WO2014044612A1 - Einweg-flaschenreaktortank - Google Patents

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WO2014044612A1
WO2014044612A1 PCT/EP2013/069024 EP2013069024W WO2014044612A1 WO 2014044612 A1 WO2014044612 A1 WO 2014044612A1 EP 2013069024 W EP2013069024 W EP 2013069024W WO 2014044612 A1 WO2014044612 A1 WO 2014044612A1
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reactor tank
reactor
lid
separator
interior
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PCT/EP2013/069024
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Joerg Kauling
Annette WALDHELM
Helmut Brod
Verena HERRMANN
Stefanie JACOB
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Bayer Technology Services Gmbh
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    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation

Definitions

  • the subject of the application is a reactor tank designed as a disposable element with cover and / or opto-electronically readable sensor patches affixed in the interior, a reactor comprising the reactor tank and a real-estate tank peripheral comprising a catchment heater and possibly an opto-electronic measuring system for reading the Sensorpatche, the Reaktortankhait für is coupled to a drive unit for generating a rotationally oscillatory movement of the reactor tank Erend his own central vertical axis, and the use of this device for the cultivation of cells and / or microorganisms.
  • Boilers are often used in the USP and DSP as stirring and reaction systems. Especially in fermentation, a germ-free environment is essential for ertolgreiclic cultivation.
  • SIP steam-in-place
  • the autoclaving technique is also used, which, however, requires cumbersome transport of the reactors / to autoclaves and is applicable only in comparatively small reactor scales.
  • the risk of contamination during fermentation is particularly critical during sampling and on agitated stirrer shafts.
  • the latter are usually equipped with elaborate sealing systems (e.g., mechanical seals). Technologies that do not require such penetrations of the fermentation casing are preferred because of their greater process robustness.
  • the failure of the standard reactors due to the provisioning procedures can be of the order of magnitude of the retry effect, especially for short periods of use and frequent product changes.
  • Affected in the USP of biotechnological production for example, the process steps of media production and fermentation and DS solubilization, freezing, thawing, pH adjustment, precipitation, crystallization, rebuffering and virus inactivation.
  • the process steps of media production and fermentation and DS solubilization, freezing, thawing, pH adjustment, precipitation, crystallization, rebuffering and virus inactivation In order to meet the demand for a fast and flexible resending of the production plant while maintaining maximum cleanliness and sterility, there are concepts of disposable reactors of ever increasing interest on the market. In WO2007 / 121958A1 and WO2010 / 127689 such a disposable reactor for the cultivation of cells and microorganisms is described.
  • the deformable disposable reactor is received by a container that supports it. He is preferably introduced from the front into the container.
  • the container is connected to a drive unit.
  • the drive unit of the container including the disposable reactor is placed in a rotational oscillatory movement about a stationary, preferably vertical axis of the container.
  • a high power input can be achieved in the reactor contents in the oscillatory rotary motion, so that the disposable reactor can be used as a surface-agitated fermenter for the cultivation of cells and microorganisms.
  • the internals for supply and monitoring of the reactor are mounted laterally at the bottom of the reactor via a connection plate. These reactors are predominantly used at reactor volumes of more than 10 liters.
  • the challenge lies in small disposable reactors in achieving the sensor technology, mixing technology, temperature control and supply of the reactor in a possible compact and cost-effective form.
  • the drive of the stirrer is ensured via a drive shaft driven from above, the sensors (temperature, pH (former), oxygen (formerly)), the gas and gas disposal for the gas space as well as further supply and sampling via lines ,
  • the lid is attached to the reactor tank by means of a clamp connection and sealed in a sterile manner against the reactor tank via an O-ring.
  • the stirrer drive is sealed with 2 lip seals.
  • the sensors for monitoring of H and oxygen content can also be achieved by means of optoelectronic Sensorpatche at the bottom of the reactor tank.
  • the reactor tank is firmly positioned in a special container, this container having a retaining ring and a foot with an opto-electronic sensor system for reading the sensor patches.
  • the system should be usable for pess measurement volumes of 10 mL to 20 L, in particular 50 mL to 10 L and more preferably 250 mL to 3 L working volume. It is intended to meet the high requirements of the pharmaceutical industry, to be simple and intuitive to handle and to be cost-effective. It is intended to minimize safety risks by discharging substances from the process area to a minimum.
  • this object is achieved by the use of a dimensionally stable, square plastic bottle for delimiting the interior of the reactor, wherein the plastic bottle has a bottom, walls, an interior and at least one access to the interior and preferably a pyramidal, inwardly curved bottom, a wide neck and / or. or has one or more laterally in the lower region of the bottle at a position defined with coordinates Sensorpatche. ,
  • the first object of the present invention is therefore the use of a dimensionally stable square plastic bottle as a bioreactor tank for the cultivation of cells, especially sensitive cells and on (micro) carrier-growing cells such as stem, blood or tissue cells, the plastic bottle a floor, walls, a Interior and at least one lockable Access to the interior in particular has a bottleneck.
  • the plastic glass che on one or more walls in the lower region, attached to a position defined by coordinates, one or more Sensorpatche attached.
  • Another object of the present invention is a reactor tank comprising a dimensionally stable polygonal plastic bottle having a bottom, walls, an interior and at least one closable access to the interior, comprising at least one bottleneck esp.
  • Interior space, at one or more walls in the lower region of the plastic bottle, at a location defined by coordinates, one or more Sensorpatche are attached.
  • bushings are accommodated in the lid.
  • Support-fixed sensor patches constructed of fluorescent color layers (e.g., Presens, YSI), available e.g. can be stuck on bottle wall.
  • fluorescent color layers e.g., Presens, YSI
  • at least one pH sensor patch and one oxygen sensor trap are used.
  • Disposable sensors e.g. according to US 20120067724 AI, on.
  • the plastic bottle is usually made from a gamma-sterilizable plastic material.
  • the reactor tank according to the invention is preferably made of a single or multi-layer transparent polymer material that allows insight into the reactor tank during operation.
  • Plastics or glass are relatively inexpensive materials that can also be processed comparatively inexpensively.
  • the disposal of the used reactor tank and the use of a new disposable reactor tank are thus more economical than the cleaning of used reactor tanks, especially since when using a new disposable reactor tank, a complex cleaning and cleaning validation deleted.
  • the fiction, contemporary reactor tank is manufactured or cleaned in clean room and is preferably sterile packed.
  • the reactor tank according to the invention is dimensionally stable. Suitable materials or combination of materials for the reactor tank according to the invention are all cell biologically compatible, known in the art materials, in particular glass, polyethylene, polypropylene, polyether ketone (peek), PVC, polyethylene terephthalate and polycarbonate. Wall thicknesses of 0, lmm-5mm are preferred and 0.5-2mm is particularly preferred.
  • the bottle materials are usually brought into the desired shape by means of stretch blown processes known from the prior art.
  • the cross section of the reactor tank or the plastic bottle preferably has the shape of an n-corner with n in the range of 3 to 12, preferably in the range of 3 to 6, most preferably in the range of 3 to 4, most preferably n is equal to 4 ,
  • the side walls of the reactor tank or the plastic bottle according to the invention are at least partially formed as flat surfaces which meet at an angle of 45 ° to 120 °.
  • the side walls of the reactor form a polyhedron with the bottleneck attached to one of the surfaces.
  • the reactor tank or plastic bottle is cuboid with edge lengths H, b and c, where H represents the height, b the width and c the depth of the plastic bottle and b ⁇ c ⁇ H.
  • the broad neck is typically mounted on one of the small surfaces and the opposite surface serves as the bottom of the reactor tank.
  • the reactor tank according to the invention or the plastic bottle have a ratio of bottle height H to maximum width b and depth c in the range of 0.5 to 4, preferably 1 to 3, particularly preferably 1.5 to 2.5.
  • the reactor tank or the plastic bottle usually has an inwardly curved bottom.
  • the bottom has the shape of an inwardly directed tetrahedron, an inwardly directed pyramid, the shape of a paraboloid or a bell-shaped form.
  • the bottom is made pyramidal.
  • the height h w of the curvature is in the range of 0.01 times to 1 times the circle-equivalent diameter Dt of the bottom cross-section.
  • the height h w of the curvature at the circle-equivalent diameter Dt is preferably in the range from 3% to 100%, particularly preferably in the range from 5% to 30% and very particularly preferably in the range from 10% to 20%.
  • the reactor tank according to the invention can be heated and / or cooled via its outer walls.
  • a disposable heating mat is applied on the outside of the bottom of the plastic bottle or of the reactor tank, with which a very efficient heat transfer can be achieved because of the positive connection of the heating and lateral surface. In this way, the heating surface can be reduced to the floor area. .Dazu this heating mat is usually glued to the outside of the floor.
  • the reactor tank requires no additional cooling, since switching off the heating mat in reactors with a small volume and thus large specific heat exchange surface causes a sufficiently rapid cooling.
  • An additional cooling would be applicable, for example, in microbial applications at lower fermentation temperature and higher heat of respiration by attaching Peltier elements on the side surfaces of the reactor tank or the tank holder if necessary.
  • the reactor tank according to the invention preferably constitutes an externally sealable space for carrying out chemical, biological, biochemical and / or physical processes.
  • the reactor tank serves to provide a sterile space for culturing cells and / or microorganisms.
  • the bottleneck of the reactor tank is sealed by means of a lid, wherein the lid has at least passages and / or connections for the gas and liquid supply and removal of the reactor tank.
  • the cover has no passage for a drive axle [Fig. 2-5].
  • the lid is another element of the reactor tank according to the invention.
  • the connected gas lines are equipped with sterile filters, wherein the sterile filter of the exhaust pipe is preferably equipped with a heating mat to keep condensate from Fiiter schizophrenia.
  • the exhaust gas for condensate avoidance at the filter with egg nen exhaust gas cooler the e. is cooled down to a lower dew point (condensation temperature ⁇ ambient temperature) via an electronic cooling element (e.g., a Peltier element) mounted on a heat transfer surface made of sheet materials
  • the lid can, if necessary, further bushings and / or connections for elements from the group comprising:
  • one or more electronic, optoelectronic or electrochemical sensors in particular one-way electrochemical sensors from US 2012/0067724 A1 or PT100
  • Resistive sensor for temperature control and / or capacitive sensors for level control or cell density measurement
  • the reactor tank is equipped with one or more of these elements.
  • the lid is composed of a plug and a cap sleeve.
  • the plug is usually made of plastic selected from the group of polyetheretherketones, thermoplastic or silicone.
  • the plug is designed as a disposable plug, in a special imple mentation form reusable.
  • the plug is inserted into the neck of the reactor for closure, sealed by means of a circumferentially mounted O-ring seal against the inner side of the bottle neck and with a separate locking means such.
  • B screwed over a nut üb screwed to the thread of the bottle neck or jammed with a clamping ring.
  • the introduced into the bottleneck can be sealed by means of a sealing lip placed on the bottle opening and clamped with a separate screw-cap sleeve and screwed to the plastic bottle.
  • a lid containing the identical feedthroughs as the plug which is screwed to the plastic bottle and sealed with an O-ring against the bottle neck and / or the bottle opening.
  • the stopper inserted into the neck of the bottle is used, which is sealed with an O-ring seal on the neck of the bottle and screwed to the plastic bottle with a separate screw-on union nut [Fig. 2].
  • This embodiment has the advantage that the O-ring is subjected to little mechanical stress and no twisting of the hose occurs, as would be the case when turning a blanket.
  • the reactor tank with lid is preferably designed as a disposable element, i. It is preferably provided not to clean the entire reactor tank after use, but to dispose of it. Therefore, the reactor tank preferably comprises only the essential elements necessary to provide a sterile reaction space:
  • the plastic bottle is usually produced and used as a disposable item.
  • fumigation preferably takes place exclusively via the surface.
  • the lid does not have a passage for a bubble gasification element and the reactor tank according to the invention has no devices for the bubble gassing.
  • installation for additional micro- or Macrobegasung eg with hose lines from above the lid supplied and adhered to a container wall sintered body
  • the reactor according to the invention can be made completely from inexpensive elements and thus makes possible the use of the reactor as a one-way system.
  • all high quality elements are integrated into a reusable lid and only the reactor tank is used as a disposable element.
  • a cell separator in the reactor tank is used for cell retention.
  • the internal cell separator is formed by a central vertical separator tube and a separator head with a collector for extracting cells liberated culture solution, the lid has a passage for the collector and the Zellabscheider on the lid is either rotatably mounted or statically attached.
  • the tube and the separator head can have different lengths, conical and straight geometries and diameters, as well as various tube installations (conical and ring installations, rectifiers.) Special embodiments are shown in FIGS. 6 to 8.
  • the cell separator can be made of steel, glass or metal Preferably it is made of plastic such as polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyether ketone and / or polycarbonate and used as a disposable element.
  • Another object of the present invention is therefore an internal vertical cell separator for bioreactors, formed by a central vertical separator tube and a separator head with a collector for aspirating cell-depleted medium, the cell separator is attached to a cover for a reactor tank or rotatably mounted and the lid a Performing for the collector.
  • the cell separator is preferably designed so that the inner and outer regions of the cell separator are largely separated from one another by corresponding constrictions. In this way, a transfer of the sedimentation disturbing flows from the well-mixed outdoor space in the S edimentations zone can be reduced.
  • a return transport of the retained lines must remain ensured in the mixed, supplied reactor area
  • the case is a ratio l H of 0.2 to 0.9, preferably 0.5 to 0.9, in particular 0.8 used.
  • the separator tube has a round cross-section with a tube diameter d (350), wherein the ratio of tube diameter d to Flasch chenquers chnittkantenin D usually from 0.25 to 0.90, in particular from 0.5 to 0.85, preferably 0.83 ,
  • the tube diameter d is essential for the cell retention for the realization of the separator surface.
  • the gassing takes place exclusively via the surface (FIGS. 6 and 7).
  • the diameter of the pipe d (350) of the precipitator is selected so that a ratio of over the surfaces fumigated Kuiturvoiumen VK defined by formula (I) and trap volume VA defined by formula (II) of 0.01 to 1 0 preferably from 0.2 to 2 is present ,
  • V K D 2 * L - d 2 ⁇ L - S) (I)
  • V A ⁇ d 2 l (II)
  • the collector (320) At the separator head is the collector (320) for aspirating cell-free culture solution.
  • the ratio dv / d of the collector diameter dv (360) to the pipe diameter d 0, 1 to 0.7 is preferably 0.3-0.5
  • the collector (320) has a conical shape. This form has the advantage that there is room for the introduction of further elements (sensors, sample collection line, etc.) over the lid. Also, the fumigation * is reduced slightly.
  • the separator is used in the reactor tank with a ratio 1 / s from the separator length 1 to the bottom clearance s of the separator tube of 0.75 to 9.
  • the reactor according to the invention also has an automatic sampling element.
  • This Y-shaped sampling element is for the realization of an automatic sampling module consisting of hoses, pinch valves, sterile filters, a positive and negative pressure supply particularly advantageous.
  • the sample taking element which can be integrated in the cover is provided and used as a disposable element.
  • the basic principle of the Y-shaped sampling element is shown in WO 2007/121887, and is integrated by reference, in which two burettes are driven in order to ensure the transport and the aliquoting of a sample.
  • the Probe Erasmuseiement is sterilized with EtOH and dried.
  • filter elements for air and EtOH are incorporated to prevent contamination of the sampling element.
  • the sampling element is coupled with the biological chromatograph for automated analysis by Bayer Technology Services GmbH.
  • the reactor tank on a bottle wall in particular on the wall opposite the sensors (sensor patch or electrochemical sensors), has a passage and / or a connection in the area near the ground for the attachment of a sampling system.
  • feedthroughs and / or inserts include standardized Ingold nozzle or PG 13.5 threaded nozzles.
  • a suitable sampling system is z. B. described in DE102008033286 AI.
  • the mixing within the reactor tank according to the invention is carried out by a periodically reversing rotation of the reactor tank, which causes in combination with the polygonal shape of the plastic bottle inwardly directed wavy currents to the surface of the reactor contents.
  • WO2010 / 127689 is integrated by reference.
  • All other elements which are required for operating a reactor, in particular for cultivating cells and / or microorganisms, in particular a drive unit for generating the periodically direction-changing rotation of the reactor tank and optoelctronic sensor system for reading the Sensorpatche be provided by a periphery and are reusable.
  • Reactor which usually represents a coherent unit in the prior art, is thus preferably divided in the present case into separate parts, which are designed according to their functions.
  • a further element of the reactor according to the invention is therefore the periphery.
  • a reactor tank storage periphery is used as the periphery, which has one or more reactor deposits, wherein the reactor tank and the reactor tank aging are adapted to one another as separate parts of an overall system in such a way that the reactor tank into the reactor tank Reactor tank holder introduced or in particular can be trapped there and is supported by this in the liquid-filled state.
  • the reactor tank receiving periphery for accommodating a reactor tank according to the invention is a further element of the reactor according to the invention and comprises at least:
  • One or more Reaktortankhaiterept for receiving in each case a reactor tank comprising a matched on the Reaktorlank footprint and one or more lateral fastening elements.
  • the eaves on k ha 11 eru n g an adjusting plate and lateral lemmarme or surfaces on.
  • Reactor Tank Holdings is a drive unit for performing a periodically reversing rotation, such as Z.
  • B is a stepper motor.
  • a stepper motor without gears with direct coupling of the motor and the drive is used.
  • the reactor tank can be displaced about its stationary, vertical axis in a periodically inclined rotating rotation, so that a direct coupling of the drive unit to the reactor tank itself is not required.
  • a stepper motor without gear is used for the realization of the reactor movement.
  • the drive unit is controllable by means of a control unit.
  • the controller is part of the drive unit.
  • the data transmission is conducted via differential, serial
  • the optoelectronic sensor system has the differential, serial interface for symmetrical signal transmission type EIA485 / RS485 due to the robust data transmission and a high Toieran / against electromagnetic interference.
  • a stepper motor without a gearbox with direct coupling of the motor and the drive has been identified as particularly advantageous, because this allows a particularly trouble-free data transmission.
  • FIG. 11 shows a particular embodiment of the reactor including the reactor tank receiving periphery.
  • the footprint adapted to the reactor is replaceable or adaptable, so that the reactor frame can be used with reactors of different sizes.
  • the present invention also provides for the use of the inventive reactor and reactor tanks and a method for cultivating cells and / or microorganisms.
  • a ratio of liquid level to reactor tank width of preferably 0.05 to 2 and more preferably 0.1 to 1 is present in the reactor tank, wherein the liquid level may change as a result of replenishment with the growth of the cells.
  • a capacitive sensor for level control is used by the lid or on one of the container walls.
  • the reactor tank is moved at an angular amplitude ⁇ in the range of 2 ° ⁇ jaj ⁇ 3600 °, preferably 20 ° ⁇ jaj ⁇ 180 °, particularly preferably 45 ° ⁇ jaj ⁇ 90 ° in a rotationally oscillating manner Deviation of ⁇ 5 ° may be present.
  • jaj 60 ° is considered to be very particularly preferred when using particularly low-shear surface-treated bioreactors. In total, the oscillating motion thus covers an angle of 2 jaj.
  • Figure 1 shows schematically the lateral longitudinal section of a preferred embodiment of the reactor tank according to the invention and reactor tank holder in side view.
  • FIG. 2 shows a schematic view of a plug-type thermoplastic construction from above.
  • Figure 3 shows a schematic section of a Stop fen- Silikonaus guide with hose nozzles (135) secured with cap sleeve (120) and O-ring seal (140).
  • FIG. 4 shows schematically in front view a section through a plug Siiikonausmentation attached with cap sleeve (120) and sealed by means of sealing lip (140b).
  • FIG. 5 shows a schematic front view of a section through a screwable plastic cover with hose nozzles (135).
  • Fig. 7 shows schematically in plan view a straight tube separator with a straight head.
  • Fig. 9 shows schematically the experimental set-up together with lines, wherein a reactor is shown by way of example with a statically fixed in the lid straight tube separator with conical head.
  • 10 shows the schematic structure of an automated lid sampling element with a sample suction line (1110) passing through the lid, which via Y-pieces (1170) with a sample line (1120) to an automation platform (1190) for fully automated
  • Removal and plug-flow transport of liquids is connected as well as to other lines for air supply and ETOH cleaning or sterilization (1210).
  • FIG. 11 shows in particular the guidance of the rector tank of the reactor receiving tank periphery.
  • Fig. 13 shows comparative experiments to other sedimentation. Reference / calibrate:
  • the container had rounded edges ( Figures 6 and 7); however, this hardly affected the characteristics of the system.
  • the drive was carried out with a stepper motor, which acted directly on the bottle holder (Fig. 11).
  • a cell separator 300 was installed in the container 100 to operate the bioreactor as a perfusion system ( Figure 9).
  • the suction tube 340 has been firmly integrated into the cover 120b and therefore followed the periodically direction-alternating rotary motion (also called oscillation movement) about the fixed axis 101 of the bioreactor (co-rotating embodiment).
  • the suction tube 340 was alternatively mounted on a tripod; in these experiments, the cell separator 300 was then used statically.
  • the separator tube 310 protruded into the suspension in the container (fill level 390> ground clearance s, 380).
  • the suspension was sucked from below into the separator volume V A of the separator tube 310 by means of a peristaltic pump (peristaltic pump from Watsen & Marlow) connected to the harvesting current collector 320.
  • a peristaltic pump peripheral pump from Watsen & Marlow
  • the suspension rose and was clarified by sedimentation of the lines / particles (vertical precipitation). The particles fell back against the flow direction out of the separator volume into the culture volume VK (FIG. 7).
  • the clarified solution was collected from the crop stream collector 320 of the separator tube 310 and discharged through the suction tube 340.
  • the surface A of the separator tube corresponds to its Kreisförmi en cross section and is according to Eq. III calculated.
  • the particle ytem PAN-X (polyacrylonitrile, spherical particles from Dralon GmbH) was used as the model particle for the investigation of the separation efficiency of the reactor bottle according to the invention with integrated cell enabels in cell culture.
  • the particle size distribution and the particle sinking rate were compared since these are the determining factors for the sedimentation.
  • the particle size distribution was determined by the laser diffraction method (Mastersizer 2000, measured according to the instruction manual). The application of the results is carried out as a particle volume in%, based on the total volume, as a function of the particle size in ⁇ .
  • the modal value XM OÜ indicates which particle size is most frequently represented by volume and was about 21 ⁇ .
  • the rate of descent was analyzed by means of a sedimentation balance.
  • a suspension was prepared which has the same concentration as that used in the experiment.
  • a temperature of 20 ° C was chosen.
  • Sinking rates v s measured from these experimental conditions, from 0.129 m / h to 0.137 mh, were determined on different PAN-X batches and correspond to the conditions of non-obstructed sedimentation.
  • C HO cells have a sedimentation rate of 0.0145 m / h [Searles J A, Todd P, Kompala D S, Biotechnol Prog (1994) 10: 198-206] and are relatively slow-sedimenting cells.
  • the hybridoma cell line AB2-143.2 has a sedimentation rate of 0.029 m / h [Wang Z, Belovich J M (2010) Biotechnol Prog 26 (5): 1361-1366].
  • the results showed the clear advantage of the conical harvest current collector.
  • the retention performance of this separator was surprisingly almost constant at separator lengths 1 of 90 to 143 mm in the entire examination area. In harvest crop collectors with sudden expansion, the separation efficiency increased with increasing separator lengths 1 from 90 to 170 mm, but without fully achieving the performance of the conical cross-sectional constriction.
  • the Klär perennial insect v of Ab s cheiderrohre s corresponds to the speed of the vertically rising medium and has according to Eq. IV direct influence on the Partikei Wegiens.
  • FIG. 13 A comparison of the performance of various separation systems is shown in FIG. 13 in the form of retention levels R over the treatment surface load.
  • the test results prove a nearly equivalent retention performance of all separators over the entire areas of the examined Kiär vombelastung of 0.025 to 0.2 m / h with slight Vortei len for the cube.

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Abstract

Gegenstand der Anmeldung ist ein als Einwegelement ausgeführter Reaktortank mit Deckel und / oder im Innenraum befestigte opto-elektronisch lesbare Sensorpatche, ein Reaktor umfassend den Reaktortank und eine Reaktortanlcaufnahmeperipherie, ihrerseits umfassend eine Reaktortanlthalterung und ggf. ein opto-elektronisches Messsystem zum Ablesen von Sensorpatchen, wobei die Reaktortankhalterung an eine Antrieb seinheit zur Erzeugung einer rotatorisch- oszillierenden Bewegung des Reaktortanks um eigene mittlere vertikale Achse gekoppelt ist, sowie die Verwendung dieser Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen und/oder Mikroorganismen.

Description

Einweg-Fiasefaeiireaktortank
Gegenstand der Anmeldung ist ein als Einwegelement ausgeführter Reaktortank mit Deckel und / oder im Innenraum befestigte opto-elektronisch lesbare Sensorpatche, ein Reaktor umfassen den Reaktortank und eine Realrtortankaumahmeperipherie umfassend eine R ea kt ortan k ha I teru n und ggf. ein opto-elektronisches Messsystem zum Ablesen der Sensorpatche, wobei die Reaktortankhaiterung an eine Antriebseinheit zur Erzeugung einer rotatorisch-oszilli er enden Bewegung des Reaktortanks um eigene mittlere vertikale Achse gekoppelt ist, sowie die Verwendung dieser Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen und/oder Mikroorganismen.
Bei der stark regulierten pharmazeutischen Produktion entfällt ein großer zeitlicher, technischer und personeller Aufwand auf die Bereitstellung gereinigter und sterilisierter Bioreaktoren. Um Kreuzkontaminationen bei einem Produkt Wechsel, in einer Muiti-Purpose-Aniage oder zwischen zwei Produktchargen sicher zu vermeiden, wird außer der Reinigung eine sehr aufwändige Reinigungsvalidierung benötigt, welche bei einer Prozessadaption ggf. wiederholt werden muss.
Dies gilt sowohl fiir das Upstream-Processing USP, d.h. die Herstellung biologischer Produkte in Fermentern als auch für das Downstream-Processing DSP, d. h . die Aufreinigung der Fermentationsprodukte.
Im USP und DSP kommen dabei häufig Kessel als Rühr- und Reaktions Systeme zum Einsatz. Gerade bei der Fermentation ist eine keimfreie Umgebung für eine ertolgreiclic Kultivierung essentiell. Zur Sterilisation von Batch- oder Fed-Batch-Fermentem kommt in der Regel die SIP -Technik zum Einsatz (SIP = steam-in-place). Um bei kontinuierlicher Prozessführung eine ausreichende Langzeitsterilität zu gewährleisten wird auch die Autoklaviertechnik genutzt, die allerdings einen umständlichen Transport der Reaktoren /um Autoklaven erfordert und nur in vergleichsweise kleinen Reaktormaßstäben anwendbar ist. Die Gefahr der Kontamination während der Fermentation ist besonders kritisch bei der Probenahme und an bewegten Rührerwellen. Letztere sind in der Regel mit aufwändigen Dichtungssystemen (z.B. : Gleitringdichtungen) ausgestattet. Technologien, die ohne solche Durchdringungen der Fermentationshülle auskommen, werden wegen ihrer größeren Prozessrobustheit bevorzugt.
Der durch die Bereitsteilungsprozeduren bedingte Nutzungsaus fall der Standardreaktoren kann insbesondere bei kurzen Nutzungsperioden und häufigem Produktwechsel in der Größenordnung der R ea kt or ver tu gbark ei t liegen. Betroffen sind im USP der biotechnologischen Produktion z.B. die Prozessschritte der Medienherstellung und Fermentation und im DS das Solubilisieren, Einfrieren, Auftauen, pH-Adjustieren, Fällen, Kristallisieren, das Umpuffern und die Virusinaktivierung. Um der Forderung an ein schnelles und flexibles Neubeschicken der Produktionsanlage unter Wahrung maximaler Sauberkeit und Sterilität gerecht zu werden, erfreuen sich auf dem Markt Konzepte für Einwegreaktoren eines ständig wachsenden Interesses. In WO2007/121958A1 und WO2010/127689 ist ein solcher Einwegreaktor für die Kultivierung von Zellen und Mikroorganismen beschrieben. Er besteht in einer bevorzugten Ausführungsform aus einem stabilen, vorzugsweise mehrlagigen Polymerwerkstoffbeutel. Der verformbare Einwegreaktor wird von einem Behälter aufgenommen, der ihn stützt. Dabei wird er bevorzugt von vorne in den Behälter eingeführt. Der Behälter ist mit einer Antriebseinheit verbunden. Durch die Antriebseinheit wird der Behälter inklusive des Einwegreaktors in eine rotatorisch-osziliierende Bewegung um eine ortsfeste, vorzugsweise vertikale Achse des Behälters versetzt. Durch eine eckige Ausführungsform des Einwegreaktors und/oder Einbauten im Einwegreaktor kann bei der oszillatorisch rotierenden Bewegung ein hoher Leistungs eintrag in den Reaktorinhalt erreicht werden, so dass der Einwegreaktor als oberflächenbegaster Fermenter zur Kultivierung von Zellen und Mikroorganismen eingesetzt werden kann. Die Einbauten zur Versorgung und Überwachung des Reaktors werden seitlich am Boden des Reaktors über eine Anschlussplatte angebracht. Diese Reaktoren werden überwiegend bei Reaktorvolumen von mehr als 10 L eingesetzt.
Für kleinere Reaktorvolumen ist die Produktion eines Reaktorbeutels samt passendem Behälter zu aufwändig.
Die Herausforderung liegt in kleinen Einwegreaktoren darin, die Sensorik, die Mischtechnik, die Temperierung und Versorgung des Reaktors in einer möglich kompakten und kostengünstigen Form zu erreichen.
Kleine gerührte Einwegreaktoren sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Sartorius Stedim Biotech bietet mit ihrem Univers el® SU (http://www.sart orius- stedim.com/Biotechnology/Fermentation_Technologies/Reusable_Bioreactors/Data Sheets/Data_ UniVessel_SU_SBI2033-e.pdf) einen gerührten Einwegreaktor, bei dem der Reaktortank zylindrisch ist. Der Einwegreaktor verfügt für das Durchmischen über einen Rührer und für die Gasversorgung von unten über einen I. -Sparger unter dem Rührer. Über dem Deckel wird der Antrieb des Rührers über eine von oben getriebene Antriebsachse, die Sensorik (Temperatur, pH (ehem.), Sauerstoff (ehem.)), die Gasver- und Gasentsorgung für den Gasraum, sowie weitere Versorgung sowie Probeentnahme über Leitungen gewährleistet. Der Deckel wird mittels Clamp- Verbindung an den Reaktortank befestigt und per O-Ring gegen den Reaktortank steril abgedichtet. Der Rührerantrieb wird mit 2 Lippendichtungen abgedichtet. Die Sensorik für die Überwachung von H und Sauerstoffgehalt kann auch mittels optoelektronischen Sensorpatche am Boden des Reaktortanks erreicht werden. Für den Betrieb wird der Reaktortank in einem speziellen Behälter fest positioniert, wobei dieser Behälter über einen Halterungsring und einen Fuß mit einem optoelektronischen Sensorsystem zum Ablesen der Sensorpatche verfügt.
Der Nachteil dieses bzw. ähnlicher im Markt verfügbarer Reaktorsysteme liegt darin, dass diese gerührten Systeme bewegte Einbauten sowie ein aufwändiges, steriles Dichtungssystem im Deckel erfordern und infolge der hohen Scherkräfte für die Kultivierung von sehr empfindlichen Zellen, wie z.B. Stammzellen, wenig geeignet sind.
Es stellt sich ausgehend vom Stand der Technik die Aufgabe, ein scherarmes System zur Durchführung von Prozessen mit hohen Anforderungen an Reinheit und Sterilität bereitzustellen, das den zeitlichen, technischen und personellen Aufwand auf die Bereitstellung gereinigter und sterilisierter Komponenten reduziert. Das System soll für Pi zessvolumina von 10 mL bis 20 I insbesondere 50 mL bis 10 L und besonders bevorzugt 250 mL bis 3 L Arbeitsvolumen verwendbar sein. Es soll den hohen Anforderungen der pharmazeutischen Industrie gerecht werden, einfach und intuitiv handzuhaben und kostengünstig sein. Es soll Sicherheitsrisiken durch das Austreten von Stoffen aus dem Prozessraum auf ein Minimum reduzieren. Es soll eine ausreichende Durchmischung des Reaktorinhalts ermöglichen, für die Kultivierung von Mikroorganismen und Zeilkulturen geeignet sein und hierbei für eine ausreichende Ver- und Entsorgung des Kulturmediums mit flüssigen Nährmedien und insbesondere gasförmigen Stoffen sorgen. Es soll für die Prozessentwicklung ebenso geeignet sein wie für die Herstellung von Zellprodukten, insbklinischer Zeliprodukte wie. Z. B. menschliche oder tierische Körperzellen: Stammzellen, Blutzeilen, Leukozyten wie z. B. natürliche Killerzellen (NK-Zelien), Gewebezellen oder pharmazeutischer Wirkstoffe wie z.B. monoklonale Antikörper, Proteine, Enzyme in Bioreaktoren.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verwendung einer formstabilen, eckigen Kunststoffflasche zur Abgrenzung des Reaktorinnenraums gelöst, wobei die Kunststoffflasche einen Boden, Wände, einen Innenraum und mindestens einen Zugang zum Innenraum aufweist und bevorzugt einen pyramidalen, nach innen gewölbten Boden, einen breiten Hals und/oder einen oder mehrere seitlich im unteren Bereich der Flasche an einer mit Koordinaten definierten Stelle angebrachte Sensorpatche aufweist. .
Erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung einer formstabile eckige Kunststoffflasche als Bioreaktortank für die Kultivierung von Zellen, insbesondere empfindlicher Zellen und auf (Mikro)träger wachsender Zellen wie z.B. Stamm, Blut- oder Gewebezellen, wobei die Kunststoffflasche einen Boden, Wände, einen Innenraum und mindestens einen verschließbaren Zugang zum Innenraum insbesondere einen Flaschenhals aufweist. Üblicherweise sind im Innenraum der Kunststoffflas che an einer oder mehreren Wänden im unteren Bereich, an einer mit Koordinaten definierten Stelle, einen oder mehrere Sensorpatche angebracht. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reaktortank umfassend eine formstabile eckige Kunststoffflasche, die einen Boden, Wände, einen Innenraum und mindestens einen verschließbaren Zugang zum Innenraum aufweist, umfassend mindestens einen Flaschenhals insb. verschließbar durch einen Deckel und/oder mindestens eine Durchführung, wobei im Innenraum, an einem oder mehreren Wänden im unteren Bereich der Kunststoffflasche, an einer mit Koordinaten definierten Stelle, ein oder mehrere Sensorpatche angebracht sind. Vorzugsweise werden Durchführungen im Deckel untergebracht.
Im Markt sind trägerfixierte, aus fluoreszierenden Farbschichten aufgebaute Sensorpatche verfügbar (z.B. Fa. Presens, Fa. YSI), die z.B. auf Flaschenwand aufgeklebt werden können. Üblicherweise werden mindestens einen pH-Sensorpatch und einen Sauerstoff-S ensorpatch verwendet.
Alternativ weist der Reaktortank bzw. ioreaktor an einer Flaschenwand oder in dem Deckel, bevorzugt in dem Deckel, Durchführungen für elektrochemische Sensoren, bevorzugt
Einwegsensoren z.B. nach US 20120067724 AI, auf.
Damit der Reaktor die Sterilitätsanforderungen der pharmazeutischen Industrie erfüllen kann, wird die Kunststoffflasche üblicherweise aus einem gamma-sterilisierbaren Kunststoffmaterial hergestellt. Der erfindungsgemäße Reaktortank ist vorzugsweise aus einem ein- oder mehrlagigen durchsichtigen Polymermaterial ausgeführt, dass Einblick in den Reaktortank während des Betriebs ermöglicht.
Kunststoffe oder Glas sind ein vergleichsweise kostengünstige Materialien, das sich auch vergleichsweise kostengünstig verarbeiten lassen. Die Entsorgung des gebrauchten Reaktortanks und die Verwendung eines neuen Einwegreaktortanks sind damit wirtschaftlicher als die Reinigung von gebrauchten Reaktortanken, insbesondere da bei der Verwendung eines neuen Einwegreaktortanks eine aufwändige Reinigung und Reinigungsvalidierung entfällt. Der erfindungs gemäße Reaktortank wird im Reinraum hergestellt oder gereinigt und ist vorzugsweise steril verpackt. Der erfindungsgemäße Reaktortank ist formstabil. Als Materialien oder Materialkombination für den erfindungsgemäßen Reaktortank eignen sich alle zellbiologisch kompatiblen, dem Fachmann bekannte Materialien, insbesondere Glas, Polyethylen, Polypropylen, Polyetherketon (Peek), PVC, Polyethylenterephthalat und Polycarbonat. Wandstärken von 0,lmm-5mm werden bevorzugt und von 0.5 - 2mm besonders bevorzugt.
Die Flaschenmaterialien werden üblicherweise mittels aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren des Streckblas ens in der gewünschten Form gebracht. Der Querschnitt des Reaktortanks bzw. der Kunststoffflasche weist vorzugsweise die Form eines n- Ecks mit n im Bereich von 3 bis 12 auf, bevorzugt im Bereich von 3 bis 6, ganz besonders bevorzugt im Bereich 3 bis 4, am meisten bevorzugt ist n gleich 4.
Vorzugsweise sind die Seitenwände des erfindungsgemäßen Reaktortanks bzw. der Kunststoffflasche zumindest teilweise als ebene Flächen ausgebildet, die in einem Winkel von 45° bis 120° aufeinandertreffen. Bevorzugt bilden die Seitenwände des Reaktors einen Polyeder, wobei der Flaschenhals auf einer der Fläche angebracht ist.
Bevorzugt ist der Reaktortank bzw. die Kunststoffflasche quaderförmig mit Kantenlängen H, b und c, wobei H die Höhe, b die Breite und c die Tiefe der Kunststoffflasche darstellen und b < c < H. Der breite Hals ist typischerweise auf einer der kleinen Flächen angebracht und die dieser gegenüberliegenden Fläche dient als Boden des Reaktortanks. Der erfindungsgemäße Reaktortank bzw. die Kunststoffflasche weisen ein Verhältnis von Flaschenhöhe H zur maximalen Breite b und Tiefe c im Bereich von 0,5 bis 4, bevorzugt 1 bis 3, besonders bevorzugt 1.5 bis 2.5 auf. In der bevorzugten Aus führungs form weist der Reaktor t an k e i n e qu a dra t i s c h e Flaschenquerschnittkantenlänge a=c=D auf.
Für eine bessere Durchmischung des Reaktors und ein verringertes Startvolumen weist der Reaktortank bzw. die Kunststoffflasche üblicherweise einen nach innen gewölbten Boden auf. Für die Gestaltung des Bodens wird die Lehre aus WO2010/127689 per Referenz integriert. Der Boden weist insbesondere die Form eines nach innen gerichteten Tetraeders, einer nach innen gerichteten Pyramide, die Form eines Paraboloids oder eine Glockenform auf— Besonders bevorzugt ist der Boden pyramidal ausgeführt. Die Höhe hw der Wölbung liegt im Bereich des 0,01 -fachen bis 1 -fachen des kreisäquivalenten Durchmessers Dt des Bodenquerschnitts. Bevorzugt liegt die Höhe hw der Wölbung zum kreisäquivalenten Durchmesser Dt im Bereich von 3 % bis 100%, besonders bevorzugt im Bereich von 5% bis 30% und ganz besonders bevorzugt im Bereich von 10%o bis 20%. Der erfindungsgemäße Reaktortank kann über seine Außenwände beheizt und/oder gekühlt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird auf der Außenseite des Bodens der Kunststoffflasche bzw. des Reaktortanks eine Einweg-Heizmatte aufgebracht, mit der wegen der formschlüssigen Verbindung von Heiz- und Mantelfläche ein sehr effizienter Wärmetransport erreicht werden kann. Auf diese Weise kann die Heizfläche auf die Boden fläche reduziert werden. .Dazu wird diese Heizmatte üblicherweise auf die Außenseite des Bodens aufgeklebt. In der Regel bedarf der Reaktortank keiner zusätzlichen Kühlung, da ein Ausschalten der Heizmatte bei Reaktoren mit kleinem Volumen und somit großer spezifischer Wärmeaustauschfläche eine ausreichend schnelle Abkühlung herbeiführt. Eine zusätzliche Kühlung wäre z.B. bei microbiellen Anwendungen bei niedrigerer Fermentationstemperatur und höhere Respirationswärme durch Anbringung von Peltierelementen auf den Seitenflächen des Reaktortanks oder des Tankhalters im Bedarfsfall anwendbar.
Der erfindungsgemäße Reaktortank stellt vorzugsweise einen nach außen abdichtbaren Raum für die Durchführung von chemischen, biologischen, biochemischen und/oder physikalischen Prozessen dar. Insbesondere dient der Reaktortank der Bereitstellung eines sterilen Raumes zur Kultivierung von Zellen und/oder Mikroorganismen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reaktortanks wird hierfür der Flaschenhals des Reaktortanks mittels eines Deckels dicht verschlossen, wobei der Deckel mindestens über Durchführungen und / oder Anschlüsse für die Gas- und Flüssigkeitsversorgung und -abfuhr des Reaktortanks verfügt. Erfindungsgemäß weist der Deckel keine Durchführung für eine Antriebsachse auf [Fig. 2-5]. Der Deckel ist ein weiteres Element des erfindungsgemäßen Reaktortanks. Vorzugsweise werden die angeschlossenen Gasleitungen mit Sterilfiltern ausgestattet, wobei der Sterilfilter der Abgasleitung vorzugsweise mit einer Heizmatte ausgestattet ist, um Kondensat von den Fiiterflächen fernzuhalten. Alternativ kann das Abgas zur Kondensatvermeidung am Filter mit ei nen Abgaskühler , der z.B. über ein elektronisches Kühlelement (z.B. ein Peltiereiement), das auf einer aus Folienmaterialien hergestellten Wärmeübertragungsfläche aufgebracht ist, auf einen niedrigeren Taupunkt (Kondensationstemperatur < Umgebungstemp eratur) heruntergekühlt werden
Weiterhin kann der Deckel nach Bedarf weitere Durchführungen und / oder Anschlüsse für Elemente aus der Gruppe umfassend:
einen oder mehrere elektronische, optoelektronische oder elektrochemis che Sensoren, insbesondere einwegelektrochemische Sensoren aus US 2012/0067724 AI oder PT100
Widerständes ensor zur Temperaturkontrolle und / oder kapazitive Sensoren zur Füllstandskontrolle oder zur Zelldichtemessung,
- einen internen Zellabscheider und / oder
ein Prob ennahmesystem
aufweisen. Der Reaktortank ist entsprechend je nach Anwendung m it ei nem oder mehreren dieser Elemente ausgestattet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung setzt sich der Deckel aus einem Stopfen und einer Überwurfhülse zusammen. Der Stopfen wird üblicherweise aus Kunststoff ausgewählt aus der Gruppe der Polyetheretherketone, Thermoplast oder Silikon hergestellt. Üblicherweise ist der Stopfen als Einweg-Stopfen, in einer besonderen Aus führungs form auch wiederverwendbar ausgeführt.
Bevorzugt wird der Stopfen in den Hals des Reaktors zur Schließung eingeführt, mittels einer auf dem Umfang angebrachten O-Ringdichtung gegen die innere Seite des Flaschenhals gedichtet und mit einer separaten Arretiermittel wie z. B. eine verschraubbare Üb erwurfmutter an das Gewinde des Flaschenhals angeschraubt oder mit einem Klemmring verklemmt. Alternativ kann der in den Flaschenhals eingeführte Stopfen mittels einer auf der Flaschenöffnung aufgelegten Dichtlippe abgedichtet und mit einer separaten verschraubbaren Überwurfhülse verklemmt und an der Kunststoffflasche angeschraubt werden. Eine weitere Alternative ist ein Deckel, der die identischen Durchführungen wie der Stopfen enthält, welcher an der Kunststoffflasche angeschraubt wird und mit einem O-Ring gegen die Flaschenhals und/oder die Flaschenöffnung abgedichtet wird. Bevorzugt wird der in den Flaschenhals gesteckte Stopfen verwendet, weicher mit O-Ringdichtung am Flaschenhals gedichtet und mit einer separaten verschraubbaren Überwurfmutter an der Kunststoffflasche festgeschraubt wird [Fig. 2]. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass der O-Ring mechanisch gering beansprucht wird und keine Verdrillung der Schlauchleitung auftritt, wie es bei dem Drehen eines Deckeis der Fall wäre.
Der Reaktortank samt Deckel ist vorzugsweise als Einwegelement ausgeführt, d.h. es ist vorzugsweise vorgesehen, den kompletten Reaktortank nach der Verwendung nicht zu reinigen, sondern zu entsorgen. Daher umfasst der Reaktortank vorzugsweise nur die wesentlichen Elemente, die zur Bereitstellung eines sterilen Reaktionsraumes notwendig sind:
Die Kunststoffflasche wird üblicherweise als Einwegartikel produziert und verwendet. Für die Kultivierung empfindlicher Zellen bzw. Herstellung von klinischen Zellprodukten erfolgt die Begasung vorzugsweise ausschließlich über die Oberfläche. In diesem Fall weist der Deckel keine Durchführung für ein Blasenbegasungseiement auf und der erfindungsgemäße Reaktortank weist keine Einbauten f r die Blasenbegasung auf. Für Anwendungen im Rahmen der Prozessentwickiung mit dem Fokus der Maßstabsübertragung auf Großfermenter, für Perfusionsverfahren mit hohen Zeildichten oder für mikrobielie Prozesse kann ein Einbau für eine zusätzliche Mikro- oder Macrobegasung ( z.B. mit Schlauchleitungen von oben über den Deckel versorgte und an eine Behälterwand angeklebte Sinterkörper ) vorgesehen werden. Bevorzugter Weise las st sich der erfindungsgemäßen Reaktor vollständig aus preiswerten Elementen herstellen und ermöglicht hiermit die Verwendung des Reaktors als Einwegsystem. Alternativ werden alle hochwertigen Elemente in einen wiederverwendbaren Deckel integriert und der lediglich der Reaktortank wird als Einwegeiement verwendet.
In einer besonderen Ausfuhrungsform des Reaktors wird zur Zeilrückhaltung ein Zellabscheider in dem Reaktortank verwendet. Erfindungsgemäß wird der interne Zellabscheider gebildet durch ein zentrales vertikales Abscheiderrohr und einen Abscheiderkopf mit einem Sammler zum Absaugen von Zellen befreiter Kulturlösung, wobei der Deckel eine Durchführung für den Sammler aufweist und der Zellabscheider am Deckel entweder drehbar gelagert oder statisch befestigt ist. Das Rohr und der Abscheiderkopf können unterschiedlichen Längen, Geometrie (konisch und gerade) und Durchmessern sowie diversen Rohreinbauten (Kegel- und Ringeinbauten, Gleichrichter aufweisen. Besondere Aus führungs formen sind in Fig. 6 bis 8 dargestellt. Der Zellabscheider kann aus Stahl, Glas oder Kunststoff hergestellt sein. Vorzugsweise wird er aus Kunststoff wie z. B. Polyethylen, Polypropylen. Polyethylenterephthalat, Polyetherketon und/oder Polycarbonat hergestellt und als Einwegelement verwendet.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein interner vertikaler Zellabscheider für Bioreaktoren, gebildet durch ein zentrales vertikales Abscheiderrohr und einen Abscheiderkopf mit einem Sammler zum Absaugen von zellenbefreiten Medium, wobei der Zellabscheider am einem Deckel für einen Reaktortank befestigt oder drehbar gelagert ist und der Deckel eine Durchf hrung für den Sammler aufweist.
Wird ein Zellabscheider verwendet, weist der Reaktortank üblicherweise einen breiten Hals auf, damit der vorgefertigten an den Deckel befestigten Zellabscheider durch den Flaschenhals eingeführt werden kann. Ist der Zellabscheider bewegbar an den Deckel befestigt (=drehbar gelagert), wird er von der Drehbewegung des Reaktortanks aufgrund seiner Massenträgheit nur minimal beeinflusst. Dadurch lassen sich die vom Abscheider in den Sedimentationsraum übertragenen und den S edimentations Vorgang störenden Umwälzströmungen vermeiden, und die Rückhaltung erheblich verbessern, wie in Fig. 10 gezeigt.
Der Zellabscheider wird bevorzugt so konzipiert, dass Innen- und Außenbereich des Zellabscheiders durch entsprechende Verengungen weitgehend voneinander getrennt sind. Auf diese Weise soll eine Übertragung der die Sedimentation störenden Strömungen aus dem gut durchmischten Außenraum in die S edimentations zone vermindert werden. M it anderen Worten soll das Innenvolumen des Zellabscheiders von Strömungen im Außenvolumen (=Kulturvolumen) so wenig wie möglich beeinflusst werden, wobei jedoch ein Rücktransport des zurückgehaltenen Zeilen in den durchmischten, versorgten Reaktorbereich gewährleistet bleiben muss
Bevorzugt weist der interne Zellabscheider für einen Reaktortank mit den Dimensionen Querschnittkantenlänge D=120 mm, H=235 mm ein Abscheiderrohr (310) mit einer Abs cheider länge 1 (370) von 40 mm bis 200 mm, insbesondere von 90 bis 190 mm, bevorzugt 190 mm auf (Fig. 6 und 7). den ereil wird ein Verhältnis l H von 0,2 bis 0,9, bevorzugt 0,5 bis 0,9 insbesondere 0,8 verwendet.
Das Abscheiderrohr weist einen runden Querschnitt mit einem Rohrdurchmesser d (350) auf, wobei das Verhältnis von Rohrdurchmesser d zum Flas chenquers chnittkantenlänge D üblicherweise von 0,25 bis 0,90 insbesondere von 0,5 bis 0,85, bevorzugt 0,83 beträgt. Der Rohrdurchmesser d ist für die Zellrückhaltung wesentlich zur Realisierung der Abscheiderfläche.
Es wird bevorzugt, den Flaschenhals- und die Zeliabscheiderquerschnitte so auszuwählen, dass der Zellabscheider mühelos in die Flasche eingeführt werden kann. Dies ist insbesondere dann notwendig, wenn ein wiederverwendbarer, autoklavierbarer Deckel verwendet werden soll, der unter der Cleanbench mit dem γ-steriliserten Reaktortank verbunden werden soll.
In einer ersten Aus führungs form des Bioreaktors erfolgt die Begasung ausschließlich über die Oberfläche (Fig. 6 und 7). Hierfür wird der Rohrdurchmesser d (350) des Abscheiders so ausgewählt, dass ein Verhältnis von über die Oberflächen begasten Kuiturvoiumen VK definiert durch Formel (I) und Abscheidervolumen VA definiert durch Formel (II) von 0.01 bis 1 0 bevorzugt von 0.2 bis 2 vorhanden ist.
VK = D2 * L - -d2 {L - S) (I)
VA = ~ d2 l (II)
Weitere Parameter des Zellabscheiders sind die Abscheidefläche (=Klärfläche) A definiert als A =—d (III) sowie die Klärflächenbelastung v=q/A, wobei q der Erntestrom ist. Am Abscheiderkopf befindet sich der Sammler (320) zum Absaugen von zellenfreier Kulturlösung. Üblicherweise beträgt das Verhältnis dv/d des Sammlerdurchmessers dv (360) zum Rohrdurchmesser d 0, 1 bis 0,7 bevorzugt 0.3-0.5 auf
Vorzugsweise weist der Sammler (320) eine konische Form auf. Diese Form hat den Vorteil, dass ehr Platz für die Einführung von weiteren Elementen (Sensoren, Probenaufhahmeleitung, usw.) über den Deckel verfügbar ist. Ebenfalls wird die Begasung* läche geringfügiger reduziert. Vorzugsweise wird der Abscheider im Reaktortank mit einem Verhältnis 1/s von der Abscheiderlänge 1 zum Bodenabstand s des Abscheiderohres von 0,75 bis 9 verwendet.
Auf Einbauten in das Abscheiderrohr und Sammler (320) wird im Zellenabscheider bevorzugt verzichtet.
In hydrodynamis chen Untersuchungen mit dem Modelpartikel PAN-X wurde ein an den Deckel statisch eingebautes Rohr mit unterschiedlichen Rohrlängen, Geometrie (konischer / gerader Kopf) und Durchmessern sowie diversen Rohreinbauten (Kegel- und Ringeinbauten, Gleichrichter usw.) untersucht. Nach den bisher vorliegenden Experimenten weist der statisch eingebaute (=mitdrehende) , interne Zellabscheider für Feststoffe im Bereich der Klärflächenbelastung v von 0,025 < v [m/h] < 0,2 bei einem Leistungs eintrag P/VK von 3 W/m3 einen vergleichbaren Rückhaltegrad wie statische externe Systeme auf (z.B. Plattenabs cheider, Dortmundbrunnen) auf (Fig. 13). Insbesondere ist der erfindungsgemäße Zellenabscheider für die Kultur von gut sedimentierbaren Partikeln, wie z. B. Träger-fix ierten Zellen anwendbar, die je nach Sinkgeschwindigkeit der
Trägermateriaiien in erheblich höheren Leistungseintragsbereichen P/VK von > >3W/m3 einsetzbar ist.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist der erfindungsgemäße Reaktor außerdem ein automatisches Probennahmeeiement auf.
In einer ersten Ausführungsform besteht das Probennahmeeiement aus einer Aufnahmeleitung, die durch den Deckel durchgeführt wird (=Deckelprobennaiimeeiement, siehe Fig 10). Außerhalb des Reaktors kann die Leitung mittels Klammern und Quetschventilen abgesperrt werden. Über ein angrenzendes Y-Stück, erfolgen einerseits die vertikale Ansaugung der Probe aus dem Fermenter mittels Unterdruck und der anschließende Transport zur Probenvorbereitungsstation mittels Überdruck. Dieses Y-förmige Proben entnahmeelement ist fü die Realisierung eines automatischen Probenahmemoduls bestehend aus Schlauchleitungen, Quetschventilen, Sterilfiltern, einer Über- und Unter druckversorgung besonders vorteilhaft. Üblicherweise werden kommerziell verfügbare Leitungen, Ventile und Y-Stücke aus Kunststoff verwendet, so dass das in den Deckel integrierbare Probennahmeeiement als Einwegelement bereitgestellt und eingesetzt wird. Das Grundprinzip des Y- förmige Probenentnahmeelement ist in WO 2007/121887 dargestellt, und wird per Referenz integriert, in dem zwei Büretten angesteuert werden, um den Transport und die Aliquotierung einer Probe zu gewährleisten. Nach der Probenentnahme wird das Probennahmeeiement mit EtOH sterilisiert und getrocknet. Vorzugweise werden Filterelemente für Luft und EtOH eingebaut, um die Kontamination des Probenentnahmenelements zu verhindert. Vorzugsweise wird das Probennahmeeiement mit der BiiyC hromat - lat form zur automatisierten Analyse der Bayer Technology Services GmbH gekoppelt. In einer weiteren Ausführungsform weist der Reaktortank an einer Flaschenwand insbesondere an der den Sensoren (Sensorpatch oder elektrochemische Sensoren) gegenüberliegenden Wand, eine Durchführung und/oder einen Anschluss im bodennahen Bereich für die Anbringung eines Probennahmesystems auf. Beispiele für Durchführungen und oder Einbringungen sind u.a. genormte Ingoldstutzen - oder PG 13,5 -Gewindestutzen. Ein geeignetes Probennahmesystem ist z. B. in DE102008033286 AI beschrieben.
Das Durchmischen innerhalb des erfindungsgemäßen Reaktortanks erfolgt durch eine periodisch richtungswechselnde Rotation des Reaktortanks, die in Kombination mit der eckigen Form der Kunststoffflasche nach innen gerichtete wellenförmige Strömungen an die Oberfläche des Reaktorinhalts verursacht. Für die Gestaltung der Reaktorbewegung wird die Lehre aus WO2010/127689 per Referenz integriert.
Alle übrigen Elemente, die zum Betrieb eines Reaktors, insbesondere zur Kultivierung von Zellen und/oder Mikroorganismen benötigt werden, insbesondere eine Antriebseinheit zur Erzeugung der periodisch richtungs wechselnde Rotation des Reaktortanks und optoelelctronische Sensorsystem zum Ablesen der Sensorpatche werden durch eine Peripherie bereitgestellt und sind wiederwendbar. Der
Reaktor, der im Stand der Technik üblicherweise eine zusammenhängende Einheit darstellt, wird also im vorliegenden Fall vorzugsweise in separate Teile aufgeteilt, die ihren Funktionen gemäß gestaltet sind.
Ein weiteres Element des erfindungsgemäßen Reaktors stellt daher die Peripherie dar. Insbesondere wird als Peripherie eine Reaktortankaumahmeperipherie eingesetzt, die eine oder mehrere Reaktortankhaiterungen aufweist, wobei der Reaktortank und die Reaktortank alterung als separate Teile eines Gesamtsystems dabei so aufeinander angepasst sind, dass der Reaktortank in die Reaktortankhalterung eingebracht bzw. insbesondere dort eingeklemmt werden kann und von dieser im flüssigkeitsgefüllten Zustand gestützt wird.
Die Reaktortankaufnahmeperipherie zur Aufnahme eines er fmdungs gemäß en Reaktortanks ist ein weiteres Element des erfindungsgemäßen Reaktors und umfasst mindestens:
Ein oder mehrere Reaktortankhaiterungen zur Aufnahme jeweils eines Reaktortanks umfassend eine auf dem Reaktorlank angepasste Stellfläche und ein oder mehrere seitliche Befestigungselemente. Beispielsweise weist die R ea k t ort an k ha 11 eru n g eine Stellplatte und seitliche lemmarme bzw. flächen auf. - Verbunden mit dem Reaktortankhaiterungen, insbesondere mit der Stellfläche der
Reaktortankhaiterungen, ist eine Antriebseinheit zur Durchführung einer periodisch richtungs wechs elnde Rotationsb ewegung, wie Z. B ein Schrittmotor. Vorzugsweise wird ein Schrittmotor ohne Getriebe mit direkter Kopplung des Motors und des Antriebes eingesetzt. Durch die Antriebseinheit kann der Reaktortank um seine ortsfeste, vertikale Achse in einer periodisch r i chtungs wechs elnde Rotationsbewegung versetzt werden, so dass eine direkte Koppelung der Antriebseinheit mit dem Reaktortank selbst nicht erforderlich ist. Vorzugsweise wird für die Realisierung der Reaktorbewegung ein Schrittmotor ohne Getriebe verwendet. Eine solche Anordnung besitzt den Vorteil sehr geräuscharm zu sein Vorzugsweise ist die Antrieb seinheit mittels einer Steuereinheit steuerbar. Üblicherweise ist die Steuerung Teil der Antriebeinheit.
- Einem oder mehreren an der Reaktortanichalterung , insbesondere an einem der seitlichen Befestigungselemente installierten opto - elektronis chen Sensorsysteme zum Ablesen der seitlich an einer mit Koordinaten definierten Stelle des Reaktortanks angebrachten Sensorpatche, insbesondere ein pH-Trans mitler und /oder ein Sauerstoffgehalttrans mitter. Durch die direkte Ankopplung der Lichtanregungs- und Detektionseinheiten an die Sensoren lassen sich die
Lichtintensitäten zur Erzeugung auswertbarer Messsignale und somit die Erzeugung von Radikaien erheblich verringern, was einer verlängerten Lebensdauer der Sensorpatche zugutekommt. Erfindungsgemäß erfolgt die Datenübertragung leitungsgebunden über differentielle, serielle
Schnittstellen und / oder leistungsungebunden über Funk wie beispielsweise Bluetooth oder WLAN. Vorzugsweise verfügt das opto- elektronisches Sensorsystem über die differentielle, serielle Schnittstelle zur symmetrischen Signalübertragung Typ EIA485/RS485 aufgrund der robusten Datenübertragung und eine hohe Toieran/ gegenüber elektromagnetischen Störungen. Für eine verbesserte Datenübertragung wurde ein Schrittmotor ohne Getriebe mit direkter Kopplung des Motors und des Antriebes als besonders vorteilhaft identifiziert, weil das eine besonders störungsfreie Datenübertragung ermöglicht.
Fig. 1 1 zeigt eine besondere Aus führungs form des Reaktors samt Reaktortankaufnahmeperipherie.
Bevorzugt ist die auf dem Reaktor angepasst Stellfläche austauschbar bzw. anpassbar, so dass das Reaktorgestell mit Reaktoren verschiedener Größen anwendbar ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des er findungs gemäßen Reaktors und Reaktortanks sowie ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen und/oder Mikroorganismen. Im Reaktortank liegt während des Betriebs ein Verhältnis von Flüssigkeitsspiegel zur Reaktortankbreite von bevorzugt 0.05 bis 2 und besonders bevorzugt 0,1 bis 1 vor, wobei der Flüssigkeitsspiegel sich infolge Nachfütterung mit dem Wachstum der Zellen ändern kann. Außerdem wird der Reaktortank unter Wahrung seiner bevorzugten hydrodynamischen und prozesstechnischen Eigenschaften mit einem ausreichenden Kopfraum zwischen Reaktortankkopf und Flüssigkeitsspiegel (=Füllstand 180, Hi,)von mindestens 5% bis 50 % Flüssigkeitshöhe bevorzugt mindestens 25% Flüssigkeitshöhe betrieben, um bei Schaumbildung einen ausreichenden Abständen zur mit einem Sterilfilter ausgestatteten Gasaus tragsleitung zu gewährleisten. Zur Kontrolle des Füllstands wird üblicherweise durch den Deckel oder an einer der Behälterwände ein kapazitiver Sensor zur Füllstandskontrolle eingesetzt.
Es hat sich überraschend herausgestellt, dass eine vergleichsweise kleine Winkelamplitude für die rotatorisch-oszillierende Bewegung des Reaktors ausreicht, um eine gute Durchmischung und/oder eine hinreichende Intensivierung von Transportprozessen zu erreichen. Insbesondere ist es kaum erforderlich, 3600° -Umdrehungen (das entspricht 10 Umdrehungen) des Reaktors zu realisieren, so dass keine konstruktiv aufwändige Lösungen für die Anbindung des oszillatorisch rotierenden Reaktors an die ruhende Umgebung (z.B. zur Zu- und Abfuhr von Medien und Gasen, von elektrischer Energie und von elektrischen Signalen) erforderlich sind. Bei der er fmdungs gemäß en Verwendung wird der Reaktortank mit einer Winkelamp litude α im Bereich von 2° < jaj < 3600°, bevorzugt 20° < jaj < 180°, besonders bevorzugt 45° < jaj < 90° rotatorisch-oszillierend bewegt, wobei Abweichungen von ±5° vorhanden sein können. Insbesondere gilt jaj = 60° als ganz besonders bevorzugt bei der Verwendung von besonders scherarmen oberflächenbegasten Bioreaktoren. In Summe überstreicht damit die oszillierende Bewegung einen Winkel von 2 jaj.
Versuche haben gezeigt, dass sich bei Erhöhung des Leistungseintrags Bewegungszustände in dem Reaktor einstellen können, bei denen Gasblasen in das Reaktormedium eingetragen werden. Gasblasen werden ab einem Leistungs eintrag von P/VK > 10 W/m3 eingezogen, Für Zellen und/oder Mikroorganismen, die durch eine Blasenbegasung nicht geschädigt werden, kann auf diese Weise eine sehr einfache Steigerung der Gasversorgung realisiert werden. Durch eine zusätzliche Blasenbegasung über ein bevorzugt seitlich im Bodenbereich installiertes Sinterohr kann der Stofftransport erheblich verbessert werden. Die durch die rotatorische Oszillation erzeugte Strömung sorgt für einen schonenden Abriss der Mikroblasen vom Sparger und somit für eine große Phasengrenzfläche a bzw. einen großen Stoffübergangskoeffizient km. Die Erfindung wird nachstehend anhand von Figuren näher erläutert, ohne sie jedoch auf die gezeigten Aus führungs formen zu beschränken.
Beschreibung der Figuren:
Figur 1 zeigt schematisch den seitlichen Längsschnitt einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reaktortanks und Reaktortankhalterung in der Seitenansicht. Figur 2 zeigt eine schematische Ansicht einer Stopfen-Thermoplastausführung von oben.
Figur 3 zeigt ein schematischer Schnitt einer Stop fen- Silikonaus führung mit Schlauchtüllen (135) befestigt mit Überwurfhülse (120) und O-Ring-Dichtung (140).
Figur 4 zeigt schematisch in Vorderansicht einen Schnitt durch eine Stopfen-Siiikonausführung befestigt mit Überwurfhülse (120) und abgedichtet mittels Dichtlippe (140b). Figur 5 zeigt schematisch in Vorderansicht einen Schnitt durch einen verschraubbaren Kunststoffdeckels mit Schlauchtüllen (135).
Fig. 6 zeigt schematisch in Vorderansicht einen geraden Rohrabscheiders mit geraden Kop (= sprunghafter Querschnittsverengung) im Längsschnitt.
Fig. 7 zeigt schematisch in der Draufsicht einen geraden Rohrabscheider mit geradem Kopf.
Fig. 8 zeigt schematisch in der Vorderansicht einen geraden Rohrabscheiders mit geraden Kopf (= sprunghafter Querschnittsverengung) und Strömungsinverter.
Fig. 9 zeigt schematisch den Versuchsaufbau samt Leitungen, wobei ein Reaktor mit einem im Deckel statisch befestigten geraden Rohrabscheider mit konischem Kopf exemplarisch dargestellt ist. Fig. 10 zeigt den schematischen Aufbau eines automatisierten Deckelprobennahmeelements mit einer durch den Deckel durchgeführten Probeeinsaugleitung (1110), die über Y-Stücke (1170) mit einer Probenleitung (1120) an eine Automatisierungsplattform ( 1190) zur vollautomatisierten
Entnahme und zum pfropfenförmigen Transport von Flüssigkeiten angeschlossenen ist sowie an weitere Leitungen für die Luftzufuhr und die ETOH-Reinigung bzw. Sterilisation (1210).
Fig. 11 z e i gt e in e b e s on dere Au s führun g s fo rm de s Re aktortank s s amt Reaktortankaufhahmeperipherie. Fig. 12 zeigt Versuchsergebnisse R = f(P/V) beim Vergleich des statischen und mitrotierenden Abscheiders nach Fig. 6 und 7 und belegt die höchst überraschende Notwendigkeit eines drehbar gelagerten Sedimentationsrohres, das im Gegensatz zur mitbewegten Variante auch bei höheren Leistungs einträgen P/VK > 3 W/m3 eine gute Partikelrückhaltung gewährleistet.
Fig. 13 zeigt Vergleichsversuche zu anderen Sedimentationsabscheidern. Bezugs/eichen:
8, 9 Port (ID 2mm, OD 3mm, Port länge: 15mm)
10 bis 15 Port ( I D 3mm, OD 4mm, Pon länge: 15mm, Port 10 mit beidseitiger Schlauchtülle)
16, 17 PG13,5-Port
18 baugleicher Port zu PC i 1 3.5 mit I D4mm
100 Container
101 Rotationsachsen
110 Flaschenhals
120 Üb erwurfmutter /' Überwurfhülse
120b ver s chraubbar er Deckel
130 Stopfen
1 35 Schlauchtülle
136 Silikonschlauch
140 O-Ring
140b Dicht lippe
140c Dichtung
150 Stutzen
160 Boden
170 Gasverteiler
180 Füllstand HL
185 Flaschenhöhe H
186 Flaschenquerschnitt D
190 Flaschenwand
198 Kulturvolumen VB
200 Gaszufuhr
210 Sterilfilter
220 Gasabfuhr
230 Sterilfilter
240 Medium 250 Stellmittel
260 Harvest
261 PG13,5-Stutzen (Deckeleinbringung) 270 Filterheizung (19Janl2)
280 seitliche Probenahme (19Janl 2) 290 Sensorport (chem.)(19Janl2)
300 Settler/Zellabscheider
310 Abscheiderrohr / -zylinder
320 Sammler / Konus
330 Sammler einbau / Strömungsinverter
331 Öffnung
332 Spalt
333 Sedimentabzug
340 Ablauf / Absaugrohr
350 Rohrdurchmesser d
360 Sammlerdurchmesser dv
370 Abscheiderlänge 1
380 Bodenabstand s
390 Füllstand
395 Abscheidervolumen VA
400 Halter
410 Wärmeleitelement
420 Oszillation
430 Heizmatte
610 pH-Messung
61 1 pH -Spot
620 p02-Messung
621 p02-Spot
630 Temperaturmessung
640 Füllstandmessung
700 Antriebseinheit mit Motor
710 opto-elektronisches Messsysti 20 Schaltschrank
30 Temperaturmessung40 Drehknopf
50 Display
60 Reaktorgestell 00 Probenventil
10 Überwurfmutter
1 1 Dichtung
12 Rohr
21 Rückschlagventil
22 Rückschlagventil
23 Membran
30 Probenleitung
3 1 Probe
50 Spülleitung
51 Steril filier
52 Gas
53 Wasserdampf
60 Probenverteilung
70 Druckleitung
71 Unterdruck
72 Überdruck
80 pH-Messung
81 pH-Sensor
982 Puffer
983 Abfall
990 Koppler (Luer-Lock)
1 100 Deckelprobenahmeelement
1 1 10 Probeeinsaugleitung
1 120 Probeleitung
1130 Klemme
1 140 Flüssigkeitsfilter
1 150 Luftfilter
1 160 Druckminderer
1 170 Y-Stück
1 180 Quetschventile 1190 Automatisierungsplattform zur vo llautomati si erten Entnahme von Flüssigkeiten, Transport, Probenvorbereitung und anschließender Analytik wie z.B. aus der EP- 1439472 A I und der EP-2013328A2 bekannt (BaychroMAT®)
1200 Zufuhr Reinigsungslösung
1210 Luftzufuhr
B spie
Bioreaktorflasche
Als Container 100 diente eine Einweg-Kunststoffflasche mit quadratischem Querschnitt und Querschnittskantenlänge D=120 mm, eine Höhe H=235 mm und einen runden Flaschenhals 110 mit einem Halsquerschnittdurchmesser von 105 mm. Der Container wies abgerundete Kanten auf (Fig. 6 und 7); dies beeinflusste die Charakteristik des Systems jedoch kaum. Der Antrieb erfolgte mit einem Schrittmotor, der direkt auf die Flaschenhalterung einwirkte (Fig. 11).
In den Container 100 wurde ein Zellabscheider 300 eingebaut, um den Bioreaktor als Perfusionssystem zu betreiben (Fig. 9). Der Zellabscheider 300 umfasste ein durch den Deckel 120b durchgeführtes Absaugrohr 340 senkrecht verbunden mit einem zylindrischen Abscheiderrohr 310 mit einem Rohrdurchmesser d (=350) von 70 mm, wob e i der Übergangsbereich zwischen dem Absaugrohr 340 und dem oberen Bereich des Abscheiderrohrs 310 den Erntestromsammler 320 bildete und den nach unten offenen unteren Teil des Abscheiderrohrs 310 das Abscheidervolumen VA bildete (fig. 7).
Um auf bewegte Dichtungen zu verzichten, wurde das Absaugrohr 340 fest in den Deckel 120b integriert und folgte daher der periodisch richtungs wechs elnden Rotationsbewegung (auch Oszillationsbewegung genannt) um die ortsfeste Achse 101 des Bioreaktors (mitdrehende Ausfuhrungsform). Für Vergleichsversuche wurde alternativ der Absaugrohr 340 auf einen Stativ befestigt; in diesen Versuchen wurde dann der Zellabscheider 300 statisch verwendet.
Im Perfusionsbetrieb ragte das Abscheiderrohr 310 in die im Behälter befindliche Suspension (Füllgrad 390 > Bodenabstand s, 380) hinein.
Durch eine am Erntestromsammler 320 angeschlossene Per usionspumpe (Schlauchpumpe von Watsen & Marlow) wurde die Suspension von unten in das Abscheidervolumen VA des Abscheiderrohrs 310 gesaugt. Innerhalb des Abscheiderrohrs 310 stieg die Suspension auf und wurde durch Sedimentation der Zeilen / Partikeln geklärt (Vertikalab s chei dung) . Die Partikel fielen entgegen der Strömungsrichtung unten aus dem Abscheidervolumen heraus in das Kulturvoiumen VK zurück (Fig. 7). Die geklärte Lösung wurde aus dem Erntestromsammler 320 des Abscheiderrohres 310 gesammelt und durch das Absaugrohr 340 abgeführt.
Die lärfläche A des Abscheiderrohres entspricht seinem Kreisförmi en Querschnitt und wird nach Gl. III berechnet. PAN-X Untersuchungen:
Als Modelpartikel für die Untersuchung der Abscheideleistung der erfindungsgemäßen Reaktorflasche mit integrierten Zell enab s cheider bei Zellenkultur wurde das Partikels ytem PAN-X (Polyacrylnitril, sphärische Partikel der Firma Dralon GmbH) verwendet.
Zur Prüfung der Identität der physikalischen Eigenschaften wurden die Partikeigrößenverteilung und die Partikelsinkgeschwindigkeit verglichen, da dies die bestimmenden Faktoren für die Sedimentation sind. Die Bestimmung der Partikelgrößenverteilung erfolgte über das Laserbeugungsverfahren (Mastersizer 2000, nach Bedienungsanleitung gemessen). Die Auftragung der Ergebnisse erfolgt als Partikelvolumen in %, bezogen auf das Gesamtvolumen, als Funktion über der Partikelgröße in μιη. Der Modalwert XMOÜ sagt aus, welche Partikelgröße volumenmäßig am häufigsten vertreten ist und betrug ca. 21 μπι.
Die Analyse der Sinkgeschwindigkeit erfolgte mit Hilfe einer Sedimentationswaage. Dazu wurde eine Suspension hergestellt, welche die gleiche Konzentration besitzt, wie die im Versuch verwendete. Das PAN-X wurde in entsalztem Wasser (= VE-Wasser) suspendiert und hatte eine Massenkonzentration von ca. 3 g 6 bzw. eine Volumenkonzentration von 0,88 Vol-%. Für die Analyse wurde eine Temperatur von 20 °C gewählt. . Unter diesen Versuchsbedingungen gemessenen Sinkgeschwindigkeiten vs, von 0,129 m/h bis 0,137 m h wurden an verschiedenen PAN-X Chargen ermittelt und entsprechen den Bedindungen der nicht-behinderten Sedimentation.
C HO-Zellen weisen beispielsweise eine S edimentations ges chwindigkeit von 0,0145 m/h auf [Searles J A, Todd P, Kompala D S, Biotechnol Prog (1994) 10: 198-206] und sind hiermit relativ langsam sedimentierende Zeilen. Die Hybridoma-Zelllinie AB2-143.2 weist eine Sedimentationsgeschwindigkeit von 0,029 m/h auf [Wang Z, Belovich J M (2010) Biotechnol Prog 26 (5): 1361-1366]. Für die Herstellung der Modellsuspension wurden 3 g PAN-X abgewogen und in 1000 ml VE- Wasser unter Verwendung eines Magnetrühr ers suspendiert. Zur Probenahme wurde der Erntestrom in einem Messzylinder aufgefangen, während entnommenes Volumen mittels einer zweiten Schlauchpumpe durch VE- Wasser bis zu einem Füllstand H D = 1 ersetzt wurde.
Wenn nicht abweichend angegeben, wurden alle Versuche mit folgenden Standardparametern durchgeführt:
Beschleunigung a = 1000 s2 (P/V = 1 1 ,12 W/m3)
Abscheider mitdrehend Kiärflächenbelastung v = 0,1 m h
Bodenabstand s = 70 mm
Gravimetrische Bestimmung der Partikelkonzentration: Die Bestimmung der Partikelkonzentration im Erntestrom erfolgte durch Abfiltrieren (Saugfiltration) eines definierten Volumens Erntestroms und anschließendes Trocknen und Wiegen des Filters mittels einer Trocknungswaage.
Der Einfluss der Beschleunigung bzw. des Leistungseintrages auf den Rückhaltegrad bei verschiedenen Abscheiderlängen 1 (=370) wurde ermittelt. Hierfür werden Versuche mit statischem Abscheider und mitdrehendem Abscheider verglichen (Ergebnisse siehe Fig. 12). An ein Abscheiderrohr mit einem Durchmesser d = 70 mm wurde der Erntestromsammler mit sprunghaften Querschnittsverengung nach Fig. 6 und 7 angebaut. Länge L des Abscheiders von 90 mm und 170 mm bei Beschleunigungen von 600 bis 2000 °/s2 wurden untersucht.
Der Leistungsvergleich bei der Rückhaitung der PAN-Modelipartike! bei verschiedenen Leitungs eintragen P/V von bis zu P/V = 50 W/m3 und Kiärflächenbelastung v = 0,1 m/h zeigte, dass der Rückhalt egrad R mit zunehmendem Leistungseintrag in den Bioreaktor bei einer mitrotierender Installation des Ab s cheiderrohr es abfallt, wobei der Rückhaltegrad durch erhöhte Länge L des Abscheiders erheblich positiv beeinflusst wird. In weiteren Experimente wurde der Einfluss verschiedener Erntestromsammle r bei einer Abscheiderlänge 1 = 108 mm und einem Leistungseintrag von P/V = 11,12 W/m3 (a = 1000 °/s2) und v = 0,1 m h untersucht. Der Erntestromsammler mit sprunghafter Querschnittsverengung nach Fig. 6 und 7 mit dem Durchmesserverhältnis dv/d = 5/70 (auch einfacher Sammler genannt) oder ein Erntestromsammler mit konischer Quer s chnitts Verengung nach Fig. 8 mit einem Öffnungswinkel von 54 ° und einer Abscheiderlänge 1 = 58 mm wurden mitdrehend in den Deckel 120b des Bioreaktors eingebaut. Die Ergebnisse zeigten den deutlichen Vorteil des konischen Erntestromsammlers. Die Rückhalteleistung dieses Abscheiders war überraschenderweise bei Abscheiderlängen 1 von 90 bis 143mm im gesamten Untersuchungsbereich beinahe konstant. Beim Erntestromsammler mit sprunghafter Erweiterung stieg die Abscheideleistung mit zunehmender Abscheiderlängen 1 von 90 bis 170 mm an, jedoch ohne die Leistungsfähigkeit der konischen Querschnittsverengung völlig zu erreichen.
Einfluss des Bodenabstandes:
Zur Untersuchung des Bodenabstandes wurde ein Abscheiderrohr mit einfachem Erntestromsammler nach Fig. 6 und 7 und Ab s cheider länge 1 = 90 mm verwendet. Es wurde mit Bodenabständen s von 10 bis 90 mm eingestellt. Unter Standardversuchsbedingungen von PIV = 1 1 W/m3 und v = 0, 1 m/h konnte mit dem Abscheiderrohr d = 70 mm und / = 90 mm im
Bereich der Bodenabstände von 10 < s [mm] < 70 kein Einfluss des Bodenabstandes festgestellt werden. Erst oberhalb von s > 70 mm wird ein Einfluss des Bodenabstandes sichtbar. Einfluss der Klärfi ächenb elastung :
Die Klärflächenbelastung v des Ab s cheiderrohre s entspricht der Geschwindigkeit des vertikal aufsteigenden Mediums und hat nach Gl. IV direkten Einfluss auf die Partikeirückhaltung. Der Einfluss der Klärflächenbelastung wurde am Abscheiderrohr nach Fig 6 und 7 (d = 70 mm, I = 170 mm) untersucht. Das Abscheiderrohr wurde mit Bodenabstand s = 70 mm mitdrehend in den Flaschendeckel fixiert. Der Reaktor wurde bei einem Leistungs eintrag von 3,43 W/m3 (a = 600 °/s2) und einer Klärflächenbelastungen von v = 0,025 m h bis v = 0,2 m/h betrieben. Im untersuchten Belastungsbereich von 0,025 < v [m/h] < 0,2 nimmt der Rückhaitegrad R mit zunehmender Flächenbelastung bzw. Steiggeschwindigkeit v des Abscheiders nahezu linear ab. Dieses Ergebnis ist sowohl bedingt durch die Charakteristik des Ab s ch eiders , a l s auch durch di e S edimentations eigens chaft en der verwendeten Modellsuspension. PA -X-Partikel liegen als polydisperse Suspension mit breit verteilter Partikelgröße und Sinkgeschwindigkeit vor. Es ist daher davon auszugehen, dass die Rückhaltecharakteristik in den nahezu monodispersen Zellsuspensionen einen steileren und zu kleineren Aufstiegsgeschwindigkeiten hin verschobenen Verlauf aufweist.
Eine Gegenüberstellung der Leistungsfähigkeit verschiedener Abscheidesysteme zeigt Fig. 13 in der Form der Rückhaltegrade R über der Klärflächenbelastung. Verglichen werden 2 bei Leistungseinträgern von P/V ~ 3 W/m3 mitdrehend in den Reaktortank eingebaute Vcrt ika labsche ider mit Abscheiderflächen von 8 cur und 39 cm2 (Innenrohre 1 und 2) m it den ruhenden externen Schwerkraftabscheidervarianten, wie dem klassischen Dortmundbrunnen, einem Schägkanalabscheider gemäß EP 1451290 und einem würfelförmigen Abscheider gemäß EP 1 2001 1 21 .8. Die Versuchsergebnisse belegen eine nahezu gleichwertige Rückhalteleistung aller Abscheider über den gesamten Bereiche der untersuchen Kiärflächenbelastung von 0.025 bis 0.2 m/h mit leichten Vortei len für den Würfelabscheider.
Di e A rb eiten , di e zu die s er E rfin du n g g efü h rt h ab e n , w r d e n ge m äß d e r Finanzhilfevereinbarung„Bio. RW: ProCell - Innovative Plattformtechnologien für die integrierte Prozcssentwicklung mit Zeilkulturen" im Rahmen des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) gefördert

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer formstabilen eckigen Kunststoffflasche, die einen Boden, Wände, einen Innenraum und mindestens einen Zugang zum Innenraum aufweist als Bioreaktortank für die Kultur von Zellen.
2. Reaktortank umfassend eine formstabile eckige Kunststoffflasche, die einen Boden, Wände, einen Innenraum und mindestens einen verschließbaren Zugang /um Innenraum aufweist, wobei der verschließbare Zugang aus mindestens einem Flaschenhals und / oder mindestens einer Durchführung besteht, und wobei im Innenraum, an einem oder mehreren Wänden im unteren
Bereich der Kunststoffflasche, an einer mit Koordinaten definierten Stelle, ein oder mehrere Sensorpatche angebracht sind.
3. Reaktortank umfassend eine formstabile eckige Kunststoffflasche, die einen Boden, Wände, einen Innenraum und mindestens einen verschließbaren Zugang zum Innenraum aufweist, wobei der verschließbare Zugang aus mindestens einem Flaschenhals besteht, und wobei der Flaschenhals mit einem Deckel verschlossen ist, der Durchführungen und / oder Anschlüsse für die Gas- und Flüssigkeitsversorgung und abfuhr in den und aus dem Reaktorlank und keine Durchführung für eine Antriebsachse aufweist.
4. Reaktortank nach Anspruch 3, wobei für die Gasabfuhr eine mit einem Sterilfilter mit einer Heizmatte ausgestattete Gasaustragsleitung durch den Deckel durchgeführt ist.
5. Reaktortank nach einem der Ansprüche 3 bis 4, wobei einen oder mehrere elektronische, optoelektronische oder elektrochemis che Sensoren durch den Deckel durchgeführt sind.
6. Reaktortank nach einem der Ansprüche 3 bis 5, weiterhin umfassend einen internen vertikaler
Zellabscheider, selber umfassend:
a. ein zentrales vertikales Abscheiderrohr mit einem runden Querschnitt mit einem Rohrdurchmes s ers d, wob ei das Verhältnis von Rohrdurchmes s er d zur
Flaschenquerschnittkantenlänge D von 0,25 bis 0,90 beträgt, und
b. einen Abscheiderkopf mit einem Sammler zum Absaugen von zellenbefreiter Kuiturlösung, wobei der Zellabscheider am dem Deckel des Reaktortanks statisch oder drehbar gelagert befestigt ist und der Sammler durch den Deckel durchgeführt ist.
7. Reaktortank nach einem der Ansprüche 3 bis 6 weiterhin umfassend ein Einweg- Proben nahmeel einen t , wobei das Einweg-Probennahmeelement eine an der Wand oder am Deckel des Reaktortanks installierte Probeeinsaugleitung (11 10) aufweist , die mit Hilfe eines Y-Stückes (1170) an eine Probentransportleitung (1 120) angeschlossen ist, mit der die Probennahmeleitung an eine Automatisierungsplattform zur vollautomatisierten sterilen Entnahme von Flüssigkeiten (1 190), verbunden wird, wobei der Probentreagsport mittels einer an das Y-Stück angeschlossenen eine Luftzufuhr (1210) unterstütz wird.
Reaktor umfassend:
- einen Reaktortank gebildet durch eine formstabile eckige Kunststoffflasche, die einen Boden, Wände, einen Innenraum und mindestens einen verschließbaren Zugang zum Innenraum aufweist, wobei der verschließbare Zugang aus mindestens einem Flaschenhals und / oder mindestens einer Durchführung besteht, und
- eine Reaktortankaufnahmeperipherie zur Aufnahme des Reaktortanks umfasst, wobei die Reaktortankaufnahmeperipherie besteht aus:
- Mindestens einer Reaktortankhalterung zur Aufnahme jeweils eines Reaktortanks mit einer auf dem Reaktortank angepasste Stellfläche und einem oder mehrerer seitlicher Befestigungselemente,
- einer mit der Reaktortanichalterung verbundenen Antriebseinheit zur Durchführung einer periodisch richtungs wechselnden Rotationsbewegung. 9. Reaktor gemäß Anspruch 8, wobei im Innenraum des Reaktortanks, an einem oder mehreren Wänden im unteren Bereich der Kunststo ffflas che , an einer mit Koordinaten definierten Stelle, ein oder mehrere Sensorpatche angebracht sind und wobei an der Reaktortankhalterung direkt oder mittels Lichtwellenleiter ein oder mehrere opto-elektronische Sensorsysteme zur Anregung und Auslesung der Sensorpatche befestigt sind.
10. Reakt r gemäß Anspruch 9, wobei das opto-elektronisches Sensorsystem gesammelte Daten leitungsgebunden über differentielle, serielle Schnittstellen und / oder leistungsungebunden über Funk überträgt. 11. Reaktor gemäß Anspruch 10, wobei die Antrieb einheit ein Schrittmotor ohne Getriebe mit direkter Kopplung des Motors und des Antriebes ist.
12. Reaktor gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11 , wobei der verschließbare Zugang des
Reaktortanks ein Flaschenhals ist und mit einem Deckel verschlossen ist, der Durchführungen und / oder Anschlüsse für die Gas- und Flüssigkeitsversorgung des Reaktortanks und keine
Durchführung für eine Antriebsachse aufweist. Realdortankaumahmeperipherie zur Aufnahme eine s Reaktortanks , wob e i di e Reaktortankaufhahmeperipherie umfasst:
- Mindestens eine Reaktortankhalterung zur Aufnahme j eweils eines Reaktortanks mit einer auf dem Reaktortank angepasste Stellfläche und einem oder mehreren seitlichen Befestigungselementen,
- ein oder mehrere an der Reaktortankhalterung befestigte opto-elektronische Sensorsysteme zum Ablesen von seitlich an einer mit Koordinaten definierten Stelle des Reaktortanks angebrachten Sensorpatch en,
- Verbunden mit der Reaktortankhalterung, eine Antriebseinheit zur Durchführung einer periodisch richtungswechselnden Rotationsbewegung, wobei die Antriebeinheit ein Schrittmotor ohne Getriebe mit direkter Kopplung des Motors und des Antriebes ist.
Verfahren zur Kultur von Zellen in einem Reaktor gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei der Reaktortank mit einer Winkelamp litude α im Bereich von 2° < jcxj < 3600° mit einem Leistungseintrag >10 W/m3 um seine ortsfeste, vertikale Achse in einer periodisch richtungswechselnde Rotationsbewegung versetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 14 zur Kultur von Zellen gekennzeichnet durch eine Sinkgeschwindigkeit von 0.01 bis 100 cm / h , wobei der Reaktortank einen internen vertikalen Zeilabscheider aufweist, der durch ein zentrales vertikales Abscheiderrohr und einen Abscheiderkopf mit einem Sammler zum Absaugen von zellenbefreiten Medium gebildet ist, wobei der Zellabscheider am einem Deckel für einen Reaktortank statisch oder drehbar gelagert befestigt ist und der Sammler durch den Deckel durchgeführt ist,, wobei eine von Zellen mit Hil e des Zellabscheiders abgetrennte Kuituriösung aus dem Reaktortank abgesaugt wird.
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