WO2013170940A1 - Mikroskop und mikroskopieverfahren - Google Patents

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WO2013170940A1
WO2013170940A1 PCT/EP2013/001350 EP2013001350W WO2013170940A1 WO 2013170940 A1 WO2013170940 A1 WO 2013170940A1 EP 2013001350 W EP2013001350 W EP 2013001350W WO 2013170940 A1 WO2013170940 A1 WO 2013170940A1
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Thomas Kalkbrenner
Ralf Netz
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    • G02B26/06—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the phase of light

Definitions

  • the temporal focus modulation technique is a method in fluorescence microscopy that allows fast switching between different focus fields. This is especially important if you only want to influence the light in the focus of a lens.
  • FMM temporal focus modulation technique
  • this method relies on the rapid switching of the optical phase in the pupil of a lens. So far, it has been shown that the phase is switched to two half-pupils.
  • the circuit between the optical phases of other partial beams in the pupil Similar to the described Halbpupillenscrien can be advantageously used, the circuit between the optical phases of other partial beams in the pupil.
  • Figure 1 shows the temporal switching between two focus states that cause a modulation of the fluorescence only in focus.
  • the figure shows an example of two focus states in the cross section between which can be switched. It can be clearly seen that one of the states has a zero on the optical axis. Outside the focus, the zero disappears.
  • Figure 2 shows an embodiment of the mentioned type of focus modulation on the basis of an electro-optical polarization rotator and Figure 3 possible associated variants of the phase plate, which lead to a focus modulation.
  • Fig. 2 shows such a fast optical mode switch, based on an arranged in the illumination beam path electro-optic modulator EOM and passive phase elements PP.
  • the element PP is in operative connection with the EOM, which causes a rapid rotation of the polarization direction of the incident light beam L, usually a linearly polarized laser beam by appropriate control.
  • the light beam After passage through PP, the light beam, as in the arrangements shown below, continues in the direction of the microscope M via a scanning unit, not shown, to the sample, as is known from the prior art. Due to the half-sided phase change through the plate PP, the light beam undergoes FMM-typical field modulation.
  • phase plates shown in Fig. 3 are only examples. In principle, different geometries are conceivable here.
  • the passive phase elements shown by way of example each consist of a combination of a birefringent crystal, a phase plate PP in the form of a split ⁇ / 2 plate, and a component which is polarization-independent with respect to the phase, for example formed as glass (FIG. 3).
  • the phase plate is aligned so that the fast direction of the crystal is advantageously aligned parallel or perpendicular or at a further optimized angle to the incident laser polarization.
  • Fig. 3 various modifications of the phase plate PP are shown, a half-sided division into a ⁇ / 2 half and a glass half in PP_1, a quarter division in opposite ⁇ / 2 quarters and glass quarters in PP_2, an outer K / 2 ring and an inner glass core in PP_3 and vice versa an outer glass ring and an inner KI2 core in PP_4.
  • Glass is listed here only as an example.
  • Amorphous quartz (Suprasil) or other non-birefringent materials can also be used.
  • the orientation of the extraordinary axis of the respective KI2 part is shown by way of example in FIG. 3, PP_1 as an arrow. Pass a parallel to this Arrow direction polarized light beam of this element, a phase shift is generated in the ⁇ / 2 part by half a wavelength relative to the glass part. If, however, its polarization is oriented perpendicular to the direction of the arrow, no relative phase delay is generated.
  • the polarization state can be varied in time, for example, either sinusoidally or rectangularly or in another advantageous waveform.
  • the transition between the spatial field distributions in the focus of the microscope is influenced differently in time.
  • the intrinsic laser modulation frequency of the pulsed light source can be utilized for generating the focus modulation, and indeed cost-effectively and without great technical effort.
  • the light source already carries the modulation frequency itself and it is advantageously possible to dispense with the fast switches shown above.
  • the technical complexity can thus be significantly reduced if, according to the invention, only passive elements for phase modulation are used.
  • FIG. 4 shows an advantageous embodiment of the focus modulation taking advantage of the intrinsic laser modulation frequency or repetition rate.
  • a pulsed laser L here deflected via a deflection mirror Us in the optical illumination beam path of a microscope, which is shown here only schematically with reference to the microscope objective O and the sample plane PR.
  • means for example main beam splitter, not shown here, are provided in the detection direction behind the objective in order to deflect the sample light in the direction of a detection (not shown).
  • the illumination side of the objective upstream scanning means to perform a focused by O illumination beam, a beam distribution or a lighting line in one - or two directions over the sample, which descains from the sample light in the direction of detection backwards before the suppression in the direction of detection Be run through detection again.
  • the laser L emits the short pulse Pu is a ⁇ / 2 plate Wp downstream.
  • the illumination light L reaches a first polarization beam splitter Pst1 and is split into two pulsed components Pu1 and Pu2.
  • the one transmitted component Pu1 passes through a preferably in the objective pupil or a conjugate to their planes arranged phase plate PP of the pulse chain Pu1 and a second pole divider Pst2 in the direction of the sample through the lens O.
  • the second pulse train Pu2 is reflected at S1 and passes via deflection mirror S2 and S2 delayed in time with respect to Pu1 to the second pole splitter Pst2 and is also deflected at the latter in the direction of the sample via the objective O.
  • the linear polarization of the light pulses from the laser is polarized by means of ⁇ / 2 or ⁇ / 4 plate so that the polarization beam splitter Pst1 divides the incoming pulse train into two parts of the same energy partial beams or two pulse trains. These two partial beams differ only in polarization.
  • one of these pulse trains also passes through the phase plate PP in the pupil (Fig. 3) in order to generate a spatially modulated illumination pattern in the lens focus (with zero on the axis).
  • the two pulse trains are temporally shifted from each other, e.g. by half the repetition time, and if possible half the repetition time should not be less than the fluorescence lifetime, i. Repetition rates ⁇ 100 MHz are recommended.
  • the time delay is due to different light paths in the
  • Partial beam paths which can be preferably adjusted by displacement of the mirror S1, S2 perpendicular to the optical axis.
  • Fluorescence signal in the focus of the lens, the mod. Frequency is due to the
  • the time-modulated focus signal can be detected by means of phase-sensitive lock-in technology or BOX-CAR integration
  • phase plates PP As phase plates PP, the embodiments described in Fig. 3
  • a pulsed laser can also be a CW laser which is switched off by appropriate switching means.
  • a similar cost-effective structure using CW laser sources L and two AOM 1, 2 can be created.
  • An example of this principle is shown in Fig. 5: After the beam splitting by a polarization beam splitter Pst1 the light passes through (transmits and reflects) an acousto-optic modulator (AOM1 and AOM2) and respectively beam matching optics Bo1, 2 where the respectively used advantageous first diffraction order in the direction of the sample PR and the two AOMs the light with a frequency> 10 MHz each on and off and are connected so that the amplitudes are out of phase with each other by D / 2.
  • the AOMs are used for pulsed switching on and off of the laser beam in the two light paths.
  • the amplitude modulation in the two light paths can be designed in the course of time, for example sinusoidal or rectangular.

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Description

Titel: Mikroskop und Mikroskopieverfahren
Stand der Technik:
Literatur / Patente:
[1] Chen et al., Opt. Express 16, 18764 (2008)
[2] Wong et al., Appl. Opt. 48, 3237 (2009)
[3] WO2009/008838
[4] A. Leray and J. Mertz, Opt. Express 14, 10565 (2006)
[5] DE102011013613, DE102010013829
[6] EP500717 B2 Zweiphotonenmikroskopie
[7] Sueda et al., Opt. Express 12, 3548 (2004)
[8] Chong et al., Biomedical Optics Expres Vol.1 No. 3
[9] Israel Rocha-Mendoza, Wolfgang Langbein, Peter Watson, and Paola Borri, "Differential coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy with linearly chirped femtosecond laser pulses," Opt. Lett. 34, 2258-2260 (2009)
Die zeitliche Fokusmodulationstechnik (FMM) ist eine Methode in der Fluoreszenzmikroskopie die das schnelle Schalten zwischen verschiedenen Fokusfeldern ermöglicht. Dies ist insbesondere dann wichtig, wenn man nur das Licht im Fokus eines Objektivs beeinflussen möchte. Hier wurde bereits in der Literatur eine Methode demonstriert, mit welcher eine dreidimensionale Abbildung von optisch dicken Proben bei gleichzeitiger Diskriminierung von Hintergrundlicht möglich wird [1- 4].
Die Grundlage ist hierbei, dass eine Eigenschaft (z.B. die Fluoreszenz), welche im Wesentlichen im Fokus generiert wird, zeitlich derart beeinflusst wird, dass diese Eigenschaft (Fluoreszenz) außerhalb des Fokus nicht moduliert wird.
Bislang beruht diese Methode auf dem schnellen Schalten der optischen Phase in der Pupille eines Objektivs. Gezeigt wurde bislang vor allem, dass man die Phase in zwei Halbpupillen schaltet.
Ähnlich der geschilderten Halbpupillenschaltung kann vorteilhaft auch die Schaltung zwischen den optischen Phasen anderer Teilstrahlen in der Pupille genutzt werden. Zudem ist es vorteilhaft möglich, nicht nur die Phasen, sondern generell die Feldmodenschaltung zu nutzen, um eine zeitliche Modulation der Emission aus dem Fokalvolumen zu generieren, wobei die Strahlung außerhalb des Fokalvolumens zeitlich nicht moduliert wird.
Abbildung 1 zeigt das zeitliche Schalten zwischen zwei Fokuszuständen, die eine Modulation der Fluoreszenz lediglich im Fokus bewirken.
Die Abbildung zeigt ein Beispiel für zwei Fokuszustände im Querschnitt zwischen denen geschaltet werden kann. Man erkennt deutlich, dass einer der Zustände eine Nullstelle auf der optischen Achse besitzt. Außerhalb des Fokus verschwindet die Nullstelle.
Neben der reinen Phasenschaltung in der Pupille wird zudem die Schaltung der Polarisation in Kombination mit einer Phasenplatte als eine weitere Möglichkeit vorgeschlagen [5], um die aus dem Fokalvolumen kommende Strahlung zu modulieren.
Abbildung 2 zeigt eine Ausführungsform der genannten Art von Fokusmodulation auf der Basis eines elektro-optischen Polarisationsdrehers und Abbildung 3 mögliche dazugehörige Varianten der Phasenplatte, die zu einer Fokusmodulation führen. Hierzu wird auf die ältere Anmeldung DE102011013613 sowie auf DE102010013829 verwiesen.
Alle infrage kommenden Fokusmodulationstechniken profitieren von Modulationsfrequenzen von mehreren MHz. Damit sind sie grundsätzlich für einen vorteilhaften Einsatz in Laser-Scanning Mikroskopen (LSM) zur Erhöhung der Eindringtiefe ohne Einbußen in der Scangeschwindigkeit geeignet. Eine weitere Erhöhung der Geschwindigkeit ergibt sich durch eine Parallelisierung mittels Multispotmikroskopie. Allerdings ist eine langsamere Modulation immer auch möglich und kann entsprechend eingestellt werden.
Wegen der vorteilhaften hohen Modulationsfrequenzen kommen im Wesentlichen schnell schaltende opto-elektronische Elemente wie zum Beispiel AOMs und EOMs in Frage. Diese Bauelemente sind in der Lage, die Polarisation zeitlich sehr schnell schalten zu können, wodurch polarisationsabhängige Phasenhübe in verschiedenen räumlichen Bereichen, vorzugsweise in einer Objektivpupille, eingeführt werden (Abb. 2). Es ist also möglich, durch eine Schaltung des Polarisationszustandes eine Umschaltung der Phasen zu erzielen. Mit diesen Lösungen kann eine Eigenschaft geschaltet werden, die sich am Ende im Wesentlichen auf das Feld im Fokus auswirkt und in dessen Resultat das Fokusfeld moduliert wird, während die wesentlichen außerfokalen Anteile nicht signifikant moduliert werden.
Abb. 2 zeigt einen derartigen schnellen optischen Modenschalter, basierend auf einem im Beleuchtungsstrahlengang angeordneten elektrooptischen Modulator EOM und passiven Phasenelementen PP. Das Element PP ist in Wirkverbindung mit dem EOM, der durch entsprechende Ansteuerung eine schnelle Drehung der Polarisationsrichtung des einfallenden Lichtstrahls L, meist eines linear polarisierten Laserstrahls, bewirkt. Nach Durchgang durch PP verläuft der Lichtstrahl, wie auch in den im Weiteren dargestellten Anordnungen, in Richtung des Mikroskops M, über eine nicht dargestellte Scaneinheit zur Probe weiter, wie es auch aus dem Stand der Technik bekannt ist. Durch die halbseitige Phasenänderung durch die Platte PP erfährt der Lichtstrahl die FMM-typische Feldmodulation.
Die in Abb. 3 gezeigten Phasenplatten sind nur beispielhaft. Prinzipiell sind hier verschiedene Geometrien denkbar. Die beispielhaft gezeigten passiven Phasenelemente bestehen hier jeweils aus einer Kombination eines doppelbrechenden Kristalls, dargestellt ist eine Phasenplatte PP in Form einer geteilten λ/2-Platte, und einer bezüglich der Phase polarisationsrichtungs- unabhängigen Komponente beispielweise als Glas ausgebildet (Abb. 3). Dabei ist die Phasenplatte so ausgerichtet, dass die schnelle Richtung des Kristalls vorteilhaft parallel bzw. senkrecht oder in einem weiteren optimierten Winkel zur eingestrahlten Laserpolarisation ausgerichtet wird.
In Abb. 3 sind verschiedene Modifikationen der Phasenplatte PP dargestellt, eine halbseitige Teilung in eine λ/2 Hälfte und eine Glashälfte in PP_1 , eine Viertelteilung in gegenüberliegende λ/2 Viertel und Glasviertel in PP_2, einen außenliegenden K/2 Ring und einen inneren Glaskern in PP_3 und umgekehrt einen außenliegenden Glasring und einen innenliegenden KI2 Kern in PP_4.
Glas ist hier nur beispielhaft aufgeführt. Auch amorphes Quarz (Suprasil) oder andere nicht doppelbrechende Materialien können zum Einsatz kommen.
In Fig 3, PP_1 beispielhaft als Pfeil dargestellt ist die Orientierung der außerordentlichen Achse des jeweiligen KI2 Teils. Durchtritt ein parallel zu dieser Pfeilrichtung polarisierter Lichtstrahl dieses Element, wird im λ/2 Teil eine Phasenverschiebung um eine halbe Wellenlänge relativ zum Glasteil erzeugt. Ist dessen Polarisation hingegen senkrecht zur Pfeilrichtung orientiert, wird keine relative Phasenverzögerung erzeugt.
Es ist hinzuzufügen, dass z.B. auch nematische Kristalle, welche aber langsamer reagieren, oder Aufbauten, die über eine Wegaufteilung eine unterschiedliche Polarisation erzeugen und dieser Weg z.B. über einen AOM/AOTF schnell wechselt, zur gewünschten Veränderung der Polarisation verwendet werden können.
Generell kann der Polarisationszustand zeitlich beispielsweise entweder sinusförmig oder rechteckförmig oder in einer anderen vorteilhaften Wellenform variiert werden. Hierdurch wird der Übergang zwischen den räumlichen Feldverteilungen im Fokus des Mikroskops zeitlich verschieden beeinflusst.
Die Vorteile der FMM lassen sich wie folgt zusammenfassen:
• Erhöhung der Eindringtiefe durch Reduzierung des außerfokalem Streulichts
• Optisches Schneiden - Reduzierung des Fluoreszenzvolumens
• Erhöhung der optischen Auflösung
Es ist nun insbesondere anhand der Abbildungen 2 und 3 zu erkennen, dass ein größerer technischer Aufwand zur Umsetzung der Fokusmodulation betrieben werden muss. Das Anliegen der Erfindung ist es daher, einen einfacheren, kostengünstigen Lösungsvorschlag zur Fokusmodulation zu realisieren.
Lösung
Erfindungsgemäß ist nun erkannt worden dass überraschend die intrinsische Laser- Modulationsfrequenz der gepulsten Lichtquelle zur Erzeugung der Fokusmodulation ausgenutzt werden kann und zwar kostengünstig und ohne großen technischen Aufwand.
Verwendet man eine gepulste Beleuchtungsquelle, so bringt vorteilhaft die Lichtquelle die Modulationsfrequenz schon selbst mit und man kann vorteilhaft auf die oben dargestellten schnellen Schalter verzichten. Der technische Aufwand kann also deutlich verringert werden, wenn man erfindungsgemäss nur passive Elemente zur Phasenmodulation einsetzt.
Ähnliche Verfahren sind zwar bereits für andere optische Zwecke beschrieben worden. In [9] ist beispielsweise eine passive Anordnung für die Modulation in der CARS-Mikrospektroskopie angegeben. Allerdings wird hier nicht die optische Phase moduliert, sondern es wird ein zeitlich variierender zeitlicher Abstand zwischen je zwei Laserpulsen eingeführt, welcher durch Veränderung zu verschiedenen Beiträgen im resultierenden CARS-Signal sorgt.
Es ist jetzt erfindungsgemäß erkannt worden, dass mit passiven Elementen allein eine Modulation der optischen Phase möglich ist, wobei die Modulation im MHz- Bereich liegen kann, wenn der Laser eine entsprechend hohe Repetitionsrate aufweist.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der schematischen Zeichnungen näher beschrieben.
Abbildung 4 zeigt eine vorteilhafte Ausführung der Fokusmodulation unter Ausnutzung der intrinsischen Lasermodulationsfrequenz bzw. Repetitionsrate.
In Abb. 4 wird ein gepulster Laser L, hier über einen Umlenkspiegel Us in den optischen Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops umgelenkt, das hier nur schematisch anhand des Mikroskopobjektives O und der Probenebene PR dargestellt ist.
Im von der Probe kommenden Strahlengang mit Probenlicht sind hier nicht dargestellte Mittel (z.B. Hauptstrahlteiler) in Detektionsrichtung nach dem Objektiv vorgesehen, um das Probenlicht in Richtung einer nicht dargestellten Detektion umzulenken.
Weiterhin nicht dargestellt sind beleuchtungsseitig dem Objektiv vorgeordnete Scanmittel um einen durch O fokussierten Beleuchtungsstrahl, eine Strahlverteilung oder eine Beleuchtungslinie in ein - oder zwei Richtungen über die Probe zu führen, die vom Probenlicht in Richtung der Detektion rückwärts vor der Ausblendung in Richtung der Detektion zur descannten Detektion wieder durchlaufen werden.
Dem Laser L der kurze Pulse Pu aussendet ist eine λ/2-Platte Wp nachgeordnet. Das Beleuchtungslicht L gelangt auf einen ersten Polarisationsstrahlteiler Pst1 und wird in zwei gepulste Komponenten Pu1 und Pu2 aufgespalten. Die eine transmittierte Komponente Pu1 gelangt über eine vorzugsweise in der Objektivpupille oder einer zu ihr konjugierten Ebenen angeordnete Phasenplatte PP der Pulskette Pu1 und einen zweiten Polteiler Pst2 in Richtung der Probe über das Objektiv O.
Die zweite Pulskette Pu2 wird an S1 reflektiert und gelangt über Umlenkspiegel S2 und S2 zeitlich verzögert gegenüber Pu1 zum zweiten Polteiler Pst2 und wird an diesem ebenfalls in Richtung der Probe über das Objektiv O umgelenkt.
Abbildung 4 zeigt somit das Prinzip der vorliegenden Erfindung:
1. Die lineare Polarisation der Lichtimpulse aus dem Laser wird mittels λ/2- oder λ/4-Platte so polarisiert, dass der Polarisationsstrahlteiler Pst1 den ankommenden Impulszug in zwei seitens der Energie gleiche Teilstrahlen bzw. zwei Impulszüge aufteilt. Diese beiden Teilstrahlen unterscheiden sich nur in der Polarisation.
2. Einer dieser Impulszüge durchläuft jedoch zusätzlich die Phasenplatte PP in der Pupille (Abb. 3), um ein räumlich moduliertes Beleuchtungsmuster im Objektivfokus (mit Nullstelle auf der Achse) erzeugen zu können.
3. Außerdem werden die beiden Impulszüge zeitlich gegeneinander verschoben, z.B. um die Hälfte der Repetitionszeit, und wenn möglich sollte die halbe Repetitions- zeit die Fluoreszenzlebensdauer nicht unterschreiten, d.h. Repetitionsraten < 100 MHz sind empfehlenswert.
Die zeitliche Verzögerung erfolgt durch unterschiedliche Lichtwege in den
Teilstrahlengängen, die durch Verschiebung der Spiegel S1 , S2 senkrecht zur optischen Achse vorzugsweise auch einstellbar sein kann.
Nach dem Polteiler PST2 erfolgt in zeitlicher Abfolge, wie dargestellt, ein Wechsel zwischen den Impulsen PU2 und den durch PP beeinflussten Pulszügen mit teilweise verzögerter Phasenlage nach dem FMM Prinzip.
Im Objektivfokus (in der Probe) treffen diese Pulszüge im Wechsel auf.
Durch das in Abb. 4 skizzierte Prinzip kommt es zur zeitlichen Modulation des
Fluoreszenzsignals im Fokus des Objektivs, die Mod .-Frequenz ist durch die
Repetitionsrate des Lasers gegeben. Das zeitlich modulierte Fokus-Signal kann mittels phasensensitiver Lock-In-Technik oder BOX - CAR - Integration der
Differenzsignale der beiden Extrempunkte rekonstruiert werden.
Als Phasenplatten PP können die in Abb. 3 beschriebenen Ausführungen
Verwendung finden. Als gepulster Laser kann auch ein CW Laser dienen der durch entsprechende schelle Schaltmittel an- uns ausgeschaltet wird.
Es ist zu ergänzen, dass auf Basis des Aufbaus in Abb. 4 ein ähnlich kostengünstiger Aufbau unter Verwendung von CW-Laserquellen L und zweier AOM 1 , 2 geschaffen werden kann. Ein Beispiel zu diesem Prinzip ist in Abb. 5 angegeben: Nach der Strahlteilung durch einen Polarisationsstrahlteiler Pst1 durchläuft das Licht jeweils (transmittiert und reflektiert) einen akusto-optischen Modulator (AOM1 bzw. AOM2) sowie jeweils Strahlanpassungsoptiken Bo1 ,2 wobei die jeweils vorteilhaft genutzte erste Beugungsordnung in Richtung der Probe PR gelangt und die beiden AOMs das Licht mit einer Frequenz > 10 MHz jeweils an- und ausschalten und so verschaltet sind, dass die Amplituden um D/2 phasenverschoben zueinander sind. Im Gegensatz zur Literatur [8] dienen hier die AOM zum gepulsten Ein- bzw. Ausschalten des Laserstrahls in den beiden Lichtwegen.
Auf diese Weise entsteht hinter dem Strahlteiler Pst 2 wiederum, zeitlich versetzt, die Pulsabfolge wie in Fig. 4.
Die Amplitudenmodulation in den beiden Lichtwegen kann im zeitlichen Verlauf beispielsweise sinus- oder rechteckförmig gestaltet sein.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die in den Abbildungen 4 und 5 dargestellte Methode sowohl in der linearen als auch in der nicht-linearen Mikroskopie funktioniert, d.h. auf Ein-Photon-Prozesse als auch auf Mehr-Photonen-Prozesse (Second Harmonie Generation - SHG, Third Harmonie Generation - THG, Two-Photon-Absorption - TPA [6], Coherent Anti-Stokes-Raman Scattering - CARS) anwendbar ist, wobei die Methode in Abb. 4 (gepulste Laserlichtquelle) im Fall von Mehr-Photonen- Wechselwirkung aufgrund der höheren Peak-Intensität im Objektivfokus einfacher zu verwertbaren Signalen führt.
Mit weiteren Verfahren kann diese Methode vorteilhaft kombiniert werden:
• Punktscannenden Hochauflösungsverfahren: stimulated emission depletion (STED) microscopy, reversible saturable optical (fluorescence) transitions (RESOLFT) microscopy, saturated patterned excitation microscopy (SPEM) und struetured Illumination microscopy (SIM)
• FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Claims

Patentansprüche
1.
Mikroskop, vorzugsweise Laser-Scanning-Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der in einem Teilbereich entlang seines Querschnitts mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang und mindestens einem Mittel zur Demodulation,
wobei ein gepulster Beleuchtungsstrahl vorliegt und im Beleuchtungsstrahlengang vor dem Mikroskopobjektiv ein erster Polarisationsstrahlenteiler vorgesehen ist der mindestens einen ersten und zweiten Teilstrahlengang erzeugt ,die, vorzugsweise einstellbar, unterschiedliche Lichtwege aufweisen und ein Vereinigungselement, vorzugsweise ein zweiter Polteiler, zur Wiedervereinigung der Teilstrahlen vorgesehen ist wobei in einem Teilstrahlengang ein Phasenelement vorgesehen ist das mindestens zwei Bereiche mit unterschiedlicher Phasenbeeinflussung aufweist.
2.
Mikroskop nach Anspruch 1 , wobei der Beleuchtungsstrahl durch einen gepulsten Laser gebildet ist.
3.
Mikroskop nach Anspruch 1 , wobei der Beleuchtungsstrahl durch einen hochfrequent an- und ausgeschalteten CW Laser gebildet ist.
4.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Phasenelement eine Phasenplatte ist.
5.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Phasenplatte einen Bereich oder Bereiche mit im Wesentlichen nicht beeinflusster Phase und einen Bereich oder Bereiche mit beeinflusster Phase aufweist.
6.
Mikroskop nach Anspruch 5, wobei der Bereich oder die Bereiche mit beeinflusster Phase mindestens eine lambda / halbe Platte ist.
7.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zur Demodulation elektronische Mittel wie eine lock-in Verstärkung vorgesehen sind oder eine Änderung der Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation erfolgt.
8.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Phasenplatte in Lichtrichtung vor dem ersten Polteiler zur Polarisationsänderung zur Änderung der Lichtaufteilung zwischen den Teilstrahlen drehbar ausgebildet ist.
9.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Phasenplatte ein räumlicher Lichtmodulator (SLM, Spatial Light Modulator) ist.
10.
Mikroskopieverfahren, wobei mindestens ein Beleuchtungsstrahl in einem Teilbereich entlang seines Querschnitts mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und über Mikroskopobjektiv zur Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe fokussiert wird
Und über Detektionsstrahlengang und mindestens einem Mittel zur Demodulation eine Detektion erfolgt,
wobei ein gepulster Beleuchtungsstrahl zur Beleuchtung dient und im Beleuchtungsstrahlengang vor dem Mikroskopobjektiv ein erster Polarisationsstrahlenteiler vorgesehen ist der mindestens einen ersten und zweiten Teilstrahlengang erzeugt ,die, vorzugsweise einstellbar, unterschiedliche Lichtwege aufweisen und die über ein Vereinigungselement, vorzugsweise einen zweiter Polteiler, vereinigt werden, wobei in einem Teilstrahlengang ein Phasenelement in mindestens zwei Bereichen die Phase unterschiedlich beeinflusst. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Beleuchtungsstrahl durch einen gepulsten Laser gebildet ist.
12.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Beleuchtungsstrahl durch einen hochfrequent an- und ausgeschalteten CW Laser gebildet ist.
13.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei als Phasenelement eine Phasenplatte eingesetzt wird.
14.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Phasenplatte einen Bereich oder Bereiche mit im Wesentlichen nicht beeinflusster Phase und einen Bereich oder Bereiche mit beeinflusster Phase aufweist.
15.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Bereich oder die Bereiche mit beeinflusster Phase mindestens eine lambda / halbe Platte ist.
16.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Demodulation durch elektronische Mittel wie eine lock-in Verstärkung erfolgt
oder eine Änderung der Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation erfolgt.
17.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Phasenplatte in Lichtrichtung vor dem ersten Polteiler zur Polarisationsänderung zur Änderung der Lichtaufteilung zwischen den Teilstrahlen gedreht wird.
18.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Phasenplatte ein räumlicher Lichtmodulator (SLM, Spatial Light Modulator) ist.
19.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der in einem Teilbereich entlang seines Querschnitts mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang und mindestens einem Mittel zur Demodulation, wobei der Beleuchtungsstrahl durch einen kontinuierlich ausstrahlenden CW- Laser gebildet wird
und im Beleuchtungsstrahlengang vor dem Mikroskopobjektiv ein Polarisationsstrahlenteiler vorgesehen ist der einen ersten und zweiten Teilstrahlengang erzeugt und ein Vereinigungselement zur Wiedervereinigung der Teilstrahlen vorgesehen ist wobei in einem Teilstrahlengang ein Phasenelement vorgesehen ist das mindestens zwei Bereiche mit unterschiedlicher Phasenbeeinflussung aufweist
und in beiden Teilstrahlengängen akustooptische Elemente (AOM) zur wechselseitigen An- und Abschaltung der Teilstrahlen vorgesehen sind.
20.
Mikroskopieverfahren wobei mindestens ein Beleuchtungsstrahl in einem Teilbereich entlang seines Querschnitts mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und über Mikroskopobjektiv zur Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe fokussiert wird
und über einen Detektionsstrahlengang und mindestens einem Mittel zur Demodulation eine Detektion erfolgt,
wobei der Beleuchtungsstrahl durch einen kontinuierlich ausstrahlenden CW- Laser gebildet wird
und im Beleuchtungsstrahlengang vor dem Mikroskopobjektiv durch einen ein Polarisationsstrahlenteiler ein erster und zweiter Teilstrahlengang erzeugt wird und ein Vereinigungselement eine Wiedervereinigung der Teilstrahlen vornimmt, wobei in einem Teilstrahlengang ein Phasenelement in mindestens zwei Bereichen die Phase unterschiedlich beeinflusst und in beiden Teilstrahlengängen akustooptische Elemente (AOM) eine wechselseitige An- und Abschaltung der Teilstrahlen erzeugen.
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