WO2014058031A1 - 酸性化合物の検出方法 - Google Patents

酸性化合物の検出方法 Download PDF

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acidic compound
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一謹 佐々木
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ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an acidic compound, and particularly to a method for detecting an acidic compound that does not contain a basic residue using a mass spectrometer.
  • Acidic compounds typified by phosphate compounds and organic acids are important for understanding energy metabolism in the living body as intermediates of glycolysis, but there are acidic compounds that exist only in trace amounts in living organisms. Therefore, an analytical technique capable of detecting an acidic compound with high sensitivity is desired.
  • detection in the negative mode of [MH] ⁇ is generally performed by a mass spectrometer (MS).
  • Non-Patent Document 1 a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) is connected to capillary electrophoresis (CE) and detected as [MH] ⁇ ions.
  • TOF-MS time-of-flight mass spectrometer
  • CE capillary electrophoresis
  • QqQMS triple quadrupole mass spectrometer
  • LC liquid chromatography
  • precursor ions also referred to as precursor ions
  • an acidic compound that does not contain a basic residue in a solvent containing ammonium carbonate is detected in the positive mode, but the negative mode is more sensitive.
  • the precursor ions are cleaved with a tandem mass spectrometer and distinguished by the difference in product ions (also called product ions).
  • product ions also called product ions.
  • the main product ion is often a phosphate ion, and it is difficult to distinguish isomers.
  • an object of the present invention is to detect an acidic compound not containing a basic residue with high sensitivity using a mass spectrometer.
  • an acidic compound having an acidic residue and not containing a basic residue is dissolved in a solvent containing formic acid, acetic acid or butyric acid and the following base, and then in a positive mode using a mass spectrometer.
  • a method for detecting an acidic compound which is characterized by detecting.
  • the acidic compound to be detected can be a phosphate compound that does not contain a basic residue.
  • the acidic compound to be detected can be an organic acid that does not contain a basic residue.
  • the acidic compound to be detected can be a sulfuric acid compound that does not contain a basic residue.
  • the acidic compound can be detected by using the mass spectrometer as a tandem mass spectrometer and using the generated ions as precursor ions.
  • the phosphoric acid compound 2-Phosphoglyceric acid, 2,3-Bisphosphoglyceric acid, 3-Phosphoglyceric acid, 6-Phosphogluconic acid, Dihydroxyacetone phosphate, Erythrose 4-phosphate, Fructose 1-phosphate, Fructose 6-phosphate, Fructose 1 , 6-bisphosphate, Galactose 1-phosphate, Glucose 1-phosphate, Glucose 6-phosphate, Glyceraldehyde 3-phosphate, Glycerol 3-phosphate, Mannose 1-phosphate, Mannose 6-phosphate, Phosphoenolpyruvic acid, Phosphoribosyl pyrophosphate, Ribose 5-phosphate , Ribose 1-phosphate, Ribulose 5-phosphate, Sedoheptulose 7-phosphate, and Xylulose 5-phosphate.
  • m / z141 ⁇ 0.5 or m / z99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of 2-phosphoglyceric acid using the tandem mass spectrometer.
  • m / z277 ⁇ 0.5 or m / z259 ⁇ 0.5, m / z99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of 2,3-Bisphosphoglyceric acid using the tandem mass spectrometer.
  • m / z141 ⁇ 0.5 or m / z99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as the product ion of 3-phosphoglyceric acid using the tandem mass spectrometer.
  • m / z259 ⁇ 0.5 or m / z99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of 6-phosphogluconic acid using the tandem mass spectrometer.
  • m / z171 ⁇ 0.5 or m / z99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Dihydroxyacetone phosphate using the tandem mass spectrometer.
  • m / z99 ⁇ 0.5 or m / z85 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Erythrose®4-phosphate using the tandem mass spectrometer.
  • m / z 243 ⁇ 0.5 or m / z 145 ⁇ 0.5, m / z 99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Fructose 1-phosphate.
  • m / z 243 ⁇ 0.5 or m / z 109 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Fructose ⁇ 6-phosphate using the tandem mass spectrometer.
  • m / z323 ⁇ 0.5 or m / z207 ⁇ 0.5, m / z127 ⁇ 0.5, m / z109 ⁇ 0.5 is selected and detected as a product ion of Fructose 1,6-bisphosphate be able to.
  • m / z261 ⁇ 0.5 or m / z116 ⁇ 0.5, m / z99 ⁇ 0.5, m / z91 ⁇ 0.5, or m / z91 ⁇ 0.5 can be selected and detected as the product ion of Galactose 1-phosphate. it can.
  • m / z261 ⁇ 0.5 or m / z116 ⁇ 0.5, m / z99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Glucose 1-phosphate using the tandem mass spectrometer.
  • tandem mass spectrometer it is possible to select and detect m / z 243 ⁇ 0.5 or m / z 127 ⁇ 0.5, m / z 109 ⁇ 0.5, m / z 99 ⁇ 0.5 as a product ion of Glucose 6-phosphate. it can.
  • m / z171 ⁇ 0.5 or m / z99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Glyceraldehyde 3-phosphate using the tandem mass spectrometer.
  • m / z99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Glycerol® 3-phosphate using the tandem mass spectrometer.
  • m / z 163 ⁇ 0.5 or m / z 145 ⁇ 0.5, m / z 85 ⁇ 0.5 can be selected and detected as the produced ion of Mannose® 1-phosphate.
  • m / z 243 ⁇ 0.5 or m / z 109 ⁇ 0.5, m / z 99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as the produced ion of Mannose 6-phosphate.
  • m / z 169 ⁇ 0.5 or m / z 151 ⁇ 0.5, m / z 43 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Phosphoenolpyruvic® acid using the tandem mass spectrometer.
  • m / z 169 ⁇ 0.5 or m / z 151 ⁇ 0.5, m / z 43 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Phosphoribosyl pyrophosphate using the tandem mass spectrometer.
  • m / z97 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Ribose 5-phosphate using the tandem mass spectrometer.
  • m / z133 ⁇ 0.5, m / z116 ⁇ 0.5, m / z99 ⁇ 0.5, or m / z99 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Ribose 1-phosphate using the tandem mass spectrometer.
  • m / z273 ⁇ 0.5 or m / z219 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Sedoheptulose-7-phosphate using the tandem mass spectrometer.
  • m / z231 ⁇ 0.5 or m / z133 ⁇ 0.5, m / z115 ⁇ 0.5, m / z97 ⁇ 0.5, m / z55 ⁇ 0.5 are selected as the product ions of Xylulose 5-phosphate And can be detected.
  • the organic acid can be 3-hydroxybutyric acid, gluconic acid, or mevalonic acid.
  • m / z 87 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of 3-hydroxybutyric acid using the tandem mass spectrometer.
  • m / z 179 ⁇ 0.5 or m / z 133 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of gluconic acid using the tandem mass spectrometer.
  • m / z113 ⁇ 0.5 or m / z71 ⁇ 0.5, m / z59 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Mevalonic acid using the tandem mass spectrometer.
  • the sulfuric acid compound can be Camper 10-sulfonic acid.
  • m / z 233 ⁇ 0.5 can be selected and detected as a product ion of Camper 10-sulfonic acid using the tandem mass spectrometer.
  • an acidic compound that does not contain a basic residue When an acidic compound that does not contain a basic residue is detected by a mass spectrometer, it is generally detected as a negative ion such as [M ⁇ H] ⁇ ion, but in the present invention, positive such as [M + NH 4 ] + is detected. Since the ions are added, it is possible to detect an acidic compound containing no basic residue in the positive mode. In this case, it can be detected with higher sensitivity than that detected as negative ions. Furthermore, since it becomes possible to detect with high sensitivity in the positive mode, various product ions can be detected.
  • FIG. 1 shows a basic configuration of a tandem mass spectrometer (CE / MS / MS) equipped with an electrospray ion source (ESI) for carrying out the present invention.
  • 10 is a capillary electrophoresis (CE) apparatus
  • 12 is an electrospray ion source (ESI)
  • 14 is a sample ion (precursor ion) having a specific mass from various ions ionized by the ESI 12.
  • 16 is a collision chamber for colliding and breaking precursor ions and causing collision-induced dissociation to form product ions
  • 18 is a product ion.
  • a mass spectrometer (second stage MS) as a second mass separation device for detecting specific ions from (20) is a recording system.
  • step 100 an acidic compound is dissolved in a solvent containing formic acid, acetic acid or butyric acid and the following base
  • step 110 in the ESI 12
  • step 110 in the ESI 12
  • step 120 the generated ions are detected as precursor ions in the positive mode using the mass spectrometers 14 and 18.
  • the acidic compound was measured by multiple reaction monitoring (MRM) under the following analysis conditions to determine the detection limit.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • standard solutions of 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 ⁇ mol / L were measured.
  • the detection limit was defined as a signal-to-noise ratio of 3, and the detection limit was calculated from the signal-to-noise ratio of the standard solution with the lowest concentration at which a signal-to-noise ratio of 3 or more was obtained.
  • Capillary electrophoresis (CE) analysis conditions Capillary electrophoresis (CE) apparatus: Agilent 1600 CE System Capillary: Fused silica capillary (inner diameter 50 ⁇ m, outer diameter 350 ⁇ m, total length 80cm) Capillary temperature: 20 ° C Buffer: 50 mmol / L ammonium acetate pH8.5 Applied voltage: +30 kV Sample injection: Pressurization method (50mbar, 25 seconds) Triple quadrupole mass spectrometer (QqQMS) analysis conditions Positive mode Mass spectrometer (MS): Agilent 6460 LC / MS Triple Quad Ionization voltage: 4 kV Drying gas: Nitrogen Temperature 300 °C 7 L / min Nebulizer pressure: 7 psig Sheath liquid: 50% methanol aqueous solution 10 ⁇ L / min
  • Table 1 shows the positive mode MRM precursor ions, product ions, and detection limit of each compound.
  • the detection limit in negative mode MRM is shown.
  • the analysis conditions for CE are the same as in Example 1, and the analysis conditions for QqQMS are as follows.
  • Negative mode MS Agilent 6460 LC / MS Triple Quad Ionization voltage: -3.5 kV Drying gas: Nitrogen Temperature 300 °C 7 L / min Nebulizer pressure: 7 psig Sheath liquid: 50% methanol aqueous solution 10 ⁇ L / min
  • Table 2 shows the precursor ion and product ion of negative mode MRM in each compound.
  • Table 3 shows a comparison of detection limits.
  • the detection limit is lower in the positive mode than in the negative mode, indicating that the sensitivity is improved in the positive mode.
  • the ratio is almost 10 times or more, and the sensitivity is improved 10 times or more for most acidic compounds by measuring in the positive mode.
  • the acidic compound was measured under the following analysis conditions to determine the detection limit.
  • standard solutions 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 ⁇ mol / L were measured.
  • the detection limit was defined as a signal-to-noise ratio of 3, and the detection limit was calculated from the signal-to-noise ratio of the standard solution with the lowest concentration at which a signal-to-noise ratio of 3 or more was obtained.
  • the analysis conditions for CE are the same as in Example 1, and the analysis conditions for a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) are as follows.
  • the detection limit in negative mode MRM was determined.
  • the analysis conditions for CE are the same as in Example 1, and the analysis conditions for TOF-MS are as follows.
  • Table 4 shows the comparison of detection limits.
  • the detection limit is lower in the positive mode than in the negative mode, indicating that the sensitivity is improved in the positive mode.
  • Examples of the various product ions that can be obtained include the product ions of Glucose® 6-phosphate, Fructose® 6-phosphate, Ribose® 5-phosphate, and Ribulose® 5-phosphate.
  • the analysis conditions for capillary electrophoresis (CE) are the same as those in Example 1, and the analysis conditions for a triple quadrupole mass spectrometer (QqQMS) are shown below.
  • the main product ions in the negative mode are m / z 97 (phosphoric acid) or 79 (phosphoric acid dehydrate) in all the compounds as illustrated in FIGS.
  • Glucose76-phoshate m / z 127 as shown in Fig. 7
  • Fructose 6-phosphate as m / z 109 as shown in Fig. 8
  • RiboseR5-phosphate as m / z 97
  • Ribulose 5-phosphate as shown in Fig.
  • various ions such as m / z 133, 115, and 97 were obtained.
  • Glucoseluc6-phosphate and Fructose 6-phosphate, Ribose 5-phosphate and Ribulose 5-phosphate are structural isomers, respectively, and it can be said that the structural isomer can be selectively detected as compared with the negative mode.
  • the present invention can also be applied to infusion analysis using a single MS, or MS connected with liquid chromatography (LC) or CE.
  • LC liquid chromatography

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Abstract

　酸性残基を有しかつ塩基性残基を含まない酸性化合物を、ギ酸、酢酸もしくは酪酸及び次に示す塩基を含んだ溶媒に溶解した後、質量分析計１４、１８を用いてポジティブモードで検出することにより、質量分析計を用いて塩基性残基を含まない酸性化合物を高感度に検出する。ここで、質量分析計にて、プロトン付加もしくはプロトン付加した上での脱水もしくは次に示すイオンが付加した酸性化合物を生成させる段階と、生成したイオンを質量分析計で検出する階と、の各工程を含むことができる。

Description

酸性化合物の検出方法
　本発明は、酸性化合物の検出方法に係り、特に、質量分析計を用いた、塩基性残基を含まない酸性化合物の検出方法に関する。
　リン酸化合物や有機酸に代表される酸性化合物は解糖系の中間体として生体内のエネルギー代謝を理解するために重要であるが、生体には微量しか存在しない酸性化合物も存在する。そのため、酸性化合物を高感度に検出できる分析手法が望まれている。塩基性残基を含まない酸性化合物を高感度に検出したい場合は、質量分析計（ＭＳ）にて、［Ｍ－Ｈ］－のネガティブモードでの検出が一般的である。
　例えば、非特許文献１では、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）に飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ－ＭＳ）を接続し、［Ｍ－Ｈ］－イオンとして検出している。又、非特許文献２では、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に三連四重極質量分析計（ＱｑＱＭＳ）を接続し、前駆イオン（プリカーサーイオンとも称する）を［Ｍ－Ｈ］－イオンとして検出している。更に非特許文献３では、炭酸アンモニウムを含む溶媒中の塩基性残基を含まない酸性化合物をポジティブモードで検出しているが、ネガティブモードの方が感度が良いという結果になっている。
　又、質量分析計により構造異性体を分離する際は、タンデム質量分析計を用いて前駆イオンを開裂させ生成イオン（プロダクトイオンとも称する）の違いにより区別するが、特にリン酸化合物をネガティブモードで検出する場合、主要な生成イオンはリン酸イオンであることが多く、異性体の区別が難しい。
Soga T et al., Anal Chem. 2009 Aug 1;81(15):6165-74. Kato H et al., J Biosci Bioeng. 2012 May;113(5):665-73. Pluskal T et al., Mol Biosyst. 2010 Jan;6(1):182-98.
　前述の手法を用いても非検出の物質は存在するため、高感度な分析手法が望まれている。
　そこで、本発明では、質量分析計を用いて、塩基性残基を含まない酸性化合物を高感度に検出することを課題としている。
　本発明は、酸性残基を有しかつ塩基性残基を含まない酸性化合物を、ギ酸、酢酸もしくは酪酸及び次に示す塩基を含んだ溶媒に溶解した後、質量分析計を用いてポジティブモードで検出することを特徴とする酸性化合物の検出方法により、前記課題を解決したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  ここで、質量分析計にて、プロトン付加もしくはプロトン付加した上での脱水もしくは次に示すイオンが付加した酸性化合物を生成させる段階と、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 生成したイオンを質量分析計で検出する段階と、の各工程を含むことができる。
　又、検出する酸性化合物を、塩基性残基を含まないリン酸化合物とすることができる。
　又、検出する酸性化合物を、塩基性残基を含まない有機酸とすることができる。
　又、検出する酸性化合物を、塩基性残基を含まない硫酸化合物とすることができる。
　又、前記質量分析計をタンデム質量分析計とし、前記生成したイオンを前駆イオンとすることにより、前記酸性化合物を検出することができる。
　又、ネガティブモードでは検出されないポジティブモード特有の生成イオンを用いて定量することができる。
　又、前記リン酸化合物を、2-Phosphoglyceric acid、2,3-Bisphosphoglyceric acid、3-Phosphoglyceric acid、6-Phosphogluconic acid、Dihydroxyacetone phosphate、Erythrose 4-phosphate、Fructose 1-phosphate、Fructose 6-phosphate、Fructose 1,6-bisphosphate、Galactose 1-phosphate、Glucose 1-phosphate、Glucose 6-phosphate、Glyceraldehyde 3-phosphate、Glycerol 3-phosphate、Mannose 1-phosphate、Mannose 6-phosphate、Phosphoenolpyruvic acid、Phosphoribosyl pyrophosphate、Ribose 5-phosphate、Ribose 1-phosphate、Ribulose 5-phosphate、Sedoheptulose 7-phosphate、Xylulose 5-phosphateの少なくともいずれかとすることができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、2-Phosphoglyceric acidの生成イオンとしてm/z141±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、2,3-Bisphosphoglyceric acidの生成イオンとしてm/z277±0.5又はm/z259±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、3-Phosphoglyceric acidの生成イオンとしてm/z141±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、6-Phosphogluconic acidの生成イオンとしてm/z259±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Dihydroxyacetone phosphateの生成イオンとしてm/z171±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Erythrose 4-phosphateの生成イオンとしてm/z99±0.5又はm/z85±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Fructose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z243±0.5又はm/z145±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Fructose 6-phosphateの生成イオンとしてm/z243±0.5又はm/z109±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Fructose 1,6-bisphosphateの生成イオンとしてm/z323±0.5又はm/z207±0.5、m/z127±0.5、m/z109±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Galactose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z261±0.5又はm/z116±0.5、m/z99±0.5、m/z91±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Glucose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z261±0.5又はm/z116±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Glucose 6-phosphateの生成イオンとしてm/z243±0.5又はm/z127±0.5、m/z109±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Glyceraldehyde 3-phosphateの生成イオンとしてm/z171±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Glycerol 3-phosphateの生成イオンとしてm/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Mannose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z163±0.5又はm/z145±0.5、m/z85±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Mannose 6-phosphateの生成イオンとしてm/z243±0.5又はm/z109±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Phosphoenolpyruvic acidの生成イオンとしてm/z169±0.5又はm/z151±0.5、m/z43±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Phosphoribosyl pyrophosphateの生成イオンとしてm/z169±0.5又はm/z151±0.5、m/z43±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Ribose 5-phosphateの生成イオンとしてm/z97±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Ribose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z133±0.5又はm/z116±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Ribulose 5-phosphateの生成イオンとしてm/z231±0.5又はm/z133±0.5、m/z115±0.5、m/z97±0.5、m/z73±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Sedoheptulose 7-phosphateの生成イオンとしてm/z273±0.5又はm/z219±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Xylulose 5-phosphateの生成イオンとしてm/z231±0.5又はm/z133±0.5、m/z115±0.5、m/z97±0.5、m/z55±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記有機酸を、3-Hydroxybutyric acid又はGluconic acid、Mevalonic acidとすることができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、3-Hydroxybutyric acidの生成イオンとしてm/z87±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Gluconic acidの生成イオンとしてm/z179±0.5又はm/z133±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Mevalonic acidの生成イオンとしてm/z113±0.5又はm/z71±0.5、m/z59±0.5を選択し、検出することができる。
　又、前記硫酸化合物を、Campher 10-sulfonic acidとすることができる。
　又、前記タンデム質量分析計を用いて、Campher 10-sulfonic acidの生成イオンとしてm/z233±0.5を選択し、検出することができる。
　塩基性残基を含まない酸性化合物を質量分析計で検出する際、一般的には、［Ｍ－Ｈ］－イオンなどのネガティブイオンとして検出するが、本発明では、［Ｍ＋ＮＨ４］＋などポジティブイオンを付加したので、塩基性残基を含まない酸性化合物のポジティブモードによる検出が可能となる。この際、ネガティブイオンとして検出するよりも、高感度に検出できる。更に、ポジティブモードで高感度に検出可能になったことにより、多様な生成イオンを検出することができる。
本発明を実施するためのエレクトロスプレーイオン源を装着したタンデム質量分析計の基本的な構成を示す図 本発明の実施形態における処理手順を示すフローチャート ネガティブモードにおけるGlucose 6-phosphateの生成イオンのマススペクトルを示す図 ネガティブモードにおけるFructose 6-phosphateの生成イオンのマススペクトルを示す図 ネガティブモードにおけるRibose 5-phosphateの生成イオンのマススペクトルを示す図 ネガティブモードにおけるRibulose 5-phosphateの生成イオンのマススペクトルを示す図 ポジティブモードにおけるGlucose 6-phosphateの生成イオンのマススペクトルを示す図 ポジティブモードにおけるFructose 6-phosphateの生成イオンのマススペクトルを示す図 ポジティブモードにおけるRibose 5-phosphateの生成イオンのマススペクトルを示す図 ポジティブモードにおけるRibulose 5-phosphateの生成イオンのマススペクトルを示す図
　以下、図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　本発明を実施するためのエレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）を装着したタンデム質量分析計（ＣＥ／ＭＳ／ＭＳ）の基本的な構成を図１に示す。図において、１０はキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置、１２は、エレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）、１４は、該ＥＳＩ１２でイオン化した様々なイオンから特定の質量の試料イオン（前駆イオン）を選択するための第１質量分離装置としての質量分析計（１段目のＭＳ）、１６は、前駆イオンを衝突させ壊して衝突誘起解離させ、生成イオンとするための衝突室、１８は、生成イオンの中から特定のイオンを検出するための第２質量分離装置としての質量分析計（２段目のＭＳ）、２０は記録系である。
　本実施形態においては、図２に示す如く、まず、ステップ１００で、ギ酸、酢酸もしくは酪酸及び次に示す塩基を含んだ溶媒に酸性化合物を溶解し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  次いで、ステップ１１０で、前記ＥＳＩ１２にて、プロトン付加もしくは次に示すイオンが付加した酸性化合物を生成させ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　
  次いで、ステップ１２０で、生成したイオンを前駆イオンとして質量分析計１４、１８を用いてポジティブモードで検出する。
　以下の分析条件で多重反応モニタリング（ＭＲＭ）により酸性化合物の測定を行い、検出限界を求めた。それぞれの酸性化合物について0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100μmol/Lの標準溶液を測定した。検出限界はシグナルノイズ比が３と定義し、シグナルノイズ比が３以上得られた最低濃度の標準溶液のシグナルノイズ比から検出限界を計算した。
　　キャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析条件
　　　　キャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置：Agilent社1600 CE System
　　　　キャピラリー：フューズドシリカキャピラリー（内径50μm、外径350μm、全長80cm）
　　　　キャピラリー温度：20℃
　　　　緩衝液：50 mmol/L酢酸アンモニウム pH8.5
　　　　印加電圧：＋30 kV
　　　　試料注入：加圧法（50mbar、25秒間）
　　三連四重極質量分析計（ＱｑＱＭＳ）分析条件
　　　　ポジティブモード
　　　　質量分析計（ＭＳ）：Agilent社6460 LC/MS Triple Quad
　　　　イオン化電圧：4 kV
　　　　乾燥ガス：窒素 温度300℃　7 L/min
　　　　ネブライザー圧力：7 psig
　　　　シース液：50％メタノール水溶液　10 μL/min
　それぞれの化合物におけるポジティブモードのＭＲＭの前駆イオンと生成イオン及び検出限界は表１の如くであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　比較例としてネガティブモードのＭＲＭにおける検出限界を示す。ＣＥの分析条件は実施例１と同じであり、ＱｑＱＭＳの分析条件は次に示す。
　　ＱｑＱＭＳ分析条件
　　　　ネガティブモード
　　　　ＭＳ：Agilent社6460 LC/MS Triple Quad
　　　　イオン化電圧：-3.5 kV
　　　　乾燥ガス：窒素 温度300℃　7 L/min
　　　　ネブライザー圧力：7 psig
　　　　シース液：50％メタノール水溶液　10 μL/min
  それぞれの化合物におけるネガティブモードのＭＲＭの前駆イオンと生成イオンを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　検出限界の比較を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　検出限界はネガティブモードで測定した場合と比較し、ポジティブモードで低くなっており、ポジティブモードで感度が改善していることが示されている。その比も大半が10倍以上であり、ポジティブモードで測定することにより大半の酸性化合物で10倍以上感度が改善している。
　以下の分析条件で酸性化合物の測定を行い、検出限界を求めた。それぞれの酸性化合物について0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100μmol/Lの標準溶液を測定した。検出限界はシグナルノイズ比が３と定義し、シグナルノイズ比が３以上得られた最低濃度の標準溶液のシグナルノイズ比から検出限界を計算した。ＣＥの分析条件は実施例１と同じであり、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ－ＭＳ）の分析条件は次に示す。
　　ＴＯＦ－ＭＳ分析条件
　　　　ポジティブモード
　　　　ＭＳ：Agilent社1969A LC/MSD TOF
　　　　イオン化電圧：4 kV
　　　　乾燥ガス：窒素 温度300℃　7 L/min
　　　　ネブライザー圧力：5 psig
　　　　シース液：50％メタノール水溶液　10 μL/min
　　　　フラグメンター電圧：125V
　　　　スキマー電圧：50V
　　　　OCT RFV：245V
　比較例としてネガティブモードのＭＲＭにおける検出限界を求めた。ＣＥの分析条件は実施例１と同じであり、ＴＯＦ－ＭＳの分析条件は次に示す。
　　ＴＯＦ－ＭＳ分析条件
　　　　ネガティブモード
　　　　ＭＳ：Agilent社1969A LC/MSD TOF
　　　　イオン化電圧：-3.5 kV
　　　　乾燥ガス：窒素 温度300℃　7 L/min
　　　　ネブライザー圧力：5 psig
　　　　シース液：50％メタノール水溶液　10 μL/min
　　　　フラグメンター電圧：125V
　　　　スキマー電圧：50V
　　　　OCT RFV：245V
　検出限界の比較を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　検出限界はネガティブモードで測定した場合と比較し、ポジティブモードで低くなっており、ポジティブモードで感度が改善していることが示されている。
　多様な生成イオンが得られる例としてGlucose 6-phosphate及びFructose 6-phosphate、Ribose 5-phosphate、Ribulose 5-phosphateの生成イオンを示す。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の分析条件は実施例１と同じであり、三連四重極質量分析計（ＱｑＱＭＳ）の分析条件は下記に示す。
　　三連四重極質量分析計（ＱｑＱＭＳ）分析条件
　　　　ポジティブモード
　　　　ＭＳ：Agilent社6460 LC/MS Triple Quad
　　　　イオン化電圧：4kV
　　　　乾燥ガス：窒素 温度300℃　7 L/min
　　　　ネブライザー圧力：7 psig
　　　　シース液：50％メタノール水溶液　10 μL/min
　　　　生成イオンスキャン条件　m/z 20-300
　　　　前駆イオン
　　　　　　・Glucose 6-phosphate m/z 278　　衝突エナジー　5V
　　　　　　・Fructose 6-phosphate m/z 278　　衝突エナジー　5V
　　　　　　・Ribose 5-phosphate m/z 248　　衝突エナジー　5V
　　　　　　・Ribulose 5-phosphate m/z 248　　衝突エナジー　5V
　　　　ネガティブモード
　　　　ＭＳ：Agilent社6460 LC/MS Triple Quad
　　　　イオン化電圧：-3.5 kV
　　　　乾燥ガス：窒素 温度300℃　7 L/min
　　　　ネブライザー圧力：7 psig
　　　　シース液：50％メタノール水溶液　10 μL/min
　　　　生成イオンスキャン条件　m/z 20-300
　　　　前駆イオン
　　　　　　・Glucose 6-phosphate m/z 259　　衝突エナジー　15V
　　　　　　・Fructose 6-phosphate m/z 259　　衝突エナジー　15V
　　　　　　・Ribose 5-phosphate m/z 229　　衝突エナジー　15V
　　　　　　・Ribulose 5-phosphate m/z 229　　衝突エナジー　15V
　ネガティブモードでの主要な生成イオンは、図３乃至図６に例示する如く、全ての化合物においてm/z 97（リン酸）もしくは79（リン酸の脱水物）であるのに対し、ポジティブモードでは、Glucose 6-phoshateでは図７に示す如くm/z 127 、Fructose 6-phosphateでは図８に示す如くm/z 109、Ribose 5-phosphateでは図９に示す如くm/z 97、Ribulose 5-phosphateでは図１０に示す如くm/z 133, 115, 97と多様なイオンが得られた。又、Glucose 6-phosphateおよびFructose 6-phosphate、Ribose 5-phosphate及びRibulose 5-phosphateはそれぞれ構造異性体であり、ネガティブモードに比べ構造異性体を選択的に検出できるといえる。
　本発明は、ＭＳ単体によるインフュージョン分析や、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）やＣＥを接続したＭＳに対しても適用可能である。
　１０…キャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置
　１２…エレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）
　１４、１８…質量分析計（ＭＳ）
　１６…衝突室
　２０…記録系

Claims (37)

  1. 　酸性残基を有しかつ塩基性残基を含まない酸性化合物を、ギ酸、酢酸もしくは酪酸及び次に示す塩基を含んだ溶媒に溶解した後、質量分析計を用いてポジティブモードで検出することを特徴とする酸性化合物の検出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　質量分析計にて、プロトン付加もしくはプロトン付加した上での脱水もしくは次に示すイオンが付加した酸性化合物を生成させる段階と、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　生成したイオンを質量分析計で検出する段階と、
    　の各工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の酸性化合物の検出方法。
  3. 　検出する酸性化合物が、塩基性残基を含まないリン酸化合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の酸性化合物の検出方法。
  4. 　検出する酸性化合物が、塩基性残基を含まない有機酸であることを特徴とする請求項１又は２に記載の酸性化合物の検出方法。
  5. 　検出する酸性化合物が、塩基性残基を含まない硫酸化合物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の酸性化合物の検出方法。
  6. 　前記質量分析計がタンデム質量分析計であり、前記生成したイオンを前駆イオンとすることにより、前記酸性化合物を検出することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の酸性化合物の検出方法。
  7. 　ネガティブモードでは検出されないポジティブモード特有の生成イオンを用いて定量することを特徴とする請求項６に記載の酸性化合物の検出方法。
  8. 　前記リン酸化合物が、2-Phosphoglyceric acid、2,3-Bisphosphoglyceric acid、3-Phosphoglyceric acid、6-Phosphogluconic acid、Dihydroxyacetone phosphate、Erythrose 4-phosphate、Fructose 1-phosphate、Fructose 6-phosphate、Fructose 1,6-bisphosphate、Galactose 1-phosphate、Glucose 1-phosphate、Glucose 6-phosphate、Glyceraldehyde 3-phosphate、Glycerol 3-phosphate、Mannose 1-phosphate、Mannose 6-phosphate、Phosphoenolpyruvic acid、Phosphoribosyl pyrophosphate、Ribose 5-phosphate、Ribose 1-phosphate、Ribulose 5-phosphate、Sedoheptulose 7-phosphate、Xylulose 5-phosphateの少なくともいずれかであることを特徴とする請求項３に記載の酸性化合物の検出方法。
  9. 　前記タンデム質量分析計を用いて、2-Phosphoglyceric acidの生成イオンとしてm/z141±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  10. 　前記タンデム質量分析計を用いて、2,3-Bisphosphoglyceric acidの生成イオンとしてm/z277±0.5又はm/z259±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  11. 　前記タンデム質量分析計を用いて、3-Phosphoglyceric acidの生成イオンとしてm/z141±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  12. 　前記タンデム質量分析計を用いて、6-Phosphogluconic acidの生成イオンとしてm/z259±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  13. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Dihydroxyacetone phosphateの生成イオンとしてm/z171±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  14. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Erythrose 4-phosphateの生成イオンとしてm/z99±0.5又はm/z85±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  15. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Fructose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z243±0.5又はm/z145±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  16. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Fructose 6-phosphateの生成イオンとしてm/z243±0.5又はm/z109±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  17. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Fructose 1,6-bisphosphateの生成イオンとしてm/z323±0.5又はm/z207±0.5、m/z127±0.5、m/z109±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  18. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Galactose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z261±0.5又はm/z116±0.5、m/z99±0.5、m/z91±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  19. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Glucose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z261±0.5又はm/z116±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  20. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Glucose 6-phosphateの生成イオンとしてm/z243±0.5又はm/z127±0.5、m/z109±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  21. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Glyceraldehyde 3-phosphateの生成イオンとしてm/z171±0.5又はm/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  22. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Glycerol 3-phosphateの生成イオンとしてm/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  23. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Mannose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z163±0.5又はm/z145±0.5、m/z85±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  24. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Mannose 6-phosphateの生成イオンとしてm/z243±0.5又はm/z109±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  25. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Phosphoenolpyruvic acidの生成イオンとしてm/z169±0.5又はm/z151±0.5、m/z43±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  26. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Phosphoribosyl pyrophosphateの生成イオンとしてm/z169±0.5又はm/z151±0.5、m/z43±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  27. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Ribose 5-phosphateの生成イオンとしてm/z97±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  28. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Ribose 1-phosphateの生成イオンとしてm/z133±0.5又はm/z116±0.5、m/z99±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  29. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Ribulose 5-phosphateの生成イオンとしてm/z231±0.5又はm/z133±0.5、m/z115±0.5、m/z97±0.5、m/z73±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  30. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Sedoheptulose 7-phosphateの生成イオンとしてm/z273±0.5又はm/z219±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  31. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Xylulose 5-phosphateの生成イオンとしてm/z231±0.5又はm/z133±0.5、m/z115±0.5、m/z97±0.5、m/z55±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項８に記載の酸性化合物の検出方法。
  32. 　前記有機酸が、3-Hydroxybutyric acid又はGluconic acid、Mevalonic acidであることを特徴とする請求項４に記載の酸性化合物の検出方法。
  33. 　前記タンデム質量分析計を用いて、3-Hydroxybutyric acidの生成イオンとしてm/z87±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項３２に記載の酸性化合物の検出方法。
  34. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Gluconic acidの生成イオンとしてm/z179±0.5又はm/z133±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項３２に記載の酸性化合物の検出方法。
  35. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Mevalonic acidの生成イオンとしてm/z113±0.5又はm/z71±0.5、m/z59±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項３２に記載の酸性化合物の検出方法。
  36. 　前記硫酸化合物が、Campher 10-sulfonic acidであることを特徴とする請求項５に記載の酸性化合物の検出方法。
  37. 　前記タンデム質量分析計を用いて、Campher 10-sulfonic acidの生成イオンとしてm/z233±0.5を選択し、検出することを特徴とする請求項３６に記載の酸性化合物の検出方法。
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