WO2013180490A1 - 유동추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물 - Google Patents

유동추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물 Download PDF

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skin aging
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pharmaceutical composition
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김재화
오세량
김승호
안경섭
강호범
김두영
김정희
김찬수
손장미
이형규
지다정
최인성
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한국생명공학연구원
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    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/92—Oral administration

Definitions

  • a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging containing a flow extract, a fraction thereof or a diterpene compound isolated therefrom as an active ingredient
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging, containing as extract of the extract A ⁇ eun ' tes fordii), a fraction thereof or a diterpene compound isolated from the fraction as an active ingredient.
  • Flow G4 / «/ r / es fordii) extract is known to treat swelling, soreness, toothache and rheumatism in throat in Oriental traditional medicine. It has also been known to treat smallpox and early breast cancer, but the biological activity of the flow extract is not yet well known. On the other hand, it has been confirmed that the flow extract or fractions thereof have an antiviral effect (Korean Patent Publication No. 10-2011-0049722). Skin aging is caused by a decrease in collagen, elastin, and hyaluronic acid, which are components of the extracellular matrix (ECM), the cells that make up the skin tissue, and the overall immune function. It is known that the deterioration of the skin and wrinkles of the skin appear (Exp Dermatol. 2011 May; 20 (5): 454-6).
  • ECM extracellular matrix
  • Hyaluronic acid is a natural moisturizing ingredient present in the interstitial cells of the epidermal and dermal layers, and maintains moisture in the skin to maintain moisturizing and skin elasticity. It has the ability to attract about 80 times its own weight and has excellent water absorption. Such hyaluronic acid decreases with age, causing wrinkles. In addition, the skin is harmful when exposed to ultraviolet rays. Free radicals are produced, thereby reducing collagen and the intercellular substance hyaluronic acid in the dermal layer, resulting in wrinkles. In order to scientifically analyze the skin aging phenomenon, it is necessary to analyze the change of skin tissue and to develop a bioactive substance to induce the increase of hyaluronic acid which is a component of skin tissue according to aging.
  • Wrinkle improvement products are used to enhance skin elasticity and collagen synthesis, and to promote epidermal metabolism.
  • Wrinkle improvement functions include retinol, adenosine, polyethoxylateddretinamide and retinyl palmitate.
  • products such as angelica, adenosine, apple, pear, rosemary, etc. extracted from natural products, kinetine, coenzyme Q-10, and yeast extract, which are a kind of plant hormone synthesized from plants and herbs It was used as an enhancement function ingredient.
  • natural products obtained from plants have no problem in human stability, and are easy to manufacture and have a low price.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing and improving skin aging comprising administering to a subject a liquid extract, a fraction thereof or a diterpene compound isolated therefrom.
  • Still another object of the present invention is to provide a use of a fluid extract, a fraction thereof or a diterpene compound separated therefrom for use as a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging.
  • Still another object of the present invention is to provide a use of a fluid extract, a fraction thereof or a diterpene compound separated therefrom for use as a cosmetic composition for preventing and improving skin aging.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging, health food or cosmetic composition containing the active extract or fractions thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing and improving skin aging comprising administering a fluid extract or a fraction thereof to a subject.
  • the present invention also provides the use of a flow extract or a fraction thereof for use as a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging.
  • the present invention provides a use of a flow extract or a fraction thereof for use as a cosmetic composition for preventing and improving skin aging.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging, health food, or cosmetic composition containing a diterpene compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient .
  • the present invention provides a method for preventing and improving skin aging comprising administering to a subject a diterpene compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also provides the use of a diterpene compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use as a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging.
  • the present invention provides a use of a diterpene compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use as a cosmetic composition for preventing and improving skin aging.
  • R 1 is C 1 -C 4 straight or branched alkyl, unsubstituted or substituted with hydroxy
  • R 2 is H or hydroxy
  • R3 is H or 0, where 0 is substituted when _ is a double bond).
  • the present invention relates to an anti-aging pharmaceutical composition
  • an anti-aging pharmaceutical composition comprising an AJeuriies fordii extract, a fraction thereof or a phorbol-type diterpene compound isolated from the fraction as an active ingredient, wherein the flow extract Acts on blood cells to move them into skin tissue.
  • the flow extract Acts on blood cells to move them into skin tissue.
  • CD44 a cell surface material required, and acts on skin epithelial cells to increase the production enzymes of hyaluronic acid, which has a moisturizing effect, thereby treating anti-aging or preventing skin aging.
  • It may be used as an active ingredient of a functional food having anti-aging and improving health food or anti-wrinkle effect.
  • Figure 1 is a diagram showing the chemical structure of the diterpene compound of the four-ball type isolated from ⁇ iAleurites fordii) extract.
  • Figure 2 is the expression level of the mRNA of the CD44 marker protein required for the recruitment of blood (immune) cells in epidermal epithelial tissue in the blood cells treated with flow extract K562, U937, HMC cells and epithelial cells A549, CRL2076 cells The result was confirmed by RT-PCR (FIG. 2A), and the expression level of CD44 labeled protein was confirmed by FACS (FIG. 2B).
  • FIG. 3 shows the expression of hyaluronic acid synthase-2 (HAS-2), which is an enzyme related to the production of hyaluronic acid in CRL2076, a Hacat cell treated with flow extract, and the concentration of extract (3A and X) and the time (3B) is confirmed that the result.
  • HAS-2 hyaluronic acid synthase-2
  • FIG. 4 CD44 mRNA expression is increased according to the concentration of the extract treated in the flow-treated blood cells K562 (Fig. 4A) and the treatment time (Fig. 4B), CD44 protein (Fig. 4C) It is the figure which confirmed that this increased.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating skin shine while skin is being regenerated after inducing normal wounds and inducing tape strapping to induce a slight wound;
  • Control group cream only group
  • Fluid Extract Treatment Group 70 // g / ml Creamy treatment group with fluid extract ingredients. [Best form for implementation of the invention]
  • improved means any action that improves or changes the symptoms of the disease by administration of the composition.
  • administration means providing a patient with a certain substance by any suitable method, and the route of administration of the composition of the present invention is oral or parenteral through all general routes as long as the target tissue can be reached. Oral administration.
  • the composition can be administered by any device in which the active agent can migrate to the target cell.
  • the present invention will be described in detail.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging containing a flow extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the flow extract is preferably prepared by a manufacturing method comprising the following steps, but not always limited thereto:
  • step 3 drying the filtered extract of step 2) under reduced pressure.
  • the flow of step 1) can be used without limitation, such as grown or commercially available.
  • the flow is not limited to all flowers, stems, leaves or fruit of the flow is available.
  • the extraction solvent of step 1) is preferably water, alcohol or a mixture thereof.
  • the alcohol C1 to C2 lower alcohols are preferably used, and as lower alcohols, ethane or methane is preferably used.
  • the extraction method it is preferable to use shaking extraction, Soxhlet extraction or reflux extraction, but is not limited thereto. remind The extraction solvent is preferably extracted by adding 2. to 20 times the amount of dried flow. Extraction temperature is preferably 20 to 50 ° C, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 10 to 48 hours, more preferably 24 hours, but is not limited thereto.
  • the number of times the extraction is preferably 3 to 5 times, it is more preferable to extract three times repeatedly, but is not limited thereto.
  • the decompression concentration in step 3) preferably uses a vacuum decompression concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the decompression concentration in step 3) preferably uses a vacuum decompression concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably dried under reduced pressure, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but not always limited thereto.
  • the fraction may be obtained using an organic solvent selected from the group consisting of nucleic acid, chloroform and ethyl acetate, but is not limited thereto.
  • the flow extract or fractions thereof may be one having skin regeneration, wrinkle improvement or moisturizing activity, but is not limited thereto.
  • CD44 was confirmed that the increase in expression by treatment with the extract of the flow of mR A marker protein (see Fig. 2A), the CD44 protein, too, was confirmed to increase (see Fig. 2B).
  • HAS-2 hyaluronic acid synthase 2
  • FIGS. 3A, B and C MRNA expression and protein expression levels of CD44 were confirmed in K562 cells according to the treatment concentration and treatment time of the flow extract.
  • the increase of CD44 in K562 cells was strong even in the flow extract 0.1 / ml (see Figure 4A), and after 3 hours the transcript began to increase and after 12 hours it was confirmed that the maximum transcription activity (See FIG. 4B).
  • Analysis of the surface protein changes in FACS it was confirmed that the CD44 protein expression shows the same aspect (see Figure 4C).
  • the composition according to the present invention induces the production of CD44, a cell surface material required for blood cells to move to skin tissues, and also acts on skin epithelial cells and has a moisturizing effect of hyaluronic acid. It can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging because it can prevent or improve skin wrinkles by exhibiting an effect of increasing the production enzyme.
  • a scavenger or excipient such as commonly used layering agents, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, patients, powders, granules, capsules, Troches and the like, and such solid preparations are prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose or gelatin with one or more compounds represented by the present invention. .
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose or gelatin
  • lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • the liquid formulations for oral administration are suspensions, solutions, 'simple dilution agent water, various excipients in addition to liquid paraffin which there is the emulsion or sireom the snout, often used, for example, wetting agents, sweeteners, aromatics and preservatives, etc. May be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like.
  • non-aqueous solvent and the suspending solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol, gelatin and the like can be used.
  • composition according to the invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, the effective dose level is the type of disease, severity, drug Activity, sensitivity to drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. It is important to dose the amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount of no side effects taking into account all the above factors, which can be determined easily, by those skilled in the art.
  • the effective amount of the fluid extract and fractions thereof according to the present invention may vary depending on the age, sex and weight of the patient, generally between 0.1 and 100 mg, preferably between 0.5 and 10 mg per kg of body weight, daily or Every other day It may be administered by dividing 1 to 3 times a day. However, since the dose may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a healthy food for preventing and improving skin aging containing a flow extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the flow extract or fractions thereof may be one having skin regeneration, wrinkle improvement or moisturizing activity, but is not limited thereto.
  • the flow extract or fractions thereof of the present invention act on blood cells to induce the production of CD44, a cell surface substance necessary for blood cells to migrate to skin tissue, and also act on skin epithelial cells to produce hyaluronic acid with a moisturizing effect. Since it can prevent or improve skin wrinkles by showing an effect of increasing the enzyme, it can be used as an active ingredient of a healthy food for preventing and improving skin aging. There is no particular limitation on the kind of food.
  • Examples of foods to which the substance may be added include dairy products, including soups, meats, sausages, breads, biscuits, rice cakes, chocolates, candy, snacks, sweets, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, Beverages, alcoholic beverages and vitamin complexes, dairy products and dairy products, etc., includes all the health functional foods in the conventional sense.
  • the flow extract of the present invention or a fraction thereof may be added to the food as it is or used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the combined amount of the active ingredient can be suitably determined depending on the purpose of use (prevention or improvement).
  • the amount of the compound in the health food can be added to 0.1 to 90 parts by weight of the total food weight.
  • the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety. have.
  • the health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except for containing the compound as essential ingredients in the indicated proportions, and may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, as in general beverages.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, and xylyl, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tautin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of natural carbohydrates is generally from about 1 to 20 g, preferably from about 5 to 12 g per 100 compositions of the present invention.
  • the flow extract of the present invention or fractions thereof may include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors such as flavoring agents, colorants and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof. , Alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the flow extract of the present invention or fractions thereof may contain flesh for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages.
  • the proportion of such additives is not so critical but is generally selected in the range of 0.1 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the flow extract or fractions thereof of the present invention.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for preventing and improving skin aging containing a flow extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the flow extract or fractions thereof may be one having skin regeneration, wrinkle improvement or moisturizing activity, but is not limited thereto. 1
  • the flow extract of the present invention or fractions thereof induces the production of CD44, a cell surface substance required for blood cells to move to skin tissues, and also acts on skin epithelial cells to provide a moisturizing effect of hyaluronic acid. It can be used to prevent skin aging, for example, skin atrophy, collagen loss, elastic fiber loss, connective tissue loss, cellite, wrinkle formation, etc., as it has the effect of enhancing the enzyme, thereby improving or preventing skin wrinkles. Can be.
  • Cosmetic compositions for preventing or improving skin aging according to the present invention include, but are not limited to, lotions, ointments, gels, creams, patches or sprays.
  • the flow extract of the present invention or a fraction thereof may be added in an amount of 1 to 15 parts by weight, preferably 2 or 10 parts by weight, to the externally used skin composition.
  • the external preparation for skin may include fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickening and gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, fragrances, interfaces.
  • the present invention also provides a method for preventing and improving skin aging comprising administering a fluid extract or a fraction thereof to a subject.
  • the present invention also provides the use of a flow extract or a fraction thereof for use as a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging.
  • the present invention for use as a health food for preventing and improving skin aging
  • a flowing extract or fractions thereof Provided is the use of a flowing extract or fractions thereof.
  • the present invention also provides the use of a flow extract or a fraction thereof for use as a cosmetic composition for preventing and improving skin aging.
  • the flow extract of the present invention or a fraction thereof acts on blood cells to induce the production of CD44, a cell surface material necessary for blood cells to migrate to skin tissue, and also acts on skin epithelial cells to produce hyaluronic acid having a moisturizing effect. Since the effect of increasing the enzyme can be prevented or improved skin wrinkles, the flow extract or fractions thereof may be usefully used as an active ingredient in a pharmaceutical composition, health food or cosmetic composition for preventing and improving skin aging.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging containing a diterpene compound represented by the following Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a diterpene-based compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient for preventing skin aging and improving health food.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for preventing and improving skin aging containing a diterpene-based compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • At least one is a single bond
  • R 1 is C 1 -C 4 straight or branched alkyl, unsubstituted or substituted with hydroxy
  • R 2 is H or hydroxy
  • R3 is H or 0, and 0 is substituted when is a double bond.
  • the compound represented by Formula 1 is preferably one selected from the group represented by Formula 2 to Formula 6, but is not limited thereto.
  • the diterpene-based compound of Formula 1 may be separated from the flow extract, but is not limited thereto.
  • the compound may be one having skin regeneration, wrinkle improvement or moisturizing activity, but is not limited thereto.
  • the present inventors obtained by purification from the extract prepared from the flowing fruit by the compoundol chromatography fractionation method of the formula (1) and analyzed the structure (see Formula 2 to Formula 6). Therefore, the diterpene-based compound of Formula 1 according to the present invention acts on blood cells to induce the production of CD44, a cell surface material necessary for blood cells to move to skin tissue, and also acts on skin epithelial cells to moisturize.
  • the present invention also provides a method for preventing and improving skin aging comprising administering to the subject a diterpene-based compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention to use as a pharmaceutical composition for preventing and improving skin aging It provides a use of the diterpene-based compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a use of the diterpene-based compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use as a health food for preventing and improving skin aging.
  • the present invention also provides the use of the diterpene-based compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use as a cosmetic composition for preventing and improving skin aging.
  • the diterpene-based compound of formula 1 of the present invention induces the production of CD44, a cell surface substance required for blood cells to move to skin tissues, and also acts on skin epithelial cells to moisturize hyaluronic acid.
  • the diterpene-based compound of Chemical Formula 1 may be usefully used as an active ingredient in a pharmaceutical composition, health food or cosmetic composition for preventing and improving skin aging, because it may prevent or improve skin wrinkles. Can be.
  • Flow extracts were isolated from ⁇ Ajeurjies fordii) ⁇ ⁇ buds according to previously reported protocols (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 22, Issue 6, 15 March 2012, Pages 2318-2320). Briefly, a flow methanol extract was prepared by extracting 2.9 kg of dried dried buds of Jeju-do, Seogwipo, with 4 liters of 100% methane (SK Chemicals, Korea). The yield of the flow methanol extract obtained through the above process was 449.6 g.
  • Example 2 Preparation of Fractions of Flowable Extracts
  • the extracted methane of ⁇ Example 2> was extracted with 96.3, 53.9 and 85.9 g, respectively, in 1.5 liters of water, and / ⁇ nucleic acid Hiexane), chloroform (CHC1 3 ) and ethyl acetate (EtOAc) were added to each solvent 1.5. Extracted successively using liters.
  • 27.6 g of the light nucleic acid fraction, 28 g of the chloroform fraction, and 80 g of the ethyl acetate fraction were obtained.
  • Optical rotation was measured with a Jasco P2000 polarimeter (Jasco corporation, Japan). UV data were obtained on a UV-VIS spectrometer 2400 (Shimadzu Co. Ltd .; Japan), and NMR spectra were collected on a Vari an UNITY 400 (Varian, Inc., Palo Alto, CA) using tetramethylsilanol as an internal standard. Recorded. HRESIMS was performed on a Waters Q-Tof Premier spectrometer (Micromass UK Ltd., Manchester, UK).
  • the nucleic acid extract was subjected to column chromatography (CC) on silica gel (230-400 mesh) using nucleic acid / EtOAc (50: 1— 1: 5) as eluent, followed by CHCl 3 / MeOH (10: 1- 1: 1) Silica gel column chromatography was performed again to obtain 38 fractions (LH1-LH38).
  • the active fractions LH30 and LH31 were found to be similar on the TLC chromatogram, mixed together and then RP-C18 (75C 18) using a gradient gradient mixture of MeOH-H 2 0 (45:55 to 90:10) as eluent.
  • Subfraction LH3435-7-1 to LH3435 were further fractionated using Sephadex LH20 column chromatography using nucleic acid / C3 ⁇ 4Cl 2 / MeOH (10: 10: 1) as eluent for fraction LH3435-7 (1.2 g). Got -7-8. Then LH3435-I 2 (784 mg) was chromatographed again on silica gel column chromatography using a concentration gradient solvent of CHC1 3 / acetone (5: 1, 4: 1) to give Compound 2 (39.8 mg) and Compound 5 (278 mg) was obtained.
  • olefin protons ⁇ ⁇ of 6.86 H-5) correlate with oxygenated carbon of 6 C 61.3 (020) and two carbonyl groups of S c 205.KC-3) and 202.6CC-7).
  • Another leupin proton ⁇ ⁇ of 7.6KH-1) resonated with a methyl group of 10.6 (C-19) and a carbonyl group of 205.KC-3). This indicates that there are two ⁇ , ⁇ -unsaturated ketone backbones in these compounds and that they are not far from each other.
  • Compound 5 was isolated as a white amorphous powder. This showed a molecular ion peak [MH] 'of m / z 659.4143 corresponding to molecular formula C 38 H 60 0 9 in HRESIMS.
  • the 3 ⁇ 4 and 13 C ⁇ R spectra of compound 5 contained signals substantially the same as that of compound 4 except that the methyl group at C-16 was replaced by hydroxymethylene. Therefore, the structure of compound 5 was found to be 12- ⁇ nucleusdecanoyl -16- hydroxypobol -13-acetate.
  • Nuxadecanoyl-pobol-13-acetate (4) colorless oil; [a] 20 D + 42.6 ° (c 0.21, CHCI 3 ); UV (EtOH); ⁇ ⁇ (logs) 202 (3.22), 228 (1.80) nm; 3 ⁇ 4 and 13 CNMR data, see Table 1 and Table 2 below; HRESIMS m / z 643.4244 [ ⁇ - ⁇ (calcd for C 38 H 59 0 8 , 643.4210),
  • Nuxadecanoyl-4-deoxy-4 alpha -16-hydroxy phosphol -13-acetate (6) colorless oil; [a] 20 D -7.6 ° (c 0.45, CHC1 3 ); UV (EtOH); ⁇ max (log ⁇ ) 232 (2.62) nm; 3 ⁇ 4 and 13 C NMR data, see Table 1 and Table 2 below; HRESIMS m / z 689.4296 [M ⁇ H] “ (calcd for C 39 H 6 i0i 0 , 689.4265). In addition, 3 ⁇ 4- ⁇ (400 MHz, CDCls) and 13 C-NMR (100 ⁇ z, CDCls) of compounds 2 to 6 above. ) Data is shown in Tables 1 and 2, respectively.
  • K562 cells, U937, HMC and CRL2076, Hacat cells were 10% eluted serum (Fetal Calf Serum, FCS) (HyClone, Logan, UT), 2 mM-glutamate 100 ⁇ / ⁇ penicillin, 100 g / i strapomycin ( DMEKLife Technologies, Düsseldorf, Germany) medium containing Life Technologies).
  • Amplification by PCR reaction was performed using the GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) under the following conditions; After 5 minutes at 94 ° C, followed by 45 seconds at 94 ° C, 45 seconds at 56 ° C and 25-40 cycles of 1 min at 72 ° C, the final extension reaction was carried out at 72 ° C for 7 minutes.
  • PCR primers in Table 3 were designed using the Primer3 program and were purchased from Bioneer (Daejeon, Korea).
  • PCR products were separated on 1.5% agarose gel, stained with ethidium bromide (EtBr) and visualized with Gel Doc 2000 UV trans-i 1 luminator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif., USA). One sof tware (Bio-Rad Laboratories) was used for analysis. Each sample was tested three or more times and representative data were presented.
  • the flow extract was treated with blood cells K562, U937, HMC cells and epithelial cells A549, CRL2076 cells, and the mRNA of CD44 marker protein required for the recruitment of blood (immune) cells into epidermal epithelial tissue in each cell. It was confirmed that expression increased when the flow extract was treated (FIG. 2A).
  • Flow extracts were treated to blood cells K562, U937, HMC cells and epithelial cells A549, CRL2076 cells to inhibit the expression level of CD44 marker protein required for recruitment of blood (immune) cells into epidermal epithelial tissue.
  • CD44 antibodies ((Harlan SeraLab, Wales, UK) and FACS were identified. Specific FACS methods are as follows: Each cell was treated with a flow extract for 15 hours for FACS analysis and then cells were treated with 1% pores. Aldehyde immobilized, incubated with anti-CD44-FITC antibody for 1 hour and stained and analyzed using FACScan flow cytometer (Becton Dickinson San Jose, Calif.).
  • HAS-2 production was induced in epidermal epithelial cells CRL2076 and Hacat (FIG. 3).
  • the production of HAS-2 in the epithelial cells began to increase at a concentration of 0.5 / ml, and showed an increase in transcriptional activity 1 hour after the treatment (Fig. 3A, B and C).
  • CD44 increase in K562 cells was strong even at 0.1 ig / ml of the flow extract (FIG. 4A), and the transcript began to increase after 3 hours and had a maximum transcription activity after 12 hours. (FIG. 4B).
  • FIG. 4A As a result of analyzing the surface protein changes in FACS, it was confirmed that the expression of CD44 protein showed the same pattern (FIG.).
  • mice The rats used in the experiments were purchased from a central laboratory animal (Korea) and reared without dietary restriction for red-eye, and then normal 5-week-old male Balb / C mice (mouse) were also raised in the same environment as control mice. After attempting to strapping and artificially causing some skin damage, we analyzed the regeneration and skin elasticity of the skin by treating the flow extract. At this time, the mice per group were tested in two replicates of 10 animals.
  • the flow extract induces the activity of skin cells and promotes the production of hyaluronic acid, a kind of extracellular matrix (ECM) of skin tissues, thereby inhibiting wrinkles of the skin and preventing wrinkles. It was confirmed that the excellent effect of inducing the activity of the skin (Fig. 5).
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • Vitamin Complex Vitamin A Acetate 70 iig Vitamin E 1.0 mg Vitamin 0.13 mg Vitamin B2 0.15 mg Vitamin B6 0.5 rag Vitamin B12 0.2 / zg Vitamin C 10 mg Biotin 10 fig Nicotinamide 1.7 rag Folic acid 50 mg Calcium Pantothenate 0.5 rag Mineral mixture à a Sulfate Ferrous 1.75 mg Zinc oxide 0.82 mg Magnesium carbonate 25.3 rag Potassium phosphate 15 mg Dicalcium phosphate 55 mg Potassium citrate 90 mg Calcium carbonate 100 rag Magnesium chloride 24.8 mg
  • the composition ratio of the above vitamin and mineral mixture is relatively suitable for health foods. Although the ingredients are mixed in a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified. The above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method, and then granules are prepared. It can be used for manufacture.
  • composition ratio is a relatively suitable composition for a preferred beverage in a preferred embodiment, but the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and national preferences such as demand hierarchy, demand country, and usage.
  • Cetostearyl alcohol 2.8 parts by weight beeswax 2.6 parts by weight stearic acid 1.4 parts by weight lipophilic monostearic acid glycerin 2 parts by weight Fiji -100 stearate 1 part by weight sesquioleate sorbitol 1.4 parts by weight jojoba oil 4 parts by weight squalane 3.8 parts by weight poly Sorbate 60 1.1 parts by weight Macadamia oil 2 parts by weight Tocopherol acetate 0.2 parts by weight Methyl polysiloxane 0.4 parts by weight Ethyl paraben 0.1 parts by weight Propyl paraben 0.1 parts by weight
  • Cetostearyl alcohol 1.6 parts by weight stearic acid 1.4 parts by weight lipophilic monostearate glycerine 1.8 parts by weight sebum-100 stearate 2.6 parts by weight sesquierlane sorbate 0.6 parts by weight squalene 4.8 parts by weight macadamia oil 2 parts by weight jojoba oil 2 0.4 parts by weight Methyl polysiloxane 0.2 parts by weight Ethyl paraben 0.1 parts by weight 0.1 parts by weight 0.1 parts by weight of propyl paraben 1,3-butylene glycol 4 parts by weight Methyl paraben 0.1 parts by weight xanthan gum 0.1 parts by weight glycerin 4 parts by weight d-pandenol 0.15 parts by weight allantoin 0.1 parts by weight fluid extract, fractions thereof or diterpene compounds separated therefrom

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Abstract

본 발명은 유동(Aleurites fordii) 추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 포볼-형 디테르펜(phorbol-type diterpene) 화합물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 유동 추출물은 혈액세포에 작용하여 혈액세포가 피부조직으로 이동하기 위하여 필요한 세포표면물질인 CD44의 생산을 유도하고, 피부상피세포에 작용하여 보습효능을 지닌 하이알루론산(Hyaluronic acid)의 생성효소를 증대시키므로, 피부질환 치료용 또는 피부노화를 방지하는 항노화용 약학적 조성물, 피부노화 방지 및 개선용 건강 식품, 또는 주름 방지 효능을 지니는 기능성 화장품의 유효성분으로 이용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
유동추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 ^동 AJeun'tes fordii) 추출물， 이의 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 디테르펜 (diterpene) 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
유동 G4/«/r/ es fordii) 추출물은 동양 전통의학에서 인후의 붓고 아픈 것， 치통, 류머티즘통올 치료하는 것으로 알려져 있다. 또한 천연두와 초기 유방암을 치료한다고 알려진 바 있으나, 유동 추출물의 생물학적 활성은 아직까지 명확히 알려져 있지 않다. 한편， 유동 추출물 또는 이의 분획물이 항바이러스 효과가 있는 것이 확인된 바 있다 (대한민국 공개특허 10-2011-0049722). 피부노화 현상은 피부조직을 이루는 세포와 지지체인 세포의기질 (extracellular matrix, ECM)의 구성물질인 콜라겐 (col lagen)， 엘라스틴 (elastin), 하이알루론산 (hyaluronic acid)의 감소가 일어남으로써， 전체적인 면역기능의 저하와 피부의 주름현상이 나타난다고 알려져 있다 (Exp Dermatol. 2011 May;20(5) :454-6) .
하이알루론산은 표피층과 진피층에 있는 세포간질에 존재하는 천연보습성분이며, 피부에서 수분을 유지시켜 보습작용과 피부의 탄력을 유지시키는 작용이 있다. 자기 무게의 80배 정도의 수분을 끌어당기는 능력이 있고， 수분흡인력이 뛰어나다. 이러한 하이알루론산은 연령이 많아질수록 감소하게 되어 주름의 원인이 된다. 또한, 피부가 자외선에 노출되면 유해한 활성산소가 생성되고 이에 의해 진피층 속에 있는 콜라겐과 세포간 물질인 하이알루론산이 감소되어 주름이 생긴다. 피부노화현상을 과학적으로 분석하기 위한 피부조직의 변화를 분석하고 노화에 따른 피부조직의 구성물질인 하이알루론산의 증가를 유도하기 위한 생리활성물질의 개발이 필요하다. 주름개선제품은 피부 탄력 강화 및 콜라겐 합성을 촉진하고， 표피의 신진대사를 촉진하는 용도로 사용된다. 주름 개선 기능 성분으로 레티놀， 아데노신, 폴리에톡실레이티드레틴아미드， 레티닐팔미테이트가 있다. 2000년대부터 천연물에서 추출한 안젤리카성분， 아데노신, 사과， 배， 로즈마리 등 식물과 약초에 포함된 우르솔릭애씨드 둥을 합성한 식물 호르몬의 일종인 카이네틴, 코엔자임 Q— 10, 효모추출물 소재 제품들이 주름 개선 기능 성분으로 사용되었다. 특히 식물에서 얻어진 천연물은 인체 안정성에 아무런 문제가 없고， 제조가 용이할 뿐만 아니라 가격이 싸다는 점에서 장점을 갖는다. 주름개선제품에 야생 팬지 추출물, 에델바이스 추출물, 올리브 잎 등의 천연추출물이 가미되고 있으나, 유동 추출물을 피부질환 치료 또는 주름 개선에 이용한 바는 현재까지 없는 실정이다. 본 발명자들은 주름을 포함한 노화현상에서 급격히 감소하는 하이알루로난의 생성을 유도하기 위한 물질을 천연물의 추출액에서 발굴하고자 시도한 결과， 유동추출물, 이의 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리된 디테르펜 (diterpene) 화합물이 혈액세포에서 하이알루로난을 인지하여 피부조직으로 이동하기 위한 리간드 (ligand)인 CD44의 발현을 유도하는 능력이 탁월하고, 피부세포에서 피부보습에 관여하는 히알루론산의 생산효소인 하이알루론 합성효소의 생산을 유도하여， 피부보습을 통한 항노화 효능을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명올 완성하였다. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】 본 발명의 목적은 유동 추출물， 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 (diterpene) 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물， 건강 식품 또는 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 유동 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 및 개선 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물로 사용하기 위한 유동 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물로 사용하기 위한 유동 추출물， 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 과제를 해결하기 위해， 본 발명은 유동 추출물 또는 이의 분획물올 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물， 건강 식품 또는 화장료 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 유동 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 및 개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물로 사용하기 위한 유동 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물로 사용하기 위한 유동 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디테르펜 (diterpene) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물， 건강 식품， 또는 화장료 조성물을 제공한다. 또한， 본 발명은 하기 화학식 1의 디테르펜 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 및 개선 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물로 사용하기 위한 하기 화학식 1의 디테르펜 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물로 사용하기 위한 하기 화학식 1의 디테르펜 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
[화학식 1]
Figure imgf000006_0001
(상기 화학식 1에 있어서， 는 단일 또는 이중 결합이고， 이때 상기
― 가 이웃하는 경우 적어도 하나는 단일 결합이고ᅤ
R1은 비치환 또는 하이드록시로 치환된 C1-C4의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고，
R2는 H또는 하이드록시이고， 및
R3는 H 또는 0이되， 상기 0는 _가 이중결합인 경우에 치환된다).
【유리한 효과】
본 발명은 · Γ동 (AJeuriies fordii) 추출물， 이의 분획물 또는 상기 분획물로부터 분리한 포볼-형 디테르펜 (phorbol-type diterpene) 화합물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 유동 추출물은 혈액세포에 작용하여 혈액세포가 피부조직으로 이동하기 위하여 필요한 세포표면물질인 CD44의 생산을 유도하고， 피부상피세포에 작용하여 보습효능을 지닌 하이알루론산 (Hyaluronic acid)의 생성효소를 증대시키므로, 피부질환 치료용 또는 피부노화를 방지하는 항노화용 약학적 조성물， 피부노화 방지 및 개선용 건강 식품， 또는 주름 방지 효능을 지니는 기능성 화장품의 유효성분으로 이용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 ^^iAleurites fordii) 추출물로부터 분리한 포볼 타입의 디테르펜 화합물의 화학 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 유동 추출물이 처리된 혈액세포인 K562, U937, HMC 세포와 상피세포인 A549, CRL2076세포에서 표피상피조직 내에 혈액 (면역)세포들의 모집 (recruitment)에 필요한 CD44 표지단백질의 mRNA의 발현 수준을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이며 (도 2A), CD44 표지 단백질의 발현 수준을 FACS를 통해 확인한 결과이다 (도 2B).
도 3은 유동추출물이 처리된 상피세포인 CRL2076, Hacat 세포에서 히알루론산의 생성과 관련된 효소인 히알루론산 합성효소 -2(hyaluronic acid synthase-2, HAS-2)의 발현이 추출물의 농도 (3A 및 X)와 시간 (3B)에 따라 증가되는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 유동추출물이 처리된 혈액세포인 K562에서 처리된 추출물의 농도 (도 4A)와 추출물의 처리 시간 (도 4B)에 따라 CD44 mRNA 발현이 증가하고, 처리 시간에 따라 CD44 단백질 (도 4C)이 증가한 것을 확인한 도이다.
도 5는 정상적인 Balb/C 생쥐 피부를 제모하고 테잎 스트랩핑 (tape strapping)을 유도하여 약간의 상처를 유도한 후 피부가 재생되는 동안 피부의 윤기를 관찰한 도이다;
대조군: 크림만 바른 군; 및
유동 추출물 처리군: 70 //g/ml 유동 추출물 성분이 함유된 크림을 바른 처리군. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명의 용어를 상세하게 설명한다. 본 발명에 있어서， "개선' '이란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이톱게 변경되는 모든 행위 의미한다.
본 발명에 있어세 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며， 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한， 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 이하， 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명은 유동 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 유동 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 유동에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계 ; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축한 후 건조하는 단계 .
상기 방법에 있어서， 단계 1)의 유동은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 유동은 유동의 꽃, 줄기， 잎 또는 열매가 모두 이용가능하며, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서， 상기 단계 1)의 상기 추출용매는 물， 알코을 또는 이들의 흔합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1내지 C2저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며， 저급 알코올로는 에탄을 또는 메탄을을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕 추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매는 건조된 유동 분량의 2. 내지 20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 50°C인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한，추출시간은 10내지 48시간인 것이 바람직하며， 24시간이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러， 추출 회수는 3 내지 5회인 것이 바람직하며， 3희 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서， 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서， 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조， 비등건조， 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 분획물은 핵산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 유기용매를 이용하여 수득된 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 유동 추출물 또는 이의 분획물은 피부 재생， 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 유동 추출물을 제조하고 상기 추출물로부터 분획물을 제조하였다. 유동 추출물을 혈액세포인 K562, U937, HMC 세포와 상피세포인 A549, CRL2076세포에' 처리하여 각 세포에서 표피상피조직 내에 혈액 (면역)세포들의 모집 (recruitment)에 필요한 CD44 표지단백질의 mRNA 발현 및 단백질 발현 정도를 확인하였다. CD44 표지단백질의 mR A의 발현이 유동추출물을 처리하였을 때 증가한 것을 확인하였고 (도 2A 참조), CD44 단백질 역시 증가한 것을 확인하였'다 (도 2B 참조). 표피상피세포인 CRL2076과 Hacat에서 히알루론산 합성효소 -2(hyaluronic acid synthase 2, HAS-2)의 생성과 관련된 mRNA 수준의 변화를 확인하였고, HAS-2의 생성이 0.5 의 농도에서 증가하기 시작하였고, 처리 1 시간 후부터 전사활동의 증가 현상을 보이는 것을 확인하였다 (도 3A, B 및 C 참조). 유동추출물의 처리 농도와 처리 시간에 따른 K562 세포에서 CD44의 mRNA 발현 및 단백질 발현 정도를 확인하였다. 그 결과， K562 세포에서 CD44 증가 현상은 유동추출물 0.1 /ml에서도 강하게 나타났고 (도 4A 참조)， 3 시간이 지나면서 전사물이 증가하기 시작하여 12 시간이 지나면 최대치의 전사 활성을 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 4B 참조). FACS에서 표면 단백질의 변화를 분석한 결과， CD44 단백질 발현도 같은 양상을 보이는 것을 확인하였다 (도 4C 참조).
유동 추출물의 마우스에서 피부 개선 효과를 분석하기 위해， 정상적인 Balb/C 생쥐의 제모된 피부에 테잎 스트랩핑 (tape strapping)을 시도하여 피부손상을 유발한 후 유동추출물을 처리함으로써 피부의 재생과 피부탄력을 분석하였다. 그 결과, 크림만 바른 대조군에 비해 유동추출물이 함유된 크림을 바른 유동추출물 처리군의 경우， 피부의 주름 현상을 억제하여 주름방지와 피부의 활성을 유도하는 우수한 효과를 보이는 것을 확인하였다 (도 5 참조).
따라서， 본 발명에 따른 조성물은 혈액세포에 작용하여 혈액세포가 피부조직으로 이동하기 위하여 필요한 세포표면물질인 CD44의 생산을 유도하고 또한, 피부상피세포에 작용하여 보습효능을 지닌 하이알루론산 (Hyaluronic acid)의 생성효소를 증대시키는 효과를 나타내어 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있으므로， 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 층진제， 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제， 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제， 과립제， 캡슐제， 트로키제 등이 포함되며， 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 탄산칼슘, 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슴 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， '유제 또는 시럼제 둥이 해당되는데， 흔히 사용되는 단순 회석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제, 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁용제， 유제， 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리콜， 폴리에틸렌 글리콜， 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골， 트원 (tween) 61, 카카오지， 라우린지， 글리세를, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서， "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 /위험 비율로 질환을 치료하기에 층분한 양을 의미하며， 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도， 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율， 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며， 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게'결정될 수 있다.
구체적으로， 본 발명에 따른 유동 추출물 및 이의 분획물의 유효량은 환자의 나이， 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며， 일반적으로는 체증 1 kg당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도， 성별， 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한， 본 발명은 유동 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 건강 식품을 제공한다.
상기 유동 추출물 또는 이의 분획물은 피부 재생， 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 유동 추출물 또는 이의 분획물은 혈액세포에 작용하여 혈액세포가 피부조직으로 이동하기 위하여 필요한 세포표면물질인 CD44의 생산을 유도하고, 또한, 피부상피세포에 작용하여 보습효능올 지닌 하이알루론산의 생성효소를 증대시키는 효과를 나타내어 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있으므로, 피부노화 방지 및 개선용 건강 식품의 유효성분으로 이용할 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류， 소시지， 빵， 비스킷， 떡， 초콜릿， 캔디류, 스낵류,과자류，피자,라면,기타 면류,껌류，아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수， 알코올 음료 및 비타민 복합제， 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 유동 추출물 또는 이의 분획물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고， 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 흔합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로， 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물올 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당， 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스， 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드， 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리를, 소르비를, 에리트리를 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린， 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 유동 추출물 또는 이의 분획물은 여러 가지 영양제， 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈， 초콜릿 등)， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제， 안정화제, 방부제， 글리세린， 알코을, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 유동 추출물 또는 이의 분획물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육올 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 유동 추출물 또는 이의 분획물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 유동 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 유동 추출물 또는 이의 분획물은 피부재생， 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다. 1 본 발명의 유동 추출물 또는 이의 분획물은 혈액세포에 작용하여 혈액세포가 피부조직으로 이동하기 위하여 필요한 세포표면물질인 CD44의 생산을 유도하고, 또한， 피부상피세포에 작용하여 보습효능을 지닌 하이알루론산의 생성효소를 증대시키는 효과를 나타내어 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있으므로, 피부 노화, 예를 들면 피부 위축， 콜라겐 손실， 탄성 섬유 손실, 결합 조직 손실, 셀를라이트, 주름 형성 등의 예방에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 로션, 연고， 겔， 크림， 패치 또는 분무제 등을 포함하나 여기에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제조함에 있어서, 통상적으로 함유되는 피부 외용제 조성물에 본 발명의 유동 추출물 또는 이의 분획물을 1내지 15중량부, 바람직하게는 2또는 10중량부로 첨가할 수 있다. 상기 피부 외용제 조성물에는 본 발명의 유동 추출물 또는 이의 분획물에 추가로 지방 물질， 유기 용매， 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제， 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제， 충전제， 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민， 차단제, 습윤화제， 필수 오일， 염료, 안료， 친수성 또는 친유성 활성제， 지질 소낭 또는 피부 외용제 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다. 또한, 본 발명은 유동 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 및 개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물로 사용하기 위한 유동 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 건강식품으로 사용하기 위한 유동 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물로 사용하기 위한 유동 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공한다.
본 발명의 유동 추출물 또는 이의 분획물은 혈액세포에 작용하여 혈액세포가 피부조직으로 이동하기 위하여 필요한 세포표면물질인 CD44의 생산을 유도하고, 또한， 피부상피세포에 작용하여 보습효능을 지닌 하이알루론산의 생성효소를 증대시키는 효과를 나타내어 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있으므로, 상기 유동 추출물 또는 이의 분획물은 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물, 건강식품 또는 화장료 조성물에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디테르펜계 (diterpene) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 건강식품올 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물올 제공한다.
【화학식 11
Figure imgf000015_0001
(상기 화학식 1에 있어서, 는 단일 또는 이중 결합이고， 이때 상기
― 가 이웃하는 경우 적어도 하나는 단일 결합이고，
R1은 비치환 또는 하이드록시로 치환된 C1-C4의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R2는 H또는 하이드록시이고, 및
R3는 H또는 0이되, 상기 0는 가 이중결합인 경우에 치환된다) 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 내지 화학식 6으로 표시되는 군으로부터 선택되는 1종인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
[화학식 2] [화학식 3]
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물은 유동 추출물로부터 분리한 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
상기 화합물은 피부재생， 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 유동 열매로부터 제조한 추출물로부터 상기 화학식 1의 화합물올 크로마토그래피 분획 방법으로 정제하여 수득하고 그 구조를 분석하였다 (화학식 2 내지 화학식 6 참조). 따라서, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물은 혈액세포에 작용하여 혈액세포가 피부조직으로 이동하기 위하여 필요한 세포표면물질인 CD44의 생산을 유도하고， 또한， 피부상피세포에 작용하여 보습효능을 지닌 하이알루론산의 생성효소를 증대시키는 효과를 나타내어 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있으므로, 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물, 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물 또는 피부노화 방지 및 개선용 건강 식품의 유효성분으로 이용할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 및 개선 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물로 사용하기 위한 상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 건강식품으로 사용하기 위한 상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물로 사용하기 위한 상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 화학식 1의 디테르펜계 화합물은 혈액세포에 작용하여 혈액세포가 피부조직으로 이동하기 위하여 필요한 세포표면물질인 CD44의 생산올 유도하고, 또한, 피부상피세포에 작용하여 보습효능을 지닌 하이알루론산의 생성효소를 증대시키는 효과를 나타내어 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있으므로, 상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물은 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물， 건강식품 또는 화장료 조성물에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예， 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예， 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다. <실시예 1>유동 추출물의 제조
유동 추출물은 ^^ Ajeurjies fordii)^\ 꽃봉오리로부터 이미 보고된 프로토콜 (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 22, Issue 6, 15 March 2012, Pages 2318-2320)에 따라 분리하였다. 간략히 설명하면, 제주도 서귀포에서 채취한 유동의 건조된 꽃 봉오리 2.9 kg를 100% 메탄을 4 리터 (SK Chemicals, 한국)로 추출하여 유동 메탄올 추출물을 제조하였다. 상기 과정을 통해 수득한 유동 메탄올 추출물의 수득량은 449.6g 이었다.
<실시예 2>유동 추출물의 분획물의 제조 상기 <실시예 2>의 유동 메탄을 추출물을 각각 96.3, 53.9그리고 85.9 g 을 물 1.5 liter에 현탁시키고, /广핵산 Hiexane)， 클로로폼 (CHC13) 및 에 틸아세테이트 (EtOAc)을 각 용매 1.5 리터 (liter)를 사용하여 연속적으로 추출해내었다. 상기 실시예를 통하여, 广핵산 분획물 27.6 g, 클로로포름 분획물 28 g, 에틸아세테이트 분획물 80 g을 수득하였다.
<실시예 3>유동 추출물로부터 디테르펜계 화합물의 분리 및 정제
<3-1> 전반적인 실험 과정
광학적 회전은 Jasco P2000 편광계 (Jasco corporation, Japan)로 측정하였다. UV데이터는 UV-VIS분광기 2400(Shimadzu Co. Ltd.; Japan)상에서 얻었으며， NMR 스펙트럼은 내부 표준물질로서 테트라메틸실란올 사용하여 Vari an UNITY 400(Varian, Inc., Palo Alto, CA)상에서 기록하였다. HRESIMS는 Waters Q-Tof Premier분광기 (Micromass UK Ltd. , Manchester, UK)분광기 상에서 수행하였다. 실리카 겔 (230-400메쉬， SiliCycle Inc.， Quebec, Canada), RP-C18 ( Cosmos il 75C18-PREP, Kyoto, Japan) , 세파텍스 LH-20 (25-100 im, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. TLC는 프리코팅된 Kiesel-gel 60 F254 (0.25睡， Merck, Darmstadt, Germany) 및 Kiesel-gel 60 RP-18F254s (0.25 mm, Merck, Steinheim, Germany) 상에서 수행하였다.
<3-2>추출 및 분리
대기 중에서 건조시킨 유동의 잎 2.9 kg을 분쇄한 후 상온에서 3회 MeOH로 추출하여 449.6g의 고체 추출물을 얻었다. 상기 MeOH 추출물을 ¾0 중에 현탁시킨 다음 n—핵산, EtOAc, 및 η-BuOH로 연속적으로 분배시켜 각각 96.3 g, 53.9 g 및 85.9 g의 잔사물을 얻었다. 상기 핵산 추출물이 다른 용매 추출물에 비해 IFN-Y 유도 활성이 더 큰 것으로 나타났다. 이에 상기 핵산 추출물을 핵산 /EtOAc (50:1— 1:5)을 용리액으로 사용하여 실리카 겔 (230-400 메쉬)상에서 컬럼 크로마토그래피 (CC)를 실시한 다음, CHCl3/MeOH (10:1-1:1)올 사용하여 다시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 38개 분획물 (LH1-LH38)올 얻었다. 활성 분획 LH30 및 LH31은 TLC 크로마토그램 상에서 유사한 것으로 나타나 함께 흔합한 다음， MeOH-H20 (45:55내지 90:10)의 단계적인 농도구배 흔합물을 용리액으로 사용하여 RP-C18 (75C18-PREP)의 중압 액체 크로마토그래피 (MPLC) 컬럼 상에서 크로마토그래피를 수행하여 21개 하위분획 (LH3031-1 내지 LH3031-21)을 얻었다. 분획 LH3031—20 (30mg)에 대하여 핵산 /EtOAc (2.5:1)를 이용하여 추가로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화합물 3 (2.6mg) 및 화합물 4 (13mg)을 얻었다. 활성 분획 LH34 및 LH35의 조합인, 분획 LH3435에 대하여 CHCl3/MeOH (50:1, 20:1)을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 하위분획 LH3435-1 내지 LH3435-11을 얻었다. 분획 LH3435-7 (1.2g)에 대하여 핵산 /C¾Cl2/MeOH (10:10:1)을 용리액으로 사용하여 세파덱스 LH20 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 추가로 분획하여 하위분획 LH3435-7-1 내지 LH3435-7-8을 얻었다. 그 다음 LH3435-그 2 (784mg)를 CHC13/아세톤 (5:1, 4:1)의 농도구배 용매를 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 상에서 다시 크로마토그래피를 수행하여 화합물 2 (39.8mg) 및 화합물 5 (278mg)를 얻었다. 분획 N3435-3 (50.1mg)에 대하여 핵산 /C¾Cl2/MeOH (10: 10:1)을 용리액으로 이용하여 세파덱스 LH20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 4개의 하위분획 LH3435-3-1 내지 LH3435-3-4를 얻었다. 그 다음 LH3435-3-2 (30mg)를 CHC13/아세톤 (2:1)을 이용하여 박막 크로마토그래피 (PLC)를 수행하여 LH-3-2-P를 얻고, 예비 HPLC (C18, 5um, 92% ACN)를 통해 추가로 정제하여 화합물 6 (6. (kg)를 얻었다.
<3-3>화합물 동정
화합물 2는 흰색의 비결정질 고체로서 분리되었다. 이의 고해상도 전기분무 이은화 질량 스펙트럼 (HRESIMS)에 나타난 673.3953 [M-H]ᅳ의 분자 이온 피크를 통해 분자식은 (38¾8010인 것으로 확인되었다 (화학식 2). 화합물 2의 ， 13C및 DEPT스펙트럼은 2개의 이중 결합， 4개의 카보닐기， 5개의 메틸기 : 2개의 산소화된 메틸렌기， 5개의 메틸기 및 4개의 4급 탄소 (3개의 산소화된)를 나타내었다 (화학식 3 내지 화학식 5). 1H 스펙트럼의 δΗ 1.24의 커다란 넓은 피크를 통해 이 화합물 내에 탄소의 장사슬 단위가 존재함을 알 수 있었다.
HMBC 스펙트럼에서, 6.86 H-5)의 올레핀 프로톤 δΗ 가 6C 61.3(020)의 산소화된 탄소 및 Sc 205.KC-3) 및 202.6CC-7)의 2개의 카보닐기와 상관관계를 보였으며, 7.6KH-1)의 또 다른 을레핀 프로톤 δΗ는 10.6 (C-19)의 메틸기 및 205.KC-3)의 카보닐기와 공명을 나타냈다. 이는 이러한 화합물 내에 2개의 α ,β-불포화 케톤 골격이 존재함을 나타내며, 이들이 서로 멀리 있지 않음을 나타낸다. 또한 δΗ 3.83(Η-16) 및 5C 18.4(C-17) 사이에 시그널이 존재하나, 2개의 단일항 프로톤이， 프로톤이 이중항으로 나타나는 C-14, 및 C-15(4급 탄소)와 각각 상관관계를 가졌다. 이는 이러한 탄소가 gem-이중치환-시클로프로판 부분을 구성한다는 점을 나타낸다. 또한, 2개의 카보닐기가 δ(: 173.5 및 174.4에서 나타났다. 상기 첫 번째 피크는 δΗ 5.45CH-12), δΗ2.30및 1.60의 프로톤과 상관관계를 보였으나, 두ᅳ번째 피크는 δΗ 2.15(Η-22)의 단일항 메틸과의 접촉 가능성을 나타내었다. 이를 통해 Sc 174.4의 탄소가 아세테이트기에 속하며, 다른 하나는 질량 분광학으로부터 추측된 16-탄소 에스테르 사슬의 구성 요소임을 알 수 있었다. 상기 화합물 2의 HMBC (H→C) 상관관계 및 COSY (H-H) 상관관계를 화학식 6에 나타내었다. 상기 데이터를 통해， 화합물 2의 탄소 골격이 포볼—타입 디테르펜으로 확인된 피멜리아 에론가타 (/V e/e<3 elongata) 유래의 12-^데카노일포볼 -13-아세테이트 (Patricia Y.H. et al . , J. Nat. Prod. , 2010， 73, 1907-1913)와 일부 유사함을 추측할 수 있었다. 화합물 3의 메틸 시그널 대신에 화합물 2에 히드록시메틸렌 (C— 16)이 존재하는 것을 제외하고는 화합물 2와 3의 ¾ 및 13Cᅳ顺 R 내의 모든 시그널은 유사하였다. 이러한 점에 근거하여, 화합물 2의 구조가 12-ί 핵사데카노일 -7-옥소 -5-엔 -16-히드록시포볼 -13-아세테이트임올 확인할 수 있었다.
화합물 3은 무색의 오일로서 얻어졌다. 이는 HRESIMS에서 분자식 C38H5809에 해당하는 m/z 657.3969의 분자 이온 [M-H]ᅳ를 나타내었다. 화합물 2과 비교하여, 화합물 3의 ¾ 및 13C NMR 데이터는 C-16에서 메틸기 대신에 히드록시메틸렌으로 대체된 것을 제외하고는 화합물 2의 데이터와 동일하였다. 그러므로, 화합물 3의 구조는 헥사데카노일 -7-옥소 -5-엔 -포볼 -13- 아세테이트임을 알 수 있었다. 이는 이전에 조구나무 (5<¾0/ sebiferum)로 —^ 분리된 화합물로 보고된 바 있으나 (Ohigashi H. et al. , Agri. Bio. Chem. , 1983, 7, 1617-1622) , 이의 특성에 대해서는 보고된 바 없다. 화합물 4는 무색의 오일로서 얻어졌다. 이는 HRESIMS에서 분자식 C38H6008에 해당하는 m/z 643.4244의 분자 이온 피크 [M— H]ᅳ를. 나타내었다. 화합물 4의 ¾ 및 13C_NMR 시그널은 질량 분광법으로 확인된 16-탄소 에스테르 사슬의 차이만을 제외하고 12-6>-데카노일포볼 -13-아세테이트의 문헌 NMR 데이터와 일치하몄다. 그러므로, 화합물 4는 12— 핵사데카노일ᅳ포볼 -13- 아세테이트인 것으로 확인되었다.
화합물 5는 흰색의 비결정질 분말로서 분리되었다. 이는 HRESIMS에서 분자식 C38H6009에 해당하는 m/z 659.4143의 분자 이온 피크 [M-H]ᅳ를 나타내었다. 화합물 5의 ¾ 및 13C 匪 R 스펙트럼은 C-16에서 메틸기가 히드톡시메틸렌으로 대체된 것을 제외하고는 화합물 4의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 시그널들을 포함하였다. 그러므로, 화합물 5의 구조는 12-^핵사데카노일 -16-히드톡시포볼 -13-아세테이트인 것으로 확인되었다.
화합물 6는 무색의 오일로서 얻어졌다. 이는 HRESIMS에서 분자식 C38H6008에 해당하는 m/z 689.4296의 분자 이온 피크 [M+FA-H]—를 나타내었다. 이의 ¾ 및 13C NMR 스펙트럼 내의 시그널들은 Sc 73.1 C-4)의 산소화된 4급 탄소가 5(: 49.5의 3급 탄소로 환원된 것을 제외하고는 화합물 5의 시그널들과 일치하였다. ¾— 코지 스펙트럼 (화학식 6)에서， δΗ 2.78 (Η-4)의 프로톤은 δΗ 3.51 (H-10)의 프로톤과 상관관계를 가졌으며， C-4와 HI, H5 사이에 크로스 -피크 (cross-peak)가 있었다. 그러므로, 화합물 6의 구조는 핵사데카노일 -4-데옥시 -4 α -16-히드록시포볼 -13-아세테이트인 것으로 확인되었다. 화합물 2 내지 6의 구조 (화학식 2 내지 화학식 6)， 물리화학적 특징 및 분광학적 데이터를 하기에 나타내었다:
[화학식 2]
Figure imgf000023_0001
12-^핵사데카노일 -7-옥소 -5-엔 -16-히드록시포볼 -13-아세테이트 (2)： 흰색 비결정질 고체; [a] 20 D+10.7° (c 1.68， CHC13); UV (EtOH) ； max (loge ) 222 (2.84)nm; ¾ 및 13C N R 데이터, 하기 표 1 및 표 2 참조; HRESIMS m/z 673.3953 [M— ΗΓ (calcd for C38H57010, 673.3952),
[화학식 3]
Figure imgf000023_0002
12-ί?"핵사데카노일 -7-옥소 -5-엔 -포볼 -13-아세테이트 (3): 무색 오일; [ a] 20D +41.5° (c 0.11, CHC13); UV (EtOH) ； Xmax (logs ) 221 (2.46) nm; ¾ 및 13CNMR데이터， 하기 표 1및 표 2참조; HRESIMS m/z 657.3969 [Μ-ΗΓ (calcd for C38¾709 , 657.4003),
[화학식 4]
Figure imgf000024_0001
핵사데카노일 -포볼 -13-아세테이트 (4): 무색 오일; [a] 20 D +42.6° (c 0.21, CHCI3)； UV (EtOH) ； λ腿 (logs ) 202 (3.22), 228 (1.80)nm; ¾및 13CNMR데이터 ,하기 표 1및 표 2참조; HRESIMSm/z 643.4244 [Μ-ΗΓ (calcd for C38H5908, 643.4210),
[화학식 5]
Figure imgf000024_0002
12-^핵사데카노일 -16-히드록시포볼 -13-아세테이트 (5): 비결정질 흰색 분말; [a] 20D +61.06° (c 0.34, CHC13); UV (EtOH) ； 入 max (logs ) 203 (3.32), 227 (1.92) nm; ¾ 및 13C 蘭 R 데이터, 하기 표 1 및 표 2 참조; HRESIMS m/z 659.4143 [Μ-ΗΓ (calcd for C38H5909, 659.4159), 및
[화학식 6]
Figure imgf000024_0003
핵사데카노일 -4-데옥시 -4 α -16-히드록시포볼 -13-아세테이트 (6)： 무색 오일; [a] 20 D-7.6° (c 0.45, CHC13); UV (EtOH) ； λ max ( log ε ) 232 (2.62) nm ; ¾ 및 13C NMR 데이터， 하기 표 1 및 표 2 참조 ; HRESIMS m/z 689.4296 [M-H]" (calcd for C39H6i0i0 , 689.4265) . 아울러，상기 화합물 2 내지 6의 ¾-賺 (400 MHz , CDCls) 및 13C-NMR ( 100 丽 z , CDCls) 데이터를 하기 표 1 및 표 2에 각각 나타내었다.
【표 1】
-匿 (400 MHz , CDCI3) 데이터
H 3 4
7.61 brs 7.66 brs 7.58 brs 7.56 brs 7,01 brs
2.78 m
3.40 dd
6.86 s 6.90 bis 2.56 d (19.2) 2.61 d (19,2)
(15.6,2.5)
2.48 dd
2.48 d (19.2) 2.40 d (19.2)
(15.6,5.0)
6
7 5.67 d (5.1) 5.66 d (4.5) 5.14 brs
8 4.01 d (4.2) 3.73 d (5.3) 3.25： brs 3.35 brs 2.03 brs
Q y
10 3.14 brs 3.31 m 3.25 brs 3.21 brs 3.51 m
u 2.36 m 2.20 m 2.14 m 2.21 m 1.73 m
12 5.45 d (10.1) 5.45 d (10.4) 5.40 d (10.3) 5.43 d (10.2) 5.58 l (10.4)
13
14 2.03 d (5.3) 1.85 1.08 d (5.2) 1.24 0.98 d (5.1)
Figure imgf000025_0001
【표 2]
¾C-匪 R (100 MHz, CDCls) 데이터
Figure imgf000026_0001
<실시예 4>세포 배양
인간 세포주 (K562, CRL2076)의 배양은 37°C, 5% C02의 습화된 조건하에서 수행하였다. 혈액 세포주 K562(인간 림프종 (human lymphoma)), U937(ATCC (Rockville, MD)), HMC-l(Dr. J. Butterfield (Mayo Clinic, Rochester, MN) 제공)과 표피상피세포인 CRL2076과 Hacat (인간 각질세포 (Human keratinocyte))는 ATCC(American Type Culture Col lect ion, Rockville, MD)로부터 구입'하였다. 또한， K562 세포， U937, HMC와 CRL2076, Hacat 세포는 10% 우아혈청 (Fetal Calf Serum, FCS)(HyClone, Logan, UT) , 2mML-글루타메이트 100 μ /νλί 페니실린, 100 g/i 스트랩토마이신 (Life Technologies)을 포함하는 DMEKLife Technologies, Karlsruhe, Germany) 배지에서 유지하였다.
<실험예 1>유동추출물에 의한 CD44의 발현 확인
<1-1> RT-PCR올 통한유동추출물에 의한 CD44의 mRNA 발현 확인 유동 추출물을 혈액세포인 K562, U937, HMC 세포와 상피세포인 A549, CRL2076 세포에 처리하여 각 세포에서 표피상피조직 내에 혈액 (면역)세포들의 모집 (recruitment)에 필요한 CD44 표지단백질의 mRNA 발현 및 단백질 발현 정도를 확인하였다.
구체적인 RT-PCR 방법은 하기와 같다. 총 RNA는 표준 프로토콜에 따라 분리하였고， cDNA는 제조자의 지시서에 따라 AccuScript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Stratagene)를 사용하여 합성하였다. 2단계 RT-PCR 반웅은 oligo-dT 프라이머와 역전사효소, 특이 프라이머 쌍과 Taq 폴리머라아제 (Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 하기와 같이 수행하였다. 합성한 1 μ ΐ의 cDNA를 0.5 U £ i¾7 DNA폴리머라아제， IX 완층제 (buffer) 및 1 mM dNTP mix(Takara)와 특이적 프라이머 쌍으로 이루어진 20 μ ΐ의 흔합액에 회석하였고, cDNA가 회석된 흔합액을 PCR반웅에 사용하였다. PCR반웅에 의한 증폭은 다음과 같은 조건에서 GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 사용하여 수행하였다; 94°C에서 5분， 이어서 94°C에서 45 초, 56°C에서 45 초 및 72°C에서 1 분올 25-40 사이클 행한 후, 최종 연장반웅은 72°C에서 7 분간 시행하였다. 표 3의 PCR 프라이머는 Primer3 program을 사용하여 디자인하였으며， Bioneer사 (대한민국， 대전)로부터 구입하였다.
【표 3】
PCR에 의해 cDNA증폭에 사용된 프라이머
Figure imgf000028_0001
PCR 생성물은 1.5% 아가로즈젤상에서 분리하여 에티듐 브로마이드 (ethidium bromide, EtBr)로 염색하여 Gel Doc 2000 UV trans-i 1 luminator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 시각화한 후에, Quantity One sof tware(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 분석하였다. 각 샘플들은 3회 이상 테스트하였으며 대표 데이터를 제시하였다.
유동 추출물을 혈액세포인 K562, U937, HMC 세포와 상피세포인 A549, CRL2076세포에 처리한 결과， 각 세포에서 표피상피조직 내에 혈액 (면역) 세포들의 모집 (recruitment)에 필요한 CD44 표지단백질의 mRNA의 발현이 유동추출물을 처리하였을 때 증가한 것을 확인하였다 (도 2A).
<1-2> FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)를 통한 유동추출물에 의한 CD44 단백질의 발현 확인
유동 추출물을 혈액세포인 K562, U937, HMC 세포와 상피세포인 A549, CRL2076세포에 처리하여 각 세포에서 표피상피조직 내에 혈액 (면역)세포들의 모집 (recruitment)에 필요한 CD44 표지 단백질의 발현 정도를 항— CD44 항체 ((Harlan SeraLab, Sussex, UK)와 FACS를 이용하여 확인하였다. 구체적인 FACS 방법은 하기와 같다. FACS 분석을 위해 각각의 세포에 유동 추출물을 15시간 동안 처리한 후 세포를 1% 포르알데히드로 고정시키고 항 -CD44-FITC 항체로 1시간 동안 배양하여 염색하고 FACScan유세포 분석기 (Becton Dickinson San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다.
FACS로 표면단백질을 분석한 결과， K562 세포 및 A549 세포에서 CD44 단백질의 발현도 증가되고 있음을 확인하였다 (도 2B). <실험예 2> RT-PCR을 통한 유동 추출물에 의한 HAS-2의 전사 유도 확인 표피상피세포인 CRL2076과 Hacat에서 히알루론산 합성효소 -2(hyaluronic acid synthase 2, HAS-2)의 생성과 관련된 mRNA 수준의 변화를 알아보기 위해 상기 <실험예 1>의 RT-PCR 방법올 이용하여 수행하였다. 상기 CRL2076과 Hacat 세포들을 1 ； «g/ml의 유동추출물 함께 15 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 용해시킨 후에 공지된 프로토콜에 따라 RNA를 분리하였다. RNA에 대해 poly A+프라이머와 함께 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. CD44, HAS-2에 대해 디자인된 프라이머를 PCR 증폭에 사용하였다 (표 4). GAPDH를 내부 표준으로 사용하였다.
【표 4】
PCR에 의해 cDNA증폭에 사용된 프라이머
Figure imgf000029_0001
그 결과 표피상피세포인 CRL2076과 Hacat에서 HAS-2의 생성이 유도되고 있음을 확인하였다 (도 3). 아울러， 상피세포에서 HAS-2의 생성이 0.5 /ml의 농도에서 증가하기 시작하였고， 처리 1 시간 후부터 전사활동의 증가 현상을 보였다 (도 3A, B 및 C).
<실험예 3> 유동추출물의 처리 농도와 시간에 따른 K562세포에서 CD44의 mRNA 발현 및 단백질 발현 정도 확인
상기 <실험예 1-1>의 RT-PCR 방법 및 <실험예 1-2〉의 FACS 방법을 이용하여 유동추출물의 처리 농도와 처리 시간에 따른 K562 세포에서 CD44의 mRNA 발현 및 단백질 발현 정도를 확인하였다.
그 결과， K562 세포에서 CD44 증가 현상은 유동추출물 0.1 ig/ml에서도 강하게 나타났고 (도 4A), 3 시간이 지나면서 전사물이 증가하기 시작하여 12 시간이 지나면 최대치의 전사 활성을 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 4B). FACS에서 표면 단백질의 변화를 분석한 결과， CD44단백질 발현도 같은 양상을 보이는 것을 확인하였다 (도 ).
<실험예 4>마우스에서 피부 개선 효과분석
실험에 사용된 쥐는 중앙실험동물 (한국)에서 구입하여 적웅을 위해 식이 제한 없이 사육 한 후 정상적인 5주령 수컷 Balb/C 생쥐 (mouse)로 대조군의 생쥐도 동일한 환경에서 사육하였고， 제모된 피부에 테잎 스트랩핑 (tape strapping)을 시도하여 인위적으로 약간의 피부손상을 유발한 후 유동추출물을 처리함으로써 피부의 재생과 피부탄력을 분석하였다. 이때 그룹당 생쥐는 10마리씩 2번 반복으로 실험하였다.
그 결과， 정상적인 피부로 빠른 시간 내에 환원됨과 동시에 피부의 탄력과 윤기를 확인하였다. 이상의 실험에서 유동 추출물이 피부세포의 활성을 유도하고 피부조직의 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)의 한 종류인 하이알루론산 (hyaluronic acid)의 생성을 촉진시킴으로써, 피부의 주름 현상을 억제하여 주름방지와 피부의 활성을 유도하는 우수한 효과를 보이는 것을 확인하였다 (도 5).
<제조예 1> 약제의 제조
1. 산제의 제조
유동추출물 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 디테르펜계 화합물
500 ng 유당 1 g 상기의 성분을 흔합하고 기밀포에 층진하여 산제를 제조하였다. 2. 정제의 제조
유동추출물， 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 디테르펜계 화합물
500 ng 옥수수전분 100 mg o
ΤΓ당 100 nig 스테아린산 마그네슘 2 mg 상기의 성분을 흔합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
유동추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 디테르펜계 화합물
500 ng 옥수수전분 100 mg 유당 100 mg 스테아린산 마그네슘 2 mg 상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡술제를 제조하였다. 4. 주사제의 제조
유동추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 디테르펜계 화합물
500 ng 만니를 180 rag
Na2HP04 · 2H20 26 nig 증류수 2974 rag 통상적인 주사제의 제조방법에 따라， 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.
<제조예 2> 건강식품의 제조
1. 건강식품의 제조
유동추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 디테르펜계 화합물
500 ng 비타민 흔합물 적량 비타민 A 아세테이트 70 iig 비타민 E 1.0 mg 비타민 0.13 mg 비타민 B2 0.15 mg 비타민 B6 0.5 rag 비타민 B12 0.2 /zg 비타민 C 10 mg 비오틴 10 fig 니코틴산아미드 1.7 rag 엽산 50 mg 판토텐산 칼슘 0.5 rag 무기질 흔합물 ᄀ a 황산제 1철 1.75 mg 산화아연 0.82 mg 탄산마그네슘 25.3 rag 제 1인산칼륨 15 mg 제 2인산칼슘 55 mg 구연산칼륨 90 mg 탄산칼슘 100 rag 염화마그네슘 24.8 mg 상기의 비타민 및 미네랄 흔합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합 조성하였지만， 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며， 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음，과립을 제조하고,통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
2. 건강 음료의 제조 유동추출물， 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 디테르펜계 화합물
500 ng 구연산 1000 nig 을리고당 100 g 매실농축액 2 g 타우린 1 g 정제수를 가하여 전체 900 통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음， 약 1 시간 동안 85°C에서 교반 가열한 후， 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다. ᅳ 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합 조성하였지만 수요계층이나， 수요국가， 사용용도 등 지역적， 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
<제제예 3>화장료조성물의 제조
1. 크림의 제조
세토스테아릴알코을 2.8 중량부 밀납 2.6 중량부 스테아린산 1.4 중량부 친유형모노스테아린산글리세린 2 중량부 피이지 -100 스테아레이트 1 중량부 세스퀴올레인산소르비탈 1.4 중량부 호호바오일 4 중량부 스쿠알란 3.8 중량부 폴리소르베이트 60 1.1 중량부 마카다이아오일 2 중량부 초산토코페롤 0.2 중량부 메칠폴리실톡산 0.4 중량부 에칠파라벤 0.1 중량부 프로필파라벤 0.1 중량부
Euxyl K-400 0.1 중량부
1ᅳ3-부칠렌글리콜 7 중량부 메칠파라벤 0.05 중량부 글리세린 6 증량부 d-판데놀 0.2 중량부 유동추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 디테르펜계 화합물
4.6 중량부 트리에탄을아민 0.2 증량부 pt 41891 0.2 중량부 p-H20 46.05 중량부
2. 로션의 제조 '
세토스테아릴알코을 1.6 중량부 스테아린산 1.4 중량부 친유형모노스테아린산글리세린 1.8 중량부 피이지 -100 스테아레이트 2.6 중량부 세스퀴을레인산소르비탈 0.6 중량부 스쿠알렌 4.8 중량부 마카다이아오일 2 중량부 호호바오일 2 중량부 초산토코페를 0.4중량부 메칠폴리실록산 0.2 중량부 에칠파라벤 0.1 중량부 프로필파라벤 0.1 중량부 1 ,3-부칠렌글리콜 4 중량부 메칠파라벤 0.1 중량부 산탄검 0.1 중량부 글리세린 4 중량부 d-판데놀 0.15 중량부 알란토인 0.1 중량부 유동추출물， 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 디 테르펜계 화합물
3.5 중량부 카르보머 (2% aq. Sol ) 4 중량부 트리에탄을아민 0.15 중량부 에탄올 3 중량부 pt 41891 0.1 중량부 p-H20 . 48.3 중량부

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
유동 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 추출물은 물, 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 흔합물을 용매로 사용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 유동 추출물은 유동의 꽃, 줄기， 잎 또는 열매로부터 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 분획물은 핵산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 유기용매를 이용하여 수득된 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서, 상기 유동 추출물 또는 이의 분획물은 피부 재생, 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물.
【청구항 6】
유동 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 건강 식품.
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 유동 추출물 또는 이의 분획물은 피부 재생, 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 건강 식품.
【청구항 8】
유동 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물.
【청구항 9】
제 8항에 있어서, 상기 유동 추출물 또는 이의 분획물은 피부재생, 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물.
【청구항 10]
하기 화학식 1로 표시되는 디테르펜계 (diterpene) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물:
[화학식 1]
Figure imgf000037_0001
(상기 화학식 1에 있어서, 는 단일 또는 이중 결합이고， 이때 상기
―.가 이웃하는 경우 적어도 하나는 단일 결합이고，
R1은 비치환 또는 하이드록시로 치환된 C1-C4의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고,
R2는 H또는 하이드록시이고， 및
R3는 H또는 0이되， 상기 0는 rr^가 이중결합인 경우에 치환된다)/
【청구항 11】
제 10항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2 내지 화학식 6으로 표시되는 군으로부터 선택되는 1종인 것올 특징으로 하는 피부 노화 방지 및 개선용 약학적 조성물:
[화학식 2] [화학식 3]
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
【청구항 12】
제 10항에 있어서, 상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물은 유동 추출물로부터 분리한 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물.
【청구항 13]
제 10항에 있어서, 상기 화합물은 피부재생, 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물.
【청구항 14】
상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 건강 식품.
【청구항 15]
제 14항에 있어서， 상기 화합물은 피부재생， 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 건강 식품.
【청구항 16]
상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물.
【청구항 17】
제 16항에 있어서, 상기 화합물은 피부재생, 주름 개선 또는 보습 강화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물.
【청구항 18】
유동 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 및 개선 방법.
【청구항 19】
상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부노화 방지 및 개선 방법.
【청구항 20】
피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물로 사용하기 위한 유동 추출물 또는 이의 분획물의 용도.
【청구항 21]
피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물로 사용하기 위한 상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
【청구항 22]
피부노화 방지 및 개선용 화장료 약학적 조성물로 사용하기 위한 유동 추출물 또는 이의 분획물의 용도.
【청구항 23】
피부노화 방지 및 개선용 화장료 조성물로 사용하기 위한 상기 화학식 1의 디테르펜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
PCT/KR2013/004766 2012-05-30 2013-05-30 유동추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 개선용 약학적 조성물 WO2013180490A1 (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104083354A (zh) * 2014-07-08 2014-10-08 李玉芬 一种含有佛波醇型二萜化合物的组合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010077123A (ja) * 2008-08-29 2010-04-08 Hayashikane Sangyo Kk メイラード反応阻害剤
US20110293751A1 (en) * 2009-02-06 2011-12-01 Keith Coupland Composition for Treatment of Skin

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010077123A (ja) * 2008-08-29 2010-04-08 Hayashikane Sangyo Kk メイラード反応阻害剤
US20110293751A1 (en) * 2009-02-06 2011-12-01 Keith Coupland Composition for Treatment of Skin

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHO, S. ET AL.: "Red ginseng root extract mixed with Torilus fructus and Corni fructus improves facial wrinkles and increases type I procollagen synthesis in human skin: a randomized, double-blind, placebo-controlled study", JOURNAL OF MEDICINAL FOOD, vol. 12, no. 6, 2009, pages 1252 - 1259 *
KIM, S. -S. ET AL.: "In vitro screening of Jeju medicinal plants for cosmeceutical materials", JOURNAL OF APPLIED BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 50, no. 4, 2007, pages 215 - 220 *
PEI, Y. -H. ET AL.: "Tigliane diterpene esters with IFN y-inducing activity from the leaves of Aleurites fordii.", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 22, 31 January 2012 (2012-01-31), pages 2318 - 2320 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104083354A (zh) * 2014-07-08 2014-10-08 李玉芬 一种含有佛波醇型二萜化合物的组合物

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