WO2014032953A1 - Formulation pour la delivrance de sequences nucleotidiques susceptibles de moduler des mecanismes endogenes d'arn interferents - Google Patents

Formulation pour la delivrance de sequences nucleotidiques susceptibles de moduler des mecanismes endogenes d'arn interferents Download PDF

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WO2014032953A1
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surfactant
nucleotide sequence
lipid
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PCT/EP2013/066821
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Fabrice Navarro Y Garcia
Jonathan BRUNIAUX
Xavier Gidrol
Eric SULPICE
Isabelle Texier-Nogues
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Definitions

  • the present invention relates to a nanoemulsion type formulation useful for the delivery of nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of interfering RNA.
  • RNA interference is a mechanism of post-transcriptional inhibition of gene expression and is based on small double-stranded interfering RNAs that specifically degrade a target mRNA and very selectively and specifically inhibit the expression of a protein . This mechanism takes place in the cytoplasm and involves a multi-protein complex called the RISC (RNA-induced silencing complex).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interfering mechanisms have been used in many academic and / or pharmaceutical laboratories as research tools in several disciplines of biology.
  • nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of interfering RNA are used to reveal new therapeutic targets in many pathologies. By very selectively and specifically inhibiting the expression of this or that protein, it is thus possible to highlight the role it plays in the process of development of the pathology.
  • RNA interference mechanisms which are generally large molecules ( > 10 kDa) and are negatively charged, to cross the negatively charged plasma membrane which constitutes a real barrier.
  • Physical methods include electroporation or pore generation in the ultrasonic membrane.
  • Biological methods include the use of systems specialized in the delivery of nucleic acids such as viruses.
  • Chemical methods include the use of:
  • lipopolyses complexes formed between nucleic acids and cationic lipids, for example lipofectamine® 2000,
  • polyplexes complexes formed between nucleic acids and cationic polymers, for example polyethyleneimine PEI
  • complexes formed between nucleic acids and dendrimers for example PANAM poly (amidoamine) -based dendrimers
  • lipopolyplexes complexes formed between nucleic acids, liposomes and polymers
  • SNALPs stable nucleic acid-lipid particles
  • PEG polyethylene glycol polymers
  • nucleic acids complexes formed between nucleic acids and polymeric nanoparticles based on poly (DL-lactide-co-glycolide) PLGA.
  • lipid nanoparticles for the delivery of siRNA.
  • the lipid nanoparticles comprise cholesterol, 1,2-dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) and an siRNA derivative and have been used for transfection and quenching of the GFP protein.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamine
  • siRNAs were covalently grafted to them.
  • the siRNAs have in fact been covalently bound to a poly (ethylene oxide) chain which is inserted into the nanoparticles and makes it possible to fix the siRNAs.
  • a fluorescent label (imaging agent) was also covalently grafted to siRNA for transfection monitoring.
  • any chemical modification of siRNA is likely to distort it.
  • the technique of Park et al. requires chemically modify each siRNA used, which is time consuming and expensive. There is therefore a need to provide a nucleotide sequence delivery system capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms in which these are not chemically modified.
  • WO 2010/018223 describes the use of a formulation in the form of a nanoemulsion, comprising a continuous aqueous phase and at least one dispersed phase comprising an amphiphilic lipid, a solubilizing lipid, a therapeutic agent and a coagulation agent.
  • surfactant comprising at least one chain composed of alkylene oxide units, for delivery of an amphiphilic or lipophilic therapeutic agent.
  • the therapeutic agent may in particular be an siRNA.
  • siRNAs being hydrophilic compounds, they would be in the continuous aqueous phase of the nanoemulsion, and not in the dispersed phase.
  • the formulation described in this application is therefore not suitable for the delivery of nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of interfering RNA.
  • the present inventors have demonstrated that all the formulations described in WO 2010/018223, and in particular those described in the examples, even incorporating cationic surfactants, are not suitable for the present application, because the complexation yield is very high. low, and transfection would not be effective. Indeed, as explained below, only formulations comprising specific proportions of components allow the delivery of nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of interfering RNA.
  • deoxyribonucleic acid (DNA) delivery systems based on oil-in-water emulsion or lipid droplets are known.
  • the lipid droplets comprise cationic surfactants, whereby the DNA binds to the droplets through electrostatic interactions.
  • Tween 80 was used. However, it has some toxicity vis-à-vis the cells.
  • Tween 80 comprises poly (ethylene oxide) chains comprising 20 ethylene oxide units.
  • a surfactant having longer poly (ethylene oxide) chains is easier to formulate, is more stable, and more effectively protects the nucleotide sequences included in the formulation vis-à-vis the external medium.
  • the nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms, in particular siRNA are generally less stable than DNA.
  • the biological activities of DNA and siRNA are very different, which implies that the delivery systems adapted for DNA are not necessarily the same as those adapted for the delivery of siRNA.
  • the present invention provides a formulation in the form of a nanoemulsion, comprising a continuous aqueous phase and at least one dispersed phase.
  • the invention provides a formulation comprising a nucleotide sequence capable of modulating endogenous mechanisms of interfering RNA that allows the delivery of said sequences.
  • premix free of nucleotide sequence capable of modulating endogenous mechanisms of interference RNA, which allows the preparation of a formulation comprising a nucleotide sequence capable of modulating endogenous mechanisms of interfering RNA by complexation a nucleotide sequence capable of modulating endogenous mechanisms of RNA interference with this "premix” formulation.
  • This "premix” formulation can therefore advantageously be complexed with a nucleotide sequence capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms adapted according to the desired use of the final formulation.
  • the present invention provides a formulation in the form of a nanoemulsion, comprising a continuous aqueous phase and at least one dispersed phase, and comprising: at least 5 mol% of amphiphilic lipid,
  • At least one lipophilic group chosen from:
  • R represents a linear hydrocarbon chain comprising from 1 1 to 23 carbon atoms
  • ester or amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and of phosphatidylethanolamine
  • At least one hydrophilic group comprising at least one cationic group chosen from:
  • a linear or branched alkyl group comprising from 1 to 12 carbon atoms and interrupted and / or substituted by at least one cationic group
  • hydrophilic polymeric group comprising at least one cationic group
  • a co-surfactant comprising at least one poly (ethylene oxide) chain comprising at least 25 ethylene oxide units
  • solubilizing lipid comprising at least one glyceride of fatty acids
  • amphiphilic lipid wherein the molar percentages of amphiphilic lipid, cationic surfactant and cosurfactant are relative to the total (amphiphilic lipid / cationic surfactant / cosurfactant / optional fusogenic lipid).
  • amphiphilic lipid / cationic surfactant / cosurfactant / possible fusogenic lipid are the main components of the droplet corona of the "premix" formulation.
  • the emulsion is thus an oil-in-water emulsion. It can be simple or multiple, in particular having in the dispersed phase a second aqueous phase. Preferably, it is simple.
  • the invention is based on the unexpected discovery that the formulation described above can be used as a transfection agent and / or for the in vitro and in vivo delivery of nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms.
  • the formulation advantageously has a good bioavailability and may make it possible to limit the degradation of the nucleotide sequences likely to modulate endogenous RNA interfering mechanisms generally. observed with other delivery systems, including protein degradation.
  • the formulation is advantageously stable: it can be stored for several hours without any degradation being observed.
  • the formulation according to the invention comprises a cationic surfactant comprising:
  • At least one lipophilic group chosen from:
  • ester or amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and of phosphatidylethanolamine, such as distearyl phosphatidylethanolamine (DSPE), and
  • DSPE distearyl phosphatidylethanolamine
  • At least one hydrophilic group comprising at least one cationic group chosen from:
  • a linear or branched alkyl group comprising from 1 to 12 carbon atoms and interrupted and / or substituted by at least one cationic group
  • hydrophilic polymeric group comprising at least one cationic group, said polymeric group being in particular chosen from:
  • a poly (ethylene oxide) typically comprising from 3 to 500 ethylene oxide units, preferably from 20 to 200 ethylene oxide units, and comprising at least one cationic group.
  • a polysaccharide such as dextran, cellulose or chitosan, especially having molecular masses of between 0.5 and 20 kDa, for example between 1 and 12 kDa,
  • a polyamine such as a chitosan or a polylysine, having in particular molecular masses of between 0.5 and 20 kDa, for example between 1 and 12 kDa.
  • ester or amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and of hosphatidylethanolamine is meant a group of
  • R 3 and R 4 independently represent a hydrocarbon chain
  • a 3 and A 4 represent O or NH
  • M represents H or a cation.
  • the cationic groups of the cationic surfactant are typically:
  • oniums chosen from ammonium, imidazolium, pyridinium, pyrrolidinium, piperidinium, phosphonium or sulphonium groups, or
  • metal complexes between a radical of a mono- or multi-dentate chelating organic group for example phenanthroline, pyridine, ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), diethylene triamine penta acetic acid (DTPA), porphyrins, phthalocyanines, clorines, bacterioclorins complexed with an inorganic cation, such as Ca 2+ , Al 3+ , Ni + , Zn 2+ Fe 2+ , Fe 3+ or Cu 2+ ,
  • ammonium groups in particular - + NMe 3 , - + NHMe 2 , - + NH 2 Me and - + NH 3 , in particular - + NH 3 , being particularly preferred.
  • anions are associated with the cationic group (s) for the formulation to be electrically neutral.
  • the nature of the anions is not limited. By way of illustration, mention may be made of halides, in particular chloride or bromide, or trifluoroacetate.
  • linking group linking the lipophilic group (s) to the hydrophilic group (s) comprising at least one cationic group is not limited.
  • linker groups are provided below (group L).
  • the cationic surfactant has the following formula (A) [(Lipo) the -L (Hydro) h] n +! (n / m) [A] (A)
  • I and h represent integers independently of 1 to 4,
  • n is an integer greater than or equal to 1, generally between 1 and 50, lipo represents a lipophilic group as defined above,
  • Hydro represents a hydrophilic group as defined above comprising at least one cationic group
  • L represents a linking group
  • n is an integer representing the charge of the anion
  • n is an integer representing the charge of the cation [(Lipo) r L- (Hydro) h ].
  • L is such that:
  • L is a divalent linking group chosen from:
  • a group Z chosen from -O-, -NH-, -O (OC) -, - (CO) O-, - (CO) NH-, -NH (CO) -, -O- (CO) -O -, -NH- (CO) -O-, -O- (CO) -NH- and -NH- (CO) -NH, -O-PO (OH) -O- or a cyclic divalent radical of 5 to 6 atoms,
  • Alk group being an alkylene comprising from 1 to 6 carbon atoms
  • L is a trivalent group chosen from a phosphate group OP- (O-) 3 , a group derived from glycerol of formula -O-CH 2 -CH- (O-) CH 2 -O- and a cyclic trivalent radical of 5 to 6 atoms, - for the other values of I and h, L is a cyclic multivalent radical of 5 to 6 atoms.
  • L is such that:
  • L is a divalent linking group chosen from:
  • a group Z chosen from -O-, -NH-, -O (OC) -, - (CO) O-, - (CO) NH-, -NH (CO) -, -O- (CO) -O -, -NH- (CO) -O-, -O- (CO) -NH- and -NH- (CO) -NH or -O-PO (OH) -O-,
  • L is a trivalent group chosen from a phosphate group OP- (O-) 3 and a group derived from glycerol of formula -O-CH 2 -CH- (O-) CH 2 -O-.
  • I and h are preferably independently 1 or 2.
  • the hydrophilic group of the cationic surfactant is a linear or branched alkyl group comprising from 1 to 12 carbon atoms and interrupted and / or substituted by at least one cationic group.
  • cationic surfactants include:
  • each Lipo is independently a lipophilic group as defined above, and R33 is H, Me or -CH 2 -CH 2 -OH,
  • Lipo is a lipophilic group as defined above, and R 34, R35, R36, R37, R38, R39, R o 4, 4 i, R 2 4 and R 43 independently represent H, Me, or -CH 2 -CH 2 -OH.
  • the cationic surfactant is chosen from:
  • DOTAP 1, 2-dioleyl-3-trimethylamoniumpropane
  • DOGS dioctadecylamidoglycylspermine
  • the hydrophilic group of the cationic surfactant is a hydrophilic polymeric group comprising at least one cationic group.
  • the cationic group (s) may be a terminal group (s) or pendant group (s).
  • the cationic group (s) may be a terminal group (s) or pendant group (s).
  • the hydrophilic polymeric group is a polyethylene oxide
  • the cationic group (s) is (are) generally located on a terminal group at the end of the poly (oxide) chain ethylene).
  • the hydrophilic polymeric group is dextran or cellulose
  • the cationic group (s) is (are) generally located on a terminal group at the end of the polysaccharide chain.
  • the cationic group (s) is (are) generally a group (s) during (s), in particular -NH 3 + groups present in an acid medium on chitosan.
  • the cationic group (s) is (are) a terminal group (s).
  • pendant groups of anionic surfactants adjacent the surface of the droplets of the dispersed phase repel electrostatic interactions and, therefore, formulations comprising cationic surfactants whose Hydro group includes pendant groups are generally less stable.
  • the cationic group (s) is (are) a group (s) pendant (s). It is advantageously possible to use a cationic surfactant whose hydrophilic group comprises several pendant cationic groups, and thus to obtain a more positively charged formulation, which will allow all the better the complexation of negative species such as the nucleotide sequences likely to modulate endogenous mechanisms of interfering RNA.
  • the preferred hydrophilic polymeric group is a radical of a poly (ethylene oxide) typically comprising from 3 to 500 ethylene oxide units, preferably from 20 to 200 ethylene oxide units, and comprising at least one cationic group.
  • the cationic surfactant has one of the following formulas:
  • R 1, R 2 , R 3 and R 4 independently represent a linear hydrocarbon chain comprising from 1 to 23 carbon atoms
  • a 2 , A 3 and A 4 represent O or NH
  • n, o and p independently represent integers from 3 to 500, preferably 20 to 200, and
  • a represents an integer of 20 to 120
  • M represents H or a cation
  • An, Ai 2 and Ai 3 independently represent a group - + NR 20 R 2 -
  • An represents - + NH 3 and the cationic surfactant has the following formula:
  • R 2 is C 17 H 35 .
  • hydrophilic polymeric group would allow: - to stabilize the formulation
  • nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of interfering RNA located on the surface of the droplets of the proteins of the medium in which the formulation is administered / used, and thus the degradation of the nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of Interfering RNA by these proteins.
  • the formulation according to the invention comprises at least two cationic surfactants, of which:
  • - one is chosen from:
  • DOTAP 1,2-dioleyl-3-trimethylamoniumpropane
  • DOGS dioctadecylamidoglycylspermine
  • DOTAP 1, 2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane
  • a cationic surfactant comprising:
  • At least one lipophilic group chosen from:
  • R represents a linear hydrocarbon chain comprising from 1 1 to 23 carbon atoms
  • ester or amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and of phosphatidylethanolamine, such as distearyl phosphatidylethanolamine (DSPE), and
  • DSPE distearyl phosphatidylethanolamine
  • hydrophilic polymeric group comprising at least one cationic group, said polymeric group being chosen from:
  • a poly (ethylene oxide) typically comprising from 3 to 500 ethylene oxide units, preferably from 20 to 200 ethylene oxide units, and comprising at least one cationic group,
  • polysaccharide such as dextran, cellulose or chitosan
  • a polyamine such as a chitosan or a polylysine
  • the formulation according to the invention comprises, as cationic surfactants:
  • a cationic surfactant comprising:
  • At least one lipophilic group chosen from:
  • R represents a linear hydrocarbon chain comprising from 1 1 to 23 carbon atoms
  • ester or amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and of phosphatidylethanolamine, such as distearyl phosphatidylethanolamine (DSPE), and
  • DSPE distearyl phosphatidylethanolamine
  • the formulation according to the invention comprises, as cationic surfactants:
  • the cationic surfactant is in the crown of the droplets of the formulation. It binds via electrostatic interactions to nucleotide sequences that can modulate endogenous RNA interference mechanisms and allows the siRNAs to be maintained on the surface of the droplets.
  • the formulation comprises from 15 to 70 mol% of at least one cationic surfactant relative to the combination (amphiphilic lipid / cationic surfactant / co-surfactant / optional fusogenic lipid). Below 15%, the formulation does not include enough positive charges and the subsequent complexation of the "premix" formulation with nucleotide sequences (negatively charged) is insufficient. Beyond 70%, the formulations are not stable, and generally can not even be formulated (the formation of the nanoemulsion is not possible because the droplets coalesce to form two phases), and the droplets generally become toxic for cells.
  • the formulation according to the invention comprises a fusogenic lipid, which is capable of facilitating the cytosolic release by destabilization of the endosomal membrane, called "helper" lipid.
  • this lipid is dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE).
  • This lipid makes it possible to promote the endosomal escape of the droplets of the formulation according to the invention, and thus of the nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms that they contain, and generally improves the extinction efficiency of the invention. gene of interest.
  • the lipid capable of facilitating the cytosolic release by destabilization of the endosomal membrane is located in the crown of the droplets of the formulation. ⁇ Amphiphilic lipid
  • the formulation comprises at least one amphiphilic lipid, which is located in the crown of the droplets of the formulation.
  • at least one amphiphilic lipid as a surfactant.
  • the amphiphilic nature of the surfactant ensures the stabilization of the oil droplets within the continuous aqueous phase. Below 5 mol% of amphiphilic lipid relative to the whole (amphiphilic lipid / cationic surfactant / co-surfactant / possible fusogenic lipid), the formulations are not stable, and generally can not even be formulated (the formation of nanoemulsion is not possible because the droplets coalesce to form two phases).
  • the formulation comprises from 5 to 85 mol%, preferably from 5 to 75 mol%, in particular from 5 to 50 mol% and most preferably from 8 to 30 mol% of amphiphilic lipid relative to the whole (amphiphilic lipid).
  • amphiphilic lipid cationic surfactant / co-surfactant / possible fusogenic lipid.
  • amphiphilic lipids comprise a hydrophilic part and a lipophilic part. They are generally chosen from compounds whose lipophilic part includes a saturated or unsaturated chain, linear or branched, having from 8 to 30 carbon atoms.
  • lipids may be chosen from phospholipids, cholesterols, lysolipids, sphingomyelins, tocopherols, glucolipids, stearylamines, cardiolipins of natural or synthetic origin; molecules composed of a fatty acid coupled to a hydrophilic group by an ether or ester function, such as sorbitan esters such as sorbitan monooleate and sorbitan monolaurate sold under the Span ® names by Sigma; polymerized lipids; lipids conjugated to short chains of polyethylene oxide (PEG) such as the nonionic surfactants sold under the trade names Tween ® by ICI Americas, Inc. and Triton ® by Union Carbide Corp .; sugar esters such as mono- and di-laurate, mono- and di-palmitate, mono- and distearate sucrose; said surfactants can be used alone or in mixtures.
  • PEG polyethylene oxide
  • Phospholipids are the preferred amphiphilic lipids.
  • Lecithin is the particularly preferred amphiphilic lipid.
  • the formulation further comprises a solubilizing lipid comprising at least one glyceride of fatty acids, which is in the dispersed phase of the nanoemulsion, more precisely in the core of the droplets.
  • This compound has the main mission of solubilizing the amphiphilic lipid, poorly soluble, in the dispersed phase of the nanoemulsion.
  • the solubilizing lipid is a lipid having an affinity with the amphiphilic lipid sufficient to allow its solubilization.
  • the solubilizing lipid is solid at room temperature.
  • amphiphilic lipid is a phospholipid, it may be in particular:
  • esters of fatty acids and of fatty alcohol such as cetylpalmitate, or
  • the solubilizing lipid used is advantageously chosen according to the amphiphilic lipid used. It will generally present a close chemical structure, in order to ensure the desired solubilization. It can be an oil or a wax. Preferably the solubilizing lipid is solid at ambient temperature (20 ⁇ ), but liquid at body temperature (37 ⁇ C).
  • the preferred solubilizing lipids are esters of fatty acids and of fatty alcohol, such as cetyl palmitate, or glycerides of fatty acids, in particular of saturated fatty acids, and in particular of fatty acids. saturated with 8 to 18 carbon atoms, more preferably 12 to 18 carbon atoms.
  • it is a mixture of different glycerides.
  • it is saturated fatty acid glycerides comprising at least 10% by weight of C12 fatty acids, at least 5% by weight of C14 fatty acids, at least 5% by weight of acids.
  • C16 fatty acids and at least 5% by weight of C18 fatty acids are saturated fatty acid glycerides comprising at least 10% by weight of C12 fatty acids, at least 5% by weight of C14 fatty acids, at least 5% by weight of acids.
  • C16 fatty acids and at least 5% by weight of C18 fatty acids are saturated fatty acid glycerides comprising at least 10% by weight of C12 fatty acids, at least 5% by weight of C14 fatty acids, at least 5% by weight of acids.
  • saturated fatty acid glycerides having from 0% to 20% by weight of C8 fatty acids, 0% to 20% by weight of C10 fatty acids, 10% to 70% by weight of C12 fatty acids, 5% to 30% by weight of C14 fatty acids, 5% to 30% by weight of C16 fatty acids and 5% to 30% by weight of C18 fatty acids.
  • N-type Suppocire ® is obtained by direct esterification of fatty acids and glycerol.
  • hemi-synthetic glycerides of saturated C8 to C18 fatty acids the qualitative composition of which is shown in the table below.
  • the aforementioned solubilizing lipids make it possible to obtain a formulation in the form of a nanoemulsion which is advantageously stable.
  • the aforementioned solubilizing lipids make it possible to obtain droplets in the nanoemulsion having an amorphous core.
  • the core thus obtained has a high internal viscosity without showing crystallinity.
  • the crystallization is detrimental to the stability of the nanoemulsion because it generally leads to aggregation of the droplets and / or expulsion of the encapsulated molecules outside the droplets. These physical properties promote the physical stability of the nanoemulsion.
  • solubilizing lipid can vary widely depending on the nature and amount of amphiphilic lipid present in the dispersed phase.
  • the core of the droplets comprises from 1 to 100% by weight, preferably from 5 to 80% by weight and most preferably 40 to 75% by weight of solubilizing lipid.
  • the dispersed phase may also include one or more other oils, which is (are) in the heart of the droplets.
  • the oils used preferably have a hydrophilic-lipophilic balance (HLB) of less than 8 and more preferably of between 3 and 6.
  • HLB hydrophilic-lipophilic balance
  • the oils are used without chemical or physical modification prior to the formation of the emulsion.
  • oils are generally chosen from biocompatible oils, and in particular from oils of natural origin (vegetable or animal) or synthetic oils.
  • oils of natural plant origin including among others oils of soybean, flax, palm, peanut, olives, grape seed and sunflower; synthetic oils among which include triglycerides, glycerides and mono glycerides. These oils can be first expressions, refined or inter-esterified.
  • Preferred oils are soybean oil and linseed oil.
  • the oil will be contained in the core of the droplets (including the solubilizing lipid, the possible oil, the possible imaging agent, the optional therapeutic agent if it is lipophilic) in a proportion ranging from 1 to 80% by weight, preferably 5 to 50% by weight and most preferably 10 to 30% by weight.
  • the dispersed phase may further contain other additives such as dyes, stabilizers, preservatives or other active ingredients in an appropriate amount.
  • the formulation comprises a co-surfactant, which stabilizes the nanoemulsion.
  • the co-surfactants that can be used in the formulations used in the invention are generally water-soluble surfactants. They comprise at least one poly (ethylene oxide) chain comprising at least 25, in particular at least 30, preferably at least 35, ethylene oxide units. The number of ethylene oxide units is generally less than 500.
  • Formulations comprising a co-surfactant comprising a poly (ethylene oxide) chain comprising less than 25 ethylene oxide units are indeed not stable. Generally, it is not even possible to prepare the nanoemulsion.
  • the presence of the ethylene oxide unit chain of the co-surfactant would make it possible to protect the nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interfering mechanisms localized on the surface. droplets of the proteins of the medium in which the formulation is administered / used, and thus the degradation of nucleotide sequences by these proteins.
  • co-surfactants which may be particularly mentioned the compounds conjugated polyethylene glycol / phosphatidylethanolamine (PEG-PE), fatty acid polyethylene glycol ethers such as the products sold under the trade names Brij ® ( e.g. Brij ® 35, 58, 78 or 98) by ICI Americas Inc., fatty acid esters of polyethylene glycol such as the products sold under the trademarks Myrj ® by the company ICI Americas Inc. (e.g.
  • Myrj ® 45, 52, 53 or 59 and copolymers of ethylene oxide and propylene oxide such as the products sold under the trade names Pluronic ® from BASF AG (for example Pluronic ® F68, F127 , L64, L61, 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 and 25R4) or the products sold under the trade name Synperonic ® by Unichema Chemie BV (eg Synperonic ® PE / F68, PE / L61 or PE / L64).
  • Pluronic ® from BASF AG
  • Pluronic ® F68, F127 , L64, L61, 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 and 25R4 or the products sold under the trade name Synperonic ® by Unichema Chemie BV (eg Synperonic ® PE / F68, PE / L61 or PE / L64).
  • the co-surfactant is in both the continuous aqueous phase and the dispersed phase.
  • the hydrophobic part of the co-surfactant is inserted in the droplets of the dispersed phase, whereas the polyalkoxylated chains are in the continuous aqueous phase.
  • the mass percentages of dispersed phase described are calculated by considering that the co-surfactant belongs to the dispersed phase.
  • the formulation comprises from 10% to 55% molar of co-surfactant with respect to the assembly (amphiphilic lipid / cationic surfactant / co-surfactant / optional fusogenic lipid).
  • the formulations are not stable, and generally can not even be formulated (the formation of the nanoemulsion is not possible because the droplets coalesce to form two phases). Beyond 55%, the subsequent complexation of the "premix" formation with the nucleotide sequences does not take place, probably because the positive charges of the cationic surfactant are masked by the poly (ethylene oxide) chains of the co-surfactant. , and therefore more accessible to bind electrostatically to the nucleotide sequences.
  • the co-surfactant may also have other effects in the intended application of the nanoemulsion.
  • the dispersed phase of the nanoemulsion is grafted on the surface with molecules of interest such as biological ligands, in order to increase the specific targeting of an organ.
  • molecules of interest such as biological ligands
  • Such grafting allows specific recognition of certain cells or organs by promoting the internalization of the droplets of the formulation according to the invention by the target cells which express the surface receptor. It is thus possible to transfect cells known to be resistant to the transfection agents of the prior art.
  • the surface grafting is carried out by coupling the molecules of interest or their precursors with an amphiphilic compound, especially with the co-surfactant.
  • the nanoemulsion then comprises a grafted cosurfactant.
  • the co-surfactant plays the role of a spacer for accommodating the molecules of interest on the surface.
  • the molecules of interest can be for example:
  • targeting biological ligands such as antibodies, peptides, saccharides, aptamers, oligonucleotides or compounds such as folic acid;
  • a stealth agent an entity added in order to confer on the nanoemulsion a stealthiness vis-à-vis the immune system, to increase its circulation time in the body, and to slow down its elimination.
  • the alkylene oxide chain grafting of the surfactant may be provided by maleimide-thiol coupling. • aqent of imaqer
  • the formulation comprises an imaging agent, which advantageously makes it possible to visualize the distribution of the droplets in the cells or the body of the patient, and thus the distribution of the nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms. .
  • the imaging agent may especially be used in imaging types such as:
  • the imaging agent may be a compound comprising a radionuclide, such as 8 F, C, a metal cation chelate 68 Ga, 64 Cu),
  • the imaging agent may be a compound comprising a radionuclide, for example 23 l, or a 99 m Tc or In chelate),
  • the imaging agent may be a gadolinium chelate or a magnetic nanocrystal such as a nanocrystal of iron oxide, manganese oxide or iron-platinum FePt),
  • the imaging agent may be a lipophilic fluorophore or a contrast agent, for example an iodinated molecule such as iopamidol, amidotrizoate, or gold nanoparticles).
  • the imaging agent is a lipophilic fluorophore for performing optical imaging.
  • the nature of the lipophilic fluorophore (s) used is not critical from the moment they are compatible with in vivo imaging (i.e. they are biocompatible and nontoxic).
  • the fluorophores used as imaging agent absorb and emit in the visible or near infrared.
  • the preferred fluorophores absorb and emit in the near infrared.
  • lipophilic fluorophore can be mentioned for example the compounds described in Chapter 13 ("Probes for Lipids and Membranes") catalog InVitrogen. More specifically, there may be mentioned, as a fluorophore, indocyanine green (ICG), fatty acid analogues and phospholipids functionalized with a fluorescent group such as the fluorescent products sold under the trade names Bodipy ( R) such as Bodipy (R) 665/676 (Ex / Em.); lipophilic derivatives carbocyanines such as 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate (DiD), for example sold under the reference D-307, 3,3'-dihexadecyloxacarbocyanine perchlorate ( DiO), for example sold under the reference D1 125, 1,1'-dihexadecyl-3,3,3 'perchlorate, 3'-te
  • the fluorophore is indocyanine green, 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate, 3,3'-perchlorate. dihexadecyloxacarbocyanine, or 1,1'-dihexadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate.
  • the formulation according to the invention may comprise a therapeutic agent.
  • the therapeutic agents capable of being encapsulated in the nanoemulsion according to the invention comprise in particular the active ingredients acting chemically, biologically or physically.
  • it may be pharmaceutical active principles or biological agents such as DNA, proteins, peptides or antibodies or agents useful for physical therapies such as compounds useful for thermotherapy, releasing compounds singlet oxygen when excited by light useful for phototherapy and radioactive agents.
  • it is active ingredients administered parenterally.
  • the therapeutic agent will be encapsulated by the dispersed phase or will be at the interface of the two phases.
  • the nature of the therapeutic agents encapsulated in the nanoemulsion is not particularly limited.
  • the nanoemulsion is particularly interesting for poorly soluble compounds, which are difficult to formulate in conventional delivery systems and for active ingredients useful for phototherapy, whose quantum yield can be preserved. Due to the mild conditions of the preparation process, the described formulation is particularly interesting for the encapsulation of therapeutic agents which degrade at high temperature.
  • agents used in the treatment of AIDS agents used in the treatment of heart diseases, analgesics, anesthetics, anorectics, anthelmintics, antiallergics, Anti-anginal drugs, antiarrhythmic agents, anticholinergics, anticoagulants, antidepressants, antidiabetics, antidiuretics, antiemetics, anticonvulsants, antifungals, antihistamines, antihypertensives, anti-inflammatories, anti-migraine drugs, antimuscarinics, antimycobacterials, anti-cancer drugs including antiparkinson drugs, antithyroid drugs, antivirals, astringents, blocking agents, blood products, blood substitutes, cardiac inotropic agents, cardiovascular agents, central nervous system agents, chelators, chemotin agents therapy, hematopoietic growth factors, corticosteroids, antitussives, dermatological agents, diuretics, dopamine
  • radioactive isotopes include radioactive isotopes and photo-sensitizers.
  • the photosensitizers mention may in particular be made of those belonging to the class of tetrapyrroles such as porphyrins, bacteriochlorins, phthalocyanines, chlorines, purpurins, porphycenes, pheophorbides, or those belonging to the class of texaphyrins or hypericins.
  • the first-generation photosensitizers there may be mentioned hemato-porphyrin and a mixture of hemato-porphyrin derivatives (HpD) (sold under the trade name Photofrin ® by Axcan Pharma).
  • photosensitizers second generation there may be mentioned meta-tetra-hydroxyphenyl chlorine (mTHPC; trade name Foscan ®, Biolitec AG) and mono cycle A benzoporphyrin derivative (BPD-MA sold under the trade name Visudyne ® by QLT and Novartis Opthalmics).
  • mTHPC meta-tetra-hydroxyphenyl chlorine
  • BPD-MA mono cycle A benzoporphyrin derivative
  • the second-generation photosensitizer formulations which associate with these photosensitizers a molecule (lipid, peptide, sugar, etc.) described as a carrier which allows their selective delivery to the tumor tissue are called third-generation photosensitizers.
  • oligonucleotides DNA, RNA, siRNAs, peptides and proteins and saccharides.
  • the therapeutic agent can be formulated directly in its active form or in the form of a prodrug. Furthermore, it is envisaged that several therapeutic agents can be formulated in combination in the nanoemulsion.
  • the amount of therapeutic agent depends on the intended application as well as the nature of the agent. However, it will generally be sought to formulate the nanoemulsion with a maximum concentration of therapeutic agent, especially when it comes to poorly soluble therapeutic agents, in order to limit the volume and / or the duration of administration to the patient.
  • the molar proportion of core components of the droplets with respect to the components of the droplets is 10 to 80%, especially 25 to 75%, preferably 33.35 to 73.99%.
  • the molar proportion (mol / mol) of the whole (solubilising lipid / optional oil / optional imaging agent / possible lipophilic therapeutic agent) relative to the dispersed phase (i.e. components of the dispersed phase) is generally 10 to 80%, especially 25 to 75%, preferably 33.35 to 73.99%.
  • the mass proportion (wt / wt) of the core components of the droplets with respect to the components of the droplets is from 10 to 60%, especially from 20 to 60%, preferably from 23.53 to 59.51%.
  • the mass proportion of the whole (solubilising lipid / optional oil / optional imaging agent / optional lipophilic therapeutic agent) relative to the dispersed phase is generally from 10 to 60 %, in particular from 20 to 60%, preferably from 23.53 to 59.51%.
  • the formulation "premix” is particularly suitable for the formulation "premix” to be stable on storage, especially since it is stable by being stored for more than 28 days at 40 ° C., or even more than 300 days at 40 ° C.
  • the stability can in particular be measured by following the size of the droplets, their polydispersity index and / or their zeta potential (for example by quasi-elastic light scattering by a device of the ZetaSizer type, Malvern).
  • This stability of the "premix” formulation is important for the intended applications. Indeed, as detailed below, the "premix” formulation is used to prepare the "final” formulation comprising a nucleotide sequence capable of modulating endogenous mechanisms of RNA interference. It is particularly advantageous to be able to store the formulation "premix” and complexation with said sequence just before using the "final” formulation.
  • the aqueous phase of the nanoemulsion used in the invention preferably consists of water and / or a buffer such as a phosphate buffer such as for example PBS ("Phosphate Buffer Saline”) or a saline solution, especially sodium chloride.
  • a buffer such as a phosphate buffer such as for example PBS ("Phosphate Buffer Saline") or a saline solution, especially sodium chloride.
  • the continuous aqueous phase also comprises a thickening agent such as glycerol, a saccharide, oligosaccharide or polysaccharide, a gum or a protein, preferably glycerol.
  • a thickening agent such as glycerol, a saccharide, oligosaccharide or polysaccharide, a gum or a protein, preferably glycerol.
  • the aqueous phase advantageously comprises 0 to 50% by weight, preferably 1 to 30% by weight and most preferably 5 to 20% by weight of thickening agent.
  • the aqueous phase may further contain other additives such as dyes, stabilizers and preservatives in an appropriate amount.
  • the proportion of dispersed phase and aqueous phase is very variable. However, most often, the nanoemulsions will be prepared with 1 to 50%, preferably 5 to 40% and most preferably 10 to 30% by weight of dispersed phase and 50 to 99%, preferably 60 to 95% and most preferably 70 to 95%. at 90% by weight of aqueous phase.
  • the viscosity of the formulation is greater than 1 poise (0.1 Pa.s) at 25 ° C.
  • the nanoemulsion used is in the form of "gel".
  • gel is generally understood to mean a thermodynamically stable solid-liquid biphasic system consisting of a continuous three-dimensional continuous interpenetrating network, one solid and the second liquid. Such a gel is a two-phase liquid-solid system whose solid network retains a liquid phase. Although the gels can be considered as solid, they have properties specific to solids (structural stiffness, elasticity to deformation) and liquids (vapor pressure, compressibility and electrical conductivity).
  • the three-dimensional network is formed by the droplets, the interstices between droplets being filled with continuous phase.
  • the links between the network units, namely the droplets, are mainly based on electrostatic interactions (ion pairs). These electrostatic interactions exist mainly between the nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of interference RNA and the cationic surfactants of adjacent droplets.
  • a nanoemulsion in gel form therefore shows a pressure resistance and is capable of maintaining a defined shape, which may be advantageous depending on the form and / or the desired route of administration.
  • nanoemulsion in gel form has a viscosity and a coefficient of elasticity greater than a liquid nanoemulsion.
  • the nanoemulsion in gel form can, depending on the concentration of droplets and therefore the mass fraction dispersed phase, be in the form of viscous liquid, viscoelastic solid or elastic solid.
  • the nanoemulsion is considered a viscous liquid when its viscosity is 10 times higher than that of the water, corresponding to> 10 mPa.s at 25 q C.
  • the nanoemulsion is in the form of a viscous liquid when G "> G '.
  • the nanoemulsion When G 'becomes close to G ", the nanoemulsion is in the state of viscoelastic solid When G" ⁇ G', it is in the state of elastic solid.
  • the nanoemulsion is preferably in the viscous liquid state or the viscoelastic solid, because the viscosity is sufficiently moderate in these states to allow applications involving administration by injection.
  • the viscosity and the coefficient of elasticity can be measured by a cone-plane rheometer or a Couette rheometer.
  • the viscosity of a liquid nanoemulsion is generally less than 1 poise, or even often less than 0.01 poise.
  • the nanoemulsion used in this embodiment of the invention generally has a viscosity greater than 1 poise, and may have a viscosity up to that of a solid (more than 1000 poise).
  • the nanoemulsion of the present invention generally has a viscosity of 1 to 1000 poises, preferably 1 to 500 poise and even more preferably between 1 and 200, these values being given at 25 ' ⁇ .
  • a viscosity greater than 1 poise is indeed adapted so that the droplets of the dispersed phase form a three-dimensional network inside the continuous phase. Indeed, it has been found that below 1 poise, the droplets are generally not close enough to each other. Above 1000 poises, a quasi-solid system is obtained. The nanoemulsion is then too viscous which makes its use difficult.
  • the coefficient of elasticity is generally less than 10 in the case of a liquid nanoemulsion
  • the elasticity coefficient of a nanoemulsion in the form of a gel is generally greater than 10.
  • the peaks of the diffractogram obtained for a liquid nanoemulsion are characteristic of the structure of the dispersed phase droplets (large diffraction angles characteristic of short distances), whereas the peaks of the diffractogram of a nanoemulsion in the form of a gel are characteristic of only the droplet structure (large diffraction angles characteristic of short distances) but also the organization of these three-dimensional network droplets (small diffraction angles characteristic of greater distances).
  • the nanoemulsion used in this embodiment of the invention is advantageously in the form of a dispersible gel, that is to say that the droplets forming the three-dimensional network can be released in the continuous phase under certain conditions by "degelling" the system.
  • disintegration also referred to as "disintegration" in this application.
  • the disintegration is observed by adding continuous phase to the gel, by contact with the physiological fluids during the administration of the nanoemulsion or by increasing the temperature.
  • adding the continuous phase causes a difference in osmotic pressure between the inside of the gel and the continuous phase.
  • the system will therefore tend to decrease, to cancel, this osmotic pressure difference by releasing the droplets in the continuous phase excess, until a homogeneous droplet concentration is obtained throughout the continuous phase volume.
  • increasing the temperature of the system sufficiently amounts to giving the different droplets a thermal energy greater than the energies involved in the bonds, for example the hydrogen bonds, and thus breaking these bonds and releasing the droplets from the three-dimensional network.
  • the disintegration of the nanoemulsion in gel form can be followed by X-ray diffraction, differential scanning calorimetry (DSC) or nuclear magnetic resonance (NMR).
  • DSC differential scanning calorimetry
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • Disintegration can also be followed by DSC.
  • a peak appears on the thermogram during the nanoemulsion transition in the form of a gel / liquid nanoemulsion while rising in temperature.
  • an NMR study can also make it possible to follow the disaggregation by measuring the diffusion coefficient associated with each droplet by distinguishing a liquid nanoemulsion from a nanoemulsion in gel form.
  • the formulation comprises a surfactant of formula (I) below:
  • L 2 independently represent lipophilic groups
  • Xi, X 2 , Y 1 , Y 2 and G independently represent a linking group
  • H 2 independently represent hydrophilic groups comprising a polyalkoxylated chain
  • v and w are independently an integer from 1 to 8,
  • the surfactant of formula (I) is partially in the continuous aqueous phase and partially in the dispersed phase.
  • the surfactant of formula (I) comprises two lipophilic groups (II and L 2 ) and two hydrophilic groups (Hi and H 2 ).
  • the hydrophilic groups are located mainly on the surface of the droplets, in the continuous aqueous phase while the lipophilic groups are in the droplets of the formulation.
  • the lipophilic group Li is in certain droplets, and the L 2 group in adjacent droplets.
  • the droplets are thus covalently linked to one another by the group - (Xi-H Yi) v G- (Y 2 -H 2 .X 2 ) w - of the surfactant of formula (! ⁇
  • the groups X 1 and X 2 are lipophilic and hydrophilic linking groups.
  • Group G is a linking group between the two [lipophilic-hydrophilic] parts of the surfactant of formula (I).
  • Groups Y 1 and Y 2 are linking groups group G to these two parts [lipophilic-hydrophilic].
  • the formulation of this embodiment may advantageously be shaped (for example by placing it in a mold or container having a given shape), and remain in the desired shape according to the desired application.
  • This embodiment of the invention is therefore particularly suitable when the formulation is used in capsule, gel, ovum or patch form. On the other hand, it resists dilution with an aqueous phase. More specifically, when an aqueous phase is added to this formulation, it remains in shape and does not dilute. In the medium, one observes on the one hand the formulation comprising the droplets, and on the other hand an aqueous phase substantially free of droplets.
  • L 2 are independently selected from:
  • R represents a linear hydrocarbon chain comprising from 1 1 to 23 carbon atoms
  • ester or amide of fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms and of phosphatidylethanolamine, such as distearyl phosphatidylethanolamine (DSPE), and
  • DSPE distearyl phosphatidylethanolamine
  • X 1 , X 2 , Y 1 and Y 2 are independently selected from:
  • a group Z chosen from -O-, -NH-, -O (OC) -, - (CO) O-, - (CO) NH-, -NH (CO) -, -O- (CO) -O -, -NH- (CO) -O-, -O- (CO) -NH- and -NH- (CO) -NH,
  • Alk group being an alkylene comprising from 1 to 6 carbon atoms
  • - Hi and H 2 are independently selected from poly (ethylene oxide) typically comprising from 3 to 500 ethylene oxide units, preferably from 20 to 200 ethylene oxide units, and / or
  • G comprises at least one group G 'having one of the following formulas (the groups Y 1 and Y 2 being connected to the left and to the right of the formulas described below):
  • a 102 is CH or N
  • R 02 is H or a linear hydrocarbon chain comprising from 1 to 6 carbon atoms
  • a 0 i represents -O-, -NH- (CO) - or -O- (CO
  • R 100 is H or methyl
  • a 100 is -O- or -NH-
  • R 0 is H, Me or -OMe.
  • v and w are independently 1 or 2. v and w are preferably 1.
  • the group G may comprise one or more of the groups G 'defined above.
  • the group G consists of a group G '.
  • v and w represent 1.
  • the group G corresponds to the formula -G'-Y 3 -G'- in which:
  • Y 3 represents a linking group, in particular chosen from:
  • a group Z chosen from -O-, -NH-, -O (OC) -, - (CO) O-, - (CO) NH-, -NH (CO) -, -O- (CO) -O -, -NH- (CO) -O-, -O- (CO) -NH- and -NH- (CO) -NH,
  • Alk group being an alkylene comprising from 1 to 6 carbon atoms
  • each of G 'independently represents a group of formula (XI) to (XXVI) mentioned above, and preferably, the two groups G' of the formula -G'-Y 3 -G'- are identical.
  • v and w represent 1.
  • This embodiment is particularly advantageous when the two groups G 'are identical and comprise a cleavable function. Indeed, it is then sufficient to cleave only one of the two functions to break the covalent bonds between the droplets of the formulation.
  • the group G is a dendrimer comprising (v + w) groups G '.
  • the group G can in particular be a dendrimer comprising several groups G ', such as a dendrimer comprising a polyamidoamine group (PAMAM).
  • group G may have one of the following formulas (XXX) to (XXXIII), which include:
  • R represents a linear hydrocarbon chain comprising 1 1 to 23 carbon atoms
  • / or L 2 represent groups derived from fatty acids comprising from 12 to 24 carbon atoms.
  • L 2 represents an ester or a fatty acid amide comprising from 12 to 24 carbon atoms and of hosphatidylethanolamine ", is meant that they represent a
  • R 3 and R 4 independently represent a linear hydrocarbon chain comprising from 1 to 23 carbon atoms
  • a 3 and A 4 represent O or NH, and M represents H or a cation.
  • I 1 and L 2 are identical and / or X 1 and X 2 are identical and / or H 1 and H 2 are identical.
  • Particularly preferred surfactants of formula (I) are those in which I 1 and L 2 are identical, X 1 and X 2 are identical and H 1 and H 2 are identical. These surfactants are indeed symmetrical compounds and are therefore generally easier to synthesize, and therefore less expensive.
  • the radicals LXH and / or L 2 -X 2 -H 2 - consist of one of the following groups of formulas (the group Y 1 or Y 2 being connected to the right formulas described below):
  • R 1, R 2 , R 3 and R 4 independently represent a linear hydrocarbon chain comprising from 1 to 23 carbon atoms
  • Ai A 2 , A 3 and A 4 represent O or NH
  • n, o and p independently represent integers from 3 to 500, preferably 20 to 200, and
  • a represents an integer of 20 to 120
  • M represents H or a cation.
  • Li-Xi-H radicals R and / or L 2 -X 2 -H 2 - of the formula (C l) are preferred. Indeed, they are easy to prepare (in particular by forming an ester or an amide between a fatty acid and a poly (ethylene glycol) derivative.) Moreover, a formulation comprising a surfactant comprising a Li-Xi radical.
  • H and / or L 2 -X 2 -H 2 - of formula (Ci 1) can generally be prepared with a greater amount of this surfactant than a formulation comprising a surfactant comprising a radical Li-XrH and / or L 2 - X 2 -H 2 - of formula (III)
  • the higher the proportion of surfactant of formula (I) in the formulation the greater the cohesion between the droplets, and the more the formulation remains in shape and resists the . dilution
  • these two properties can be further exacerbated for a formulation comprising a surfactant comprising a radical r X r H r eJou L 2 - X 2 -H 2 - of the formula (CII).
  • radicals X r r H r eJou L 2 -X 2 -H 2 - of the formula (C l) with A 2 represents NH are particularly preferred, because the surfactants comprising such radicals can prevent the leakage of interest agents lipophiles optionally present outside the droplets of the formulation more effectively than surfactants comprising Li-XrH and / or L 2 -X 2 -H 2 - radicals of formula (Ci 1) with A 2 represents O.
  • R 2 and R 5 independently represent a linear hydrocarbon chain comprising 1 to 23 carbon atoms, preferably 1 7,
  • - A 2 and A 5 represent O or NH, preferably NH, and n and q independently represent integers from 3 to 500, preferably from 20 to 200.
  • the groups Hi and H 2 are independently selected from poly (ethylene oxide) comprising more than 3 units of poly (ethylene oxide), or even more than 20 units, in particular more than 50 units (in the aforementioned formulas, m, n, o, p and / or q are preferably greater than 3, even 20, especially more than 50).
  • the group G of the surfactant of formula (I) of the formulation comprises a cleavable function, especially at certain pH (basic or acidic pH), by enzymes, by light (visible light, ultraviolet or infrared). and / or beyond certain temperatures.
  • the group G then comprises a group G 'comprising a cleavable function.
  • the group G disulfide function of formula (XV) is cleavable with ultraviolet light or with enzymes such as thioreductases,
  • the group G amide function of formula (XI) is cleavable by enzymes such as proteases,
  • phosphate function of the group G of formula (XXII) is cleavable by enzymes such as phosphatases,
  • the ratio of the surfactant mass of formula (I) to the bulk of the combination (surfactant of formula (I) / co-surfactant) is greater than or equal to 15%. It has indeed been observed that such formulations are easier to prepare. • Droplet size of the premix formulation
  • the droplets of the "premix" formulation defined above generally have a diameter of between 20 and 200 nm. This diameter can in particular be measured by quasi-elastic light scattering on a ZetaSizer device, Malvern.
  • a formulation comprising droplets of size between 40 and 100 nm
  • the formulation may have stability problems, beyond 50%, the transfection efficiency of the "final" formulation after complexation with the nucleotide sequences is less), and / or
  • a formulation comprising droplets with a size between 130 and 175 nm
  • a formulation comprising at least 5 mol% of amphiphilic lipid and 15 to 70 mol% of at least one cationic surfactant and:
  • amphiphilic lipid cationic surfactant and cosurfactant are relative to the total (amphiphilic lipid / cationic surfactant / cosurfactant / optional fusogenic lipid).
  • formulation comprising a nucleotide sequence capable of modulating endogenous mechanisms of interfering RNA
  • the formulation may further comprise a mono or double-stranded nucleotide sequence, comprising less than 200 bases for a single-stranded nucleotide sequence or less than 200 base pairs for a double-stranded nucleotide sequence, and capable of modulating endogenous mechanisms of Interfering RNA (ribonucleic acid), such as:
  • siRNA small interfering RNA
  • Mimic a synthetic microRNA, called Mimic ("MicroRNA” or “miRNA” in English).
  • said nucleotide sequence is siRNA.
  • SiRNA is a nucleotide sequence of double-stranded RNA. It is a natural or synthetic nucleotide sequence.
  • siRNA is likely to target a transcript of interest, that is to say that the nucleotide sequence of one siRNA strand is complementary to the nucleotide sequence of the transcript of interest.
  • the size of each strand of siRNA double strand generally ranges from 15 to 30 nucleotides, preferably from 19 to 25 nucleotides, in particular from 19 to 21 nucleotides.
  • Two deoxythymidine are generally added in part 3 'of each of its strands to increase the stability.
  • an siRNA whose deoxythymidine has been grafted to its 3 'parts does not fall outside the definition of an siRNA according to the present application.
  • An siRNA makes it possible to reduce the expression of a target protein by interference with the messenger RNA encoding this protein.
  • said nucleotide sequence is a blocked nucleic acid.
  • a blocked nucleic acid is a nucleotide sequence of RNA and / or single-stranded DNA of which at least one of the nucleic acids contains a methylene bridge between the hydroxyl at the 2-position and the carbon-4 atom of the ribose. It is a synthetic nucleotide sequence.
  • a blocked nucleic acid is a microRNA inhibitor and makes it possible to regulate the expression of one or more target proteins whose mRNAs were in interference with the RNA sequences derived from said microRNA. Regulation is most often a rise in protein expression inhibition.
  • said nucleotide sequence is a microRNA.
  • a microRNA is a nucleotide sequence of single-stranded RNA (of the order of one hundred bases). It is a synthetic nucleotide sequence.
  • a microRNA makes it possible to regulate the expression of one or more target proteins by interference with one or more mRNA coding respectively for these proteins.
  • the regulation is most often an inhibition of the expression of the proteins.
  • Said nucleotide sequences are maintained on the surface of the droplets of the dispersed phase of the formulation by virtue of the electrostatic interactions with the cationic surfactant. They are therefore located on the surface of the droplets, at the level of the droplet crown, the hydrophilic side of the crown.
  • said nucleotide sequences are not chemically modified and they are not denatured.
  • said nucleotide sequences are not covalently linked to the other components of the droplets.
  • said nucleotide sequences are not covalently bound to either the co-surfactant, the amphiphilic lipid or the optional imaging agent.
  • said nucleotide sequences are solely linked to the droplets of the nanoemulsion by electrostatic interactions with the cationic surfactants. This is very advantageous because said nucleotide sequences, once released into their site of action, are not denatured and can play the expected role.
  • the droplets of the "final" formulation generally have a diameter of between 20 and 250 nm, typically between 40 and 200 nm. This diameter can in particular be measured by quasi-elastic light scattering on a ZetaSizer device, Malvern. ⁇ Location of droplet components
  • the droplets of the formulation according to the invention are organized in the form of corona hearts, where:
  • the heart includes:
  • the possible therapeutic agent if it is lipophilic
  • the crown includes:
  • amphiphilic lipid the amphiphilic lipid
  • the co-surfactant (optionally grafted with a molecule of interest),
  • nucleotide sequence capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms
  • the invention relates to a kit comprising the formulation
  • Premix as defined above, and separately, at least one mono or double-stranded nucleotide sequence, comprising less than 200 bases for a single-stranded nucleotide sequence or less than 200 base pairs for a double-stranded nucleotide sequence, and capable of to modulate endogenous mechanisms of RNA (ribonucleic acid) interference.
  • the "premix" formulation is physically separated from at least one nucleotide sequence.
  • co-surfactant comprises a poly (ethylene oxide) chain comprising at least 25 ethylene oxide units
  • solubilizing lipid in the core of the droplets, and / or
  • the premix formulation can be stored. Thus, it is not necessary to prepare the "premix” emulsion each time it is desired to use the formulation
  • the invention relates to the process for preparing the formulation defined above.
  • the various oily constituents are first mixed to prepare an oily premix for the dispersed phase of the emulsion, and then dispersed in an aqueous phase under the effect of shearing.
  • the preparation process typically comprises the following steps:
  • the preparation of the oily phase comprises mixing the oily components of the formulation (solubilizing lipid / amphiphilic lipid / cationic surfactant).
  • the formulation comprises a lipid capable of facilitating the cytosolic release by destabilization of the endosomal membrane and / or an oil, and / or an imaging agent and / or a therapeutic agent, these are generally introduced into the oily phase during of step (i).
  • the mixture may optionally be facilitated by dissolving one of the constituents or the complete mixture in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent is then evaporated to obtain a homogeneous oil premix for the dispersed phase.
  • Step (i) it is preferred to carry out the premixing (step (i)) at a temperature at which all the ingredients are liquid.
  • the oily phase is dispersed in the aqueous phase in the liquid state. If one of the phases solidifies at room temperature, it is preferable to carry out the mixing with one or preferably both heated phases at a temperature greater than or equal to the melting temperature.
  • the emulsification under the shearing effect is preferably carried out using a sonifier or a microfluidizer.
  • the aqueous phase and then the oily phase are introduced in the desired proportions in a suitable cylindrical container and the sonifier is immersed in the medium and started for a sufficient time to obtain a nanoemulsion, usually a few minutes.
  • the average diameter of the oil droplets is generally greater than 10 nm and less than 200 nm, preferably between 30 and 190 nm, and the zeta potential is greater than 20 mV, generally between 25 mV and 60 mV, preferably between 40 and 55 mV, preferably when the aqueous phase of the formulation is a 0.15 mM aqueous solution of NaCl.
  • the nanoemulsion obtained at the end of step (iii) corresponds to the formulation
  • Step (iv) Step (iv) then makes it possible to prepare the formulation that is useful for delivering said nucleotide sequences by complexing said nucleotide sequences on the "premix" formulation obtained at the end of step (iii).
  • the nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms are added to the formed nanoemulsion and the mixture obtained is mixed at room temperature, for example 30 minutes.
  • the nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms carrying negatively charged phosphate groups, bind electrostatically to the droplets whose surface is positively charged by the cationic groups of the cationic surfactants. .
  • Complexes are thus formed between the nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of interference RNA and the droplets of the nanoemulsion.
  • the nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of RNA interference are generally added in aqueous solution, for example nuclease-free water, cell culture media, culture media optimized for transfection, in particular Opti medium.
  • Stage (iv) is typically carried out at room temperature (25 ° C.), after simple homogenization or with stirring (for example between 100 and 1000 rpm), for a period of between 5 minutes and 2 hours, for example from the order of 30 minutes.
  • the quantity of nucleotide sequences introduced is such that the ratio of the amount of positive charges due to the cationic surfactant in the "premix” formulation to the amount of negative charges contributed by the nucleotide sequences introduced into the medium is greater than 8/1.
  • the skilled person is able to calculate the amount of negative charges made by the nucleotide sequences introduced into the medium, and the amount of positive charges due to the cationic surfactant in the formulation "premix".
  • Such a ratio makes it possible to obtain a quantitative complexation, that is to say that there are no longer any nucleotide sequences capable of modulating endogenous free interfering RNA mechanisms in the medium.
  • Step (iv) can be followed by various methods, for example by:
  • nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms are heavier and are visualized in the wells. If the complexation is less important, nucleotide sequences capable of modulating endogenous free-interference RNA mechanisms will migrate to another position.
  • DLS - dynamic light scattering
  • a homogeneous nanoemulsion is generally obtained in which the average diameter of the oil droplets is generally greater than 10 nm and less than 200 nm, preferably between 60 and 200 nm.
  • the process for preparing the formulation does not require the nucleotide sequences to be chemically modified, and in particular does not require them to be grafted covalently to another component of the formulation. It is therefore very easy to prepare in parallel numerous formulations according to the invention comprising nucleotide sequences.
  • the formulation can be purified, for example by column purification or by dialysis.
  • the emulsion Before conditioning, the emulsion can be diluted and / or sterilized, for example by filtration or dialysis. This step eliminates any aggregates that may have formed during the preparation of the emulsion.
  • the nanoemulsion used for complexing with nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms may be prepared by a method comprising contacting:
  • an emulsion 1 comprising a continuous aqueous phase and a disperse phase in the form of droplets comprising an amphiphilic lipid and a surfactant of the following formula (Ib):
  • an emulsion 2 comprising a continuous aqueous phase and a dispersed phase in the form of droplets comprising an amphiphilic lipid and a surfactant of formula (LU) below:
  • G 1 and G 2 are groups capable of reacting to form the group G such that defined above, under conditions allowing the reaction of the surfactants of formulas (Ll) and (LU) to form the surfactant of formula (I) as defined above, whereby covalent bonds between the droplets of the phase dispersed form.
  • the continuous aqueous phases of emulsions 1 and 2 comprise a cosurfactant as defined above.
  • the dispersed phases of emulsions 1 and 2 comprise a solubilizing lipid as defined above.
  • the dispersed phase of the emulsion 1 and / or the dispersed phase of the emulsion 2 comprises a cationic surfactant as defined above.
  • the groups G 1 and G 2 are typically groups capable of reacting with each other to form the group G.
  • emulsions 1 and 2 are generally brought into contact with a compound which is capable of reacting with the surfactants of formulas (L1) and (L1) to form the group G.
  • This compound typically comprises at least v functions G'i likely to react with the group Gi and w functions G ' 2 likely to react with the group G 2 .
  • the method of preparing the formulation typically comprises contacting:
  • G'i-Y 3 -G'2 in which Y 3 is as defined above, G'i is a group capable of reacting with d to form the first group G 'as defined herein above and G ' 2 is a group capable of reacting with G 2 to form the second group G' as defined above (of identical or different nature from the first group G '),
  • the method of preparing the formulation typically comprises contacting:
  • G'i v -Y 4 - (G ' 2 ) w in which v and w and are as defined above
  • G'i is independently a group capable of reacting with Gi to form a group G 'as defined above
  • G' 2 is independently a group capable of reacting with G 2 to form a group G 'as defined above (each G' being identical in nature or different from the other groups G ')
  • Y 4 is the skeleton of a dendrimer
  • the compound of formula (G'i) v -Y 4 - (G ' 2 ) W can respectively have one of the following formulas ( ⁇ '), ( ⁇ '), ( ⁇ ') and ( ⁇ '):
  • the groups G 1 and G 2 of the compounds of formulas (Ll) and (LU) may for example be chosen as follows: - G 1 represents a thiol (-SH ) and G 2 represents:
  • Gi represents a hydroxyl and G 2 represents -COOH or an activated ester, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XXIII) being then formed,
  • Gi represents an amine -NH 2 and G 2 represents -COOH or an activated ester, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XI) being then formed,
  • G 2 represents an activated carbonate, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XIX) being formed,
  • - Gi represents an amine -NH 2 and G 2 represents an activated carbonate, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XII) being formed, - Gi represents an amine -NH 2 and G 2 represents an aldehyde -CHO, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XXI) being then formed,
  • Gi represents an alkyne and G 2 represents an azide, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XVIII) being then formed,
  • Gi represents a cyclooctyne and G 2 represents an azide, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XVIN') being then formed, G 1 represents a furan and G 2 represents a maleimide, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XVII) being then formed,
  • Gi represents an aldehyde and G 2 represents an amine, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XXI) being formed,
  • Gi represents a good leaving group LG and G 2 represents a group of formula
  • Gi represents a hydroxyl or an amine -NH 2 and G 2 represents a group of
  • G comprises a group G 'representing a group of formula (XXIV) in which A 10 i respectively represents -O- (CO) - or -NH- (CO) being formed
  • Gi represents a good leaving group LG and G 2 represents a hydroxyl , a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XXV) being then formed,
  • Gi represents a good leaving group LG and G 2 represents an amine -NH 2
  • a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XXVI) being then formed Gi represents an oxyamine -O-NH 2 and G 2 represents an aldehyde, a surfactant of formula (I) in which G comprises a group G 'representing a group of formula (XXVII) being formed.
  • the choice of the groups reacting together: G'i and Gi on the one hand and G' 2 and G 2 on the other hand, can be carried out in the same way, by replacing the groups Gi or G 2 in the examples mentioned above by
  • Emulsions 1 and 2 used in the process may be prepared by the above-mentioned first method comprising steps (i), (ii), (iii) and (v) (by not performing step (iv) of addition of nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms).
  • the formulation is advantageously stable and not very toxic. It can be used as a transfection agent and / or as a nucleotide sequence delivery system capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms.
  • the formulation comprises an imaging agent
  • the invention relates to a method for introducing nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms in a eukaryotic cell, comprising contacting the eukaryotic cell with the formulation according to the invention.
  • This method is a transfection method.
  • the method of introduction can be performed in vitro.
  • the contacting of the eukaryotic cell with the formulation according to the invention takes place in a buffer solution, for example an OptiMEM ® medium.
  • the putting in contact lasts generally between 8 and 96 hours, typically of the order of 72 hours, at a temperature of about 37 ⁇ ⁇ .
  • the cells are recovered. Not only the droplets of the formulation according to the invention make it possible to efficiently transfect the cells, but in addition they are functionally active and make it possible to extinguish the expression of the gene of interest.
  • the endosomal escape would release the droplets and nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of RNA interference in the cytoplasm , therefore in the action site nucleotide sequences likely to modulate endogenous mechanisms of interference by RNA, which would prevent the degradation of these nucleotide sequences in the lysosome, allowing them to interfere with the target mRNA and therefore of thus extinguish expression of the gene of interest.
  • the formulation comprises a co-surfactant grafted with a biological targeting ligand.
  • a biological targeting ligand advantageously allows the introduction of nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms in eukaryotic cells that are usually resistant to transfection, that is to say known to be difficult to transfect, especially stem cells.
  • primary cells for example human fibroblasts or human endothelial cells
  • lymphocyte cell lines for example of the Jurkat type
  • neuroblastomas for example of the SK-N-SH type.
  • the biological targeting ligand makes it possible to facilitate the transfection of cells that are usually resistant to transfection by the formulation.
  • the formulation according to the invention is a system for in vitro or in vivo delivery of nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms.
  • the invention relates to the formulation defined above for its use for the prevention and / or treatment of a disease.
  • the disease is typically a disease for which an extinction of one or more genes is sought, such as:
  • AMD age-related macular degeneration
  • glaucoma glaucoma
  • congenital Pachyonychia congenital Pachyonychia
  • HCV hepatitis C virus
  • HAV human immunodeficiency virus
  • RSV respiratory syncytial virus
  • the formulation according to the invention protects the nucleotide sequences capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms of the patient's body (and of these proteins) to which the formulation is administered (in particular by avoiding its premature metabolism ).
  • the formulation may comprise a therapeutic agent for treating the disease, which makes it possible to benefit from a double therapeutic effect: that induced by the nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of interference RNA and that induced by the therapeutic agent.
  • a method of preventing and / or treating a disease comprising administering to a mammal, preferably a human, that needs an effective amount of the formulation as defined above is also a the present invention.
  • nanoemulsion is intended to mean a composition having at least two phases, generally an oily phase, and an aqueous phase, in which the average size of the dispersed phase is less than 1 micron, preferably from 10 to 500 nm and in particular from 20 to 200 nm, and most preferably from 50 to 200 nm (see article C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and J. Garcia-Celma, Curr Opin Colloid In, 2005, 10, 102-1 10).
  • the term "disperse phase” means the droplets comprising the optional oil / cationic surfactant (s) / solubilizing lipid / amphiphilic lipid / co-surfactant / l possible surfactant of formula (I) / the possible fusogenic lipid / the possible imaging agent / the possible therapeutic agent / the possible nucleotide sequences capable of modulating endogenous mechanisms of interfering RNA.
  • the dispersed phase is generally free of aqueous phase.
  • droplet encompasses both liquid oil droplets themselves as well as solid particles from oil-in-water emulsions in which the dispersed phase is solid. In the latter case, one often speaks also of solid emulsion.
  • lipid in this presentation refers to all the fatty substances or substances containing fatty acids present in fats of animal origin and in vegetable oils. They are hydrophobic or amphiphilic molecules mainly composed of carbon, hydrogen and oxygen and having a density lower than that of water. The lipids can be in the solid state at room temperature (25%), as in waxes, or liquid, as in oils.
  • phospholipid refers to lipids having a phosphate group, especially phosphoglycerides. Most often, the phospholipids comprise a hydrophilic end formed by the optionally substituted phosphate group and two hydrophobic ends formed by fatty acid chains. Among the phospholipids, mention will in particular be made of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phophatidylinositol, phosphatidyl serine and sphingomyelin.
  • lecithin refers to phosphatidylcholine, i.e. a lipid formed from choline, phosphate, glycerol and two fatty acids. It covers more widely phospholipids extracted from living, of plant or animal origin, insofar as they consist mainly of phosphatidylcholine. These lecithins generally constitute mixtures of lecithins carrying different fatty acids.
  • fatty acid refers to aliphatic carboxylic acids having a carbon chain of at least 4 carbon atoms. Natural fatty acids have a carbon chain of 4 to 28 carbon atoms (usually an even number). Long-chain fatty acids with a length of 14 to 22 carbons and a very long chain are called if there are more than 22 carbons.
  • surfactant is understood to mean compounds with an amphiphilic structure which gives them a particular affinity for the interfaces of the oil / water and water / oil type, which gives them the capacity to lower the free energy of these interfaces and to stabilize dispersed systems.
  • co-surfactant a surfactant acting in addition to a surfactant to further lower the energy of the interface.
  • hydrocarbon chain refers to a chain composed of carbon and hydrogen atoms, saturated or unsaturated (double or triple bond). Preferred hydrocarbon chains are alkyl or alkenyl.
  • alkylene is intended to denote a divalent aliphatic hydrocarbon group, saturated, linear or branched, preferably linear.
  • cyclic radical means a radical derived from a ring.
  • a phenylene radical is a divalent radical derived from a benzene group.
  • ring is meant a saturated, unsaturated or aromatic carbocycle or heterocycle (aryl or heteroaryl),
  • a carbocycle a ring composed of saturated carbon atoms (the preferred saturated carbocycles being in particular a cycloalkyl, such as a cyclopentyl or a cyclohexyl), unsaturated (for example a cyclohexene) or aromatic (that is to say a phenyl),
  • a heterocycle a cyclic group comprising, unless otherwise stated, from 5 to 6 atoms, and comprising one or more heteroatoms chosen from O, N and / or S.
  • Said heterocycle may be saturated or partially unsaturated and comprise one or more double bonds . This is called a heterocycloalkyl group. It can also be aromatic, comprising, unless otherwise stated, from 5 to 6 atoms and then represent a heteroaryl group.
  • pyrazolidinyl imidazolidinyl, tetrahydrothiophenyl, dithiolanyl, thiazolidinyl, tetrahydropyranyl, dioxanyl, morpholinyl, piperidyl, piperazinyl, tetrahydrothiopyranyl, thiomorpholinyl, dihydrofuranyl, 2-imidazolinyl, 2, -3-pyrrolinyl, pyrazolinyl, dihydrothiophenyl, dihydropyranyl, pyranyl, tetrahydropyridyl, dihydropyridyl, tetrahydropyrinidinyl, dihydrothiopyranyl, isoxazolidinyl, as heteroaryl, there may be mentioned especially the following representative groups: furyl, imidazolyl, isoxazoly
  • activated ester is meant a group of formula -CO-LG
  • activated carbonate means a group of formula -O-CO-LG where LG is a good leaving group chosen in particular from a chlorine, a imidazolyl, pentafluorophenolate, pentachlorophenolate, 2,4,5-trichlorophenolate, 2,4,6-trichlorophenolate, -O-succinimidyl, -O-benzotriazolyl, -O- (7-aza-benzotriazolyl) and -O - (4-nitrophenyl).
  • FIG. 1 represents a diagram illustrating the core / crown structure of a droplet of a formulation according to the invention ("final" formulation with a nucleotide sequence capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms).
  • 1 represents the continuous aqueous phase
  • 2 the crown (in part) of the droplet
  • 3 the heart (in part) of the droplet.
  • the amphiphilic lipid for example neutral phospholipid such as lecithin
  • the cationic surfactant cationic phospholipid DOTAP for example
  • the co-surfactant whose poly (ethylene oxide) chain folding is represented in the aqueous phase and the double-stranded nucleotide sequence, and capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms (siRNA for example).
  • siRNA capable of modulating endogenous RNA interference mechanisms
  • FIG. 2 represents a UV-revealed electrophoresis gel made after complexing siRNA with formulation B10 with the concentrations specified in Table 8. Scale and siRNA (control) are on the left.
  • Figure 3 gives the SiRNA amount (ng) results obtained by processing the electrophoresis data on the ImageJ software of the UV revealed electrophoresis gel of Figure 2.
  • FIG. 4 represents the intensity obtained on a Malvern ZetaSizer device as a function of the hydrodynamic diameter in nm for the free siRNA (comparison) and for three formulations according to the invention obtained by complexation with a N / P ratio: amount of positive charges due to the cationic surfactant in the formulation "Premix” (due to the charged nitrogen, hence the N of N / P), on the amount of negative charges provided by the siRNA (due to the phosphorus of SiRNA, hence the P of N / P) of 4/1, 8/1 or 16/1.
  • FIG. 5 represents a UV electrophoresis gel with, from left to right:
  • FIG. 6 represents a UV electrophoresis gel of a siRNA complex / formulation B10 just after complexation (TO) then 15 min, 45 min, 1 h 30, 3 h and 6 h after complexation.
  • the scale and siRNA (control) are on the left.
  • Figure 7 shows the decrease in FITC fluorescence intensity in% by transfecting cell lines with:
  • siRNA complex / cationic liposome formulation comprising DOTAP (58% wt), DOPE (18% wt), cholesterol (2% wt) and DSPE-PEG3000
  • FIG. 8 represents the fluorescence intensity (FITC) for 3 cell lines experimentally overexpressing the fluorescent protein GFP (for green fluorescent protein): U20S, PC3 and Hela for the complex Si / RNA formulation B10, the siRNA called siGFP being targeted against the mRNA coding for the GFP protein, and for the negative control (cells incubated with a B10 formulation complexed with a negative control siRNA, that is to say "inert" with no effect on the transcriptome of the cell called siAIIStar).
  • GFP for green fluorescent protein
  • FIG. 9 represents a UV-revealed electrophoretic gel produced after complexation of mimic-type synthetic microRNA with the formulation A3 with concentrations specified in Table 9.
  • the scale and the microRNAs Mimic (control) and the premix formulation A3 uncomplexed are on the left.
  • the final formulations resulting from the complexation of the premix formulation A3 and the Mimic with five different N / P ratios are on the right.
  • DOPE Avanti Polar
  • Soybean oil Croda
  • the hydrodynamic diameter of the droplets of the formulations as well as their zeta potential were measured by quasi-elastic light scattering by a ZetaSizer-type apparatus, Malvern.
  • the hydrodynamic diameter of the droplets was measured in a 0.1 X PBS solution, the zeta potential in 0.15 mM aqueous NaCl solution.
  • Sixteen different formulations were made, the compositions of which are shown in Tables 1 to 5.
  • % wt is a mass percentage. % mol. corresponds to a molar percentage.
  • Percentages "/ droplet” represent percentages relative to the whole (Lipoid / DOTAP / Myrj S40 / possibly DOPE / Suppocire NB / Soybean oil).
  • Percentages "/ crown” represent percentages relative to the set (Lipoid / DOTAP / Myrj S40 / possible DOPE).
  • the percentages "/ crown without PEG” represent percentages with respect to the whole (Lipoid / DOTAP / possible DOPE).
  • Percentages "/ heart” represent percentages relative to the whole (Suppocire NB / Soybean oil).
  • Lipoid S75-3 contains 65-75% phosphatidylcholine.
  • the aliphatic chains of the phospholipids are predominantly saturated (average composition: 12-16% of C16: 0, 80-85% of C18: 0, ⁇ 5% of C18: 1, ⁇ 2% of C18: 2).
  • Lipoid S75 comprises 65-75% phosphatidylcholine.
  • the aliphatic chains of the phospholipids are predominantly unsaturated (average composition: 17-20% C16: 0.25% C18: 0.8-12% C18: 1.58-65% C18: 2.4 6% C18: 3).
  • Lipoid S100-3 comprises> 94% phosphatidylcholine.
  • the aliphatic chains of the phospholipids are predominantly saturated (average composition: 12-16% C16: 0.88-88% C18: 0, ⁇ 2% C18: 1, ⁇ 1% C18: 2).
  • Formulations A1, B1, B4 and C1 are comparative examples since they do not comprise a cationic co-surfactant.
  • siRNA did not take place on the surface of the droplets, as expected.
  • Formulation B9 is a comparative example because it does not include amphiphilic lipid.
  • the emulsion could not be prepared. The following preparation process was followed:
  • the soybean oil, the NC suppocire, the amphiphilic lipid, the DOTAP, the optional DOPE, were weighed and then mixed with dichloromethane before being heated to 60 ° C. in order to obtain a homogeneous viscous solution. Dichloromethane makes it possible to promote solubilization. The solvents were then evaporated under vacuum.
  • the oily phase was about 40% (in viscous form) and the aqueous phase at about 70 ° C. (at the bath outlet). The aqueous phase was poured into the oily phase.
  • the vial containing the two phases was fixed in the sonication chamber of an AV505® sonifier (Sonics, Newton, USA).
  • the protocol consisted of performing sonication cycles (10 seconds of activity every 30 seconds) at a power of 100 W over a period of 40 minutes.
  • the droplets thus produced were then purified by dialysis (cut-off: 12 kDa, against 154 mM NaCl, overnight) to remove non-LNP lipid components. Finally, the formulation was sterilized by filtration on cellulose membrane.
  • the complexation consists of a simple mixing of the formulations prepared above and a solution of siRNA, all in a buffer.
  • the choice of buffer is a function of the intended application: for an in vitro study, the optimized culture medium for the transfection steps, OptiMEM, was used. For a complexation study, 5 mM Hepes buffer was used.
  • siRNA GFP-22 siRNA rhodamine (catalog No. 1 0221 76) (Qiagen) or siGFP (Sigma) was used (25 ⁇ g ml in 20 ⁇ l).
  • the mixture was stirred for 30 minutes at 600 rpm at room temperature (about 25 ° C.).
  • the negative charges provided by the siRNAs are offset by the positive charges of the formulation (i.e. the positive charges of the cationic surfactant DOTAP).
  • DOTAP which comprises only a single positive charge
  • a quantitative yield of complexation is obtained when the ratio of amount of positive charges due to the cationic surfactant in the formulation "premix" on the amount of negative charge provided by the siRNAs is greater than 8/1, as illustrated in FIGS. 2 and 3.
  • Figure 2 shows a UV-revealed electrophoresis gel made after complexing siRNA with the B10 formulation with concentrations specified in Table 8, mixing a solution of siRNA and the formulation in a 5 mM Hepes buffer. Prior to agarose gel deposition 1, 5%, 2 loading buffer was added to the assays. After 1 h 30 of electrophoresis at 100 V, the gel was immersed in GeIRed 3X. Finally, a UV revelation was performed.
  • FIGS. 2 and 3 show that for a ratio of quantity of positive charges due to the cationic surfactant in the "premix" formulation to the amount of negative charge contributed by the siRNAs greater than 8/1, there is no more free siRNA in the middle and that the siRNA has been completely complexed.
  • FIG. 4 represents the intensity obtained on a Malvern ZetaSizer apparatus as a function of the hydrodynamic diameter in nm for the free siRNA (comparison) and for three formulations according to the invention obtained by complexation with a ratio of quantity of positive charges due to the cationic surfactant in the "premix” formulation on the amount of negative charge provided by siRNAs of 4/1, 8/1 or 16/1.
  • the diameter is larger for free siRNA (comparison).
  • siRNA / droplet complex around 100 nm and a population larger size representing siRNAs in free form (arrow).
  • the complexation step was carried out with various formulations.
  • FIG. 5 represents a UV electrophoresis gel with, from left to right:
  • the yield is quantitative whether or not the formulation used includes DOPE.
  • siRNA siRNA release kinetics of the siRNA complex / formulation B10 prepared above were carried out in order to observe the evolution of the complexation over time and is illustrated in FIG. 6. Up to 3 hours after complexation, the siRNAs are not found in free form. At 6 o'clock, the siRNAs begin to be released. The complex is therefore stable for at least three hours.
  • GFP-22 siRNA rhodamine (catalog No. 1022176) (Qiagen)
  • Transfection was performed with a final siRNA concentration of 100 nM.
  • GFP-expressing cells were seeded in 12-well (25,000 cells / well) well plates treated with siRNA / Formulation complexes (B1, B6, B6 7 months after its preparation or B10) obtained above. The cells are then incubated for 72 hours at 37 ° C and then recovered for flow cytometric fluorescence intensity analysis to determine the effectiveness of the formulation as a transfection agent.
  • the active delivery of siRNA specifically inhibiting the expression of the GFP protein induces a decrease in the fluorescence provided by this protein.
  • the commercial transfection agent Lipofectamine RNAimax was used for comparison.
  • Figure 7 shows the decrease in FITC fluorescence intensity in% by transfecting cell lines with:
  • siRNA complex / formulation of cationic liposomes comprising DOTAP (58% wt), DOPE (18% wt), cholesterol (2% wt) and DSPE-PEG3000 (22% wt) (comparative).
  • formulations according to the invention thus allow an active delivery of siRNA inducing a relative extinction of the expression of the GFP gene.
  • DOPE in addition, by incorporating DOPE into the formulations, greater fluorescence quenching is visible, with DOPE promoting endosomal escape.
  • Synthetic microRNA complexation Preparation of "final” formulations comprising synthetic microRNA nucleotide sequences (mimic).
  • the complexation consists of a simple mixture of the premix A3 formulation prepared above and a solution of microRNA (miRIDIAN Mimic Human hashR612 (ThermoScientific REF # C-300937-01 Lot No. 13061 1)), all in a tampon.
  • the choice of buffer is a function of the intended application: for an in vitro study, the optimized culture medium for the transfection steps, OptiMEM ® , was used. For a complexation study, 5 mM HEPES buffer was used.
  • microRNA miRIDIAN Mimic Human has-miR612 (ThermoScientific REF # C-300937-01 Lot # 13061 1) was used.
  • the mixture was stirred for 30 minutes at 600 rpm, this at room temperature (about 25 C q).
  • the complexation was visualized by revealing an agarose gel obtained by electrophoresis, which allows to observe the migration of microRNAs. If there is a good complexation, then the droplets comprising the complexed microRNAs are heavier than the free microRNAs and will be visualized in the wells. If the complexation is less important, free microRNAs migrate to another position.
  • premix A3 formulation required to have a quantitative microRNA complexation yield has been optimized.
  • the negative charges provided by the microRNAs are offset by the positive charges of the premix formulation (i.e., the positive charges of the cationic surfactant DOTAP).
  • the premix formulation i.e., the positive charges of the cationic surfactant DOTAP.
  • DOTAP which comprises only a single positive charge
  • a quantitative yield of complexation is obtained when the ratio of amount of positive charges due to the cationic surfactant in the formulation "premix" the amount of negative charge provided by microRNAs (N / P ratio) is greater than 8/1, as previously with siRNAs.
  • FIG. 9 shows a UV-revealed electrophoresis gel made after complexing microRNA with Formulation A3 with concentrations specified in Table 9, by mixing a microRNA solution and Premix A3 formulation in 5 mM HEPES buffer. Before deposition on agarose gel 1, 5%, 2 ⁇ of loading buffer was added to the tests. After 1 h 30 of electrophoresis at 100 V, the gel was immersed in GeIRed 3X. Finally, a UV revelation was performed.
  • FIG. 9 shows that for a ratio of amount of positive charges due to the cationic surfactant in the "premix" formulation to the amount of negative charge contributed by the microRNAs greater than 8/1, there is no more free microRNA in the medium. and that the microRNA has been completely complexed, as shown in FIGS. 2 and 3 with siRNAs.

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Abstract

La présente invention concerne une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée, utile comme système de délivrance de séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence ou comme agent de transfection.

Description

FORMULATION POUR LA DELIVRANCE DE SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES SUSCEPTIBLES DE MODULER DES MECANISMES ENDOGENES D'ARN
INTERFERENTS La présente invention concerne une formulation de type nanoémulsion utile pour la délivrance de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents.
Le mécanisme d'interférence par ARN est un mécanisme d'inhibition post- transcriptionnelle de l'expression des gènes et repose sur de petits ARN interférents double brin qui dégradent spécifiquement un ARNm cible et inhibent très sélectivement et spécifiquement l'expression d'une protéine. Ce mécanisme se déroule dans le cytoplasme et met en jeu un complexe multi-protéique nommé le complexe RISC (en anglais RNA- induced silencing complex).
Depuis la découverte de ce mécanisme naturel, des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents sont utilisées dans de nombreux laboratoires académiques et/ou pharmaceutiques comme outils de recherche dans plusieurs disciplines de la biologie. Par exemple, les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents sont utilisées pour révéler de nouvelles cibles thérapeutiques dans de nombreuses pathologies. En inhibant très sélectivement et spécifiquement l'expression de telle ou telle protéine, on peut ainsi mettre en relief le rôle qu'elle joue dans le processus de développement de la pathologie. Néanmoins, l'introduction de matériel génétique exogène dans la cellule (la transfection) requiert une méthode adaptée physique, chimique ou biologique, pour permettre à ces séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence, qui sont généralement de grosses molécules (>10 kDa) et sont chargées négativement, de traverser la membrane plasmique chargée négativement qui constitue une véritable barrière.
Parmi les méthodes physiques, on peut citer l'électroporation ou la génération de pores dans la membrane par ultrasons. Parmi les méthodes biologiques, on peut citer le recours à des systèmes spécialisés dans la délivrance d'acides nucléiques tels que les virus. Parmi les méthodes chimiques, on peut citer l'utilisation :
- de lipoplexes (complexes formés entre des acides nucléiques et des lipides cationiques), par exemple la lipofectamine® 2000,
- de polyplexes (complexes formés entre des acides nucléiques et des polymères cationiques, par exemple le polyéthylèneimine PEI), - de complexes formés entre des acides nucléiques et des dendrimères, par exemple les dendrimères à base de poly(amidoamine) PANAM,
- de lipopolyplexes (complexes formés entre des acides nucléiques, des liposomes et des polymères), par exemple les SNALPs (« stable nucleic acid-lipid particles » en anglais), qui correspondent à des mélanges de lipides cationiques et auxiliaires formant des liposomes, stabilisés par des polymères de type polyethylene-glycol (PEG),
- de complexes formés entre des acides nucléiques et des nanoparticules polymériques à base de poly(DL-lactide-co-glycolide) PLGA.
A la connaissance des inventeurs, seul Park et al. (Molecular Pharmaceutics 5, 4, 622-631 , 2008) décrit l'utilisation de nanoparticules lipidiques pour la délivrance de siARN. Les nanoparticules lipidiques comprennent du cholestérol, de la 1 ,2-Dioléoyl-sn- Glycéro-3-Phosphoéthanolamine (DOPE) et un dérivé de siARN et ont été utilisées pour la transfection et l'extinction de la protéine GFP. Toutefois, pour éviter la fuite du siARN hors des nanoparticules, ceux-ci ont été greffés de manière covalente à celles-ci. Les siARN ont en effet été liés de manière covalente à une chaîne poly(oxyde d'éthylène) qui s'intercale dans les nanoparticules et permet de fixer les siARN. De plus, un marqueur fluorescent (agent d'imagerie) a également été greffé de manière covalente aux siARN pour le suivi de la transfection. Or, toute modification chimique du siARN est susceptible de le dénaturer. De plus, la technique de Park et al. nécessite de modifier chimiquement chaque siARN utilisé, ce qui est long et coûteux. Il existe donc un besoin de fournir un système de délivrance de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence dans lequel ceux-ci ne sont pas modifiés chimiquement.
De plus, la demande de brevet WO 2010/018223 décrit l'utilisation d'une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée comprenant un lipide amphiphile, un lipide solubilisant, un agent thérapeutique et un co-tensioactif comprenant au moins une chaîne composée de motifs d'oxyde d'alkylène, pour la délivrance d'un agent thérapeutique amphiphile ou lipophile. L'agent thérapeutique peut notamment être un siARN. Toutefois, les siARN étant des composés hydrophiles, ils se situeraient dans la phase aqueuse continue de la nanoémulsion, et non dans la phase dispersée. La formulation décrite dans cette demande n'est donc pas adaptée pour la délivrance de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents. De plus, les présents inventeurs ont mis en évidence que toutes les formulations décrites dans WO 2010/018223, et en particulier celles décrites dans les exemples, même en y intégrant des tensioactifs cationiques, ne sont pas adaptées pour la présente application, car le rendement de complexation est très faible, et la transfection ne serait pas efficace. En effet, comme expliqué ci-après, seules des formulations comprenant des proportions spécifiques de composants permettent la délivrance de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents.
Par ailleurs, des systèmes de délivrance d'acide désoxyribonucléique (ADN) à base d'émulsion huile dans l'eau ou de gouttelettes lipidiques sont connues. Dans ces systèmes, les gouttelettes lipidiques comprennent des tensioactifs cationiques, grâce auxquels l'ADN se lie aux gouttelettes par des interactions électrostatiques.
Par exemple, Del Pozo-Rodriguez et al. (International Journal of Pharmaceutics, 385, 2010, 157-162) ont observé une présence de fluorescence dans le foie et la rate de souris auxquelles ont été administrées par voie intraveineuse des nanoparticules lipidiques comprenant de l'ADN plasmidique nu (pADN) de la protéine fluorescente EGFP, du Precirol® ATO 5, du Tween 80, du chlorure de 1 ,2-dioleoyl-3-triméthylammoniumpropane (DOTAP) (tensioactif cationique) pour transfecter in vitro des cellules HEK293 et in vivo après administration à des souris.
Tabatt et al. (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57, 2004, 155) décrit l'utilisation de nanoparticules lipidiques solides comprenant du Compritol ATO 888 ou du cetylpalmitate, du Tween 80, du Span 85, un tensioactif cationique choisi parmi le chlorure d' alkyldimethylbenzylammonium (BA), le bromure de tétradécyltriméthylammonium (CTAB), le chlorure de hexadécylpyridinium (CPC), le bromure de diméthyldioctadécylammonium (DDAB), le chlorure de N,N-di-(b- stéaroyléthyl)-N,N-diméthyl-ammonium (Esterquat 1 , EQ 1 ) et le chlorure de 8, N-[1 -(2,3- dioléoyloxy)propyl]-N,N,Ntriméthylammonium (DOTAP) pour transfecter in vitro des cellules COS-1 .
Dans ces deux articles, du Tween 80 a été utilisé. Or, celui-ci présente une certaine toxicité vis-à-vis des cellules. De plus, le Tween 80 comprend des chaînes poly(oxyde d'éthylène) comprenant 20 unités d'oxyde d'éthylène. Comme expliqué ci-après, les inventeurs ont mis en évidence qu'un tensioactif ayant des chaînes poly(oxyde d'éthylène) plus longues (au moins 25 unités d'oxyde d'éthylène) est plus facile à formuler, est plus stable, et permet de protéger plus efficacement les séquences nucléotidiques comprises dans la formulation vis-à-vis du milieu extérieur. Enfin, les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence, en particulier le siARN, sont généralement moins stables que l'ADN. De plus, les activités biologiques d'ADN et de siARN sont très différentes, ce qui induit que les systèmes de délivrance adaptés pour l'ADN ne sont pas nécessairement les mêmes que ceux adaptés pour la délivrance de siARN. En particulier, même si dans les deux cas, un prérequis est un système de délivrance permettant de réaliser des transfections efficaces, cela n'est pas suffisant pour un système de délivrance de siARN qui ne sera intéressant que s'il permet d'éteindre le gène. Le développement de nouvelles formulations permettant la délivrance in vivo et in vitro de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence est donc nécessaire.
[Formulation]
A cet effet, selon un premier objet, la présente invention fournit une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée.
L'invention fournit une formulation comprenant une séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents qui permet la délivrance desdites séquences.
Elle fournit également une formulation, dite « prémix », exempte de séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence, qui permet la préparation d'une formulation comprenant une séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents par complexation d'une séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'interférence par ARN avec cette formulation « prémix ». Cette formulation « prémix » peut donc avantageusement être complexée avec une séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence adaptée selon l'utilisation désirée de la formulation finale.
[Formulation de type prémix]
Ainsi, selon un premier objet, la présente invention fournit une formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée, et comprenant : - au moins 5% molaire de lipide amphiphile,
- de 15 à 70% molaire d'au moins un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et
- de 10% à 55% molaire d'un co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins 25 unités d'oxyde d'éthylène,
- un lipide solubilisant comprenant au moins un glycéride d'acides gras,
- éventuellement un lipide fusogène,
où les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co- tensioactif / éventuel lipide fusogène).
Comme expliqué ci-après, les : lipide amphiphile / tensioactif cationique / co- tensioactif / éventuel lipide fusogène sont les principaux composants de la couronne des gouttelettes de la formulation « premix ».
L'émulsion est donc une émulsion de type huile dans l'eau. Elle peut être simple ou multiple, notamment en comportant dans la phase dispersée une seconde phase aqueuse. De préférence, elle est simple.
L'invention repose sur la découverte inattendue que la formulation décrite ci- dessus peut être utilisée comme agent de transfection et/ou pour la délivrance in vitro et in vivo de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence. La formulation présente avantageusement une bonne biodisponibilité et peut permettre de limiter la dégradation des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents généralement observée avec d'autres systèmes de délivrance, notamment la dégradation par des protéines.
De plus, la formulation est avantageusement stable : elle peut être stockée plusieurs heures sans qu'aucune dégradation ne soit observée.
• Tensioactif cationique
La formulation selon l'invention comprend un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R représentant une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, ledit groupe polymérique étant notamment choisi parmi :
- un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique.
- un polysaccharide, tel que du dextrane, de la cellulose ou du chitosan, ayant notamment des masses moléculaires comprises entre 0,5 et 20 kDa, par exemple entre 1 et 12 kDa,
- un polyamine, tel qu'un chitosan ou une polylysine, ayant notamment des masses moléculaires comprises entre 0,5 et 20 kDa, par exemple entre 1 et 12 kDa. Par «ester ou amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de hosphatidyléthanolamine», on entend un groupe de
formule
Figure imgf000008_0001
dans laquelle
- R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée
comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- A3 et A4 représentent O ou NH, et
- M représente H ou un cation. Les groupes cationiques du tensioactif cationique sont typiquement :
- des oniums choisis parmi les groupes ammonium, imidazolium, pyridinium, pyrrolidinium, pipéridinium, phosphonium ou sulfonium, ou
- des complexes métalliques entre un radical d'un groupe organique chélatant mono- ou multi-dentate, par exemple la phénantroline, la pyridine, l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), l'acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA), les porphyrines, les phtalocyanines, les clorines, les bactériochlorines complexé avec un cation inorganique, tel que Ca2+, Al3+, Ni+, Zn2+ Fe2+, Fe3+ ou Cu2+,
les groupes ammonium, notamment -+NMe3, -+NHMe2, -+NH2Me et -+NH3, en particulier -+NH3, étant particulièrement préféré.
Bien sûr, des anions sont associés au(x) groupe(s) cationique(s) pour que la formulation soit électriquement neutre. La nature des anions n'est pas limitée. A titre illustratif, on peut citer les halogénures, notamment le chlorure ou le bromure, ou le trifluoroacétate.
Dans le tensioactif cationique, la nature du groupe de liaison liant le(s) groupe(s) lipophile(s) au(x) groupe(s) hydrophile(s) comprenant au moins un groupe cationique n'est pas limitée. Des exemples de groupes de liaison sont fournis ci-dessous (groupe L).
Dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique a la formule (A) suivante [(Lipo)l-L-(Hydro)h]n+ ! (n/m) [A] (A)
dans laquelle:
I et h représentent des nombres entiers indépendamment compris entre 1 et 4,
- n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 , généralement compris entre 1 et 50, - Lipo représente un groupe lipophile tel que défini ci-dessus,
- Hydro représente un groupe hydrophile tel que défini ci-dessus comprenant au moins un groupe cationique,
- L représente un groupe de liaison,
- A représente un anion,
- m est un nombre entier représentant la charge de l'anion,
- n est un nombre entier représentant la charge du cation [(Lipo)rL-(Hydro)h].
Dans la formule (A) susmentionnée, de préférence L est tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(CO)-0-, -0-(CO)-NH- et -NH-(CO)-NH, -0-PO(OH)-0- ou un radical divalent cyclique de 5 à 6 atomes,
- un groupe Alk étant un alkylène comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et
un groupe Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk ou Z-Alk-Z où Alk et Z sont tels que définis ci- dessus et où les deux groupes Z du groupe Z-Alk-Z sont identiques ou différents, - lorsque l'un des groupes I ou h représente 1 , et l'autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate OP-(0-)3, un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0- et un radical trivalent cyclique de 5 à 6 atomes, - pour les autres valeurs de I et h, L est un radical multivalent cyclique de 5 à 6 atomes.
De manière particulièrement préférée, L est tel que :
- lorsque I et h représentent 1 , L est un groupe de liaison divalent choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(CO)-0-, -0-(CO)-NH- et -NH-(CO)-NH ou -0-PO(OH)-0-,
- lorsque l'un des groupes I ou h représente 1 , et l'autre représente 2, L est un groupe trivalent choisi parmi un groupe phosphate OP-(0-)3 et un groupe dérivé du glycérol de formule -0-CH2-CH-(0-)CH2-0-. Dans la formule (A) susmentionnée, I et h représentent de préférence indépendamment 1 ou 2.
Selon une première alternative, le groupe hydrophile du tensioactif cationique est un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique. Comme exemple de tels tensioactifs cationiques, on peut citer:
1 ) (Lipo)-(CH2)m1-NR30R3i R32, où Lipo est un groupe lipophile tel que défini ci-dessus, m1 représente 1 ou 2 et R30, R3i et R32 représentent indépendamment H, Me ou -CH2-CH2- OH,
2)
Figure imgf000010_0001
, où chaque Lipo est indépendamment un groupe lipophile tel que défini ci-dessus, et R33 représente H, Me ou -CH2-CH2-OH,
3)
Figure imgf000010_0002
, où Lipo est un groupe lipophile tel que défini ci-dessus, et R34, R35, R36, R37, R38, R39, R4o, 4i , R42 et R43 représentent indépendamment H, Me ou -CH2-CH2-OH.
Dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique est choisi parmi :
- le Λ/[1 -(2,3-dioléyloxy) propyl]-/V,/V,/V-triméthylammonium (DOTMA),
- le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP),
- le A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1 -propananium) (DMRIE), - le 1 -[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium (DOTIM), et
- le dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS) (sous forme protonée),
et est de préférence le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP). Selon une deuxième alternative, le groupe hydrophile du tensioactif cationique est un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique.
Lorsque le groupe hydrophile du tensioactif cationique est polymérique, le(s) groupe(s) cationique(s) peu(ven)t être un(des) groupe(s) terminal(aux) ou pendant(s). Par exemple :
- lorsque groupe polymérique hydrophile est un poly(oxyde d'éthylène), le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) généralement situé(s) sur un groupe terminal à l'extrémité de la chaîne poly(oxyde d'éthylène).
- lorsque le groupe polymérique hydrophile est du dextrane ou de la cellulose, le(s) groupe(s) cationiques est(sont) généralement situé(s) sur un groupe terminal à l'extrémité de la chaîne polysaccharidique.
- lorsque le groupe polymérique hydrophile est du chitosan, le(s) groupe(s) cationiques est(sont) généralement un(des) groupe(s) pendant(s), en particulier des groupes - NH3 + présents en milieu acide sur le chitosan.
Dans un mode de réalisation, le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) un(des) groupe(s) terminal(aux). En effet, les groupes pendants de tensioactifs anioniques adjacents en surface des gouttelettes de la phase dispersée se repoussent par interactions électrostatiques et, par conséquent, les formulations comprenant des tensioactifs cationiques dont le groupe Hydro comprend des groupes pendants sont généralement moins stables.
Dans un autre mode de réalisation, le(s) groupe(s) cationique(s) est(sont) un(des) groupe(s) pendant(s). Il est avantageusement possible d'utiliser un tensioactif cationique dont le groupe hydrophile comprend plusieurs groupes cationiques pendants, et donc d'obtenir une formulation plus chargée positivement, et qui permettra d'autant mieux la complexation d'espèces négatives comme les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents.
Le groupe polymérique hydrophile préféré est un radical d'un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique.
Ainsi, dans un mode de réalisation, le tensioactif cationique a l'une des formules suivantes :
Figure imgf000012_0001
dans lesquelles :
- Ri , R2, R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- A1 ; A2, A3 et A4 représentent O ou NH,
- m, n, o et p représentent indépendamment des nombres entiers de 3 à 500, de préférence 20 à 200, et
- a représente un nombre entier de 20 à 120,
- M représente H ou un cation,
- Aio, An , Ai2 et Ai3 représentent indépendamment un groupe -+NR20R2-| R22, dans lequel R20, R21 et R22 représentent indépendamment H, Me ou -CH2-CH2-OH.
Dans un mode de réalisation, dans la formule (AN), An représente -+NH3 et le tensioactif cationique a la formule suivante :
Figure imgf000012_0002
dans laquelle A2, R2 et n sont tels que définis ci-dessus. De préférence, dans la formule (AN), R2 représente Ci7H35.
Sans vouloir être liés à une théorie particulière, la présence du groupe polymérique hydrophile permettrait : - de stabiliser la formulation, et
- de protéger les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents localisés à la surface des gouttelettes des protéines du milieu dans lequel la formulation est administrée/utilisée, et donc la dégradation des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents par ces protéines.
Selon une troisième alternative, la formulation selon l'invention comprend au moins deux tensioactifs cationiques, dont :
- l'un est choisi parmi :
- le Λ/[1 -(2,3-dioléyloxy) propyl]-/V,/V,/V-triméthylammonium (DOTMA),
le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP),
- le A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1 -propananium) (DMRIE),
- le 1 -[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium chloride (DOTIM), et
- le dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS),
et est de préférence le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane (DOTAP), et
- l'autre est un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde de propylène), et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, ledit groupe polymérique étant choisi parmi :
- un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique,
- un polysaccharide, tel que du dextrane, de la cellulose ou du chitosan,
- un polyamine, tel qu'un chitosan ou une polylysine,
et est de préférence un poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins un groupe cationique. Dans un mode de réalisation, la formulation selon l'invention comprend, à titre de tensioactifs cationiques :
- du 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane, et
- un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et comprenant au moins un groupe cationique. Dans un mode de réalisation, la formulation selon l'invention comprend, à titre de tensioactifs cationiques :
- du 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane, et
un composé de formule (AN) telle que définie ci-dessus, notamment de formule (AV). Le tensioactif cationique se situe dans la couronne des gouttelettes de la formulation. Il se lie par interactions électrostatiques aux séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence et permet de maintenir les siARN à la surface des gouttelettes. La formulation comprend de 15 à 70% molaire d'au moins un tensioactif cationique par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène). En dessous de 15%, la formulation ne comprend pas assez de charges positives et la complexation ultérieure de la formulation « prémix » avec les séquences nucléotidiques (chargées négativement) est insuffisante. Au-delà de 70%, les formulations ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n'est pas possible car les gouttelettes coalescent pour former deux phases), et les gouttelettes deviennent généralement toxiques pour les cellules.
Ces proportions sont particulièrement adaptées pour obtenir une complexation efficace des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents, et donc une bonne délivrance et/ou transfection. • Lipide fusoqène (« helper lipid » en anglais)
Dans un mode de réalisation, la formulation selon l'invention comprend un lipide fusogène, qui est susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale, dit lipide « helper ». De préférence, ce lipide est le dioléylphosphatidyléthanolamine (DOPE).
Ce lipide permet de favoriser l'échappement endosomal des gouttelettes de la formulation selon l'invention, et donc des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'interférence par ARN qu'elles contiennent, et améliore généralement l'efficacité d'extinction du gène d'intérêt.
Le lipide susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale se situe dans la couronne des gouttelettes de la formulation. · lipide amphiphile
La formulation comprend au moins un lipide amphiphile, qui se situe dans la couronne des gouttelettes de la formulation. Afin de former une nanoémulsion stable, il est nécessaire d'inclure dans la composition au moins un lipide amphiphile à titre de tensioactif. La nature amphiphile du tensioactif assure la stabilisation des gouttelettes d'huile au sein de la phase continue aqueuse. En dessous de 5% molaire de lipide amphiphile par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène), les formulations ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n'est pas possible car les gouttelettes coalescent pour former deux phases).
Généralement, la formulation comprend de 5 à 85% molaire, de préférence de 5 à 75% molaire, en particulier de 5 à 50% molaire et tout particulièrement de 8 à 30% molaire de lipide amphiphile par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène).
La quantité de lipide amphiphile contribue avantageusement à contrôler la taille de la phase dispersée de la nanoémulsion. Les lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan vendus sous les dénominations Span® par la société Sigma; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs non-ioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween® par la société ICI Americas, Inc. et Triton® par la société Union Carbide Corp.; les esters de sucre tels que les mono- et di- laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges.
Les phospholipides sont les lipides amphiphiles préférés.
La lécithine est le lipide amphiphile particulièrement préféré.
• lipide solubilisant
La formulation comprend par ailleurs un lipide solubilisant comprenant au moins un glycéride d'acides gras, qui se situe dans la phase dispersée de la nanoémulsion, plus précisément dans le cœur des gouttelettes. Ce composé a pour mission principale de solubiliser le lipide amphiphile, peu soluble, dans la phase dispersée de la nanoémulsion.
Le lipide solubilisant est un lipide présentant une affinité avec le lipide amphiphile suffisante pour permettre sa solubilisation. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante.
Dans le cas où le lipide amphiphile est un phospholipide, il peut s'agir notamment :
- d'esters d'acides gras et d'alcool gras, comme le cétylpalmitate, ou
- de dérivés du glycérol, et en particulier de glycérides obtenues par estérification de glycérol avec des acides gras.
Le lipide solubilisant utilisé est avantageusement choisi en fonction du lipide amphiphile utilisé. Il présentera généralement une structure chimique proche, afin d'assurer la solubilisation recherchée. Il peut s'agir d'une huile ou d'une cire. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20 ^), mais liquide à la température du corps (37 <C).
Les lipides solubilisants préférés, en particulier pour les phospholipides, sont les esters d'acides gras et d'alcool gras, comme le cétylpalmitate, ou les glycérides d'acides gras, notamment d'acides gras saturés, et en particulier d'acides gras saturés comportant 8 à 18 atomes de carbone, encore préféré 12 à 18 atomes de carbone. Avantageusement, il s'agit d'un mélange de différents glycérides.
De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant au moins 10% en poids d'acides gras en C12, au moins 5% en poids d'acides gras en C14, au moins 5% en poids d'acides gras en C16 et au moins 5% en poids d'acides gras en C18.
De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comportant 0% à 20% en poids d'acides gras en C8, 0% à 20% en poids d'acides gras en C10, 10% à 70% en poids d'acides gras en C12, 5% à 30% en poids d'acides gras en C14, 5% à 30% en poids d'acides gras en C16 et 5% à 30% en poids d'acides gras en C18.
Particulièrement préférés sont les mélanges de glycérides semi-synthétiques solides à température ambiante vendus sous la dénomination commerciale Suppocire®NC par la société Gattefossé et approuvé pour l'injection chez l'homme. Les Suppocire® de type N sont obtenues par estérification directe d'acides gras et de glycérol. Il s'agit de glycérides hémi-synthétiques d'acides gras saturés de C8 à C18, dont la composition quali- quantitative est indiquée dans le tableau ci-dessous.
Les lipides solubilisants précités permettent d'obtenir une formulation sous forme de nanoémulsion avantageusement stable. Sans vouloir être lié à une théorie particulière, il est supposé que les lipides solubilisants précités permettent d'obtenir des gouttelettes dans la nanoémulsion présentant un cœur amorphe. Le cœur ainsi obtenu présente une viscosité interne élevée sans pour autant présenter de cristallinité. Or, la cristallisation est néfaste pour la stabilité de la nanoémulsion car elle conduit généralement à une agrégation des gouttelettes et/ou à une expulsion des molécules encapsulées à l'extérieur des gouttelettes. Ces propriétés physiques favorisent la stabilité physique de la nanoémulsion.
La quantité de lipide solubilisant peut varier largement en fonction de la nature et de la quantité de lipide amphiphile présent dans la phase dispersée. Généralement, le cœur des gouttelettes (comprenant le lipide solubilisant, l'éventuelle huile, l'éventuel agent d'imagerie, l'éventuel agent thérapeutique s'il est lipophile) comprend de 1 à 100% en poids, de préférence de 5 à 80% en poids et tout particulièrement de 40 à 75% en poids de lipide solubilisant. Composition en acides gras du Suppocire NC de Gattefossé
Figure imgf000018_0001
• huile La phase dispersée peut comporter par ailleurs une ou plusieurs autres huiles, qui se situe(nt) dans le cœur des gouttelettes.
Les huiles utilisées présentent de préférence une balance hydrophile-lipophile (HLB) inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6. Avantageusement, les huiles sont utilisées sans modification chimique ou physique préalablement à la formation de l'émulsion.
Les huiles sont généralement choisies parmi les huiles biocompatibles, et en particulier parmi les huiles d'origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d'origine naturelle végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de lin, de palme, d'arachide, d'olives, de pépin de raisins et de tournesol ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, di glycérides et les mono glycérides. Ces huiles peuvent être de premières expressions, raffinées ou inter-estérifiées.
Les huiles préférées sont l'huile de soja et l'huile de lin.
Généralement, si présente, l'huile sera contenue dans le cœur des gouttelettes (comprenant le lipide solubilisant, l'éventuelle huile, l'éventuel agent d'imagerie, l'éventuel agent thérapeutique s'il est lipophile) dans une proportion allant de 1 à 80% en poids, de préférence entre 5 et 50 % en poids et tout particulièrement 10 à 30% en poids.
La phase dispersée peut contenir en outre d'autres additifs tels que des colorants, stabilisants, conservateurs ou d'autres principes actifs, en quantité appropriée.
• Co-tensioactif
La formulation comprend un co-tensioactif, qui permet de stabiliser la nanoémulsion. Les co-tensioactifs utilisables dans les formulations utilisées dans l'invention sont généralement des tensioactifs hydrosolubles. Ils comprennent au moins une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins 25, notamment au moins 30, de préférence au moins 35, unités d'oxyde d'éthylène. Le nombre d'unités d'oxyde d'éthylène est généralement inférieur à 500.
Des formulations comprenant un co-tensioactif comprenant une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant moins de 25 unités d'oxyde d'éthylène ne sont en effet pas stables. Généralement, il n'est même pas possible de préparer la nanoémulsion.
Ces nombres d'unités sont en effet particulièrement adaptés pour éviter la fuite des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents hors des gouttelettes.
En effet, les inventeurs ont observé qu'une formulation ne comprenant pas un co- tensioactif n'est pas suffisamment stable.
De plus, sans vouloir être liés à une théorie particulière, la présence de la chaîne composée de motifs d'oxyde d'éthylène du co-tensioactif permettrait de protéger les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents localisées à la surface des gouttelettes des protéines du milieu dans lequel la formulation est administrée/utilisée, et donc la dégradation dédites séquences nucléotidiques par ces protéines.
A titre d'exemple de co-tensioactifs, on peut en particulier citer les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Brij® (par exemple Brij® 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj® par la société ICI Americas Inc. (par exemple Myrj® 45, 52, 53 ou 59) et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic® par la société BASF AG (par exemple Pluronic® F68, F127, L64, L61 , 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 ou 25R4 ) ou les produits vendus sous la dénomination commerciale Synperonic® par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic® PE/F68, PE/L61 ou PE/L64).
Ainsi, le co-tensioactif se situe à la fois dans la phase aqueuse continue et dans la phase dispersée. En effet, la partie hydrophobe du co-tensioactif s'insère dans les gouttelettes de la phase dispersée, alors que les chaînes polyalcoxylées sont dans la phase aqueuse continue. Dans la présente demande, les pourcentages massiques de phase dispersée décrits sont calculés en considérant que le co-tensioactif appartient à la phase dispersée. La formulation comprend de 10% à 55% molaire de co-tensioactif par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co-tensioactif / éventuel lipide fusogène). En dessous de 10%, les formulations ne sont pas stables, et ne peuvent généralement même pas être formulées (la formation de la nanoémulsion n'est pas possible car les gouttelettes coalescent pour former deux phases). Au-delà de 55%, la complexation ultérieure de la formation « prémix » avec les séquences nucléotidiques n'a pas lieu, probablement car les charges positives du tensioactif cationique sont masquées par les chaînes poly(oxyde d'éthylène) du co-tensioactif, et donc plus accessibles pour se lier par liaison électrostatique aux séquences nucléotidiques.
Le co-tensioactif peut par ailleurs présenter d'autres effets dans l'application envisagée de la nanoémulsion.
Selon un mode de réalisation, la phase dispersée de la nanoémulsion est greffée en surface avec des molécules d'intérêts tels que des ligands biologiques, afin d'augmenter le ciblage spécifique d'un organe. Un tel greffage permet une reconnaissance spécifique de certaines cellules ou de certains organes en favorisant l'internalisation des gouttelettes de la formulation selon l'invention par les cellules cibles qui expriment le récepteur en surface. Il est ainsi possible de transfecter des cellules connues comme étant résistantes aux agents de transfection de l'art antérieur. De préférence, le greffage en surface est réalisé par couplage des molécules d'intérêts ou de leurs précurseurs avec un composé amphiphile, notamment avec le co-tensioactif. La nanoémulsion comprend alors un co- tensioactif greffé. Dans ce cas, le co-tensioactif joue le rôle d'un espaceur permettant d'accommoder les molécules d'intérêt en surface.
Les molécules d'intérêt peuvent être par exemple :
- des ligands biologiques de ciblage tels que des anticorps, peptides, saccharides, aptamères, oligonucléotides ou des composés comme l'acide folique ;
- un agent de furtivité : une entité ajoutée afin de conférer à la nanoémulsion une furtivité vis-à-vis du système immunitaire, d'augmenter son temps de circulation dans l'organisme, et de ralentir son élimination.
Par exemple, lorsque le ligand biologique est un peptide comprenant une ou plusieurs cystéine, le greffage à la chaîne oxyde d'alkylène du tensioactif peut être assuré par couplage thiol maléimide. • aqent d'imaqerie
Dans un mode de réalisation, la formulation comprend un agent d'imagerie, qui permet avantageusement de visualiser la distribution des gouttelettes dans les cellules ou le corps du patient, et donc la distribution des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence.
L'agent d'imagerie peut notamment être utilisé dans les imageries de type :
- tomographie à émission de positons (Positron Emission Tomography (PET) en anglais) (l'agent d'imagerie pouvant être un composé comprenant un radionucléide, tel que 8F, C, un chélate de cations métalliques 68Ga, 64Cu),
- tomographie d'émission monophotonique (TEMP) (Single photon émission computed tomography (SPECT) en anglais) (l'agent d'imagerie pouvant être un composé comprenant un radionucléide par exemple 23l, ou un chélate de 99mTc ou In),
- imagerie par résonance magnétique (IRM) (l'agent d'imagerie pouvant être un chélate de gadolinium ou un nanocristal magnétique tel qu'un nanocristal d'oxyde de fer, d'oxyde de manganèse ou de fer-platine FePt),
- imagerie optique ou imagerie aux rayons X (l'agent d'imagerie pouvant être un fluorophore lipophile ou un agent de contraste, par exemple une molécule iodée telle que l'iopamidol, l'amidotrizoate, ou des nanoparticules d'or).
De préférence, l'agent d'imagerie est un fluorophore lipophile permettant de réaliser de l'imagerie optique.
La nature du ou des fluorophores lipophiles utilisables n'est pas critique à partir du moment où ils sont compatibles avec l'imagerie in vivo (c'est à dire qu'ils sont biocompatibles et non toxiques). De préférence, les fluorophores utilisés comme agent d'imagerie absorbent et émettent dans le visible ou le proche infrarouge. Pour l'imagerie non invasive dans un tissu ou un organisme vivant (animal, homme) les fluorophores préférés absorbent et émettent dans le proche infrarouge. En effet, pour que la lumière d'excitation et la lumière émise par le fluorophore puissent mieux traverser les tissus, il convient d'utiliser des fluorophores absorbant et émettant dans le proche infrarouge, c'est- à-dire à une longueur d'onde comprise entre 640 et 900 nm.
A titre de fluorophore lipophile on peut par exemple citer les composés décrits dans le chapitre 13 ("Probes for Lipids and Membranes") du catalogue InVitrogen. De façon plus précise, on peut notamment citer, à titre de fluorophore, le vert d'indocyanine (ICG), les analogues d'acides gras et les phospholipides fonctionnalisés par un groupement fluorescent tels que les produits fluorescents vendus sous les dénominations commerciales Bodipy (R) tels que le Bodipy (R) 665/676 (Ex/Em.) ; les dérivés lipophiles de carbocyanines telles que le perchlorate de 1 ,1 '--dioctadécyl-3,3,3',3'- tétraméthylindodicarbocyanine (DiD), par exemple vendu sous la référence D-307, le perchlorate de 3,3'-dihexadecyloxacarbocyanine (DiO), par exemple vendu sous la référence D1 125, le perchlorate de 1 ,1 '-dihexadecyl-3.3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine (Dil), par exemple vendu sous la référence D384; les sondes fluorescentes dérivées de sphingolipides, de stéroïdes ou de lipopolysaccharides tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales BODIPY ® TR céramides, BODIPY ® FL C5- lactosylcéramide, BODIPY ® FL C5-ganglioside, BODIPY ® FL cérébrosides ; les dérivés amphiphiles de cyanines, de rhodamines, de fluorescéines ou de coumarines tels que l'octadécyl rhodamine B, l'octadécyl ester de fluorescéine et la 4-heptadécyl-7- hydroxycoumarine ; et le diphénylhexatriène (DPH) et ses dérivés ; l'ensemble de ces produits étant vendus par la société Invitrogen.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, le fluorophore est le vert d'indocyanine, le perchlorate de 1 ,1 '-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindodicarbocyanine, le perchlorate de 3,3'-dihexadecyloxacarbocyanine, ou le perchlorate de 1 ,1 '-dihexadecyl- 3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine.
• agent thérapeutique La formulation selon l'invention peut comporter un agent thérapeutique.
Les agents thérapeutiques susceptibles d'être encapsulés dans la nanoémulsion selon l'invention comprennent en particulier les principes actifs agissant par voie chimique, biologique ou physique. Ainsi, il peut s'agir de principes actifs pharmaceutiques ou d'agents biologiques tels que de l'ADN, des protéines, peptides ou anticorps ou encore des agents utiles pour des thérapies physiques tels que des composés utiles pour la thermothérapie, les composés relarguant de l'oxygène singulet lorsqu'ils sont excités par une lumière utiles pour la photothérapie et des agents radioactifs. De préférence, il s'agit de principes actifs administrés de façon parentérale.
Selon son affinité lipophile ou amphiphile, l'agent thérapeutique sera encapsulé par la phase dispersée ou se situera à l'interface des deux phases.
La nature des agents thérapeutiques encapsulés dans la nanoémulsion n'est pas particulièrement limitée. Cependant, la nanoémulsion est particulièrement intéressante pour des composés peu solubles, qui sont difficiles à formuler dans les systèmes d'administration classiques et pour les principes actifs utiles pour la photothérapie, dont le rendement quantique peut être préservé. Du fait des conditions douces du procédé de préparation, la formulation décrite est particulièrement intéressante pour l'encapsulation d'agents thérapeutiques qui se dégradent à température élevée.
Parmi les principes actifs pharmaceutiques intéressants comme agents thérapeutiques, on peut citer en particulier les agents utilisés dans le traitement du SIDA, les agents utilisés dans le traitement des maladies cardiaques, les analgésiques, les anesthésiques, les anorexigènes, les anthelmintiques, les antiallergiques, les antiangineux, les antiarythmisants, les anticholinergiques, les anticoagulants, les antidépresseurs, les antidiabétiques, les antidiurétiques, les antiémétiques, les anticonvulsivants, les antifongiques, les antihistaminiques, les antihypertenseurs, les antiinflammatoires, les anti-migraineux, les antimuscariniques, les antimycobactériens, les anticancéreux y compris les antiparkinsoniens, les antithyroïdiens, les antiviraux, les astringents, les agents bloquants, les produits sanguins, les substituts sanguins, les agents inotropes cardiaques, les agents cardiovasculaires, les agents du système nerveux central, les chélateurs, les agents de chimiothérapie, les facteurs de croissance hématopoïétiques, les corticostéroïdes, les antitussifs, les agents dermatologiques, les diurétiques, les dopaminergiques, les inhibiteurs de l'élastase, les agents endocrines, les alkaloïdes de l'ergot, les expectorants, les agents gastro-intestinaux, les agents génito- urinaires, le facteur de déclenchement de l'hormone de croissance, les hormones de croissance, les agents hématologiques, les agents hématopoïétiques, les hémostatiques, les hormones, les immunosuppresseurs, les interleukines, les analogues d'interleukines, les agents de régulation des lipides, la gonadolibérine, les myorelaxants, les antagonistes narcotiques, les nutriments, les agents nutritifs, les thérapies oncologiques, les nitrates organiques, les vagomimétiques, les prostaglandines, les antibiotiques, les agents rénaux, les agents respiratoires, les sédatifs, les hormones sexuelles, les stimulants, les sympathomimétiques, les anti-infectieux systémiques, le tacrolimus, les agents thrombolytiques, les agents thyroïdiens, les traitements pour les troubles de l'attention, les vasodilatateurs, les xanthines, les agents diminuant le cholestérol. Particulièrement visés sont les anticancéreux tels que le taxol (paclitaxel), la doxorubicine et le cisplatine.
Parmi les agents physiques ou chimiques, on peut citer notamment les isotopes radioactifs et les photo-sensibilisateurs.
Parmi les photo-sensibilisateurs, on peut citer notamment ceux appartenant à la classe des tétrapyrroles comme les porphyrines, les bactériochlorines, les phtalocyanines, les chlorines, les purpurines, les porphycènes, les phéophorbides, ou encore ceux appartenant à la classe des texaphyrines ou des hypericines. Parmi les photosensibilisateurs de première génération, on peut mentionner l'hémato-porphyrine et un mélange de dérivés d'hémato-porphyrine (HpD) (vendu sous la marque commerciale Photofrin® par Axcan Pharma). Parmi les photo-sensibilisateurs de seconde génération, on peut mentionner le méta-tetra-hydroxyphenyl chlorine (mTHPC ; nom commercial Foscan®, Biolitec AG) et le dérivé monoacide du cycle A de la benzoporphyrine (BPD-MA vendu sous la marque commerciale Visudyne® par QLT et Novartis Opthalmics). Les formulations des photo-sensibilisateurs de seconde génération qui associent à ces photosensibilisateurs une molécule (lipide, peptide, sucre etc..) qualifiée de transporteur qui permet leur acheminement sélectif au niveau du tissu tumoral sont appelées photosensibilisateurs de troisième génération.
Parmi les agents biologiques, on peut mentionner les oligonucléotides, de l'ADN, de l'ARN, des siARN, les peptides et les protéines et les saccharides.
Bien entendu, l'agent thérapeutique peut être formulé directement sous sa forme active ou sous forme d'un prodrug. Par ailleurs, il est envisagé que plusieurs agents thérapeutiques puissent être formulés en association dans la nanoémulsion.
La quantité d'agent thérapeutique dépend de l'application visée ainsi que de la nature de l'agent. Toutefois, on cherchera généralement à formuler la nanoémulsion avec une concentration maximale en agent thérapeutique, notamment lorsqu'il s'agit d'agents thérapeutiques peu solubles, afin de limiter le volume et/ou la durée d'administration au patient.
Or il a été constaté que la présence du lipide solubilisant dans la phase dispersée permet d'incorporer une quantité importante de composés mêmes hydrophobes ou amphiphiles.
• Proportion de cœur dans les gouttelettes
Généralement, la proportion molaire des composants du cœur des gouttelettes par rapport aux composants des gouttelettes est de 10 à 80%, notamment de 25 à 75%, de préférence de 33,35 à 73,99%. Autrement dit, la proportion molaire (mol/mol) de l'ensemble (lipide solubilisant / éventuelle huile / éventuel agent d'imagerie / éventuel agent thérapeutique lipophile) par rapport à la phase dispersée (c'est-à-dire à tous les composants de la phase dispersée) est généralement de 10 à 80%, notamment de 25 à 75%, de préférence de 33,35 à 73,99%.
Généralement, la proportion massique (wt/wt) des composants du cœur des gouttelettes par rapport aux composants des gouttelettes est de 10 à 60%, notamment de 20 à 60%, de préférence de 23,53 à 59,51 %. Autrement dit, la proportion massique de l'ensemble (lipide solubilisant / éventuelle huile / éventuel agent d'imagerie / éventuel agent thérapeutique lipophile) par rapport à la phase dispersée (c'est-à-dire à tous les composants de la phase dispersée) est généralement de 10 à 60%, notamment de 20 à 60%, de préférence de 23,53 à 59,51 %.
Ces proportions molaires et/ou massiques sont particulièrement adaptées pour que la formulation « premix » soit stable au stockage, notamment qu'elle soit stable en étant stockée plus de 28 jours à 40 °C, voire plus de 300 jours à 40 ^. La stabilité peut notamment être mesurée en suivant la taille des gouttelettes, leur index de polydispersité et/ou leur potentiel zêta (par exemple par diffusion quasi-élastique de la lumière par un appareil de type ZetaSizer, Malvern). Cette stabilité de la formulation « premix » est importante pour les applications envisagées. En effet, comme détaillé ci-après, la formulation « premix » est utilisée pour préparer la formulation « finale » comprenant une séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'interférence par ARN. Il est particulièrement intéressant de pouvoir stocker la formulation « premix » et d'effectuer la complexation avec ladite séquence juste avant utilisation de la formulation « finale ».
• Phase aqueuse
La phase aqueuse de la nanoémulsion utilisée dans l'invention est de préférence constituée d'eau et/ou d'un tampon tel qu'un tampon phosphate comme par exemple du PBS ("Phosphate Buffer Saline") ou d'une solution saline, notamment de chlorure de sodium.
Selon un mode de réalisation, la phase aqueuse continue comporte également un agent épaississant tel que du glycérol, un saccharide, oligosaccharide ou polysaccharide, une gomme ou encore une protéine, de préférence du glycérol. En effet, l'utilisation d'une phase continue de viscosité plus élevée facilite l'émulsification et permet de ce fait de réduire le temps de sonication.
La phase aqueuse comporte avantageusement de 0 à 50% en poids, de préférence de 1 à 30% en poids et tout particulièrement de 5 à 20% en poids d'agent épaississant.
Bien entendu, la phase aqueuse peut contenir en outre d'autres additifs tels que des colorants, stabilisants et conservateurs en quantité appropriée. La proportion de phase dispersée et de phase aqueuse est très variable. Cependant, le plus souvent, les nanoémulsions seront préparées avec 1 à 50%, de préférence 5 à 40% et tout particulièrement 10 à 30% en poids de phase dispersée et 50 à 99%, de préférence 60 à 95% et tout particulièrement 70 à 90 % en poids de phase aqueuse.
• Nanoémulsion sous forme de gel
Dans un mode de réalisation, la viscosité de la formulation est supérieure à 1 poise (0,1 Pa.s) à 25°C.
Dans ce mode de réalisation, la nanoémulsion utilisée se présente sous forme de « gel ». On entend par le terme « gel » habituellement un système biphasique solide- liquide thermodynamiquement stable, constitué d'un double réseau interpénétré continu tridimensionnel, l'un solide et le second liquide. Un tel gel est un système biphasique liquide-solide dont le réseau solide retient une phase liquide. Bien que les gels puissent être considérés comme solides, ils présentent des propriétés propres aux solides (rigidité structurelle, élasticité à la déformation) comme aux liquides (pression de vapeur, de compressibilité et conductivité électrique).
Dans le cas d'une nanoémulsion sous forme de gel, le réseau tridimensionnel est formé par les gouttelettes, les interstices entre gouttelettes étant remplis de phase continue. Les liaisons entre les unités du réseau, à savoir les gouttelettes, reposent principalement sur des interactions électrostatiques (paires d'ions). Ces interactions électrostatiques existent principalement entre les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence et les tensioactifs cationiques de gouttelettes adjacentes.
Une nanoémulsion sous forme de gel montre donc une résistance à la pression et est capable de maintenir une forme définie, ce qui peut être avantageux selon la forme et/ou la voie d'administration souhaitée.
Pour mettre en évidence que la nanoémulsion est sous forme de gel, on peut réaliser des études rhéologiques permettant d'évaluer les propriétés viscoélastiques, et/ou des études plus structurelles montrant les liaisons entre les gouttelettes formant le réseau tridimensionnel (diffraction aux rayons X, neutrons...). En effet, une nanoémulsion sous forme de gel possède une viscosité et un coefficient d'élasticité plus important qu'une nanoémulsion liquide. La nanoémulsion sous forme de gel peut, en fonction de la concentration de gouttelettes et donc de la fraction massique en phase dispersée, se trouver à l'état de liquide visqueux, de solide viscoélastique ou de solide élastique. Par rapport à la phase dispersante aqueuse, dont la viscosité est proche de celle de l'eau (1 mPa.s à 25°C), la nanoémulsion est considérée comme un liquide visqueux lorsque sa viscosité est 10 fois plus élevée que celle de l'eau, soit > 10 mPa.s à 25qC. Par ailleurs, lorsque l'on procède à la mesure rhéologique des modules de G' (module de conservation en cisaillement) et G" (module de perte en cisaillement), on considère que la nanoémulsion est sous forme d'un liquide visqueux lorsque G" >G'. Lorsque G' devient proche de G", la nanoémulsion est à l'état de solide viscoélastique. Lorsque G" < G', on est à l'état de solide élastique. Dans ce mode de réalisation, la nanoémulsion se présente de préférence à l'état liquide visqueux ou de solide viscoélastique, car la viscosité est suffisamment modérée dans ces états pour permettre des applications impliquant une administration par injection. La viscosité et le coefficient d'élasticité peuvent être mesurés par un rhéomètre cône-plan ou par un rhéomètre Couette. La viscosité d'une nanoémulsion liquide est généralement inférieure à 1 poise, voire même souvent inférieure à 0,01 poise. La nanoémulsion utilisée dans ce mode de réalisation de l'invention a généralement une viscosité supérieure à 1 poise, et pourra avoir une viscosité allant jusqu'à celle d'un solide (plus de 1000 poises). La nanoémulsion de la présente invention a généralement une viscosité de 1 à 1000 poises, préférentiellement de 1 à 500 poises et encore plus préférentiellement entre 1 et 200, ces valeurs étant données à 25 'Ό. Une viscosité supérieure à 1 poise est en effet adaptée pour que les gouttelettes de la phase dispersée forment un réseau tridimensionnel à l'intérieur de la phase continue. En effet, il a été constaté que en dessous de 1 poise, les gouttelettes ne sont généralement pas assez proches les unes des autres,. Au dessus de 1000 poises, on obtient un système quasi-solide. La nanoémulsion est alors trop visqueuse ce qui rend son utilisation difficile. De même, alors que le coefficient d'élasticité est généralement inférieur à 10 dans le cas d'une nanoémulsion liquide, le coefficient d'élasticité d'une nanoémulsion sous forme de gel est généralement supérieur à 10. Les études structurelles, notamment les diffractions aux rayons X ou aux neutrons, permettent également de différencier l'organisation d'une nanoémulsion liquide, de l'organisation d'une nanoémulsion sous forme de gel. En effet, les pics du diffractogramme obtenu pour une nanoémulsion liquide sont caractéristiques de la structure des gouttelettes de phase dispersée (grand angles de diffraction caractéristiques de distances courtes), alors que les pics du diffractogramme d'une nanoémulsion sous forme de gel sont caractéristiques non seulement de la structure des gouttelettes (grand angles de diffraction caractéristiques de distances courtes) mais aussi de l'organisation de ces gouttelettes en réseau tridimensionnel (faibles angles de diffraction caractéristiques de distances plus grandes). La nanoémulsion utilisée dans ce mode de réalisation de l'invention est avantageusement sous forme de gel dispersible, c'est-à-dire que les gouttelettes formant le réseau tridimensionnel peuvent être relarguées dans la phase continue sous certaines conditions par « dégélification » du système gel, également dénommée « désagrégation » dans la présente demande. La désagrégation est observée par ajout de phase continue au gel, par mise en contact avec les fluides physiologiques lors de l'administration de la nanoémulsion ou par augmentation de la température. En effet, ajouter de la phase continue entraîne une différence de pression osmotique entre l'intérieur du gel et la phase continue. Le système tendra donc à diminuer, jusqu'à annuler, cette différence de pression osmotique en libérant les gouttelettes dans l'excès de phase continue, jusqu'à obtenir une concentration en gouttelettes homogène dans l'ensemble du volume de phase continue. De même augmenter suffisamment la température du système revient à donner aux différentes gouttelettes une énergie thermique supérieure aux énergies mises en jeu dans les liaisons, par exemple les liaisons hydrogène, et ainsi à rompre ces liaisons et libérer les gouttelettes du réseau tridimensionnel. Ces températures dépendent de la composition du gel et plus particulièrement de la taille des gouttelettes et de la longueur des chaînes polyalcoxylées du co-tensioactif. La désagrégation de la nanoémulsion sous forme de gel peut être suivie par diffraction aux rayons X, par calorimétrie différentielle à balayage (DSC) ou par résonance magnétique nucléaire (RMN). En suivant par diffraction aux rayons X la désagrégation de la nanoémulsion sous forme de gel, on observe une évolution du spectrogramme, c'est-à-dire une diminution de l'intensité des angles faibles (caractéristiques de l'organisation des gouttelettes en réseau tridimensionnel) (comme décrit dans Matija Tomsic, Florian Prossnigg, Otto Glatter 'Journal of Colloid and Interface Science' Volume 322, Issue 1 , 1 June 2008, Pages 41 -50). La désagrégation peut également être suivie par DSC. Un pic apparaît sur le thermogramme lors de la transition nanoémulsion sous forme de gel / nanoémulsion liquide en montée en température. Enfin, une étude RMN peut aussi permettre de suivre la désagrégation par mesure du coefficient de diffusion associé à chaque gouttelette en distinguant une nanoémulsion liquide d'une nanoémulsion sous forme de gel. En effet, le coefficient de diffusion est très significativement diminué dans le cas d'une nanoémulsion sous forme de gel (il est alors généralement inférieur à 0.0^m2/s), où le système est figé. (WESTRIN B. A.; AXELSSON A.; ZACCHI G. 'Diffusion measurement in gels', Journal of controlled release 1994, vol. 30, n°3, pp. 189-199). • Emulsion dans laquelle les gouttelettes sont liées entre-elles de façon covalente
Dans un mode de réalisation, la formulation comprend un tensioactif de formule (I) suivante :
(L1-X1-H1-Y1)V-G-(Y2-H2-X2-L2)W (I), dans laquelle :
- !_! et L2 représentent indépendamment des groupes lipophiles,
- Xi, X2, Yi, Y2 et G représentent indépendamment un groupe de liaison,
- H! et H2 représentent indépendamment des groupes hydrophiles comprenant une chaîne polyalcoxylée,
- v et w sont indépendamment un nombre entier de 1 à 8,
et les gouttelettes de la phase dispersée sont liées entre-elles de façon covalente par le tensioactif de formule (I). Le tensioactif de formule (I) se situe partiellement dans la phase aqueuse continue et partiellement dans la phase dispersée. En effet, le tensioactif de formule (I) comprend deux groupes lipophiles (l_i et L2) et deux groupes hydrophiles (Hi et H2). Les groupes hydrophiles sont situés majoritairement à la surface des gouttelettes, dans la phase aqueuse continue alors que les groupes lipophiles se situent dans les gouttelettes de la formulation.
Plus précisément, le groupe lipophile Li se situe dans certaines gouttelettes, et le groupe L2 dans des gouttelettes adjacentes. Les gouttelettes sont donc reliées de façon covalente entre-elles par le groupe -(Xi-H Yi)v-G-(Y2-H2.X2)w- du tensioactif de formule (!)■
Les groupes Xi et X2 sont des groupes de liaison liant les groupes lipophiles et hydrophiles. Le groupe G est un groupe de liaison entre les deux parties [lipophile- hydrophile] du tensioactif de formule (I). Les groupes Yi et Y2 sont des groupes de liaison liant le groupe G à ces deux parties [lipophile-hydrophile]. La formulation de ce mode de réalisation peut avantageusement être mise en forme (par exemple en la plaçant dans un moule ou un récipient ayant une forme donnée), et rester dans la forme désirée selon l'application souhaitée. Ce mode de réalisation de l'invention est donc particulièrement adapté lorsque la formulation est utilisée sous forme de gélule, de gel, d'ovule ou de patch. D'autre part, elle résiste à la dilution à une phase aqueuse. Plus précisément, lorsqu'une phase aqueuse est ajoutée à cette formulation, celle-ci reste en forme et ne se dilue pas. Dans le milieu, on observe d'une part la formulation comprenant les gouttelettes, et d'autre part une phase aqueuse essentiellement exempte de gouttelettes.
Sans vouloir être liés à une théorie particulière, il semble que ces propriétés de cette formulation puissent être expliquées par la présence des liaisons covalentes entre les gouttelettes, qui confèrent une cohésion très forte entre elles.
Dans un mode de réalisation, dans la formule (I) susmentionnée :
- !_! et L2 sont indépendamment choisis parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, tel que le distéaryl phosphatidyléthanolamine (DSPE), et
- un poly(oxyde de propylène), et/ou
- Xi , X2, Yi et Y2 sont indépendamment choisis parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(CO)-0-, -0-(CO)-NH- et -NH-(CO)-NH,
- un groupe Alk étant un alkylène comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et
un groupe Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk ou Z-Alk-Z où Alk et Z sont tels que définis ci- dessus et où les deux groupes Z du groupe Z-Alk-Z sont identiques ou différents, et/ou
- Hi et H2 sont indépendamment choisis parmi un poly(oxyde d'éthylène) comprenant typiquement de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, de préférence de 20 à 200 unités oxyde d'éthylène, et/ou
- G comprend au moins un groupe G' ayant l'une des formules suivantes (les groupes Yi et Y2 étant reliés à gauche et à droite des formules décrites ci-dessous):
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0002
XXVI I) où A102 représente CH ou N, Ri02 représente H ou une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, A 0i représente -O-, -NH-(CO)- ou -O-(CO)- , R100 représente H ou un méthyle, A100 représente -O- ou -NH- et R 0i représente H, Me ou -OMe.
Figure imgf000031_0003
Par la formule on entend que le groupe Y2 peut être relié à n'importe
lequel des six atomes du cyclooctyle et par la formule
Figure imgf000031_0004
on entend que les groupe A 0i et R10i peuvent être relié à n'importe lequel des quatre atomes du phényle.
Notamment, v et w représentent indépendamment 1 ou 2. v et w représentent de préférence 1 .
Le groupe G peut comprendre un ou plusieurs des groupes G' définis ci-dessus.
Ainsi, dans un premier mode de réalisation, le groupe G est constitué d'un groupe G'. Dans ce mode de réalisation, dans la formule (I), v et w représentent 1 .
Dans un second mode de réalisation, le groupe G répond à la formule -G'-Y3-G'- dans laquelle :
- Y3 représente un groupe de liaison, notamment choisi parmi :
- une liaison simple,
- un groupe Z choisi parmi -O-, -NH-, -O(OC)-, -(CO)O-, -(CO)NH-, -NH(CO)-, -O- (CO)-O-, -NH-(CO)-0-, -0-(CO)-NH- et -NH-(CO)-NH,
- un groupe Alk étant un alkylène comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, et
un groupe Z-Alk, Alk-Z, Alk-Z-Alk ou Z-Alk-Z où Alk et Z sont tels que définis ci- dessus et où les deux groupes Z du groupe Z-Alk-Z sont identiques ou différents
- chacun des G' représente indépendamment un groupe de formule (XI) à (XXVI) susmentionnés, et de préférence, les deux groupes G' de la formule -G'-Y3-G'- sont identiques.
Dans ce mode de réalisation, dans la formule (I), v et w représentent 1 .
Ce mode de réalisation est particulièrement intéressant lorsque les deux groupes G' sont identiques et comprennent une fonction clivable. En effet, il suffit alors de cliver une seule des deux fonctions pour rompre les liaisons covalentes entre les gouttelettes de la formulation.
Dans un troisième mode de réalisation, le groupe G est un dendrimère comprenant (v+w) groupes G'. Le groupe G peut notamment être un dendrimère comprenant plusieurs groupes G', tel qu'un dendrimère comprenant un groupe polyamidoamine (PAMAM). Par exemple, le groupe G peut avoir l'une des formules (XXX) à (XXXIII) suivantes, qui comprennent :
- 4 groupes G' de formule (XXVI). v et w représentent 2.
- 4 groupes G' de formule (XXIV) où R10i représente -O-Me, A10i représente -NH-, R100 représente un méthyle et A100 représente -NH-. v et w représentent 2.
- 4 groupes G' de formule (XIV). v et w représentent 2.
16 groupes G' de formule (XXVI). v et w représentent 8.
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
(XXXIII)
Lorsque et/ou L2 représentent un groupe R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone, et/ou L2 représentent des groupes issus d'acide gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone.
Par «!_! et L2 représentent un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de hosphatidyléthanolamine», on entend qu'ils représentent un
groupe de formule :
Figure imgf000034_0002
dans laquelle
- R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- A3 et A4 représentent O ou NH, et M représente H ou un cation.
De préférence, l_i et L2 sont identiques et/ou Xi et X2 sont identiques et/ou Hi et H2 sont identiques. Des tensioactifs de formule (I) particulièrement préférés sont ceux dans lesquels l_i et L2 sont identiques, Xi et X2 sont identiques et.Hi et H2 sont identiques. Ces tensioactifs sont en effet des composés symétriques et sont donc généralement plus faciles à synthétiser, et donc moins coûteux.
Dans un mode de réalisation, dans la formule (I) susmentionnée, les radicaux L X H et/ou L2-X2-H2- consistent en l'un des groupes de formules suivantes (le groupe Yi ou Y2 étant relié à droite des formules décrites ci-dessous):
Figure imgf000035_0001
dans lesquelles :
- Ri, R2, R3 et R4 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- Ai, A2, A3 et A4 représentent O ou NH,
- m, n, o et p représentent indépendamment des nombres entiers de 3 à 500, de préférence 20 à 200, et
- a représente un nombre entier de 20 à 120,
- M représente H ou un cation. Les radicaux Li-Xi-Hret/ou L2-X2-H2- de formule (Ci l) sont préférés. En effet, ils sont faciles à préparer (notamment par formation d'un ester ou d'une amide entre un acide gras et un dérivé de poly(éthylène glycol). De plus, une formulation comprenant un tensioactif comprenant un radical Li-Xi-H et/ou L2-X2-H2- de formule (Ci l) peut généralement être préparé avec une quantité plus importante de ce tensioactif qu'une formulation comprenant un tensioactif comprenant un radical Li-XrH et/ou L2-X2-H2- de formule ( I I I). Or, plus la proportion de tensioactif de formule (I) dans la formulation est élevée, plus la cohésion entre les gouttelettes est grande, et plus la formulation reste en forme et résiste à la dilution. Ainsi, ces deux propriétés peuvent être encore exacerbées pour une formulation comprenant un tensioactif comprenant un radical rXrHreJou L2- X2-H2- de formule (Cil).
Les radicaux rXrHreJou L2-X2-H2- de formule (Ci l) avec A2 représente NH sont particulièrement préférés, car les tensioactifs comprenant de tels radicaux permettent d'éviter la fuite des agents d'intérêts lipophiles éventuellement présents hors des gouttelettes de la formulation plus efficacement que des tensioactifs comprenant des radicaux Li-XrH et/ou L2-X2-H2- de formule (Ci l) avec A2 représente O.
Dans un mode de réalisation, dans la formule (I), v et w représentent 1 , Li et L2 sont indépendamment R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone, Hi et H2 sont indépendamment des poly(oxyde d'éthylène) comprenant de 3 à 500 unités oxyde d'éthylène, Xi et X2 représentent -O- ou -NH-, G est constitué d'un groupe G' représentant -S-S- (groupe de formule (XV) ci-dessus) et Yi et Y2 représentent -CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2- (groupe Alk- Z-Alk ci-dessus avec Alk représente -CH2-CH2- et Z représente -NH-(CO)-) et le tensioactif de la formulation a alors la formule (Γ) suivante :
Figure imgf000036_0001
(Ι') dans laquelle :
R2 et R5 représentent indépendamment une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone, de préférence 1 7,
- A2 et A5 représentent O ou NH, de préférence NH, et - n et q représentent indépendamment des nombres entiers de 3 à 500, de préférence de 20 à 200.
Dans un mode de réalisation, les groupes Hi et H2 sont indépendamment choisis parmi un poly(oxyde d'éthylène) comprenant plus de 3 unités de poly(oxyde d'éthylène), voire plus de 20 unités, notamment plus de 50 (dans les formules susmentionnées, m, n, o, p et/ou q sont de préférence supérieurs à 3, voire 20, notamment plus de 50).
Dans un mode de réalisation, le groupe G du tensioactif de formule (I) de la formulation comprend une fonction clivable, notamment à certains pH (pH basique ou acide), par des enzymes, par la lumière (lumière visible, ultraviolets ou infrarouge) et/ou au-delà de certaines températures. Généralement, le groupe G comprend alors un groupe G' comprenant une fonction clivable.
Par exemple :
- la fonction β-cétoaminoester du groupe G de formule (XX) est clivable à pH acide (typiquement autour de 5),
- la fonction disulfure du groupe G de formule (XV) est clivable aux ultraviolets ou par des enzymes telles que des thioréductases,
- la fonction amide du groupe G de formule (XI) est clivable par des enzymes telles que des protéases,
- la fonction phosphate du groupe G de formule (XXII) est clivable par des enzymes telles que des phosphatases,
- la fonction imine des groupes G de formules (XXI) et (XIII) sont clivables à pH acide ou au-delà de certaines températures,
- le cycle cyclohexène du groupe G de formule (XVII) est clivable au-delà de certaines températures (par rétro Diels-Alder),
- la fonction carbonate du groupe G de formule (XIX) et la fonction carbamate du groupe G de formule (XII) sont clivables à pH acide.
L'homme du métier, au vu de ses connaissances générales, sait quelles fonctions sont clivables et dans quelles conditions. Il est notamment à même de choisir la fonction du groupe G' du tensioactif de formule (I) pour qu'elle soit clivable dans les conditions rencontrées lors de l'administration de la formulation selon l'invention.
De préférence, le rapport de la masse de tensioactif de formule (I) sur la masse de l'ensemble (tensioactif de formule (I) / co-tensioactif) est supérieur ou égal à 15%. Il a en effet été observé que de telles formulations sont plus faciles à préparer. • Taille des gouttelettes de la formulation « premix »
Les gouttelettes de la formulation « premix » définie ci-dessus ont généralement un diamètre compris entre 20 et 200 nm. Ce diamètre peut notamment être mesuré par diffusion quasi-élastique de la lumière sur un appareil ZetaSizer, Malvern.
Il est possible d'obtenir des gouttelettes de taille plus spécifique en adaptant les pourcentages des composants de la nanoémulsion. Pour une formulation comprenant des gouttelettes de taille comprise entre 20 et
40 nm, on préférera utiliser une formulation comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et :
- de 25 à 45% molaire de co-tensioactif (en dessous de 25% molaire, la formulation peut présenter des problèmes de stabilité), et/ou
- de 15 à 50% molaire de tensioactif cationique.
Pour une formulation comprenant des gouttelettes de taille comprise entre 40 et 100 nm, on préférera utiliser une formulation comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et :
- de 45 à 50% molaire de co-tensioactif (en dessous de 45% molaire, la formulation peut présenter des problèmes de stabilité. Au-delà de 50%, l'efficacité en transfection de la formulation « finale » après complexation avec les séquences nucléotidiques est moindre), et/ou
- de 30 à 40% molaire de tensioactif cationique. (en dessous de 30% molaire, l'efficacité en transfection de la formulation « finale » après complexation avec les séquences nucléotidiques est moindre. Au-delà de 40%, la formulation peut présenter des problèmes de stabilité).
Pour une formulation comprenant des gouttelettes de taille comprise entre 130 et 175 nm, on préférera utiliser une formulation comprenant au moins 5% molaire de lipide amphiphile et de 15 à 70% molaire d'au moins un tensioactif cationique et :
- de 10 à 25% molaire, notamment de 10 à 15% de co-tensioactif.
Les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co- tensioactif / éventuel lipide fusogène). [Formulation comprenant une séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents] (dite aussi « formulation « finale »)
• séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents
En complexant la formulation « premix » définie ci-dessus avec une séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'interférence par ARN, on obtient la formulation « finale » utile pour la délivrance desdites séquences.
Ainsi, la formulation peut en outre comprendre une séquence nucléotidique mono ou double brin, comprenant moins de 200 bases pour une séquence nucléotidique mono brin ou moins de 200 paires de base pour une séquence nucléotidique double brin, et susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN (acide ribonucléique) interférents, telle que :
un petit ARN interfèrent (siARN) (« short-interfering RNA » ou « small interfering RNA » siRNA en anglais)
- un acide nucléique bloqué (« Locked Nucleic Acid » LNA en anglais) :
un microARN synthétique, dit Mimic (« MicroRNA » ou « miRNA » en anglais).
Dans un mode de réalisation, ladite séquence nucléotidique est un siARN.
Un siARN est une séquence nucléotidique d'ARN double brin. C'est une séquence nucléotidique naturelle ou synthétique.
Un siARN est susceptible de cibler un transcrit d'intérêt, c'est à dire que la séquence nucléotidique d'un des brins du siARN est complémentaire de la séquence nucléotidique du transcrit d'intérêt. La taille de chaque brin du double brin du siARN varie généralement de 15 à 30 nucléotides, de préférence de 19 à 25 nucléotides, en particulier de 19 à 21 nucléotides. Deux deoxythymidine sont généralement ajoutés en partie 3' de chacun de ses brins pour en augmenter la stabilité. Ainsi, un siARN dont des deoxythymidine ont été greffés à ses parties 3' ne sort pas de la définition d'un siARN selon la présente demande. Un siARN permet de diminuer l'expression d'une protéine cible par interférence avec l'ARN messager codant pour cette protéine.
Dans un mode de réalisation, ladite séquence nucléotidique est un acide nucléique bloqué. Un acide nucléique bloqué est une séquence nucléotidique d'ARN et/ou d'ADN mono brin dont au moins un des acides nucléiques contient un pont méthylène entre l'hydroxyle en position 2 et l'atome de carbone 4 du ribose. C'est une séquence nucléotidique synthétique.
Un acide nucléique bloqué est un inhibiteur de microARN et permet de réguler l'expression d'une ou plusieurs protéines cibles dont les ARNm étaient en interférence avec les séquences ARN issues du dit microARN. La régulation est le plus souvent une levée d'inhibition d'expression des protéines. Dans un mode de réalisation, ladite séquence nucléotidique est un microARN.
Un microARN est une séquence nucléotidique d'ARN simple brin (de l'ordre de la centaine de bases). C'est une séquence nucléotidique synthétique.
Un microARN permet de réguler l'expression d'une ou plusieurs protéines cibles par interférence avec un ou plusieurs ARNm codant respectivement pour ces protéines.. La régulation est le plus souvent une inhibition de l'expression des protéines.
Lesdites séquences nucléotidiques sont maintenues à la surface des gouttelettes de la phase dispersée de la formulation grâce aux interactions électrostatiques avec le tensioactif cationique. Elles sont donc localisées à la surface des gouttelettes, au niveau de la couronne des gouttelettes, du côté hydrophile de la couronne.
Outre l'éventuelle liaison des siARN à des deoxythymidine mentionnées ci-dessus, lesdites séquences nucléotidiques ne sont pas modifiées chimiquement et elles ne sont pas dénaturées. En particulier, lesdites séquences nucléotidiques ne sont pas liées de façon covalente aux autres composants des gouttelettes. Notamment, lesdites séquences nucléotidiques ne sont liées de façon covalente ni au co-tensioactif, ni au lipide amphiphile, ni à l'éventuel agent d'imagerie. En effet, lesdites séquences nucléotidiques sont uniquement liées aux gouttelettes de la nanoémulsion par interactions électrostatiques avec les tensioactifs cationiques. Ceci est très avantageux car lesdites séquences nucléotidiques, une fois libérées dans leur site d'action, ne sont pas dénaturées et peuvent jouer le rôle attendu. De plus, il n'est pas nécessaire de préparer des dérivés de séquences nucléotidiques, ce qui est coûteux. Les séquences nucléotidiques disponibles dans le commerce peuvent donc être complexées aux gouttelettes sans modification préalable. Les gouttelettes de la formulation « finale » ont généralement un diamètre compris entre 20 et 250 nm, typiquement entre 40 et 200 nm. Ce diamètre peut notamment être mesuré par diffusion quasi-élastique de la lumière sur un appareil ZetaSizer, Malvern. · Localisation des composants des gouttelettes
Comme illustré sur la figure 1 , les gouttelettes de la formulation selon l'invention s'organisent sous forme de cœur - couronne, où :
- le cœur comprend :
- le lipide solubilisant,
l'éventuelle huile,
- l'éventuel agent d'imagerie,
- l'éventuel agent thérapeutique s'il est lipophile,
- la couronne comprend :
- le lipide amphiphile,
- le tensioactif cationique,
- le co-tensioactif (éventuellement greffé avec une molécule d'intérêt),
- la séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence,
- l'éventuel lipide fusogène,
- l'éventuel agent thérapeutique s'il est amphiphile,
- l'éventuel tensioactif de formule (I).
Cette organisation est la même dans la formulation « premix », excepté que dans ce cas, la couronne est exempte de séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'interférence par ARN.
[Kit] Selon un deuxième aspect, l'invention concerne un kit comprenant la formulation
« prémix » telle que définie ci-dessus, et séparément, au moins une séquence nucléotidique mono ou double brin, comprenant moins de 200 bases pour une séquence nucléotidique mono brin ou moins de 200 paires de base pour une séquence nucléotidique double brin, et susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN (acide ribonucléique) interférence. Dans le kit, la formulation « prémix » est séparée physiquement d'au moins une séquence nucléotidique. On peut par exemple utiliser un kit comprenant au moins deux récipients, un pour la formulation « prémix », et au moins un pour une séquence nucléotidique, de préférence plusieurs contenant chacun des séquences nucléotidiques de nature différente.
Comme explicité ci-dessus, la formulation « premix », notamment grâce à :
- la proportion molaire de tensioactif cationique dans la couronne des gouttelettes,
- la proportion molaire de lipide amphiphile dans la couronne des gouttelettes,
- la proportion molaire de co-tensioactif dans la couronne des gouttelettes,
- le fait que le co-tensioactif comprenne une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins 25 unités d'oxyde d'éthylène,
- la présence de lipide solubilisant dans le cœur des gouttelettes, et/ou
- la proportion molaire et/ou massique de cœur dans les gouttelettes,
est avantageusement stable. Cette stabilité de la formulation « premix » permet de stocker à long terme la formulation « premix », ce qui est un prérequis pour pouvoir stocker et commercialiser le kit défini ci-dessus.
Il est ainsi avantageusement possible de préparer la formulation « finale » à partir de la formulation « premix » et de la séquence juste avant utilisation de la formulation
« finale ». La formulation « premix » peut être stockée. Ainsi, il n'est pas nécessaire de préparer l'emulsion « premix » à chaque fois que l'on souhaite utiliser la formulation
« finale », ce qui est un avantage en termes de gain de temps et de coût.
[Procédé de préparation]
Selon un troisième aspect, l'invention concerne le procédé de préparation de la formulation définie ci-dessus.
Typiquement, on mélange d'abord les différents constituants huileux pour préparer un pré-mélange huileux pour la phase dispersée de l'émulsion, puis on le disperse dans une phase aqueuse sous l'effet d'un cisaillement.
Le procédé de préparation comprend typiquement les étapes suivantes :
(i) préparer une phase huileuse comprenant un lipide solubilisant, un lipide amphiphile, le tensioactif cationique;
(ii) préparer une phase aqueuse comprenant éventuellement le co-tensioactif;
(iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une formulation « prémix »; puis (iv) ajouter des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence à la formulation « prémix » formée, puis
(v) récupérer la formulation ainsi formée. · Etape (i)
Généralement, la préparation de la phase huileuse comprend le mélange des composants huileux de la formulation (lipide solubilisant / lipide amphiphile / tensioactif cationique). Lorsque la formulation comprend un lipide susceptible de faciliter la libération cytosolique par déstabilisation de la membrane endosomale et/ou une huile, et/ou un agent d'imagerie et/ou un agent thérapeutique, ceux-ci sont généralement introduits dans la phase huileuse lors de l'étape (i).
Le mélange peut éventuellement être facilité par mise en solution d'un des constituants ou du mélange complet dans un solvant organique approprié. Le solvant organique est ensuite évaporé, pour obtenir un pré-mélange huileux homogène pour la phase dispersée.
Par ailleurs, il est préféré de réaliser le pré-mélange (étape (i)) à une température à laquelle l'ensemble des ingrédients est liquide. · Etape (iii)
Avantageusement, la phase huileuse est dispersée dans la phase aqueuse à l'état liquide. Si l'une des phases se solidifie à température ambiante, il est préférable de réaliser le mélange avec l'une ou de préférence les deux phases chauffées à une température supérieure ou égale à la température de fusion.
L'émulsification sous l'effet de cisaillement est de préférence réalisée à l'aide d'un sonificateur ou d'un microfluidiseur. De préférence, la phase aqueuse puis la phase huileuse sont introduites dans les proportions souhaitées dans un récipient cylindrique approprié puis le sonificateur est plongé dans le milieu et mis en marche pendant une durée suffisante pour obtenir une nanoémulsion, le plus souvent quelques minutes.
A la fin de l'étape (iii), on obtient généralement une nanoémulsion homogène dans laquelle :
- le diamètre moyen des gouttelettes d'huile est généralement supérieur à 10 nm et inférieur à 200 nm, de préférence entre 30 et 190 nm, et - le potentiel zêta est supérieur à 20 mV, généralement compris entre 25 mV et 60 mV, de préférence entre 40 et 55 mV, de préférence lorsque la phase aqueuse de la formulation est une solution aqueuse de NaCI 0,15 mM. La nanoémulsion obtenue à la fin de l'étape (iii) correspond à la formulation
« prémix » définie ci-dessus.
• Etape (iv) L'étape (iv) permet alors de préparer la formulation utile pour la délivrance desdites séquences nucléotidiques par complexation desdites séquences nucléotidiques sur la formulation « premix » obtenue à la fin de l'étape (iii).
Généralement, les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence sont ajoutées à la nanoémulsion formée et le mélange obtenu est mélangé à température ambiante, par exemple 30 minutes.
Lors de l'étape (iv), les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence, porteuses de groupes phosphates chargés négativement, se lient par liaisons électrostatiques aux gouttelettes dont la surface est chargée positivement grâce aux groupes cationiques des tensioactifs cationiques. Des complexes sont ainsi formés entre les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence et les gouttelettes de la nanoémulsion. Les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'interférence par ARN sont généralement ajoutées en solution aqueuse, par exemple de l'eau exempte de nucléases, des milieux de culture cellulaire, des milieux de culture optimisés pour la transfection, notamment du milieu Opti-MEM ou des solutions tampons, notamment de l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique (HEPES). L'étape (iv) est typiquement réalisée à température ambiante (25°C), après simple homogénéisation ou sous agitation (par exemple entre 100 et 1000 tours par minute), pendant une durée comprise entre 5 minutes et 2 heures, par exemple de l'ordre de 30 minutes.
De préférence, lors de l'étape (iv), la quantité de séquences nucléotidiques introduite est telle que le rapport entre la quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charges négatives apportées par les séquences nucléotidiques introduites dans le milieu est supérieur à 8/1 . L'homme du métier est à même de calculer la quantité de charges négatives apportées par les séquences nucléotidiques introduites dans le milieu, et la quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix ». Un tel rapport permet d'obtenir une complexation quantitative, c'est-à-dire qu'il ne reste plus de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents libres dans le milieu.
L'étape (iv) peut être suivie par diverses méthodes, par exemple par :
- électrophorèse sur gel d'agarose, qui permet d'observer la migration des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence. S'il y a une bonne complexation, alors les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence complexées aux gouttelettes sont plus lourdes et sont visualisées dans les puits. Si la complexation est moins importante, des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence libres migreront à une autre position.
- diffusion dynamique de la lumière (DLS), en observant l'impact de la complexation sur le diamètre hydrodynamique. Plus la complexation est efficace, plus le profil s'oriente vers une distribution monomodale.
A la fin de l'étape (iv), on obtient généralement une nanoémulsion homogène dans laquelle le diamètre moyen des gouttelettes d'huile est généralement supérieur à 10 nm et inférieur à 200 nm, de préférence entre 60 et 200 nm.
Avantageusement, le procédé de préparation de la formulation ne nécessite pas de modifier chimiquement les séquences nucléotidiques, et ne nécessite en particulier pas de les greffer de façon covalente à un autre composant de la formulation. Il est donc très aisé de préparer en parallèle de nombreuses formulations selon l'invention comprenant des séquences nucléotidiques.
• Eventuelles étapes ultérieures La formulation peut être purifiée, par exemple par purification sur colonne ou par dialyse.
Avant conditionnement, l'émulsion peut être diluée et/ou stérilisée, par exemple par filtration ou dialyse. Cette étape permet d'éliminer les éventuels agrégats qui pourraient s'être formés au cours de la préparation de l'émulsion.
L'émulsion ainsi obtenue est prête à l'emploi, le cas échéant après dilution. • Préparation d'une formulation comprenant un tensioactif de formule (I)
Dans le mode de réalisation dans lequel la formulation comprend un tensioactif de formule (I), la nanoémulsion utilisée pour la complexation avec les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence peut être préparée par un procédé comprenant la mise en contact :
- d'une émulsion 1 comprenant une phase aqueuse continue et une phase dispersée sous forme de gouttelettes comprenant un lipide amphiphile et un tensioactif de formule (Ll) suivante :
L X H Y G! (Ll),
- avec une émulsion 2 comprenant une phase aqueuse continue et une phase dispersée sous forme de gouttelettes comprenant un lipide amphiphile et un tensioactif de formule (LU) suivante :
G2-Y2-H2.X2-L2 (LU)
où ί,, Χ,, Η,, Y,, L2, X2, H2 et Y2 sont tels que définis ci-dessus, et Gi et G2 sont des groupes susceptibles de réagir pour former le groupe G tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant la réaction des tensioactifs de formules (Ll) et (LU) pour former le tensioactif de formule (I) tel que défini ci-dessus, ce par quoi des liaisons covalentes entre les gouttelettes de la phase dispersée se forment.
Les phases aqueuses continues des émulsions 1 et 2 comprennent un co- tensioactif tel que défini ci-dessus. Les phases dispersées des émulsions 1 et 2 comprennent un lipide solubilisant tel que défini ci-dessus. La phase dispersée de l'émulsion 1 et/ou la phase dispersée de l'émulsion 2 comprend un tensioactif cationique tel que défini ci-dessus.
Lorsque le groupe G comprend un seul groupe G', les groupes Gi et G2 sont typiquement des groupes susceptibles de réagir l'un avec l'autre pour former le groupe G.
Lorsque le groupe G comprend plusieurs groupes G', on met généralement les émulsions 1 et 2 en contact avec un composé susceptible de réagir avec les tensioactifs de formules (Ll) et (LU) pour former le groupe G. Ce composé comprend typiquement au moins v fonctions G'i susceptibles de réagir avec le groupe Gi et w fonctions G'2 susceptibles de réagir avec le groupe G2.
Ainsi, dans le mode de réalisation dans lequel le groupe G répond à la formule -G'-Y3-G'- définie ci-dessus, le procédé de préparation de la formulation comprend typiquement la mise en contact :
- d'une émulsion 1 telle que définie ci-dessus,
- et d'une émulsion 2 telle que définie ci-dessus, - avec un composé de formule G'i-Y3-G'2 dans laquelle Y3 est tel que défini ci-dessus, G'i est un groupe susceptible de réagir avec d pour former le premier groupe G' tel que défini ci-dessus et G'2 est un groupe susceptible de réagir avec G2 pour former le second groupe G' tel que défini ci-dessus (de nature identique ou différente du premier groupe G'),
dans des conditions permettant la réaction des tensioactifs de formules (Ll) et (LU) et du composé de formule G'i-Y3-G'2 pour former le tensioactif de formule (I) dans lequel le groupe G répond à la formule -G'-Y3-G'- définie ci-dessus, ce par quoi des liaisons covalentes entre les gouttelettes de la phase dispersée se forment.
De même, dans le mode de réalisation défini ci-dessus dans lequel le groupe G est un dendrimère comprenant (v+w) groupes G', le procédé de préparation de la formulation comprend typiquement la mise en contact :
- d'une émulsion 1 telle que définie ci-dessus,
- et d'une émulsion 2 telle que définie ci-dessus,
- avec un dendrimère de formule (G'i)v-Y4-(G'2)w dans laquelle v et w et sont tels que définis ci-dessus, G'i est indépendamment un groupe susceptible de réagir avec Gi pour former un groupe G' tel que défini ci-dessus et G'2 est indépendamment un groupe susceptible de réagir avec G2 pour former un groupe G' tel que défini ci- dessus (chaque G' étant de nature identique ou différente des autres groupes G') et Y4 est le squelette d'un dendrimère,
dans des conditions permettant la réaction des tensioactifs de formules (Ll) et (LU) et du dendrimère de formule (G'i)v-Y4-(G'2)W pour former le tensioactif de formule (I) dans lequel le groupe G est un dendrimère comprenant (v+w) groupes G', ce par quoi des liaisons covalentes entre les gouttelettes de la phase dispersée se forment.
Par exemple, pour former un groupe G ayant la formule (XXX), (XXXI), (XXXII) et (XXXIII), le composé de formule (G'i)v-Y4-(G'2)W peut respectivement avoir une des formules (ΧΧΧ'), (ΧΧΧ '), (ΧΧΧΙΙ') et (ΧΧΧΙΙΙ') suivantes :
Figure imgf000047_0001
(dans laquelle d et G'2 -représentent NH2 et v et w représentent 2),
Figure imgf000048_0001
(XXX Ι')
(dans laquelle ΘΊ et G'2 -représentent NH2 et v et w représentent 2),
Figure imgf000048_0002
(XXXI I')
(dans laquelle G'i et G'2 -représentent
Figure imgf000048_0003
et v et w représentent 2),
Figure imgf000049_0001
(XXXI II')
(dans laquelle ΘΊ et G'2 -représentent NH2 et v et w représentent 8).
Au vu de ses connaissances générales en chimie, l'homme du métier est à même de choisir la nature des groupes G'i , G'2, Y3, Y4, G1 et G2 à utiliser pour former le groupe G et les conditions permettant la réaction. Les réactions de chimie organique usuelles peuvent être suivies, notamment celles décrites dans « Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Préparations » de Richard C. Larock édité par John Wiley & Sons Inc, et les références qui y sont citées. Ainsi, les exemples de groupes G1 et G2 ci-dessous sont cités à titre illustratif et non limitatif.
Typiquement, lorsque le groupe G est constitué d'un groupe G', les groupes G1 et G2 des composés de formules (Ll) et (LU) peuvent par exemple être choisis comme suit : - G1 représente un thiol (-SH) et G2 représente :
- soit un maléimide, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XIV) où Ai02 représente N étant alors formé,
- soit une vinylsulfone, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XVI) étant alors formé, - soit un groupe -S-S-pyridinyle ou -SH, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XV) étant alors formé,
- Gi représente un hydroxyle et G2 représente -COOH ou un ester activé, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XXIII) étant alors formé,
- Gi représente une aminé -NH2 et G2 représente -COOH ou un ester activé, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XI) étant alors formé,
- Gi représente un hydroxyle et G2 représente un carbonate activé, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XIX) étant alors formé,
- Gi représente une aminé -NH2 et G2 représente un carbonate activé, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XII) étant alors formé, - Gi représente une aminé -NH2 et G2 représente un aldéhyde -CHO, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XXI) étant alors formé,
- Gi représente un hydrazide de formule -(C=0)-NH-NH2 et G2 représente un groupe - (C=O)-R102, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XIII) étant alors formé,
- Gi représente un alcyne et G2 représente un azoture, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XVIII) étant alors formé,
- Gi représente un cyclooctyne et G2 représente un azoture, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XVIN') étant alors formé, Gi représente un furane et G2 représente un maléimide, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XVII) étant alors formé,
Gi représente un aldéhyde et G2 représente une aminé, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XXI) étant alors formé,
Gi représente un phosphate de formule -0-P(=0)(OH)2 et G2 représente un hydroxyle, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XXII) étant alors formé,
Gi représente un bon groupe partant LG et G2 représente un groupe de formule
suivante
Figure imgf000051_0001
, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XXIV) dans laquelle A10i représente O étant alors formé,
Gi représente un hydroxyle ou une aminé -NH2 et G2 représente un groupe de
formule suivante
Figure imgf000051_0002
, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XXIV) dans laquelle A10i représente respectivement -O-(CO)- ou -NH-(CO) étant alors formé,
Gi représente un bon groupe partant LG et G2 représente un hydroxyle, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XXV) étant alors formé,
Gi représente un bon groupe partant LG et G2 représente une aminé -NH2, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XXVI) étant alors formé, - Gi représente une oxyamine -0-NH2 et G2 représente un aldéhyde, un tensioactif de formule (I) dans lequel G comprend un groupe G' représentant un groupe de formule (XXVII) étant alors formé.
Lorsque le groupe G comprend plusieurs groupes G', le choix des groupes réagissant ensemble : G'i et Gi d'une part et G'2 et G2 d'autre part, peut être effectué de la même façon, en remplaçant les groupes Gi ou G2 dans les exemples mentionnés ci-dessus par
Les émulsions 1 et 2 mises en œuvre dans le procédé peuvent être préparées par le premier procédé susmentionné comprenant les étapes (i), (ii), (iii) et (v) (en n'effectuant pas l'étape (iv) d'ajout des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence).
[Utilisation]
La formulation est avantageusement stable et peu toxique. Elle peut être utilisée comme agent de transfection et/ou comme système de délivrance de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence.
Lorsque la formulation comprend un agent d'imagerie, il est avantageusement possible de suivre la délivrance des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence et/ou la transfection des cellules, par exemple par suivi de la fluorescence lorsque l'agent d'imagerie est un fluorophore lipophile.
• Comme agent de transfection
Selon un quatrième aspect, l'invention concerne une méthode d'introduction de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en contact de la cellule eucaryote avec la formulation selon l'invention. Cette méthode est une méthode de transfection.
La méthode d'introduction peut être réalisée in vitro. Dans ce cas, généralement, la mise en contact de la cellule eucaryote avec la formulation selon l'invention a lieu dans une solution tampon, par exemple un milieu OptiMEM®. La mise en contact dure généralement entre 8 et 96 heures, typiquement de l'ordre de 72 heures, à une température de l'ordre de 37 <Ό.
Généralement, après l'étape de mise en contact, les cellules sont récupérées. Non seulement les gouttelettes de la formulation selon l'invention permettent de transfecter efficacement les cellules, mais en plus elles sont fonctionnellement actives et permettent d'éteindre l'expression du gène d'intérêt.
Sans vouloir être liés à une théorie particulière, une fois que les gouttelettes de la nanoémulsion selon l'invention ont transfecté la cellule, l'échappement endosomal libérerait les gouttelettes et les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence dans le cytoplasme, donc dans le site d'action des séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'interférence par ARN, ce qui éviterait la dégradation de ces séquences nucléotidiques dans le lysosome, leur permettant d'interférer avec l'ARNm cible et donc d'éteindre ainsi Γ expression du gène d'intérêt.
Dans un mode de réalisation, la formulation comprend un co-tensioactif greffé par un ligand biologique de ciblage. Ce mode de réalisation permet avantageusement l'introduction de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence dans des cellules eucaryotes usuellement résistantes à la transfection, c'est-à-dire connues comme étant difficiles à transfecter, notamment des cellules souches, des cellules primaires (par exemple des fibroblastes humains ou des cellules endothéliales humaines) ou des lignées cellulaires lymphocytaires (par exemple de type Jurkat) ou de neuroblastomes (par exemple de type SK-N-SH). Le ligand biologique de ciblage permet en effet de faciliter la transfection de cellules usuellement résistantes à la transfection par la formulation.
• pour la déliyrance de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence
La formulation selon l'invention est un système de délivrance in vitro ou in vivo de séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence.
Ainsi, selon un cinquième aspect, l'invention concerne la formulation définie ci- dessus pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie. La maladie est typiquement une maladie pour laquelle une extinction d'un ou plusieurs gènes est recherchée, telle que :
- les maladies oculaires, notamment la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), le glaucome ou la Pachyonychia congénitale.
- le cancer, les tumeurs solides, les métastases mais également les leucémies myéloïdes chroniques.
- les troubles rénaux, notamment après transplantation ou insuffisance rénale aiguë, l'hypercholestérolémie.
- les maladies virales liées notamment à une infection, par le virus de l'hépatite C (VHC), par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et par le virus respiratoire syncytial (VRS).
Avantageusement, comme explicité ci-dessus, la formulation selon l'invention protège les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence du corps du patient (et de ces protéines) auquel la formulation est administrée (notamment en évitant son métabolisme prématuré).
La formulation peut comprendre un agent thérapeutique permettant de traiter la maladie, ce qui permet de bénéficier d'un double effet thérapeutique : celui induit par les séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence et celui induit par l'agent thérapeutique.
Du fait qu'elle peut être préparée exclusivement à partir de constituants approuvés pour l'homme, elle est intéressante pour une administration par voie parentérale. Cependant, il est également possible d'envisager une administration par d'autres voies, notamment par voie orale, par voie topique, ou par voie ophtalmologique.
Une méthode de prévention et/ou de traitement d'une maladie comprenant l'administration chez un mammifère, de préférence un humain, qui en a besoin d'une quantité efficace de la formulation telle que définie ci-dessus est également un des objets de la présente invention.
[Définitions] Dans le cadre de la présente demande, on entend par le terme « nanoémulsion » une composition présentant au moins deux phases, généralement une phase huileuse et une phase aqueuse, dans laquelle la taille moyenne de la phase dispersée est inférieure à 1 micron, de préférence de 10 à 500 nm et en particulier de 20 à 200 nm, et tout préférentiellement de 50 à 200 nm (voir article C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and M. J. Garcia-Celma, Curr Opin Colloid In, 2005, 10, 102-1 10).
Au sens de la présente demande, l'expression « phase dispersée » signifie les gouttelettes comprenant l'éventuelle huile / le(s) tensioactif(s) cationique(s) / le lipide solubilisant/ le lipide amphiphile/ le co-tensioactif/ l'éventuel tensiactif de formule (I)/ l'éventuel lipide fusogène / l'éventuel agent d'imagerie / l'éventuel agent thérapeutique / les éventuelles séquences nucléotidiques susceptibles de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférents. La phase dispersée est généralement exempte de phase aqueuse.
Le terme « gouttelette » englobe à la fois les gouttelettes d'huile liquide proprement dites ainsi que les particules solides issues d'émulsions de type huile-dans- eau dans lesquelles la phase dispersée est solide. Dans ce dernier cas, on parle souvent aussi d'émulsion solide.
Le terme « lipide » désigne dans le cadre de cet exposé l'ensemble des corps gras ou des substances contenant des acides gras présents dans les graisses d'origine animales et dans les huiles végétales. Ce sont des molécules hydrophobes ou amphiphiles principalement constituées de carbone, d'hydrogène et d'oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. Les lipides peuvent être à l'état solide à température ambiante (25^), comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles.
Le terme « phospholipide » vise des lipides possédant un groupe phosphate, notamment les phosphoglycérides. Le plus souvent, les phospholipides comportent une extrémité hydrophile formée par le groupe phosphate éventuellement substitué et deux extrémités hydrophobes formées par des chaînes d'acides gras. Parmi les phospholipides, on citera en particulier la phosphatidylcholine, la phosphatidyl éthanolamine, la phophatidyl inositol, la phosphatidyl sérine et la sphingomyéline.
Le terme « lécithine » désigne la phosphatidylcholine, c'est-à-dire un lipide formé à partir d'une choline, d'un phosphate, d'un glycérol et de deux acides gras. Il couvre de manière plus large les phospholipides extraits du vivant, d'origine végétale ou animale, dans la mesure où ils sont majoritairement constitués de phosphatidylcholine. Ces lécithines constituent généralement des mélanges de lécithines portant différents acides gras.
On entend par le terme « acide gras » désigner des acides carboxyliques aliphatiques présentant une chaîne carbonée d'au moins 4 atomes de carbone. Les acides gras naturels possèdent une chaîne carbonée de 4 à 28 atomes de carbone (généralement un nombre pair). On parle d'acide gras à longue chaîne pour une longueur de 14 à 22 carbones et à très longue chaîne s'il y a plus de 22 carbones.
On entend par le terme « tensioactif » des composés à structure amphiphile qui leur confère une affinité particulière pour les interfaces de type huile/eau et eau/huile ce qui leur donne la capacité d'abaisser l'énergie libre de ces interfaces et de stabiliser des systèmes dispersés.
On entend par le terme « co-tensioactif » un tensioactif agissant en plus d'un tensioactif pour abaisser davantage l'énergie de l'interface.
On entend par le terme « chaîne hydrocarbonée » désigner une chaîne composée d'atomes de carbone et d'hydrogène, saturée ou insaturée (double ou triple liaison). Les chaînes hydrocarbonées préférées sont les alkyle ou alcényle.
On entend par le terme « alkylène » désigner un groupe divalent aliphatique hydrocarboné, saturé, linéaire ou ramifié, de préférence linéaire.
On entend par « radical cyclique » un radical issu d'un cycle. Par exemple, un radical phénylène est un radical divalent issu d'un groupe benzène. Par « cycle », on entend un carbocycle ou un hétérocycle, saturé, insaturé ou aromatique (aryle ou hétéroaryle),
- un carbocycle : un cycle composé d'atomes de carbone, saturé (les carbocycles saturés préférés étant notamment un cycloalkyle, tel que un cyclopentyle ou un cyclohexyle), insaturé (par exemple un cyclohexène) ou aromatique (c'est-à-dire un phényle),
- un hétérocycle : un groupe cyclique comprenant, sauf mention contraire, de 5 à 6 atomes, et comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et/ou S. Ledit hétérocycle peut être saturé ou partiellement insaturé et comprendre une ou plusieurs doubles liaisons. On parle alors de groupe hétérocycloalkyle. Il peut également être aromatique, comprenant, sauf mention contraire, de 5 à 6 atomes et représenter alors un groupe hétéroaryle.
- à titre d'hétérocycle non aromatique ou hétérocycloalkyle, on peut citer, le pyrazolidinyle, l'imidazolidinyle, le tétrahydrothiophényle, le dithiolanyle, le thiazolidinyle, le tétrahydropyranyle, le dioxanyle, le morpholinyle, le pipéridyle, le pipérazinyle, le tétrahydrothiopyranyle, le thiomorpholinyle, le dihydrofuranyle, le 2-imidazolinyle, le 2,-3-pyrrolinyle, le pyrazolinyle, le dihydrothiophényle, le dihydropyranyle, le pyranyle, le tétrahydropyridyle, le dihydropyridyle, le tétrahydropyrinidinyle, le dihydrothiopyranyle, l'isoxazolidinyle, - à titre d'hétéroaryle, on peut notamment citer les groupes représentatifs suivants : furyle, imidazolyle, isoxazolyle, isothiazolyle, oxadiazolyle, 1 ,2,4- oxadiazolyle, 1 ,3,4-oxadiazolyle, pyrazinyle, pyridazinyle, pyrazolyle, pyridyle, pyrimidinyle, pyrrolyle, 1 ,3,4-thiadiazolyle, 1 ,2,3-thiadiazolyle, thiazolyle, thiényle, triazolyle, 1 ,2,3-triazolyle et 1 ,2,4-triazolyle.
Par « ester activé », on entend un groupe de formule -CO-LG, et par « carbonate activé », on entend un groupe de formule -O-CO-LG où LG est un bon groupe partant notamment choisi parmi un chlore, un imidazolyle, un pentafluorophénolate, un pentachlorophénolate, un 2,4,5-trichlorophénolate, 2,4,6-trichlorophénolate, un groupe -O- succinimidyle, -O-benzotriazolyle, -0-(7-aza-benzotriazolyle) et -0-(4-nitrophényle).
L'invention sera décrite plus en détail au moyen de la figure en annexe et des exemples qui suivent. FIGURES
La figure 1 représente un schéma illustrant la structure cœur/couronne d'une gouttelette d'une formulation selon l'invention (formulation « finale » avec une séquence nucléotidique susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence). 1 représente la phase aqueuse continue, 2 la couronne (en partie) de la gouttelette et 3 le cœur (en partie) de la gouttelette. Dans la couronne 2, sont illustrés : le lipide amphiphile (par exemple phospholipide neutre tel que la lécithine), le tensioactif cationique (phospholipide cationique DOTAP par exemple), le co-tensioactif dont la chaîne poly(oxyde d'éthylène) se repliant est représentée dans la phase aqueuse et la séquence nucléotidique double brin, et susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence (siARN par exemple).
La figure 2 représente un gel d'électrophorèse révélé à l'UV réalisé après complexation de siARN avec la formulation B10 avec des concentrations précisées au tableau 8. L'échelle et les siARN (témoin) sont à gauche.
La figure 3 donne les résultats de quantité de SiARN (ng) obtenus par traitement des données de l'électrophorèse sur le logiciel ImageJ du gel d'électrophorèse révélé à l'UV de la figure 2.
La figure 4 représente l'intensité obtenue sur un appareil ZetaSizer Malvern en fonction du diamètre hydrodynamique en nm pour le siARN libre (comparaison) et pour trois formulations selon l'invention obtenues par complexation avec un rapport N/P : quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » (dues à l'azote chargé, d'où le N de N/P), sur la quantité de charges négatives apportée par les siARN (dues au phosphore du SiARN, d'où le P de N/P) de 4/1 , de 8/1 ou de 16/1 .
La figure 5 représente un gel d'électrophorèse révélé à l'UV avec, de gauche à droite :
- l'échelle,
le siARN libre (témoin)
puis des migrations obtenues par complexation de siARN :
- avec la formulation B1 (exemple comparatif) (pas de complexation, les siARN sont libres),
- avec la formulation B6 avec un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN de 8/1 (complexation quantitative),
- avec la formulation B6 avec un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN de 8/1 (complexation quantitative),
- avec la formulation B10 avec un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN de 8/1 (complexation quantitative),
- avec de la lipofectamine (exemple comparatif) (complexation incomplète).
La figure 6 représente un gel d'électrophorèse révélé à l'UV d'un complexe siARN/formulation B10 juste après complexation (TO) puis 15 min, 45 min, 1 h30, 3h et 6h après complexation. L'échelle et les siARN (témoin) sont à gauche.
La figure 7 représente la diminution de l'intensité de fluorescence FITC en % en transfectant les lignées cellulaires avec :
- de la Lipofectamine RNAimax (agent commercial),
le complexe siARN/formulation B1 ,
- avec le complexe siARN/formulation B6, la formulation ayant été conservée 7 mois à température ambiante préalablement à la complexation,
- avec le complexe siARN/formulation B6, la formulation ayant été conservée 12 mois à température ambiante préalablement à la complexation,
avec le complexe siARN/formulation B10, la formulation ayant été conservée 12 mois à température ambiante préalablement à la complexation,
- avec un complexe siARN / formulation de liposomes cationiques comprenant du DOTAP (58% wt), du DOPE (18% wt), du cholestérol (2% wt) et du DSPE-PEG3000
(22% wt)) (comparatif). La figure 8 représente l'intensité de fluorescence (FITC) pour 3 lignées cellulaires surexprimant expérimentalement la protéine fluorescente GFP (pour green fluorescent protein) : U20S, PC3 et Hela pour le complexe Si/ARN formulation B10, le siARN appelé siGFP étant ciblé contre l'ARNm codant pour la protéine GFP, et pour le contrôle négatif (cellules incubées avec une formulation B10 complexée avec un siRNA contrôle négatif, c'est-à-dire « inerte » sans effet sur le transcriptome de la cellule appelé siAIIStar).
La figure 9 représente un gel d'électrophorèse révélé à l'UV réalisé après complexation de microARN synthétique de type mimic avec la formulation A3 avec des concentrations précisées au tableau 9. L'échelle et les microARN Mimic (témoin) et la formulation prémix A3 non complexée sont à gauche. Les formulations finales issues de la complexation de la formulation prémix A3 et des Mimic à cinq rapports N/P différents sont à droite.
EXEMPLES
• Préparation et composition de formulations « premix » avant complexation aux siARN La phase aqueuse utilisée est une solution tampon PBS "I X.
Les fournisseurs des composés sont les suivants :
Lipoid S75-3 : Lipoid
Lipoid S75 : Lipoid
Lipoid S100-3 : Lipoid
DOTAP : Avanti Polar
DOPE : Avanti Polar
MyrjS40 : Croda
Suppocire NB : Gattefossé
Huile de soja : Croda
Le diamètre hydrodynamique des gouttelettes des formulations ainsi que leur potentiel zeta ont été mesurés par diffusion quasi-élastique de la lumière par un appareil de type ZetaSizer, Malvern. Le diamètre hydrodynamique des gouttelettes a été mesuré dans une solution de PBS 0,1 X, le potentiel zeta dans une solution aqueuse de NaCI 0,15 mM. Seize formulations différentes ont été réalisées, dont les compositions sont indiquées dans les tableaux 1 à 5.
A1 (comp.) A2 A3
COURONNE Lipide amphiphile : Lipoid S75-3 S75-3 S75-3
% wt Lipoid 1 gouttelette 35,29 8,83 3,53
% wt Lipoid /couronne sans PEG 100 25 10
% wt Lipoid 1 couronne 46,15 11 ,54 4,62
% mol. Lipoid 1 couronne 70,02 16,86 6,74
Tensioactif cationique DOTAP X DOTAP DOTAP
% wt DOTAP /gouttelette 0 26,47 26,47
% wt DOTAP /couronne sans PEG 0 75 75
% wt DOTAP /couronne 0 34,61 34,61
% mol. DOTAP 1 couronne 0 54,28 54,24
Co-tensioactif Myrj S40 Myrj S40 Myrj S40
% wt co-tensioactif/ gouttelette 41 ,17 41 ,17 41 ,17
% wt (co-tensioactif) 1 couronne 53,85 53,85 53,85
% mol. (co-tensioactif) 1 couronne 29,98 28,86 28,84
Lipide fusogène DOPE X X DOPE
% wt DOPE /gouttelette 0 0 5,29
% wt DOPE /couronne sans PEG 0 0 15
% wt DOPE 1 couronne 0 0 6,92
% mol. DOPE 1 couronne 0 0 10,18
Suppocire Suppocire
COEUR Lipide solubilisant Suppocire NB
NB NB
% wt lipide solubilisant/cœur 75 75 75
% wt lipide solubilisant 1 gouttelette 17,65 17,65 17,65
Huile Huile de soja Huile de soja Huile de soja
% wt huile / cœur 25 25 25
% wt huile 1 gouttelette 5,88 5,88 5,88
% wt cœur / gouttelette 23,53 23,53
% mol. cœur / gouttelette 33,35 33,35
Formulation (nombre de répétition) 3 4 3
RESULTAT Diamètre hydrodynamique (nm) - average 124,9 49,1 44,48
ZP (mV)_dans NaCI 0,15 mM -26 25,38 30,87
Stabilité ok ok ok
Complexation (%) 0 100 100
Efficacité d'extinction (%) 0 72,88 75,06
Tableau 1 B1 (comp.) B2 B3
COURONNE Lipide amphiphile : Lipoid S75-3 S75 S100-3
% wt Lipoid 1 gouttelette 8,75 4,25 4,25
% wt Lipoid /couronne sans PEG 100 50 50
% wt Lipoid 1 couronne 15,98 7,99 7,99
% mol. Lipoid 1 couronne 34,14 17,89 17,89
Tensioactif cationique DOTAP X DOTAP DOTAP
% wt DOTAP /gouttelette 0 4,25 4,25
% wt DOTAP /couronne sans PEG 0 50 50
% wt DOTAP /couronne 0 7,99 7,99
% mol. DOTAP 1 couronne 0 17,85 17,85
Co-tensioactif Myrj S40 Myrj S40 Myrj S40
% wt co-tensioactif/ gouttelette 46 46 46
% wt (co-tensioactif) 1 couronne 84,02 84,02 84,02
% mol. (co-tensioactif) 1 couronne 65,86 64,27 64,27
Lipide fusogène DOPE X X X
% wt DOPE /gouttelette 0 0 0
% wt DOPE /couronne sans PEG 0 0 0
% wt DOPE 1 couronne 0 0 0
% mol. DOPE 1 couronne 0 0 0
Suppocire
COEUR Lipide solubilisant Suppocire NB Suppocire NB
NB
% wt lipide solubilisant/cœur 75 75 75
% wt lipide solubilisant 1 gouttelette 33,94 33,94 33,94
Huile Huile de soja Huile de soja Huile de soja
% wt huile / cœur 25 25 25
% wt huile 1 gouttelette 11 ,31 11 ,31 11 ,31
% wt cœur / gouttelette 45,25 45,25
% mol. cœur / gouttelette
Formulation (nombre de répétition) 6 2 2
RESULTAT Diamètre hydrodynamique (nm) - average 59,51 42,11 61 ,43
ZP (mV)_dans NaCI 0,15 mM -21 ,8 21 ,4 6,72
Stabilité ok ok ok
Complexation (%) 0 ND ND
Efficacité d'extinction (%) 0 0 0
Tableau 2 B4 (comp.) B5 B6
COURONNE Lipide amphiphile : Lipoid S75-3 S75-3 S75-3
% wt Lipoid 1 gouttelette 6,58 2,19 2,84
% wt Lipoid /couronne sans PEG 100 25 25
% wt Lipoid 1 couronne 14,29 4 6,9
% mol. Lipoid 1 couronne 31 ,24 8,39 12,39
Tensioactif cationique DOTAP X DOTAP DOTAP
% wt DOTAP /gouttelette 0 6,56 8,52
% wt DOTAP /couronne sans PEG 0 75 75
% wt DOTAP /couronne 0 11 ,99 20,67
% mol. DOTAP 1 couronne 0 26,99 39,87
Co-tensioactif Myrj S40 Myrj S40 Myrj S40
% wt co-tensioactif/ gouttelette 39,48 46 29,87
% wt (co-tensioactif) 1 couronne 85,71 84,02 72,43
% mol. (co-tensioactif) 1 couronne 68,76 64,63 47,74
Lipide fusogène DOPE X X X
% wt DOPE /gouttelette 0 0 0
% wt DOPE /couronne sans PEG 0 0 0
% wt DOPE 1 couronne 0 0 0
% mol. DOPE 1 couronne 0 0 0
COEUR Lipide solubilisant Suppocire NB Suppocire NB Suppocire NB
% wt lipide solubilisant/cœur 75 75 75
% wt lipide solubilisant 1 gouttelette 40,46 33,94 44,07
Huile Huile de soja Huile de soja Huile de soja
% wt huile / cœur 25 25 25
% wt huile 1 gouttelette 13,49 11 ,31 14,69
% wt cœur / gouttelette 45,25 58,76
% mol. cœur / gouttelette 73,99
Formulation (nombre de répétition) 3 4 6
RESULTAT Diamètre hydrodynamique (nm) - average 84,88 56,68 86,77
ZP (mV)_dans NaCI 0,15 mM -18,89 26,51 36,38
Stabilité ok ok ok
Complexation (%) 0 100 100
Efficacité d'extinction (%) 0 0 42,81
Tableau 3
Figure imgf000064_0001
Tableau 4 C1(comp.) C2 C3
COURONNE Lipide amphiphile : Lipoid S75-3 S75-3 S75-3
% wt Lipoid 1 gouttelette 28,44 7,11 4,27
% wt Lipoid /couronne sans PEG 100 25 15
% wt Lipoid 1 couronne 70,24 17,56 10,54
% mol. Lipoid 1 couronne 86,55 20,65 12,38
Tensioactif cationique DOTAP X DOTAP DOTAP
% wt DOTAP /gouttelette 0 21 ,33 21 ,33
% wt DOTAP /couronne sans PEG 0 75 75
% wt DOTAP /couronne 0 52,68 52,68
% mol. DOTAP 1 couronne 0 66,51 66,47
Co-tensioactif Myrj S40 Myrj S40 Myrj S40
% wt co-tensioactif/ gouttelette 12,05 12,05 12,05
% wt (co-tensioactif) 1 couronne 29,76 29,76 29,76
% mol. (co-tensioactif) 1 couronne 13,45 12,84 12,83
Lipide fusogène DOPE X X DOPE
% wt DOPE /gouttelette 0 0 2,84
% wt DOPE /couronne sans PEG 0 0 10
% wt DOPE 1 couronne 0 0 7,02
% mol. DOPE 1 couronne 0 0 8,32
COEUR Lipide solubilisant Suppocire NB Suppocire NB Suppocire NB
% wt lipide solubilisant/cœur 75 75 75
% wt lipide solubilisant 1 gouttelette 44,63 44,63 44,63
Huile Huile de soja Huile de soja Huile de soja
% wt huile / cœur 25 25 25
% wt huile 1 gouttelette 14,88 14,88 14,88
% wt cœur / gouttelette 59,51 59,51
% mol. cœur / gouttelette 65,85
Formulation (nombre de répétition) 4 4 3
RESULTAT Diamètre hydrodynamique (nm) - average 153,03 162,2 168,9
ZP (mV)_dans NaCI 0,15 mM -37,71 53,7 51 ,83
Stabilité ok ok ok
Complexation (%) 0 100 100
Efficacité d'extinction (%) 0 80,51 81 ,72
Tableau 5 Dans les tableaux 1 à 5 :
% wt correspond à un pourcentage massique. % mol. correspond à un pourcentage molaire.
ND (non déterminé) signifie que l'expérience n'a pas été réalisée
Les pourcentages « /gouttelette » représentent des pourcentages par rapport à l'ensemble (Lipoid/DOTAP/Myrj S40/ éventuel DOPE/Suppocire NB/Huile de soja).
Les pourcentages « /couronne » représentent des pourcentages par rapport à l'ensemble (Lipoid/DOTAP/Myrj S40/éventuel DOPE).
Les pourcentages « /couronne sans PEG » représentent des pourcentages par rapport à l'ensemble (Lipoid/DOTAP/éventuel DOPE).
Les pourcentages « /cœur » représentent des pourcentages par rapport à l'ensemble (Suppocire NB/Huile de soja).
Le Lipoid S75-3 comprend 65-75% de phosphatidylcholine. Les chaînes aliphatiques des phospholipides sont majoritairement saturées (composition moyenne : 12-16 % de C16:0, 80-85% de C18:0, < 5 % de C18:1 , < 2 % de C18:2).
Le Lipoid S75 comprend 65-75% de phosphatidylcholine. Les chaînes aliphatiques des phospholipides sont majoritairement insaturées (composition moyenne : 17-20 % de C16:0, 2-5 % de C18:0, 8-12 % de C18:1 , 58-65 % de C18:2, 4-6 % de C18:3).
Le Lipoid S100-3 comprend >94 % de phosphatidylcholine. Les chaînes aliphatiques des phospholipides sont majoritairement saturées (composition moyenne : 12-16 % de C16:0, 85-88% de C18:0, < 2 % de C18:1 , < 1 % de C18:2).
Les formulations A1 , B1 , B4 et C1 sont des exemples comparatifs, car elles ne comprennent pas de co-tensioactif cationique.
Leurs potentiels zêta sont négatifs.
La complexation de siARN n'a pas eu lieu en surface des gouttelettes, conformément à ce qui était attendu.
La formulation B9 est un exemple comparatif, car elle ne comprend pas de lipide amphiphile. L'émulsion n'a pas pu être préparée. Le procédé de préparation suivant a été suivi :
(i) Préparation de la phase huileuse :
L'huile de soja, la suppocire NC, le lipide amphiphile, le DOTAP, l'éventuel DOPE, ont été pesés puis mélangées avec du dichlorométhane avant d'être chauffés à 60 'Ό afin d'obtenir une solution visqueuse homogène. Le dichlorométhane permet de favoriser la solubilisation. Les solvants ont ensuite évaporés sous vide.
(ii) Préparation de la phase aqueuse : Pendant la phase d'évaporation de l'éthanol, la phase aqueuse a été préparée. Dans un eppendorf de 5ml, le co-tensioactif, du glycérol et la solution aqueuse de PBS (NaCI 1 54 mM, pH 7,4) ont été mélangés puis dissous dans un bain à 75°C.
(iii) Mélange des deux phases :
La phase huileuse était à environ 40 ^ (sous forme visqueuse) et la phase aqueuse à environ 70 °C (en sortie du bain). La phase aqueuse a été versée dans la phase huileuse.
(iv) Emulsification :
Le flacon contenant les deux phases a été fixé dans l'enceinte de sonication d'un sonificateur AV505® (Sonics, Newton, USA). Le protocole consistait en la réalisation de cycles de sonication (10 secondes d'activité toutes les 30 secondes) à une puissance de 100 W sur une période de 40 minutes.
(v) Purification :
Les gouttelettes ainsi produites ont ensuite été purifiées par dialyse (seuil de coupure : 12 kDa, contre du NaCI 154 mM, sur une nuit) pour éliminer les composants lipidiques non- intégrés aux LNP. Finalement, la formulation a été stérilisée par filtration sur membrane de cellulose.
• Taille des gouttelettes des formulations et potentiel zêta - Influence de la composition de la formulation
Les résultats des tableaux 1 à 5 montrent qu'une diminution de la proportion en co- tensioactif (Myrj S40) conduit à une augmentation du diamètre des gouttelettes.
- Evolution dans le temps
L'évolution de la taille des gouttelettes (Tableau 6) et du potentiel zêta (tableau 7) des formulations ont été mesurées à 40 °C (stabilité accélérée). Les formulations étaient conservées à 40 ^ entre deux mesures.
Figure imgf000067_0001
mesurés par diffusion quasi-élastique de la lumière en fonction du temps Jours B1 B4 B5 B6 B10 C1 C2
0 -21 ,3 -21 ,16 24,03 34,13 34,97 -40,27 57,33
7 -25,6 -21 ,17 28,23 31 ,77 34,73 -43,13 56,77
14 -24,73 -21 ,03 29,45 28,4 33,47 -42,33 55,33
21 -21 ,8 -20,47 28,63 34,3 33,07 -38,1 53,9
28 -18,93 -19,83 27,5 33 31 ,23 -39,03 51 ,6
Tab eau 7 : Evolution du potentie zêta des formulations en fonction du temps
Il a été observé que la taille des gouttelettes et le potentiel zêta de formulations selon l'invention conservées à 40 °C pendant 300 jours n'évoluent pas.
Ces résultats montrent que les formulations selon l'invention sont stables dans le temps.
• Complexation avec des siARN : Préparation de formulations « finales » comprenant des séquences nucléotiques siARN.
La procédure générale suivante a été suivie :
La complexation consiste en un simple mélange des formulations préparées ci- dessus et d'une solution de siARN, le tout dans un tampon. Le choix du tampon est fonction de l'application envisagée : pour une étude in vitro, le milieu de culture optimisé pour les étapes de transfection, OptiMEM, a été utilisé. Pour une étude de complexation, du tampon Hepes 5 mM a été utilisé.
Une quantité de 0,5 μg de siARN (GFP-22 siRNA rhodamine (catalogue n °1 0221 76) (Qiagen) ou siGFP (Sigma)) a été utilisée (25 μg mL dans 20 μΙ_).
Le mélange a été agité durant 30 minutes à 600 rpm, ceci à température ambiante (environ 25 <C).
La complexation a été visualisée à travers deux outils :
- L'électrophorèse sur gel d'agarose qui permet d'observer la migration des siARN. S'il y a une bonne complexation, alors les gouttelettes comprenant les siARN complexés seront plus lourdes que les siARN libres et seront visualisés dans les puits. Si la complexation est moins importante, des siARN libres migrent à une autre position.
- En DLS en observant l'impact de la complexation sur le diamètre hydrodynamique.
Plus la complexation est efficace, plus le profil s'oriente vers une distribution monomodale. La quantité de formulation nécessaire pour avoir un rendement de complexation quantitatif des siARN a été optimisée.
En pratique, les charges négatives apportées par les siARN sont compensées par les charges positives de la formulation (c'est-à-dire les charges positives du tensioactif cationiques DOTAP).
Typiquement, lorsque le seul tensioactif cationique de la formulation est du DOTAP (qui ne comprend qu'une seule charge positive), un rendement quantitatif de complexation est obtenu lorsque le rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN est supérieur à 8/1 , comme illustré sur les figures 2 et 3.
La figure 2 représente un gel d'électrophorèse révélé à l'UV réalisé après complexation de siARN avec la formulation B10 avec des concentrations précisées au tableau 8, en mélangeant une solution de siARN et la formulation dans un tampon Hepes 5 mM. Avant dépôt sur gel d'agarose 1 ,5 %, 2 de tampon de charge ont été ajoutés aux essais. Après 1 h30 d'électrophorèse à 100 V, le gel a été plongé dans du GeIRed 3X. Enfin, une révélation UV a été effectuée.
Figure imgf000069_0001
Tableau 8
La figure 3 donne les résultats obtenus par traitement des données de l'électrophorèse sur le logiciel ImageJ des mêmes expériences. Les figures 2 et 3 montrent que pour un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN supérieur à 8/1 , il n'y a plus de siARN libre dans le milieu et que le siARN a été complètement complexé.
La figure 4 représente l'intensité obtenu sur un appareil ZetaSizer Malvern en fonction du diamètre hydrodynamique en nm pour le siARN libre (comparaison) et pour trois formulations selon l'invention obtenues par complexation avec un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN de 4/1 , de 8/1 ou de 16/1 .
Le diamètre est plus important pour le siARN libre (comparaison).
Avec un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN de 4/1 , on a observé 2 populations : un complexe siARN/gouttelette autour de 100 nm et une population de taille supérieure représentant les siARN sous forme libre (flèche).
Avec les rapports quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN de 8/1 et 16/1 , une seule population représentant le complexe siARN/ gouttelette a été observée.
Ces résultats montrent également qu'une complexation quantitative (100%) des siARN sur les gouttelettes est permise.
L'étape de complexation a été réalisée avec diverses formulations.
A titre comparatif, un test de complexation a été réalisé avec une formulation exempte de tensioactif cationique : la formulation B1 décrite ci-dessus. Comme attendu, la complexation du siARN n'a pas eu lieu et le siARN est resté sous forme libre. La figure 5 représente un gel d'électrophorèse révélé à l'UV avec, de gauche à droite :
- l'échelle,
le siARN libre (témoin)
puis des migrations obtenues par complexation de siARN :
- avec la formulation B1 (exemple comparatif) (pas de complexation, les siARN sont libres), - avec la formulation B6 (prémix formulé 6 mois auparavant) avec un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN de 8/1 (complexation quantitative),
- avec la formulation B6 (prémix formulé 12 mois auparavant) avec un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN de 8/1 , la formulation ayant été conservée 7 mois à température ambiante préalablement à la complexation (complexation quantitative),
- avec la formulation B10 avec un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les siARN de 8/1 (complexation quantitative),
- avec de la lipofectamine (exemple comparatif) (complexation incomplète). La complexation de siARN est quantitative lorsque la formulation B6 ou B10 ont été utilisées. Le stockage de la formulation à température ambiante avant sa complexation avec le siARN n'a pas d'influence sur le rendement de complexation, qui reste quantitatif, ce qui montre la stabilité des formulations utilisées.
Le rendement est quantitatif que la formulation utilisée comprennent ou non du DOPE.
Avec l'agent de transfection commercial Lipofectamine RNAimax, plus de 60 % des siARN ont été retrouvés sous forme libre. Ceci implique que les formulations de nanoémulsions utilisées dans l'invention offrent un meilleur rendement de complexation que la Lipofectamine.
Enfin, une cinétique de relargage des siARN du complexe siARN/formulation B10 préparé ci-dessus a été effectuée pour observer l'évolution de la complexation au cours du temps et est illustrée en figure 6. Jusqu'à 3 heures après complexation, les siARN ne sont pas retrouvés sous forme libre. A 6 heures, les siARN commencent à être relargués. Le complexe est donc stable au moins trois heures.
• Transfection in vitro
Des tests de transfection ont été effectués sur différentes lignées cellulaires sur- exprimant la Green Fluorescent Protein (GFP, Protéine de fluorescence verte) en apportant un siARN inhibant spécifiquement une séquence de l'ARN messager de cette protéine (GFP-22 siRNA rhodamine (catalog n °1022176) (Qiagen)).
La transfection a été effectuée avec une concentration finale en siARN de 100 nM. Ainsi, des cellules exprimant la GFP ont été ensemencées dans des plaques 12 puits (25 000 cellules/puits) puits traitées avec les complexes siARN/Formulations (B1 , B6, B6 7 mois après sa préparation ou B10) obtenus ci-dessus. Les cellules sont ensuite incubées 72 heures à 37 °C, puis récupérées pour analyse de l'intensité de fluorescence au cytomètre en flux pour déterminer l'efficacité de la formulation en tant qu'agent de transfection. La délivrance active de siARN inhibant spécifiquement l'expression de la protéine GFP induit une diminution de la fluorescence apportée par cette protéine.
L'agent de transfection commercial, la Lipofectamine RNAimax a été utilisé pour comparaison.
La figure 7 représente la diminution de l'intensité de fluorescence FITC en % en transfectant les lignées cellulaires avec :
- de la Lipofectamine RNAimax,
le complexe siARN/formulation B1 ,
- avec le complexe siARN/formulation B6, la formulation ayant été conservée 7 mois à température ambiante préalablement à la complexation,
- avec le complexe siARN/formulation B6, la formulation ayant été conservée 12 mois à température ambiante préalablement à la complexation,
avec le complexe siARN/formulation B10,
- avec un complexe siARN / formulation de liposomes cationiques comprenant du DOTAP (58% wt), du DOPE (18% wt), du cholestérol (2% wt) et du DSPE-PEG3000 (22% wt)) (comparatif).
Ainsi, une diminution de la fluorescence de 33 à 50% est observée avec les formulations selon l'invention testées. Les formulations selon l'invention permettent donc une délivrance active de siARN induisant une extinction relative de l'expression du gène de la GFP.
De plus, en incorporant du DOPE dans les formulations, une plus importante extinction de fluorescence est visible, le DOPE favorisant l'échappement endosomal.
Aucune diminution de la fluorescence n'a été observée avec le complexe ssiARN / formulation de liposomes cationiques, ce qui pourrait par exemple s'expliquer par une mauvaise stabilité des liposomes dans le milieu de culture, un mauvais rendement de complexation et/ou une mauvaise rétention des siARN par les liposomes après complexation. Enfin, de tels résultats sur la délivrance active de siARN médiée par les formulations selon l'invention ont été reproduits sur 3 lignées cellulaires exprimant la GFP : U20S, PC3 et Hela, comme illustré en figure 8.
• Complexation avec un microARN synthétique : Préparation de formulations « finales » comprenant des séquences nucléotiques de microARN synthétique (mimic).
La procédure générale suivante a été suivie :
La complexation consiste en un simple mélange de la formulation premix A3 préparée ci-dessus et d'une solution de microARN (miRIDIAN Mimic Human has- miR612 (ThermoScientific REF#C-300937-01 Lot n °13061 1 )), le tout dans un tampon. Le choix du tampon est fonction de l'application envisagée : pour une étude in vitro, le milieu de culture optimisé pour les étapes de transfection, OptiMEM®, a été utilisé. Pour une étude de complexation, du tampon HEPES 5 mM a été utilisé.
Une quantité de 0,5 μg de microARN (miRIDIAN Mimic Human has-miR612 (ThermoScientific REF#C-300937-01 Lot n °13061 1 ) a été utilisée.
Le mélange a été agité durant 30 minutes à 600 rpm, ceci à température ambiante (environ 25qC).
La complexation a été visualisée par révélation d'un gel d'agarose obtenu par électrophorèse, qui permet d'observer la migration des microARN. S'il y a une bonne complexation, alors les gouttelettes comprenant les microARN complexés sont plus lourdes que les microARN libres et seront visualisés dans les puits. Si la complexation est moins importante, des microARN libres migrent à une autre position.
La quantité de formulation premix A3 nécessaire pour avoir un rendement de complexation quantitatif des microARN a été optimisée.
En pratique, les charges négatives apportées par les microARN sont compensées par les charges positives de la formulation premix (c'est-à-dire les charges positives du tensioactif cationiques DOTAP). Typiquement, lorsque le seul tensioactif cationique de la formulation premix est du DOTAP (qui ne comprend qu'une seule charge positive), un rendement quantitatif de complexation est obtenu lorsque le rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les microARN (rapport N/P) est supérieur à 8/1 , comme précédemment avec les siARN. La figure 9 représente un gel d'électrophorèse révélé à l'UV réalisé après complexation de microARN avec la formulation A3 avec des concentrations précisées au tableau 9, en mélangeant une solution de microARN et la formulation premix A3 dans un tampon HEPES 5 mM. Avant dépôt sur gel d'agarose 1 ,5 %, 2 μΙ_ de tampon de charge ont été ajoutés aux essais. Après 1 h30 d'électrophorèse à 100 V, le gel a été plongé dans du GeIRed 3X. Enfin, une révélation UV a été effectuée.
Figure imgf000074_0001
Tableau 9
La figure 9 montre que pour un rapport quantité de charges positives dues au tensioactif cationique dans la formulation « prémix » sur la quantité de charge négative apportée par les microARN supérieur à 8/1 , il n'y a plus de microARN libre dans le milieu et que le microARN a été complètement complexé, comme illustré dans les figures 2 et 3 avec les siARN.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Formulation sous forme de nanoémulsion, comprenant une phase aqueuse continue et au moins une phase dispersée, et comprenant :
- au moins 5% molaire de lipide amphiphile,
- de 15 à 70% molaire d'au moins un tensioactif cationique comprenant :
- au moins un groupe lipophile choisi parmi :
- un groupe R ou R-(C=0)-, où R représente une chaîne hydrocarbonée linéaire comprenant de 1 1 à 23 atomes de carbone,
- un ester ou un amide d'acides gras comprenant de 12 à 24 atomes de carbone et de phosphatidyléthanolamine, et
- un poly(oxyde de propylène), et
- au moins un groupe hydrophile comprenant au moins un groupe cationique choisi parmi :
- un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 12 atomes de carbone et interrompu et/ou substitué par au moins un groupe cationique, et
- un groupe polymérique hydrophile comprenant au moins un groupe cationique, et
- de 10% à 55% molaire d'un co-tensioactif comprenant au moins une chaîne poly(oxyde d'éthylène) comprenant au moins 25 unités d'oxyde d'éthylène,
- un lipide solubilisant,
- éventuellement un lipide fusogène,
où les pourcentages molaires de lipide amphiphile, de tensioactif cationique et de co- tensioactif sont par rapport à l'ensemble (lipide amphiphile / tensioactif cationique / co- tensioactif / éventuel lipide fusogène).
2. Formulation selon la revendication 1 , dans laquelle le tensioactif cationique est choisi parmi :
le Λ/[1 -(2,3-dioléyloxy) propyl]-/V,/V,/V-triméthylammonium,
- le 1 ,2-dioleyl-3-trimethylamonium-propane,
- le A/-(2-hydroxyethyl)-/V,/V-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy-1 -propananium),
le 1 -[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium, et
- le dioctadecylamidoglycylspermine.
3. Formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, comprenant un lipide fusogène, tel que la 1 ,2-Dioléoyl-sn-Glycéro-3-Phosphoéthanolamine.
4. Formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le lipide amphiphile est un phospholipide.
5. Formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant un agent d'imagerie.
6. Formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant un agent thérapeutique.
7. Formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant un co- tensioactif greffé avec une molécule d'intérêt, de préférence un ligand biologique de ciblage.
8. Formulation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant une séquence nucléotidique mono ou double brin, comprenant moins de 200 bases pour une séquence nucléotidique mono brin ou moins de 200 paires de base pour une séquence nucléotidique double brin, et susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence.
9. Formulation selon la revendication 8, où ladite séquence nucléotidique est choisie parmi :
un petit ARN interfèrent,
- un acide nucléique bloqué, et
- un microARN synthétique.
10. Formulation selon la revendication 9, où ladite séquence nucléotidique est un petit ARN interfèrent.
1 1 . Procédé de préparation d'une formulation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, comprenant les étapes suivantes :
(i) préparer une phase huileuse comprenant un lipide solubilisant, un lipide amphiphile, le tensioactif cationique;
(ii) préparer une phase aqueuse comprenant le co-tensioactif; (iii) disperser la phase huileuse dans la phase aqueuse sous l'action d'un cisaillement suffisant pour former une formulation sous forme de nanoémulsion telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 7; puis
(iv) ajouter une séquence nucléotidique mono ou double brin, comprenant moins de 200 bases pour une séquence nucléotidique mono brin ou moins de 200 paires de base pour une séquence nucléotidique double brin, et susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence à la formulation sous forme de nanoémulsion telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, puis
(v) récupérer la formulation ainsi formée.
12. Méthode d'introduction in vitro d'une séquence nucléotidique mono ou double brin, comprenant moins de 200 bases pour une séquence nucléotidique mono brin ou moins de 200 paires de base pour une séquence nucléotidique double brin, et susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence dans une cellule eucaryote, comprenant la mise en contact de la cellule eucaryote avec une formulation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10.
13. Formulation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie.
14. Kit comprenant la formulation sous forme de nanoémulsion telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et séparément, au moins une séquence nucléotidique mono ou double brin, comprenant moins de 200 bases pour une séquence nucléotidique mono brin ou moins de 200 paires de base pour une séquence nucléotidique double brin, et susceptible de moduler des mécanismes endogènes d'ARN interférence.
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