WO2014013122A1 - Extracto polifenólico a partir de residuos de uva blanca - Google Patents

Extracto polifenólico a partir de residuos de uva blanca Download PDF

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WO2014013122A1
WO2014013122A1 PCT/ES2013/070526 ES2013070526W WO2014013122A1 WO 2014013122 A1 WO2014013122 A1 WO 2014013122A1 ES 2013070526 W ES2013070526 W ES 2013070526W WO 2014013122 A1 WO2014013122 A1 WO 2014013122A1
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white grape
bagasse
white
mixture
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PCT/ES2013/070526
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Marta LORES AGUIN
Carmen GARCIA JARES
Marta ALVAREZ CASAS
Maria LLOMPART
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Universidade De Santiago De Compostela
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Definitions

  • the present invention relates to polyphenolic extracts, their method of obtaining and their uses.
  • Barker and collaborators developed a new method for the disruption and extraction of solid samples: the matrix dispersion in solid phase ("matrix soüd-phase dispersion", MSPD) (US 08 / 026,275).
  • matrix soüd-phase dispersion MSPD
  • This procedure combines aspects of several techniques for the disruption of the sample and, at the same time, generates a material that has a unique character for the extraction of the compounds of interest from a given sample.
  • the first applications of the MSPD were oriented to the isolation of active components or metabolites present in biological matrices, but later this technique has also been applied to the extraction of natural compounds (vitamins, flayonoids), pesticides and other contaminants from animal tissues, treats, vegetables and other food, biological and environmental matrices.
  • the MSPD involved mixing a viscous, solid or semi-solid sample with a solid silica support previously derivatized to produce a bonded organic phase on its surface, such as octadecylsilyl (C18).
  • Some applications of the MSPD have assuming the mixing of the samples with silicates without derivatizing (silica gel, sand, etc.) or other organic solids (graffiti fibers) or inorganic (Florisil, alumina, etc.).
  • silicates without derivatizing (silica gel, sand, etc.) or other organic solids (graffiti fibers) or inorganic (Florisil, alumina, etc.).
  • the SPD technique has been optimized for extractions with very small amounts of samples, less than 50 milligrams and using a quantity of solvent of the order of microliters, which makes this technique a miniaturized process that allows analysis Chromatographic samples (x ⁇ stenson, EM: Haverkate, E.GJ .; Slooten, CJ; Ramos, L .; Vreuls., RJJ; Brinkman, Ü.A.Th, Min ⁇ aturized autorr ⁇ ated raafrix solid-phase dispersion ext action of pesti cides in fruit folio wed by gas chromatographic-mass spectrometric analysis. J. Chromatogr.
  • the present invention provides a simple and short-term process for obtaining extracts with antibacterial antioxidant properties from white grape residues. This procedure uses non-polluting materials, takes place in mild conditions and also avoids suspended solids in the eluates obtained, so that a subsequent filtration process is not necessary.
  • the process of the invention allows the provision of extracts at the industrial level.
  • the invention is directed to a process for obtaining an extract from white grape residue comprising: a) preparing a mixture comprising white grape residue and a dispersant, b) adding a solvent, c) elute, and d) collect euuates.
  • the invention is directed to a white grape polyphenylene extract characterized by the absence of anthocyanins and a pH between 4 and 8 measured in aqueous solution.
  • the invention relates to a cosmetic, pharmaceutical or nutritional composition comprising the extract described above.
  • the invention also relates to the use of the extract of the invention for the preparation of a food preservative or an antibacterial composition
  • Figure 2 Represents the total polyphenols index expressed in mg equivalent of gallic acid per gram of bagasse (dry weight) with respect to the mass of the starting sample (1, 10 and 20 g, respectively).
  • Figure 3 Represents the anti-oxidant activity in millimoles of Trolox of the extracts of example 1.1.
  • Figure 4 Resistance-sensitivity test to the antimicrobial agent performed with the white grape residue extract obtained in example 1, on a plate covered with colonies of the Gram + S bacteria, aureus. The. patent size of the halo inhibited against control.
  • the process of the invention makes it possible to use any white grape residue as a starting material, such as bagasse, lees, pulp, skin, depleted seeds or pomace (distillation residue).
  • the white grape residue is selected from bagasse, lees, pulp, skin, depleted seeds or pomace.
  • the distribution of phenolic substances in grapes is not homogeneous, for example, the pulp contains approximately 83% to 91%; the skins or skins between 7 and 12% and the seeds can reach 6%.
  • the white grape residue is bagasse.
  • the white grape residue is previously stored between -40 ° C and 20 ° C, preferably between -30 ° C and! ⁇ ) "C.
  • the grape is the edible fruit of the vine, small and round or oval in shape, with a very juicy flesh and a thin skin; it was used to make wine.
  • the majority of the cultivated grape comes from the Vitis species vinifera, a native of Mediterranean Europe and Central Asia, grapes are classified fiuidamentally into two types: white and black or red grapes.
  • Each type of grape has a different polyphenol composition, especially with regard to white and red grapes, which will be reflected in the wines that are made from them.
  • red wines there is a greater amount of polyphenols in general, due to the different way in which it is fermented.
  • white wine is made by fermenting exclusively the juice squeezed from the grapes
  • red wine is made by macerating the must with the skin and the seeds for a certain time. This causes the waste generated in the white wine process (white grape bagasse) be very rich in polyphenols, to the extent that they have passed into wine in smaller quantities.
  • white grape residues are of interest for the present invention.
  • White grape residues can come from any variety of white grapes.
  • the white grape residues are selected from the varieties Airón, Alarije, Albalonga, Alba ⁇ á, Albari ⁇ o, Ca ⁇ nho Branco, Aligóte, Altesse, Arinto, Améis, Ai-vine, Assyrtiko, Auxerrois Blanc, Barcelos, Bogdanusa, Bacchus, Bical, Bouvier, Bual, Catarratto, Chardonnay, Chasselas, Chenin Blanc, Clairette, Cut, Courbu, Crouchen, Cserszeg ⁇ Füszeres, Doradilio, Erbaluce, Ehrenfelser, Ezerjó, Faber, Falangfaina, Feteascá Alba.
  • the white grape residues are selected from the white grape residues of the Albari ⁇ o, Treixadura, Godello, Loure ⁇ ra Ca ⁇ fio Blanco variety.
  • the Albari ⁇ o variety accounts for 95% of the total white grape production in Galicia ⁇ Consell Regulador DO Rias Baixas).
  • the white grape residue is bagasse of the variety selected from the group consisting of Albari ⁇ o, Caifio Blanco, Godello, Torrontés and Treixadura.
  • dispenser refers to a solid material that mixed with a biological sample allows its disruption and its dispersion on its surface, so that the mechanical mixture disturbs the architecture of the sample, breaking the material in smaller pieces and increasing the release of the chemical compounds present inside the plant cells of the sample.
  • the dispersant is selected from the group consisting of sand, ⁇ lor ⁇ sü, C18, alumina and silica ge !, In a particular embodiment the dispersant is sand. In a particular embodiment the dispersant is sand of natural origin. In a particular embodiment the grain size of the dispersant is selected between 100 pm and 1 mm, preferably between 250 ⁇ and 320 ⁇ .
  • the preparation of the mixture comprising white grape residue and a dispersant can be carried out using a mortar (glass, porcelain, agate) or any other device that allows the mixture to be crushed and homogenized mechanically. This stage takes place in a temperature range between 10 ° C and 40 ° C and atmospheric pressure, which is why there is no risk of degradation of the compounds to be extracted.
  • the dispersant and the sample are mixed at a temperature between 10 and 40 ° C and at a pressure between 0.8-1.2 atm.
  • the weight ratio between the white grape residue and the dispersant is between 1: 1 and 1: 3, preferably 1: 2.
  • the solvent of step b) described above is in a proportion of between 0.05 and 8 volumes of solvent with respect to the weight of the mixture of white grape residue and dispersant, preferably between 0.1 and 5 volumes
  • the invention is directed to a process as described above, where the suspension of step b) is maintained between 1 and 36 hours at a temperature between 10 ° C and 40 ° C Preferably between 5 and 24 hours.
  • the process of the invention further comprises elution of the mixture of step a) with the eluates collected in step d).
  • step d) is repeated between 1 and 7 times.
  • step d) is repeated 3, 4 or 5 times.
  • the process of the invention comprises: a ') preparing a mixture comprising white grape residue and a dispersant, b') adding a solvent to the mixture prepared in step a) and maintaining between 1 and 36 hours at a temperature between 10 ° C and 40 ° C, c ') elute the mixture from stage a) with a solvent, d') collect the eluates, e ') elute the mixture from stage a) with the eluates collected with stage d ').
  • the solvent is independently selected from the group consisting of water, alkyl alcohol, glycols, or mixtures thereof.
  • alkyl alcohol refers to a substance with a linear or branched hydrocarbon chain containing a hydroxyl group, between 1 and 12 carbon atoms, preferably between 1 and 6 carbon atoms. They are, for example, alkyl alcohols methane !, ethanol, isopropanol, tere-buril alcohol, etc. In a particular embodiment the alkyl alcohol is selected from methane], ethanol, isopropanol, and mixtures thereof.
  • glycoc refers to a substance with a linear or branched hydrocarbon chain containing two or more hydroxyl groups, between 1 and 12 carbon atoms, preferably between 1 and 8 carbon atoms, and optionally may contain one or more ether groups.
  • the glycol is selected from 1,2-ethanediol (ethylene glycol), butane-1,4-diol (1,4-butylene glycol), butane-1, 3-diol, butane-1,2- d.iol, butane-2,3 ⁇ diol, 1,5-pentanediol (pentylene glycol), 2 ⁇ methi-2,4-pentanediol (hexylene glycol), 2- ⁇ 2-ethoxyethoxy) ethanol (diethylene glycol monoethyl ether), ether 2 5 2'-dihidrox ⁇ d ⁇ propilo (d ⁇ propiienglieo ⁇ ) and 1,2- octanediol eapr ⁇ lil glycol).
  • 1,2-ethanediol ethylene glycol
  • butane-1,4-diol 1,4-butylene glycol
  • butane-1, 3-diol butane-1,2-
  • the process of the invention comprises the following steps: a ") prepare a mixture comprising white grape and sand bagasse in a weight ratio of between 1: 1 and 1: 3, b") add a mixture glycols / water in a volume between 0, 1 and 5 with respect to the weight of the white grape residue dispersant mixture from stage a ") and keep between 5 and 24 hours at a temperature between 10 ° C and 40 ° C,
  • the dissolvent employed in the process of the invention may have a modified p ' H of between 0.5 and 3.
  • This pH is achieved by adding organic or inorganic acids to the solvent prior to use, for example. hydrochloric acid, acetic acid, phosphoric acid, etc.
  • the process of the invention further comprises evaporation of the solvent.
  • the process of the invention further comprises a lyophilization step.
  • a lyophilization stage it is possible to pre-freeze the collected eluates or the eluates after evaporation of the solvent.
  • the lyophilization is carried out between -50 ° C and ⁇ 20 ° C, preferably between -45 ° C and -35 0 C, in a particular embodiment the lyophilization is carried out between 1,31.10 ⁇ atm and 6.6Q.10 "6 atm (1-50 m Hg), preferably between 1.31. ⁇ O " 6 atm and 1-31.10 "5 atm (1-10 ⁇ Hg).
  • the extract is stable and n addition is necessary of stabilizers in the lyophilization stage, however, it is possible to add small amounts of sugars such as glucose, sucrose or trehalose at a concentration ranging from 1% to 5% or other molecules that act as cryoprotectants and / or lioprotectors.
  • sugars such as glucose, sucrose or trehalose at a concentration ranging from 1% to 5% or other molecules that act as cryoprotectants and / or lioprotectors.
  • the extract of the invention after lyophilization is not altered in any way.
  • the invention is directed to a polyphenolic white grape extract obtainable by any of the methods described above, In another aspect, the invention is directed to a white grape polyphenolic extract characterized by the absence of anthocyanins and a pH between 4 and 8 measured in aqueous solution. In a particular embodiment, the invention is directed to a white grape polyphenolic extract obtainable by any of the methods described above, characterized by the absence of anthocyanins and a pH of between 4 and 8 measured in aqueous solution.
  • the invention is directed to a white grape polyphenolic extract characterized by a) an index of total polyphenols of between 8 and 50 mg of gallic acid / g of dried bagasse; b) a concentration of gallic acid between 0.035 0.125 mg / g of dried bagasse; c) a concentration of catechins between 0.3 and 1.28 mg / g of dried bagasse; d) a concentration of epicatechin between 0.3 and 0.80 mg g of dried bagasse; e) a pH between 4 and 8; and f) absence of aniocians.
  • the invention is directed to a white grape polyphenolic extract characterized by a) an index of total polyphenols of between 15 and 25 mg of gallic acid / g of dried bagasse; b) gallic acid between 0.064 and 0j082 mg g of dried bagasse; c) catechin between Q: ⁇ 4 and 1, 23 mg / ' .g of dried bagasse; d) epicatechin between 0.63 and 0.68 mg g of dried bagasse, e) a pH between 4 and 8 measured in aqueous solution; and f) absence of anthocyanins.
  • the previously described extract further comprises at least one of the compounds selected from quercetins, epieatequ ⁇ n-ga ⁇ ato and procyanidins Bl and B2, and mixtures thereof.
  • the quercetins are selected from quercetin, quercetin 3-glycoside and quercetin 3-glueuronide.
  • anthocyanins refers to a group of flavonoid polyphenols comprising the set consisting of anthocyanides and anthocyanidins, which also includes the ossidic combinations of an anthocyanidin with a sugar. They are responsible for the bluish red color of the skin of red grapes.
  • the white grape polyphenolic extract is obtainable by the procedure described above.
  • the extract is in solution, in suspension or freeze-dried.
  • the extract is in solid form, as a powder or as a paste.
  • the invention is directed to a cosmetic composition comprising the extract previously described.
  • compositions according to the invention include any liquid composition or any composition comprising the extract of the invention and which is in the form of ge ⁇ , cream, ointment or balm for topical administration.
  • Said cosmetic composition can be applied to various surface parts of the human or animal body such as the skin, hair and hair system, nails, lips or mucous membranes of the human or animal body,
  • the cosmetic composition may also incorporate active molecules of an ipophilic and hydrophilic nature having properties as a cosmetic or personal hygiene agent.
  • active molecules that can be incorporated there may be mentioned emollient agents, preservatives, fragrance substances, anti-acne agents, antifungal agents, antioxidants, deodorants, antiperspirants, anti-dandruff agents, depigmenting agents, anti-seborrheic agents, dyes, tanning lotions, UV light absorbers, enzymes, among others.
  • the invention relates to a pharmaceutical or dermatological composition comprising the extract described above.
  • compositions according to the invention include any liquid composition or any composition in the form of gel, ointment, cream or balm for topical administration.
  • the extract of the invention is suitable for the preparation of an antibacterial composition.
  • the invention relates to the use of the extract previously described for the preparation of an antibacterial composition.
  • the antibacterial composition is an antibacterial composition against Gram-positive bacteria.
  • the invention relates to the use of the extract previously described for the preparation of an anti-acne composition.
  • the invention relates to the extract previously described for use as an anti-acne.
  • the The invention is directed to an ani-acne composition comprising the extract of the invention.
  • the invention relates to a nutritional composition
  • Said nutritional composition may be a food, a dietary supplement or a nutritional supplement.
  • Nutritional compositions may include milk, yogurts, fruit and vegetable juices, desserts, baby products or dehydrated products. The adition of! extract to the nutritional composition] is carried out by mixing and homogenization according to the technical procedure to produce each product. Due to its antioxidant properties, the extract of the invention is suitable for the preparation of a food preservative.
  • the invention relates to the use of the extract previously described for the preparation of a food preservative.
  • Said food preservative can be a food additive or be part of a biodegradable container or wrapper.
  • Food preservatives according to the invention include any liquid composition or any composition comprising the extract of the invention and which is in the form of a solid, gel or solution for addition to the food or its container.
  • the invention is directed to a biodegradable container or wrapper comprising the extract of the invention. In another aspect, the invention is directed to a food preservative comprising the extract of the invention.
  • the white grape bagasse samples used come from the varieties; Alhari ⁇ o, Treixadura, Godello, Loureira and Ca ⁇ o Blanco, which are native varieties of Galicia and they come from vinification residues of the cellars of the 5 Galician Designations of Origin.
  • IPT Total Pipiphenoid Index
  • the IPT or total polyphenol index is measured, which is expressed in mg equivalent of gallic acid per gram of dry bagasse. It is a classic and robust spectrophotometric index for which the method described by Singleton et al. (Singleton, VL; Ross ⁇ , JA, Jr., Colorimetry of total phenolics w ⁇ th phosphomolybd ⁇ c-phosphotungst ⁇ c ac ⁇ d reagents, Am. J. EnoL Vitic. 1965, 16, (3), 144-58).
  • the concentration of the total polyphenols was calculated using a calibration curve of gallic acid (and - 0.0735x-0.0044: R 2 - 0.9985), whose concentration range was (3-20 mg.L "s ) , The results were expressed as equivalents of gallic acid (mg.L "1 GAE). The concentrations of the final extracts were expressed as mg of gallic acid per gram of dried bagasse (gallic mg / g dry weight).
  • the mobile phase consists of the solvents (A) 1% formic acid / water and (B) 1% formium acid / rnetanol.
  • the mobile phase gradient starts with 5% B, changes to 20% B at 20 min, and changes to 100% B at 25 min.
  • the total duration of the chromatographic analysis is 25 min with a flow of 1.0 mL min and a column temperature of 50 ° C.
  • the majority polyphenols of the extract were detected at 280 nm and 350 nm and were identified by comparison of their times of retention and of its spectra, with those corresponding to the pure standards analyzed under the same conditions experienced in such.
  • Antioxidant Activity (AA) Antioxidant Activity
  • the antioxidant activity of the extracts was determined with 2,2-diphenylpyridylhydrazyl (DPPH) against Trolox®, using the modified Brand-Williams method (W. Brand-Williams, ME Cuvelier, C. Berset, LWT - Food Sci. Technol .28 (1995) 25).
  • a solution of 0.1 mM DPPH in 100% methanol was prepared.
  • 0.1 mL of the bagasse extract is pipetted and 3.9 mL of the DPPH methanolic solution is added. The mixture is stirred vigorously and allowed to stand in the dark for 30 minutes. The decrease in absorbance of the resulting solution is monitored at 515 nm at 30 min.
  • the AA of the extracts is expressed in mM Trolox / g of bagasse (dry weight).
  • the stock radical solution is prepared fresh daily.
  • IC50 mean maximum inhibitory concentration
  • the IC 5 0 is calculated as the concentration of the plant extract that causes 50% inhibition of the DPPH radical.
  • the synthetic antioxidants Butylhydroxyanisole (BHA) and Butylhydroxytoluene (BHT) were used as reference compounds,
  • Example 1 General process to obtain an ⁇ xidantes and anifbac ⁇ erianos extracts from white grape residues.
  • the extraction of the white grape residues of the Albari ⁇ o variety is carried out in a column with a frit in its lower part and another in its upper part.
  • the dispersant: sample ratio is 2: 1 and is crushed in a mortar.
  • the mixture is poured into the column and lightly compacted for greater contact with the eluent.
  • the elution solvent is then passed through, ensuring a constant elution, and the euuate is collected.
  • Ep ⁇ catechin 920 ppm (0.66 mg g)
  • the extract is also characterized by the presence of caftaric acid, procyanidins (B l B2) 4 epicatequin-gallate and quereetinas (specifically, quercetin, quercetin ⁇ 3- glycoside quercetin 3-gmcuronide).
  • B l B2 procyanidins
  • quereetinas specifically, quercetin, quercetin ⁇ 3- glycoside quercetin 3-gmcuronide.
  • Table 2 IPT data obtained according to the type of solvent used.
  • Extracts were obtained from white grape bagasse of the variety
  • IPT gallic mg / g dried bagasse
  • Table 4 IPT data obtained according to the grain size of the natural area.
  • Extraction was carried out as described in example 1.
  • the maceration is studied by contacting the solvent with the mixture for three hours to finally be collected by gravity or by using a pump, which accelerates the eluate collection process.
  • the pump used has a maximum flow of 7 L / min.
  • Table 6 IPT data obtained with different mass of starting sample.
  • IPT (mg gallon / g dry bagasse)
  • Table 8 IPT data obtained with the different white varieties tested.
  • Example 2 Extraction was carried out as described in Example 1 using only the raw material isolated from seeds isolated from white grape bagasse.
  • the IPT of the extract obtained from the seeds is 40.21 ⁇ 3.78 (gallic mg / g dried seeds),
  • Example 2 Scaling of the general process for obtaining antioxidant and antibacterial extracts from white grape residues.
  • the extraction of the white grape residues of the Albari ⁇ o variety is carried out in a column of dimensions greater than that used in Example 1.
  • a column of dimensions greater than that used in Example 1.
  • between 1 10 kg of bagasse and between 3 30 kg of dispersant are mixed. Once crushed, the mixture is poured into the column and then Enter the elution solvent. The mixture is macerated between 6 and 3.6 hours and then, ensuring a constant elution, the eluate is collected.
  • the volume of elution solvent, a mixture of 1,3-butanedioI and water, is between 1 and 5 L.
  • the data obtained for this particular embodiment are detailed in Table 9.
  • Table 9 Characteristic data of the extract obtained in example 2.
  • Example 3 Evaluation of the activities of the extracts obtained Example 3.1, Antioxidant and antiradial activity
  • the antioxidant activity (AA) of the extracts obtained at different scales was determined, using different combinations of solvents or using different types of initial raw material, as indicated in Tables 11 and 12 (and in Figure 3). In . In cases where the pH of the elution solvent is modified, it is adjusted with concentrated HC ' l by monitoring it at a pH meter. The best results were obtained when ⁇ : ⁇ 2 0 (50:50) or white brandy were used as solvents on a 20 g scale, and the differences observed between both results are not statistically significant.
  • Tabl 1 1 Data obtained from AA of the extractions obtained with the Albari ⁇ o variety and different solvents
  • Table 12 Data obtained from AA of extractions obtained with bagasse
  • the AA of the extract obtained in Example 2 was equivalent to 65.46 ⁇ 4.20 mM Trolox or 5310 ppm of Vitamin C.
  • the average anti-oxidant activity (n-5) of the extracts obtained with the larger column was 73 , 1 ⁇ 13.7 mM Trolox.
  • the effectiveness to eliminate free radicals was calculated as detailed in the corresponding methodology section.
  • the results obtained expressed as the mean maximum inhibitory concentration (IC50) were 432 mg GAE / L for the extract obtained in example 2.
  • the data for the synthetic reference antioxidants were 730 mg / L and 8498 mg / L for BHA and the BHT, respectively.
  • the extract of Example 2 has a relative efficacy in the elimination of free radicals that is equivalent to ⁇ 20 times that of BHT and ⁇ 1.7 times that of BHA, in solutions of equivalent concentration.
  • Example 3-2 L Qualitative assessment of Antibacterial Activity by Inhibition Halos
  • TSB medium soy broth and tryptone
  • Luria Brotb Medium 1% tryptone, 1% NaCl, 0.5% yeast extract.
  • Disc / well diffusion tests are based on the ability of many antimicrobial agents to diffuse into the agar creating a continuous concentration gradient. If the disc containing the antimicrobial substance is deposited on a newly inoculated plate, the growth of the analyzed microorganism will occur, at a point of the gradient and will result in a concentric area to the growth inhibition disc / well. This area, being proportional to the minimum inhibitory concentration (CM ⁇ ) will allow the distinction of sensitive, resistant or intermediate strains.
  • CM ⁇ minimum inhibitory concentration
  • Figure 4 shows the photo of the resistance-sensitivity test to the antimicrobial agent, where it can be seen as on a plate completely covered by S. aureus, the "growth inhibition halo" generated by the concentrated extract obtained as described is shown. in example i. In the center of the plate, a control carried out with 50/50 aqueous ethanol (elution solvent of the extracts) can be seen and where the inhibitory halo does not appear.
  • Example 3.2 Quantitative evaluation of the Antibacterial Activity; Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC).
  • the bacteria were grown in LB medium at 37 ° C. Liquid cultures were incubated in an orbital shaker at 200 rpm. In the case of P. acnes, because it is a strict anaerobic battery, the cultures were introduced into an anaerobiosis jar with Anaerocult ®A envelopes (Merck). The jug of anaerobiosis was fixed to an orbital shaker and P. acnes was incubated with gentle agitation in liquid medium to ensure the homogeneous distribution of the extract to be tested, since it has a tendency to precipitate when added.
  • Example 3.2.1 CMI and influence of the vehicle.
  • erlenmeyer flasks containing 18 rnL of liquid culture medium were prepared to which different volumes of the extract (from 20 ⁇ L to 2 mL) were added, adding the amount of vehicle necessary to achieve a final volume of 20 mL in the erlenmeyer flasks.
  • the concentration of butylene glycol was 6.5% in all cases and the concentration of the extract was tested between 0.1 and 10% v / y.
  • microorganism in culture medium without extract or vehicle 2.
  • Control of vehicle influence microorganism: in culture medium with 2 mL of vehicle ⁇ butylene glycol ragua 65:35)
  • Extract contamination control culture medium with 2 ml of the extract The cultures were incubated overnight (approx. 1 to 16 hours) under the conditions mentioned above. Once the incubation was complete, serial dilutions were made from them in tubes containing saline solution. From dilutions 10 " ", 10 and 10 "” 20 ⁇ were taken. of sample that were seeded by extension in Petri dishes with the corresponding solid culture medium and incubated for 24 hours at the appropriate temperature.
  • the MIC values for the bacteria studied have been the following:
  • Example 3.3 Protective activity against UV radiation (UV light absorbing activity)
  • the absorbent activity of the liquid extract obtained as detailed in example 2 against type UV radiation has been studied.
  • a and B> Specifically, the entire " UV " spectrum has been measured, from 200 to 400 nm of a 1: 500 dilution of the extract, which is shown in Figure 7.
  • Table 13 shows the absorbance values at two lengths wavelengths representative of UVB radiation (280 and 320 nffi) two other absorbance values at two wavelengths representative of UVA radiation (350 and 400 toa).
  • Example 2 The stability of the extract obtained in Example 2 under different storage conditions has been studied and a 1% ascorbic acid solution in 65% glycol was used as a control:
  • T ft of storage (with N 2 in head and dark space): T at room (25 ° C); Freezing (-20 ° C); Refrigeration (4 ° C)
  • Exposure to Light (N 2 in head space and 25 ° C): Vial exposed to light.
  • the controls have been programmed as follows: a weekly check during the first month; a biweekly control during the 2nd month; and, from this moment, a monthly check.
  • Table 14 summarizes the results obtained. A statistical comparison of the data has been made, where a value of p 0.05 indicates that there are no significant differences; and that, therefore, the extract is stable in relation to the evaluated parameter.
  • Student i value parameter used to evaluate statistically significant differences between 2 groups of data; null hypothesis (cold); there is no difference between the means versus the alternative hypothesis (H): there is a difference between the means of both groups of data.
  • Probability of rejection of hypothesis is 0.05 (working at 95% confidence): Yes p> 0.05 is accepted 3 ⁇ 4; if /.' ⁇ 0.05, Hj.

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Abstract

Extracto polifenólieo a partir de residuos de uva blanca. La invención se refiere a un proceso sencillo y en pocas etapas para la obtención de extractos con propiedades antioxidantes y antibacterianas a partir de residuos de uva blanca. Por las características de la vinificación en blanco, que se elabora fermentando exclusivamente el mosto exprimido de las uvas, sin contacto con los restos de pulpa, hollejos y pepitas; el residuo generado en el proceso {bagazo de uva blanca) es muy rico en poliíenoles, en la medida en que han pasado al vino en menor cantidad. El procedimiento que se propone emplea materiales no contaminantes, transcurre en condiciones suaves y además evita los sólidos en suspensión en los eluatos obtenidos; permitiendo la provisión de extractos ricos en polifenoles bioactivos utilizables a nivel industrial, fundamentalmente en los sectores cosmético, farmacéutico y/o alimentario.

Description

Extracto polifenólico a partir de residuos de uva blanca Sector de ia técnica
La presenta invención se refiere a extractos polifenólicos, su procedimiento de obtención y sus usos.
Antecedentes
Barker y colaboradores desarrollaron un nuevo método para la disrupción y extracción de muestras sólidas: la dispersión de matriz en fase sólida ("matrix soüd-phase dispersión", MSPD) (US 08/026,275). Este procedimiento combina aspectos de varias técnicas para la disrupción de la muestra y, al mismo tiempo, genera un material que posee un carácter único para la extracción de los compuestos de interés de una muestra dada. Las primeras aplicaciones de la MSPD estaban orientadas al aislamiento de componentes activos o metabolítos presentes en matrices biológicas, pero posteriormente esta técnica también se ha aplicado a la extracción de compuestos naturales (vitaminas, flayonoides), pesticídas y otros contaminantes de tejidos animales, tratas, vegetales y otras matrices alimentarias, biológica y medioambientales.
En su concepción original, la MSPD implicaba la mezcla de una muestra viscosa, solida o semisólida con un soporte sólido de sílica previamente derivatizado para producir en su superficie una fase orgánica enlazada, como por ejemplo octadecílsílil (C18), Algunas aplicaciones de la MSPD han supuesto la mezcla de las muestras con silicatos sin derivatizar (sílica gel, arena, etc.) u otros sólidos orgánicos (fibras grafitizadas) o inorgánicos (Florisil, alúmina, etc.). (Barker, S,A. Matrix soiid-phase dispersión (MSPD). J. Biochem. Biophys. Metho s, 2Θ07, 70, 151-162),
Las primeras aplicaciones de la MSPD a la extracción de polifenoles fueron en el campo de las plantas medicinales, específicamente ácidos fenólicos (Ziaková A, Brandsteterová E, Blahová ti (2003) Matrix soiid-phase dispersión for rae liquid chromatographic detennination of phenolic acids ín Melissa offieinalis, Journal of Chromatography A 983, 271-275) e isofl vonoides (Xiao HB, rueker M, Albert , Li'ang XM (2004) Detennination and identifi catión of isoflavonoíds i Radix astragali by matrix solid- phase dispersión extractíón and high-performance liquid chrornatography with photodiode array and mass spectrometric detection, Journal of Chromatography A 1032, Π 7-124). Más tarde, Manhíta y colaboradores la aplicaron a la extracción de antocianinas a muestras vegetales (Journal of ' Chromatography A, 2006:, 1129, 14-20), en la que parece ser la primera aplicación de esta técnica en Vitis vinifera (uvas tintas). En ocasiones, las cantidades de muestra disponibles para su análisis son limitadas, particularmente en el caso de muestras biológicas, por lo que los errores en la etapa de preparación de muestra se hacen inadmisibles, y los protocolos que implican el uso de pequeñas cantidades de muestra pasan a ser muy valiosos. De este modo, la técnica SPD se ha venido optimizando para extracciones con cantidades muy pequeñas de muestras, inferiores a 50 miligramos y empleando una cantidad de disolvente del orden de los microlítros, lo que convierte a esta técnica en un proceso miniaturzado que permite los análisis cromatográficos de las muestras ( xístenson, E.M.: Haverkate, E.GJ.; Slooten, C.J.; Ramos, L.; Vreuls., R.J.J.; Brinkman, Ü.A.Th, Miníaturized autorríated raafrix solid-phase dispersión ext action of pesti cides in fruit folio wed by gas chromatographic-mass spectrometric analysis. J. Chromatogr. A 2001, 917, 277-286; ristenson, E. .; Shahmiri, S.; Slooten, C.J.; Vreuls, RJJ.; Brinkman, U.A.Th. Matrix solid-phase dispersión micro-extraction of pestícides from single insects with subsequent GC- S analysis. Chromatographia 2004, 59, 315-320),
Aunque existen diversas técnicas para la extracción de polifenoles a partir de residuos vitivinícolas, existe todavía una necesidad de proporcionar un método sencillo, eficaz y fácil m ente industrial ízable.
Descripción breve de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento sencillo y en pocas etapas para la obteneión de extractos con propiedades antíoxidantes antibacterianas a partir de residuos de uva blanca. Este procedimiento emplea materiales no contaminantes, transcurre en condiciones suaves y además evita los sólidos en suspensión en los eluatos obtenidos, por l que no es necesario un proceso de filtrado posterior, El procedimiento de la invención permite la provisión de extractos a nivel industrial.
Así, en un aspecto la invención se dirige a un procedimiento para obtener un extracto a partir de residuo de uva blanca que comprende: a) preparar una mezcla que comprende residuo de uva blanca y un dispersante, b) añadir un disolvente, c) eluir, y d) recoger ios eíuatos.
En otro aspecto, la invención se dirige un extracto polifenólieo de uva blanca caracterizado por la ausencia de antocianos y un pH de entre 4 y 8 medido en disolución acuosa.
En aspectos adicionales, la invención se refiere a una composición cosmética, farmacéutica o nutricional que comprende el extracto descrito anteriormente.
Además, la invención también se refiere al uso del extracto de la invención para l preparación de un conservanté alimentario o de una composición antibacteriana,
Descripción de las figuras
Figura 1... Aspecto de los extractos en disolución obtenidos en algunos de los ejemplos.
Figura 2. Representa el índice de polifenoles totales expresado en mg equivalentes de ácido gálico por cada gramo de bagazo (peso seco) respecto a la masa de muestra de partida (1, 10 y 20 g, respectivamente).
Figura 3. Representa la actividad antíoxidante en milimoles de Trolox de los extractos del ejemplo 1.1.
Figura 4. Ensayo de resistencia-sensibilidad al agente antimicrobiano realizado con el extracto de residuo de uva blanca obtenido en el ejemplo 1, en una placa cubierta de colonias de la bacteria Gram + S, aureus. Se observa el. tamaño patente del halo de inhibició frente al control.
Figura 5. Ensayos de resistencia-sensibilidad al agente antimicrobíano mostrando los halo de inhibició del crecimiento a dos diluciones diferentes del extracto (izqda.) frente a los controles del disolvente utilizado (dcha.) a) B ci w spp b) S.aureus ; c) P, acnés
Figura ó. Ausencia y presencia de colonias bacterianas en una placa Pé'trí con la
Concentración Mínima Inhibitoria y con la concentración anterior ensayada del extract de bagazo de uva blanca, a) S iureus (placa I: 1,5%; placa II: 1,25%); b) B ciüus spp (Placa I: ,25 %; Placa II: 1 %). Figura 7, Espectro UV (200-400 nm) de una dilución 1 :500 del extracto obtenido en el ejemplo 2,
Descripción detallada de la inveación El procedimiento descrito anteriormente es sencillo, económico y fácilmente escalable. Está diseñado para la extracción de polifenoles de manera que los eluatos obtenidos presentan propiedades antioxidantes y antibacteiianas, no comprenden sólidos en suspensión por lo que posteriores etapas de filtración y/o ultrafütración no son necesarios. Esto presenta una ventaja adicional ya que simplifica el proceso y la obtención de los extractos de interés.
El procedimiento de la invención permite emplear como materia de partida cualquier residuo de uva blanca, como por ejemplo, bagazo, lías, pulpa, piel, semillas u orujos agotados (residuo de destilación). En una realización particular, ei residuo de uva blanca se selecciona de bagazo, lías, pulpa, piel, semillas u orujos agotados. La distribución de las sustancias fenólicas en l uva no es homogénea, por ejemplo la pulpa contiene aproximadamente entre el 83 el 91 %; los hollejos o pieles entre el 7 el 12 % y las semillas pueden alcanzar un 6 %, En una realización particular, el residuo de uva blanca es bagazo. En una realización particular el residuo de uva blanca se almacena previamente entre -40°C y 20 °C, preferiblemente entre -30°C y ! í)"C. La uva es el fruto comestible de la vid, pequeño y de forma redonda u ovalada, con una carne muy jugosa y una piel fina; se utiliz para elaborar vino. La mayoría de la uva cultivada proviene de la especie Vitis vinifera, natural de la Europa mediterráne y Asia central. Las uvas se clasifican fiuidamentalmente en dos tipos: uvas blancas y negras o tintas.
Cada tipo de uva presenta una composición en polifenoles diferente, especialmente en lo que se refiere a uvas blancas y tintas, la cual se plasmará en los vinos que se elaboren a partir de las mismas. En los vinos tintos hay mayor cantidad de polifenoles en general, debido a la distinta manera en que se fermenta. Mientras que el vino blanco se elabora fermentando exclusivamente el mosto exprimido de las uvas, el vino tinto se elabora macerando durante un cierto tiempo el mosto con los pellejos y las pepitas. Esto hace que el residuo generado en el proceso de vinificación en blanco (bagazo de uva blanca) sea mu rico en polifenoles, en la medida en que han pasado al vino en menor cantidad. Así, para la presente invención son de interés los residuos de uva blanca. Los residuos de uva blanca pueden proceder de cualquier variedad de uva blanca. En una realización particular, los residuos de uva blanca se seleccionan de entre las variedades Airón, Alarije, Albalonga, Albañá, Albariño, Caínho Branco, Aligóte, Altesse, Arinto, Améis, Ai-vine, Assyrtiko, Auxerrois Blanc, Barcelos, Bogdanusa, Bacchus, Bical, Bouvier, Bual, Catarratto, Chardonnay, Chasselas, Chenin Blanc, Clairette, Córtese, Courbu, Crouchen, Cserszegí Füszeres, Doradilio, Erbaluce, Ehrenfelser, Ezerjó, Faber, Falangfaina, Feteascá Alba. Feteasca Regala, Piano, Flora, Freisaraer, Froníenteau, Garganega Bianca, Gewürztramíner, Gloria, Godello, Goldriesling, Greco, Grenaehe lanc, Grenaehe Gris, Grüner Veltliner, Hárslevelü, Hondarribí Zuri, Huxelrebe, Irsai Oliver, Izsákí Sarfeñér, Jacquére, Juhfark, erner, Krsíaé, Len de l'El, Macabeo, Madeleine Angevine, Malvar, Malvasía, Petit Manseng, Gros Manseng María Gomes, Marsanne, Mauzac, Merseguera, Moschofilero, Mtsvane, Rivaner, Museadet de Bourgogne, Muscat, Moscatel de Málaga, de Setúbül, Moscatel Branco, Muscadelle, Muscat Oítonel, Neuberger, Ondene, Ortega, Pare, Palomino Fino, Parellada, Pecorino, Pedro Xíménez, Pínot Blanc, Pinot Gris, Prosecco, Rabígato, Reíehensteiner, Rhodítis, Rieslmg, Rieslaner, Rkatsiteli, Rotgipfler, Roussanne, Sauvignon Blanc, Savagnín Blanc, Savaíiano, Scheurebe, Schonburger, Sémillon, Septiner, Sercial, Siegerrebe, Sylvaner, Smederevka, Spatrot, Sultana, Symphony, Torrantes, Trebbiano, Treixadura, Treusseau Gris, Verdejo, Verdiso, VerdíccMo, Verduzzo Friulano, Verduzzo Trevigiano, Vermentíno, Vernacciá, Viognier, Riesling Itálico, Würzer, Xarello, Xynisteri, Zeta, Zmsz.
En una realízacíóíi más particular, los residuos de uva blanca se seleccionan de los residuos de uva blanca de la variedad Albariño, Treixadura, Godello, Loureíra Caífio Blanco. La variedad Albariño supone en Galicia el 95 % de la producción total de uva blanca {Consell Regulador DO Rias Baixas). En una realización particular de la invención, el residuo de uva blanca es bagazo de la variedad seleccionada de entre el grupo constituido por Albariño, Caífio Blanco, Godello, Torrontés y Treixadura, Para la presente invención, "dispersante" se refiere a un material sólido que mezclado con una muestra biológica permite su disrupción y su dispersión en su superficie, de modo que la mezcla mecánica perturba la arquitectura de la muestra, rompiendo el material en pedazos de menor tamaño e incrementando la liberación de los compuestos químicos presentes en el interior de las células vegetales de la muestra.
En una realización particular el dispersante se selecciona de entre el grupo constituido por arena, ílorísü, C18, alúmina y sílica ge!, En una realización particular el dispersante es arena. En una realización particular el dispersante es arena de origen natural. En una realización particular el tamaño del grano del dispersante se selecciona de entre 100 pm y 1 mm, preferiblemente de entre 250 μιη y 320 μτη.
La preparación de la mezcla que comprende residuo de uva blanc y un dispersante se puede llevar a cabo utilizando un mortero (vidrio, porcelana, ágata) o cualquier otro dispositivo que permita triturar y homogeneizar la mezcla mecánicamente. Esta etap transcurre en un rango de temperaturas de entre 10 °C y 40 °C y presión atmosférica, razones por las cuales no hay riesgo de degradación de los compuestos a extraer. En una realización particular, el dispersante y la muestra se mezclan a una temperatura de entre 10 y 40 °C y a una presión de entre 0,8-1,2 atm. En una realización particular l relación en peso entre el residuo de uva blanca y el dispersante es de entre 1 :1 y 1 :3, preferiblemente es 1 :2.
En una realización particular, el disolvente de la etapa b) descrita anteriormente está en una proporción de entre 0,05 y 8 volúmenes de disolvente respecto al peso de la mezcla de residuo de uva blanca y dispersante, preferiblemente de entre 0, 1 y 5 volúmenes. De un modo opcional, es posible mantener durante cierto tiempo la suspensión formada en la etapa b) en detenninadas condiciones de forma que se produce la maceracíón de la muestra. Así, en una realización particular la invención se dirige a un procedimiento como se describió anteriormente, donde la suspensión de la etapa b) se mantiene entre 1 y 36 horas a una temperatura de entre 10 °C y 40 °C Preferiblemente entre 5 y 24 horas. Los autores de la invención comprobaron que la recíreulacíón de los eluatos recogidos en la etapa d) pennite disminuir el volumen total de disolvente utilizado en el proceso y además permite airaientar de manera significativa la cantidad de poli fenoles totales estraídos de los residuos de uva blanca. Así, en una realización particular, el procedimiento de la invención comprende además la elución de la mezcla de la etapa a) con los eluatos recogidos en la etapa d). En una realización particular la etapa d) se repite entre 1 y 7 veces. En una realización particular la etapa d) se repite 3, 4 o 5 veces.
La combinación de las etapas de maceradón y de recírculación de los eluatos conducen a un procedimiento más optimizado en cuanto a rendimiento del extracto obtenido y el bajo consumo de disolventes. Así en una realización particular, el procedimiento de la invención comprende: a') preparar una mezcla que comprende residuo de uva blanca y un dispersante, b') añadir un disolvente a la mezcla preparada en la etapa a) y mantener entre 1 y 36 horas a una temperatura de entre 10 °C y 40 °C, c') eluir la mezcla de la etapa a) con un disolvente, d') recoger los eluatos, e') eluir la mezcla de la etapa a) con los eluatos recogidos cu la etapa d').
En otra realización particular, el disolvente se selecciona de forma independiente de entre el grupo constituido por agua, alcohol alquílico, glicoles, o sus mezclas.
En la presente invención "alcohol alquílico" se refiere a una sustancia con una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene un grupo hidroxilo, de entre 1 y 12 átomos de carbono, preferiblemente de entre 1 y 6 átomos de carbono. Son por ejemplo alcoholes alquílícos el metano!, etanol, isopropanol, tere-buril alcohol, etc. En una realización particular el alcoholo alquílico se selecciona entre metano], etanol, isopropanol, y sus mezclas.
En la presente invención "glícolés" se refiere a una sustancia con una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que contiene dos o más grupos hidroxilo, de entre 1 y 12 átomos de carbono, preferiblemente de entre 1 y 8 átomos de carbono, y opcionaímente puede contener uno o más grupos éter. En una realización particular, el glic l se selecciona de entre 1,2-etanodiol (etilenglicol), butano- 1 ,4-diol (1,4- butilenglicol), butano-l,3~díol, butano- 1,2-d.iol, butano-2,3~díol, 1 ,5-pentanodiol (pentilengíicol), 2~metií-2,4-pentanodiol (hexilengiicol), 2-{2-etoxietoxi)etanol (dieíilenglicol monoetil éter), éter 252'-dihidroxídípropilo (dípropiienglieoí) y 1,2- octanodiol eaprílil glicol),. y sus mezclas. En una realización particular, el procedimiento de ía invención comprende las siguientes etapas: a") preparar una mezcla que comprende bagazo de uva blanca y arena en una relación en peso de entre 1 :1 y 1 :3, b") añadir una mezcla glicoles/agua en un volumen de entre 0, 1 y 5 respecto al peso de la mezcla de residuo de uva blanca y dispersante de la etapa a") y mantener entre 5 y 24 horas a una temperatura de entre 10 °C y 40 °C,
c") eluir, d") recoger los eluatos, e") eluir la mezcla de la etapa a) con los eluatos recogidos en ía etapa d').
En una realización particular, eí disolvent empleado en el procedimiento de la invención puede tener un p'H modificado de entre 0,5 y 3. Este pH se consigue mediante la adición de ácidos orgánicos o inorgánicos al disolvente previamente a su utilización como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, etc.
En una realización particular, el procedimiento de la invención comprende además la evaporación del disolvente.
En otra realización particular, el procedimiento de la invención comprende además una etapa de liofilización . En esta etapa de liofilízación es posible congelar previamente los eluatos recogidos o bien los eluatos tras la evaporación del disolvente. En una realización particular la liofilización se lleva a cabo entre -50°C y ~20°C, preferiblemente entre -45°C y -350C, En una realización particular la liofilización se lleva a cabo entre 1,31.10^ atrn y 6,6Q.10"6 atm (1-50 m Hg), preferiblemente entre 1,31. ÍO"6 atm y 1-31.10"5 atm (1-10 μιη Hg). El extracto es estable y n es necesaria la adición de estabilizantes en la etapa de liofilización. Sin embargo, es posible añadir pequeñas cantidades de azúcares tales como glucosa, sacarosa o trealosa a una concentración que oscila desde un 1 % hasta un 5% u otras moléculas que actúen como crioprotectores y/o lioproteetóres. El extracto de la invención después de ía liofilízación no se altera de ningún modo.
En otro aspecto, la invención se dirige a un extracto polifenólico de uva blanca obtenible mediante cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos, En otro aspecto, la invención se dirige a un extracto polifenólico de uva blanca caracterizado por la ausencia de antocianos y un pH de entre 4 y 8 medido en disolución acuosa. En una realización particular, la invención se dirige a un extracto polifenólico de uva blanca obtenible medíante cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos, caracterizado por la ausencia de antocianos y un pH d entre 4 y 8 medido en disolución acuosa
En una realización particular, la invención se dirige a un extracto polifenólico de uva blanca caracterizado po a) un índice de polifenoles totales de entre 8 y 50 mg de ácido gálico/g de bagazo seco; b) una concentración de ácido gálico de entre 0,035 0,125 mg/ g de bagazo seco; c) una concentración de catequína de entre 0,3 y 1,28 mg/ g de bagazo seco; d) una concentración de epicatequina de entre 0,3 y 0,80 mg g de bagazo seco; e) un pH de entre 4 y 8; y f) ausencia de aníocianos.
En una realización particular, la invención se dirige a un extracto polifenólico de uva blanca caracterizado por a) un índice de polifenoles totales de entre 15 y 25 mg de ácido gálico/g de bagazo seco; b) ácido gálico de entre 0,064 y 0j082 mg g de bagazo seco; c) catequina de entre Q:¡¡4 y 1 ,23 mg/'.g de bagazo seco; d) epicatequina de entre 0,63 y 0,68 mg g de bagazo seco, e) un pH de entre 4 y 8 medido en disolución acuosa; y f) ausencia de antocianos.
En una realización particular, el extracto previamente descrito comprende además al menos uno de los compuestos seleccionados de entre quercetinas, epieatequín-gaíato y procianidinas Bl y B2, y sus mezclas. En una realización particular, las quercetinas se seleccionan de entre quercetina, quercetina 3 -glucósido y quercetina 3-glueurónido.
Los métodos de análisis y los aparatos empleados se describen en los ejemplos.
Para la presente invención, "antocianos" se refiere a un grupo de polifenoles flavonoides que comprende el conjunto formado por antoeiamnas y antocíanidinas, que también incluye las combinaciones osídicas de una antoeianidina co un azúcar. Son los responsables del color rojo azulado de la piel de las uvas tintas.
En una realización particular, el extracto polifenólico de uva blanca es obtenible mediante el procedimiento anteriormente descrito. En una realización particular el extracto se encuentra en disolución, en suspensión o iiofiiizado. En otra realización particular, el extracto se encuentra en forma sólida, como polvo o como pasta.
En otro aspecto, la invención se dirige a una composición cosmética que comprende el extracto previamente descrito.
Las composiciones cosméticas según la invención incluyen cualquier composición líquida o cualquier composición que comprenda el extracto de la invención y que esté en la forma de ge}, crema, pomada o bálsamo para su administración por vía tópica.
Dicha composición cosmética puede ser aplicada a diversas partes superficiales del cuerpo humano o animal tal como la piel, sistema piloso y capilar, uñas, labios o mucosas del cuerpo humano o animal,
En una realización particular, la composición cosmética también puede incorporar moléculas activas de naturaleza íipófila e hidrófila que tienen propiedades como agente cosmético o de higiene personal. Entre las moléculas activas que pueden incorporarse pueden citarse agentes emolientes, conservantes, sustancias de fragancia, agentes antiacné, agentes antifiingicos, antioxidantes, desodorantes, antitranspirantes, agentes contra la caspa, despigmentantes, agentes antiseborreicos, tintes, lociones bronceadoras, absorbentes de luz UV, enzimas, entre otros.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica o dermatológica que comprende el extracto descrito anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas o dermatológicas según ¡a invención, incluyen cualquier composición líquida o cualquier composición en la forma de gel, pomada, crema o bálsamo para su administración por vía tópica.
Debido a sus propiedades antíbacterianas, el extracto de la invención es adecuado para 3a preparación de una composición antibacteriana. En un aspecto, la invención se refiere al uso del extracto descrito previamente para la preparación de un composición antibacteriana. En una realización particular, la composición antibacíeriana es tina composición antibacteriana contra bacterias Gram-positivo. En una realización particular, la invención se refiere al uso del extracto descrito previamente para l preparación de una composición anti-acné. En una realización particular, la invención se refiere al extracto descrito previamente par su uso como anti-acné. En otro aspecto, la invención se dirige a una composición aníi-acné que comprende el extracto de la invención.
En otro aspecto la invención se refiere a una composición nutrieional que comprende el extracto anteriormente descrito. Dicha composición nutrieional puede ser un alimento, un suplemento dietético o un suplemento nutrieional. Las composiciones nutricionales pueden incluir leche, yogures, zumos de fruta y de vegetales, postres, productos infantiles o productos deshidratados. La adición de! extracto a la composición nutriciona] se realiza medíante mezcla y homogenizaeíón según el procedimiento técnico para elaborar cada producto, Debido sus propiedades antioxidantes el extracto de la invención es adecuado para la preparación de un conservante alimentario. En un aspecto, ta invención se refiere al uso del extracto descrito previamente para la preparación de un conservante alimentario. Dicho conservante alimentario puede ser un aditivo alimentario o formar parte de un envase o envoltorio biodegradable. Los conservantes alimentarios según la invención incluyen cualquier composición líquida o cualquier composición que comprenda el extracto de la invención y que esté en l forma de sólido, gel o disolución para su adición al alimento o a su envase.
En otro aspecto, la invención se dirige a un envase o envoltorio biodegradable que comprende el extracto de la invención, En otro aspecto, la invención se dirige a un conservante alimentario que comprende el extracto de la invención.
A continuación, y a modo ilustrativo se recogen ejemplos de la invención sin que estos supongan una limitación de la misma.
Métodos empleados
Preparación y conservación de las muestras
Las muestras de bagazo de uva blanca utilizadas proceden de las variedades; Alhariño, Treixadura, Godello, Loureira y Caíño Blanco, que son variedades autóctonas de Galicia y proceden de residuos de vinificación de las bodegas de las 5 Denominaciones de Origen Gallegas.
Para calcular la humedad contenida en las muestras de bagazo se secaron en una estufa 3 g de bagazo a 305 °C, Se pesaron las muestras antes y después de la etapa de secado. Esta operación se llevó a cabo por triplicado.
Todas las muestras de bagazo utilizadas fueron congeladas a una temperatura de -20 °C para su almacenaje, inmediatamente después de su recogida en bodega, donde se introdujo el bagazo en bolsas de plástico (20 x 20 cm) con cierre de zip.
Para la homogeneizacíón de las muestras conteniendo hollejos, restos de pulpa y semillas, se trituraro con un molinillo para café antes de proceder a su extracción mediante el método propuesto.
Indice de Póíifenoies Totales (IPT)
En los siguientes ejemplos se mide el IPT o índice de polifenoles totales, que se expresa en mg equivalentes de ácido gálico por gramo de bagazo seco. Se trata de un índice espeetrofotométrieo clásico y robusto para lo que se empleó el método descrito por Singleton et al. (Singleton, V. L.; Rossí, J. A., Jr., Colorímetry of total phenolics wíth phosphomolybdíc-phosphotungstíc acíd reagents, Am. J. EnoL Vitic. 1965, 16, (3), 144- 58). En un tubo de ensayo se introdujeron 5 mi de la muestra diluida en agua mílli-Q, 100 μΐ, deí reactivo Folin & Cioealteu y 1 mL de una disolución de carbonato sódico (20 % NajCOs en H20 Milli-Q) previamente preparada. Se agitó en vórtex y se dejó reposar 30 min a temperatura ambiente y oscuridad, tiempo suficiente para que el reactivo Folin & Cioealteu sea reducido por los compuestos fenóiieos e condiciones alcalinas, desarrollando color azul. La medida espectrofotométrica se realizó a 760 nm. Se utilizó agua milli-Q como blanco de la medida. La concentración de los polifenoles totales se calculó mediante una curva de calibrado de ácido gálico (y - 0,0735x-0, 0044: R2— 0,9985), cuyo rango de concentraciones fue (3-20 mg.L"s), Los resultados fueron expresados como equivalentes de ácido gálico (mg.L"1 GAE), Las concentraciones de los extractos finales se expresaron como mg de ácido gálico por gramo de bagazo seco (mg gálico/g peso seco).
Análisis de Polifenoles por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (IIPLC) Los extractos concentrados obtenidos como se describen en el ejemplo 1 y 2 se filtraron mediante ün filtro de 0.22 μηι PVDF y se analizaro en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución equipado con. un detector de red de diodos (HPLC-DAD); la columna cromato gráfica utilizada fue una Waters Nova-Pak C18 (3.9 mm 150 mm, 4 μηι, 60 Á). El volumen de inyección fue de 20μ1-.
La fase móvil está constituida por los disolventes (A) 1% ácido fórmico/agua y (B) 1% ácido fórmieo/rnetanol. El gradiente de fase móvil comienza con un 5 % B, cambia al 20% B a los 20 min, y cambia ai 100 % B a los 25 mín. La duración total del análisis cromatográfico es de 25 min con un flujo de 1.0 mL min y una temperatura de la columna de 50 °C, Los poli fenoles mayoritarios del extracto se detectaron a 280 nm y a 350 nm y se identificaron por comparación de sus tiempos de retención y de sus espectros, con los correspondientes a los patrones puros analizados en las mismas condiciones experim en tales . Actividad Antioxidante (AA)
La actividad antioxidante de los extractos se determinó con 2,2-difenilpícrilhidrazilo (DPPH) frente a Trolox®, mediante el método de Brand-Williams modificado (W. Brand- Williams, M.E. Cuvelier, C. Berset, LWT - Food Sci. Technol. 28 (1995) 25). Se preparó una disolución de DPPH 0.1 mM en 100% metanol. En un tubo de centrífuga, se pipetean 0,1 mL del extracto de bagazo y se le añaden 3,9 mL de la disolución metanólica de DPPH. La mezcla se agit vigorosamente y se deja reposar en oscuridad durante 30 minutos. La disminución de la absorbancia de la disolución resultante se monítoriza a 515 nm a los 30 min. La actividad antiradieálica (A A) se determina medíante la siguiente ecuación (y = 0.5223 + 0.0276; R2- 0,999) obtenida por regresión lineal después de representar la A5j 5 de disoluciones conocidas de Trolox frente a la concentración (0,1-1 mM). La AA de los extractos se expresa en mM Trolox/g de bagazo (peso seco). La disolución stock radicálica se prepara fresca diariamente. Actividad antiradieálica
Mediante una adaptación del ensayo anterior se determinó ia concentración inhibitoria máxima media (ÍC50) como medida de la capacidad del extracto para la eliminación de radicales libres, utilizando también el radical estable 2,2-difenilpicrílhidrazilo (DPPH). Se añaden 2 raL de una disolución metanólíca del radical DPPH de concentración 6.10" M 50 μΙ_ de una disolución metanólíca del antioxidante; y se determina la disminución de la absorbencia a 515 nm después de 1 minutos en un espeetrofotómetro UV- Visible. Los porcentajes de inhibición (Pí) del radical DPPH para cada extracto ensayado se detenninan de acuerdo con la siguiente ecuación;
PI ~ [(A(.
Figure imgf000016_0001
O rain)] X 100
El IC50 se calcula como la concentración del extracto de planta que causa el 50 % de inhibición del radical DPPH. Los aníioxidantes sintéticos Butílhidroxianisol (BHA) y Butilhidroxitolueno (BHT) se utilizaron como compuestos de referencia,
Ejemplo 1, Proceso general par la obtención de extractos aníioxidantes y anífbacíerianos a partir de residuos de uva blanca.
La extracción de los residuos de uva blanca de la vaiiedad Albariño se lleva a cabo en una columna con una frita en su parte inferior y otra en su parte superior. La relación dispersante: muestra es 2: 1 y se tritura en un mortero. La mezcla se vierte en la columna y se compacta ligeramente para un mayor contacto con el eluyente. A continuación se hace pasar el disolvente de elución, procurando una elución constante, y se recoge el eíuato.
Una muestra de 20 g mezclada con 40 g de arena y triturada, se introduce en la columna de vidrio, estrecha y alargada (1,5. cm de diámetro x 45 cm de largo) y se compacta ligeramente. El volumen de disolvente de elución, EtOH'H^O (50:50), es de 50 roL. En esta realización particular, el extracto se concentró a vacío 8 veces. El rendimiento es del 6,9 % y el extracto final tiene un contenido de polifenoles totales del 29 %. Los datos obtenidos para esta realización particular se detallan en la Tabla 1.
Tabla 1 ; Datos característicos del extracto obtenido en el ejemplo 1.
Indice de Polifenoles Totales 18,31 mg GAE/g bagazo seco
Gálico 103 ppm (0,074 mg/g)
C te uiz 1692 ppm (1 ,21 mg g)
Epícatequina 920 ppm (0,66 mg g)
pH 5,90 El extracto se caracteriza también por la presencia de ácido caftárico, procianidinas (B l B2)4 epicatequin-galato y quereetinas (concretamente, quercetina, quercetina~3- glucósido quercetina 3-gmcurónido). Ejemplo 1,1. Estudio de disolvente
Se llevó a cabo la extracción según se describe en el ejemplo 1 empleando disolventes diferentes: metanol acuoso, etanol acuoso, butílenglícol acuoso y aguardiente blanca; y se compararon los resultados obtenidos sobre la base del índice de polifenoles totales, expresado en mg equivalentes de ácido gálico por gramo de bagazo seco (Tabla 2).
Tabla 2: Datos de IPT obtenidos según el tipo de disolvente empleado.
Figure imgf000017_0001
Ejemplo 1.2. Estudio de dispersante en combinación con disolvente
Se llevó a cabo la obtención de extractos a partir de bagazo de uva blanca de la variedad
Albarífio, según se describe en el ejemplo 1 empleando como dispersante arena de diferentes orígenes.
No hay diferencias significativas (P95— 0,076) entre los datos obtenidos con arena comercial y arena natural (Tabla 3.): ni en ninguna de las combinaciones con los disolventes (P 5 = 0,15) (Tabla 3).
Tabla 3: Datos de IPT obtenidos según el origen de la arena y el tipo de disolvente empleado
IPT (mg gálico/g bagazo seco)
Aren a/Disol véate Medía Desviación Límite Límite
Figure imgf000018_0001
Tampoco se -observan diferencias significativas (P¾ = 0,48) según el tamaño de grano después de tamizar la arena natural por tamices de diferente luz de malla (250-320 μη ) (Tabla 4).
Tabla 4: Datos de IPT obtenidos según el tamaño de grano dé l aren natural.
Figure imgf000018_0002
Ejemplo 1,3. Estudio de la maceración
Se llevó a cabo la extracción según se describe en el ejemplo 1. Se estudia la maceración poniendo en contacto el disolvente con la mezcla durante tres horas para ser recogido finalmente por gravedad o empleando una bomba, que acelera el proceso de recogida del eluato. La bomba utilizada tiene un caudal máximo de 7 L/min.
Después de analizar el efecto de macerar o no macerar la mezcla bagazo:dispersante con el disolvente; y la utilización o no de una bomba, se concluye que es mejor macerar y bombear (Tabla 5) .
Tabla 5: Datos de JPT obtenidos en el estudio de la combinación de dos factores: bomba y maceración. ϊ PT (rag gálico/g bagazo seco)
Maceración Media Desviación Límite Límite
Figure imgf000019_0001
Ejemplo 1.4, Escalado
Se llevó a cabo la extracción según se describe en el ejemplo 1, pero empleando diferentes cantidades del bagazo inicial: 1 g, 10 g y 20 g. Los resultados demuestran que a medida que aumenta la masa de bagazo, manteniendo constante la relación muestra dispersante, la extracción de polifenoles aumenta proporcionalmente (Figura 2, Tabla 6).
Tabla 6: Datos de IPT obtenidos con diferente masa de muestra de partida.
IPT (mg gálfeo/g bagazo seco)
Figure imgf000019_0003
Ejemplo 1.5. Recircuíaeión
Se llevó a cabo la extracción según el ejemplo 1, pero en este caso la cantidad de muestra inicia! es de 100 g mezclados con 200 g del dispersante. Para estos experimentos se empleó una columna de 5 cm de diámetro x 37 cm de largo. Se emplearon 500 mL de una mezcla EtOH; H20 50:50, que se recirculó tres veces. Los datos se muestran en la siguiente tabla (Tabla 7).
Tabla 7: aeión.
Figure imgf000019_0002
j In fracción (500 mí) 16,17
1 fracción (490 mi) 17,06
i 3a fracción (480 mi) 21,82
Ejemplo 1.6. Variedades de Uva Blanca
Se llevó a cabo la extracció según se describe en el ejemplo 1 empleando variedades vitivinícolas blancas, diferentes de la variedad Albariño. Concretamente se sometieron al proceso las siguientes variedades: Camo Blanco, Godello, Loureira Treixadura; todas ellas variedades cultivadas comúnmente para vinificación en blanco. Los datos se muestran en la siguiente tabla (Tabla 8).
Tabla 8: Datos de IPT obtenidos con las distintas variedades blancas ensayadas.
Figure imgf000020_0001
Ejemplo 1.7. Semillas
Se llevó a cabo la extracción según se describe en el ejemplo 1 empleando como materia prima de partida exclusivamente las semillas aisladas a partir de bagazo de uva blanca. El IPT del extracto obtenido a partir de las semillas es de 40,21± 3,78 (mg gálico/g semillas secas),
Ejemplo 2. Escalado del proceso general para la obtención de extractos antioxidantes y antibacíerianos a partir de residuos de uva blanca.
La extracción de jos residuos de uva blanca de la variedad Albariño se lleva a cabo en una columna de dimensiones superiores a la utilizada en el Ejemplo 1. En esta realización particular se mezclan entre 1 10 kg de bagazo co entre 3 30 kg de dispersante. Una vez triturada, la mezcla se vierte en la columna y a continuación se introduce el disolvente de elución. La mezcla macera entre 6 y 3.6 horas y después, procurando una elución constante, se recoge el eluato.
El volumen de disolvente de elución, una mezcla de 1,3-butanodioI y agua, es de entre 1 y 5 L. Los datos obtenidos para esta realización particular se detallan en la Tabla 9.
Tabla 9: Datos característicos del extracto obtenido en el ejemplo 2.
Figure imgf000021_0001
'miligramos equivalentes de ácido gálíco/g de bagazo seco
Para evaluar la robustez del procedimiento descrito en el ejempl 2, en términos de variabilidad, estimada como coeficiente de variación de las variables respuesta medidas, se realizó el proceso por quintuplicado manteniendo constantes las condiciones experimentales. Los datos obtenidos se resumen en ía tabla 1 :
Tabla 10: Valores medios de los extractos obtenidos según la descripción del ejemplo 2
(n=5).
Figure imgf000021_0002
miligramos equivalentes de ácido gálico
Ejemplo 3. Evaluación de las actividades de los extractos obtenidos Ejemplo 3.1 , Actividad antioxidante y antiradieálica
Se determinó la actividad antioxidante (AA) de los extractos obtenidos en diferentes escalas, empleando diferentes combinaciones de disolventes o utilizando distintos tipos de materia prima inicial, según se indica en las tablas 11 y 12 (y en la figura 3). En . los casos en los que se modifica el pH del disolvente de elución, éste se ajusta con HC'l concentrado monitorizándolo en un pHmetro. Los mejores resultados se obtuvieron cuando a una escala de 20 g se emplearon como disolventes ΕίΟΗ:Η20 (50:50) o aguardiente blanca, además las diferencias observadas entre ambos resultados no son significativas desde el punto de vista estadístico.
Tabl 1 1 : Datos obtenidos de AA de las extracciones obtenidas con la variedad Albariño y distintos disolventes
Figure imgf000022_0001
Tabla 12: Datos obtenidos de AA de las extracciones obtenidas con bagazo
variedades blancas o con semillas
AA (mM Trolox)
Peso de Disolvente Media Desviación bagazo inicial estándar
20 g I Caíño Blanco 5,05 0, 16
2 g Godello 5,73 0,43 2.1
Figure imgf000023_0001
La AA del extracto obtenido en el ejemplo 2 fiié equivalente a 65,46 ± 4,20 mM Trolox o a 5310 ppm de Vitamina C. La actividad antíoxidante media (n— 5) de los extractos obtenidos con la columna de mayores dimensiones fue de 73,1 ±13,7 mM Trolox. La eficacia para eliminar radicales libres se calculo como se detalla en la sección de metodología correspondiente. Los resultados obtenidos expresados como la concentración inhibitoria máxima media (ÍC50) fueron de 432 mg GAE/L para el extracto obtenido en el ejemplo 2. Los datos para ios antioxidantes sintéticos de referencia fueron 730 mg/L y 8498 mg/L para el BHA y el BHT, respectivamente. Asi, el extracto del ejemplo 2 tiene una eficacia relativa en la eliminación de radicales libres que equivale a ~ 20 veces la del BHT y ~ 1,7 veces la del BHA, en disoluciones de concentración equivalente.
Ejemplo 3.2. Actividad antibacteriana
Ejemplo 3-2. L Valoración cualitativa de la Actividad Antibacteriana mediante Halos de Inhibición
Cepas utilizadas;
Stapkylococcus aureus (S. aureus), Bacillus spp, y Propionibacterium -acnés P. acnés). Medios de cultivo:
a. Medios de cultivo empleados para .V. aureus y Bacillus spp.
Medio TSB: caldo de soja y triptona
Medio Luria Brotb (LB): 1% triptona, 1% NaCl, 0,5% extracto de levadura. b. Medio de cultivo empleado para P. acnés.
c. Medio para bacterias anaerobias: 3% triptona, 2% extracto de levadura, 0,05% L- cisteína clorhidrato, 0,5% glucosa. Autoclavar durante 30 minuto a i 10°C y añadir 2,5% v/v de solución de hemina previamente esterilizada por filtración. Solución de hemina (para 100 mL): 0,1 de hemina, 4 mL de trietanoíaniina y 96 mL de agua destilada. Los medios de cultivo fueron suplementados con un 2% de agar-agar en ei caso de requerirse sólidos.
Se h estudiado la actividad antimicrobiana del extracto obtenido frente a bacterias Grarn +, Para testar la capacidad antimicrobiana de los extractos polifenólícos de bagazo se empleó una variación de la técnica de difusión estándar descrit por Fattouch et al [Fattouch, S.: Caboni, P.; Coroneo, V.; Tuberoso, C- I, G.; Angioni, A.; Dessi, S.; Marzouki, N.; Cabras, P. Antimicrobial actívity of Tunisjan quince (Cydonia oblonga Míiler) puíp and peel polyphenolic extracts. J. Agrie, Food Chem, 2007, 55, 963-969,]. Las pruebas de difusión en disco/pocilio se basan en la capacidad de muchos agentes antimicrobianos de difundir en el agar creando un gradiente continuo de concentración. Si el disco que contiene la sustancia antimicrobiana se deposita sobre una placa recién inoculada, se producirá la inhibición del crecimiento del microorganismo analizado, en un punto del gradiente y dará como resultado un área concéntrica al disco/pocili de inhibición del crecimiento. Esta área, al ser proporcional a la concentración mínima inhibitoria (CMÍ) permitirá la distinción de cepas sensibles, resistentes o intermedias.
Se partió de una suspensión bacteriana, de S. aureus crecida en un medio de cultivo TSB, ajustada a una turbidez correspondiente a 0,5 en la escala de McFarland (108 UFC/ml). Se inoculó, superficialmente y con la ayuda de un asa de Digalsky, una placa agar de medio mínimo M9, con 100 de la suspensión bacteriana anterior, con el fi de obtener un césped microbiano. A continuación se hicieron pocilios equidistantes en el agar en los que se pipetearon volúmenes de 100 μL del extracto obtenido como se describe en el ejemplo 1. Se utilizó cloranfenicoi (1000 μg/mL) como control positivo el mismo disolvente del extracto como control negativo. Después de 24h de incubación se midió el tamaño del halo de inhibición usando una regla con una precisión de 0,5 mm. En la Figura 4 se muestra la foto del ensayo de resistencia-sensibilidad al agente antimicrobiano, donde puede observarse como en una placa totalmente cubierta por S. aureus, aparece el "halo de inhibición del crecimiento" generado por el extracto concentrado obtenido como se describe en el ejemplo i. En el centro dé la placa, puede verse un control llevado a cabo con etanol acuoso 50/50 (disolvente de elución de los extractos) y en donde no aparece el halo inhibitorio.
Para el ensayo de Bacülus spp se procedió de igual modo, pero se partió de una suspensión bacteriana crecida en un caldo de cultivo LB. En la Figura 5 se muestran las fotos de los ensayos de resistencia-sensibilidad al agente 'antimicrobiano, donde puede observarse como en una placa totalmente cubierta por Bacittw spp. (figura 5a), aparece el halo de inhibición del crecimiento generado por el extracto obtenido como se muestra en el ejemplo 2; y en dos diluciones diferentes, siendo el diámetro del halo de inhibición proporcional a la concentración del extracto. Aparecen además los dos controles correspondientes al butilenglicol acuoso (65/35) (disolvente de elución de los extractos) y en donde no aparece el halo inhibitorio. La figura 5b responde al mismo tratamiento y resultados en una placa totalmente cubierta por S. aureus, crecida también en este caso en medio LB. La figura 5c es el ensayo equivalente para P. acnés, obtenido respetando las peculiaridades del cultivo de esta bacteria anaerobia.
Ejemplo 3,2. Valoración cuantitativa de la Actividad Antibacteriana; Determinación de la Concentración Mínima inhibitoria (CMI).
Condiciones de cultivo;
Las bacterias fueron cultivada en medio LB a 37°C, Los cultivos líquidos fueron incubados en un agitador orbital a 200 rpm. En el caso de P. acnés, por tratarse de una baetería anaerobia estricta, los cultivos fuero introducidos en una jarra de anaerobiosis con sobres Anaerocult ®A (Merck). La jarra de anaerobiosis fue fijada a un agitador orbital y P. acnés fue incubada con agitación suave en medio líquido para asegurar la distribución homogénea del extracto a ensayar, ya que este tiene tendencia a precipitar cuando se añade.
Ejemplo 3.2.1. CMI e influencia del vehículo.
Para determinar la concentración mínima inhibitoria y la influencia del vehículo (butilenglicol) sobre la inhibición del crecimiento, se prepararon matraces erlenmeyer conteniendo 18 rnL de medio de cultivo liquido a los cuales se añadieron diferentes volúmenes del extracto (desde 20 μL hasta 2 mL), añadiendo la cantidad de vehículo necesaria para conseguir un volumen final de 20 mL en los matraces erlenmeyer.
De esta tnanera, la concentración de butilenglicol fue del 6,5% e todos los casos y la concentración del extracto se testó entre el 0,1 y el 10% v/y.
Estos matraces fueron inoculados con 100 μϊ^ de un cultivo del microorganismo a ensayar en fase estacionaria.
En cada caso se realizaron los siguientes controles:
1. Control positivo; microorganismo en medio de cultivo sin extracto ni vehículo 2. Control de la influencia del vehículo:. microorganismo: en medio de cultivo con 2 mL de vehículo {butilenglicol ragua 65:35)
3. Control de contaminación del vehículo: medio de cultivo con 2 mL del vehículo
4. Control de contaminación del extracto: medio de cultivo con 2 mi del extracto Los cultivos se incubaron durante toda la noche (aprox. entre 1 y 16 horas) en las condiciones anteriormente mencionadas. Una vez completada la incubación se realizaron diluciones seriadas a partir de ellos en tubos conteniendo solución salina. De las diluciones 10"", 10 y 10"" se tomaron 20 ΐ. de muestra que fueron sembrados por extensión en pl cas de Petri con el correspondiente medio de cultivo sólido e incubados durante 24 horas a la temperatura adecuada.
Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.
Los resultados se valoraron por el método de recuento de UFC (unidades formadoras de colonias) en placa.
Ejemplo 3.2.2. CMI en bacterias Gram positivas,
Una vez realizadas las pruebas preliminares y comprobada la no influencia del vehículo en la inhibición del crecimiento de bacterias Gra positivas, se procedió a ajusíar con más exactitud la CMI para S. oureus, Bacitíus spp y P. acnés, utilizando como referencia los valores obtenidos en el estudio anterior. Así se ensayaron diversas concentraciones del extracto entre el 1 y el 3% v/v en matraces erlenmeyer conteniendo 20 mL del medio de cultivo correspondiente. El procedimiento de incubación y siembra en placa fue idéntico al anteriormente descrito. Las figuras 6a y 6b muestran respectivamente los resultados obtenidos para S. aureus y Bacilhis spp.
Los valores de CMI para las bacterias estudiadas han sido ios siguientes:
S.aureus 1,25-1,5 %
Baciílus spp: 1-1 ,25 %
P. acnés: 1-1 ,5 %
Esto indica que pequeñas diluciones del extracto, de entre 1 y 1 ,5 mL en 100 mL de medio pueden inhibir el crecimiento visible de los microorganismos después de su incubación.
Ejemplo 3.3. Actividad protectora contra radiación UV (actividad absorbente de luz UV) Se ha estudiado la actividad absorbente del extracto líquido obtenido según se detalla en el ejemplo 2 frente a radiación UV de tipo . A y B> Concretamente se ha medido el espectro "UV completo, desde 200 a 400 nm de una dilución 1 :500 del extracto, el cual se muestra en la figura 7. Adicionalmente, la tabla 13 muestra los valores de absorbancia a dos longitudes de onda representativas de la radiación UVB (280 y 320 nffi) otros dos valores de absorbancia a dos longitudes de onda representativas de la radiación UVA (350 y 400 toa). Las características espectrales del extracto, lo hacen especialmente útil en potenciales acciones protectoras frente a la radiación UVB, pues es en dicha zona dónde presenta su máximo de absorbancia (λι113Χ = 277 nm}.
Tabla 13 : Absorbancia en la zona UV del espectro de una dilución 1 :500 del extracto obtenido en el ejemplo 2
Figure imgf000027_0001
Ejemplo 4, Evaluación de la estabilidad de los extracto obtenidos.
Se ha estudiado la estabilidad del extracto obtenido en el ejemplo 2 en diferentes condiciones de almacenamiento y se empleó una disolución de ácido ascórbico al 1% en 65 % de glicol como control:
• Tft de almacenamiento (con N2 en espacio de cabeza y oscuridad): Ta ambiente (25 °C); Congelación (-20°C ); Refrigeración (4°C )
β Presencia oxígeno (oscuridad y 25 °C): Vial con 02 en espacio de cabeza
* Exposición a la Luz (N2 en espacio de cabeza y 25 °C): Vial expuesto a la luz. Los controles se han programado del siguiente modo: un control semanal durante el primer mes; un control quincenal durante el 2o mes; y, a partir de este momento, un control mensual.
Las variables medidas han sido el IPT, la AA, la absorbancia a λ= 420, 520 y 620nm; y la concentració de los polifenoles individuales identificados determinada por análisis cromatogfáfieo, Adicionalmente, se ha evaluado el aspecto visual de los extractos en cada control realizado, observándose tan sólo un ligero incremento del color en el vial almacenado en presencia de 02, que sin embargo no se correspondió con ninguna variación significativa del contenido polífenólico del extracto ni de su actividad antioxídante.
La Tabla 14 resume los resultados obtenidos. Se ha realizado una comparación estadística de los datos, dónde un valor de p 0,05 indica que no hay diferencias significativas; y que, por lo tanto, el extracto es estable en relación con el parámetro evaluado.
Tabla 14: Datos estadísticos del estudio de estabilidad del extracto del ejemplo 2
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Valor de la i de Student, parámetro utilizad para evaluar diferencias estadísticamente significativas entre 2 grupos de datos; hipótesis nula (fío); no existe diferencia entre las medias versus hipótesis alteraativa(H ): existe diferencia entre las medias de ambos grupos de datos.
Probabilidad de rechazo de hipotésis: el valor umbral es 0,05 (trabajando al 95 % de confianza): Sí p> 0,05 se acepta ¾; si /.'<0,05, se acepta Hj.
3Valor de l& F ' de Fisher. La prueba-F áú análisis de la varianza (ANOVA) determina si hay diferencias significativas entre las medias de más de dos grupos de datos. Si el vaíor-p de la prueba-F es menor que 0,05, existe una. diferencia estadísticamente significativa éntre las medias de las 3. variables con un nivel del 95,0% de confianza; y viceversa. Del análisis de los datos de estabilidad durante los primeros 100 días de almacenamiento del extracto en las distintas condiciones mencionadas, se concluye que el extracto es completamente estable a lo largo de dicho período en relación con la actividad antioxidaníe la concentración de epicatequina y quercetinas. Tanto el gálico como la catequína sufre ligeras modificaciones en su concentración (el gálico aument levemente en presencia de {¾ y a 25 °C), procedentes probablemente de la existencia de epicate uin-galato en el extracto y su posible transformación en poiifenoles simples. En relación con la absorban cía a distintas longitudes de onda, sólo varían los datos cuando el extracto se almacena a 25°C en presencia de O ; en dichas condiciones la absorbancia aumenta ligeramente. Por último, el IPT del extracto se mantiene completamente estable durante el período estudiado si se almacena en nevera o congelador, disminuyendo ligeramente a parti del primer mes de almacenamiento si se almacena a Ta ambiente, en presencia de luz y con 0;; en cualquier caso la actividad antioxidante del extracto no se ve afectada en ninguna circunstancia. La utilización de nitrógeno en el almacenamiento no se considera necesaria, como tampoc es imprescindible mantenerlo en ausencia de luz, si bien un frasco ámbar puede conservar mejor sus características iniciales de color (absorbancia a 420, 520 y 620 nm) en presencia de (¾.

Claims

Reivindicaciones
1. Procedimiento para obtener un extracto a partir de residuo de uva blanca que comprende: a. preparar una mezcla que comprende residuo de uva blanca y un dispersante, b. añadir un disolvente, c. emir, y d . recoger los eluatos .
2. Procedimiento según la reivindicación 1 , donde el residuo de uva blanca es bagazo.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, donde el dispersante se selecciona de entre el grupo constituido por arena, florisil, C1.8, alúmina y sílica gei
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 3, donde el dispersante es arena.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, donde el disolvente de la etapa b) se selecciona de forma independiente de entre el grupo constituido por agua, alcohol alquílico, glicoles, o sus mezclas.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la suspensión de la etapa b) se mantiene entre 1 y 36 horas a una temperatura de entre 10 °C y 40 °C .
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde comprende además la elución de la mezcla de la etapa a) con los eluatos recogidos en la etapa d).
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende: a") preparar una mezcla que comprende bagazo de uva blanca y arena en una relación en peso de entre 1 :1 y 1 :3, b" ) añadir una mezcla gí icoles/agua en un volumen de entre 0,1 y 5 respecto al peso de la mezcla de residuo de uva blanca y dispersante de la etapa a") y mantener entre 5 y 24 horas a una temperatura de entre 10 °C y 40 °C, c' ') eluir, d") recoger los eluatos, e") eluir la mezcla de la etapa a) con los eluatos recogidos en la etapa d').
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde comprende además la evaporación del disolvente.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde comprende además una etapa de liofilización.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el residuo de uva blanca es bagazo de la variedad seleccionada de entre el grupo constituido por Albariño, Caíño Blanco, Godello, Torrontés y Treixadura,
12. Extracto polifenólico de uva blanca obtenible mediante el procedimiento descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Extracto polifenólico de uva blanca según la reivindicación 12, caracterizado por la ausencia de antocianos y un pH de entre 4 y 8 medido en disolución acuosa.
14. Extracto polifenóHco de uva blanca, según la reivindicación 1.2, caracterizado por a) un Indice de polifenoies totales de entre 8 y 50 mg de ácido gálieo/g de bagazo seco; b) una concentración de ácido gálico de entre 0,035 y 0,125 mg/ g de bagazo seco; c) una concentración de catequina de entre '0,3. 1,28 m g de bagazo seco; d) una concentración de epícatequina de entre 0,3 y 0,80 mg g de bagado seco; e) un pH de entre 4 y 8; y f) ausencia de antocianos.
15. Extracto polifenólico según las reivindicaciones 12 a 14 que se encuentra en disolución, en suspensión o liofilízado.
16. Extracto polifenólico según las reivindicaciones 12 a 14 que se encuentra en forma sólida, como polvo o como pasta.
17. Composición cosmética que comprende el extracto descrito en cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 16,
18. Composición Farmacéutica que comprende el extracto descrito en cualquiera de l s reivindicaciones de 12 a 16.
19. Composición nutrí cional que comprende el extracto descrito en cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 16.
20. Uso del extracto descrito en cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 16, para la preparación de un conservante alimentario.
21. Uso del extracto descrito en cualquiera de las reivindicaciones de Í2 a 16, para la preparación de composición antibacteriana.
22. Composición anti-acné que comprende el extracto según cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 16.
23. Envase o envoltorio biodegradable que comprende el extracto según cualquiera de í s reivindicaciones de 12 a 16,
24. Conservante alimentario que comprende él extracto según cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 16.
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