
Tabela 4 - Código dos materiais usados
INB Bagaço in natura
CE Celulose microcristalina Celulofloc ™200 (Celuflok Ind. Com. )
BEX Bagaço: tratamento por explosão a vapor
HB Bagaço tratamento hidrotérmico
BED Bagaço: tratamento a vapor e deslignifiçado
BAD Bagaço: tratamento ácido
Tabela 5 - Distribuição de proteínas por família (classificação Cazy) em função do tipo de pré-tratamento empregado em bagaço de cana-de-açúcar usado como fonte de C em cultivo de P. echinulatum
CAZY- familia Função INB CE BED HB BAD
GH
endoglucanase (EC
3.2.1.4);
GH6 16 18 22 20 21 cellobiohydroláse (EC
3.2.1.91)
endo-b-1, 4-glucanase
(EC 3.2.1.4);
reducing end-acting
cellobiohydroláse (EC
GH7 3.2.1.176) ; 22 25 30 38 30 chitosanase (EC
3.2.1.132); endo-b- 1, 3-1, -glucanase (EC
3.2.1.73)
endoglucanase (EC
3.2.1.4); xyloglucan
GH12 hydrolase (EC 5 2 0 0 0
3.2.1.151) ; b-1,3-
1 , -glucanase (EC 3.2.1.73); xyloglucan
endotransglycosylase
(EC 2.4.1.207)
glucan endo-l,3-b- glucosidase (EC
3.2.1.39) ; glucan
1 , 3-b-glucosidase (EC
GH17 3.2.1.58) ; 2 1 0 0 1 licheninase (EC
3.2.1.73) ; b-1,3- glucanosyltransglycos
ylase (EC 2.4.1.-) .
b-glucosidase (EC
3.2.1.21) ; xylan 1,4- b-xylosidase (EC
3.2.1.37) ; b-N- acetylhexosaminidase
(EC 3.2.1.52) ; glucan
1.3-b-glucosidase (EC
GH3 4 3 0 0 0
3.2.1.58) ; glucan
1. -b-glucosidase (EC
3.2.1.74); exo-1,3-
1 , 4-glucanase (EC
3.2.1.-); a-L- arabinofuranosidase
(EC 3.2.1.55) .
GH11 xylanase (EC 3.2.1.8) 2 0 1 0 0 a-L-
GH62 arabinofuranosidase 2 0 0 1 0
(EC 3.2.1.55) endo-1, 4-b-xylanase
(EC 3.2.1.8) ; endo-
GHIO 3 0 3 0 1
1 , 3-b-xylanase (EC
3.2.1.32)
b-xylosidase (EC
3.2.1.37) ; b-1, 3- xylosidase (EC
3.2.1.-); a-L- arabinofuranosidase
(EC 3.2.1.55) ;
GH43 2 0 0 0 0 arabinanase (EC
3.2.1.99); xylanase
(EC 3.2.1.8) ;
galactan 1,3-b- galactosidase (EC
3.2.1.145)
Swolleni
amorfogênese 9 6 5 6 5 na
rhamnogalacturonan
PL4 2 0 0 0 0 lyase (EC 4.2.2.-) .
acetyl xylan esterase
(EC 3.1.1.72) ;
cinnamoyl esterase
(EC 3.1.1.-) ;
feruloyl esterase (EC
CEI 1 0 0 0 0
3.1.1.73) ;
carboxylesterase (EC
3.1.1.1); S- formylglutathione
hydrolase (EC 3.1.2.12)
polysacenaride
GH61 monooxygenases Cu- 1 0 0 0 0 dependente
Total 26 9 9 7 6

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Processo de indução da produção de enzimas por fungo filamentoso Penicillium echinulatum, caracterizado por compreender as etapas de:
(i) preparação de inoculo com esporos do fungo;
(ii) crescimento do micélio do fungo;
(iii) indução da produção de complexo enzimático; e
(iv) recuperação do complexo enzimático;
em que a etapa (iii) compreende a adição de fonte de carbono e nitrogénio de forma controlada para modulação das ditas enzimas.
2. Processo, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fungo filamentoso Penicillium echinulatum ser selecionado do grupo consistindo das linhagens Penicillium echinulatum DSM 18942, Penicillium echinulatum S1M29 ou mutantes destas linhagens.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela adição da fonte de carbono e nitrogénio de forma controlada ser preferencialmente executada sob um regime de batelada alimentada.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela etapa de preparação do inoculo compreender preparação de um meio de inoculo com solução salina, em que dita solução salina é fonte de suplementação do meio de cultura constituída de fontes assimiláveis de nitrogénio, fósforo, magnésio, potássio, enxofre e oxigénio e micro-elementos como, manganês, cobalto, zinco, molibdênio, níquel, cobre e boro, polisorbato 80, polipropileno glicol peptona, antiespumante e por compreender a adição de fontes de carbono facilmente assimiláveis selecionadas do grupo consistindo de glicose, sacarose, glicerol, ou a combinação dos mesmos.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender adicionalmente a adição de celulose microcristalina .
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela etapa de inoculo ser incubada a temperatura de 28 a 30°C e ocorrer preferencialmente em um tanque de multiplicação em que a relação entre o volume de suspensão de esporos e o volume de meio de Inoculo contido no dito tanque de multiplicação é de 0,05 a 0,10 e o tempo de multiplicação ser de 24 a 48h.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela etapa de crescimento compreender um meio de crescimento com solução salina em que dita solução salina é fonte de suplementação do meio de cultura constituída de fontes assimiláveis de nitrogénio, fósforo, magnésio, potássio, enxofre e oxigénio e micro-elementos como, manganês, cobalto, zinco, molibdênio, níquel, cobre e boro, polisorbato 80, polipropileno glicol, peptona, antiespumante , extrato de levedura, farelo de soja e conter a adição de fontes de carbono facilmente assimiláveis selecionadas do grupo que consiste de bagaço pré-tratado, sacarose, xarope ou melaço de cana-de-açúcar, glicerol ou resíduos ricos em glicerol, ou a combinação dos mesmos.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela etapa de crescimento ser efetuada em temperatura entre 29°C - 30°C, preferencialmente em um Biorreator que opera com velocidade de agitação da ponta do impelidor entre 15 e 100 cm/s; oxigénio dissolvido a um valor entre 15 e 40% de saturação do ar; pH de 5,0 a 6,0; valor de ART do meio em fermentação abaixo de 0,5 g/L.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela etapa de indução compreender introdução no dito Biorreator dos materiais Celufloc, bagaço de cana-de-açúcar in natura ou pré- tratado, com adição de solução salina, em que dita solução salina é fonte . de suplementação do meio de cultura constituída de fontes assimiláveis de nitrogénio, fósforo, magnésio, potássio, enxofre e oxigénio e micro-elementos como, manganês, cobalto, zinco, molibdênio, níquel, cobre e boro para induzir a produção de enzimas.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela etapa de indução compreender adicionalmente uma suplementação com materiais adicionais como farelo de soja ou pectina, ou resíduos industriais ricos em pectina como resíduos de produção de suco de laranja e de maçã.
11. Processo, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo controle da introdução da fonte de nitrogénio nas etapas de crescimento e de indução ser efetivada com base no controle de pH que é realizado pela adição de solução aquosa de NH40H 2M a 4M ou de NH3 em forma gasosa.
12. Processo, de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que ao término da etapa de indução o conteúdo do Biorreator é imediatamente transferido para um reator de hidrólise ou para um tanque de espera.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender adicionalmente uma etapa de recuperação das enzimas contidas no tanque de espera, em que dita recuperação ocorre pela agregação à suspensão do tanque de espera de um auxiliar de filtração, como a terra diatomácea ou outro auxiliar de filtração na proporção de 1 a 10% p/v com posterior processamento e recuperação das ditas enzimas presentes no filtrado em um dispositivo de separação de sólidos, em que a concentração das enzimas contidas no filtrado ou no sobrenadante, de qualquer dessas operações unitárias de separação de sólidos, ser efetuada por precipitação das enzimas por efeito "salting-out", ultrafiltração, liofilização ou secagem por "spray-dryer" .
14. Uso da enzima, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado por ser na hidrólise enzimática de biomassa lignocelulosica.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela biomassa lignocelulosica ser selecionada do grupo consistindo de resíduos agrícolas como palha, sabugo de milho, casca de arroz, resíduos de madeira, bagaço, palha de cana-de-açúcar ou combinações dos mesmos.
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