WO2014006253A1 - Composición para el tratamiento de infecciones bacterianas de la piel y mucosas - Google Patents

Composición para el tratamiento de infecciones bacterianas de la piel y mucosas Download PDF

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Manuel MARTÍNEZ BUENO
Eva VALDIVIA MARTÍNEZ
Samir Ananou Jaled
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Universidad de Granada
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Definitions

  • the present invention is within the pharmaceutical sector, and more specifically in the field of compositions for the treatment of bacterial infections of the skin with antibacterial compounds.
  • Healthy human skin is colonized by numerous microorganisms that are responsible for maintaining their natural microbial balance.
  • its normal microbiota is made up of resident or transient populations of bacteria and various species of fungi (particularly yeasts), some of them very stable.
  • the most common resident microorganisms of the skin are limited to some genera of Gram + bacteria, whose species can represent up to 50%.
  • those belonging to the Phylum Firmicutes with low G + C content Streptococcus and Staphylococcus genera
  • the Phylun Actinobacteria Corynebacter ⁇ um and Propionibacter ⁇ um genera
  • the remaining bacterial groups are much more transient since around 70% undergo changes over time and the individual's conditions.
  • Infectious mastitis of the mammary glands is characterized by multiple local and systemic symptoms in nursing mothers. It is mainly caused by S. aureus and Streptococcus species, which are often multidrug-resistant to antibiotics, so antibiotic therapy is, in many cases, unsatisfactory and the problem tends to be recurrent. Its incidence ranges from 3-33% of them, and determines a high percentage of cessation of breastfeeding.
  • common acne is an infection of the skin, particularly in those areas with higher density of sebaceous follicles. It is the most common skin infection among humans, due to changes in the hair follicles and associated sebaceous glands, which take place mainly in puberty (85% of adolescents suffer this problem to some degree), as a multifactorial response that includes hormonal, microbiological and immunological mechanisms.
  • the use of antibacterial peptides produced by bacteria (bacteriocins) against bacterial infections is being consolidated as an alternative to the lack of chemotherapeutic agents, due to antibiotic resistance.
  • Bacteriocins are today in the spotlight of novel studies on their application against common pathogens in clinical practice, so it is already a growing trend in the field of pharmaceutical compositions and in antibacterial treatment methods (reviewed by Montalban-López , M., Sánchez-Hidalgo, M., Valdivia, M., Martinez- Bueno, M., and Maqueda, M. 201 1.
  • Montalban-López M.
  • Sánchez-Hidalgo M.
  • Valdivia M.
  • Martinez- Bueno M.
  • Maqueda M. 201 1.
  • Examples include existing patents protecting the use of antibiotic peptides (W09957281, WO2004082701, US5635594, CA24531 12) or bacteriocins produced by bacteria (Mutacin CA2268744 and S6521596, gallidermin CA1338310 (C) - 1996-05-07 and Enterocin L50A / B produced by E. faecalis SL-5 which has been registered as Lactopadt TM Acne as a cosmetic ingredient (INCI) (CTFA file No. 9082) by Cell Biotech Co. Ltd. (KOSDAQ) with the objective of using it for cosmetic purposes , in the upper layers of the skin).
  • compositions that integrate bacteriocins have the advantage of preventing the development of resistance by pathogens that colonize and infect the skin. For this reason there are some publications on the ability of some bacteriocins to inhibit P. acnes, reducing the inflammatory lesions caused by this bacterium. Such is the case of those produced by Lactococcus sp. HY 449 or Enterococcus faecalis SL-5 discussed above. Similarly, the use of bacteriocins has been described, including AS-48, against different MRSA strains of Staphylococcus, and / or those producing mastitis.
  • bacteriocin AS-48 produced by Enterococcus species, in combination with a potentiating agent, lysozyme, an enzyme that hydrolyzes the cell wall of bacteria, which increases the potency of AS-48 in order to combat pathogenic species that cause skin infections, specifically P. acnes and S. aureus.
  • lysozyme an enzyme that hydrolyzes the cell wall of bacteria
  • the possible explanation for this synergy is a multi-barrier effect that occurs because the simultaneous application, at moderate doses, of several factors that act at different levels, it is much more effective than the application of only one, which, when acting at a single level, requires a higher dose (Leistner, L. 2000. Basic aspects of food preservation by hurdle technology. Int. J. Food Microbiol. 55: 181-186).
  • the bacteriocin AS-48 is a circular protein of ribosomal synthesis consisting of 70 natural amino acids. Its nature is strongly unfriendly which allows it to adapt to different environmental conditions. Thus, in aqueous solutions, AS-48 adopts a dimeric form (DF-I) in which it exposes hydrophilic domains, but this association changes in hydrophobic environments such as the case of the skin or the presence of cell membranes, adopting a new dimeric form. (DF-II) in which hydrophobic domains are exposed, which undoubtedly facilitates their insertion into strongly negatively charged membranes as occurs in the case of bacteria, but without activity against eukaryotic cells.
  • AS-48 has been recognized as one of the bacteriocins with the greatest potential, due to its broad spectrum of action against the bacterial membranes of most Gram + bacteria tested and some Gram- bacteria. It favors its activity and therefore its possible biotechnological applications, the great stability that AS-48 presents in wide ranges of pH, temperature and surfactant treatments, due to its structural characteristics (a circular protein), which justifies the success of its use in food bioconservation.
  • Lysozyme also called 1,4-N-acetyl muramidase, is a hydrolytic enzyme that specifically catalyzes the hydrolysis of the beta 1, 4 junctions between N-acetylmuramic acid and N-acetyl-D-glucosamine residues of bacterial peptidoglycan, a majority compound of the bacterial cell wall, in particular of Gram-positive bacteria.
  • This enzyme lacks protease, kinase, lipase, amylase or phosphatase activity and is found naturally in numerous secretions (tears, mucus, saliva and milk) and in large quantities in egg white, which is its source of use for use. industrial (Sigma).
  • bacteriocin has been used in conjunction with other bacteriocins and with chemical preservatives (nitrites) for the control of Clostridium.
  • the high pressures have been combined with various bacteriocins and strains that produce them (nisin, lacticin 3147, lacticin 481, AS-48, TAB 57, pediocin AcH and enterokines 1, A and B) in different foods for the control of altering and pathogenic microbiota.
  • nisin and lysozyme act synergistically in the control of Lactobacillus and S. aureus and that their spectrum can be extended to Gram-bacteria by the addition of chelating agents.
  • AS-48 has been successfully combined with other antibacterials, including lysozyme, for the elimination of foodborne pathogens.
  • the object of the present invention is a composition comprising AS-48 in combination with lysozyme for the treatment and prophylaxis of bacterial infections of the skin and mucous membranes.
  • this composition allows the P. acnes and S. aureus batteries to be completely eliminated. More specifically, the use of these compositions is described, with the active ingredients dissolved in suitable extracts, against P. acnes and S. aureus, in a stabilized manner in a pharmaceutically acceptable preparation.
  • compositions allow the control of bacteria, especially Staphylococcus species involved in infections and superinfections of the skin, as well as P. acnes, responsible for inflammatory lesions ⁇ acne vulgaris), which often lack adequate antibiotic treatment due to Resistance has developed.
  • compositions will preferably be used by topical application, two or more times a day, being formulated in cream, gel and / or aqueous solution.
  • compositions have not produced, in any of the cases tested in vivo, irritation (allergies, erythema) on the skin, despite having been used topically on healthy people for many days.
  • the preparations do not suffer decrease or loss of activity during storage at different temperatures, or by interaction of the active molecules with cosmetic compounds (emulsifiers and / or lipid or aqueous components) or by antagonism between the different agents used.
  • AS-48 has been selected as an antibacterial agent for skin infections due to its biochemical and structural characteristics.
  • CMB minimum bactericidal concentration
  • Figures 1 and 2 show the minimum bactericidal concentration (CMB) of AS-48 tested alone (fig. 1) and in the presence of lysozyme (fig. 2) against P. acnes over time (144 h) in a laboratory culture at 37 e C.
  • Figure 3 shows the synergistic effect of lysozyme and AS-48 on the removal of S. aureus CECT 976 in a laboratory culture (BHI at 37 e C).
  • Figure 1. Determination of the CMB of AS-48 against P. acnes in BHI. The viability of P. acnes is expressed in CFU / ml.
  • Figure 2. Determination of the CMB of AS-48 combined with 4 mg / ml of lysozyme against P. acnes in BHI. The viability of P. acnes is expressed in CFU / ml.
  • Figure 3 Determination of the CMB of AS-48 (10 ⁇ g / ml) in combination with lysozyme (8 mg / ml) against S. aureus CECT 976 in BHI medium at 37 e C.
  • the viability of S. aureus is expressed as log of the CFU / ml.
  • compositions comprising AS-48 bacteriocin, a very stable molecule that possesses a broad antibacterial activity, in combination with lysozyme, an enzyme with muramidase activity, which significantly enhances the activity of the former, for the control of Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus and other bacteria involved in skin infections.
  • Conditions caused by bacterial infections that can be treated with the compositions of the present invention include lesions caused by P. acnes ⁇ acne vulgaris) and dermal infections and / or superinfections due to S. aureus, a bacterium that is also The most important infectious agent in patients suffering from atopic eczema.
  • the active compound AS-48 significantly increases its activity in the presence of lysozyme, while lysozyme, by itself, has no activity under the test conditions).
  • compositions of the present invention whose weak immunogenicity and low toxicity have been confirmed (Maqueda, M. et al. "Neutralizing Antibodies against the Peptide Antibiotic AS-48". Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 1993. 37, 148-15) are preferably formulated for topical applications.
  • the compositions contain the active ingredients and bring together the most physical-chemical properties suitable for topical application, considering the characteristics of the infections to be treated.
  • the bacteriocin used in the compositions and methods of the present invention is AS-48 obtained from supernatants of the UGR10 probiotic strain of Enterococcus faecalis isolated from cheeses (Cebrián, R., Ba ⁇ os, A, Valdivia, E. , Pérez-Pulido, R, Mart ⁇ nez- Bu en o, M, Maqueda M. 2012. Characterization of functional, safety, and probiotic properties of Enterococcus faecalis UGRA10, a new AS-48-producer strain. Food Microbiol. 30, 59- 67).
  • waste from the dairy industry will be used under the conditions previously optimized in our laboratory.
  • the lysozyme used is commercial and is obtained from egg white (Sigma L6876).
  • Cream emulsion of fused petroleum jelly with antibacterial agents in a proportion between 100 and 200 ⁇ g AS-48 and 8 mg lysozyme per g of cream. The emulsion is carried out using a homogenizer. Composition against P. acnes
  • Neutral gel added of the antibacterial agents in a proportion between 10 and 20 ⁇ g of AS-48 and 4 or 8 mg of lysozyme (Sigma) per g of gel.
  • the dissolution will be carried out using a homogenizer.
  • Aqueous solution of antibacterial agents added in a proportion between 10 and 20 ⁇ g of AS-48 and 4 or 8 mg of lysozyme (Sigma) per ml.
  • the mixture will be homogenized well before use. Comparative data on the efficacy of AS-48 alone or in synergistic combination with lysozyme
  • the figures show the activity of AS-48 tested at different concentrations, alone or in combination with lysozyme against P. acnes (figures 1 and 2) and against S. aureus (figure 3)
  • Table 1 shows the data of the CMB against P. acnes of different compositions containing increasing concentrations of AS-48 (from 0.01 to 10 ⁇ ) and in table 2 those of the CMB of AS-48 combined with lysozyme (4 mg / ml) against the same bacteria. Controls without active agents and with lysozyme separately are also exposed.
  • Table 3 shows the results obtained against S. aureus, with AS-48 alone and added lysozyme (8 mg / ml).

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Description

COMPOSICIÓN PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES BACTERIANAS DE
LA PIEL Y MUCOSAS
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuentra dentro del sector farmacéutico, y más concretamente en el campo de las composiciones para el tratamiento de infecciones bacterianas de la piel con compuestos antibacterianos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La piel humana sana está colonizada por numerosos microorganismos que son responsables del mantenimiento de su equilibrio microbiano natural. De hecho, su microbiota normal está constituida por poblaciones residentes o transitorias de bacterias y diversas especies de hongos (en particular levaduras), algunas de ellas muy estables. Los microorganismos residentes más habituales de la piel se limitan a algunos géneros de bacterias Gram+, cuyas especies pueden llegar a representar hasta el 50%. Entre ellos destacan las pertenecientes al Phylum Firmicutes con bajo contenido en G+C (géneros Streptococcus y Staphylococcus) y al Phylun Actinobactería (géneros Corynebacteríum y Propionibacteríum). Los restantes grupos bacterianos, incluidas las bacterias Gram-, son mucho más transitorios ya que alrededor del 70% sufren cambios con el paso del tiempo y las condiciones del individuo. Hay, sin embargo, una serie de bacterias causantes de infecciones cutáneas como la mastitis y el acné, entre las que destacan por su frecuencia S. aureus y Propionibacteríum acnés, respectivamente. La mastitis infecciosa de las glándulas mamarias se caracteriza por múltiples síntomas locales y sistémicos en madres lactantes. Es causada principalmente por S. aureus y especies de Streptococcus, que suelen ser multirresistentes a los antibióticos, por lo que el tratamiento mediante antibioterapia es, en muchos casos, insatisfactorio y el problema tiende a ser recurrente. Su incidencia oscila entre el 3-33% de ellas, y determina un alto porcentaje de cese de la lactancia. Por su parte, el acné común (acné vulgaris) es una infección de la piel, en particular de aquellas áreas con mayor densidad de folículos sebáceos. Se trata de la infección cutánea más común entre los seres humanos, debida a cambios de los folículos pilosos y las glándulas sebáceas asociadas, que tienen lugar principalmente en la pubertad (el 85% de los adolescentes padecen en algún grado este problema), como una respuesta multifactorial que incluye mecanismos hormonales, microbiológicos e inmunológicos. El empleo de péptidos antibacterianos producidos por bacterias (bacteriocinas) frente a infecciones bacterianas, se está consolidando como alternativa a la falta de quimioterápicos, debido a la resistencia a los antibióticos. Las bacteriocinas están hoy en el punto de mira de novedosos estudios sobre su aplicación frente a patógenos comunes en clínica, por lo que es ya una tendencia creciente en el campo de las composiciones farmacéuticas y en los métodos de tratamiento antibacterianos (revisado por Montalban- López, M., Sánchez-Hidalgo, M., Valdivia, M., Martinez- Bueno, M., and Maqueda, M. 201 1 . Are bacteriocins underexploited? Novel applications for ancient antimicrobials. Curr. Pharm. Biotechnol. 12: 1205-1220). Ejemplos de ello son las patentes existentes protegiendo el uso de péptidos antibióticos (W09957281 , WO2004082701 , US5635594, CA24531 12) o de bacteriocinas producidas por bacterias (Mutacin CA2268744 y S6521596, gallidermin CA1338310 (C)- 1996-05-07 y de la Enterocin L50A/B producida por E. faecalis SL-5 que ha sido registrada como Lactopadt™ Acné como ingrediente cosmético (INCI) (CTFA file No. 9082) por Cell Biotech Co. Ltd. (KOSDAQ) con el objetivo de utilizarla con propósitos cosméticos, en las capas superiores de la piel).
Las composiciones que integran bacteriocinas tienen la ventaja de evitar el desarrollo de resistencias por patógenos que colonizan e infectan la piel. Por este motivo hay algunas publicaciones sobre la habilidad de algunas bacteriocinas para inhibir a P. acnés, reduciendo las lesiones inflamatorias causadas por esta bacteria. Tal es el caso de las producidas por Lactococcus sp. HY 449 o Enterococcus faecalis SL-5 antes comentada. De forma similar se ha descrito la utilización de bacteriocinas, incluida AS- 48, frente a diferentes cepas MRSA de Staphylococcus, y/o aquéllas productoras de mastitis.
Aquí se propone el empleo de la bacteriocina AS-48 producida por especies de Enterococcus, en combinación con un agente potenciador, la lisozima, un enzima que hidroliza la pared celular de las bacterias, que incrementa la potencia de AS-48 con el fin de combatir especies patógenas causantes de infecciones en la piel, en concreto P. acnés y S. aureus. La posible explicación de esta sinergia es un efecto de barreras múltiples que se produce debido a que la aplicación simultánea, a dosis moderadas, de varios factores que actúan a diferentes niveles, resulta mucho más eficaz que la aplicación de uno sólo, que, al actuar a un solo nivel, requiere una dosis más alta (Leistner, L. 2000. Basic aspects of food preservation by hurdle technology. Int. J. Food Microbiol. 55: 181 -186).
La bacteriocina AS-48 es una proteína circular de síntesis ribosómica constituida por 70 aminoácidos naturales. Su naturaleza es fuertemente antipática lo que le permite adaptarse a diferentes condiciones ambientales. Así en soluciones acuosas, AS-48 adopta una forma dimérica (DF-I) en la que expone dominios hidrófilos, pero esta asociación cambia en ambientes hidrofobicos como sería el caso de la piel o la presencia de membranas celulares, adoptando una nueva forma dimérica (DF-II) en la que se exponen los dominios hidrófobos, lo que sin duda facilita su inserción en membranas fuertemente cargadas negativamente como ocurre en el caso de las bacteria, pero sin actividad frente a células eucariotas.
AS-48 ha sido reconocida como una de las bacteriocinas con mayor potencialidad, debido a su amplio espectro de acción frente a las membranas bacterianas de la mayoría de las bacterias Gram+ ensayadas y algunas bacterias Gram-. Favorece su actividad y por ende sus posibles aplicaciones biotecnológicas, la gran estabilidad que AS-48 presenta en amplios intervalos de pH, temperatura y tratamientos surfactantes, debido a sus características estructurales (una proteína circular), lo que justifica el éxito que tiene su empleo en la bioconservación de alimentos.
La lisozima, también llamada 1 ,4 N-acetil muramidasa, es un enzima hidrolítica que cataliza específicamente la hidrólisis de las uniones beta 1 ,4 existentes entre los residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina del peptidoglicano bacteriano, un compuesto mayoritario de la pared celular bacteriana, en particular de las bacterias Gram-positivas. Este enzima carece de actividad proteasa, quinasa, lipasa, amilasa o fosfatasa y se encuentra de forma natural en numerosas secreciones (lágrimas, mocos, saliva y leche) y en gran cantidad en la clara de huevo, que es su fuente de obtención para uso industrial (Sigma).
La aplicación de múltiples barreras en el control de los microorganismos puede tener un efecto inhibidor aditivo o incluso sinérgico, sobre todo si actúan sobre distintas dianas del microorganismo. Este es el caso que describimos en el que AS-48 forma poros en la membrana celular, y dicha actividad se favorecida por la acción de lisozima que al hidrolizar parcialmente la pared celular, facilita el acceso de AS-48 a su diana, la membrana citoplasmática bacteriana.
Actualmente hay un gran interés en la aplicación de bacteriocinas solas o en combinación con otros inhibidores y también con agentes físicos o químicos que actúan de forma sinérgica frente a bacterias patógenas y/o alterantes, permitiendo en algunos casos ampliar su espectro de acción a bacterias Gram-negativas. Así, la nisina se ha empleado conjuntamente con otras bacteriocinas y con conservantes químicos (nitritos) para el control de Clostrídium. Las altas presiones han sido combinadas con diversas bacteriocinas y cepas productoras de las mismas (nisina, lacticina 3147, lacticina 481 , AS-48, TAB 57, pediocina AcH y las enterocinas 1 , A y B) en diferentes alimentos para el control de la microbiota alterante y patógena. Se ha comprobado también que la nisina y la lisozima actúan sinérgicamente en el control de Lactobacillus y S. aureus y que su espectro puede ser ampliado a bacterias Gram- mediante la adición de agentes quelantes. De igual forma, AS-48 se ha combinado con éxito con otros antibacterianos, incluida la lisozima, para la eliminación de patógenos en alimentos.
No se puede dejar de mencionar la existencia de tratamientos que podrían ser considerados erróneamente como medicina naturopática u homeopática, como algunas aplicaciones caseras empleadas para combatir el acné mediante clara de huevo (por su riqueza en lisozima) así como con yogur, caliza o miel, por citar algunas. Sin embargo, estos tratamientos suelen ser tan inocuos como inefectivos para la eliminación de una bacteria como P. acnés de difícil acceso por estar localizada en las glándulas sebáceas.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es una composición que comprende AS-48 en combinación con lisozima para el tratamiento y la profilaxis de infecciones bacterianas de la piel y mucosas. Además, esta composición permite eliminar totalmente las baterías P. acnés y S. aureus. Más concretamente, se describe el uso de estas composiciones, con los principios activos disueltos en extractos adecuados, frente a P. acnés y S. aureus, de forma estabilizada en un preparado farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con ensayos de actividad in vitro de los principios activos objeto de esta invención, disueltos en gel neutro o en soluciones acuosas, o bien emulsionados en una crema a base de glicerina, el vehículo más apropiado para la actividad es la crema, seguida del gel neutro y la solución acuosa, ambos por igual.
Estas composiciones permiten el control de bacterias, especialmente de las especies de Staphylococcus involucradas en infecciones y superinfecciones de la piel, así como de P. acnés, responsable de las lesiones inflamatorias {acné vulgarís), que en muchas ocasiones carecen del tratamiento antibiótico adecuado por haberse desarrollado resistencias.
Las composiciones se utilizarán preferentemente mediante aplicación tópica, dos o más veces al día, formulándose en crema, gel y/o disolución acuosa.
La invención propuesta presenta las siguientes ventajas:
• La actividad inhibidora de AS-48 se incrementa por un factor de 10 en presencia de lisozima
• Las composiciones no han producido, en ninguno de los casos ensayados in vivo, irritación (alergias, eritemas) en la piel, a pesar de haberse empleado tópicamente de forma repetida sobre personas sanas durante numerosos días.
• Los preparados no sufren disminución o pérdida de actividad durante su almacenamiento a diferentes temperaturas, o por interacción de las moléculas activas con compuestos cosméticos (emulsionantes y/o componentes lipidíeos o acuosos) ni tampoco por antagonismo entre los diferentes agentes empleados.
• Se ha comprobado que AS-48 sola o en combinación con lisozima carece de actividad hemolítica.
• También se ha confirmado la ausencia de citotoxicidad sobre la línea celular CCD18 de fibroblastos (procedente de colon humano normal) y sobre la línea epitelial de glándula mamaria humana MCF 10A. • Se ha confirmado que AS-48 es débilmente inmunogénica cuando se administra intramuscularmente a animales de experimentación, ya que la obtención de sueros inmunes requirió la administración repetida de AS-48 junto al coadyuvante de Freund (Maqueda et al., 1993. Neutralizing Antibodies against the Peptide Antibiotic AS-48". Antimicrobial Agent and Chemotherapy,
1993. 37, 148-15).
• Se ha seleccionado AS-48 como agente antibacteriano para infecciones de la piel por sus características bioquímicas y estructurales. El carácter antipático de AS-48 y su particular mecanismo de acción favorecido por las diferentes conformaciones que AS-48 adopta en función del ambiente en el que se encuentra, facilita su acceso a las diferentes capas de la piel donde se encuentran los estafilococos y también a los folículos sebáceos obstruidos por el exceso de sebo, donde se encuentra P. acnés.
• Debido a las características estructurales que AS-48 presenta, su actividad antibacteriana y estabilidad es muy superior a la de la mayoría de las bacteriocinas descritas frente a los patógenos propuestos, incluida L50A/B que ha sido registrada como Lactopadt™ Acné.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La concentración de un agente antibacteriano necesaria para eliminar completamente una bacteria se denomina "concentración mínima bactericida" (CMB). Esta CMB se expresa en función del logaritmo de las unidades formadoras de colonias (log de UFCs) resultantes, tras la incubación de la bacteria en presencia de compuestos antibacterianos a diferentes concentraciones, bien de forma conjunta y/o por separado.
En las figuras 1 y 2 se exponen la concentración mínima bactericida (CMB) de AS-48 ensayada sola (fig. 1 ) y en presencia de lisozima (fig. 2) frente a P. acnés a lo largo del tiempo (144 h) en un cultivo de laboratorio a 37eC. En la figura 3 se expone el efecto sinérgico de la lisozima y AS-48 en la eliminación de S. aureus CECT 976 en un cultivo de laboratorio (BHI a 37eC).
Figura 1.- Determinación de la CMB de AS-48 frente a P. acnés en BHI. La viabilidad de P. acnés se expresa en UFC/ml. Figura 2.- Determinación de la CMB de AS-48 combinada con 4 mg/ml de lisozima frente a P. acnés en BHI. La viabilidad de P. acnés se expresa en UFC/ml.
Figura 3.- Determinación de la CMB de AS-48 (10 μg/ml) en combinación con lisozima (8 mg/ml) frente a S. aureus CECT 976 en medio BHI a 37 eC. La viabilidad de S. aureus se expresa como log de las UFC/ml.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe composiciones que comprenden la bacteriocina AS- 48, una molécula muy estable que posee una amplia actividad antibacteriana, en combinación con lisozima, un enzima con actividad muramidasa, que potencia de forma significativa la actividad de la primera, para el control de Propionibacterium acnés, Staphylococcus aureus y otras bacterias involucradas en infecciones de la piel.
Entre las afecciones producidas por infecciones bacterianas que se pueden tratar con las composiciones de la presente invención se incluyen las lesiones producidas por P. acnés {acné vulgaris) y las infecciones y/o superinfecciones dérmicas debidas a S. aureus, una bacteria que es también el agente infeccioso más importante en los pacientes que sufren eczema atópico.
El compuesto activo AS-48 incrementa sensiblemente su actividad en presencia de lisozima, mientras que la lisozima, por sí sola, no presenta actividad en las condiciones de ensayo).
El efecto sinérgico que tiene esta aplicación conjunta permite reducir de forma significativa la dosis necesaria de AS-48 para obtener el mismo efecto inhibidor, tanto "in vivo" como "in vitro" en el control de infecciones por los mencionados patógenos.
Las composiciones de la presente invención, cuya débil inmunogenicidad y escasa toxicidad ha sido confirmada (Maqueda, M. et al. "Neutralizing Antibodies against the Peptide Antibiotic AS-48". Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 1993. 37, 148-15) están formuladas preferentemente para aplicaciones tópicas. Las composiciones contienen los principios activos y reúnen las propiedades físico-químicas más convenientes para su aplicación tópica, considerando las características de las infecciones a tratar.
Visto el comportamiento de AS-48 en las diferentes formulaciones, y los diferentes niveles de sensibilidad de las bacterias ensayadas, se considera que, en el tratamiento frente a S. aureus, es más apropiado utilizar una base grasa como la crema a base de vaselina, para su aplicación a las concentraciones que luego se indican.
En el caso de P. acnés una formulación con compuestos grasos está contraindicado porque incidiría en el aumento de grasa en la piel, por lo que se recomienda el uso de gel neutro o solución acuosa, a las concentraciones después expuestas.
MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La bacteriocina usada en las composiciones y métodos de la presente invención es AS-48 obtenida de sobrenadantes de la cepa probiotica UGR10 de Enterococcus faecalis aislada de quesos (Cebrián, R., Baños, A, Valdivia, E., Pérez-Pulido, R , Martínez- Bu en o, M , Maqueda M. 2012. Characterization of functional, safety, and probiotic properties of Enterococcus faecalis UGRA10, a new AS-48-producer strain. Food Microbiol. 30, 59-67).
Como medio de cultivo de la cepa productora se emplearán residuos de la industria láctea en las condiciones previamente optimizadas en nuestro laboratorio. La lisozima utilizada es comercial y se obtiene a partir de clara de huevo (Sigma L6876).
Formulaciones/composiciones desarrolladas Composición frente a S. aureus
Crema: emulsión de vaselina filante fundida con los agentes antibacterianos en proporción entre 100 y 200 μg AS-48 y 8 mg de lisozima por g de crema. La emulsión se lleva a cabo empleando un homogenizador. Composición frente a P. acnés
Gel neutro adicionado de los agentes antibacterianos en proporción entre 10 y 20 μg de AS-48 y 4 u 8 mg de lisozima (Sigma) por g de gel. La disolución se llevará a cabo empleando un homogenizador.
Solución acuosa adicionada de los agentes antibacterianos en proporción entre 10 y 20 μg de AS-48 y 4 u 8 mg de lisozima (Sigma) por mi. La mezcla se homogenizará bien antes del uso. Datos comparativos de la eficacia de AS-48 sola o en combinación sinérgica con lisozima
En las figuras se muestran la actividad de AS-48 ensayada a diferentes concentraciones, sola o en combinación con lisozima frente a P. acnés (figuras 1 y 2) y frente a S. aureus (figura 3)
Figure imgf000010_0002
Tabla 1.- Crecimiento de P. acnés (UFC/ml) en BHI a lo largo de 144 h de incubación en anaerobiosis en presencia de diferentes concentraciones de AS-48
Figure imgf000010_0001
Lisozima
4 mg/ml
+ 4,30 3,23 2,41 1 ,20 0 0 0
AS-48
0,1 μιτι/ml
Tabla 2 - Crecimiento de P. acnés (UFC/ml) en BHI a lo largo de 144 h de incubación en anaerobiosis en presencia de AS-48, lisozima o combinaciones de ambos
En la tabla 1 se proporcionan los datos de la CMB frente a P. acnés de distintas composiciones conteniendo concentraciones crecientes de AS-48 (de 0,01 a 10 μςΛπΙ) y en la tabla 2 los de la CMB de AS-48 combinada con lisozima (4 mg/ml) frente a la misma bacteria. Los controles sin agentes activos y con lisozima por separado, también se exponen.
• Los resultados asociados a la tabla 1 se presentan en la figura 1 y muestran que en un sistema cerrado como un cultivo de laboratorio, se requiere una concentración de 10 μg/ml de AS-48 para eliminar a P. acnés en 48 h. Concentraciones más bajas, como 5 o 1 μg/ml de AS-48 requieren de 96 h o 144 h respectivamente, para ejercer el mismo efecto.
• Sin embargo la actividad de AS-48 (figura 2) se incrementa por un factor de 10 en presencia de lisozima (4 mg/ml), siendo suficientes 0,1 μg/ml de AS-48 para eliminar a P. acnés en 48 h. Se observa, además, que la lisozima carece completamente de actividad en las condiciones del ensayo.
Figure imgf000011_0001
Tabla 3.- Crecimiento de S. aureus (UFC/ml) en BHI a lo largo de 24 h de incubación en presencia de AS-48, lisozima o combinaciones de ambos
En la tabla 3 se muestran los resultados obtenidos frente a S. aureus, con AS-48 sola y adicionada de lisozima (8 mg/ml).
• Como puede observarse en la figura 3, 10 μςΛηΙ de AS-48 no son capaces de eliminar a la bacteria, mientras que la adición de lisozima (8 mg/ml) a la misma concentración de AS-48, consigue su total eliminación en 14 h, confirmando así el efecto sinérgico entre ambos compuestos activos, en condiciones de laboratorio.
• Estos resultados ponen además de manifiesto que S. aureus es menos sensible que P. acnés a esta bacteriocina.
Se considera que, al tratarse de aplicaciones tópicas, las formulaciones, que serán diferentes para ambas bacterias, serán preparadas incrementando las concentraciones de los principios activos, de acuerdo con lo propuesto a continuación:
• Dada la inocuidad confirmada de los preparados y de acuerdo con la eficacia de los vehículos utilizados, que ha sido previamente confirmada en ensayos de actividad de los principios activos in vitro, es preferible aumentar al menos hasta al menos 1 mg/ml la concentración de AS-48 en los preparados neutros o acuosos (por la menor eficacia de éstos y la dificultad de acceso a la bacteria) y en la composición con base de vaselina filante, con el fin de que quede asegurada su eficacia in vivo frente a Propionibacterium acnés y Staphylococcus aureus, respectivamente.
• En el caso de la lisozima empleada con éxito a razón de 4 mg/ml frente a P. acnés, es preferible incrementar su concentración al doble (8 mg/ml o bien 8mg/g). En el caso de Staphylococcus aureus se mantiene la concentración ensayada (8 mg/ml o bien 8 mg/g) por los óptimos resultados que se obtienen.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Uso de una composición que comprende bacteriocina AS-48 y lisozima para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de infecciones bacterianas de la piel y mucosas.
2. Uso según la reivindicación 1 en el que las infecciones bacterianas de la piel y mucosas son causadas por Propionibacteríum acnés o Staphylococcus aureus.
3. Uso según la reivindicación 2 en el que la cantidad de bacteriocina AS-48 es de al menos 10 μg/ml y la infección bacteriana es causada por P. acnés.
4. Uso según la reivindicación 2 en el que la cantidad de bacteriocina AS-48 es de al menos 100 μg/ml y la infección bacteriana es causada por S. aureus.
5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la cantidad de lisozima es de al menos 4 mg/ml.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la cantidad de lisozima es de al menos 8 mg/ml.
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 5 ó 6 en el que el medicamento es un gel neutro y la infección bacteriana es causada por P. acnés.
8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3, 5 ó 6 en el que el medicamento es una solución acuosa y la infección bacteriana es causada por P. acnés.
9. Uso según la reivindicación 7 u 8 en el que la cantidad de bacteriocina AS-48 es de al menos 1 mg/ml.
10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 4 ó 6 en el que el medicamento es una crema tópica y la infección bacteriana es causada por S. aureus.
1 1 . Uso según la reivindicación 10 en el que la crema tópica es una emulsión estable de vaselina filante fundida con la bacteriocina AS-48 y la lisozima.
12. Uso según la reivindicación 10 u 1 1 en el que la cantidad de bacteriocina AS-48 es de al menos 1 mg/ml.
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