WO2014048070A1 - 一种用于促进红细胞生成的组合物及其用途 - Google Patents

一种用于促进红细胞生成的组合物及其用途 Download PDF

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WO2014048070A1
WO2014048070A1 PCT/CN2013/001169 CN2013001169W WO2014048070A1 WO 2014048070 A1 WO2014048070 A1 WO 2014048070A1 CN 2013001169 W CN2013001169 W CN 2013001169W WO 2014048070 A1 WO2014048070 A1 WO 2014048070A1
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composition
formononetin
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molar ratio
callisoflavones
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余辉
李贻昆
张莉
郑玉忠
丁显廷
詹华强
何志明
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Hong Kong University of Science and Technology
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
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Hong Kong University of Science and Technology
University of California Berkeley
University of California San Diego UCSD
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Definitions

  • composition for promoting erythropoiesis and its use please request a Chinese invention patent submitted on September 27, 2012
  • the present invention relates to the field of pharmacy, and in particular to a pharmaceutical composition or a dietary supplement composition for promoting erythropoiesis, and for preventing and treating anemia and/or anoxia, and JL: Chuan Tu. Background technique
  • Red blood cells are mainly produced in the bone marrow of the human body (especially red bone marrow), and the thousand cells in the fj' marrow are first differentiated into erythroid progenitor cells, in erythropoietin.
  • Erythropoietin also known as erythropoietin
  • K forms mature red blood cells.
  • Erythropoietin in the human body is a hormone-like substance secreted by the kidneys and liver.
  • Anemia refers to the reduction of red blood cell volume in human peripheral blood, which is lower than the lower limit of the normal range - a common clinical symptom.
  • Anemia includes chemotherapy-induced anemia (CIA) and anemia.
  • chemotherapy drugs kill a large number of cancer cells, and also kill: ⁇ [ ⁇ : often organize cells and cause varying degrees of sputum inhibition, so chemotherapy drugs can inhibit bone marrow Hematopoietic cells cause anemia. More than 60% of cancer patients are loyal to anemia after receiving chemotherapy, which seriously reduces the patient's body function and quality of life.
  • chemotherapeutic drugs cause stomach discomfort, causing vomiting and nausea, severely affecting appetite and causing the patient's body: : Relief, one of the primary difficulties is chemotherapy-induced anemia (CIA).
  • Yin anemia refers to the deficiency of renal erythropoietin production caused by various oxysera or urinary sputum in plasma.
  • I anemia caused by the formation and metabolism of red blood cells, the chronic ⁇ function does not occur until the end stage Common complications.
  • Reduced erythropoiesis shortened red blood cell count, and increased red blood cell loss in patients, affecting the patient's blood metabolic cycle.
  • chemotherapy-induced anemia and renal anemia is blood transfusion and dialysis, ii ⁇ is transfusion may bring strict : The clinical or subclinical side effects, the patient will also suffer great pain in the process of receiving treatment.
  • Hypoxia is a pathological process that causes abnormal changes in the metabolism, function, and morphological structure of tissues due to insufficient oxygen supply to the tissue or kawanoxia.
  • Hypoxia - general manifestations dizziness, headache, tinnitus, vertigo, weak limbs; or nausea, vomiting, palpitation, shortness of breath, shortness of breath, rapid heartbeat.
  • Erythrocytes are the most important medium for transporting oxygen through the blood in vertebrates, so increasing the red blood cells in the body: 3 ⁇ 4 can effectively improve the hypoxic state (see reference: "Therapeutic effect of erythropoietin on neonatal hypoxic ischemic encephalopathy" Analysis, Guo Zhimei et al, Clinical Military Medical Journal, 2008, 5 "and” EPO on the expression of NSE in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage, Liu Qing,
  • ESAs erythropoiesis stimulants
  • rHuEPO recombinant erythropoietin
  • EPO erythropoietin
  • the regulation factor of erythropoiesis in mammals is produced by the kidneys and liver. If the EPO in the blood cannot be raised in the absence of oxygen, it will cause anemia.
  • Synthetic expression of EPO regulated by hypoxia-inducible factor (HIF), HIF regulates red blood cells in many processes such as erythrocyte 4, formation, Jin.
  • HIF hypoxia-inducible factor
  • HIF selectively binds to the hypoxic response element (HRE) of the EPO gene - 1: and then 'j I sends EPO 3 ⁇ 4 due to the transition.
  • HRE hypoxic response element
  • Flavonoids from radix astragali induce the expression of erythropoietin in cultured cells: a signaling mediated via the accumulation of hypoxia-inducible factor- la, Ken YZ Zheng et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 201 1 59, 1697- 1704 ".
  • ESAs for chemotherapy-induced anemia and renal anemia It is necessary to increase the number of blood transfusions in patients by subcutaneous injection of sputum to increase the red blood cell level of 11 patients. Many clinical trials have injected subcutaneous injections of 5000 IU/day of artificial erythroblastic bovine-causal j to effectively increase red blood cell levels and reduce the number of blood transfusions in patients.
  • EPO electronic medical record
  • the US Food and Drug Administration (FDA) has issued a number of times; Controls ESAs: Use reports to improve the safety of EASs. Therefore, it is very important to reduce the pain of cancer patients and kidney patients by presenting a drug with low price and small side effects.
  • Traditional Chinese medicine has a long history in the treatment of anemia.
  • traditional Chinese medicine blood supplement formula usually has no toxic side effects and can be taken for a long time.
  • jaundice is often used as a main ingredient for preparation.
  • Astragalus membranaceus has been used for more than 2,000 years and has the effect of tonifying blood and producing blood.
  • Astragalus saponins contain saponins, sucrose, polysaccharides, various amino acids, folic acid and various trace elements such as selenium, zinc and copper. They have many biological and academic effects, such as liver protection, blood production, anti-oxidation, anti-spasmodic blood pressure, and enhanced immunity.
  • ⁇ ⁇ Mountain is complex in traditional Chinese medicine, usually composed of dozens of other compounds, and it is difficult to conduct pharmacological research and optimization.
  • the quality control of traditional Chinese medicines is also particularly important. Factors such as origin, climate, and year can affect the quality of Chinese herbal medicines, thus affecting the efficacy and stability of the drugs.
  • the effect of ⁇ treatment is also very different. Therefore, the optimization of traditional Chinese medicines and the resolution of quality: 3 ⁇ 4: control and other difficulties have important significance for the development and promotion of Chinese medicine.
  • flavonoids in Astragalus can effectively stimulate the expression of erythropoietin in kidney cells, thereby increasing red blood cell levels in the blood to improve and treat anemia.
  • the four flavonoid compounds that promote erythropoietin Roundup are oleophyllin, formononetin, verbasco isoflavones and vermiculer isoflavones : 3 ⁇ 4
  • flavonoids isolated from Astragalus membranaceus L. alone enhance the cellular transcriptional activity of low-reflexion, V: element (HRE), and promote erythropoietin from lilj.
  • the present invention provides a composition for promoting red blood cells and its use.
  • the present invention provides:
  • a composition for promoting erythropoiesis which comprises two or more flavonoid compounds as an active ingredient; wherein the flavonoid compound is represented by the following formula I:
  • R 2 is H or a hydroxyl group
  • the flavonoid compound is in a purified form.
  • composition according to (1) wherein the composition comprises verlin isoflavone and at least one selected from the group consisting of stalk stalk, formononetin and mullein.
  • composition according to (2) wherein the composition comprises vermiculene isoflavones and scutellarin.
  • composition according to (4), wherein the molar ratio of the veratible isoflavone to the hairy isoflavone ⁇ :: is 1:1.
  • composition according to (2) wherein the composition comprises flavonoids and stalks.
  • composition according to (6) wherein the molar ratio of the hairy different j3 ⁇ 4 ketone to formononetin is (0.016-2): (0.016-2).
  • composition according to (2) wherein the composition comprises whey isoflavone, formononetin and formononetin.
  • composition according to (9), wherein the molar ratio of the hairy isoflavone, the stalked stalk, and the stalked stalk is (4-6): (0.5-1.5): (20-30).
  • composition according to (2) wherein the composition comprises scutellaria xi, i., formononetin, formononetin and mullein.
  • composition according to (12), wherein the molar ratio of the isoflavone, the scutella, the formononetin and the isoflavone glycoside is (4-6): (0.5-1.5) :(0.5-1.5):
  • composition according to any one of the preceding claims, wherein the composition is a pharmaceutical composition or a dietary supplement composition, and comprises a pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • composition according to any one of (1) to (16) for the preparation of a medicament or a dietary supplement for promoting red blood cell formation.
  • composition of the present invention has a "F-professional and positive effect" compared to the prior art: a composition of the invention of the invention enhances the activity of HRE, thereby promoting red blood cell formation, and preventing and treating anemia and/or Hypoxia has a good synergistic effect, and significantly reduces the amount of the components, the price is low and the side is small. For example, in a preferred composition of the present invention, it is even possible to increase the HRE transactivation activity by about 3 times.
  • Enhancement of HRE conversion activity can directly stimulate the expression of EPO, thereby promoting erythropoiesis, And prevent and treat anemia and anoxia.
  • the composition of the present invention can increase its pharmacological effect by 2 times, and the sputum agent i can be as low as about 0.6 ⁇ ⁇ , less than 1/10 of the previous one. .
  • ⁇ 1 is the intention of the effect of the aqueous extract of Astragalus membranaceus in Comparative Example 1 on the transcriptional activity of HRE by pH 293 ⁇ cells transfected with pHRE-Luc;
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the effect of four compounds in Comparative Example 2 on the transcriptional activity of HRE when applied to pHRE-Luc-transfected HEK 293T kidney cells alone;
  • Box 3 is a schematic diagram of the pHRE-Luc vector in Test Example 1. detailed description
  • the treatment described herein refers to the process of blocking, alleviating (or modifying) or eliminating the cause or lesion in order to restore or gain health or reduce pain in a human or animal body.
  • the English name of the isoflavones described herein is Calycosin or 7,3'-dihydroxy-4'-methoxyisoflavone; the molecular formula is C 16 H 12 O 5 ; divided into 284.26348; the isoflavones ⁇ :
  • the known pharmacological effects of II pre-hairy isoflavones are as follows: (1) mention, immune function; (2) enhance anti-oxidation, anti-radiation and anti-cancer effects; (3) protect cardiovascular and cerebrovascular, liver, kidney and lung; (4) Protect brain cells and improve memory; (5) Antibacterial and inhibitory diseases; (6) Lowering blood fat, lowering blood sugar, reducing complications of diabetes.
  • the formononetin described herein is also referred to as 7-hydroxy-4'-oxyflavone, formononeta J3 ⁇ 4in; English name is Formononetin, 7-Hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)chromone, 7 -Hydroxy-4'-methoxyisoflavone. or Dadein 4'-methyl ether-, CAS 3 ⁇ 4 "j 485-72-3; fraction f is C 16 H 12 O 4 ; molecular weight is 268.26; the chemical formula of formononetin is as follows Formula III shows:
  • the known pharmacological effects of II scutellariae are as follows: (1) Anticancer effect: It can prevent breast cancer, prostate cancer and colon cancer; (2) Female stimulating chuanchuan: It can increase the small animal's ' ⁇ ': ⁇ : , but the effect of estrogen is very weak, the effect is not as good as the isoflavone dye hibiscus (Genistein), soy flavin; (3) The male 1 ⁇ disease caused by Triton WR-1339 is high Blood lipids have a hypolipidemic effect; (4) Clinically used as a diuretic.
  • the formononetin described herein is also known as the stalk stalk -7-glucoside; the English name is Oninin, or Formononetin-7-O-beta-D-glucopyranoside; CAS - '' is 486-62 - 4 ; The molecular formula is C 22 H 22 O 9 ; the molecular weight is 430.40; The chemical formula of the stalk flower: ⁇ is shown in the following chemical formula IV:
  • the isoflavone oxime described herein is also known as flavonoid isoflavone glucoside, whey ketone-7-OpD glucoside; English name is Calycosin-7-glucoside, Calycosin-7-OPD-glucoside, 3',7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavone-7- beta-D-glucopyranoside, Calycosin 7-O-beta-D-glucoside, Calycosin 7-beta-D-glucopyranoside, or Calycosin -7- O-beta-D-glucopyranoside ;
  • the fraction M is 446.40; the CAS number is 20633-67-4, and the chemical formula of the isoflavone : ⁇ is shown in the following chemical formula V:
  • the present inventors have found through experimentation that when two or more kinds of vermicillium isoflavone, formononetin, and stalk i i il I isoflavone glycoside are combined, each of the obtained compositions is 3 ⁇ 4 out
  • An unexpected synergistic effect of the resulting composition in improving the level of red blood cells in the blood has the effect of using the components separately. Based on this finding, the inventors have further obtained the technical solution of the present invention.
  • the present invention provides a composition for promoting erythropoiesis, comprising two or more flavonoid compounds as an active ingredient; wherein the flavonoid compound is as small as:
  • R 2 is H or hydroxy 3 ⁇ 4 ; And in the preparation of the composition, the flavonoid compound is in a purified form.
  • the purification of the flavonoid compound is commercially available as 3 ⁇ 4 iJ (e.g., available from Sichuan Vicky Biotech Co., Ltd.), and can also be prepared using purification methods known in the art.
  • the flavonoid compound is a flavonoid
  • the flavonoid compound is a flavonoid glycoside.
  • the concentrations of vermiculone, formononetin, formononetin and ruthenium ff can be used in the range of 0.016 to 10 ⁇ M, respectively.
  • compositions of the invention comprise Calycosin, and is selected from f: 1 tenon thorn flower ⁇ , ':. Shank flower' f, and at least one glycoside in calycosin.
  • compositions of the invention comprise verpe isoflavones and mullein isoflavone glycosides. More preferably, the molar ratio of the whey isoflavone to the flavonoid glycoside is (0.016-2): (0.016-2), and 31 is preferably 1:1.
  • compositions of the present invention comprise whey isoflavones and stalks of stalks. More preferably, the molar ratio of the isoflavone to the formononetin is (0.016-2): (0.016-2), and W is preferably 1:1.
  • compositions of the present invention comprise flavonoids, stalks and stalks. More preferably, the molar ratio of the isoflavone, formononetin and formononetin is (4-6): (0.5-1.5): (20-30), more preferably 5:1: 25.
  • compositions of the present invention comprise whey isoflavones, formononetin, formononeta : and flavonoids : More preferably, the isoflavones, the thorns, the stalks, Mangium flower : ⁇ : the molar ratio of isoflavone glycosides is (4-6) : (0.5-1.5) : (0.5-1.5) : (0.5-1.5), more preferably 5: 1 : 1 : 1 .
  • compositions of the present invention may also be included in the compositions of the present invention.
  • active ingredients such as vitamins, may also be included in the compositions of the present invention.
  • the composition of the present invention is a pharmaceutical composition or a dietary supplement composition, and comprises a medicinal adjuvant.
  • compositions of the present invention including but not limited to, for example, References: "Pharmaceutics” (Fourth Edition), edited by Bi Dianzhou, People's Health Publishing House, 2001. Pharmacopoeia excipients disclosed.
  • the pharmaceutical excipients include pharmaceutically acceptable carriers known in the art, such as polyethylene glycols, povidones, surfactants (such as poloxamer 188), and organic acids (such as tartaric acid, Succinic acid, etc., sugars (such as dextrose, galactose, sucrose, etc.) and alcohols (mannitol, sorbitol, xylitol, etc.), cellulose (such as ethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, etc.) ), poly W-acid resin, and the like.
  • pharmaceutically acceptable carriers known in the art, such as polyethylene glycols, povidones, surfactants (such as poloxamer 188), and organic acids (such as tartaric acid, Succinic acid, etc., sugars (such as dextrose, galactose, sucrose, etc.) and alcohols (mannitol, sorbitol, xylitol, etc.), cellulose (such as eth
  • compositions of the invention may be administered orally or parenterally. It will be understood by those skilled in the art that the application amount varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, and the like. Oral administration can be carried out in the form of a solid, a liquid or the like, and when it is not administered orally, I J is in the form of an injection or the like.
  • the solid form of the drug may include tablets, pills, capsules, powders, granules, etc., and those skilled in the wood field may select the following excipients for the preparation of the following: fillers (such as starch, dextrin, lactose, nectar) Alcohol, microcrystalline cellulose, etc.), absorbents (such as sulfuric acid, calcium hydrogen phosphate, etc.), wetting agents (such as water, ethanol, etc.), binders (such as hydroxymethyl 3 ⁇ 4 fiber, povidone, starch slurry, etc.) , disintegrants (such as cross-linked carboxymethyl 3 ⁇ 4 cellulose sodium, crospovidone, etc.), lubricants (such as stearic acid, talc, polyethylidene: alcohol, micronized silica gel, etc.), flavoring agents (such as sweet Flavoring agents (such as sucrose, stevia, aspartame, etc.), fragrances (such as spices and flavors, etc.), colorants (such as
  • the liquid form (oral liquid) of the chuanchuan” includes solutions, emulsions, suspensions, syrups and the like, and can be prepared by a person skilled in the art by using the following auxiliary materials as needed: Solvents (such as water, I oxime, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, flash alcohol, polyethylene: alcohol, fatty oil, liquid paraffin, ethyl acetate, etc.), flavoring agents (such as sweeteners (such as sucrose) , stevia, aspartame, etc., aromatics (such as spices and flavors), etc., ⁇ colorants (such as beet red, legs, lemon yellow, etc.), preservatives (parabens, benzoic acid'; benzene ⁇ 'sodium, sorbic acid, etc., wetting agents (such as polysorbates, polyoxyethylene fatty alcohol ethers, etc.), help
  • agents such as eucalyptus oil, gum tree, cellulose, diatomaceous earth, etc.
  • emulsifiers such as surfactants, etc.
  • the dosage form of the composition of the invention is an oral solution.
  • the invention also provides the use of the composition of any of the above-mentioned items for the preparation of a drug or a foraging supplement for the promotion of erythrocyte.
  • the drug or dietary supplement Chuan "J"-modifies and/or treats anoxia and/or anemia (more preferably chemotherapy-induced anemia and 1 ⁇ anemia).
  • anoxia and/or anemia more preferably chemotherapy-induced anemia and 1 ⁇ anemia.
  • the isoflavones, the stalks of the stalks, the stalks of the stalks, the stalks of the stalks, and the stalks of the stalks can be purchased 1'
  • Test Example 1 Construction of an in vitro study model for regulation of sputum expression
  • HEK293T cells transfected with pHRE-Luc vector were used as an in vitro study model for liPO regulation.
  • the construction process of HEK293T cells transfected with pHRE-Luc vector can be found in the reference: " Flavonoids from radix astragali induce the expression of erythropoietin in cultured cells: a signaling mediated via the accumulation of hypoxia-inducible factor- l a. Ken YZ Zheng Ct al, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 201 1, 59,
  • the human embryonic cell (HHK) 293T cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) in Manassas, Mev., and the "I: described cells” were added to the ⁇ : cell culture solution ( Fetal bovine blood containing 10% (v/v), FBS, 100 U/ml of 1 smog and 100 U/ml of streptomycin
  • I 1 In DMIiM medium), put it in a 37 °C incubator, control the carbon dioxide concentration at 5% (v/v), and culture for 24 hours.
  • Hypoxia response element obtained from the human erythropoietin (EPO) gene (5'-TCG AGG CCC TAC GTG CTG TCT CAC ACA GCC TGT CTG ACG-3') is a highly conserved hypoxia-inducible factor- 1 (HIF-1) binds to the target (5'-TAC
  • pHRE-Luc vector (see Figure 3), wherein the pBI-GL vector itself has a reporter gene: firefly luciferase gene.
  • the pHRE-Luc was transfected into cultured HHK293T cells (specification may refer to the following: "Regulation of a transcript encoding the proline-rich membrane anchor of globular muscle acetylcholinesterase: the suppressive roles of myogenesis and innervating nerves. Xie, HQ, et al., 2007. Journal of Biological Chemistry, 282, 1 1765-1 1775. " ), transfection efficiency "80%.
  • Example 1 Example 1
  • each DMSO mother liquor can be 3 concentrations: 50 ⁇ , 500 ⁇ , 5mM, for To prepare different final concentrations to improve the accuracy of the experiment).
  • each compositions of the present invention shown in Agriculture 1 according to the scores and final concentrations, take the desired volume of DMSO mother liquor, combine and dilute to 300 ⁇ l with the cell culture solution described in Test Example 1, Used in the following 3 parallel experiments. After the obtained composition solution was used as the transfected HEK293T cells constructed in the test example 1, the changes in the luciferase activity were measured, and the specific steps were as follows:
  • the transfected HEK293T cells were seeded in a 24-well culture plate, and the number of cells in a single well was 30,000.
  • the volume of the cell culture medium was 500 ⁇ l, and the original cell culture solution was aspirated after one day. Force 11 into 400 ⁇ l of fresh cell culture medium, and add 3 ⁇ l of the above cell culture medium containing the composition of the present invention 3 hours later, so that the total volume per well is 500 ⁇ l, and each group in each composition
  • the concentration of the 500 microliter cell culture liquid towel was determined to be the final concentration shown in Table 1.
  • the composition was repeated 3 times. Two days after application of the composition of the invention, the cells were lysed and 300 microliters of lysis reagent was added to each well (the lysis reagent contained 0.2% Triton X-100 and
  • the control group was the cell response without adding any drug, and the effect of the drug was evaluated by using (100 ⁇ 4 test ⁇ ⁇ ⁇ fluorescence intensity - fluorescence intensity of the control group / fluorescence intensity of the control group) X 100 %.
  • composition of the present invention can effectively improve the activity of 3 ⁇ 4HH.
  • a composition comprising at least one of isoflavones and isoflavones, and formononetin, formononetin and flavonoids is effective for increasing HRE activity.
  • M ⁇ can be increased by about one time HRE transcriptional activity.
  • a composition consisting of two of the isoflavones and the formononetin, the stalk, and the isoflavones is capable of up to about twice the HRE transcriptional activity.
  • i, 0.08 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ isoflavone and 0.016 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and 0.4 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ( (molar ratio of 5:1:25) can improve the HRE conversion: 3 ⁇ 4 activity
  • the sum of the concentrations of 1. er is only about 0.6 ⁇ .
  • composition of the isoflavones, the formononetin, the formononetin and the isoflavone glycosides can increase the HRE transcriptional activity by about 1 to 3 times.
  • the mother liquor of the aqueous extract of Astragalus membranaceus Mix the Astragalus and water in a ratio of 1:8, fry 3 ⁇ 4 times, boil for 2 hours each time, combine the two obtained water decoctions, and obtain the aqueous extract - I " ⁇ dry to obtain a powdery solid, which was dissolved in the cell culture solution described in Test Example 1 at the corresponding concentration.
  • the change in the activity of the fluorescent chymase activity was measured according to the same method as in Example 1.
  • the concentrations are: 0.01, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 1.5, lO mg/mL.
  • the results of the carcass are shown in Figure 1.
  • the mother liquor of flavonoid isoflavone, formononetin, formononetin and verruflone glycoside was prepared, and the obtained mother liquid was dissolved in the cell culture solution described in Test Example 1 according to the corresponding concentration using hydrazine, according to the same procedure as in Example 1.
  • the method measures the change of fluorescent chymase activity caused by m.
  • the final concentrations are: 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3,

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Abstract

本发明提供了一种用于促进红细胞生成的组合物及其用途。本发组合物含有两种以上的作为活性成分的类黄酮化合物；其中所述的类黄酮化合物由下式I所示。其中，R1为羟基或（II）；R2为H或羟基；并且在制备所述的组合物时，所述的类黄酮化合物是以纯化的形式使用的。本发明的组合物对增强HRE的转录活性、从而促进红细胞生成、以及预防和治疗贫血和/或缺氧症具有良好的协同效果，显著地降低了各组分的用量，价格低廉且毒副作用小。

Description

一种用于促进红细胞生成的组合物及其用途 本中请要求于 2012 年 9 月 27 日提交的中国发明专利中请
201210369803.5的优先权。 技术领域
本发明属于制药领域，具体而言，涉及一种用于促进红细胞生成、 以及预防和治疗贫血和 /或缺氧症的药物组合物或膳食补充用组合物 及 JL:川途。 背景技术
红细胞主耍在人体的骨髓 （bone marrow ) (特别是红骨髓） 内 生成， fj'髓中的千细胞先分化为红细胞原祖细胞， 在促红细胞生成素
( erythropoietin， 也称为红细胞生成索 )的作用 K形成成熟的红细胞。 人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的 -种激素样物质。
贫血 ϋ指人体外周血中红细胞容积的减少，低于正常范围下限的 -种常见的临床症状。 贫血包括化疗诱导性贫血 （CIA ) 和 ^性贫血 等。 中， 在化疗诱导性贫血中， 化疗药物在杀灭大量癌细胞的同吋， 也杀伤了 :ι [ ·:常组织细胞而引起不同程度的 -†髓抑制作用， 因此化疗药 物足通过抑制骨髓造血细胞而引起贫血。超过 60%的癌症病人接受化 疗后都忠有贫血， 严重地降低了病人的机体功能和生活质量。 大多数 化疗药物会引起胃部不适， 造成病人呕吐和恶心， 严重影响食欲并导 致病人体: :减轻， 原困之一就是化疗诱导性贫血 (CIA)。 贤性贫血足 指各种闪素造成肾脏促红细胞生成素产 不足或尿^症血浆中 匕 尜物质 I：扰红细胞的生成和代谢而导致的贫血， 足慢性 ^功能不个 发^到终末期常见的并发症。 病人体内红细胞生成减少、 红细胞 命 缩短以及红细胞丢失增加， 影响病人的血液代谢循环。 通常治疗化疗 诱导性贫血和肾性贫血的方法为输血和透析， ii〖是输血可能会带来严 ： 的临床或亚临床副作用， 病人在接受治疗的过程中也会遭受极大的 痛苦。
缺氧 （hypoxia , 或称为缺氧症） 是指因组织的氧气供应不足或 川氧障码， 而导致组织的代谢、 功能和形态结构发生异常变化的病理 过程。 缺氧症 -般表现为： 头暈、 头痛、 耳鸣、 眼花、 四肢软弱无力； 或者产生恶心、 呕吐、 心慌、 气短、 呼吸急促、 心跳快速无力。 红细 胞是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主耍的媒介， 因此增加机体 内红细胞的: ¾可以有效改善缺氧状态 （参见参考文献： "促红素治疗 新^儿缺氧缺血性脑病疗效分析， 郭志梅等， 临床军医杂志， 2008 , 5 " 及 " EPO对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 NSE表达的影响， 刘青，
¾志等， 暨南大学学报： 自然科学与医学版， 201 1， 6 " ) 。
前临床治疗化疗诱导性贫血和肾性贫血以及缺氧症最有效的 药物为红细胞生成刺激物（ESAs ) ， 主要为人工重组促红细胞生成素 ( recombinant EPO, rHuEPO ) ， 促红细胞生成素 （ EPO ) 足哺乳动物 调节红细胞生成的 要调控因子， 要由肾脏和肝脏产生， 在缺氧状 态下如果无法提升血液中的 EPO含：默将会导致贫血的发生。 EPO 的 合成表达 ：耍受缺氧诱导因子 ( HIF ) 的调控， HIF对于红细胞 4·:成、 Jin. \ 生、细胞代谢等多种过程都具有调节作川。在缺氧环境下， HIF 选择性地结合到 EPO基因的低氧响应元件（ HRE )― 1：， 进而 'j I发 EPO ¾因的转 · ¾达。 有关可参见参考文献： " Flavonoids from radix astragali induce the expression of erythropoietin in cultured cells: a signaling mediated via the accumulation of hypoxia-inducible factor- l a, Ken Y.Z. Zheng et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 201 1 , 59, 1697- 1704 " 。
ESAs治疗化疗诱导性贫血和肾性贫血: 要通过皮下注射 ΕΡΟ来 增力 11病人的红细胞水平， 可以有效减少病人的输血次数。 许多临床试 验农明皮下注射剂量为 5000 IU/天的人工 组促红细胞牛-成索 j以有 效的增加红细胞水平并减少病人的输血次数。 「I前 I 1J面― h冇多种基 f i:PO的药物， 美国 Amgen公司（位于美闺加州 Thousand Oaks市）拥有 多项关于 EPO的专利，其产品之 Epogen ® (epoetin alfa)是 1 前被最 广泛使川的 EPO药物。 但是 EPO的应用而临着费用^昂以及严: 副 作川的 题， 如心脏疾病、 血块形成、 高血压、 过敏反应等。 美闺食 药品监 符理局（FDA)多次发布关； 控制 ESAs 剂: 使用的报告来 提^ EASs使用的安全性。 因此幵发一种价格低廉、 毒副作用小的药 物， 对 减轻癌症病人和肾病病人的痛苦具有非常 : 要的 义。
中药应用在贫血治疗上有悠久的历史， 作为纯天然植物药物， 中 药补血配方通常无毒副作用， 可以长期服用。 在用于贫血治疗的中药 补血配方， 经常使用黄芪作为主要成分进行配制。 黄芪的药川迄今已 2000多年的历史， 具有补气生血的功效。 黄芪含皂甙、 蔗糖、 多 糖、 多种氨基酸、 叶酸及硒、 锌、 铜等多种微量元素， 具 许多生物 学和 学功效， 如保肝、 生血、 抗氧化、 抗卨血压、 增强免疫等。 ί ^山于中药的成分复杂， 通常有几十种甚 上 种的化合物组成， 难 以对 进行药理学研究和优化。 中药的药材质量控制也足尤其重要， 产地、 候、 年份等因素都能影响中药材的质量， 从而影响药物的 W 效性和稳定性。 尽管在国内市面上有许多治疗贫血的中药药品， 但是 π治疗效果也足良莠不齐， 因此对中药进行优化， 解决质: ¾：控制等难 题对 f中药的幵发和推广具有重要的意义。
近的研究表明，黄芪中的类黄酮成分能够有效刺激肾细胞中促 红细胞 1 成素的表达， 从而提高血液中的红细胞水平来改善和治疗贫 血。 中^要的四种具有促进促红细胞生成素农达的类黄酮化合物为 刺 柄花素、 芒柄花苷、 毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮 ΐΐ:。 ¾近的研究 明， 儿种从黄芪中分离的类黄酮化合物在单独使川时 I ij以增强细胞低 親反 /、V:兀件 ( HRE ) 的转录活性， 从 lilj促进促红细胞生成素的农达来 提 血液中的红细胞水平 （参见参考文献： " Flavonoids from radix astragali induce the expression of erythropoietin in cultured cells: a signaling mediated via the accumulation of hypoxia-inducible factor- l a. Ken Y.Z. Zheng et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 201 1 , 59. 1697- 1704 " ) 。 似是「 前的各类黄酮化合物在单独使用时 #在药 效 限— H.使 Π]剂 M较大的缺陷。 发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种川于促进 红细胞 4·:成的组合物及其用途。
具体而宫， 本发明提供：
(1) -种川于促进红细胞生成的组合物， 其含有两种以上的作为活 性成分的类黄酮化合物； 其中所述的类黄酮化合物由下式 I所示：
Jt:中， ！^为
Figure imgf000005_0001
R2为 H或羟基；
并上1.在制备所述的组合物吋，所述的类黄酮化合物是以纯化的形 式使川的。
(2) 根据 （1) 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛蕊异黄酮 以及选 ΙΊ刺芒柄花索、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷中的至少一种。
(3) 报据 （2) 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛蕊异黄酮 和毛蕊异货酮苷。
(4) 根据 （3) 所述的组合物， 其巾， 所述的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄 酮 I 的摩尔比为 (0.016-2) ： (0.016-2) 。
(5) 根据 （4) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄 酮 ί::的摩尔比为 1:1。
(6) 根据 （2) 所述的组合物， 其巾， 所述的组合物包含毛蕊异黄酮 和芒柄花^。
(7) 根 ; (6) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异 j¾酮和芒柄花苷 的摩尔比为 (0.016-2) ： (0.016-2) 。 (8) 报据 (7) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和芒柄花 Ί 的摩尔比为 1:1。
(9)根据 （2)所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素和芒柄花苷。
(10) 根据 （9) 所述的组合物， 其巾， 所述的毛蕊异货酮、 刺芒柄 花尜和芒柄花甘 -的摩尔比为 (4-6) ： (0.5-1.5) ： (20-30) 。
(11) 根据 （10) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄 花尜和芒柄花 Π:的摩尔比为 5:1:25。
(12) 根据 （2) 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛蕊异黄 »i、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷。
(13) 根据 （12) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒枘 花素、芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为（4-6):( 0.5-1.5 ):(0.5-1.5):
(0.5-1.5) 。
(14) 根据 （13) 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄 花尜、 柄花苷和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为 5:1:1:1。
( 15) 根¾ (1) - (14) 中任意 -项所述的组合物， 其中， 所述的组 合物为药物组合物或膳食补充用组合物， 并包含药用辅料。
(16) 匪 (15) 所述的组合物， :中， 所述的组合物的剂 为 1」服 液。
(17) 根据 （1) - (16) 中任意一项所述的组合物在制备用于促进红 细胞 ^- -.成的药物或膳食补充剂中的用途。
(18) 根据 （17) 所述的用途， 其中， 所述的药物或膳食补充剂用于 预防 Ι I /或治疗缺氧症和 /或贫血。 本发明的组合物与现有技术相比具有以― F优点和积极效 ¾： 木发明的组合物对增强 HRE的转 > 活性、 从而促进红细胞 '\ -成、 以及预防和治疗贫血和 /或缺氧症具有良好的协同效果， 并 显著地 降低了 ^ 性组分的川量， 价格低廉且^副作川小。 例如， 在本发 liJ 的 ·个优选的组合物中， 甚至能增加约 3倍的 HRE转 活性。 HRE转 ¾活性的增强能够直接刺激 EPO的表达， 从而达到促进红细胞生成、 以及预防并治疗贫血和缺氧症的 的。相比各活性组分单独作用和黄 芪水提液的作用效果， 本发明的组合物能够提升其 2倍的药效， 并且 所耑剂 i可低至约 0.6μΜ， 不到先前的 1/10。
附图说明
阁 1 为比较例 1 中的黄芪水提液成分作用于 pHRE- Luc 转染的 Ηΐ;Κ 293Τ 细胞时， 对 HRE转录活性的影响的 意图；
2为比较例 2 中的 4种化合物单独作用于 pHRE-Luc转染的 HEK 293T肾细胞时， 对 HRE转录活性的影响的示意图；
阁 3为试验例 1中的 pHRE-Luc载体的图谱示意图。 具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一歩说 明， 似这并非是对本发明的限制， 本领域技术人员根据本发明的基本 思 ， I >j'以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想， 均在本发明的范围之内。
本文中所述的治疗是指为使有 4:.命的人体或者动物体恢复或获 得健康或减少痛苦， 进行阻断、 缓解 （或改稗） 或者消除病因或病灶 的过程。
本文中所述的毛蕊异黄酮的英文名称为 Calycosin 或 7,3'-dihydroxy-4'-methoxyisoflavone ; 分子式为 C16H12O5 ; 分 为 284.26348； 毛蕊异黄酮 ^ :
Figure imgf000007_0001
化学式 II
I I前毛蕊异黄酮已知的药理作用如下： （1 )提, 免疫功能； ( 2 ) 增强抗氧化、 抗辐射和抗癌作用； （3 ) 保护心脑血管、 肝脏、 肾脏 和肺脏作用； （4 ) 保护脑细胞、 提高记忆力； （5 ) 抗菌及抑制病毐 作川； （6 ) 降血脂、 降血糖、 减少糖尿病并发症等。 本文中所述的刺芒柄花素也称为 7-羟基 -4' - 氧基 ^黄酮、 芒柄 花 J¾ 素 ； 英 文 名 称 为 Formononetin 、 7-Hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)chromone 、 7-Hydroxy-4'- methoxyisoflavone. 或 Dadein 4'-methyl ether-, CAS ¾ "j 485-72-3； 分 f式为 C 16H12O4 ; 分子量为 268.26 ; 刺芒柄花素的化学式如下化学 式 III所示：
Figure imgf000008_0001
H.
化学式 III
刺芒柄花素易溶于甲醇、 乙酸乙酷、 乙醚、 稀碱溶液， 难溶于水。 可以从植物中提取刺芒柄花素， 也可通过化学方法合成。 例如， 合成 方法可参见参考文献： " J.Agric.Food Chem.. EN;9.1994,42, 1869- 1871 " 。 I I前刺 柄花素已知的药理作用如下： （1 ) 抗癌作用： 可 防治乳腺癌、 前列腺癌以及结肠癌； ( 2 ) 雌激尜作川： 能增加小 动物了'ώ'的: Φ: ， 但雌激素作用是很弱的， 作用不及同类的异黄酮 染料木尜（金雀异黄素）、 大豆黄素； （3 ) 对 Triton WR- 1339引起的 雄性 1Ί化病大鼠高血脂有降血脂作用； （ 4 ) 临床用作利尿剂。
本文中所述的芒柄花苷也称为刺芒柄花尜 -7-葡 糖甙； 英文名 称为 Ononin、 或 Formononetin-7-O-beta-D-glucopyranoside ; CAS - '' 为 486-62- 4 ; 分子式为 C22H22O9 ; 分子量为 430.40 ; 芒柄花 :ίΐ的化学 式如下化学式 IV所示：
Figure imgf000008_0002
化学式 IV
本文中所述的毛蕊异黄酮卄也称为毛蕊异黄酮葡 ¾ί糖 、 毛蕊 酮 -7-O-p-D 葡萄糖苷； 英文名为 Calycosin-7-glucoside、 Calycosin-7-O-P-D-glucoside、 3',7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavone-7- beta-D-glucopyranoside、 Calycosin 7-O-beta-D-glucoside、 Calycosin 7-beta-D-glucopyranoside、 或 Calycosin-7- O-beta-D-glucopyranoside ; 分 M为 446.40 ; CAS号为 20633-67-4， 毛蕊异黄酮 :ί 的化学式如 下化学式 V所示：
Figure imgf000009_0001
化学式 V
本发明的 Η的在于提供一种含有类黄酮化合物的组合物及其用 途。
本发明人通过实验发现： 当将毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 柄花 i I· il I毛蕊异黄酮苷中的两种或多种进行组合吋， 所得到的组合物的各 ^分 ¾ 出了出人意料的协同作用， 所得到的组合物在提高血液中的 红细胞水平方面的效果优子各组分单独使用的效果。在此发现的 础 上， 本发明人进 -步得到了本发明的技术方案。
体而言， 本发明提供了- -种用于促进红细胞生成的组合物， 其 含冇两种以上的作为活性成分的类黄酮化合物； 其中所述的类黄酮化 合物山下式 I所小- :
其中， 1^为
Figure imgf000009_0002
R2为 H或羟 ¾ ; 并且在制备所述的组合物时，所述的类黄酮化合物是以纯化的形 式使川的。
所述的类黄酮化合物的纯化) - 式可商购得 ¾ iJ (例如可得 四川维 克奇生物技术有限公司），也可使用本领域巳知的纯化方法进行制备。
巾， 特别说明的是， 式 I中， ¾ R,为羟基， 12为 11吋， 所述 的类黄酮化合物为刺芒柄花素；
式 I 中， ^ 为羟基， R2为羟基时， 所述的类黄酮化合物为毛 蕊 黄酮；
式 I中， 当！^为
Figure imgf000010_0001
， R2为 Η时， 所述的类黄酮化 物为芒柄花苷；
式
Figure imgf000010_0002
I屮， ^！^为 ， R2为羟基时， 所述的类黄酮 化合物为毛蕊异黄酮苷。
在本发明的组合物中， 毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛 蕊异 嗣 ff的使用浓度可以分别为 0.016-10μΜ。
优选的是， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮、 以及选 f:1刺芒枘花 ϊ、'.:柄花 'f和毛蕊异黄酮苷中的至少一种。
优选的是， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷。 更 优选的是， 所述的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为（0.016-2)： (0.016-2) ， 31优选为 1:1。
优选的是， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮和芒柄花卄。 更优选 的 ，所述的毛蕊异黄酮和芒柄花苷的摩尔比为（ 0.016-2 )： ( 0.016-2 )， W优选为 1:1。
优选的足， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮、 剌芒柄花索和 >'.：柄 花 l 。 更优选的是， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素和芒柄花苷的摩 尔比为 (4-6) ： (0.5-1.5) ： (20-30) ， 更优选为 5:1:25。
优选的足， 本发明的组合物包含毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄 花 Π:和毛蕊异黄酮 :。 更优选的是， 所述的毛蕊异黄酮、刺 ^柄花尜、 芒柄花 :Π:和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为 ( 4-6 ) ： ( 0.5- 1.5 ) ： ( 0.5- 1.5 ) ： ( 0.5- 1 .5 ) ， 更优选为 5: 1 : 1 : 1。
优选的是， 本发明的组合物中还可包含其它活性成分， 如， 维生 尜
优选的是， 本发明的组合物为药物组合物或膳食补充用组合物， 并包含药川辅料。
本领域技术人员可以根据需要对药用辅料的种类和用量进行选 择， 以制成所需的药物或膳食补充剂。 本发明的组合物中可采用本领 域公知的药用辅料， 包括但不限于 （例如） 参考文献： " 《药剂学》 (第四版） ， 毕殿洲主编， 人民卫生出版社 2001 年出版" 中所披露 的药川辅料。
所述的药用辅料包括本领域已知的可药用载体， 例如聚乙二醇 类、 聚维酮类、 表面活性剂类 （如泊洛沙姆 188 ) 、 ^机酸类 （如酒 石酸、 琥珀酸等） 、 糖类 （如右旋糖、 半乳糖、 蔗糖等） 与醇类 （廿 露醇、 山梨醇、 木糖醇等） 、 纤维素 （如乙基纤维素、 羧甲乙纤维素 等） 、 聚 W烯酸树脂类等。
本发明的组合物可以口服或者非口服的形式施用。本领域技术人 W能够理解的是， 施用量根据年龄、 体重、 症状、 治疗效果、 施用方 法、 处理时问等而不同。 口服施用时可采用固体、 液体等形式， 非口 服施川时 I J采用注射剂等形式。
川于 U服的固体形式可包括片剂、 丸剂、 胶囊剂、 散剂、 颗粒剂 等， 木领域技术人员可以根据需要选择采川下述辅料进行制备： 填充 剂 （如淀粉、 糊精、 乳糖、 甘露醇、 微晶纤维素等） 、 吸收剂 （如硫 酸^、 磷酸氢钙等） 、 湿润剂 （如水、 乙醇等） 、 粘合剂 （如羟甲¾ 纤维索、 聚维酮、 淀粉浆等） 、 崩解剂 （如交联羧甲 ¾纤维素钠、 交 联聚维酮等）、润滑剂（如硬脂酸、滑石粉、聚乙 ：醇、微粉硅胶等）、 矫味剂 （如甜味剂 （如蔗糖、 甜菊甙、 阿斯帕坦等） 、 芳香剂 （如香 料和香精等） 等） 、 着色剂 （如甜菜红、 焦糖、 柠檬黄等） 等。
川」 」服的液体形式 （口服液） 包括溶液剂、 乳剂、 混悬剂、 糖 浆剂等， 本领域技术人员可以根据需要选择采用下述辅料进行制备： 溶剂 （如水、 I†汕、 二甲基亚砜 （DMSO ) 、 乙醇、 闪 醇、 聚乙 ： 醇、 脂肪油、 液体石蜡、 醋酸乙酯等） 、 矫味剂 （如甜味剂 （如蔗糖、 甜菊 、 阿斯帕坦等） 、 芳香剂 （如香料和香精） 等） 、 ^色剂 （如 甜菜红、 腿、 柠檬黄等） 、 防腐剂 （尼泊金类、 苯 酸'；苯 η'酸钠、 山梨酸等） 、 润湿剂 （如聚山梨酯类、 聚氧乙烯脂肪醇醚类等） 、 助
^；剂 （如廿油、 胶树类、 纤维素类、 硅藻土等） 、 乳化剂 （如表而活 性剂类等） 等。
优选的足， 本发明的组合物的剂型为口服液。
木发明还提供了上述任意 - -项所述的组合物在制备川丁-促进红 细胞 ^成的药物或膪食补充剂中的用途。 优选的足， 所述的药物或膳 补充剂川 "J '-改 和 /或治疗缺氧症和 /或贫血 （更优选为化疗诱导性 贫血和1 ίί性贫血） 。 以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明内 ， in这些例 /·不、V:被现解为对木发明保护范围的限制。
在以下例 中， 毛蕊异黄酮、 刺芒柄花索、 芒柄花^、 毛蕊异黄 i'f均可购 1'|四川维克奇生物技术有限公 π 。 试验例 1 : 构建 ΕΡΟ表达调控的离体硏究模型
木试验例釆川的^转染了 pHRE- Luc载体的 HEK293T细胞作为 liPO 达调控的离体研究模型。 转染了 pHRE-Luc载体的 HEK293T 细胞的构建过程可参见参考文献： " Flavonoids from radix astragali induce the expression of erythropoietin in cultured cells: a signaling mediated via the accumulation of hypoxia-inducible factor- l a. Ken Y.Z. Zheng ct al, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 201 1， 59,
1697- 1704 " ， 具体如下：
从荧 M标准生物品收藏中心 （American Type Culture Collection ( ATCC ) ， 位于美 维 尼亚州 Manassas 市） 获得人胚贤细胞 (HHK)293T细胞系， 将― I：述细胞加入 Φ:细胞培养液 (含 ϋ 10% ( v/v ) 的胎牛血.淸 ( FBS ) 、 100 U/ml的 1Ϊ霧尜以及 100 U/ml的链 素的
I 1 DMIiM培养基） 中， 放入 37 °C恒温培养箱， 控制二氧化碳浓度在 5% ( v/v ) ， 培养 24小吋。
人类促红细胞生成素 （EPO ) 基因中获取的缺氧反应元件 (HRE) (5' -TCG AGG CCC TAC GTG CTG TCT CAC ACA GCC TGT CTG ACG-3' )含冇高度保守的缺氧诱导因子- 1 ( HIF- 1 ) 结合靶点 （5' -TAC
GTG-3' ) 。 将 6个 HRE序列合成并从头到尾串联克隆到 pBI-GL载体 (可得 (：]位于美国 San Jose市的 BD Biosciences Clontech公 ) 中 ( Ά 体 歩 骤 nj' 参 照 以 下 文 献 ： " Generation of bidirectional hypoxia/HIF-responsive expression vectors to target gene expression to hypoxic cells. Post, D.E., and Van-Meir, E.G., 2001 . Gene Therapy 8,
1801 - 1807 " )，从而得到 pHRE-Luc载体（参见图 3 )，其中所述的 pBI-GL 载体本身具有 个报告基因： 萤火虫荧光素酶基因 （firefly luciferase gene ) 。 通过磷酸钙细胞转染技术， 将该 pHRE-Luc转染到培养的 HHK293T细胞中 （具体步骤可参照以下文献： " Regulation of a transcript encoding the proline-rich membrane anchor of globular muscle acetylcholinesterase: the suppressive roles of myogenesis and innervating nerves. Xie, H.Q., et al.， 2007. Journal of Biological Chemistry, 282, 1 1765- 1 1775. " ) ， 转染效率「 80%。 实施例 1
将毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷分别 ffl DMSO溶解， 配制成各 |¾的 DMSO母液 （每种 DMSO母液可分别为 3种 浓度： 50μΜ、 500μΜ、 5mM， 用来配制不同的终浓度， 以提高实验 精度） 。 针对农 1所示的每种本发明组合物， 按照其纽分及终浓度， 计 并: 取所需体积的 DMSO母液， 合并、 并用试验例 1所述的细胞 培 液稀释至 300微升， 用于下述 3次平行实验。 将所得的组合物溶液 作川 试验例 1构建的转染后的 HEK293T细胞上后， 测量所引起的荧 光索酶活性变化， 具体步骤如下：
将转染 的 HEK293T细胞种于 24孔培养板， 毎个孔巾细胞数为 3 万个， 细胞培养液体积为 500微升， 于一天后吸走原^的细胞培养液， 力 11入 400微升新鲜的细胞培养液， 3小时后再加入上述含有本发明组合 物的细胞培养液 100微升， 从而每孔总体积为 500微升， 并且每种组合 物中的各组分在该 500微升细胞培养液巾的浓度为表 1所示的终浓度。 ^种组合物重复 3次。 施加本发明组合物两天后， 将细胞裂解， 每个 孔巾加入 300微升的裂解试剂 （裂解试剂是含有 0.2%Triton X- 100和
1 mM -.硫苏糖醇和 1 OOmM磷酸钾的缓冲液 （ pH7.8 ) ) ， 振摇十分钟 /ι 收柒细胞溶解液， 溶解液用离心机离心 10分钟， 转速为 13,500rpm， 收¾.1:消液测量其荧光强度， 细胞裂解液中荧光素酶活性变化 ώ FLUOstar OPTIMA (可得自位于德 |玉 I Ortenberg市的 BMG Labtech公 ><\ ) 测定， 其荧光强度由蛋白含量进行内标， 蛋白含量由 Bradford方 法测得， 所用试剂盒可得 ΐ位于美国加利福尼亚州 Hercules市的 Bio-Rad Laboratories公司， 该测量数值可反映药物作川对 HRE的转 ¾ 活性的影响。 其中对照组为不添加任何药物的细胞响应， 釆用 ((¾验 ϊ\ \的荧光强度 -对照组的荧光强度 ) /对照组的荧光强度） X 100 %来评价 药物的作川效果。
Λ体结果参见表 1。
本发明组合物对 HRE的转录活性的影响
组合物中各组分的终浓度 (μΜ) pHRE-Luc 编 '
毛蕊异 ^酮 刺 t柄花素 芒柄花 t 毛蕊异货酮^ 活性位 (%)
1 2 2 0 0 63.1±4.34
2 0.4 0 0.4 0 41.6±1.02
3 2 0 2 0 91.1±8.45
4 0.08 0 0 0.08 26.4±11.29
5 0.4 0 0 0.4 56.2±17.46
6 2 0 0 2 129.4+15.14
7 0.4 0 0.016 10 243.9+55.52
8 0.4 0 0.08 2 100.2±31.49
9 10 0 0.016 0.016 104.8±18.71
10 0.08 0.4 0 0.4 74.4±1.87
11 0.4 0.08 0 0.08 77.1±8.16 0.4 0.08 0 10 262.9±49.33
0.08 0.016 0.4 0 214.8±40.05
0.4 10 0.08 0 121.1±28.36
2 0.016 0.4 0 189.6±34.98
0.4 0.08 0.08 0.08 333.4±20.03
0.08 0.08 0.08 0.016 126.2±50.24
10 10 0.08 0.4 236.2±37.68
2 0.08 2 10 141.4±44.82
0.4 10 0.08 2 132.2±61.10
0.4 0.016 10 0.4 141.1+63.32
10 0.016 0.4 0.08 196.0±50.63
0.4 0.4 0.08 2 174.9±50.46
0.4 0.08 0.08 10 232.8±38.28
0.08 0.016 2 0.4 38.9±10.48
0.4 0.016 0.08 0.4 40.4+18.15
0 0.08 0.4 2 146.6±14.52
2 0.08 0.4 0.016 143.2±30.45
0.4 10 0.016 0.016 192.9±14.14
0.08 0.08 0.4 0 74.7±11.49
0.016 0.016 0.4 0.08 103.1±4.56
10 10 10 0.4 108.1±10.28
0.016 0.4 0.08 10 92.4±53.66
2 0 2 0.08 86.9±31.50
10 0 0 10 216.2±46.98
0.08 10 0.08 2 266.2±83.82
0.4 0.08 0.016 0.016 69.9±10.68
0.4 0.016 0.08 2 153.7±4.95
0.4 0.016 0.016 0.016 79.6±15.55
0.4 2 0.08 0.4 1 I5.7±21.49 1 0.4 0.4 0.08 10 159.8±2.22
2 0.016 0.08 0.4 2 106.8±2.58
3 0.4 0.08 0.4 0.016 84.8±24.49
4 0.4 10 0.016 0.4 184.3+12.51
5 0.4 10 0.016 0.08 207.3±43.85
6 2 0.08 0.016 10 166.7±34.33
7 10 0.016 0.016 0.08 200.6±47.35
8 0.08 0.016 0.4 0.016 107.0±44.09
9 0.4 10 0.016 0.4 141.3±33.43
0 0.4 0.016 10 10 178.7±21.28
1 0.08 10 0.08 0.4 115.8±32.33
2 0.4 0.016 0.016 0.016 84.2±6.05
3 0.4 0.08 0.08 0.08 61.7+5.80
4 2 0.08 2 2 187.4±11.40
5 2 0.016 0.08 0.08 128.8±31.32
6 2 0.016 0.4 0.08 168.1±37.74
7 0.4 0.4 2 2 171.7±8.75
8 0 0.08 0.4 0.08 24.6±13.56
9 2 0.08 2 0.016 97.2±19.15
0 0.4 2 0.016 0.4 67.9±6.46
1 0.4 2 0.016 0.4 86.9+15.39
2 2 0.08 0.4 0.4 72.7+31.66
3 0.016 2 0.08 0.08 66.9±33.31
4 0.4 2 0.016 2 167.7±33.41
5 0.4 2 0.08 0.4 128.9±15.47
6 2 0.016 0.08 2 182.6±10.92 在上农中， 浓度为 0表示的是在该组合物中不含有相应的化合物。 从农 1π」'以^出， 本发明组合物能够 效地提 ¾jHRE转: ¾活性。 ill进 ·^而^， 山毛蕊异黄酮以及刺芒柄花素、 芒柄花卄和毛蕊异黄 酮 ΐί-中的至少一种组成的组合物能够有效的提高 HRE转朵活性。
中， 由毛蕊异黄酮和芒柄花苷组成的组合物 （摩尔比 1:1) ， 以及山毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷组成的组合物 （摩尔比 1:1) ， M ^均能够提高约一倍的 HRE转录活性。
此外， 由毛蕊异黄酮以及刺芒柄花素、 芒柄花 ^和毛蕊异黄酮 中的两种组成的组合物最高均能够提高约两倍的 HRE转录活性。 特别 !i， 山 0.08μΜ毛蕊异黄酮以及 0.016μΜ刺芒柄花素和 0.4μΜ芒柄花苷 成的组合物 （摩尔比为 5:1:25) ， 可以提高 215%的 HRE转： ¾活性， 并卜 1. .尔浓度总和仅为约 0.6μΜ。
此外， 山毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷组 成的组合物能够提高约 1~3倍的 HRE转录活性。特别是， 由 0.4μΜ毛蕊 Η黄酮、 0.08μΜ刺芒柄花素、 0.08μΜ芒柄花苷和 0.08μΜ毛蕊异黄酮 ί ϊ- ί\〖成的组合物（摩尔比为 5： 1： 1： 1 )，可以提高 333 %的 H RE转 活性， 并—11. .尔浓度总和仅为约 0.6μΜ。 比较例 1
制黄芪水提液的母液： 将黄芪与水按 量比 1:8进行混合， 煎 ¾两次， 每次煎煮 2小吋， 合并两次所得的水煎液， 将得到的水提液 — I "·燥得到粉末状固体， 使用时将该粉末按照相应浓度溶解于试验例 1 所述的细胞培养液中。 根据与实施例 1相同的方法测量所引起的荧光 尜酶活性变化。 其中终浓度分别为： 0.01、 0.1、 0.3、 0.5、 1、 1.5、 lO mg/mL Λ体结果参见图 1。 从图 17'J以看出， 为了取得较好的提高 HRI^^¾活性的效架， 所需采用的黄芪水提液成分的有效浓度偏高， ¾本为1~10 mg/mL (其中， 黄芪水提液成分的终浓度为 10mg/mL 吋， N」-测得其中含 W毛蕊异货酮约 6.9μΜ、 刺芒柄花尜约 5.6μΜ、 芒 枘花 if约 1.6μΜ和毛蕊异黄酮苷约 5.13μΜ， 总和为约 19μΜ) ， 并 Η. 在此 浓度下， 所提高的 HRE转录活性也有限， 高才能提髙约 80% 的 HRE转录活性。 比较例 2
配制毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷的 DMSO母液， 使用吋将所得母液按照相应浓度溶解于试验例 1所述的 细胞培养液中， 根据与实施例 1相同的方法测 m所'引起的荧光尜酶活 性变化。 其中终浓度分别为： 0.003、 0.01、 0.03、 0.1、 0.3、 1、 3、
10、 30μΜ。 Α体结果参见图 2。 从图 2可以看出， 各组分^独使用时， 为了取得较好的提高 HRE转录活性的效果， 所需采川的有效终浓度偏 基本为 1 ~30μΜ， 并且在此高浓度下， 所提^的 HRE转 活性也 ^限， ¾ ¾J才能提高约 80%的 HRE转录活性。 在低于 Ι μΜ的浓度下， 所提 的 HRE转录活性普遍偏低。 综上所述， 由上述实施例和比较例的结果可以看出， 本发明的组 合物对增强 HRE的转录活性、 从而促进红细胞生成、 以及预防禾 11治疗 贫 ιίιι.禾 11 /或缺氧症 n冇 好的协同效^：， 并且显著地降低了各 ί, ·性 n ι 分的川 。

Claims

权利要求书
1. -种川干促进红细胞生成的组合物， 其含 两种以上的作为 活性成分的类黄酮化合物； 其中所述的类黄酮化合物山下式 I所示：
其中， ！^为
Figure imgf000019_0001
12为 H或羟 ；
并 J .在制备所述的组合物时，所述的类黄酮化合物足以纯化的形 式使川的。
2. 根据权利耍求 1 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛 蕊异 酮以及选〔I刺芒柄花素、芒柄花 ΐί·和毛蕊异黄酮 1'ί:中的个：少 - 种。
3. 根据权利要求 2 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛 蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷。
4. 极据权利要求 3 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和 毛蕊异黄酮 Γ的摩尔比为 (0.016-2) ： (0.016-2) 。
5. 报据权利要求 4 所述的组合物， 中， 所述的毛蕊异货酮和 毛蕊异 酮^的摩尔比为 1:1。
6. 根据权利要求 2 所述的组合物， ¾中， 所述的组合物包含毛 蕊异黄酮和芒柄花苷。
7. 根据权利要求 6 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和 芒柄花 ΐ'ί·的摩尔比为 (0.016-2) ： (0.016-2) 。
8. 报据权利要求 7 所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮和 芒柄花苷的摩尔比为 1:1。
9. 根据权利要求 2 所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛 蕊异黄酮、 刺芒柄花素和芒柄花苷。
10. 根据权利要求 9所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素和芒柄花苷的摩尔比为 (4-6) ： (0.5-1.5) ： (20-30) 。
11. 根据权利要求 10所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺 柄花尜和芒柄花苷的摩尔比为 5:1:25。
12. 根据权利要求 2所述的组合物， 其中， 所述的组合物包含毛 蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮 :。
13. 根据权利要求 12所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺 t柄花素、 芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷的摩尔比为（4-6)： (0.5-1.5)：
(0.5-1.5) ： (0.5-1.5) 。
14. 根据权利要求 13所述的组合物， 其中， 所述的毛蕊异黄酮、 刺芒柄花素、 芒柄花 ^和毛蕊异黄酮 的摩尔比为 5:1:1:1ο
15. 根据权利要求 1-14中任意一项所述的组合物， 其中， 所述的 ϊ\ \合物 ¾药物组合物或膳食补充用纽合物， 并包含药川辅料。
16. 根据权利要求 15 所述的组合物， 其中， 所述的组合物的剂 動 U服液。
17. 根据权利要求 1 - 16 中任意一项所述的组合物在制备用于促 进红细胞生成的药物或膳食补充剂中的用途。
18. 报据权利要求 17 所述的川途， 其中， 所述的药物或膳食补 充剂川 "J '-预防和 /或治疗缺氧症和 /或贫血。
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