WO2014009673A1 - Systeme automatise de lyse de microorganismes presents dans un echantillon, d'extraction et de purification des acides nucleiques desdites microorganismes aux fins d'analyse - Google Patents

Systeme automatise de lyse de microorganismes presents dans un echantillon, d'extraction et de purification des acides nucleiques desdites microorganismes aux fins d'analyse Download PDF

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WO2014009673A1
WO2014009673A1 PCT/FR2013/051681 FR2013051681W WO2014009673A1 WO 2014009673 A1 WO2014009673 A1 WO 2014009673A1 FR 2013051681 W FR2013051681 W FR 2013051681W WO 2014009673 A1 WO2014009673 A1 WO 2014009673A1
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WO
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microorganisms
fluid
module
balls
reaction liquid
Prior art date
Application number
PCT/FR2013/051681
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English (en)
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Michel Guy
Hervé ROSTAING
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Biomerieux
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Publication date
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Priority to US16/797,405 priority patent/US11427854B2/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules

Definitions

  • the technical field of the present invention is that of biological analysis. More particularly, the present invention relates firstly to a device for lysing microorganisms present in an environmental or clinical sample, for extracting and purifying the nucleic acids of said microorganisms. The invention further relates to an automated system for lysing microorganisms for extracting and purifying the nucleic acids of said microorganisms for analysis.
  • aero-bio-collectors are the solution of choice for the detection of microorganisms in the air.
  • These devices are placed at the appropriate places in the places where it is desired to measure the aero-bio-contamination. They generally consist of an air collector coupled to a culture medium. The air collected by the air collector comes into contact with the culture medium; culture medium on which are deposited microorganisms possibly contained in the collected air. The culture medium is then recovered and placed in an oven to promote the growth of microorganisms. It is thus possible to detect and identify said microorganisms by traditional microbiology techniques.
  • This disadvantage is the time required to obtain the analysis result.
  • the use of traditional microbiology techniques, in particular bacteriology involves the respect of incubation times necessary for cell growth, or even reseeding phases on specific culture media to allow identification.
  • the time required to obtain a result is relatively long, or even too long, when it is sought to detect and identify a pathogenic organism responsible for a nosocomial infection or a food poisoning infection.
  • this type of device has the disadvantage of not allowing the demonstration of microorganisms present in the air, viable but not cultivable.
  • the document GB-2 254 024 thus describes a device for collecting the particles contained in the air, the principle of which is based on the cyclone effect. If such a device is suitable for the collection of particles contained in the air, including microorganisms, it is in no way studied to treat the sample thus obtained, in particular to carry out the extraction of genetic material intended to be used for analysis.
  • US-A-5,707,861 discloses a device for disintegrating living cells of the microorganism type. This device makes it possible to lyse the cells by using both glass beads but also the effect of vibration due to the space existing between the tubes containing the microorganisms and the holes of the support carrying said tubes. Thus, such a device makes it possible to optimize the lysis of cells and thus to optimize the extraction of the genetic material.
  • Such a device and the method implemented by the latter have the same limits as those described above, namely that they remain dependent on the amount of microorganisms recovered.
  • they have the additional disadvantage of having to subsequently perform a nucleic acid concentration step in order to isolate them from cell debris. Finally, they require manually recovering the nucleic acids, at the end of the concentration step.
  • WO-A-2004/018704 describes a device, and an associated method using the PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification technique, for collecting microorganisms in the air and identifying them.
  • This system is especially adapted to the fight against the attempts of attacks by biological contamination in the centers of postal sorting.
  • This system consists of an air collection device placed along the mail transport circuit, a device for filtering / separating particles by cyclone effect, a device for concentration / recovery of particles in a liquid sample, a device for transferring a fraction of the sample into a GeneXpert TM PCR assay cartridge from Cepheid, California. The cartridge is then manually transferred to an independent biological analysis machine for identification of the microorganism (s) collected in the air.
  • the Applicant has already filed a patent application WO-A-2009/001010 which relates firstly to a cartridge, capable of being positioned inside an air collection means and receiving a means for recovering the nucleic acids, said cartridge of substantially cylindrical shape, comprising a microorganism retention zone, said retention zone comprising means for lysis of microorganisms.
  • This invention further relates to a device for collecting microorganisms contained in the air and a device for lysis of microorganisms.
  • the Applicant has also already filed a patent application WO-A-2010/067019 which concerns among other things a device for collecting microorganisms contained in the air, said device comprising:
  • An air collection module comprising:
  • an upper element comprising an air intake duct allowing the entry of a flow of air inside said module, said duct having at its base means for disrupting the flow of air,
  • a lower element having means for evacuating the air allowing the outlet of the air flow created said upper and lower elements that can be secured to one another so that the air flow can be created at the inside said air collection module;
  • a cartridge of substantially cylindrical shape, comprising a microorganism retention zone, said retention zone comprising means for lysis of microorganisms, said cartridge being positioned inside said air collection module.
  • the impinging capture mode is very inefficient for small particles with a diameter of less than 1 ⁇ m.
  • Another problem there is a risk of training part of the recovery medium (beads with glycerol) by the air flow.
  • this projection of fluid and its rebound on said medium can generate splashes which are as many risks of contamination.
  • the present invention aims to provide an apparatus that meets these drawbacks enumerated above.
  • the invention proposes a device for collecting microorganisms contained in a fluid, the device comprising: A reaction module containing a set of balls,
  • At least one fluid intake duct allowing the entry of a flow of fluid inside the module
  • At least one fluid evacuation duct allowing the outlet of the flow of said fluid having passed through the interior of said module
  • At least one inlet channel of at least one reaction liquid is provided.
  • At least one evacuation channel of at least one reaction liquid is provided.
  • the channels for the reaction liquid or liquids being placed respectively at two opposite ends of the module, and
  • the channels for the reaction liquid or liquids are positioned in a plane, and the inlet and outlet conduits for the fluid are positioned along an axis, and that the axis is substantially perpendicular to the plane.
  • the device according to the invention comprises a liquid insulating tight containment vessel and liquid reaction from the outside.
  • the fluid is a gas
  • the set of beads consists of beads coated with glycerol.
  • the module contains a filter extending substantially in the plane formed by the channels for the reaction liquid or liquids, the admission channel (s) being located (s) on one side of the filter with the set of balls and the channel (s) discharge being located (s) on the other side of said filter in the absence of balls.
  • This arrangement thus allows the fluid to come into contact with the beads and then to circulate through the filter, in order to separate, for example, any uninteresting cellular residues or inhibitors, such as proteins or membranes.
  • the shape of the module if it is cut is cut:
  • the module has a quadrilateral section if it is cut in a plane perpendicular to the plane formed by the inlet and outlet channels of the reaction liquid, and passing through the axis formed by the inlet ducts and discharge of the fluid.
  • the module has a shape of "C" if it is cut:
  • a form of "C” includes at least one arcuate portion corresponding to a portion of the circumference of a circle or parabola connecting two points.
  • the ends of the "C” being the two terminal zones of the module, so that the channel (s) for admission of the reaction liquid being located at one end of the module and the channel (s) where the reaction liquid is located at the other end of the module, the reaction liquid passes entirely through the ball bed between the moment it is admitted into the inlet channel (s) of the reaction liquid. and when it is discharged through the channel (s) for discharging the reaction liquid.
  • the module has a quadrilateral shape if it is cut along a radius passing through the center of the "C” and intersecting said "C".
  • the (s) channel (channels) for admission of the reaction liquid is (are) located at a end of the "C" shape of the module, and that the channel (s) draining the reaction liquid is (are) located at the other end of the "C".
  • the balls have a diameter of between 200 and 600 ⁇ m and the retention means of said balls inside the module consist of grids whose pores have a smaller diameter than the balls and between 100 and 500 ym.
  • the module containing:
  • Means for separating uninteresting cell residues or inhibitors such as proteins, membranes, and / or
  • Means for detecting the amplicons thus generated Means for detecting the amplicons thus generated.
  • the present invention also relates to a method for collecting microorganisms contained in a fluid, which consists in:
  • reaction liquid Introducing at least one reaction liquid via at least one inlet channel for reaction liquid (s), Passing through the bed of balls where the microorganisms are immobilized in order to put the microorganisms in suspension, and
  • the beads when the fluid is a gas, the beads are covered with glycerol.
  • the balls when the fluid is a liquid, the balls are covered with a polymer coating.
  • said beads when the reaction liquid passes through the bed of beads, said beads are agitated by an external stirring means and come into contact, which makes it possible to destroy or lyse the membranes of the microorganisms, making the nucleic acids accessible and ready to be evacuated
  • a defined quantity of reaction liquid is admitted into the channel (s) for admission of the reaction liquid and is not evacuated by the channel (channels) for evacuation of the reaction liquid. during the lysis, such that the microorganisms are lysed for a definite period of time in the presence of a defined quantity of reaction liquid.
  • This duration preferably being between 5 and 30 minutes and this quantity of liquid preferably being between ⁇ and 1 ml, more preferably 500 ⁇ 1.
  • the stirring of the balls is achieved by the use of ultrasound.
  • the liquid loaded with all or part of the microorganisms is discharged to another reaction module of the device for the treatment of microorganisms collected, the treatment consisting of:
  • the fluid tested is constituted by a gas, (for example air)
  • At least one reaction liquid is introduced in order to liquefy the glycerol and to put said microorganisms in suspension.
  • the fluid tested is constituted by a liquid
  • At least one reaction liquid is introduced in order to put said microorganisms in suspension.
  • the liquid is filtered between the evacuation via at least one reaction liquid discharge channel (s) and the module allowing the elimination of the inhibitors and / or the amplification and / or the detection.
  • fluid sample any gaseous or liquid sample likely to contain microorganisms. It may be a sample of human or animal origin. This sample may be, for example, urine, whole blood, plasma or any other body fluid or exhaled air. The sample may be of food origin such as a drink. It can also be of environmental origin, such as water or confined air.
  • the liquid sample may also be a so-called transfer liquid, in which any microorganisms contained on a swab-type surface sampling device such as those marketed by COPAN under the name "flocked SWABS", were re-suspended by agitating said swab in said transfer liquid.
  • a swab-type surface sampling device such as those marketed by COPAN under the name "flocked SWABS”
  • Microorganisms are taken from the group consisting of bacteria, viruses, yeasts, molds, parasites
  • the samples from which microorganisms are isolated are of environmental origin. Thus, it may be a sample of air or liquid, such as water; surface sampling. Samples may also be of clinical origin, ie any sample of human or animal origin, suitable for analysis for the search and identification of a microorganism, possibly pathogenic.
  • Hybridization reaction is understood to mean any reaction between a capture nucleic acid and a target nucleic acid isolated or generated by a transcription, reverse transcription or transcription step.
  • amplification type for example, NASBA (for Nucleic Acid Sequence Based Amplification in English) or PCR.
  • nucleic acid is intended to mean oligonucleotides, deoxyribonucleic acids and ribonucleic acids, as well as their derivatives.
  • oligonucleotide denotes a sequence of at least two nucleotides (deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or both), preferably at least five, preferably at least eight, and even more preferably at least fourteen, whether natural or modified, capable of hybridize, under appropriate hybridization conditions, with another oligonucleotide at least partially complementary.
  • modified nucleotide is meant, for example, a nucleotide comprising a modified base and / or comprising a modification at the level of the internucleotide link and / or at the level of the backbone.
  • modified base mention may be made of inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2, 6-purine and bromo-5-deoxyuridine.
  • Alpha-oligonucleotides such as those described in patent application FR-A-2,607,507, LNAs such as phosphorothioate-LNA and 2'-thio-LNA described in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 8, Issue 16, 18 August 1998, pages 2219-2222, and the NAPs which are the subject of the article by M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897, are examples of oligonucleotides consisting of nucleotides whose backbone is modified.
  • the visualization of the hybridization reactions can be carried out by any means of detection, such as direct or indirect means.
  • the labeling can be carried out either directly on the target nucleic acids or via a specific binding partner of said previously labeled nucleic acids.
  • specific binding partner of the target nucleic acids is understood to mean any partner capable of binding with the target nucleic acid and nucleic acids, oligonucleotides or polynucleotides and enzymatic substrates are exemplified by way of example.
  • Marking means the fixing of a marker capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • markers consists of: the enzymes which produce a detectable signal, for example by electrochemistry, colorimetry, fluorescence, luminescence, enzymes such as horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (PAL), beta-galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; enzyme inhibitors; co-factors of enzymes; particles such as gold particles, magnetic latexes, liposomes; chromophores such as compounds, luminescents, dyes, radioactive molecules such as J "P, JJ S or I, fluorescent molecules such as fluorescein, rhodamine, Alexa®, umbelliferone, luminol or phycocyanines
  • fluorescence it may be the fluorescent product of an enzyme-substrate reaction, a fluorophore-quencher combination, a fluorescence quenching or any
  • Indirect systems can also be used, for example via another ligand / antiligand pair.
  • the ligand / antiligand pairs are well known to those skilled in the art, and there may be mentioned, for example, the following pairs: biotin / streptavidin, sugar / lectin,
  • polynucleotide / complementary polynucleotide In this case, it is the ligand that carries the binding agent.
  • the antiligand can be detectable directly by the markers described in the preceding paragraph or be itself detectable by a ligand / anti-ligand.
  • the preliminary labeling of the target nucleic acids can be carried out by direct or indirect incorporation of a marker by a polymerase, by a kinase, randomly or specifically, at the ends or by incorporation "inside” the molecule.
  • Figure 1 shows an exploded view of the top of the card or cartridge used to collect and lyse the microorganisms with all the elements that allow it to operate, according to a particular embodiment of the invention.
  • FIG. 2 represents a top view in perspective of the main card forming the core of the device according to the embodiment of the invention presented in FIG.
  • FIG. 3 represents a bottom view in perspective of the main board, still according to the embodiment of the invention presented in FIG.
  • Figure 4 shows a detail view of Figure 2 at the bed of balls and the grid retaining them in the plane in contact with at least one fluid intake duct and allowing the capture of microorganisms.
  • the two opposite ends of the "C" shaped module are fluidly connected to the inlet and outlet channels of the reaction liquid.
  • Figure 5A is a schematic diagram of the filtering part of the main board where the balls are present when the containment plates are closed.
  • Figure 5B is a schematic diagram similar to that of Figure 5A, but in which the containment plates are open. • Figure 6 is the recovery of a detail A of Figure 5B but in which the movement of the fluid within the capture beads and the movement of the containment plates are highlighted.
  • Figure 7 is identical to Figure 6 but focuses on the new movement of the containment plates and the beginning of the movement of the reaction liquid within the capture beads.
  • Figure 8 is identical to Figure 7 and shows the movement of the fluid within said capture beads.
  • Figure 9 is identical to Figure 8 but specifies the extraction of nucleic acids.
  • FIGS 10A to 10D show the efficiency of filling the chamber where the microorganisms are retained by the retention means over time.
  • FIG. 11 represents a graph demonstrating the effectiveness of the lysis within a device according to the invention.
  • the present invention relates to a device 1 for collecting microorganisms.
  • a device 1 for collecting microorganisms In Figure 1 we can see an exploded view of an embodiment presented by the applicant in which the device 1 for the collection of microorganisms is presented without the presence of any fluid 2 or liquid 12.
  • Said collection device 1 comprises essentially two large parts, a main card 4 located in the lower position relative to a secondary card 5, it, in the upper position.
  • the main card 4 having an "L" shape, the secondary card 5 fits into this "L” shape to give a general parallelepiped shape.
  • These main cards 4 and Secondary 5 are intended to be brought into contact with each other.
  • the retention means 9 is not simply constituted by the edges of this reaction module 3 but also includes one or more grids 27, not shown in Figure 1, allowing the passage of fluid 2 or liquids 12 without the balls 6, also not shown, can not leave the reaction module 3.
  • the diameter of the holes 28 of the grid 27 depends on the diameter of the beads 6 used.
  • the holes 28 of the grid 27 must be of a diameter smaller than the diameter of the glass beads.
  • the holes 28 of the grid 27 must be of a diameter that is significantly smaller than the diameter of the glass beads, "significantly" means, for example, that the balls 6 have a diameter of 400 to 600 ⁇ m and that the grid 27 has holes 28 of 200 to 250 ⁇ m.
  • the set of two cards 4 and 5 as well as fluid admission and discharge conduits 40 and 41 and reaction liquid inlet and outlet channels 7 and 8, shown in FIG. 4, are confined to using a sealed containment chamber 13, which is constituted, in the embodiment shown in Figure 1, by a number of containment plates.
  • the plates 15 and 17 are repositioned to close the consumable. Only the micro ⁇ organisms 10 remain in the chamber 9.
  • the channels 7 and 8 are then used to circulate the elution buffer before the ultrasound lysis phase.
  • the upper and lower plates 17 are ferromagnetic in nature because they frame the presence of a number of magnets 21 positioned at the four corners of the reaction module 3 and at its center.
  • the magnets 21 provide, on the one hand, the pressure of the ferromagnetic plates 15 and 17 on the O-rings 18 and, on the other hand, the seal after the capture of the microorganisms.
  • These plates 15 and 17 make it possible to have access to the capture balls 6, and to capture the microorganisms present in the fluid 2 on the balls 6.
  • the plates 15 and 17 slide on the surface of the device 1 by the intermediate slides 29, located on the sides, they are in this case in the form of dovetail.
  • O-ring seals 18 are three in the upper position and three also in the lower position and are concentric. Of course, this number is quite non-limiting since the use of a single O-ring may suffice.
  • other sealing means exist between the upper plates 14 and lower 16 and the rest of the device 1.
  • the means used are in particular a bonding of each of these plates with a glue or a double-sided adhesive on the main board 4.
  • the secondary card 5 is permanently bonded to the body 4 of the device. This bonding is performed by ultrasound, laser or thermally, it is final and allows the assembly of the collection device 1.
  • the main board 4 has two areas where channels are present.
  • the set of channels present at the zones 25 and 26 allows the fluidic management of the entire map.
  • the channel of the storage zone 25 is the storage tank of the reaction liquid 12 (elution buffer).
  • the channels of the analysis zone 26 are the fluidic channels for preparing the sample for analysis. They circulate on the front and the back of the card. The fluorescence reading is also done in the channels of the zone 26. Since these zones 25 and 26 are not the essence of the invention, they will not be exposed further.
  • desiccant locations 24 still within the main board 4. These locations 24 being located near the analysis zone 26, they contain desiccants make it possible to optimize the storage of the reagents integrated in the card in the form of freeze-dried reagent beads, also called "pellets” obtained by means of lyophilization, by drying or by gelling. The desiccants are not in direct contact but close to the pellets. These pellets contain the reagents necessary for the amplification of the nucleic acids 11.
  • the dispenser drawer 22 manages the distribution of the fluids in the collection device 1. As a result, there are several positions that ensure:
  • reaction liquid 12 Storage of the reaction liquid 12, The transfer of the reaction liquid 12 to the chamber or retention means 9 containing the beads 6 (after capture of the microorganisms 10),
  • the pump pistons 23 are similar to syringes which make it possible to suck and transfer the reaction liquid 12 during the entire process. Their particularity is to operate in closed air cycle (no air is sucked in from the outside), although a simpler version with an outside air intake is possible. The interest of this closed vessel is to avoid as much as possible the communication to the outside and thus the risk of cross-contamination from inside to outside and vice versa.
  • Figure 2 shows a more detailed view of the main board 4. It consists of two parts of different thickness, on the left the thickness is larger and includes the analysis zone 26. There is also the presence desiccant locations 24, and a hole 31 for receiving the dispenser drawer 22, not shown in this figure. Finally there is also the presence of six holes 32 that can accommodate the six pump pistons 23, also not shown in this figure, within the main board 4.
  • the storage zone 25 of the reaction liquid 12 On the thin portion of the main board 4 is to the right of this figure, we note the presence of the storage zone 25 of the reaction liquid 12, after said reaction liquid 12 has:
  • Figure 3 shows the secondary card 4. On this part we note the presence of locations that can receive the O-rings 18 and locations 33 that can receive the magnets 21, 18 joints and magnets 21 are not shown in this figure.
  • FIG. 4 shows an enlarged view of a detail of FIG. 2, at the level of the retention means 9 of the balls 6 as well as of the channels 7 and 8.
  • the two opposite ends of the "C" shaped module are fluidly connected to the inlet and outlet channels for the reaction liquid 7 and 8.
  • the means 9 is constituted by a grid 27, better represented in FIG. 5A or 5B.
  • the space separating the holes 28 from the grid 27 is small, for example for balls of 500 ⁇ m, the holes will have a diameter of 200 to 300 ⁇ m and will be separated from each other by spaces of 200 to 300 ⁇ m. ym, resulting that the fluids 2 or liquids 12 are forced within this space, which improves and increases the contact points between the microorganisms, containing the nucleic acids of interest, and the surface of the beads 6 for better capture of said nucleic acids 11.
  • the balls 6 are also covered with a facilitating material even more the adhesion of microorganisms to the surface of the beads.
  • This material is in particular glycerol in the case where the fluid used is a gas.
  • glycerol only works in the case of a collection of microorganisms in a gas, including air.
  • the air passes over the glycerol and the microorganisms are captured on it.
  • the glycerol is then dissolved by the reaction buffer 12. If there is presence of bacteria, they will then be lysed in this buffer by ultrasound. In the case of the collection of microorganisms present in water, this does not work with glycerol which is dissolved by water, and is driven out of the map.
  • a glycerol substitute for example a coating of polymer which does not dissolve in water but only in a specific reaction buffer or allows “salting out” in this buffer specific or add a filter downstream of the balls so that the fluid comes into contact with the balls before circulating through the filter.
  • FIGS. 5A and 5B at the level of the main card 4, where the chamber or retention means 9 is present, the presence of two conduits 40 and 41 is noted.
  • the conduit 40 allows the admission of the fluid 2 to the breast. of module 3, fluid 2 which contains the bacteria to be captured for later analysis, while the conduit 41 allows the evacuation of the same fluid 2 outside said module 3.
  • the fluid 2 will be passed within the module 3 where the balls 6 are present; it is at this level that the collection of microorganisms can be carried out.
  • reaction liquid 12 which may be constituted by an elution buffer or the like and introduced into an inlet channel 7 within the module 3, shown in Figure 4, it is also evacuated of this same module 3 by an evacuation channel 8, also shown in FIG.
  • this fluid for example air but which can also be a liquid different from the reaction liquid 12, circulates perpendicular to the card. It flows through the grids 27
  • Figures 5 to 8 describe the protocol for capturing a microorganism in a simplified manner.
  • FIG. 5A a part of the device 1 according to the invention is described, at the level of the treatment of the fluid 2, from which the microorganisms 10 are to be extracted, in which there is:
  • the device 1 is substantially identical to the configuration of FIG. 5A, but the upper ferromagnetic confinement plate and the lower ferromagnetic confinement plate 17 are translated according to Fl.
  • This movement is effected via the intake ducts 40 and the outlet 41 of the fluid 2 within the module 3.
  • ultrasound lysis is performed to lyse the microorganisms, for example bacteria, and to release the nucleic acids 11.
  • the lysate containing the nucleic acids 11 is sent to the channels via the evacuation channel 8, to prepare the amplification by resuspension of the freeze-dried reagent beads, by optical detection, etc.
  • the device thus makes it possible to capture the microorganisms 10, in particular air, on glycerolated glass beads by circulating the flow of air through a carpet of beads 6.
  • the capture of microorganisms through a dry surface presents many advantages, such as:
  • the device is designed to:
  • the device is connected to a pump that sucks the air through the capture grid 27.
  • the capture yield is very much dependent on the thickness of the log and the size of the logs but the capture efficiency is significantly higher with a capture in transmission through the beads, especially for particle sizes less than 1 ⁇ m.
  • This capture mode presents technical difficulties such as:
  • Dry capture takes place without bubbling or aqueous gel, without loss of efficiency over time (> 4 m 3 of sampling).
  • the advantage of glycerol is that it does not dry. Therefore, the volume of air taken can be very important, without significant loss of efficiency.
  • Catches on aqueous surfaces (agar, petri dish) or aqueous liquid (Coriolis type) have the disadvantage of drying out as capture. This drying causes the decrease of the capture efficiency.
  • the capture in a defined liquid determines the type of analysis performed downstream of the collection whereas with dry capture the microorganisms can be taken up with any buffer.
  • the capture on a dry surface makes it possible to release the microorganisms in a very small volume of buffer, less than 1 mL or even less than 100 ⁇ L.
  • the advantage of concentrating microorganisms is to promote their detection. Detection systems in molecular biology have a detection limit of the order of 1 equivalent genome per microliter (yL).
  • Lysis of captured microorganisms is integrated into the device.
  • the lysis technique is purely mechanical (as opposed to chemical lysis) and thus ensures excellent lysis efficiency regardless of the lysis buffer selected and the microorganism to be lysed.
  • the lysate as it is, for subsequent amplification, for example NASBA or PCR.
  • the collection device 1 makes it possible to perform amplification as well as detection of said extracted nucleic acids. To do this, there are mainly four steps that are performed after lysis.
  • the first step consists in extracting the buffer 12 containing the nucleic acids 11 as well as a certain number of residues of microorganisms 10, which are present in the liquid 12 after the lysis, these residues not being taken into account. subsequently in the analyzes that will be performed at the level of the analysis zone 26.
  • the liquid 12 loaded with the nucleic acids 11 and residues 30 will leave the retention means 9 via the channel d 8.
  • the evacuation channel 8 it is for example possible to have a filter that lets pass only the biological elements of a size less than or equal to extracted nucleic acids.
  • this mixture is sent to an area allowing aliquoting 34, as is well shown in FIG. 2.
  • the volume thus obtained corresponds to 120 ⁇ .
  • This aliquot is then sent to a third step in a separation zone of the lysate referenced 35.
  • amplification zone there are six zones which are well differentiated from each other to allow a separation into six times 20 ⁇ in the channels of analysis of the zone 26.
  • amplification is carried out by means of reagents allowing amplification, such as nucleotides, amplification primers and detection probes, which are positioned in intermediate zone 36.
  • a second intermediate zone 37 containing at least one enzyme (an enzyme if one carries out a PCR, two if one performs a TMA and three if one performs a NASBA) , which is on the front of the main map 4.
  • the fourth and last step takes place at the level of the channels of the zone 26, as is well shown in FIG. 3 to the right of the intermediate zone 37 where the detection can be carried out.
  • Sliding plates 15 and 17 are open during the entire experiment.
  • a particle counter is used to evaluate the amount of particles per cubic meter (m3) of air drawn in.
  • the detected particles are classified into different size categories between 0.3 ⁇ m, 0.5 ⁇ m, 1 ⁇ m and 5 ⁇ m. Three cycles of measurements are made:
  • the empty reference measurements are averaged.
  • the capture efficiency is calculated by the ratio between measurement with and without device.
  • Table 1 Yield (in%) of capture of microorganisms (with a particle counter) as a function of the size of the beads and the thickness of the carpet of balls l.C. Analysis:
  • Table 1 shows that the capture efficiency is very effective regardless of the size of the beads and the thickness of the ball bed compared to the state of the art constituted by the device described by the document.
  • PC Particles smaller than 0.5 ⁇ m do not seem to give a sufficient yield, even if this remains well above the state of the art (minimum of 18% yield against zero).
  • a size between 0.5 and 5 ym the results are good (always higher than 65% and even if we exclude the case to 65%, always greater than 85%). All test bed thicknesses tested are acceptable.
  • Each device is placed on a test bench that measures the pressure drop as a function of the air flow. The goal is to find the best compromise between the capture efficiency of the device 1 and its pressure drop.
  • a high pressure drop means a high power consumption of the sampling device (not favorable to a portable application).
  • Table 2 is a design aid chart for the microorganism capture device. It compares the capture efficiency of the particles (by size range: 0.5-1 ⁇ m, 1-5 ⁇ m, 5-25 ⁇ m) with the pressure drop (mBar) of the device. The energy required to pump a certain volume of air through the device is proportional to the pressure drop (for the same flow). For a portable pump application it is necessary to find the right compromise between the capture efficiency and the pressure drop (see Table 2).
  • Table 2 Capture yield of microorganisms per particle size range and pressure drop of the device under test (at 50 L / min) depending on the size of the beads and the thickness of the ball mat
  • Figures 10A to 10D show the filling of the chamber 9 where the microorganisms 10 are captured. 500 ⁇ L is injected at the inlet channel 7 and 200 ⁇ L can be recovered at the outlet channel 8.
  • the filling is done perfectly.
  • a device 1 composed of a lysis chamber is filled with a buffer 12 containing Staphylococcus epidermidis.
  • the device is subjected to ultrasound, via a sonotrode, to lyse the microorganisms.
  • the experiment is repeated with a lysis time of 0, 1, 5 and 10 minutes.
  • the lysis yield is evaluated by growth and counting lysates on Petri dishes. The objective of this experiment is to find a suitable interface for ultrasound transmission during the lysis step.
  • the three devices are tested as before and for two types of ball diameter (See Table 3).
  • a device is filled with buffer containing S. epidermidis bacteria as well as an internal control consisting of a bacterium different from this bacterium tested. Lysis is performed in the device according to the 3 rd configuration described in Example 4. The Lysate is then extracted from the device and analyzed.
  • This experiment shows the effectiveness of the device described in lysing the microorganisms and detecting them through a NASBA analysis.
  • the microorganisms are injected into the buffer 12 before the experiment (a different concentration of microorganism in each experiment).
  • the metal shutters on the map are closed.
  • the portion containing the beads is filled with buffer 12 (which contains different concentrations of microorganisms).
  • the device is placed on an ultrasound probe to perform the lysis.
  • the buffer 12 is collected manually and analyzed in NASBA outside the map. These results are to be compared to a control range.

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Abstract

Dispositif et procédé de collecte de microorganismes d'un fluide, qui comporte : · un module réactionnel renfermant des billes; · au moins un conduit d'admission du fluide permettant l'entrée à l'intérieur du module;· au moins un conduit d'évacuation du fluide permettant la sortie dudit fluide ayant traversé le module; · des moyens de rétention des billes dans le module; · au moins un canal d'admission d'au moins un liquide réactionnel; · au moins un canal d'évacuation du ou des liquides; les conduits d'admission et d'évacuation du fluide se faisant face et enserrant le module, afin de maximiser les contacts entre le fluide et les billes; les canaux pour le ou les liquides réactionnels étant placés respectivement à deux extrémités opposées du module, et; les canaux pour le ou les liquides réactionnels sont positionnés selon un plan, et les conduits d'admission et d'évacuation du fluide sont positionnés selon un axe, et que l'axe est sensiblement perpendiculaire au plan.

Description

SYSTEME AUTOMATISE DE LYSE DE MICROORGANISMES PRESENTS DANS UN ÉCHANTILLON, D'EXTRACTION ET DE PURIFICATION DES ACIDES
NUCLEIQUES DESDITS MICROORGANISMES AUX FINS D'ANALYSE
Le domaine technique de la présente invention est celui de l'analyse biologique. Plus particulièrement, la présente invention concerne en premier lieu un dispositif de lyse des microorganismes présents dans un échantillon environnemental ou clinique, d'extraction et de purification des acides nucléiques desdits microorganismes. L'invention concerne en outre un système automatisé de lyse des microorganismes d'extraction et de purification des acides nucléiques desdits microorganismes, aux fins d'analyse.
On observe, depuis plusieurs années, une recrudescence des infections nosocomiales au sein des hôpitaux. Ces infections s'expliquent par la contamination des personnes hospitalisées, et donc par définition immunodéprimées , par des microorganismes pathogènes présents dans la sphère environnementale hospitalière et non détruits malgré le soin toujours important apporté à la désinfection des outils et des surfaces et au traitement de l'air Eu égard à ces cas de plus en plus fréquents de contaminations microbiologiques environnementales, la mise au point de dispositifs et de méthodes permettant d'améliorer et de faciliter les contrôles environnementaux est devenu un enjeu majeur pour les professionnels de santé.
Au-delà du problème des infections nosocomiales, le contrôle des conditions environnementales est également devenu depuis plusieurs années, un souci récurrent dans le milieu industriel, en particulier les industries agro-alimentaires, les industries pharmaceutiques ou cosmétiques. Dans les industries agro¬ alimentaires, on sait les conséquences désastreuses sur la santé des consommateurs, que peut avoir la contamination des produits, voire de matières premières, par un microorganisme pathogène. En effet, les toxi-infections alimentaires, dues à des bactéries telles que celles du genre Listeria ou Salmonella sont aujourd'hui monnaie courante. Le contrôle de la qualité de l'air est également un processus-clé dans la démarche qualité des industries pharmaceutiques ou cosmétiques.
Par ailleurs, ces contrôles doivent répondre à un niveau d'exigence toujours plus important, de par une réglementation toujours plus stricte.
Parmi les outils à disposition des professionnels de santé ou des industriels pour la réalisation de contrôles environnementaux, les aéro-bio-collecteurs sont des solutions de choix pour la détection des microorganismes de l'air. Ces dispositifs sont placés aux endroits appropriés dans les lieux où l'on souhaite mesurer 1 ' aéro-bio-contamination . Ils sont généralement constitués d'un collecteur d'air couplé à un milieu de culture. L'air collecté par le collecteur d'air entre en contact avec le milieu de culture ; milieu de culture sur lequel viennent se déposer les microorganismes éventuellement contenus dans l'air collecté. Le milieu de culture est ensuite récupéré et placé à l'étuve pour favoriser la croissance des microorganismes. Il est ainsi possible de détecter et d'identifier lesdits microorganismes par des techniques traditionnelles de microbiologie .
Ces dispositifs présentent néanmoins un inconvénient majeur qui est lié à la technologie utilisée. Cet inconvénient est le temps nécessaire pour obtenir le résultat d'analyse. En effet, l'utilisation des techniques traditionnelles de microbiologie, en particulier de bactériologie, implique le respect de temps d'incubation nécessaires à la croissance cellulaire, voire des phases de réensemencement sur des milieux de culture spécifiques pour permettre l'identification. Il s'ensuit que le temps nécessaire pour obtenir un résultat est relativement long, voire trop long, quand on cherche à détecter et identifier un organisme pathogène, responsable d'une infection nosocomiale ou d'une toxi- infection alimentaire.
Un autre inconvénient de ce type de dispositif est que l'utilisation de milieux de culture, s'il permet de discriminer entre les genres et espèces bactériennes, ne permet généralement pas de discriminer les souches d'une même espèce bactérienne. Or, l'on sait que la pathogénicité d'un microorganisme peut varier de manière significative selon la souche considérée.
Par ailleurs, ce type de dispositif présente comme inconvénient de ne pas permettre la mise en évidence des microorganismes présents dans l'air, viables mais non cultivables.
Ces dispositifs ont également pour inconvénient le séchage des surfaces nutritives au fur et à mesure de la collection.
Il existe par ailleurs des dispositifs destinés à la récupération des particules présentes dans l'air, en particulier des microorganismes. Le document GB-2 254 024 décrit ainsi un dispositif pour collecter les particules contenues dans l'air dont le principe est basé sur l'effet cyclone. Si un tel dispositif se montre approprié à la collecte des particules contenues dans l'air, y compris les microorganismes, il n'est en aucun cas étudié pour traiter l'échantillon ainsi obtenu, en particulier pour réaliser l'extraction du matériel génétique destiné à être utilisé pour l'analyse.
De manière plus générale, les techniques les plus pertinentes en termes d'identification de microorganismes et/ou de rapidité de rendu des résultats, que ce soit vis-à-vis d'échantillons cliniques ou environnementaux, sont sans nul doute les techniques de diagnostic moléculaire. Ces techniques basées sur l'analyse du matériel génétique des microorganismes, et en particulier de certaines séquences spécifiques d'intérêt, permettent d'obtenir une identification très pointue des microorganismes en un temps record, puisqu'elles permettent de s'affranchir des étapes de culture .
Néanmoins, l'utilisation de telles techniques présente un certain nombre de limites, parmi lesquelles la plus importante est la quantité potentiellement limitée de microorganismes présents dans l'air et donc récupérable pour réaliser l'analyse. En effet, on sait que les prélèvements environnementaux, mais aussi certains prélèvements cliniques sont relativement pauvres en microorganismes. Il s'ensuit que la quantité de matériel génétique obtenue à partir de cette matière première est faible. Les performances de la technique utilisée pour extraire les acides nucléiques, en termes de rendement, deviennent alors un paramètre crucial.
Par ailleurs, la plupart des techniques existantes de lyse de microorganismes, ne sont pas génériques vis-à-vis de l'ensemble des microorganismes et/ou nécessitent l'intervention de personnel qualifié pour prendre en charge les étapes manuelles.
Le document WO-A-2005/038025 décrit une méthode d'extraction d'acides nucléiques de microorganismes prélevés notamment dans l'air. Cette méthode consiste dans la mise en œuvre de trois méthodes de lyse différentes, à savoir une lyse chimique, une lyse par choc thermique et une lyse mécanique. Si une telle méthode permet sans nul doute d'optimiser le rendement d'extraction des acides nucléiques et donc d'augmenter la quantité de matériel génétique disponible pour l'analyse, il n'en demeure pas moins que ce rendement reste dépendant de la quantité de microorganismes récupérés. Or, rien dans ce document n'est décrit pour optimiser la récupération desdits microorganismes.
Le document US-A-5, 707, 861 décrit un dispositif permettant de désintégrer des cellules vivantes du type microorganismes. Ce dispositif permet de lyser les cellules en utilisant à la fois des billes de verre mais également l'effet de vibration dû à l'espace existant entre les tubes contenant les microorganismes et les trous du support portant lesdits tubes. Ainsi, un tel dispositif permet d'optimiser la lyse de cellules et donc d'optimiser l'extraction du matériel génétique. Un tel dispositif et la méthode mise en œuvre par ce dernier présentent les mêmes limites que celles exposées précédemment, à savoir qu'ils restent dépendants de la quantité de microorganismes récupérés. Par ailleurs, ils présentent comme inconvénient supplémentaire de devoir effectuer subséquemment une étape de concentration des acides nucléiques afin de les isoler des débris cellulaires. Ils nécessitent enfin de récupérer manuellement les acides nucléiques, à l'issue de l'étape de concentration.
Ces problèmes se posent également avec le dispositif décrit dans le document US-5, 567, 050.
Des systèmes plus intégrés ont également été décrits. Ainsi, le document WO-A-2004/018704 décrit un dispositif, et une méthode associée utilisant la technique d'amplification PCR (Polymerase Chain Reaction), pour collecter des microorganismes dans l'air et les identifier. Ce système est spécialement adapté à la lutte contre les tentatives d'attentats par contamination biologique dans les centres de tri postal. Ce système se compose d'un dispositif de collecte d'air placé le long du circuit de transport du courrier, un dispositif de filtration/séparation des particules par effet cyclone, un dispositif de concentration/récupération des particules dans un échantillon liquide, un dispositif de transfert d'une fraction de l'échantillon dans une cartouche d'analyse par PCR GeneXpert™ de la société Cepheid en Californie. La cartouche est ensuite transférée manuellement dans un automate d'analyse biologique indépendant à fin d'identification du ou des microorganismes collectés dans l'air.
Si ce système permet de résoudre un bon nombre de problèmes techniques liés aux dispositifs et procédés décrits précédemment, il présente néanmoins des inconvénients majeurs. Le premier de ces inconvénients est que le système de traitement de l'échantillon (collecte, séparation, concentration/récupération) préalablement au transfert dans la cartouche d'analyse est relativement complexe et coûteux. Un deuxième inconvénient est que les microorganismes collectés sont récupérés dans un échantillon liquide dont seule une fraction est analysée. Ce qui signifie que le risque de ne pas récupérer la totalité des microorganismes et donc la totalité des acides nucléiques est très important, limitant fortement la pertinence de l'analyse. Par ailleurs, malgré sa complexité, ce système nécessite le transfert manuel de la cartouche dans l'automate d'analyse GeneXpert™.
La Demanderesse a déjà déposé une demande de brevet WO-A- 2009/001010 qui concerne en premier lieu une cartouche, susceptible d'être positionnée à l'intérieur d'un moyen de collecte d'air et à recevoir un moyen de récupération des acides nucléiques, ladite cartouche de forme sensiblement cylindrique, comportant une zone de rétention des microorganismes, ladite zone de rétention comportant des moyens de lyse de microorganismes. Cette invention concerne en outre un dispositif de collecte de microorganismes contenus dans l'air et un dispositif de lyse de microorganismes . La Demanderesse a également déjà déposé une demande de brevet WO- A-2010 /067019 qui concerne entre autres un dispositif de collecte de microorganismes contenus dans l'air, ledit dispositif comportant :
• un module de collecte d'air, comprenant :
i. un élément supérieur comportant un conduit d'admission de l'air permettant l'entrée d'un flux d'air à l'intérieur dudit module, ledit conduit disposant à sa base, de moyens de perturbation du flux d'air,
ii. un élément inférieur comportant des moyens d'évacuation de l'air permettant la sortie du flux d'air créé lesdits éléments supérieur et inférieur pouvant être solidarisés l'un à l'autre de sorte que le flux d'air puisse être créé à l'intérieur dudit module de collecte d'air ;
• une cartouche, de forme sensiblement cylindrique, comportant une zone de rétention des microorganismes, ladite zone de rétention comportant des moyens de lyse de microorganismes, ladite cartouche étant positionnée à l'intérieur dudit module de collecte d'air.
Avec ces deux nouvelles solutions, il est indéniable que le processus est amélioré avec une lyse universelle, à la fois efficace pour des prélèvements environnementaux et cliniques, pour une grande diversité de microorganismes, qu'il s'agisse de bactéries, de virus ou encore de champignons, éventuellement à l'état végétatif ou sous forme de spores.
De plus il y a une assez forte concentration des micro-organismes, le système est compatible avec différentes analyses en aval (de type PCR, étalement sur boîte, etc.) et la lyse mécanique est intégrée . Toutefois, il n'est pas dans la nature humaine de se contenter d'un système qui fonctionne bien quand on peut trouver une solution encore plus optimale. Ainsi dans ces deux cas de figure, la collecte est toujours limitée par le volume de fluide, gazeux ou liquide, qui va en contact avec le milieu de récupération, en général un milieu de culture. Le flux de fluide va toujours venir frapper ce milieu au même endroit, ce qui va entraîner :
• soit la saturation dudit milieu en un endroit précis sans que le reste ne soit utilisé,
• soit la dégradation de ce milieu car il est tout le temps frappé par un gaz ou un liquide au (x) même (s) endroit (s), ce qui entraine un dessèchement dans le cas d'un gaz et une liquéfaction de la surface du milieu dans le cas d'un liquide. Dans les deux cas et notamment dans le cas du séchage de la gélose, il y aura une diminution très nette du rendement de capture en fonction du temps.
De plus le mode de capture par impaction est très peu efficace pour les petites particules d'un diamètre inférieur à 1 ym. Autre problème, il y a un risque d ' entraînement d'une partie du milieu de récupération (billes avec du glycérol) par le flux d'air. Ainsi, cette projection de fluide et son rebond sur ledit milieu peut engendrer des éclaboussures qui sont autant de risques de contamination .
La présente invention a pour objectif de proposer un appareil qui répond à ces inconvénients ci-dessus énumérés.
Pour cela l'invention propose un dispositif de collecte de microorganismes contenus dans un fluide, le dispositif comportant : • un module réactionnel renfermant un ensemble de billes,
• au moins un conduit d'admission du fluide permettant l'entrée d'un flux de fluide à l'intérieur du module,
• au moins un conduit d'évacuation du fluide permettant la sortie du flux dudit fluide ayant traversé l'intérieur dudit module,
• des moyens de rétention des billes à l'intérieur du module,
• au moins un canal d'admission d'au moins un liquide réactionnel ,
• au moins un canal d'évacuation d'au moins un liquide réactionnel ,
les canaux d'admission et d'évacuation du liquide réactionnel et les conduits d'admission et d'évacuation du fluide étant positionnés de la manière suivante au niveau du module:
• les conduits d'admission et d'évacuation du fluide se faisant face tout en enserrant le module, afin de maximiser les contacts entre le fluide et les billes,
• les canaux pour le ou les liquides réactionnels étant placés respectivement à deux extrémités opposées du module, et
• les canaux pour le ou les liquides réactionnels sont positionnés selon un plan, et les conduits d'admission et d'évacuation du fluide sont positionnés selon un axe, et que l'axe est sensiblement perpendiculaire au plan.
Selon un premier mode de réalisation, le dispositif, selon l'invention, comprend une enceinte de confinement étanche isolant fluide et liquides réactionnels de l'extérieur. Selon une première variante de réalisation du dispositif, si le fluide est un gaz, l'ensemble de billes est constitué de billes recouvertes de glycérol.
Selon une seconde variante de réalisation du dispositif, si le fluide est un liquide, le module contient un filtre s' étendant sensiblement dans le plan formé par les canaux pour le ou les liquides réactionnels , le (s) canal (canaux) d'admission étant situé (s) d'un côté du filtre avec l'ensemble de billes et le (s) canal (canaux) d'évacuation étant situé (s) de l'autre côté dudit filtre en l'absence de billes. Cette disposition permet ainsi au fluide de rentrer en contact avec les billes puis de circuler au travers du filtre, afin de séparer par exemple d'éventuels résidus cellulaires sans intérêt ou inhibiteurs, tels que protéines, membranes.
Dans un mode de réalisation particulier, la forme du module si on le coupe :
• selon le plan formé par les canaux d'admission et d'évacuation du liquide réactionnel, et
• perpendiculairement à l'axe formé par les conduits d'admission et d'évacuation du fluide
comprend au moins une partie rectilignes et/ou au moins une partie en arc comprise (s) entre deux extrémités. Le (s) canal (canaux) d'admission du liquide réactionnel étant situé (s) à une extrémité du module et le (s) canal (canaux) d'évacuation du liquide réactionnel étant situé (s) à l'autre extrémité du module, de sorte que le liquide réactionnel traverse entièrement le lit de bille entre le moment où il est admis dans le (s) canal (canaux) d'admission du liquide réactionnel et le moment où il est évacué par le (s) canal (canaux) d'évacuation du liquide réactionnel. Selon ce dernier mode ou variante, le module à une section de quadrilatère si on le coupe selon un plan perpendiculaire au plan formé par les canaux d'admission et d'évacuation du liquide réactionnel, et passant par l'axe formé par les conduits d'admission et d'évacuation du fluide.
Dans un mode de réalisation particulier, le module à une forme de « C » si on le coupe :
• selon le plan formé par les canaux d'admission et d'évacuation du liquide réactionnel, et
• perpendiculairement à l'axe formé par les conduits d'admission et d'évacuation du fluide
Une forme de « C » comprend au moins une partie en arc correspondant à une partie de la circonférence d'un cercle ou d'une parabole reliant deux points. Les extrémités du « C » étant les deux zones terminales du module, de sorte que le (s) canal (canaux) d'admission du liquide réactionnel étant situé (s) à une extrémité du module et le (s) canal (canaux) d'évacuation du liquide réactionnel étant situé (s) à l'autre extrémité du module, le liquide réactionnel traverse entièrement le lit de bille entre le moment où il est admis dans le (s) canal (canaux) d'admission du liquide réactionnel et le moment où il est évacué par le (s) canal (canaux) d'évacuation du liquide réactionnel.
Selon ce dernier mode ou variante, le module à une forme de quadrilatère si on le coupe selon un rayon passant par le centre du « C » et coupant ledit « C ».
Toujours selon ce dernier mode ou variante, le (s) canal (canaux) d'admission du liquide réactionnel est (sont) situé (s) à une extrémité du « C » de la forme du module, et que le (s) canal (canaux) d'évacuation du liquide réactionnel est (sont) situé (s) à l'autre extrémité du « C ».
Quel que soit le mode ou la variante de réalisation, les billes ont un diamètre compris entre 200 et 600 ym et les moyens de rétention desdites billes à l'intérieur du module sont constitués de grilles, dont les pores ont un diamètre inférieur aux billes et compris entre 100 et 500 ym.
Quel que soit le mode ou la variante de réalisation, il comprend un autre module réactionnel permettant le traitement des microorganismes collectés, le module contenant :
• des moyens de séparation des résidus cellulaires sans intérêt ou inhibiteurs, tels que protéines, membranes, et/ou
• des moyens d'amplification des acides nucléiques collectées et séparés des inhibiteurs, et/ou
• des moyens de détection des amplicons ainsi générés.
La présente invention concerne également un procédé de collecte de microorganismes contenus dans un fluide, qui consiste à :
• introduire du fluide suspecté de contenir des microorganismes via au moins un conduit d'admission du fluide,
• traverser un lit de billes où les microorganismes sont immobilisés ,
• évacuer le fluide débarrassé desdits microorganismes via au moins un conduit d'évacuation dudit fluide,
• introduire au moins un liquide réactionnel via au moins un canal d'admission de liquide (s) réactionnel (s) , • traverser le lit de billes où les microorganismes sont immobilisés afin de mettre lesdits microorganismes en suspension, et
• évacuer ce liquide transportant les microorganismes via au moins un canal d'évacuation de liquide (s) réactionnel (s) , les conduits d'admission et d'évacuation du fluide se faisant face tout en enserrant le lit de billes, les canaux d'admission et d'évacuation de liquide (s) réactionnel (s) étant positionnés de manière à accéder à l'ensemble des billes.
Selon un mode de réalisation, lorsque le fluide est un gaz, les billes sont recouvertes de glycérol.
Selon un mode de réalisation, lorsque le fluide est un liquide, les billes sont recouvertes d'un revêtement de polymère.
Selon un mode de réalisation, lorsque le liquide réactionnel traverse le lit de billes, lesdites billes sont agitées par un moyen d' agitation extérieur et entrent en contact ce qui permet de détruire ou de lyser les membranes des microorganismes, rendant les acides nucléiques accessibles et prêts à être évacués
Selon un mode de réalisation, une quantité définie de liquide réactionnel est admise dans le (s) canal (canaux) d'admission du liquide réactionnel et n'est pas évacuée par le (s) canal (canaux) d'évacuation du liquide réactionnel pendant la lyse de telle sorte que les microorganismes sont lysés pendant une durée définie en présence d'une quantité définie de liquide réactionnel Cette durée étant préférentiellement comprise entre 5 et 30 minutes et cette quantité de liquide étant préférentiellement comprise entre ΙΟΟμΙ et 1 ml, plus préférentiellement de 500μ1.
Selon une variante de ce mode de réalisation, l'agitation des billes est réalisée par l'utilisation d'ultrasons. Quel que soit le mode ou la variante de réalisation, le liquide chargé de tout ou partie des microorganismes est évacué vers un autre module réactionnel du dispositif permettant le traitement des microorganismes collectés, le traitement consistant à :
• séparer les résidus cellulaires sans intérêt ou inhibiteurs, tels que protéines, membranes, et/ou
• amplifier les acides nucléiques collectées, et/ou
• détecter les amplicons ainsi générés.
Quel que soit le mode ou la variante de réalisation, une première possibilité pour ce procédé se caractérise en ce que :
• le fluide testé est constitué par un gaz, (par exemple de l'air)
• le gaz traverse le lit de billes, billes qui sont recouvertes de glycérol, où les microorganismes sont immobilisés, et
• l'on introduit au moins un liquide réactionnel afin de liquéfier le glycérol et de mettre lesdits microorganismes en suspension .
Quel que soit le mode ou la variante de réalisation, une seconde possibilité pour ce procédé se caractérise en ce que :
• le fluide testé est constitué par un liquide,
• le liquide testé traverse le lit de billes puis un filtre avant d'être évacué, débarrassé des microorganismes qu'il contenait, les microorganismes sont immobilisés, et
• l'on introduit au moins un liquide réactionnel afin de mettre lesdits microorganismes en suspension.
Selon l'une quelconque de ces deux possibilités, le liquide est filtré entre l'évacuation via au moins un canal d'évacuation de liquide (s) réactionnel (s) et le module permettant l'élimination des inhibiteurs et/ou l'amplification et/ou la détection. Par échantillon fluidique, on entend tout échantillon gazeux ou liquide susceptible de contenir des microorganismes. Il peut s'agir d'un échantillon d'origine humaine ou animale. Cet échantillon peut être par exemple, de l'urine, du sang total, du plasma ou tout autre liquide corporel ou de l'air expiré. L'échantillon peut être d'origine alimentaire tel qu'une boisson. Il peut être également d'origine environnementale, tel que de l'eau ou de l'air confiné. Par ailleurs, l'échantillon liquide peut être également un liquide dit de transfert, dans lequel des éventuels microorganismes contenus sur un dispositif de prélèvement de surface, du type écouvillon tel que ceux commercialisés par la société COPAN, sous la dénomination « flocked SWABS », ont été re-suspendus par agitation dudit écouvillon dans ledit liquide de transfert.
Les microorganismes sont pris dans le groupe comprenant les bactéries, les virus, les levures, les moisissures, les parasites
Les échantillons à partir desquels sont isolés les microorganismes sont d'origine environnementale. Ainsi, il peut s'agir d'un échantillon d'air ou de liquide, tel que de l'eau ; des prélèvement de surface. Les échantillons peuvent être également d'origine clinique, à savoir tout échantillon d'origine humaine ou animale, apte à faire l'objet d'une analyse pour la rechercher et l'identification d'un microorganisme, éventuellement pathogène.
La présence des acides nucléiques cibles peut être mise en évidence par la visualisation de réactions d'hybridation. On entend par réaction d'hybridation toute réaction entre un acide nucléique de capture et un acide nucléique cible isolé ou généré par une étape de transcription, de transcription inverse ou d'amplification de type, par exemple, NASBA (pour Nucleic Acid Séquence Based Amplification en anglais) ou PCR.
On entend par acide nucléique, les oligonucléotides , les acides désoxyribonucléiques et les acides ribonucléiques , ainsi que leurs dérivés. Le terme oligonucléotide désigne un enchaînement d'au moins deux nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides , ou les deux) , préférentiellement au moins cinq, préférentiellement au moins huit, et encore plus préférentiellement au moins quatorze, qu'ils soient naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un autre oligonucléotide au moins partiellement complémentaire.
Par nucléotide modifié, on entend par exemple un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2 , 6-purine et la bromo-5-désoxyuridine .
Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate et alkylphosphodiester.
Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans la demande de brevet FR-A-2.607.507 , les LNA tels que phosphorothioate-LNA and 2 ' -thio-LNA décrits dans Bioorganic & Médicinal Chemistry Letters, Volume 8, Issue 16,18 August 1998, pages 2219-2222, et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114,1895- 1897, sont des exemples d ' oligonucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié. La visualisation des réactions d'hybridation peut être effectuée par tout moyen de détection, tels que des moyens directs ou indirects .
Dans le cas de la détection directe, c'est-à-dire sans l'intermédiaire d'un marquage, on observe les réactions d'hybridation par résonance plasmon ou par voltamétrie cyclique sur une électrode portant un polymère conducteur.
Dans le cas de la détection indirecte, c'est-à-dire par l'intermédiaire d'un marquage, le marquage peut être effectué soit directement sur les acides nucléiques cibles, soit par l'intermédiaire d'un partenaire de liaison spécifique desdits acides nucléiques préalablement marqués.
On entend par partenaire de liaison spécifique des acides nucléiques cibles tout partenaire capable de se lier avec l'acide nucléique cible et on donnera à titre d'exemples les acides nucléiques, les oligonucléotides ou polynucléotides et les substrats enzymatiques .
Par marquage, on entend la fixation d'un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs consiste en : les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par électrochimie, colorimétrie, fluorescence, luminescence, enzymes comme la péroxydase de Raifort (HRP) , la phosphatase alcaline (PAL) , la beta-galactosidase, la glucose- 6-phosphate déshydrogénase ; les inhibiteurs d'enzymes ; les co-facteurs d'enzymes ; les particules telles que les particules en or, les latex magnétiques, les liposomes ; les chromophores comme les composés, luminescents, colorants, les molécules radioactives comme le J"P, le JJS ou le I, les molécules fluorescentes telles que la fluorescéine, la rhodamine, les Alexa®, l' umbelliférone, le luminol ou les phycocyanines . Dans le cas de la fluorescence, il peut s'agir du produit fluorescent d'une réaction enzyme- substrat, d'une combinaison fluorophore-quencher, d'une extinction de fluorescence ou de tout autre système basé sur des propriétés de fluorescence.
Des systèmes indirects peuvent être aussi utilisés, comme par exemple par l'intermédiaire d'un autre couple ligand/antiligand . Les couples ligand/antiligand sont bien connus de l'homme du métier, et on peut citer par exemple les couples suivants : biotine/streptavidine, sucre/lectine,
polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte l'agent de liaison. L'antiligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un ligand/anti-ligand .
Ces systèmes de détection indirects peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR-A-2 781 802 et WO-A-95/08000 de la demanderesse ou à l'article J. Histochem. Cytochem. 45 : 481-491, 1997.
Le marquage préalable des acides nucléiques cibles peut être effectué par incorporation directe ou indirecte de marqueur par une polymérase, par une kinase, de façon aléatoire ou spécifique, aux extrémités ou par incorporation « à l'intérieur » de la molécule .
Le marquage des partenaires de liaison spécifiques des analytes cibles est largement connu de l'homme du métier et est décrit par exemple par Greg T. Hermanson dans Bioconjugate Techniques, 1996, Académie Press Inc, 525B Street, San Diego, CA92101 USA.
Selon le type de marquage du conjugué utilisé, comme par exemple en utilisant une enzyme, l'homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage. Cette étape correspond à la révélation. Elle est précédée de l'utilisation d'un tampon de lavage qui permet d'éliminer les fractions d' analytes ou d'éléments non engagés dans la réaction, ou faiblement ou non spécifiquement liés, afin de limiter le bruit de fond.
Les buts et avantages du dispositif selon la présente invention seront mieux compris à la lumière de l'exemple nullement limitatif qui suit, en référence aux figures, dans lesquelles :
• La Figure 1 représente une vue éclatée du dessus de la carte ou cartouche utilisée pour collecter et lyser les microorganismes avec tous les éléments qui lui permettent de fonctionner, selon un mode particulier de réalisation de 1 ' invention .
• La Figure 2 représente une vue du dessus en perspective de la carte principale formant l'âme du dispositif selon le mode de réalisation de l'invention présenté à la figure 1.
• La Figure 3 représente une vue du dessous en perspective de la carte principale, toujours selon le mode de réalisation de l'invention présenté à la figure 1.
• La Figure 4 représente une vue de détail de la figure 2 au niveau du lit de billes et de la grille les retenant dans le plan en contact avec au moins un conduit d'admission du fluide et permettant la capture des microorganismes. Les deux extrémités opposées du module en forme de « C » sont connectées fluidiquement aux canaux d'admission et d'évacuation du liquide réactionnel.
• La Figure 5A est un schéma de principe de la partie filtrante de la carte principale où se trouvent présentes les billes lorsque les plaques de confinement sont fermées.
• La Figure 5B est un schéma de principe similaire à celui de la Figure 5A, mais dans lequel les plaques de confinement sont ouvertes. • La Figure 6 est la reprise d'un détail A de la figure 5B mais dans lequel le mouvement du fluide au sein des billes de capture et le mouvement des plaques de confinement sont mis en exergue.
• La Figure 7 est identique à la figure 6 mais se focalise sur le nouveau mouvement des plaques de confinement et le début du mouvement du liquide réactionnel au sein des billes de capture .
• La Figure 8 est identique à la figure 7 et montre bien le mouvement du fluide au sein desdites billes de capture.
• La Figure 9 est identique à la figure 8 mais précise l'extraction des acides nucléiques.
• Les Figures 10A à 10D montrent l'efficacité du remplissage de la chambre où les microorganismes sont retenus par les moyens de rétention au fil du temps.
• La Figure 11 représente un graphe démontrant l'efficacité de la lyse au sein d'un dispositif selon l'invention.
La présente invention concerne un dispositif de collecte 1 de microorganismes. Sur la Figure 1 on peut voir une vue éclatée d'un mode de réalisation présenté par la demanderesse dans lequel le dispositif 1 pour la collecte de microorganismes est présenté sans la présence d'aucun fluide 2 ou liquide 12. Ledit dispositif de collecte 1 comporte essentiellement deux grandes parties, une carte principale 4 située en position inférieure par rapport à une carte secondaire 5, elle, en position supérieure. La carte principale 4 ayant une forme de « L », la carte secondaire 5 s'intègre dans cette forme en « L » pour donner une forme générale de parallélépipède. Ces cartes principale 4 et secondaire 5 sont destinées à être mises en contact l'une de l'autre. De ce fait elles vont pouvoir former un moyen 9 de rétention de billes 6, essentiellement constitué par une cavité présente dans la partie horizontale de la forme en « L », cette cavité 9 étant fermée par la face inférieure de la carte secondaire 5 en contact avec la carte 4. Les deux cartes principale 4 et secondaire 5 forment une fois assemblées le module réactionnel 3. Néanmoins, le moyen de rétention 9 n'est pas simplement constitué par les bords de ce module réactionnel 3 mais comporte également une ou des grilles 27, non représentées sur la figure 1, permettant le passage de fluide 2 ou des liquides 12 sans pour autant que les billes 6, non représentées également, ne puissent sortir du module réactionnel 3. Sur la grille 27 visible sur la Figure 4, le diamètre des trous 28 de la grille 27 dépend du diamètre des billes 6 utilisées. Les trous 28 de la grille 27 doivent être d'un diamètre inférieur au diamètre des billes de verre. Dans un mode préférentiel de réalisation, les trous 28 de la grille 27 doivent être d'un diamètre significativement inférieur au diamètre des billes de verre, « significativement » veut dire par exemple que les billes 6 ont un diamètre de 400 à 600 ym et que la grille 27 a des trous 28 de 200 à 250 ym.
L'ensemble des deux cartes 4 et 5 ainsi que des conduits d'admission et d'évacuation du fluide 40 et 41 et canaux d'admission et d'évacuation du liquide réactionnels 7 et 8, présentés sur la Figure 4 , sont confinés à l'aide d'une enceinte de confinement étanche 13, qui est constituée, dans le mode de réalisation présenté sur la Figure 1, par un certain nombre de plaques de confinement.
Il y a tout d'abord en position supérieure deux plaques supérieures 14 et 15. Il y a ensuite en position inférieure deux plaques inférieures 16 et 17 ; les plaques 14 et 16 permettent le confinement du module réactionnel 3 notamment au niveau des canaux fluidiques de la zone d'analyse 26, qui sera décrite ultérieurement. Il y a ensuite les plaques supérieures et inférieure ferromagnétiques de confinement 15 et 17 qui, elles, se trouvent positionnées au-dessus dudit module réactionnel 3.
Après la phase de capture, les plaques 15 et 17 sont repositionnées pour fermer le consommable. Seules les micro¬ organismes 10 restent dans la chambre 9. Les canaux 7 et 8 sont alors utilisés pour faire circuler le tampon d'élution avant la phase de lyse ultrason.
On note que les plaques supérieure 15 et inférieure 17 sont de nature ferromagnétique car elles encadrent la présence d'un certain nombre d'aimants 21 positionnés aux quatre angles du module réactionnel 3 ainsi qu'en son centre. Les aimants 21 assurent, d'une part, la pression des plaques ferromagnétiques 15 et 17 sur les joints toriques 18 et, d'autre part, l'étanchéité après la capture des microorganismes. Ces plaques 15 et 17 permettent d'avoir accès aux billes de capture 6, et d'effectuer la capture des microorganismes 10 présents dans le fluide 2 sur les billes 6. Les plaques 15 et 17 coulissent à la surface du dispositif 1 par l'intermédiaire de glissières 29, situées sur les côtés, elles sont dans le cas présent en forme de queue d'aronde. Le prélèvement d'air terminé, lesdites plaques 15 et 17 sont repositionnées à leur emplacement d'origine par coulissement le long des glissières 29. Le circuit de liquide est alors fermé. Il faut une force de « plaquage » des plaques afin d'assurer une parfaite étanchéité à la fermeture. Cette force est par exemple ferromagnétique, ce qui à l'avantage d'être une force de pression homogène sur toute la surface des plaques concernées.
Entre les cartes principale 4 et secondaire 5 et les plaques supérieure 15 et inférieure 17 l'étanchéité est assuré par un ensemble de joints toriques d'étanchéité 18. Ces joints toriques 18 sont au nombre de trois en position supérieure et de trois également en position inférieure et sont concentriques. Bien entendu, ce nombre est tout à fait non limitatif puisque l'utilisation d'un seul joint torique peut suffire. De plus, d'autres moyens d'étanchéité existent entre les plaques supérieure 14 et inférieure 16 et le reste du dispositif 1. Les moyens utilisés sont notamment un collage de chacune de ces plaques avec une colle ou un adhésif double face sur la carte principale 4. De la même manière la carte secondaire 5 est collée définitivement sur le corps 4 du dispositif. Ce collage est effectué par ultrason, laser ou par voie thermique, il est définitif et permet l'assemblage du dispositif de collecte 1.
On note que la carte principale 4 comporte deux zones où des canaux sont présents. Il y a tout d'abord une zone de stockage référencée 25 à proximité du module réactionnel 3. Il y a également une zone d'analyse 26, qui a été évoquée précédemment. L'ensemble des canaux présents au niveau des zones 25 et 26 permet la gestion fluidique de l'ensemble de la carte. Le canal de la zone de stockage 25 est le réservoir de stockage du liquide réactionnel 12 (tampon d'élution) . Les canaux de la zone d'analyse 26 sont les canaux fluidiques de préparation de l'échantillon pour analyse. Ils circulent sur le recto et le verso de la carte. La lecture de fluorescence se fait également dans les canaux de la zone 26. Etant donné que ces zones 25 et 26 ne sont pas l'essence de l'invention, elles ne seront pas exposées plus avant.
De tels types de canaux et leurs fonctions sont mieux expliqués dans une précédente demande de brevet WO-A-2011/033231 déposée sous priorité française du 18 septembre 2009 par la demanderesse. Le lecteur est invité à s'y référer pour une information plus complète . Après capture des microorganismes 10, les plaques 15 et 17 sont refermées. Le tampon de la chambre 25 est envoyé dans la chambre de capture 9 pour remettre en suspension les microorganismes. Puis la lyse par ultrason est effectuée dans cette même chambre 9 par un moyen extérieur à la carte. Le lysat est ensuite partagé via le tiroir distributeur 22, qui coulisse dans le trou 31, et envoyé dans les canaux de la zone 26 à l'aide des pistons pompes 23, coulissant eux dans les trous 32, pour la préparation à la détection et l'amplification des acides nucléiques 11.
Toutefois il convient de comprendre qu'un certain nombre d'éléments permettent la gestion fluidique et le transfert du liquide réactionnel 12 de compartiment à compartiment grâce à l'intervention du tiroir distributeur 22, ainsi que des pistons pompes 23. Trois de ces pistons pompes 23 sont présents sur la gauche de la carte principale 4, les trois autres étant présents à la droite de cette même carte 4.
Enfin, pour en finir avec la description de la Figure 1, on note la présence d'emplacements dessiccateurs 24 toujours au sein de la carte principale 4. Ces emplacements 24 étant situés à proximité de la zone d'analyse 26, ils contiennent des desséchants permettent d'optimiser la conservation des réactifs intégrés à la carte sous forme de billes de réactif lyophilisé, également appelées « pellets » obtenues par des moyens de lyophilisation, par séchage ou encore par gélification . Les desséchants ne sont pas en contact direct mais à proximité des pellets. Ces pellets contiennent les réactifs nécessaires à l'amplification des acides nucléiques 11.
Le tiroir distributeur 22 gère la distribution des fluides dans le dispositif de collecte 1. De ce fait, il y a plusieurs positions qui assurent :
• le stockage du liquide réactionnel 12, • le transfert du liquide réactionnel 12 vers la chambre ou moyen de rétention 9 contenant les billes 6 (après capture des microorganismes 10),
• le transfert vers les six canaux de la zone 26 d'un total de 120 μΐ de volume du lysat, soit 20 μΐ par canal.
Enfin les pistons pompes 23 sont semblables à des seringues qui permettent d'aspirer et de transférer le liquide réactionnel 12 durant tout le processus. Leur particularité est de fonctionner en cycle d'air clos (aucun air n'est aspiré de l'extérieur), bien qu'une version plus simple avec une aspiration d'air extérieur est envisageable. L'intérêt de ce vase clos est d'éviter au maximum la communication vers l'extérieur et ainsi le risque de contamination croisée de l'intérieur vers l'extérieur et vice versa .
On note sur cette Figure 1, la présence d'une lame de ressort 19 de verrouillage pour les plaques ferromagnétiques 15 et 17. Cette lame 19 est solidarisée au module réactionnel 3 par une vis 20. Ainsi ces plaques amovibles ne doivent pas pouvoir être manipulées de manière non intentionnelle. Cette lame de ressort 19 permet de bloquer et d'empêcher leur ouverture inopinée.
La Figure 2 représente une vue plus détaillée de la carte principale 4. Celle-ci se compose de deux parties d'épaisseur différentes, sur la gauche l'épaisseur est plus importante et comporte la zone d'analyse 26. On note également la présence des emplacements desséchants 24, ainsi que d'un trou 31 pouvant recevoir le tiroir distributeur 22, lui non représenté sur cette figure. Enfin il y a également la présence de six trous 32 pouvant recevoir les six pistons pompe 23, eux aussi non représentés sur cette figure, au sein de la carte principale 4. Sur la partie de faible épaisseur de la carte principale 4, c'est-à-dire sur la droite de cette figure, on note la présence de la zone de stockage 25 du liquide réactionnel 12, après que ledit liquide réactionnel 12 ait :
- remis en suspension les microorganismes 10 capturés, permis la lyse grâce à l'agitation des billes 6 par les ultrasons via ce liquide 12,
- transporté les organismes d'intérêt, et finalement fourni le milieu réactionnel 12 nécessaire à l'amplification et à la détection des acides nucléiques 11.
La Figure 3 représente la carte secondaire 4. Sur cette partie on note la présence des emplacements pouvant recevoir les joints toriques 18 ainsi que des emplacements 33 pouvant recevoir les aimants 21, joints 18 et aimants 21 sont non présentés sur cette figure .
La Figure 4 montre une vue agrandie d'un détail de la Figure 2, au niveau du moyen de rétention 9 des billes 6 ainsi que des canaux 7 et 8. Les deux extrémités opposées du module en forme de « C » sont connectées fluidiquement aux canaux d'admission et d'évacuation du liquide réactionnel 7 et 8.
Dans le cas présent, le moyen 9 est constitué par une grille 27, mieux représentée sur la Figure 5A ou 5B. On note que l'espace séparant les trous 28 de la grille 27 est faible, par exemple pour des billes de 500 ym, les trous auront un diamètre de 200 à 300 ym et seront séparés les uns des autres par des espaces de 200 à 300 ym, ce qui entraîne que les fluides 2 ou liquides 12 sont forcés au sein de cet espace, ce qui améliore et augmente les points de contact entre les microorganismes, contenant les acides nucléiques d'intérêt, et la surface des billes 6 permettant une meilleure capture desdits acides nucléiques 11. Les billes 6 sont également recouvertes d'une matière facilitant encore plus l'adhésion des microorganismes à la surface des billes. Cette matière est notamment du glycérol dans le cas où le fluide utilisé est un gaz. Ainsi l'utilisation du glycérol fonctionne uniquement dans le cas d'une collecte de microorganismes dans un gaz, notamment l'air. Dans ce cas de figure, l'air passe sur le glycérol et les microorganismes sont capturées sur celui-ci. Le glycérol est ensuite dissous par le tampon réactionnel 12. S'il y a présence de bactéries, elles seront alors lysées dans ce tampon par les ultrasons. Dans le cas de la collecte de microorganismes présents dans de l'eau, cela ne fonctionne pas avec le glycérol qui est dissous par l'eau, et est entraîné hors de la carte. Pour arriver à un fonctionnement correct avec un milieu liquide, il faut utiliser un substitut au glycérol, par exemple un revêtement de polymère qui ne se dissous pas dans l'eau mais uniquement dans un tampon réactionnel spécifique ou permet un "relargage" dans ce tampon spécifique ou ajouter un filtre en aval des billes afin que le fluide entre en contact avec les billes avant de circuler au travers du filtre.
Selon la Figure 5A et 5B, au niveau de la carte principale 4, où est présent la chambre ou moyen de rétention 9, on note la présence de deux conduits référencés 40 et 41. Le conduit 40 permet l'admission du fluide 2 au sein du module 3, fluide 2 qui contient les bactéries à capturer pour analyse ultérieure, alors que le conduit 41 permet l'évacuation de ce même fluide 2 à l'extérieur dudit module 3. Bien entendu, entre l'admission et l'évacuation, le fluide 2 sera passé au sein du module 3 où sont présentes les billes 6 ; c'est à ce niveau que la collecte des microorganismes pourra être effectuée. Si le fluide 2 est introduit et évacué par les conduits 40 et 41, le liquide réactionnel 12 qui peut être constitué par un tampon d'élution ou autre et quant à lui introduit par un canal d'admission 7 au sein du module 3, représenté sur la Figure 4, il est également évacué de ce même module 3 par un canal d'évacuation 8, également représenté sur la Figure 44
En fait ce fluide 2, par exemple de l'air mais qui peut aussi être un liquide différent du liquide réactionnel 12, circule perpendiculairement à la carte. Il coule à travers les grilles 27
Les Figures 5 à 8 décrivent le protocole de capture d'un microorganisme de manière simplifiée.
Dans la Figure 5A, il est décrit une partie du dispositif 1 selon l'invention, au niveau du traitement du fluide 2, dont on veut extraire les micro-organismes 10, dans lequel il y a :
• des billes 6 présentes dans la cavité, formant moyen de rétention 9,
• une grille supérieure et une grille inférieure 27, percées de plusieurs trous 28, qui confinent les billes 6 au sein du dispositif 1 et donc du moyen de rétention 9 de la carte 4,
• une plaque supérieure ferromagnétique de confinement 15,
• une plaque inférieure ferromagnétique de confinement 17, les plaques 15 et 17 n'étant pas collées à la carte 4 comme le sont les plaques supérieure et inférieure de confinement 14 et 16.
• le canal fluidique non représenté sur cette figure. Selon la Figure 5B, le dispositif 1 est sensiblement identique à la configuration de la Figure 5A, mais les plaque supérieure ferromagnétique de confinement 15 et plaque inférieure ferromagnétique de confinement 17 sont translatées selon Fl . Ceci permet au fluide 2 de passer, selon F2, au sein des billes 6, maintenues en position par les grilles 27, selon un mouvement perpendiculaire au canaux pour le ou les liquides réactionnels , non représenté sur la figure. Ce mouvement est effectué par l'intermédiaire des conduits d'admission 40 et d'évacuation 41 du fluide 2 au sein du module 3.
Selon la Figure 6, le détail A de la Figure 5B est mis en avant. Dans cette configuration, les plaques de confinement 15 et 17 amovibles sont enlevées selon Fl, et le fluide 2 circule perpendiculairement à l'axe des grilles 27. Les micro-organismes 10 sont capturés sur les billes 6 au sein du moyen de rétention 9
Dans la Figure 7, les plaques 15 et 17 amovibles sont remises en position fermée par l'intermédiaire d'un coulissement selon F3. Le tampon d'élution 12 est inséré dans la chambre 9 par le canal d'admission 7. Il décroche les micro-organismes 10 des billes 6.
Enfin sur la Figure 8, une fois la chambre 9 remplie, une lyse à ultrasons est effectuée pour lyser les micro-organismes, par exemple des bactéries, 10 et libérer les acides nucléiques 11. Le lysat contenant les acides nucléiques 11 est envoyé dans les canaux via le canal d'évacuation 8, pour préparer l'amplification par remise en suspension des billes de réactif lyophilisé, par détection optique, etc.
Le dispositif permet donc de capturer les micro-organismes 10 notamment de l'air sur des billes de verre glycérolées en faisant circuler le flux d'air à travers un tapis de billes 6. La capture de micro-organismes à travers une surface sèche présente de nombreux avantages, tels que :
• l'absence d'usure du média durant la capture (due à 1 ' évaporation) ,
• pas d ' évaporation durant le stockage,
• très forte concentration des micro-organismes, • très grande surface développée de capture (due aux microbilles) par rapport à une surface plane d'impaction,
• la surface de capture se sature plus difficilement,
la capture est donc beaucoup plus efficace qu'un système par impaction .
De plus le dispositif est conçu pour :
• offrir une large surface hors plan pour la capture des microorganismes du fluide.
• réduire les pertes de charge et donc l'encombrement de la pompe ; ainsi lors de la capture des microorganismes présents dans l'air, le dispositif est raccordé à une pompe qui aspire l'air à travers la grille de capture 27.
• permettre la reprise des micro-organismes avec un tampon liquide quelconque simplement par pipetage du fait de l'utilisation de canaux fluidiques dans le plan de capture ; ainsi après la capture des microorganismes sur le glycérol, les plaques amovibles 15 et 17 sont refermées. Le tampon de reprise (stockés dans la chambre 25) est poussé dans la chambre contenant les billes. Les microorganismes sont alors pris dans le glycérol, ce dernier se dissolvant dans le tampon, afin que les micro-organismes capturés soient relargués .
• que la lyse (par ultrasons notamment) soit intégrée dans le consommable ou dispositif de collecte de microorganismes 1,
• obtenir un haut rendement de capture avec une faible perte de charge, l'air passant à travers un tapis de billes glycérolés (et non impacté sur un tapis de billes) .
Le rendement de capture dépend beaucoup de l'épaisseur du tapis de bille et de la taille des billes mais le rendement de capture est significativement plus important avec une capture en transmission à travers les billes, notamment pour les tailles de particules inférieures à 1 ym. Ce mode capture présente des difficultés techniques tels que :
• la maîtrise de la perte de charge,
• le maintien des billes dans la chambre de capture,
• la reprise des micro-organismes avec un tampon,
• la lyse.
La capture à sec s'effectue sans bullage ni gel aqueux, sans perte d'efficacité dans le temps (> 4 m3 de prélèvement) . L'avantage du glycérol est qu'il ne sèche pas. De ce fait, le volume d'air prélevé peut être très important, sans perte notable d' efficacité .
Les captures sur des surfaces aqueuses (gélose, boîte de pétri) ou liquide aqueux (type Coriolis) présentent l'inconvénient de s'assécher au fur et à mesure de la capture. Cet assèchement provoque la diminution du rendement de capture. La capture dans un liquide défini détermine le type d'analyse réalisée en aval de la collecte alors qu'avec une capture à sec les microorganismes peuvent être repris avec n'importe quel tampon.
De plus, la capture sur une surface sèche (billes de verres + glycérol) permet de relarguer les micro-organismes dans un volume très faible de tampon, inférieur à 1 mL voire inférieur à 100 yL. L'avantage de concentrer les microorganismes est de favoriser leur détection. Les systèmes de détection en biologie moléculaire ont une limite de détection de l'ordre de 1 génome équivalent par microlitre (yL) .
Avec les dispositifs conventionnels, il faut donc capturer beaucoup plus (de 15 à 30 fois plus soit de 200 à 600 yL) de microorganismes car le volume de capture est de 15 mL (volume important qui dilue les microorganismes) . La lyse mécanique est très efficace et est compatible avec tous les types de procédé biologique, tel que la lyse ultrason dans n'importe quel tampon nécessaire aux étapes suivantes du protocole .
La lyse des micro-organismes capturés est intégrée au dispositif. La technique de lyse est purement mécanique (par opposition à la lyse chimique) et assure ainsi un excellent rendement de lyse et ce quel que soit le tampon de lyse choisi ainsi que le microorganisme à lyser.
Il est ainsi possible d'utiliser le lysat tel quel, pour effectuer ensuite une amplification par exemple NASBA ou une PCR.
Selon une utilisation préférentielle du dispositif 1 proposé par l'invention après que les micro-organismes 10 ont été lysés et que les acides nucléiques 11 ont été repris par le liquide réactionnel ou tampon d'élution 12, le dispositif de collecte 1 permet d'effectuer une amplification ainsi qu'une détection desdits acides nucléiques 11 extraits. Pour ce faire, il y a principalement quatre étapes qui sont réalisées après la lyse.
La première étape consiste à extraire le tampon 12 contenant les acides nucléiques 11 ainsi qu'un certain nombre de résidus 30 de micro-organismes 10, qui sont présents dans le liquide 12 après la lyse, ces résidus n'entrant pas en ligne de compte par la suite dans les analyses qui seront effectuées au niveau de la zone d'analyse 26. Dans cette première étape, le liquide 12 chargé des acides nucléiques 11 et des résidus 30 va sortir du moyen de rétention 9 par l'intermédiaire du canal d'évacuation 8. Au niveau du canal d'évacuation 8, il est par exemple possible d'avoir un filtre qui permet de ne laisser passer que les éléments biologiques d'une taille inférieure ou égale aux acides nucléiques extraits. Dans une seconde étape ce mélange est envoyé dans une zone permettant l'aliquotage 34, comme cela est bien représenté sur la Figure 2. Le volume ainsi obtenu correspond à 120 μΐ .
Cet aliquot est ensuite envoyé vers une troisième étape dans une zone de séparation du lysat référencée 35. Sur cette figure, il y a six zones qui sont bien différenciées les unes des autres pour permettre une séparation en six fois 20 μΐ dans les canaux d'analyse de la zone 26. Dans ces canaux de la zone 26, est effectuée une amplification qui se fait par l'intermédiaire de réactifs permettant l'amplification, tels que des nucléotides, des amorces d'amplification et des sondes de détection, qui se trouvent positionnés en zone intermédiaire 36. On remarque sur la Figure 3 qu' il existe une seconde zone intermédiaire 37 contenant au moins une enzyme (une enzyme si on effectue une PCR, deux si on effectue une TMA et trois si on effectue une NASBA) , qui se trouve au recto de la carte principale 4.
La quatrième et dernière étape s'effectue au niveau des canaux de la zone 26, comme cela est bien présenté sur la Figure 3 à la droite de la zone intermédiaire 37 où la détection peut être réalisée .
L'ensemble de ces mouvements est donc réalisé par l'intermédiaire du tiroir distributeur 22 et des pistons pompes 23 qui, par leur coulissement non représentés sur les figures, permettent de diriger les liquides des différentes zones vers d'autres zones qui vont permettre l'amplification des acides nucléiques 11 et leur détection subséquente. Le tiroir distributeur 22 et les pistons pompes 23 possèdes des joints, bien représentés sur la Figure 1, respectivement 38 et 39 qui assurent l'étanchéité du système . EXEMPLE 1 : Rendement de capture des micro-organismes (avec un compteur de particule) en fonction de la taille des billes et de l'épaisseur du tapis de billes,
Pour un même dispositif voici le graphique du rendement de capture en fonction de la taille des billes et de l'épaisseur du lit de bille.
1. A. Mode opératoire :
Les plaques coulissantes 15 et 17 sont ouvertes durant toute 1 ' expérience .
Pour cette expérience, on utilise un compteur de particules qui évalue la quantité de particules par mètre cube (m3) d'air aspiré. Les particules détectées sont classées dans différentes catégories de taille compris entre 0,3 ym, 0,5 ym, 1 ym et 5 ym) . Trois cycles de mesures sont effectués :
1 : Mesure référence à vide sans dispositif.
2 : Mesure d'évaluation avec le dispositif en amont du compteur de particules.
3 : Une seconde mesure de référence. l.B. Expérience :
Les mesures de référence à vide sont moyennées. Le rendement de capture est calculé par le rapport entre mesure avec et sans dispositif .
Les résultats sont indiqués dans le Tableau 1 ci-dessous
¥*iiles des particules 0 , 3 μιτι 0 , 5 μιτι 1 μιτι 5 μιτι
Figure imgf000036_0001
Tableau 1 : Rendement (en %) de capture des micro-organismes (avec un compteur de particule) en fonction de la taille des billes et de l'épaisseur du tapis de billes l.C. Analyse :
Pour un même dispositif 1, le tableau 1 montre que le rendement de capture est très efficace quelles que soient la taille des billes et l'épaisseur du lit de bille par rapport à l'état de la technique constitué par le dispositif décrit par le document PC . Les particules d'une taille inférieure à 0,5 ym ne semblent pas donner un rendement suffisant même si cela reste bien supérieur à l'état de la technique (minimum de 18% de rendement contre zéro) . Dans une taille comprise entre 0,5 et 5 ym les résultats sont bons (toujours supérieurs à 65% et même si on exclut le cas à 65%, toujours supérieurs à 85%) . Toutes les épaisseurs de lit de billes testées sont acceptables.
EXEMPLE 2 : Optimisation de la perte de charge de chacun des dispositifs testés : 2. A. Mode opératoire :
Chaque dispositif est placé sur un banc d'essai qui permet de mesurer la perte de charge en fonction du débit d'air. L'objectif est de trouver le meilleur compromis entre l'efficacité de capture du dispositif 1 et sa perte de charge. Une perte de charge élevée signifie une consommation électrique élevée du dispositif de prélèvement (non favorable à une application portable) .
2.B. Expérience :
Le Tableau 2 est un tableau d'aide au design du dispositif de capture des microorganismes. Il compare le rendement de capture des particules (par gamme de taille : 0,5-1 ym, 1-5 ym, 5-25 ym) à la perte de charge en pression (mBar) du dispositif. L'énergie nécessaire pour pomper un certain volume d'air à travers le dispositif est proportionnel à la perte de charge (pour un même débit) . Pour une application de pompe portative il est nécessaire de trouver le bon compromis entre le rendement de capture et la perte de charge (voir Tableau 2) .
Figure imgf000037_0001
1 , 5 mm
425-600 ym
2,5-3 mm 72 89 88 15
WO-A-2009/001010 43 80 94, 5 6-11
Tableau 2 : Rendement de capture des microorganisme par tranche de taille de particule et perte de charge du dispositif testé (à 50 L/min) en fonction de la taille des billes et de l'épaisseur du tapis de billes
2.C. Analyse :
A la lumière de ce tableau et en comparaison avec la demande de brevet WO-A-2009/001010, constituant l'état de la technique, on peut voir que le dispositif selon l'invention, quel que soit l'épaisseur du lit de billes et quel que soit le diamètre des billes utilisés, est toujours plus performant que la solution proposée par l'état de la technique. De plus, avec des billes de 425 à 600 ym et une épaisseur de lit de 1,5 mm les résultats sont les plus efficaces pour capturer les particules que le dispositif du brevet WO-A-2009/001010 et ce pour une perte de charge en pression équivalente.
EXEMPLE 3 : Remplissage et vidange des dispositifs :
3. A. Mode opératoire :
Seule la chambre 9 de billes 6 est testée. L'entrée de la chambre de bille (pleine de bille mais sans liquide) est connectée à un raccord fluidique et une pipette. Le liquide est poussé dans la chambre de bille jusqu'à son remplissage. Une fois remplie, celle-ci est vidée de la même manière. 3.B. Expérience
Les Figures 10A à 10D montre le remplissage de la chambre 9 où les micro-organismes 10 sont capturés. On injecte 500 yL au niveau du canal d'admission 7 et on arrive à récupérer 200 yL au niveau du canal d'évacuation 8.
3. C. Résultats :
Le remplissage s'effectue parfaitement.
EXEMPLE 4 : Lyse des micro-organismes :
4. A. Mode opératoire :
Un dispositif 1 composé d'une chambre de lyse est rempli avec un tampon 12 contenant des Staphylococcus epidermidis . Le dispositif est soumis à des ultrasons, via une sonotrode, afin de lyser les micro-organismes. L'expérience est répétée avec un temps de lyse de 0, 1, 5 et 10 minutes. Le rendement de lyse est évalué par pousse et comptage des lysats sur boite de Pétri. L'objectif de cette expérience est de trouver une interface convenable pour la transmission des ultrasons lors de l'étape de lyse.
4. B. Expérience :
En relation avec la Figure 11, un même design de dispositif de chambre à billes est utilisé avec quelques configurations d'interface, soit : • lere configuration : avec des éléments en plastique remplaçant les plaques ferromagnétiques 15 et 17 (sonotrode en contact direct avec un dispositif modifié selon l'invention),
• 2eme configuration : avec une couche de silicone (présente entre la sonotrode et le dispositif selon l'invention),
• 3eme configuration : avec des éléments métalliques faisant office de plaques ferromagnétiques 15 et 17 ajoutées sur dispositif .
Les trois dispositifs sont testés comme précédemment et pour deux types de diamètre de bille (Voir Tableau 3) .
Dispositif Standard Insert métal Couche silicone
Diamètre
bille de 212-300 425-600 212-300 425-600 212-300 verre (ym)
Efficacité de 90-100 50 100 98 40-55 lyse (%)
Tableau 3 : Efficacité de la lyse par ultrasons
4.C. Résultats
Les résultats sont assez bons pour l'ensemble des tests effectués Toutefois la solution utilisant les inserts métalliques donnent de bons résultats sensiblement identiques pour les deux types de billes .
EXEMPLE 5 : Lyse et amplification NASBA sans purification de micro-organismes (S. epidermidis) :
5. A. Mode opératoire :
Un dispositif est rempli de tampon contenant des bactéries S. epidermidis ainsi qu'un contrôle interne constitué d'une bactérie différente de cette bactérie testée. La lyse est effectuée dans le dispositif selon la 3eme configuration décrite à l'exemple 4. Le Lysat est ensuite extrait du dispositif et analysé.
5.B. Expérience : Les courbes de détection sont présentées dans les Tableaux 4 & 5 ci-dessous .
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0002
Cette expérience montre l'efficacité du dispositif décrit à lyser les microorganismes et à les détecter grâce à une analyse NASBA. Les microorganismes sont injectés dans le tampon 12 avant l'expérience (une concentration différente de microorganisme à chaque expérience) . Les volets métalliques de la carte sont fermés. La partie contenant les billes est remplie de tampon 12 (qui contient différentes concentrations de microorganismes) . Le dispositif est placé sur une sonde ultrason pour effectuer la lyse. A la fin de l'étape de lyse, le tampon 12 est collecté manuellement et analysé en NASBA en dehors de la carte. Ces résultats sont à comparer à une gamme de contrôle.
En première intention l'interprétation des résultats est binaire : Positif signifie qu' il y a détection du microorganisme et Négatif signifie que le microorganisme n'est pas détecté.
5.C. Analyse : On remarque dans les tableaux ci-dessus que les échantillons testés sont marqués comme positif pour toutes les concentrations supérieures à 0,2 CFU/μΙ.
REFERENCES Dispositif de collecte de microorganismes 10 Fluide Module réactionnel Carte principale Carte secondaire Billes Canal d'admission du liquide réactionnel 12 du module 3 Canal d'évacuation du liquide réactionnel 12 du module 3 Moyen de rétention des billes 6 au sein du module 3 Microorganismes présents dans le fluide 2 Acides nucléiques présents dans les microorganismes 10 Liquide réactionnel Enceinte de confinement étanche constituée des plaques 14 à 17 Plaque supérieure de confinement du dispositif 1 Plaque supérieure ferromagnétique coulissante de confinement du dispositif 1 Plaque inférieure de confinement du dispositif 1 Plaque inférieure ferromagnétique coulissante de confinement du dispositif 1 Joints torique d'étanchéité entre l'enceinte 13 et les cartes 4 et 5 Lame ressort de verrouillage des plaque ferromagnétiques 15 et 17 Vis de fixation de la lame ressort 19 Aimants Tiroir distributeur Pistons pompes Emplacements dessiccateurs Zone de stockage du liquide réactionnel 12 Zone d'analyse sur le recto et le verso de la carte Grilles supérieure et inférieure Trous de la grille 27 Glissières Résidus de microorganismes présents dans le liquide 12 après la lyse Trou recevant le tiroir distributeur 22 Trous recevant les pistons pompes 23 Trous traversants des cartes 4 et 5 recevant les aimants 21 Zone d'aliquotage Zone de séparation Première zone intermédiaire contenant une enzyme Seconde zone intermédiaire contenant une enzyme Joints sur le tiroir distributeur 22 Joints sur les pistons pompes 23 0. Conduit d'admission du fluide 2 au sein du module 3 1. Conduit d'évacuation du fluide 2 au sein du module 3
Fl . Coulissement des plaques supérieure 15 et inférieure 17 ferromagnétiques permettant l'ouverture pour le passage du fluide 2
F2. Mouvement du fluide 2 passant au travers des billes 6
F3. Coulissement des plaques supérieure 15 et inférieure 17 ferromagnétiques permettant la fermeture pour le passage du liquide 12
F4. Mouvement du liquide 12 passant au travers des billes 6 F5 Extraction des acides nucléiques 11

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de collecte de microorganismes (1) contenus dans un fluide (2), le dispositif comportant :
• un module réactionnel (3) renfermant un ensemble de billes (6) ,
• au moins un conduit d'admission (40) du fluide (2) permettant l'entrée d'un flux de fluide à l'intérieur du module (3) ,
• au moins un conduit d'évacuation (41) du fluide (2) permettant la sortie du flux dudit fluide ayant traversé l'intérieur dudit module (3),
• des moyens de rétention (9) des billes (6) à l'intérieur du module (3) ,
• au moins un canal d'admission (7) d'au moins un liquide réactionnel (12),
• au moins un canal d'évacuation (8) d'au moins un liquide réactionnel (12),
les canaux d'admission (7) et d'évacuation (8) du liquide réactionnel (12) et les conduits d'admission (40) et d'évacuation (41) du fluide (2) étant positionnés de la manière suivante au niveau du module (3) :
• les conduits d'admission et d'évacuation du fluide (40 et 41) se faisant face tout en enserrant le module (3), afin de maximiser les contacts entre le fluide (2) et les billes (6) ,
• les canaux pour le ou les liquides réactionnels (12) étant placés respectivement à deux extrémités opposées du module (3), et
• les canaux (7 et 8) pour le ou les liquides réactionnels (12) sont positionnés selon un plan, et les conduits d'admission et d'évacuation du fluide (40 et 41) sont positionnés selon un axe, et que l'axe est sensiblement perpendiculaire au plan.
2. Dispositif, selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend une enceinte de confinement étanche (13) isolant fluide et liquides réactionnels de l'extérieur.
3. Disposition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que, si le fluide est un gaz, l'ensemble de billes est constitué de billes recouvertes de glycérol .
4. Disposition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que, si le fluide est un liquide, le module contient un filtre s' étendant sensiblement dans le plan formé par les canaux pour le ou les liquides réactionnels, le conduit d'admission étant situé d'un côté du filtre avec l'ensemble de billes et le conduit d'évacuation étant situé de l'autre coté dudit filtre en l'absence de billes.
5. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le module (3) à une forme de « C » si on le coupe :
• selon le plan formé par le (s) canaux d'admission (7) et d'évacuation (8) du liquide réactionnel, et
• perpendiculairement à l'axe formé par le (s) conduit (s) d'admission et le (s) conduit (s) d'évacuation du fluide (40 et 41) .
6. Dispositif, selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le module à une forme de quadrilatère si on le coupe selon un rayon passant par le centre du « C » et coupant ledit « C ».
7. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisé par le fait que le (s) canal (canaux) d'admission du liquide réactionnel est situé à une extrémité du « C » de la forme du module, et que le (s) canal (canaux) d'évacuation du liquide réactionnel est situé à l'autre extrémité du « C ».
8. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que les billes ont un diamètre compris entre 200 et 600 ym et que les moyens de rétention desdites billes à l'intérieur du module sont constitués de grilles, dont les pores ont un diamètre inférieur aux billes et compris entre 100 et 500 ym.
9. Dispositif, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu' il comprend un autre module réactionnel permettant le traitement des microorganismes collectés, le module contenant :
1. des moyens de séparation des résidus cellulaires sans intérêt ou inhibiteurs, tels que protéines, membranes, et/ou
2. des moyens d'amplification des acides nucléiques collectées et séparés des inhibiteurs, et/ou
3. des moyens de détection des amplicons ainsi générés.
10. Procédé de collecte de microorganismes contenus dans un fluide, caractérisé en ce qu'il consiste à :
1. introduire du fluide suspecté de contenir des microorganismes via au moins un conduit d'admission du fluide,
2. traverser un lit de billes où les microorganismes sont immobilisés ,
3. évacuer le fluide débarrassé desdits microorganismes via au moins un conduit d'évacuation dudit fluide,
4. introduire au moins un liquide réactionnel via au moins un canal d'admission de liquide (s) réactionnel (s) ,
5. traverser le lit de billes où les microorganismes sont immobilisés afin de mettre lesdits microorganismes en suspension, et
6. évacuer ce liquide transportant les microorganismes via au moins un canal d'évacuation de liquide (s) réactionnel (s) , les conduits fluidiques se faisant face tout en enserrant le lit de billes, le (s) canaux d'admission et d'évacuation de liquide (s) réactionnel (s) étant positionnés de manière à accéder à l'ensemble des billes.
11. Procédé, selon la revendication 10, caractérisé en ce que, lorsque le liquide traverse le lit de billes, lesdites billes sont agitées par un moyen d'agitation extérieur et entrent en contact ce qui permet de lyser les membranes des microorganismes, rendant les acides nucléiques accessibles et prêts à être évacués.
12. Procédé, selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'agitation des billes est réalisée par l'utilisation d' ultrasons .
13. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que le liquide chargé de tout ou partie des microorganismes est évacué vers un autre module réactionnel du dispositif permettant le traitement des microorganismes collectés, le traitement consistant à :
1. séparer les résidus cellulaires sans intérêt ou inhibiteurs, tels que protéines, membranes, et/ou
2. amplifier les acides nucléiques collectées, et/ou
3. détecter les amplicons ainsi générés.
14. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que :
1. le fluide testé est constitué par un gaz,
2. le gaz traverse le lit de billes, billes qui sont recouvertes de glycérol, où les microorganismes sont immobilisés, et
3. l'on introduit au moins un liquide réactionnel afin de liquéfier le glycérol et de mettre lesdits microorganismes en suspension.
15. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que :
1. le fluide testé est constitué par un liquide,
2. le liquide testé traverse le lit de billes puis un filtre avant d'être évacué, débarrassé des microorganismes qu'il contenait, les microorganismes sont immobilisés, et
3. l'on introduit au moins un liquide réactionnel afin de mettre lesdits microorganismes en suspension.
16. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 14 ou
15, caractérisé en ce que le liquide est filtré entre l'évacuation via au moins un canal d'évacuation de liquide (s) réactionnel (s) et le module permettant l'élimination des inhibiteurs et/ou l'amplification et/ou la détection .
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3038620B1 (fr) * 2015-07-09 2019-05-24 Biomerieux Procede de detection d'une presence ou d'une absence d'au moins une premiere zone d'inhibition
US12060548B2 (en) 2018-01-19 2024-08-13 Genomadix Inc. Fluid handling apparatus
US12083465B2 (en) 2019-11-25 2024-09-10 The Boeing Company Systems and methods for anti-microbial purification of air
EP4012042A1 (fr) 2020-12-14 2022-06-15 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Ensemble pour l'enrichissement des micro-organismes présents dans l'aérosol comprenant les petites gouttelettes d'air respiratoire d'un sujet et procédé d'enrichissement de micro-organismes
CN112881082B (zh) * 2021-01-18 2022-06-07 内蒙古京海煤矸石发电有限责任公司 基于ai视频技术的工业用微光环境下可视采样检测装置
TWI785636B (zh) * 2021-06-07 2022-12-01 新加坡商克雷多生醫有限公司 檢測卡匣

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009001010A2 (fr) * 2007-06-07 2008-12-31 bioMérieux Dispositif de lyse de microorganismes presents dans un echantillon environnemental ou clinique et d'extraction des acides nucleiques desdits microorganismes aux fins d'analyse
WO2010067019A2 (fr) * 2008-12-10 2010-06-17 bioMérieux Systeme automatise de lyse de microorganismes presents dans un echantillon, d'extraction et de purification des acides nucleiques desdits microorganismes aux fins d'analyse
WO2010133776A2 (fr) * 2009-05-19 2010-11-25 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Dispositif et procede d'isolement de cibles biologiques ou chimiques

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2607507B1 (fr) 1986-12-02 1990-04-13 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives a-d-oligonucleotides, leur preparation et leur emploi
GB9106335D0 (en) 1991-03-25 1991-05-08 Burkard Manufacturing Company Air sampler
AU672969B2 (en) * 1992-03-10 1996-10-24 United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health & Human Services, The Exchangeable template reaction
GB2273923B (en) * 1993-01-04 1996-09-25 Glaverbel Apparatus for the distribution of particulate material upon a surface
FR2710075B1 (fr) 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US5567050A (en) 1994-08-23 1996-10-22 Savant Instruments, Inc. Apparatus and method for rapidly oscillating specimen vessels
US5707861A (en) 1995-09-14 1998-01-13 Scientific Industries, Inc. Disintegrator of living cells
FR2781802B1 (fr) 1998-07-31 2001-05-11 Bio Merieux Derives satures ou insatures de l'abietane, conjugues derives et utilisations dans une composition diagnostique, un reactif et un dispositif
AU4712600A (en) * 1999-06-18 2001-01-09 Umedik, Inc. Device and method for analyzing a biologic sample
CA2290731A1 (fr) * 1999-11-26 2001-05-26 D. Jed Harrison Appareil et methode de piegeage de reactifs en forme de perles, dans le cadre d'un systeme d'analyse de microfluides
SE0001768D0 (sv) * 2000-05-12 2000-05-12 Helen Andersson Mikrofluidisk flödescell för manipulering av partiklar
US20030203504A1 (en) * 2002-04-26 2003-10-30 John Hefti Diffusion-based system and method for detecting and monitoring activity of biologic and chemical species
WO2004018704A2 (fr) 2002-05-20 2004-03-04 Northrop Grumman Corporation Systeme de detection d'agents biologiques de source ponctuelle
FR2861085B1 (fr) 2003-10-15 2006-01-27 Bertin Technologies Sa Methode d'extraction d'acides nucleiques et son application dans l'analyse de la population microbienne de l'air
US20050244837A1 (en) * 2004-04-28 2005-11-03 Cepheid Method and device for sample preparation control
KR100601972B1 (ko) * 2004-11-03 2006-07-18 삼성전자주식회사 레이저와 비드를 이용한 상 분리에 의한 핵산의 정제 장치및 방법
US20100297604A1 (en) * 2006-06-09 2010-11-25 Xing-Xiang Li Methods and reagents for virus isolation and detection
US8047235B2 (en) * 2006-11-30 2011-11-01 Alcatel Lucent Fluid-permeable body having a superhydrophobic surface
US7960180B2 (en) * 2007-02-20 2011-06-14 University Of Notre Dame Du Lac Methods and apparatus to capture and release microbe particles using amino-functionalized silica
WO2008104916A2 (fr) 2007-02-27 2008-09-04 Koninklijke Philips Electronics N.V. Dispositif de lyse et/ou dispositif de mélange cellulaire
US8435465B2 (en) * 2008-11-03 2013-05-07 Cfd Research Corporation Microfluidic biological extraction chip
US9228352B2 (en) * 2008-12-16 2016-01-05 Vtec Patents Llc Insulated skylight assembly and method of making same
US8580934B2 (en) * 2009-08-26 2013-11-12 University Of South Florida Silica-based material for detection and isolation of chitin and chitin-containing microorganisms
FR2950358B1 (fr) * 2009-09-18 2015-09-11 Biomerieux Sa Dispositif d'amplification d'acides nucleiques simplifie et son procede de mise en oeuvre

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009001010A2 (fr) * 2007-06-07 2008-12-31 bioMérieux Dispositif de lyse de microorganismes presents dans un echantillon environnemental ou clinique et d'extraction des acides nucleiques desdits microorganismes aux fins d'analyse
WO2010067019A2 (fr) * 2008-12-10 2010-06-17 bioMérieux Systeme automatise de lyse de microorganismes presents dans un echantillon, d'extraction et de purification des acides nucleiques desdits microorganismes aux fins d'analyse
WO2010133776A2 (fr) * 2009-05-19 2010-11-25 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Dispositif et procede d'isolement de cibles biologiques ou chimiques

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