WO2013164970A1 - 多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチド - Google Patents

多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチド Download PDF

Info

Publication number
WO2013164970A1
WO2013164970A1 PCT/JP2013/062122 JP2013062122W WO2013164970A1 WO 2013164970 A1 WO2013164970 A1 WO 2013164970A1 JP 2013062122 W JP2013062122 W JP 2013062122W WO 2013164970 A1 WO2013164970 A1 WO 2013164970A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
polypeptide
seq
region
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/062122
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
裕太 村上
里江 岩田
岩木　義英
翼 佐々木
Original Assignee
富士フイルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Priority to CA2872467A priority Critical patent/CA2872467C/en
Priority to EP13784603.6A priority patent/EP2845862B1/en
Priority to CN201380022493.2A priority patent/CN104271593B/zh
Priority to JP2014513364A priority patent/JP5986627B2/ja
Publication of WO2013164970A1 publication Critical patent/WO2013164970A1/ja
Priority to US14/528,197 priority patent/US20150050737A1/en
Priority to US15/291,246 priority patent/US10407662B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing pluripotent stem cells and a polypeptide used therefor.
  • pluripotent stem cells are derived from somatic cells, unlike embryonic stem cells, and thus have the advantage of fewer ethical problems.
  • iPS cells inducible pluripotent stem cells
  • they are maintained in an undifferentiated state for a long period of time. It is required to do.
  • feeder cells such as mouse fibroblasts are used to culture undifferentiated pluripotent stem cells for a long period of time.
  • a feeder cell derived from a heterologous animal such as the mouse fibroblast
  • a foreign substance such as an antigenic substance derived from the heterologous animal may be mixed in the culture solution.
  • pluripotent stem cells When pluripotent stem cells are used for medical purposes or similar uses, it is required to culture these cells in the absence of feeder cells.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-17183 discloses a cellular composition that does not contain feeder cells and contains proliferating primate progenitor cells.
  • the cellular composition further comprises an extracellular matrix.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-29186 discloses a cell culture substrate obtained by further coating a plasma polymerized cell culture surface with a coating solution containing an extracellular matrix protein and an aqueous solvent at a predetermined concentration. According to quality, it has been described as having good adhesion which helps to avoid differentiation of embryonic stem cells.
  • JP-T-2012-502664 discloses a peptide that binds to glycosaminoglycan (GAG).
  • Biomaterials, 2010, Nov; Vol.31 (32), pp.8281-8218 and Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610 can contribute to long-term culture of embryonic stem cells
  • a recombinant or synthetic peptide consisting of a vitronectin partial sequence, specifically, the first to 52nd amino acid sequences of natural vitronectin (see Biomaterials, 2010, Nov; Vol.31 (32), pp.8281-8218) , And the 41st to 52nd amino acid sequences (Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610) including the RGD sequence are disclosed. Since these peptides are non-biological samples, they are known to be excellent in that they can avoid the possibility of contamination with antigenic substances and can be produced industrially.
  • Biomaterials, 2010, Nov; Vol. 31 (32), pp. 8281-8218 and Nature Biotechnology, 2010, Vol. 28, No. 6, pp. 606-610 discloses an example in which long-term culture of embryonic stem cells was performed using a recombinant peptide consisting of a partial sequence of human vitronectin or a synthetic peptide.
  • a peptide has a uniformly low adsorptivity to the incubator, it requires a step of chemically binding to the incubator.
  • Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610 discloses that acrylate is introduced into the cell culture surface of an incubator to covalently bond the peptide.
  • JP 2012-502664A discloses a peptide that binds to glycosaminoglycan (GAG), and is used for long-term culture and maintenance of ESC and iPS using the site that binds to glycosaminoglycan. It is described to do.
  • GAG glycosaminoglycan
  • the binding site for GAG alone is not sufficient for cell culture performance for culturing ESC and iPS.
  • an object of the present invention is to enable a pluripotent stem cell to proliferate in an undifferentiated state, and which can be industrially produced without requiring a fixing treatment to a culture vessel by chemical bonding, and the polypeptide. It is intended to provide a method for culturing pluripotent stem cells using
  • the present inventors have eagerly developed a recombinant protein that allows proliferation of pluripotent stem cells in an undifferentiated state, has excellent adsorptivity to the incubator, and does not require fixation to the incubator by chemical bonding.
  • a predetermined polypeptide consisting of an amino acid residue containing a predetermined human vitronectin N-terminal partial sequence and capable of adsorbing to a culture vessel is used for pluripotent stem cells in a culture solution not containing a heterologous animal-derived component. It was found that the cells can be grown while maintaining an undifferentiated state over a long period of time, and adsorbed to the incubator without using chemical bonds.
  • a polypeptide comprising the sequence is significantly more proliferative than the recombinant vitronectin comprising the full-length sequence of human vitronectin, leading to the present invention.
  • the present invention provides the following aspects: [1] (1) a first region comprising at least one selected from the group consisting of an amino acid sequence represented by CSYYQSC (SEQ ID NO: 1) and an amino acid sequence represented by RGD; and (2) (2-i) PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN An amino acid sequence represented by (SEQ ID NO: 2), (2-ii) an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having an ability to adsorb to an incubator, or (2- iii) a second region comprising an amino acid sequence having 1 to 30 amino acid residues added, substituted or deleted to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and capable of adsorbing to an incubator; A polypeptide comprising 40 to 450 amino acid residues.
  • the number of amino acid residues added, substituted or deleted with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence of (2-iii) is 1 to 15, The polypeptide according to any one of the above. [11] (1) a first region comprising an amino acid sequence comprising the 25th to 47th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; and (2) the 342nd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • [12] (1) a first region consisting of the amino acid sequence consisting of the first to 55th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; and (2) the 342nd amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the polypeptide includes a third region, and the third region has an amino acid residue other than a cysteine residue at a position corresponding to the cysteine residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. 5.
  • the polypeptide includes a third region, and the third region has a serine residue, an alanine residue, or a glycine residue at a position corresponding to the cysteine residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • [18] The polypeptide according to any one of [1] to [17], wherein two cysteine residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are cross-linked between the two.
  • the polypeptide according to [20] further comprising an amino acid sequence represented by RGD.
  • a polypeptide-coated culture surface is obtained by applying the polypeptide according to any one of [1] to [22] to a cell culture surface of a support carrier, and on the polypeptide-coated culture surface.
  • a method for culturing pluripotent stem cells comprising seeding and culturing pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cell is at least one selected from the group consisting of embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, somatic stem cells, fertilized egg inner cell mass cells, and early embryonic cells [23] The pluripotent stem cell culture method described.
  • [25] The method for culturing pluripotent stem cells according to [23] or [24], wherein the pluripotent stem cells are induced pluripotent stem cells.
  • the method of culturing pluripotent stem cell according to any of the imparting amount to the cell culture surface of the polypeptide is 1 pmol/cm 2 ⁇ 1000pmol / cm 2 [23] ⁇ [26].
  • a pluripotent stem cell can be proliferated in an undifferentiated state, and it does not require a fixing process to a culture vessel by chemical bonding, and can be produced industrially and the polypeptide.
  • a method for culturing pluripotent stem cells can be provided.
  • the polypeptide of the present invention comprises (1) a polypeptide comprising 40 to 450 amino acid residues comprising the amino acid sequence represented by CSYYQSC (SEQ ID NO: 1) and capable of adsorbing to a culture vessel, or (1 ) A first region comprising at least one of the amino acid sequence represented by CSYYQSC (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence represented by RGD; (2) (2-i) an amino acid sequence represented by PRPSLAKKQRFRHRNKGYRSQRGHSRGRNQN (SEQ ID NO: 2); (2-ii) an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having an ability to adsorb to the incubator, or (2-iii) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence having 1 to 30 amino acid residues added, substituted or deleted, and having the ability to adsorb to an incubator Includes a free second region, the a polypeptide consisting of 40 to 450 amino acid residues
  • the first region containing the predetermined amino acid sequence since the first region containing the predetermined amino acid sequence has excellent cell adhesion, it is possible to proliferate cells, particularly pluripotent stem cells. Found in the invention.
  • the polypeptide of the present invention having such an amino acid sequence can proliferate pluripotent stem cells over a long period of time while maintaining an undifferentiated state.
  • the second region including the predetermined arrangement contributes to the adsorptivity to the surface of the incubator.
  • the polypeptide of the present invention having such an amino acid sequence exhibits good adhesion to an incubator, and is contained in the polypeptide together with the first region, so that it can be removed from the cell culture surface of the incubator during the culture period.
  • pluripotent stem cells can be proliferated over a long period of time while maintaining an undifferentiated state.
  • the polypeptide of the present invention can proliferate undifferentiated pluripotent stem cells in culture while suppressing detachment from the surface of the incubator, and can improve handling in culture operations. .
  • the proliferation of pluripotent stem cells in an undifferentiated state is promoted, and a polypeptide that can be produced industrially is obtained without the need for fixation to a culture vessel by chemical bonding. Can do.
  • polypeptide according to the present invention eliminates the risk of contamination with antigenic substances and infectious diseases as compared with natural human vitronectin, and at the same time has the same performance as natural vitronectin, that is, adhesion to pluripotent stem cells, cell proliferation , Undifferentiated maintenance can be maintained.
  • pluripotent stem cells cultured in the presence of the polypeptide according to the present invention may be contaminated with foreign substances such as antigenic substances derived from a sample or the like.
  • Pluripotent stem cells cultured by the culture method are sufficiently safe for use in medical applications or similar applications. be able to.
  • pluripotent stem cells can be cultured at a lower cost and with a simple operation, and not only for medical use but also in the research field. Can contribute widely.
  • the term “process” is not limited to an independent process, and is included in the term if the intended purpose of this process is achieved even when it cannot be clearly distinguished from other processes. .
  • a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the amount of each component in the composition is such that when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition, the plurality of substances present in the composition unless otherwise specified. Means the total amount.
  • amino acid residues in amino acid sequences are represented by one-letter code (for example, “G” for glycine residue) or three-letter code (for example, “Gly” for glycine residue) well known in the art. There is a case.
  • “%” relating to the amino acid sequence of a polypeptide is based on the number of amino acid (or imino acid) residues unless otherwise specified.
  • corresponding amino acid residues used for a particular amino acid residue in an amino acid sequence insert two or more amino acid sequences to be compared in a manner well known in the art, Matching the position of a specific amino acid residue in the reference amino acid sequence when alignment (alignment) is performed so that the number of identical amino acid residues is the largest, taking into account deletions and substitutions , Is meant to denote an amino acid residue in the other amino acid sequence.
  • identity with respect to amino acid sequence can refer to a value calculated using the BLAST package (see Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4thEd—Chapter 18). For example, 50% or more identity to SEQ ID NO: 2 means that Max. Indicates that the value of Identities is 50 or more.
  • vitronectin means human vitronectin, and specifically, is a polypeptide composed of a total length of 495 amino acid residues represented by SEQ ID NO: 3 below. It has been confirmed that natural vitronectin is a glycoprotein having a sugar chain as part of its sequence.
  • the polypeptide according to the present invention comprises (1) the amino acid sequence represented by CSYYQSC (SEQ ID NO: 1) and comprises 40 to 450 amino acid residues having the ability to adsorb to the incubator.
  • a polypeptide or a polypeptide comprising 40 to 450 amino acid residues comprising the following first region and second region: (1) a first region comprising at least one selected from the group consisting of an amino acid sequence represented by CSYYQSC (SEQ ID NO: 1) and an amino acid sequence represented by RGD (hereinafter simply referred to as RGD sequence); (2) (2-i) PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN (SEQ ID NO: 2), (2-ii) Amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 has 50% or more identity, and adsorbability to the incubator Or (3-iii) an amino acid sequence having 1 to 30 amino acid residues added, substituted or deleted to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and capable of adsorbing to an incubator A second region including
  • the first region includes at least one selected from the group consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the RGD sequence.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to the 25th to 31st 7 amino acid residues in the amino acid sequence of vitronectin.
  • the RGD sequence is a cell adhesion motif corresponding to the 45th to 47th 3 amino acid residues in the amino acid sequence of vitronectin. All of these amino acid sequences are sequences located relatively N-terminal of natural vitronectin, exhibiting adhesion to undifferentiated pluripotent stem cells, and as a result, pluripotency maintained in an undifferentiated state. It is presumed that stem cells can proliferate.
  • the polypeptide which does not contain any of these amino acid sequences is inferior in cell adhesiveness, and cannot obtain the effect of the present invention.
  • the present invention is not bound by this theory. Note that the two cysteine residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be cross-linked between the two. Thereby, a higher-order structure is formed in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the adhesion to pluripotent stem cells tends to be improved.
  • “being capable of proliferating pluripotent stem cells in an undifferentiated state” means that the pluripotent stem cells maintain differentiation potential during the culture period. Whether a pluripotent stem cell is in an undifferentiated state can be determined by a known evaluation method. For example, expression of molecular markers (expression measurement by flow cytometry such as SSEA-4 and / or Oct-4, immunostaining such as Oct-4 and / or NANOG), confirmation of pluripotent differentiation in in vitro experiments, And a method known to those skilled in the art, such as confirmation of teratoma formation by transplantation into immunodeficient mice or the like.
  • the culture period for maintaining the differentiation ability of the pluripotent stem cells in the present invention varies depending on the culture conditions and the cell state of the pluripotent stem cells, but can be, for example, a culture period of one month.
  • the first region in the culture polypeptide only needs to have any one selected from the group consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the RGD sequence. From the viewpoint of cell adhesion and cell proliferation Thus, the first region in the culture polypeptide preferably contains both of these sequences.
  • the first region may have an amino acid sequence other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the RGD sequence.
  • other amino acid sequences include (1a) the 1st to 24th amino acids of the amino acid sequence of human vitronectin represented by SEQ ID NO: 3 from the viewpoint of cell adhesion and cell proliferation in the first region. Amino acid sequence consisting of residues, (1b) Amino acid sequence consisting of 48th to 55th amino acid residues, or (1c) Amino acid sequence consisting of 32nd to 44th amino acid residues, etc., or a combination thereof Can do.
  • amino acid sequences (1a) to (1c) 1 to 30 amino acid residues were substituted, deleted, or deleted within a range not impairing the cell adhesion and cell proliferation of the first region. It may have a sequence, or may have an amino acid sequence having 50% or more identity with each of the amino acid sequences (1a) to (1c).
  • the first region can include at least one selected from the group consisting of the amino acid sequences (1a) to (1c) in addition to the amino acid sequence and RGD sequence represented by SEQ ID NO: 1, From the viewpoint of sex and cell proliferation, an amino acid sequence comprising both the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the RGD sequence, and consisting of the first to 55th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, Alternatively, it is preferable to have an amino acid sequence that approximates or part of this.
  • the number of amino acid residues in the first region can be 3 to 60 amino acid residues, and preferably 10 to 55 amino acid residues, from the viewpoint of cell adhesion and proliferation.
  • the second region includes an amino acid sequence consisting of 32 amino acid residues represented by SEQ ID NO: 2, and preferably consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 from the viewpoint of ease of purification of the polypeptide for culture.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is contained in a part of hemopexin-like domain II located on the C-terminal side of natural vitronectin, and amino acid residues 342 to 373 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Corresponds to the heparin-binding domain composed of Hereinafter, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 may be referred to as a heparin binding domain.
  • the culture polypeptide is presumed to have the ability to adsorb to the incubator by having the heparin-binding domain.
  • undifferentiated pluripotent stem cells can be cultured for a long time while maintaining an undifferentiated state, but the present invention is not bound by this theory.
  • the culture polypeptide since the culture polypeptide includes the heparin-binding domain, the culture polypeptide tends to secure the hydrophilicity of the culture polypeptide and suppress the hydrophobic aggregation of the polypeptide. As a result, the culture polypeptide can be easily purified, and the production efficiency can be increased.
  • “having the ability to adsorb to the incubator” means that the amino acid sequence chemically reacts with the cell culture surface of the subject incubator (hereinafter sometimes simply referred to as “culture surface”). It means that it is physically adsorbed without having to.
  • culture surface the cell culture surface of the subject incubator
  • Whether or not the culture surface of the incubator has an adsorption ability can be determined, for example, by adding a solution containing the polypeptide to a plasma-treated polystyrene incubator at 200 pmol / cm 2 at 37 ° C. It can be evaluated by whether or not the polypeptide remaining on the surface of the culture dish is present at 10 pmol / cm 2 or more when it is left for 2 hours and then washed twice with a phosphate buffer.
  • the amount of the polypeptide remaining on the surface of the culture dish is the ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method for quantifying the amount of binding with the antibody recognizing the polypeptide, or the amino acid produced by hydrolyzing the adsorbed polypeptide. Can be measured by quantification by HPLC or the like.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • the heparin-binding domain has 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and pluripotency
  • An amino acid sequence that can proliferate stem cells in an undifferentiated state and has an ability to adsorb to a culture vessel may be used.
  • the heparin-binding domain has a deletion, substitution or addition of 1 to 30, preferably 1 to 15, preferably 1 to 6 amino acids with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence may be an amino acid sequence that has the ability to adsorb to the incubator.
  • the culture polypeptide only needs to have the first region and the second region, and the relative position is not particularly limited.
  • the first region is preferably located on the N-terminal side of the second region.
  • the culture polypeptide consists of 40 to 450 amino acid residues. If it is less than 40 amino acid residues, it cannot be said that cell adhesion or cell growth or adsorption ability to a culture vessel is sufficient. On the other hand, if it exceeds 450 amino acid residues, cell adhesion or cell growth and adsorbability to the incubator may not be adequately exhibited, and further, protein association, cross-linking, or aggregation is likely to occur.
  • the culture polypeptide is preferably 80 or more, more preferably 90 or more, still more preferably 100 or more, from the viewpoint of making it difficult to form aggregates or the like. The number is preferably 400 or less, more preferably 250 or less, still more preferably 170 or less, and even more preferably 150 or less.
  • any of these upper limit values or lower limit values may be combined, for example, preferably 40 to 400 amino acid residues, more preferably 80 to 250 amino acid residues, and more preferably 80 More preferably, it consists of ⁇ 150 amino acid residues, even more preferably 100-150 amino acid residues.
  • the culture polypeptide preferably has a GRAVY value of -2.0 to -0.95 from the viewpoint of preventing hydrophobic aggregation.
  • GRAVY values (Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132) represent the total average hydrophobicity of the polypeptides. The larger the GRAVY value, the higher the hydrophobicity. If the GRAVY value is ⁇ 0.95 or less, the occurrence of hydrophobic aggregation tends to be easily suppressed.
  • the GRAVY value of the polypeptide is preferably ⁇ 1.70 to ⁇ 0.975, more preferably ⁇ 1.60 to ⁇ 1.10, in terms of achieving both suppression of aggregate formation and adsorptivity or cell proliferation. . Since the smaller the number of amino acid residues, the more likely it is to aggregate, when the polypeptide has 80 to 170 amino acid residues, the GRAVY value is compatible with both suppression of aggregate formation and adsorption or cell proliferation. Is preferably ⁇ 1.70 to ⁇ 0.975, more preferably ⁇ 1.60 to ⁇ 1.10.
  • the GRAVY value for example, increase or decrease the ratio of hydrophobic amino acids (eg, Trp, Tyr, Phe, Leu, Ile, Val, or Met) in the sequence, or increase or decrease the number of amino acid residues. Can do.
  • hydrophobic amino acids eg, Trp, Tyr, Phe, Leu, Ile, Val, or Met
  • the culture polypeptide has an amino acid sequence other than the first region and the second region.
  • the culture polypeptide preferably includes the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3, that is, a partial sequence of the amino acid sequence of human vitronectin.
  • cultivation can acquire the property close
  • the partial amino acid sequence of human vitronectin that can be contained in the culture polypeptide from the viewpoint of cell adhesion and cell proliferation of the culture polypeptide, adsorption ability to the incubator, or aggregation formation suppression, It preferably includes at least one selected from the group consisting of a third region and a fourth region: (3) among the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, a third region consisting of an amino acid sequence consisting of the 56th to 341st amino acid residues and an amino acid sequence selected from the partial amino acid sequence; and (4) a fourth region comprising an amino acid sequence selected from the amino acid sequence consisting of amino acid residues 374 to 459 and a partial amino acid sequence thereof among the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
  • the third region is (3a) from the amino acid residues 132 to 341 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 from the viewpoint of suppressing hydrophobic aggregation during the production of the polypeptide.
  • An amino acid sequence consisting of the 341st amino acid residue or a partial amino acid sequence thereof can be selected, or (3d) an amino acid sequence consisting of the 294th to 341th amino acid residues or a partial amino acid sequence thereof. it can.
  • the fourth region may be an amino acid sequence consisting of 374th to 459th amino acid residues or a partial amino acid sequence thereof from the viewpoint of adsorptivity to the culture dish, and the 374th to 409th amino acid residues.
  • An amino acid sequence consisting of a group or a partial amino acid sequence thereof can be used, and an amino acid sequence consisting of the 374th to 379th amino acid residues or a partial amino acid sequence thereof can be used.
  • the 374th to 379th positions are preferable in that the hydrophobic aggregation is easily suppressed at the time of producing the polypeptide, and there is a tendency that the hydrophobic aggregation is reduced by reducing the number of amino acids to be selected. is there.
  • the partial amino acid sequence of the amino acid sequence constituting the third region and the fourth region means an amino acid sequence composed of 3 or more consecutive amino acid residues in a predetermined range of amino acid residues.
  • the number of amino acid residues in these partial amino acid sequences may be selected within a range not exceeding the total number of amino acid residues of the aforementioned culture polypeptide.
  • the amino acid sequences constituting the third region and the fourth region and the partial amino acid sequences thereof are preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably, with the respective amino acid sequences or partial sequences thereof. It may be an amino acid sequence having 95% or more, more preferably 95% or more identity, or a partial amino acid sequence thereof. These amino acid sequences can be selected within a range that does not impair the cell adhesion and adsorption properties of the culture polypeptide.
  • amino acid sequence constituting the third region and the fourth region and the partial amino acid sequence thereof are 1 to 30, preferably 1 to 15, with respect to each amino acid sequence or partial sequence thereof.
  • it may be an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acid residues are deleted, substituted or added.
  • the amino acid sequence from which these amino acid residues are deleted can be selected within a range that does not impair the cell adhesion of the culture polypeptide and the adsorptivity to the incubator.
  • the culture polypeptide When the culture polypeptide includes the third region, the culture polypeptide tends to have an advantage of increasing the adsorptivity with the culture dish. By including the fourth region, the culture polypeptide tends to have an advantage of further increasing the adsorptivity with the culture dish.
  • the culture polypeptide only needs to have one of the third and fourth regions.
  • the GRAVY value of the polypeptide for culture is increased or decreased, the number of amino acid residues in the amino acid sequences constituting the third and fourth regions, substitution, deletion, addition, etc. of amino acid residues from the viewpoint of ease of adjustment. In particular, it is preferable to adjust the length of the amino acid sequence constituting the third region.
  • the culture polypeptide may not include the 56th to 131st amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and may not include the 56th to 268th amino acid residues. Alternatively, the 269th to 273rd amino acid residues may not be included, or the 50th to 293rd amino acid residues may not be included.
  • the amino acid sequence consisting of these amino acid residues is presumed not to contribute to the pluripotent cell culture performance of the above-mentioned culture polypeptide, and a sequence suitable from the viewpoint of adsorption to the culture dish is selected. .
  • the third region includes an amino acid residue corresponding to the cysteine residue of the sequence represented by SEQ ID NO: 3, it may have an amino acid residue other than the cysteine residue at the position of the cysteine residue. Good. This can prevent formation of intramolecular or intermolecular crosslinks by cysteine residues, which is preferable.
  • Other amino acid residues that substitute cysteine residues are not particularly limited, and examples include serine residues, alanine residues, and glycine residues. Especially, a serine residue and an alanine residue are preferable at the point which has a structure similar to cysteine.
  • the culture polypeptide may have any other optional amino acid residue other than the above as long as the cell adhesion and the adsorptivity to the incubator are not impaired.
  • a sequence consisting of any other amino acid residue include an added sequence added to easily produce the culture polypeptide by a recombinant technique.
  • additional sequences include an N-terminal methionine residue, an N-terminal GPLG sequence, a tag sequence (eg, GST (glutathione S-transferase), FLAG tag, His tag, etc.), which can be added between regions.
  • a linker sequence for example, GGGS, GGGGS, GGGGGS, etc. can be mentioned.
  • the culture polypeptide can be produced by amino acid synthesis techniques or genetic recombination techniques known to those skilled in the art.
  • a gene encoding a target amino acid sequence is obtained, and this is incorporated into an expression vector to produce a recombinant expression vector.
  • This is introduced into a suitable host to produce a transformant.
  • the target polypeptide is produced by culturing the obtained transformant in an appropriate medium. Therefore, the polypeptide according to the present invention can be recovered by recovering the target polypeptide from the culture by a conventional method. Can be obtained.
  • the culture polypeptide includes (1) the 25th to 47th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 from the viewpoints of cell proliferation and proliferation ability of undifferentiated pluripotent stem cells in an undifferentiated state.
  • a first region comprising an amino acid sequence comprising residues; (2) a second region comprising an amino acid sequence comprising amino acid residues 342 to 373 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; At least one selected from the group consisting of the region 3 and the fourth region: (3) from the amino acid sequence consisting of amino acid residues 269 to 341 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a partial amino acid sequence thereof
  • Fourth region consisting of amino acid sequence is preferably a 80-polypeptide consisting of 450 amino acid residues containing (A).
  • the culture polypeptide includes (1) the 1st to 55th amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 from the viewpoints of cell proliferation and proliferation ability of undifferentiated pluripotent stem cells in an undifferentiated state.
  • a first region comprising an amino acid sequence comprising the amino acid residues (including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the RGD sequence), and (2) amino acids 342 to 373 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • a second region comprising an amino acid sequence comprising residues, and at least one selected from the group consisting of the following third region and fourth region: (3) represented by SEQ ID NO: 3
  • a third region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 269 to 341 of the amino acid sequence or a partial amino acid sequence thereof; and (4) an amino acid represented by SEQ ID NO: 3.
  • a polypeptide (B) consisting of 100 to 450 amino acid residues, comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 374 to 459 of the sequence or a fourth region consisting of a partial amino acid sequence thereof. preferable.
  • the polypeptide (A) or (B) is preferably a polypeptide having a GRAVY value of -2.0 to -0.95.
  • the polypeptide (A) preferably has 80 to 250 amino acid residues.
  • the polypeptide (A) is preferably a polypeptide having a GRAVY value of -2.0 to -0.95 and an amino acid residue number of 80 to 250.
  • the polypeptide (A) is preferably a polypeptide having a GRAVY value of ⁇ 1.70 to ⁇ 0.975 and an amino acid residue number of 80 to 250.
  • the polypeptide (A) or (B) preferably has 100 to 250 amino acid residues.
  • polypeptide (A) or (B) is preferably a polypeptide having a GRAVY value of -2.0 to -0.95 and a number of amino acid residues of 100 to 250. Furthermore, the polypeptide (A) or (B) is preferably a polypeptide having a GRAVY value of ⁇ 1.70 to ⁇ 0.975 and a number of amino acid residues of 100 to 250. Furthermore, the polypeptide (A) or (B) is preferably a polypeptide having a GRAVY value of ⁇ 1.70 to ⁇ 0.975 and a number of amino acid residues of 100 to 170. Examples of the polypeptide for culture are listed below, but the present invention is not limited thereto.
  • the culture polypeptide is applied to the cell culture surface of the support carrier to obtain a culture polypeptide-coated culture surface (hereinafter referred to as a culture surface preparation step), and And culturing by seeding and culturing pluripotent stem cells on the polypeptide-coated culture surface for culture (hereinafter referred to as culture step).
  • the culture method of the present invention comprises the above-mentioned culture polypeptide having a first domain capable of retaining pluripotent stem cells in an undifferentiated state and a second domain capable of being favorably adsorbed to a culture vessel. Since it is adsorbed on the culture surface and seeded with pluripotent stem cells, the pluripotent stem cells are cultured while maintaining the undifferentiated state while suppressing detachment from the cell culture surface. be able to.
  • the pluripotent stem cell that can be proliferated while maintaining an undifferentiated state by culturing on the culturing polypeptide according to the present invention is a pluripotent stem cell of a primate, specifically, an embryonic stem cell (ES cells), inducible pluripotent stem cells (iPS cells), somatic stem cells, fertilized egg inner cell mass cells, early embryonic cells, and the like. These cells are used alone or in combination of two or more as required. May be used in combination. iPS cells include those described in Nature, 2007, July 19; Vol.448, pp.313-317; Cell, 2006, August 25; Vol.126 (4), pp.663-676, or Similar cells are included.
  • iPS cells can be mentioned as examples of pluripotent stem cells preferably applied in the present invention.
  • Examples of primates include humans, monkeys, gorillas and the like, and humans belonging to the same genus as the culture polypeptide are particularly preferable.
  • the component or substance applied to the present invention is a component or substance derived from a primate animal, it can be preferably applied to the present invention as a component or substance derived from the same animal species.
  • the culture solution used for culturing can be appropriately selected according to the type of cells to be cultured.
  • the culture medium that can be used may be any known one, and examples thereof include DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB104, 199, MCDB153, L15, SkBM, and Basal medium.
  • various components that can be generally added such as glucose, FBS (fetal bovine serum) or human serum, and antibiotics (such as penicillin and streptomycin) may be added to these culture solutions.
  • concentration in the case of adding serum can be suitably changed according to the culture state at that time, it can usually be 10% (v / v).
  • the pluripotent stem cells are preferably cultured in the absence of a heterogeneous animal-derived component.
  • the possibility of foreign matter contamination from different animals can be eliminated with high accuracy.
  • Examples of the culture in the absence of a heterologous cell-derived component include a culture using a culture solution not containing a heterologous animal-derived component, and a culture not using a feeder cell derived from a heterologous animal.
  • the pluripotent stem cells are preferably cultured in the absence of a heterogeneous animal-derived component and a serum component. Thereby, mixing of the component derived from a different animal can be eliminated further.
  • the culture solution not containing the heterologous animal-derived component includes a low osmotic pressure medium containing at least one medium component such as a non-essential amino acid, glutamic acid, ⁇ -mercaptoethanol, FGF-2, TGF- ⁇ , insulin, transferrin, etc.
  • a mixed medium consisting of can be used.
  • a medium such as TeSR2 (StemCell Technologies) can be used, but is not limited thereto.
  • normal culture conditions for example, culture in an incubator with a temperature of 37 ° C. and a concentration of 5% (v / v) CO 2 are applied.
  • a normal medium used for maintaining pluripotent stem cells can be used.
  • mTeSR, TeSR2 (StemCell Technologies, Inc.) etc. are mentioned, for example.
  • Inoculation of pluripotent stem cells in the medium is performed by a conventional method.
  • the medium used in a series of passages is not necessarily the same, and may be a different medium as long as pluripotent stem cells can be maintained in an undifferentiated state.
  • the culture polypeptide-coated culture surface includes applying a coating solution containing a predetermined amount of the culture polypeptide to the culture surface of the support carrier.
  • the culture surface can be coated with the culture polypeptide.
  • Content of the culture polypeptide in the coating solution varies depending on the kind or size of the culture surface as a coating target, from the viewpoint of adsorption ability to culture surface, be 1pmol / cm 2 ⁇ 1000pmol / cm 2 Is preferable, and more preferably 100 pmol / cm 2 to 300 pmol / cm 2 .
  • aqueous medium used in order to prepare the said coating solution For example, a phosphate buffer, a Tris buffer, an ultrapure water etc. can be mentioned.
  • the coating may be held for a predetermined time, for example, about 30 minutes to 24 hours after the coating solution is applied, so that the culture polypeptide can be coated on the culture surface without requiring any special treatment. it can.
  • the culturing step includes seeding and culturing pluripotent stem cells on the culturing polypeptide-coated culture surface.
  • the seeding density and culture of pluripotent stem cells are not particularly limited, and generally performed conditions may be applied as they are.
  • the seeding density of about 1 ⁇ 10 3 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 may be used under the above-described culture and passage conditions.
  • a cell mass of 10 ⁇ m to 100 ⁇ m may be cultured under the above-described culture and passage conditions at a seeding density of about 1 cell / cm 2 to 5 cells / cm 2 .
  • pluripotent stem cells can be handled easily on the polypeptide for culture, and can be proliferated favorably while maintaining an undifferentiated state.
  • the incubator refers to a support carrier having a surface used for cell culture.
  • a support carrier a well-known carrier for cell culture in the art can be used as it is.
  • support carriers are plastic (eg polystyrene, acrylonitrile-butadiene-styrene resin, polycarbonate resin, polyester resin), glass, microporous filters (eg cellulose, nylon, glass fiber, polyester and polycarbonate), batch Bioreactor materials (may include hollow fiber tubes or microcarrier beads) used in cell culture, in a cell culture, or in genetic engineering (eg, bioreactor, etc.) and polyethylene terephthalate, Teflon (registered trademark) , Ceramics and related polymer materials, and the like.
  • the support carrier may be a support carrier whose culture surface is coated with a plasma polymerized thin film.
  • the form of the incubator is not particularly limited, and may be any form applicable to the pluripotent stem cell culture.
  • Examples of such containers include multi-well plates (eg 6 wells, 12 wells, 24 wells, 96 wells), culture dishes (eg petri dishes, etc.), tubes, culture flasks, roller bottles, shaking cultures. A flask etc. can be mentioned.
  • the incubator according to the present invention has a support having a cell culture surface and a culture polypeptide arranged on the cell culture surface of the support. Since the incubator has a culture surface provided with the culture polypeptide according to the present invention described above, the culture polypeptide is well adsorbed to the culture surface, and the culture polypeptide When pluripotent stem cells are seeded on the top, the pluripotent stem cells can be proliferated while maintaining an undifferentiated state with good handleability.
  • the culture surface in the incubator means a surface to which cells can adhere when cells are seeded and grown.
  • An incubator according to the present invention is prepared by providing a support having a cell culture surface (hereinafter referred to as “preparation step”), and the culture polypeptide is applied to the cell culture surface to perform an adsorption treatment. (Hereinafter referred to as “adsorption treatment process”). Thereby, the incubator concerning this invention can be obtained simply.
  • an incubator provided with a support carrier having the culture surface is prepared.
  • a step of forming the plasma polymerized thin film on the support carrier may be included.
  • a conventional method may be applied as it is.
  • the adsorption treatment step includes applying and maintaining the culture polypeptide according to the present invention on the culture surface.
  • an adsorption solution containing a predetermined amount of the culture polypeptide may be prepared, applied to the culture surface, and held for a predetermined time to adsorb the culture polypeptide to the culture surface.
  • the matters described in the step of preparing a culture surface coated with a polypeptide for culturing in the culturing method can be applied as they are.
  • Example 1 A gene sequence encoding each of the RCP-1 to RCP-17 polypeptides having the amino acid sequences shown in Tables 2 and 3 was amplified by a conventional method using PCR.
  • RCP-11 corresponds to the sequence of natural human vitronectin.
  • the position in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of natural human vitronectin corresponding to the amino acid sequence of each polypeptide is shown in the “NOTE” column in Tables 2 and 3.
  • the amino acid sequence of each polypeptide may include an amino acid sequence added, deleted, or substituted with respect to the amino acid sequence of the natural human vitronectin in the corresponding range described in the table.
  • RCP-1 to RCP-10 and RCP-17 are the same amino acid sequences except that each of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 to 13 and SEQ ID NO: 38 has methionine at position 1.
  • the target gene was inserted into pET-28b (+) previously cut with NcoI (Takara Bio) using InFusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech). Each expression vector was constructed.
  • the target gene was inserted into pGEX-6P-1 (GE Healthcare) previously cleaved with BamHI (Takara Bio Inc.) in the same manner as above, and each expression A vector was constructed. The sequence of the expression vector was confirmed by sequence analysis.
  • the prepared expression vectors of RCP-1 to RCP-10 and RCP-17 were transformed to BL21 (DE3) pLysS (Novagen) by a conventional method, applied to an LB plate containing kanamycin, and incubated at 37 ° C. for 16 hours. . After confirming the introduction of the vector by the colony direct PCR method, 1 mM IPTG (Wako Pure Chemical Industries) was added and cultured with shaking at 37 ° C. for 5 hours to induce the expression of the polypeptide.
  • the cells were collected by centrifugation, and the cells were resuspended in a washing buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6). After disrupting the cells by sonication, the cells were centrifuged at 15000 rpm, 30 min, 4 ° C., and the insoluble fraction was collected. After washing with a washing buffer containing 0.5% by weight Triton X100, the suspension is resuspended in a low-concentration urea buffer (Low Urea Buffer: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 M urea, pH 7.6) and subjected to sonication treatment. It was.
  • a washing buffer 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 M urea, pH 7.6
  • the solution containing the target peptide obtained by the above method was purified using AKTA Explorer 100 (GE Healthcare) and HiTrap Heparin HP 5 ml (GE Healthcare). Stepwise elution was performed using the high-concentration urea buffer as a binding buffer and a high-salt concentration adjustment buffer (20 mM Tris, 1M NaCl, 8M urea, pH 7.6) as an elution buffer, and the target polypeptide was purified.
  • the RCP-11 to RCP-16 expression vectors prepared above were transformed to BL21 (Novagen) by a conventional method, applied to an ampicillin-containing LB plate, and incubated at 37 ° C. for 16 hours. After confirming the introduction of the vector by the colony direct PCR method, 100 ⁇ M IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside) was added and cultured with shaking at 20 ° C. for 24 hours to induce expression of the polypeptide. did.
  • the bacterial cells were collected, resuspended with B-PER (registered trademark) Bacterial Protein Extraction Reagent in Phosphate Buffer (Thermo Scientific), and then disrupted by sonication.
  • B-PER registered trademark Bacterial Protein Extraction Reagent in Phosphate Buffer
  • Thermo Scientific Bacterial Protein Extraction Reagent in Phosphate Buffer
  • Thermo Scientific Bacterial Protein Extraction Reagent in Phosphate Buffer
  • the insoluble fraction was removed by centrifugation at 15000 rpm, 30 min, 4 ° C., and the supernatant was purified using AKTA Explorer 100 and GSRapHP 5 ml ⁇ 2 (GE Healthcare).
  • the elution fraction was desalted using Hiprep 26/10 Desalting (GE Healthcare), and further, a protease for cleaving GST fusion protein (PreScission Protease) was added at 1/2000 of
  • the RCP-1 polypeptide obtained as described above was electrophoresed on a ready gel (12.5%, Bio-Rad) and stained with GelCode TM Blue Stain Reagent (Thermo Scientific). As a result, a single band was confirmed at a position corresponding to a molecular weight of 28.3 kDa predicted from the amino acid sequence. Similar results were obtained for other polypeptides.
  • each purified polypeptide solution was dialyzed using Slide-A-Lizer (3.5K MWCO.).
  • the dialysis external solution was based on a dialysis buffer (PBS, 1.5 M NaCl, 0.5 M L-arginine, 1 mM EDTA, pH 7.4), and urea was removed by step dialysis.
  • the concentration of the final dialysis product was calculated from the absorbance at 280 nm using NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Table 4 shows the presence or absence of aggregation after dialysis.
  • the GRAVY value was calculated by adding the hydrophobicity index determined for each amino acid and dividing it by the number of amino acids (Kyte J., Doolittle RF (1982), J. Mol. Biol, 157: 105- 132).
  • the GRAVY value is an index of the hydrophilicity / hydrophobicity of a polypeptide calculated from the hydrophobicity of an amino acid contained in each polypeptide. The larger the value, the more hydrophobic and the smaller the hydrophilic.
  • the results are shown in Table 4.
  • the presence or absence of aggregation was evaluated by the following G, A and B. The results are also shown in Table 4.
  • G Aggregate formation is not seen.
  • A Particle formation with a particle size of about 100 nm is observed.
  • B Formation of visible aggregate having a particle diameter of 1 mm or more is observed.
  • RCP-2 to RCP-5, RCP-7 to RCP-8, and RCP-17 are polypeptides having 80 to 170 amino acid residues and are prone to aggregation. However, since the GRAVY value is ⁇ 1.70 to ⁇ 0.975, it can be seen that the formation of aggregates is suppressed.
  • Example 2 ⁇ Evaluation of adsorptivity to culture dishes> Each polypeptide obtained by the above method is diluted with a predetermined buffer so that it can be added to the well at a predetermined final concentration of 0 to 200 pmol / cm 2 , and a plasma-treated polystyrene 96-well plate (Tissue Culture) -Treated, Falcon) was added 64 ⁇ L at a time. Each polypeptide was adsorbed to the plate by incubating at 37 ° C. for 2 hours, and then washed twice with PBS to obtain each polypeptide-coated surface of RCP-1 to RCP-16.
  • a plasma-treated polystyrene 96-well plate Tissue Culture) -Treated, Falcon
  • each of boric acid buffer and 1N NaOH was applied to the surfaces coated with RCP-1 and RCP-11 to 16, and 80 ° C., humidity 100 Incubated for 24 hours. After air cooling, 75 ⁇ L of borate buffer was added to each well, and OPA (o-phthalaldehyde: Wako Pure Chemical) / methanol solution (160 mg / ml) and NAC (N-acetyl-L-cysteine: Wako Pure Chemical) 50 ⁇ L of a reaction solution prepared by mixing 1/100 (mass ratio) / boric acid buffer solution (2 mg / ml) was added. After incubating at 40 ° C.
  • OPA o-phthalaldehyde: Wako Pure Chemical
  • methanol solution 160 mg / ml
  • NAC N-acetyl-L-cysteine: Wako Pure Chemical
  • RCP-1, 15 and 16 polypeptides containing PRPSLAKKQRFRHRNRKYRSQRGHSRGRNQN (SEQ ID NO: 2 [342nd to 373rd in SEQ ID NO: 3]) were used.
  • PRPSLAKKQRFRHRNRKYRSQRGHSRGRNQN SEQ ID NO: 2 [342nd to 373rd in SEQ ID NO: 3]
  • RCP-11 having the human vitronectin sequence.
  • the adsorption amount of RCP-13 and 14 not containing PRPSLAKKQRFRHRNRKYRSQRGHSRGRNQN is as low as about 1/4 with respect to the polypeptide containing the sequence, indicating that it is not suitable as an adsorbent for the culture dish.
  • EmbryoMax registered trademark
  • DMEM Invitrogen
  • 10% (v / v) fetal bovine serum medium used, cultured for 24 hours using DMEM (Invitrogen), 10% (v / v) fetal bovine serum medium, and allowed to adhere on a T25 flask (Corning).
  • the composition shown in Table 5 was added with FGF-2 (Sigma-aldrich) to a final concentration of 10 ng / ml.
  • iPS cells were maintained and cultured in a 37 ° C., 5% (v / v, hereinafter the same) CO 2 incubator using the above medium.
  • the medium was replaced with a new medium every day except for the day after iPS cell seeding.
  • the subculture operation was performed by detaching the cells with dispase II (neutral protease Grade II, Roche) and separating the cells into an appropriate size by pipetting.
  • the human iPS cells cultured as described above were treated with TrypLE Select (Invitrogen) at 37 ° C. for 5 minutes to separate into single cells.
  • the cells were collected by centrifugation at 300 rpm for 2 min, and the final concentration was 10 ⁇ M Y-27362 ((R)-(+)-trans-N- (4-pyrylyl) -4- (1-aminoethyl) -cyclohexanecarbamide ⁇ 2HCl ⁇ H2O, Rho It was suspended in TeSR2 (a heterogeneous animal-derived component, serum component-free medium, Stemcell Technologies) containing a binding kinase inhibitor, Wako Pure Chemical Industries).
  • TeSR2 a heterogeneous animal-derived component, serum component-free medium, Stemcell Technologies
  • RCP-1 to RCP-10 and RCP-17, RCP-11, RCP-15, and RCP-16, and human vitronectin (extracted from human plasma, BD bioscience), recombinant traminin (rLaminin-5: Oriental Yeast Co., Ltd. and Human Recombinant Laminin-511: Biolamina Co., Ltd.) were prepared so that the addition concentrations shown in Table 6 were respectively added to each well of a 96-well plate. Adsorption was carried out by maintaining at 2 ° C. for 2 hours. In each well of the obtained peptide-treated 96-well plate, iPS cells were seeded so as to have a cell density of 30000 cells / well.
  • RCP-1 to RCP-10 having the 1st to 55th positions of SEQ ID NO: 3, PCR-17 and RCP-11, and natural human vitronectin are cell adhesion of iPS cells.
  • the rate was good.
  • RCP-1 to RCP-10 and PCR-17, which do not contain some or all of the 56th to 268th amino acids of the sequence shown in SEQ ID NO: 3, are natural human vitronectin and natural human vitronectin.
  • the cell adhesion rate was better than RCP-11 having the same amino acid sequence. From this, it can be seen that sequences important for cell adhesion are present in the first to 55th sequences of SEQ ID NO: 3.
  • Peptide-4, 5 and 6 containing CSYYQSC or RGD significantly inhibited cell adhesion to native vitronectin, whereas Peptide ⁇ containing no CSYYQSC and RGD It can be seen that there is no adhesion inhibition when Peptide-7, 8 in which the RGD sequences of 1, 2, 3 and Peptide-5, 6 are replaced with RGE is added. Therefore, it can be seen that the cell adhesion ability is exhibited when the polypeptide contains at least one of CSYYQSC and RGD.
  • Example 5 ⁇ Proliferation evaluation> The iPS cells collected in the same manner as in the above ⁇ Cell adhesion evaluation 1> were seeded at a rate of 250 cells / well in a 96-well plate adsorbed with RCP-1, 11 and natural human vitronectin, and 37 ° C., 5% The cells were cultured for 8 days in a CO 2 incubator. The number of adherent cells after each lapse of time was measured by the same method as in the above ⁇ Cell adhesion evaluation 1> to obtain a growth curve. The growth curve is shown in FIG. In FIG. 2, the black rhombus indicates an example using RCP-1, and the black square indicates an example using RCP-11.
  • samples 1 to 12 were prepared so that RCP-1 to 10 and RCP-17 and Human Recombinant Laminin-511 as comparative controls were added at concentrations shown in Table 8, respectively. > was seeded at a rate of 5000 cells / well on a 96-well plate on which each polypeptide was adsorbed, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 3 days. The number of cells after 3 days was measured by the same method as in the above ⁇ Cell adhesion evaluation 1>. The results are shown in Table 8.
  • RCP-1 shows higher cell proliferation than RCP-11 having the amino acid sequence of natural vitronectin, and RCP-11 is about 1 / compared to the case of using RCP-1 on the 8th day of culture.
  • the number of cells was about 3.
  • the doubling time was calculated from the increase / decrease in the number of cells obtained.
  • RCP-1 was used, it was 46.4 ⁇ 2.1 hours, and when RCP-11 was used, 67.7 ⁇ 2.1 hours.
  • Met also shows that RCP-1 to RCP-10 and RCP-17 all have a higher cell growth rate than laminin, which is the same extracellular matrix as vitronectin. It can be seen that such a high cell growth rate can be obtained similarly even if the 274th cysteine residue in SEQ ID NO: 3 is substituted with a serine residue.
  • RCP-1 to RCP-10 and RCP-17 which do not contain a sequence have higher proliferation ability than RCP-11 having a sequence equivalent to that of human vitronectin and Laminin-511 which is a comparative example.
  • RCP-1 to RCP-10 and RCP-17 including both CSYYQSC sequence and RGD sequence and PRPSLAKKQRFRHNRNKGYRSQRGHSRGRNQN sequence showed high cell proliferation.
  • ⁇ Cell adhesion evaluation 3> Cell adhesion was evaluated in the same manner as in ⁇ Cell Adhesion Evaluation 1> except that RCP-1 was used after adjusting with PBS to a concentration of 125 pmol / cm 2 to 1000 pmol / cm 2 . The results are shown in Table 9.
  • the cell adhesion rate was defined as a relative value when the cell adhesion rate with respect to an incubator in which natural vitronectin was adsorbed at a concentration of 130 pmol / cm 2 was defined as 100.
  • n 3.
  • the adhesion of iPS cells to RCP-1 showed a cell adhesion rate equivalent to that of natural vitronectin when added at 125 pmol / cm 2 or more.
  • Example 7 ⁇ Undifferentiated maintenance evaluation> The iPS cells collected in the same manner as in the above ⁇ Cell adhesion evaluation 1> were suspended in TeSR2. Sample 1, Sample 2, Sample 5, Sample 6, and Sample 7 used in the above ⁇ Cell adhesion evaluation 1> were each adsorbed in the same manner as in the above ⁇ Cell adhesion evaluation 1> (Tissue culture- treated, Falcon) and seeded with iPS cells and cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator. The medium was replaced with a new medium every day except for the day after seeding. Passage was performed every 6 days by the same method as described above. The morphology of iPS cells cultured on each sample is shown in FIG.
  • (A) is an iPS cell cultured on RCP-1
  • (B) is an iPS cell cultured on RCP-11
  • (C) is an iPS cell cultured on native human vitronectin.
  • (D) shows iPS cells cultured on rLaminin-5
  • (E) shows iPS cells cultured on rLaminin-511.
  • Scale bar 100 ⁇ m.
  • the left column is an entire colony image
  • the right column is an enlarged image
  • the left column in FIG. 4 is a DAPI-stained image
  • the right column is a stained image with an anti-NANOG antibody.
  • Scale bar in FIGS. 3 and 4 200 ⁇ m.
  • iPS cells cultured on natural human vitronectin with RCP-1,11 containing sequences effective for cell growth and adsorption to culture dishes are homogenous colonies and have high nuclear occupancy. It was characteristic of differentiated cells.
  • iPS cells cultured on RCP-1 and 11 having a cell proliferation domain and an adsorption domain and natural human vitronectin strongly express NANOG throughout the colony, and are in an undifferentiated state. It was found that it was maintained.
  • the polypeptide consisting of 40 to 450 amino acid residues including any one of the CSYYQSC and RGD sequences and the PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN sequence was excellent in adsorptivity to the incubator. Further, such a polypeptide is equivalent to RCP-11 having a sequence equivalent to that of natural vitronectin and human vitronectin in maintaining cell adhesion and undifferentiated state of iPS cells under co-culture conditions with iPS cells. And iPS cell proliferation was superior to RCP-11. It can be seen that RCP-1 to RCP-10 and RCP-17 are all good in terms of maintaining cell adhesion and undifferentiated state of iPS cells. Good results in all of these capabilities were not obtained with other polypeptides or comparative recombinant traminin.
  • a polypeptide capable of proliferating pluripotent stem cells in an undifferentiated state and having excellent adsorptivity to the surface of cell culture, and a method for culturing pluripotent stem cells using the polypeptide And an incubator can be provided.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域と、（２）（２－ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２－ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２－iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個～３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列を含む第２の領域と、を含み、４０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。

Description

多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチド
　本発明は、多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチドに関する。
　損傷した組織の機能回復等を目的として種々の再生医療が開発されている。なかでも組織そのものの再生などを最終的な目的とする霊長類、特にヒトの全能性又は多能性幹細胞に関する技術が多く報告されている。特に、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、胚性幹細胞とは異なり体細胞から誘導されるため、倫理面の問題が少ないという利点を有する。
　これらの霊長類の全能性又は多能性幹細胞（これらの両者を総称して、本発明では単に「多能性幹細胞」と称する。）を培養する場合には、未分化状態で長期間にわたって維持することが要求される。未分化状態の多能性幹細胞を長期間培養するためには、一般に、マウス繊維芽細胞等のフィーダー細胞が用いられる。
　しかしながら、前記マウス繊維芽細胞のような異種動物由来のフィーダー細胞を使用することで、異種動物由来の抗原性物質などの異物が培養液中に混入する可能性が指摘されており、全能性又は多能性幹細胞を、医療用途、もしくはそれに準ずる用途に使用する場合には、これらの細胞をフィーダー細胞非存在下にて培養することが求められている。
　このような事情に鑑み、フィーダー細胞の機能を代替する細胞接着性素材の開発が行われている。例えばNature Biotechnology, 2001, Vol19, pp.971-974では、フィーダー細胞の代替物としてマウス肉腫抽出成分であるマトリゲルを使用し、未分化状態を維持したヒト胚性幹細胞を首尾よく培養したことが開示されている。
　特開２００１－１７１８３号公報には、フィーダー細胞を含まず、且つ増殖する霊長類始原細胞を含む細胞性組成物が開示されており、好ましい態様として、細胞外マトリクスを更に含む細胞性組成物が開示されている。また特開２０１０－２９１８６号公報には、所定濃度の細胞外マトリックスタンパク質と水性溶媒を含むコーティング溶液で、プラズマ重合された細胞培養表面を更にコーティングした細胞培養基質が開示されており、この細胞培養基質によれば、胚性幹細胞の分化を回避するのに役立つ良好な接着性を有すると記載されている。さらに、特表２０１２－５０２６６４公報には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合するペプチドが開示されている。
　Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8218及びNature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610には、胚性幹細胞の長期培養に寄与しうるビトロネクチン部分配列からなる組換えペプチド、もしくは合成ペプチド、具体的には、天然ビトロネクチンの１番目～５２番目のアミノ酸配列（Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8218参照）、及びＲＧＤ配列を含む第４１番目～第５２番目のアミノ酸配列（Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610）がそれぞれ開示されている。これらのペプチドは非生体試料であるが故に抗原性物質等の混入可能性を回避でき、かつ工業的に生産できる点で優れていると、知られている。
　しかしながら、多能性幹細胞を再生医療等の医療用途、もしくはそれに準ずる用途に使用することを考慮すると、マウス等に由来する繊維芽細胞等の異種のフィーダー細胞及びマウス由来のマトリゲルをはじめとする異種動物由来成分の使用をできる限り排除すべきである。また、同種動物由来の細胞又は成分であっても、抗原性物質の混入などの可能性を完全に排除できるものではない。さらに、同種及び異種のいずれであっても生体に由来する材料は、抽出量がごく微量であること、又は、ドナーによって性能がばらつくことがあることなど、工業的観点からも好ましくない。近年、医療用途への応用を目指して、異種動物由来成分又は抗原性物質が混入しない化学的に同定された条件下での幹細胞の培養検討が盛んに行われている。しかしながら、実用に足る細胞培養性能を示すフィーダー細胞を代替できる材料は見出されていない。
　例えば、生体に由来する材料そのものの使用を回避する手段として、Biomaterials, 2010, Nov;Vol.31(32),pp.8281-8218及びNature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610には、ヒトビトロネクチンの部分配列からなる組換えペプチド、もしくは合成ペプチドを使用して胚性幹細胞の長期培養を実施した例が開示されている。
　しかしながら、このようなペプチドは培養器に対する吸着性が一様に低いため、培養器にて対して化学的に結合させる工程を必要とする。例えば、Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610では、培養器の細胞培養表面にアクリレートを導入して、ペプチドを共有結合させることが開示されているが、この方法ではペプチドを結合させる培養表面を自由に選択することが出来ず、汎用性、簡便性に劣る上、上記ペプチドだけでは、胚性肝細胞（ＥＳＣ）及び誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ）を培養するための細胞培養性能として充分とは言えない。さらに、特表２０１２－５０２６６４公報には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合するペプチドが開示されており、グリコサミノグリカンに結合する部位を利用してＥＳＣ及びｉＰＳの長期培養および維持に使用することが記載されている。しかしながら、ＧＡＧに対する結合部位だけでは、ＥＳＣ及びｉＰＳを培養するための細胞培養性能として充分とは言えない。
　従って、本発明の目的は、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にすると共に、化学結合による培養器への固定処理を必要とせず、工業的に生産可能なポリペプチドと、このポリペプチドを用いた多能性幹細胞の培養方法を提供することである。
　本発明者らは多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にすると共に、培養器への吸着性に優れ、化学結合による培養器への固定処理を必要としない組換えタンパク質を開発するべく鋭意研究を重ね、所定のヒトビトロネクチンＮ末端部分配列を含み培養器への吸着能を有するアミノ酸残基からなる所定のポリペプチドが、異種動物由来成分を含まない培養液中にて多能性幹細胞を長期にわたって未分化状態を維持しながら増殖させることが可能であり、かつ化学的な結合を介さずとも培養器に吸着することを見出した。さらに驚くべきことに当該配列よりなるポリペプチドは、ヒトビトロネクチン全長配列よりなる組換えビトロネクチンと比較して有意に増殖性に優れることを見出し、本発明に至った。
　本発明は、以下の態様を提供する：
　［１］　（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域と、（２）（２－ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２－ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２－iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個～３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列を含む第２の領域と、を含み、４０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
　［２］　ＧＲＡＶＹ値が－２．０～－０．９５である［１］に記載のポリペプチド。
　［３］　前記第１の領域が、ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列の双方を含む［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
　［４］　４０個～４００個のアミノ酸残基からなる［１］～［３］のいずれかに記載のポリペプチド。
　［５］　下記（３－ｉ）～（３－iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチド：（３－ｉ）　配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、（３－ii）　前記（３－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び、（３－iii）　前記（３－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個～３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
　［６］　下記（３ａ－ｉ）～（３ａ－iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチド：（３ａ－ｉ）１３２番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、（３ａ－ii）前記（３ａ－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、並びに、（３ａ－iii）前記（３ａ－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個～３０個のアミノ酸残基を付加、置換若しくは欠失させたアミノ酸配列。
　［７］　下記（３ｂ－ｉ）～（３ｂ－iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチド：（３ｂ－ｉ）２６９番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、（３ｂ－ii）　前記（３ｂ－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、並びに、（３ｂ－iii）前記（３ｂ－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個～３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
　［８］　下記（４－ｉ）～（４－iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第４の領域を更に含む［１］～［７］のいずれかに記載のポリペプチド：（４－ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、（４－ii）　前記（４－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び、（４－iii）　前記（４－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個～３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
　［９］　前記（２－ii）のアミノ酸配列の配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上である［１］～［８］のいずれかに記載のポリペプチド。
　［１０］　前記（２－iii）のアミノ酸配列の配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して付加、置換又は欠失されたアミノ酸残基数が１～１５である［１］～［８］のいずれかに記載のポリペプチド。
　［１１］　（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２５番目～４７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目～３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域、を含む８０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
　［１２］　（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目～５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目～３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域、を含む１００個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
　［１３］　ＧＲＡＶＹ値が－２．０～－０．９５である［１１］又は［１２］記載のポリペプチド。
　［１４］　アミノ酸残基数が２５０個以下である［１］～［１３］のいずれかに記載のポリペプチド。
　［１５］　前記ポリペプチドが第３の領域を含み、前記第３の領域が、配列番号３で示されるアミノ酸配列のシステイン残基に対応する位置に、システイン残基以外のアミノ酸残基を有する［５］～［１４］のいずれかに記載のポリペプチド。
　［１６］　前記ポリペプチドが第３の領域を含み、前記第３の領域が、配列番号３で示されるアミノ酸配列のシステイン残基に対応する位置にセリン残基、アラニン残基又はグリシン残基を有する［５］～［１４］のいずれかに記載のポリペプチド。
　［１７］　前記第１の領域が、前記第２の領域のＮ末端側に位置する［１］～［１６］のいずれかに記載のポリペプチド。
　［１８］　配列番号１で示されるアミノ酸配列における２つのシステイン残基が両者間で架橋している［１］～［１７］のいずれかに記載のポリペプチド。
　［１９］　配列番号４～配列番号２３、配列番号３８及び配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
　［２０］　（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含み、培養器への吸着能を有する４０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
　［２１］　更にＲＧＤで示されるアミノ酸配列を含む［２０］記載のポリペプチド。
　［２２］　ＧＲＡＶＹ値が－２．０～－０．９５である［２０］又は［２１］に記載のポリペプチド。
　［２３］　支持担体の細胞培養表面に、［１］～［２２］のいずれかに記載のポリペプチドを付与して、ポリペプチド被覆培養表面を得ること、及び、前記ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養すること、を含む、多能性幹細胞の培養方法。
　［２４］　前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導型多能性幹細胞、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚細胞からなる群より選択される少なくとも一種である［２３］記載の多能性幹細胞の培養方法。
　［２５］　前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞である［２３］又は［２４］記載の多能性幹細胞の培養方法。
　［２６］　前記多能性幹細胞を、異種動物由来成分及び血清由来成分の非存在下で培養する［２３］～［２５］のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養方法。
　［２７］　前記ポリペプチドの前記細胞培養表面への付与量が１ｐｍｏｌ／ｃｍ２～１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である［２３］～［２６］のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養方法。
　［２８］　細胞培養表面を有する支持担体と、前記支持担体の細胞培養表面上に配置された［１］～［２２］のいずれかに記載のポリペプチドと、を有する培養器。
　本発明によれば、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にすると共に、化学結合による培養器への固定処理を必要とせず、工業的に生産可能なポリペプチド及び該ポリペプチドを用いた多能性幹細胞の培養方法を提供することができる。
本発明の実施例における各ポリペプチドの培養プレート表面の吸着試験の結果を示すグラフである。 本発明の実施例における各ポリペプチドを用いたｉＰＳ細胞の増殖曲線を示すグラフである。 本発明の実施例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞コロニーの形態像（左欄）及び拡大像（右欄）である。 本発明の実施例における各ポリペプチド上での培養を行った場合のｉＰＳ細胞のＤＡＰＩ染色像（左欄）及びＮＡＮＯＧ染色像（右欄）である。
　本発明のポリペプチドは、（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含み、培養器への吸着能を有する４０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は、（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列の少なくとも一方を含む第１の領域と、（２）（２－ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２－ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２－iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個～３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列を含む第２の領域と、を含み、４０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである。以下、本明細書では、これらのポリペプチドを「培養用ポリペプチド」と称する場合がある。ただし、本ポリペプチドは、培養用以外の目的に用いてもよい。
　本発明にかかる前記培養用ポリペプチドでは、所定のアミノ酸配列を含む第１の領域が、優れた細胞接着性を有することから、細胞、特に多能性幹細胞を良好に増殖させることができることが本発明において見いだされた。このようなアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドは、多能性幹細胞を、未分化状態の維持しながら長期にわたって増殖させることができる。
　また、所定の配列を含む第２の領域が、培養器の表面に対する吸着性に寄与することが本発明において見いだされた。このようなアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドは、培養器への良好な接着性を示し、前記第１の領域と共にポリペプチドに含まれることによって、培養期間中に培養器の細胞培養表面から剥がれることなく、多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながら長期にわたって増殖させることができる。また、本発明のポリペプチドは、培養中の未分化状態の多能性幹細胞を、培養器の表面からの剥がれを抑制しつつ増殖させることができ、培養操作における取扱い性を向上させることができる。
　この結果、本発明によれば、多能性幹細胞の未分化状態での増殖を促進すると共に、化学結合による培養器への固定処理を必要とせず、工業的に生産可能なポリペプチドを得ることができる。
　また、本発明にかかるポリペプチドは、天然ヒトビトロネクチンと比べて抗原性物質、感染症源の混入リスクを排除すると同時に、天然ビトロネクチンと同等の性能、即ち多能性幹細胞に対する接着性、細胞増殖性、未分化維持性を保持することができる。
　一方、本発明にかかるポリペプチドの存在下（好ましくは、更に異種動物由来成分等の非存在下）で培養した多能性幹細胞は、試料等に由来する抗原性物質等の異物の混入可能性を、ほとんど完全に、または大幅に排除することが可能であり、当該培養方法にて培養した多能性幹細胞は医療用途、もしくはそれに準じた用途への使用に対し、充分に安全性を担保することができる。
　また本発明のポリペプチドを用いた培養方法によれば、多能性幹細胞をより低コスト、かつ簡便な操作にて培養することができ、医療用途のみならず研究分野での需要に対しても広く貢献することができる。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
　また、本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　また、本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
　本明細書において、「同種」とは、ヒトを意味し、「異種」とは、ヒト以外の動物を意味する。
　本明細書では、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当該技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基を「Gly」）で表記する場合がある。
　本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸（又はイミノ酸）残基の個数を基準とする。
　本明細書において、アミノ酸配列の特定のアミノ酸残基について使用される「対応するアミノ酸残基」等の表現は、対比する２つ以上のアミノ酸配列を、当該技術分野で周知のやり方で、挿入、欠失、及び置換を考慮に入れたうえで、同一となるアミノ酸残基が最も多くなるように整列（アライメント）させたときに、基準となるアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の位置に一致する、他方のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を示すことを意味する。
　本明細書におけるアミノ酸配列に関する「同一性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、4ｔｈＥｄ　－　Ｃｈａｐｔｅｒ　１８を参照）を用いて計算される値を指すことができる。例えば、配列番号２に対して同一性５０％以上とは、ＢＬＡＳＴにおけるＭａｘ．Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓの値が５０以上であることを示す。
　本発明において、ビトロネクチンとは、ヒトビトロネクチンを意味し、具体的には、下記配列番号３で示される全長４９５アミノ酸残基で構成されたポリペプチドである。なお、天然のビトロネクチンは、配列の一部に糖鎖を有する糖タンパク質であることも確認されている。
配列番号３：
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSAGTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
＜ポリペプチド＞
　本発明にかかるポリペプチド（培養用ポリペプチド）は、（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含み、培養器への吸着能を有する４０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は、以下の第１の領域と第２の領域とを含み、４０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである：
　（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列（以下、単にＲＧＤ配列と称する）からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域と、
　（２）（２－ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２－ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（３－iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個～３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列を含む第２の領域。
　前記第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列からなる群より選択された少なくとも一方を含む。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ビトロネクチンのアミノ酸配列における２５番目～３１番目の７アミノ酸残基に相当する。また、ＲＧＤ配列は、ビトロネクチンのアミノ酸配列における４５番目～４７番目の３アミノ酸残基に相当する細胞接着性モチーフである。これらのアミノ酸配列はいずれも、天然ビトロネクチンの比較的Ｎ末端側に位置する配列であり、未分化多能性幹細胞との接着性を発揮し、その結果、未分化状態に維持された多能性幹細胞を増殖可能にしていると推測される。このため、これらのアミノ酸配列のいずれも含まないポリペプチドでは、細胞接着性に劣り、本発明の効果を得ることができない。ただし、本発明は、この理論に拘束されない。
　なお、配列番号１で示されるアミノ酸配列における２つのシステイン残基は、これら両者間で架橋していてもよい。これにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列において高次構造が形成されて、多能性幹細胞との接着性が向上する傾向がある。
　ここで、「多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能である」とは、多能性幹細胞が培養期間において分化能を維持していることを意味する。多能性幹細胞が未分化状態であるか否かは、既知の評価方法で行うことができる。例えば、分子マーカーの発現（ＳＳＥＡ－４、及び／又はＯｃｔ－４等のフローサイトメトリーによる発現測定、Ｏｃｔ－４及び／又はＮＡＮＯＧ等の免疫染色など）、インビトロ実験における多能性分化の確認、および免疫不全マウス等への移植によるテラトーマ形成の確認などの当業者既知の方法によりなされる。増殖しているか否かは、常法により、各種顕微鏡を用いた目視による観察若しくは、ＡＬＰ活性等の反応試験、フローサイトメトリーなどを利用した手法、又はその他の手段により行えばよい。また、本発明における多能性幹細胞が分化能を維持培養期間としては、培養条件及び多能性幹細胞の細胞状態によって異なるが、例えば、１ヶ月の培養期間とすることができる。
　前記培養用ポリペプチドにおける第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列からなる群より選択されるいずれか一方を有していればよく、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、前記培養用ポリペプチドにおける第１の領域は、これらの配列の双方を含むことが好ましい。
　前記第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列以外のアミノ酸配列を有していてもよい。このような他のアミノ酸配列としては、例えば、第１の領域の細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、（１ａ）配列番号３で示されるヒトビトロネクチンのアミノ酸配列の１番目～２４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、（１ｂ）４８番目～５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は（１ｃ）３２番目～４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列等、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。なお、（１ａ）～（１ｃ）のアミノ酸配列はそれぞれ、第１の領域の細胞接着性及び細胞増殖性を損なわない範囲で、１個～３０個のアミノ酸残基を置換、欠失又は削除した配列を有するものであってもよく、（１ａ）～（１ｃ）のアミノ酸配列それぞれの配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　前記第１の領域は、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列に加えて、（１ａ）～（１ｃ）のアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１つを含むことができ、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、配列番号１で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤ配列の双方を含み、且つ、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目～５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又はこれに近似した若しくはその一部のアミノ酸配列を有することが好ましい。
　前記第１の領域のアミノ酸残基数は、細胞接着性及び増殖性の観点から、３～６０アミノ酸残基数とすることができ、１０～５５アミノ酸残基数であることが好ましい。
　前記第２の領域は、配列番号２で示される３２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、培養用ポリペプチドの精製容易性の観点から好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然ビトロネクチンのＣ末端側に位置するヘモペキシン様ドメインIIの一部に含まれ、配列番号３で示されるアミノ酸配列の第３４２番目～第３７３番目のアミノ酸残基で構成されたヘパリン結合ドメインに相当する。以下、配列番号２で示されるアミノ酸配列をヘパリン結合ドメインと称する場合がある。
　前記培養用ポリペプチドは、前記ヘパリン結合ドメインを有することにより、培養器への吸着能を有すると推測される。この結果、未分化多能性幹細胞を、未分化状態を維持して長期にわたり培養することができるが、本発明はこの理論に拘束されない。
　また、前記培養用ポリペプチドは、前記ヘパリン結合ドメインを含むことにより、前記培養用ポリペプチドの親水性を担保し、ポリペプチドの疎水凝集を抑制する傾向がある。この結果、前記培養用ポリペプチドが精製しやすくなり、製造効率を高めることができる。
　ここで、「培養器への吸着能を有する」とは、前記アミノ酸配列が、対象となる培養器の細胞培養表面（以下、単に「培養表面」ということがある）に対して化学的な反応をすることなく物理的に吸着することを意味する。培養器の培養表面に対して吸着能を有するか否かについては、例えば、プラズマ処理したポリスチレン製培養器に２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２となるように当該ポリペプチドを含有する溶液を添加して３７℃で２時間放置した後、リン酸緩衝液にて２回洗浄したときに、培養皿表面に残存する当該ポリペプチドが１０ｐｍｏｌ/ｃｍ２以上存在するか否かにより評価することができる。
　ここで培養皿表面に残存するポリペプチドの量は、ポリペプチドを認識する抗体との結合量を定量するＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法又は、吸着したポリペプチドを加水分解し、生じたアミノ酸をＨＰＬＣなどによって定量することにより測定できる。
　また前記ヘパリン結合ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有すると共に、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能、且つ培養器への吸着能を有するアミノ酸配列であってもよい。
　また更に前記ヘパリン結合ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、１個～３０個、好ましくは１個～１５個、好ましくは１個～６個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ培養器への吸着能を有するアミノ酸配列であってもよい。
　前記培養用ポリペプチドは、前記第１の領域と、前記第２の領域とを有していればよく、その相対位置には特に制限はない。前記培養用ポリペプチドでは、第１の領域が、前記第２の領域のＮ末端側に位置していることが好ましい。
　前記培養用ポリペプチドは、４０個～４５０個のアミノ酸残基からなる。４０アミノ酸残基未満では、細胞接着性若しくは細胞増殖性又は培養器への吸着能が充分とはいえない．一方、４５０アミノ酸残基を超えると、細胞接着性又は細胞増殖性及び培養器への吸着能が適切に発揮されない場合があり、さらに、タンパク質同士の会合、架橋又は凝集の形成が起こりやすくなる。前記培養用ポリペプチドは、凝集の形成等を起こりにくくするという観点から、８０個以上であることが好ましく、９０個以上であることがより好ましく、１００個以上であることが更に好ましく、一方、４００個以下であることが好ましく、２５０個以下であることがより好ましく、１７０個以下であることが更に好ましく、１５０以下であることが更により好ましい。これらの上限値又は下限値はいずれを組み合わせてもよく、例えば、４０個～４００個のアミノ酸残基からなることが好ましく、８０個～２５０個のアミノ酸残基からなることがより好ましく、８０個～１５０個のアミノ酸残基からなることが更に好ましく、１００個～１５０個のアミノ酸残基からなることが更により好ましい。
　前記培養用ポリペプチドは、－２．０～－０．９５のＧＲＡＶＹ値を有することが、疎水凝集を防ぐ観点から好ましい。ＧＲＡＶＹ値（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132） は、ポリペプチドの疎水度の総平均を表す。ＧＲＡＶＹの値が大きいほど、疎水度が高いことを意味する。ＧＲＡＶＹ値が－０．９５以下であれば、疎水凝集の発生を容易に抑制できる傾向がある。一方、－２．０以上であれば、培養器表面への吸着及び未分化細胞の増殖をしやすくなり、ＧＲＡＶＹ値が大きくなるにつれて吸着性及び細胞増殖性が向上する傾向がある。ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値としては、凝集形成の抑制と吸着性又は細胞増殖性を両立する点で、－１．７０～－０．９７５がより好ましく、－１．６０～－１．１０が更に好ましい。アミノ酸残基数が少ないほど凝集する傾向があるため、アミノ酸残基数が８０～１７０個のポリペプチドである場合に、凝集形成の抑制と吸着性又は細胞増殖性を両立する点で、ＧＲＡＶＹ値が－１．７０～－０．９７５であることが好ましく、－１．６０～－１．１０であることが更に好ましい。
　ＧＲＡＶＹ値を調整するには、配列中の、例えば疎水性アミノ酸（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＭｅｔ）の割合の増減、又はアミノ酸残基数の増減等により調整することができる。
　前記培養用ポリペプチドは、前記第１の領域及び前記第２の領域以外の他のアミノ酸配列を有することが好ましい。細胞接着性及び培養器への吸着能を適切に発揮する観点から、前記培養用ポリペプチドは、配列番号３で示されるポリペプチド、即ち、ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列の部分配列を含むことが好ましい。これにより、前記培養用ポリペプチドは、ヒトビトロネクチンに近い性質、例えば、多能性幹細胞に対する優れた接着性及び増殖性を獲得することができる。
　前記培養用ポリペプチドに含まれうるヒトビトロネクチンの部分アミノ酸配列としては、前記培養用ポリペプチドの細胞接着性及び細胞増殖性、又は培養器への吸着能、又は凝集形成抑制の観点から、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つを含むことが好ましい：
　（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第３の領域、及び、
　（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第４の領域。
　前記第３の領域としては、ポリペプチドの作製時、疎水凝集を抑制する傾向があるという観点から、（３ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、１３２番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を選択することができ、又は、（３ｂ）２６９番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を選択することができ、（３ｃ）２７４番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を選択することができ、又は、（３ｄ）２９４番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができる。（３ａ）～（３ｄ）のアミノ酸配列では、アミノ酸残基数を減らすことによって疎水凝集を軽減できる傾向がある。中でも、（３ｄ）のアミノ酸配列を選択することが、疎水凝集をより確実に抑制できる傾向があるため好ましい。
　前記第４の領域としては、培養皿への吸着性の観点から、３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができ、３７４番目～４０９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができ、３７４番目～３７９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列とすることができる。
　中でも、培養皿への吸着性に加えて、ポリペプチド作製時に疎水凝集を抑制しやすいという点で、３７４番目～３７９番目が好ましく、選択するアミノ酸数を減らすことによって疎水凝集が軽減される傾向がある。
　前記第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列とは、所定範囲のアミノ酸残基のうち、連続する３アミノ酸残基以上で構成されたアミノ酸配列を意味する。これらの部分アミノ酸配列のアミノ酸残基数は、上述した前記培養用ポリペプチドの総アミノ酸残基数を超えない範囲で選択すればよい。
　なお、前記第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列は、それぞれのアミノ酸配列又はその部分配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列であってもよい。これらのアミノ酸配列は、前記培養用ポリペプチドの細胞接着性及び培養器への吸着性を損なわない範囲で選択可能である。
　また前記第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列は、それぞれのアミノ酸配列又はその部分配列に対して、１個～３０個、好ましくは１個～１５個、より好ましくは１個～５個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。これらのアミノ酸残基が欠失等されたアミノ酸配列は、前記培養用ポリペプチドの細胞接着性及び培養器への吸着性を損なわない範囲で選択可能である。
　前記培養用ポリペプチドは、前記第３の領域を含むことにより、前記培養用ポリペプチドは、培養皿との吸着性を高める利点を有する傾向がある。前記第４の領域を含むことにより、前記培養用ポリペプチドは、培養皿との吸着性をさらに高める利点を有する傾向がある。前記培養用ポリペプチドは、第３及び第４の領域のいずれか一方を有していればよい。
　また、前記培養用ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値は、調整容易性の観点から、第３及び第４の領域を構成するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数の増減、アミノ酸残基の置換、欠失、付加等により調整されることが好ましく、特に、第３の領域を構成するアミノ酸配列の長さを調整することがより好ましい。
　前記培養用ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列のうち、５６番目～１３１番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよく、５６番目～２６８番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよく、２６９番目～２７３番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよく、あるいは、５０番目～２９３番目のアミノ酸残基は含まれなくてもよい。これらのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、前記培養用ポリペプチドの多能性細胞培養への性能に寄与しないものであると推測され、培養皿との吸着の観点で適した配列が選択される。
　前記第３の領域が、配列番号３で示される配列のシステイン残基に対応するアミノ酸残基を含む場合、当該システイン残基の位置に、システイン残基以外のアミノ酸残基を有していてもよい。これにより、システイン残基による分子内又は分子間架橋の形成を防ぐことができ、好ましい。システイン残基を置換する他のアミノ酸残基としては、特に制限はなく、セリン残基、アラニン残基、グリシン残基等を挙げることができる。なかでも、システインと類似の構造を有する点で、セリン残基、アラニン残基が好ましい。
　また前記培養用ポリペプチドは、細胞接着性及び培養器への吸着性が損なわれない範囲で、上記以外の他の付加的な任意のアミノ酸残基を有していてもよい。このような他の任意のアミノ酸残基からなる配列としては、例えば、前記培養用ポリペプチドを組換え技術によって容易に作製するために付加される付加配列を挙げることができる。このような付加配列としては、Ｎ末端側のメチオニン残基、Ｎ末端側のＧＰＬＧ配列、タグ配列（例えばＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等）、各領域間に付加可能なリンカー配列（例えば、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＧＳ等）などを挙げることができる。
　前記培養用ポリペプチドは、当業者に既知のアミノ酸合成技術又は遺伝子組み換え技術によって製造することができる。
　遺伝子組み換え技術により本発明の培養用ポリペプチドを得る場合、具体的にはまず、対象となるアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、目的とするポリペプチドが産生されるので、培養物から目的とするポリペプチドを常法により回収することにより、本発明にかかるポリペプチドを得ることができる。
　前記培養用ポリペプチドとしては、細胞増殖性及び未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２５番目～４７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目～３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域、を含む８０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ａ）であることが好ましい。
　また、前記培養用ポリペプチドとしては、細胞増殖性及び未分化多能性幹細胞の未分化状態での増殖能等の観点から、（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目～５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列とＲＧＤ配列を含む）からなる第１の領域と、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目～３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域（ヘパリン結合ドメイン）と、以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つ：（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域と、を含む１００個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（Ｂ）であることが好ましい。
　また、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が－２．０～－０．９５であるポリペプチドであることが好ましい。
　また、上記ポリペプチド（Ａ）は、アミノ酸残基数が８０個～２５０個であることが好ましい。
　更に、上記ポリペプチド（Ａ）は、更にＧＲＡＶＹ値が－２．０～－０．９５であり、アミノ酸残基数が８０個～２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
　また更に、上記ポリペプチド（Ａ）は、更にＧＲＡＶＹ値が－１．７０～－０．９７５であり、アミノ酸残基数が８０個～２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
　また、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、アミノ酸残基数が１００個～２５０個であることが好ましい。
　更に、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が－２．０～－０．９５であり、アミノ酸残基数が１００個～２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
　また更に、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が－１．７０～－０．９７５であり、アミノ酸残基数が１００個～２５０個のポリペプチドであることが好ましい。
　また更に、上記ポリペプチド（Ａ）又は（Ｂ）は、更にＧＲＡＶＹ値が－１．７０～－０．９７５であり、アミノ酸残基数が１００個～１７０個のポリペプチドであることが好ましい。
　前記培養用ポリペプチドの一例を以下に挙げるが、本発明はこれらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
＜多能性幹細胞の培養方法＞
　本発明の多能性幹細胞の培養方法は、支持担体の細胞培養表面に前記培養用ポリペプチドを付与して、培養用ポリペプチド被覆培養表面を得ること（以下、培養表面調製工程という）、及び、前記培養用ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養すること（以下、培養工程という）、を含む。
　本発明の培養方法は、多能性幹細胞を未分化状態で保持することができる第１のドメインと培養器への良好に吸着することができる第２のドメインとを有する前記培養用ポリペプチドを培養表面に吸着させて、その上に多能性幹細胞を播種して培養するので、多能性幹細胞を、細胞培養表面からの剥がれによる離脱を抑制しつつ、未分化状態を維持して培養することができる。
　本発明にかかる培養用ポリペプチド上で培養することにより未分化状態を保持して増殖可能な多能性幹細胞は、霊長類動物の多能性幹細胞であり、具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、及び体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞及び初期胚細胞等が包含され、これらの細胞を１種、又は必要に応じて２種以上を混合して用いてもよい。ｉＰＳ細胞には、Nature, 2007, July 19; Vol.448, pp.313-317；Cell, 2006, August 25; Vol.126(4), pp.663-676に記載されている細胞、又はこれに類する細胞が包含される。
　なかでも、本発明において好ましく適用される多能性幹細胞の例には、ｉＰＳ細胞を挙げることができる。
　なお、霊長類動物としては、ヒト、サル、ゴリラなどが挙げられ、前記培養用ポリペプチドと同属となるヒトであることが特に好ましい。本発明に適用される成分又は物質が、霊長類動物に由来する成分又は物質であれば、同種動物由来の成分又は物質として本発明に好ましく適用可能である。
　培養に用いられる培養液としては、培養対象となる細胞の種類に応じて適宜選択することができる。使用可能な培養液としては、公知のもののいずれであってもよく、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、１９９、ＭＣＤＢ１５３、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、Ｂａｓａｌ培地などを挙げることができる。また、これらの培養液には、一般に添加可能な各種の成分、例えば、グルコース、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）またはヒト血清、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％（v/v）とすることができる。
　前記培養方法では、前記多能性幹細胞を、異種動物由来成分の非存在下で培養することが好ましい。これにより、異種動物由来の異物混入の可能性を高い精度で排除することができる。異種細胞由来成分の非存在下での培養としては、異種動物由来成分を含有しない培養液を使用する培養、異種動物由来のフィーダー細胞等を使用しない培養などが挙げられる。
　更に、前記培養方法では、前記多能性幹細胞を異種動物由来成分及び血清成分の非存在下で培養することが好ましい。これにより、よりいっそう、異種動物由来成分の混入を排除することができる。
　前記異種動物由来成分を含有しない培養液としては、非必須アミノ酸、グルタミン酸、β―メルカプトエタノール、ＦＧＦ－２、ＴＧＦ－β、インスリン、トランスフェリンなどの培地成分の少なくとも１種を含有する低浸透圧培地からなる混合培地を使用することができる。具体的にはＴｅＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などの培地を使用することができるが、これに限定されない。
　なお、細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％（v/v）ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
　前記多能性幹細胞の培養および継代方法には、多能性幹細胞を維持するために用いられている通常の培地を使用することができる。具体的には、例えば、ｍＴｅＳＲ、ＴｅＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が挙げられる。培地への多能性幹細胞の播種は常法により行う。なお、一連の継代において用いる培地は必ずしも同一でなくてもよく、多能性幹細胞を未分化状態に維持することができるかぎり、異なる培地であってもよい。
　前記培養表面調製工程では、前記培養用ポリペプチド被覆培養表面は、支持担体の培養表面に対して前記培養用ポリペプチドを所定量含有するコーティング溶液を付与することを含む。これにより、前記培養用ポリペプチドにより培養表面を被覆することができる。前記コーティング溶液における前記培養用ポリペプチドの含有量は、コーティング対象となる培養表面の種類又は大きさによって異なるが、培養表面に対する吸着能の観点から、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２～１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２とすることが好ましく、１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２～３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２とすることがより好ましい。前記コーティング溶液を調製するために用いられる水性媒体としては特に制限はなく、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、超純水等を挙げることができる。
　コーティングは、前記コーティング溶液を付与した後、所定時間、例えば３０分～２４時間程度保持すればよく、これにより特別な処理を要せずに、培養表面に前記培養用ポリペプチドを被覆することができる。
　培養工程は、前記培養用ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養することを含む。
　多能性幹細胞の播種密度及び培養については、特に制限はなく、一般に行われる条件をそのまま適用すればよい。例えば、１×１０３個／ｃｍ２～１×１０５個／ｃｍ２程度の播種密度として、上述した培養及び継代条件にて培養すればよい。また１０μｍ～１００μｍの細胞塊を１個／ｃｍ２～５個／ｃｍ２程度の播種密度として上述した培養及び継代条件にて培養してもよい。
　これにより、前記培養用ポリペプチド上で多能性幹細胞を取り扱いよく、また未分化状態を維持して良好に増殖させることができる。
＜培養器＞
　本発明において培養器とは、細胞培養に用いられる表面を有する支持担体を指す。このような支持担体としては、当業界で細胞培養用支持担体として周知のものをそのまま用いることができる。支持担体の例には、プラスチック（例えば、ポリスチレン、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂）、ガラス、微孔質のフィルター（例えば、セルロース、ナイロン、ガラス繊維、ポリエステルそしてポリカーボネート）、バッチ式又は連続式で細胞培養において、あるいは遺伝子工学（例えばバイオリアクター等）において用いられるバイオリアクター用材料（中空繊維チューブ又はマイクロキャリアビーズを含めてもよい。）及び、ポリエチレンテレフタレート、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、セラミック及びその関連ポリマー材料等を含めてもよい。
　また、前記支持担体は、プラズマ重合薄膜により培養表面が被覆された支持担体であってもよい。
　前記培養器の形態としては特に制限はなく、前記多能性幹細胞の培養に適用可能な如何なる形態であってもよい。このような形態の容器の例としては、マルチウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、９６ウェル）、培養皿（例えば、ペトリディッシュ等）、チューブ、培養フラスコ、ローラーボトル、振盪培養フラスコ等を挙げることができる。
　本発明にかかる培養器は、細胞培養表面を有する支持体と、前記支持体の細胞培養表面上に配置された培養用ポリペプチドを有するものである。
　本培養器は、前述した本発明にかかる培養用ポリペプチドを備えた培養表面を有しているので、培養表面に対して前記培養用ポリペプチドが良好に吸着しており、前記培養用ポリペプチド上に多能性幹細胞を播種した場合には、取扱い性よく、未分化状態を維持させた状態で多能性幹細胞を増殖させることができる。
　ここで、培養器における培養表面とは、細胞を播種し成育する際に、細胞が付着し得る表面を意味する。
　本発明にかかる培養器は、細胞培養表面を有する支持担体を備えたものを準備すること（以下、「準備工程」）、前記細胞培養表面に、前記培養用ポリペプチドを付与して、吸着処理を行うこと（以下、「吸着処理工程」）を含む製造方法により製造することができる。これにより、簡便に本発明にかかる培養器を得ることができる。
　準備工程では、前記培養表面を有する支持担体を備えた培養器が準備される。前記支持担体が、プラズマ重合薄膜を培養表面に有する場合には、プラズマ重合薄膜を支持担体上に形成する工程を含めてもよい。プラズマ重合薄膜を形成する方法については、常法をそのまま適用すればよい。
　吸着処理工程では、本発明にかかる培養用ポリペプチドを前記培養表面に付与して保持することを含む。吸着処理工程では、培養用ポリペプチドを所定量で含有する吸着液を調製し、培養表面に付与し、所定時間保持することにより、前記培養用ポリペプチドを培養表面に吸着させればよい。
　吸着処理工程については、前記培養方法において前記培養用ポリペプチド被覆培養表面調製工程で説明した事項をそのまま適用することができる。
　以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
［実施例１］
＜ポリペプチドの調製＞
　ＰＣＲを利用した常法にて、表２及び表３に示すアミノ酸配列を有するＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１７の各ポリペプチドをコードする遺伝子配列を増幅した。なお、ＲＣＰ－１１は天然ヒトビトロネクチンの配列に相当する。なお、各ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号３）における位置を、表２及び表３中、「ＮＯＴＥ」欄に示す。ただし、各ポリペプチドのアミノ酸配列には、表中に記載された対応する範囲の天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列に対して付加、削除、又は置換されたアミノ酸配列が含まれる場合がある。なお、ＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０及びＲＣＰ－１７は、上述した配列番号４～１３及び配列番号３８で示されるアミノ酸配列のそれぞれに対して、１位にメチオニンを有する以外は、同一のアミノ酸配列を有する。
　ＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０及びＲＣＰ－１７については、あらかじめＮｃｏＩ（タカラバイオ社）にて切断処理したｐＥＴ－２８ｂ（＋）に、ＩｎＦｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて目的遺伝子を挿入し、各発現用ベクターを構築した。ＲＣＰ－１１～ＲＣＰ－１６については、あらかじめＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）にて切断処理したｐＧＥＸ－６Ｐ－１（ＧＥヘルスケア社）に、上記と同様の手法にて目的遺伝子を挿入し、各発現用ベクターを構築した。発現用ベクターの配列は、シークエンス解析により確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 
　作製したＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０及びＲＣＰ－１７の発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に常法によりトランスフォーメーションし、カナマイシン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃、１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬工業）を添加して、３７℃、５時間振とう培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。
　菌体を遠心処理にて回収し、菌体を洗浄用バッファ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）にて再懸濁した。ソニケーションにて菌体を破砕した後、１５０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃で遠心し、不溶性画分を回収した。０．５質量％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００を含む洗浄用バッファで洗浄した後、低濃度尿素バッファ（Ｌｏｗ　Ｕｒｅａ　Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ７．６）にて再懸濁し、ソニケーション処理を行った。遠心処理にて不溶性各分を回収した後、高濃度尿素バッファ（Ｈｉｇｈ　Ｕｒｅａ　Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を添加し、ソニケーション処理にて不溶性各分を可溶化した。
　上記の方法により得られた目的ペプチドを含む溶液を、ＡＫＴＡ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥヘルスケア社）及びＨｉＴｒａｐ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ＨＰ　５ｍｌ（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。前記高濃度尿素バッファを結合用バッファとして、高塩濃度調整バッファ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１Ｍ　ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を溶出用バッファとして段階的溶出を行い、目的のポリペプチドを精製した。
　上記で作製されたＲＣＰ－１１～ＲＣＰ－１６の発現ベクターを、ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に常法によりトランスフォーメーションし、アンピシリン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃、１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１００μＭのＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド）を添加して、２０℃、２４時間振とう培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。
　菌体を回収し、Ｂ－ＰＥＲ（登録商標）　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｉｎ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて再懸濁したのち、ソニケーションにて菌体を破砕した。１５０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃で遠心して不溶性画分を除去し、上清をＡＫＴＡ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００、及びＧＳＴｒａｐＨＰ　５ｍｌ×２（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。溶出画分をＨｉｐｒｅｐ　２６／１０　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＧＥヘルスケア社）を用いて脱塩し、更に、ＧＳＴ融合タンパク質切断用プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ）を、溶液量の１／２０００で添加して４℃で２４時間インキュベートし、ＧＳＴタグを切断した。再度ＧＳＴｒａｐＨＰ　５ｍｌ×２にて精製し、切断したＧＳＴタグをカラムに吸着させ除去した。カラム通過画分をＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｉｚｅｒ（３．５Ｋ ＭＷＣＯ．：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、以下、同じ）を用いて透析し、ＰＢＳに置換した。
　上記のようにして得られたＲＣＰ－１のポリペプチドを、レディーゲル（１２．５％，Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）で泳動し、ＧｅｌＣｏｄｅＴＭ　Ｂｌｕｅ　Ｓｔａｉｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で染色した。その結果、アミノ酸配列から予想される分子量２８．３ｋＤａに相当する箇所に単一のバンドが確認できた。その他のポリペプチドに対しても同様の結果が得られた。
　ＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０及びＲＣＰ－１７について、精製後の各ポリペプチド溶液を、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｉｚｅｒ（３．５Ｋ ＭＷＣＯ．）を用いて透析した。透析外液は、透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．５Ｍ　Ｌ－アルギニン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を基本とし、段階透析にて尿素を除去した。最終透析産物はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｒｅｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。透析後の凝集の有無を表４に示す。
　またＧＲＡＶＹ値は、アミノ酸ごとに決められている疎水性の指標を総和し、アミノ酸数で割った値として計算した（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132参照）。ＧＲＡＶＹ値は各ポリペプチドに含まれるアミノ酸の疎水度から計算されるポリペプチドの親疎水性の指標であり、値が大きいほど疎水的、小さいほど親水的であることを示す。結果を表４に示す。
　また凝集有無については、以下のＧ、Ａ及びＢで評価した。結果を表４に併せて示す。
　Ｇ：凝集物形成が見られない。
　Ａ：粒径１００ｎｍ程度の粒子形成が認められる。
　Ｂ：粒径１ｍｍ以上の可視凝集の形成が認められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 
　表４に示されるように、ＲＣＰ－２～ＲＣＰ－５、ＲＣＰ－７～ＲＣＰ－８、及びＲＣＰ－１７は、アミノ酸残基数が８０個～１７０個のポリペプチドであり、凝集が生じやすいが、ＧＲＡＶＹ値が－１．７０～－０．９７５であるため、凝集形成が抑制されていることがわかる。
［実施例２］
＜培養皿への吸着性評価＞
　上記の方法により得られた各ポリペプチドを、所定のバッファにて、０～２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の所定の最終濃度でウェルへ添加できるように希釈し、プラズマ処理済ポリスチレン製９６ウェルプレート（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ―Ｔｒｅａｔｅｄ、Ｆａｌｃｏｎ社）に６４μＬずつ添加した。３７℃、２時間インキュベートして各ポリペプチドをプレートに吸着させた後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１６の各ポリペプチド被覆表面を得た。
　上記のようにして得られた各ポリペプチド被覆表面のうち、ＲＣＰ－１およびＲＣＰ－１１～１６を被覆した表面に対し、ホウ酸バッファと１ＮのＮａＯＨをそれぞれ６４μＬ付与し、８０℃、湿度１００％で２４時間インキュベートした。空冷後、各ウェルにホウ酸バッファを７５μＬ添加し、さらにＯＰＡ（ｏ－フタルアルデヒド：和光純薬）／メタノール溶液（１６０ｍｇ／ｍｌ）と、ＮＡＣ（Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン：和光純薬）／ホウ酸バッファ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を１：１００（質量比）に混合した反応液を５０μＬ添加した。４０℃で３０分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ マルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて蛍光強度を測定した（励起３５５ｎｍ／蛍光４８６ｎｍ）。別途各ポリペプチド溶液より検量線を作成し、吸着量を算出した。結果を図１に示す。図１において黒菱形はＲＣＰ－１、黒四角はＲＣＰ－１１、黒三角はＲＣＰ－１２、黒丸はＲＣＰ－１３、白菱形はＲＣＰ－１４、白四角はＲＣＰ－１５、白三角はＲＣＰ－１６をそれぞれ示す。
　図１に示されるように、試験に使用したポリペプチドのうち、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２［配列番号３における３４２番目～３７３番目］）を含むＲＣＰ－１、１５、１６のポリペプチドを用いた場合に、ヒトビトロネクチンの配列を有するＲＣＰ－１１と同等の良好なプレートへの吸着性を有することがわかる。一方でＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮを含まないＲＣＰ－１３、１４の吸着量は該配列を含むポリペプチドに対して約１／４と低く、培養皿への吸着材として不適当であることがわかる。
［実施例３］
＜細胞接着性評価１＞
　上記ポリペプチドへのヒトｉＰＳ細胞（「Ｔｉｃ」：細胞番号Ｎｏ．ＪＣＲＢ１３３１：独立行政法人　医薬基盤研究所［５６７－００８５　大阪府茨木市彩都あさぎ７丁目６番８号］より分譲）の細胞接着性評価は、以下のとおりに行った。
　ヒトｉＰＳ細胞を維持するためのフィーダー細胞として、ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）（初代マウス胚性線維芽細胞：ハイグロマイシン耐性、マイトマイシンＣ処理済み, Ｃ５７／ＢＬ６由来、継代３代目）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％ (v/v) ウシ胎児血清培地を使用して２４時間培養し、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）上に接着させた。ヒトｉＰＳ細胞用培地は、表５の組成のものに、ＦＧＦ－２（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 
　ｉＰＳ細胞は、上記培地を用いて、３７℃、５％（v/v、以下同じ）ＣＯ２インキュベーター内で維持培養した。培地はｉＰＳ細胞の播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。継代操作は ディスパーゼII（ｎｅｕｔｒａｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ＧｒａｄｅII、Ｒｏｃｈｅ社）で細胞を剥離し、ピペッティング操作にて細胞を適切なサイズに分離することで実施した。
　上述の様にして培養したヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて３７℃、５分間処理し、シングルセルに分離した。３００ｒｐｍ，２ｍｉｎ遠心して細胞を回収し、終濃度１０μＭ　Ｙ－２７３６２（（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）－４－（１－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｉａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤、和光純薬工業）を含むＴｅＳＲ２（異種動物由来成分、血清成分不含培地、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁した。
　ＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０及びＲＣＰ－１７と、ＲＣＰ－１１、ＲＣＰ－１５及びＲＣＰ－１６と、比較対照として、ヒトビトロネクチン（ヒト血漿より抽出、ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、リコンビナントラミニン（ｒＬａｍｉｎｉｎ－５：オリエンタル酵母社、及び、Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｌａｍｉｎｉｎ－５１１：Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）とを、それぞれ表６に示す添加濃度となるように、試料１～１７を調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、３７℃、２時間保持して吸着させた。得られたペプチド処理９６ウェルプレートの各ウェルに対し、ｉＰＳ細胞を、３００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度となるように播種した。２４時間培養した後、非接着細胞をＰＢＳ洗浄にて取り除き、接着細胞のみを４％パラホルムアルデヒド（和光純薬）にて固定した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標） ＡＰ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にてＡＬＰ活性を算出し、検量線からＡＬＰ活性を有する未分化ｉＰＳ細胞数を算出した。結果を表６に示す。表６中、細胞接着率については、天然ビトロネクチンを用いた試料１５による細胞接着率を１００とした相対値とした。ｎ＝３。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示されるように、配列番号３に記載された配列の１番目～５５番目を有するＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０、ＰＣＲ－１７及びＲＣＰ－１１と天然ヒトビトロネクチンは、ｉＰＳ細胞の細胞接着率が良好であった。特に、配列番号３に記載された配列の第５６番目から第２６８番目のアミノ酸の一部もしくは全てを含まないＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０、ＰＣＲ－１７は、天然ヒトビトロネクチン及び、天然ヒトビトロネクチンと同一アミノ酸配列を有するＲＣＰ－１１よりも細胞接着率が良好であった。これより、配列番号３に記載された配列の１番目～５５番目に細胞接着に重要な配列が存在することがわかる。
［実施例４］
＜細胞接着性評価２＞
　表７に示すポリペプチドをＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。天然ビトロネクチンを１３０ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度で吸着させた表面を作製した後、１００μＭの上記合成ペプチドを添加した細胞懸濁液を３０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種した。播種２４ｈ後の接着細胞数を、＜細胞接着性評価１＞と同様の手法にて算出した。結果を表７に示す。表７中、細胞接着率については、合成ペプチドを含まない培養液での細胞接着率を１００とした相対値とした。ｎ＝３。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 
　表７に示されるように、ＣＳＹＹＱＳＣ又はＲＧＤを含むＰｅｐｔｉｄｅ－４、５及び６を添加することで天然ビトロネクチンへの細胞の接着が有意に阻害されたのに対し、ＣＳＹＹＱＳＣおよびＲＧＤを含まないＰｅｐｔｉｄｅ－１、２、３およびＰｅｐｔｉｄｅ－５、６のＲＧＤ配列をＲＧＥに置換したＰｅｐｔｉｄｅ－７、８を添加した場合は接着阻害が無いことがわかる。従って、ポリペプチドがＣＳＹＹＱＳＣ及びＲＧＤの少なくとも一方を含むことにより、細胞接着能が発揮されることがわかる。
［実施例５］
＜増殖評価＞
　上記＜細胞接着性評価１＞と同様に回収したｉＰＳ細胞を、ＲＣＰ－１、１１及び天然ヒトビトロネクチンを吸着させた９６ウェルプレートに対し、２５０ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で８日間培養した。各経時後の接着細胞数を、上記＜細胞接着性評価１＞と同様の方法で計測し、増殖曲線を得た。増殖曲線を図２に示す。なお図２において黒菱形はＲＣＰ－１を用いた例、黒四角はＲＣＰ－１１を用いた例を示す。
　同様にＲＣＰ－１～１０及びＲＣＰ－１７と、比較対照として、Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｌａｍｉｎｉｎ－５１１をそれぞれ表８に示す添加濃度となるように、試料１～１２を調製し、上記＜細胞接着性評価１＞と同様にして各ポリペプチドを吸着させた９６ウェルプレートに対して５０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの割合で播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。３日後の細胞数を上記＜細胞接着性評価１＞と同様の方法で計測した。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 
　図２より、ＲＣＰ－１は、天然ビトロネクチンのアミノ酸配列を有するＲＣＰ－１１よりも高い細胞増殖性を示し、ＲＣＰ－１１は、培養８日目でＲＣＰ－１を用いた場合よりも約１／３程度の細胞数であった。得られた細胞数の増減から倍加時間を算出したところ、ＲＣＰ－１を用いた場合には４６．４±２．１時間、ＲＣＰ－１１を用いた場合には６７．７±２．１時間であった。
　また表８より、ＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０及びＲＣＰ－１７はいずれも、ビトロネクチンと同じ細胞外マトリクスであるラミニンよりも細胞増殖率が高いことがわかる。このような高い細胞増殖率は、配列番号３における２７４番目のシステイン残基をセリン残基に置換しても同様に得られることがわかる。
　図２及び表８の結果から、驚くべきことに、細胞増殖と培養皿への吸着に有効な配列からなり、天然ヒトビトロネクチンの第５６番目から第２６８番目のアミノ酸の一部もしくは全てに相当する配列を含まないＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０及びＲＣＰ－１７は、ヒトビトロネクチンと同等の配列を有するＲＣＰ－１１、及び比較例であるＬａｍｉｎｉｎ－５１１よりも高い増殖能を有していることがわかる。
　さらに、表８より、ＣＳＹＹＱＳＣの配列及びＲＧＤ配列と、ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮの配列の双方を含むＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０及びＲＣＰ－１７はいずれも高い細胞増殖性を示すことがわかった。
［実施例６］
＜細胞接着性評価３＞
　ＲＣＰ－１を、１２５ｐｍｏｌ/ｃｍ２～１０００ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度にＰＢＳで調整して使用した以外は、前記＜細胞接着性評価１＞と同様にして細胞接着性を評価した。結果を表９に示す。表９中、細胞接着率については、天然ビトロネクチンを１３０ｐｍｏｌ/ｃｍ２の濃度で吸着させた培養器に対する細胞接着率を１００とした場合の相対値とした。ｎ＝３。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 
　表９に示されるように、ＲＣＰ－１に対するｉＰＳ細胞の接着性は、１２５ｐｍｏｌ/ｃｍ２以上添加することで天然ビトロネクチンと同等の細胞接着率を示した。
［実施例７］
＜未分化維持評価＞
　上記＜細胞接着性評価１＞と同様に回収したｉＰＳ細胞を、ＴｅＳＲ２中に懸濁した。上記＜細胞接着性評価１＞で用いた試料１、試料２、試料５、試料６及び試料７をそれぞれ、上記＜細胞接着性評価１＞と同様にして吸着させた６ウェルプレート（Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ－ｔｒｅａｔｅｄ，　Ｆａｌｃｏｎ社）にｉＰＳ細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培地は播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。６日毎に前述と同様の方法にて継代を行った。それぞれの試料上で培養したｉＰＳ細胞の形態を図３に示す。
　また本条件で１ヶ月間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ／ＰＢＳにて膜透過性を亢進させた。Ｉｍａｇｅ　ＩＴ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にてブロッキング処理を行った後、抗ヒトＮＡＮＯＧ抗体（ＡＦ１９９７，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５５５結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびＤＡＰＩ（同仁化学社）を添加して標識し、蛍光顕微鏡にて撮像した。これらの蛍光顕微鏡像を図４に示す。
　図３及び図４のそれぞれにおいて、（Ａ）はＲＣＰ－１上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｂ）はＲＣＰ－１１上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｃ）は天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｄ）はｒＬａｍｉｎｉｎ－５上で培養したｉＰＳ細胞、（Ｅ）はｒＬａｍｉｎｉｎ－５１１上で培養したｉＰＳ細胞を、それぞれ示す。スケールバー：１００μｍ。図３において左欄はコロニー全体像、右欄は拡大像であり、図４において左欄はＤＡＰＩ染色像、右欄は抗ＮＡＮＯＧ抗体による染色像を示す。図３及び図４中のスケールバー：２００μｍ。
　図３に示されるように、細胞増殖と培養皿への吸着に有効な配列を含むＲＣＰ－１、１１と天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞は均質なコロニー、かつ高い核占有率を有する未分化細胞に特徴的な形態を示していた。また図４に示されるように、細胞増殖ドメイン及び吸着ドメインを有するＲＣＰ－１、１１と天然ヒトビトロネクチン上で培養したｉＰＳ細胞は、ＮＡＮＯＧをコロニー全体に強く発現しており、未分化状態が良好に維持されていることがわかった。
　上記実施例１～７の評価結果から、ＣＳＹＹＱＳＣ及びＲＧＤ配列のいずれか一方とＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮの配列を含む４０～４５０アミノ酸残基からなるポリペプチドは、培養器への吸着性に優れていた。また、このようなポリペプチドは、ｉＰＳ細胞との共培養条件下では、ｉＰＳ細胞の細胞接着性、及び未分化状態の維持において、天然ビトロネクチンおよびヒトビトロネクチンと同等の配列を有するＲＣＰ－１１と同等であり、かつｉＰＳ細胞の増殖性においてはＲＣＰ－１１よりも優れる結果であった。ＲＣＰ－１～ＲＣＰ－１０及びＲＣＰ－１７はいずれもｉＰＳ細胞の細胞接着性及び未分化状態の維持の点で良好であることがわかる。このような各能力の全てにおいて良好の結果は、その他のポリペプチド又は比較例であるリコンビナントラミニンでは得られなかった。
　従って、本発明によれば、多能性幹細胞を未分化状態で増殖可能にすると共に、細胞培養表面への吸着性に優れたポリペプチドと、該ポリペプチドを用いた多能性幹細胞の培養方法及び培養器を提供することができる。
　２０１２年５月１日に出願された日本国特許出願第２０１２－１０４８１６号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。

Claims (28)

  1. 　（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも一方を含む第１の領域と、
    　（２）（２－ｉ）ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ（配列番号２）で示されるアミノ酸配列、（２－ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、又は（２－iii）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個～３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列を含む第２の領域と、
    　を含み、４０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
  2. 　ＧＲＡＶＹ値が－２．０～－０．９５である請求項１記載のポリペプチド。
  3. 　前記第１の領域が、ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列の双方を含む請求項１又は請求項２記載のポリペプチド。
  4. 　４０個～４００個のアミノ酸残基からなる請求項１～請求項３のいずれか１項記載のポリペプチド。
  5. 　下記（３－ｉ）～（３－iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む請求項１～請求項４のいずれか１項記載のポリペプチド：
    　（３－ｉ）　配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、５６番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、
    　（３－ii）　前記（３－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び、
    　（３－iii）　前記（３－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個～３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
  6. 　下記（３ａ－ｉ）～（３ａ－iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む請求項１～請求項４のいずれか１項記載のポリペプチド：
    　（３ａ－ｉ）　１３２番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、
    　（３ａ－ii）　前記（３ａ－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び、
    　（３ａ－iii）　前記（３ａ－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個～３０個のアミノ酸残基を付加、置換若しくは欠失させたアミノ酸配列。
  7. 　下記（３ｂ－ｉ）～（３ｂ－iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第３の領域を更に含む請求項１～請求項４のいずれか１項記載のポリペプチド：
    　（３ｂ－ｉ）　２６９番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、
    　（３ｂ－ii）　前記（３ｂ－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び、
    　（３ｂ－iii）　前記（３ｂ－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個～３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
  8. 　下記（４－ｉ）～（４－iii）のいずれかひとつのアミノ酸配列からなる第４の領域を更に含む請求項１～請求項７のいずれか１項記載のポリペプチド：
    　（４－ｉ）　配列番号３で示されるアミノ酸配列のうち、３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、
    　（４－ii）　前記（４－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び、
    　（４－iii）　前記（４－ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して、１個～３０個のアミノ酸残基を付加、置換又は欠失させたアミノ酸配列。
  9. 　前記（２－ii）のアミノ酸配列の配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する同一性が８０％以上である請求項１～請求項８のいずれか１項記載のポリペプチド。
  10. 　前記（２－iii）のアミノ酸配列の配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して付加、置換又は欠失されたアミノ酸残基数が１～１５である請求項１～請求項８のいずれか１項記載のポリペプチド。
  11. （１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２５番目～４７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、
    （２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目～３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域と、
    　以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：
    　（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び
    　（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域、
    　を含む８０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
  12. 　（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列の１番目～５５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第１の領域と、
    　（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３４２番目～３７３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる第２の領域と、
    　以下の第３の領域及び第４の領域からなる群より選択される少なくとも１つと：
    　（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列の２６９番目～３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第３の領域、及び（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列の３７４番目～４５９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列からなる第４の領域、
    　を含む１００個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
  13. 　ＧＲＡＶＹ値が－２．０～－０．９５である請求項１１又は請求項１２記載のポリペプチド。
  14. 　アミノ酸残基数が２５０個以下である請求項１～請求項１３のいずれか１項記載のポリペプチド。
  15. 　前記ポリペプチドが第３の領域を含み、前記第３の領域が、配列番号３で示されるアミノ酸配列のシステイン残基に対応する位置に、システイン残基以外のアミノ酸残基を有する請求項５～請求項１４のいずれか１項記載のポリペプチド。
  16. 　前記ポリペプチドが第３の領域を含み、前記第３の領域が、配列番号３で示されるアミノ酸配列のシステイン残基に対応する位置にセリン残基、アラニン残基又はグリシン残基を有する請求項５～請求項１４のいずれか１項記載のポリペプチド。
  17. 　前記第１の領域が、前記第２の領域のＮ末端側に位置する請求項１～請求項１６のいずれか１項記載のポリペプチド。
  18. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列における２つのシステイン残基が両者間で架橋している請求項１～請求項１７のいずれか１項記載のポリペプチド。
  19. 　配列番号４～配列番号２３、配列番号３８及び配列番号３９のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
  20. 　（１）ＣＳＹＹＱＳＣ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含み、培養器への吸着能を有する４０個～４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
  21. 　更にＲＧＤで示されるアミノ酸配列を含む請求項２０記載のポリペプチド。
  22. 　ＧＲＡＶＹ値が－２．０～－０．９５である請求項２０又は請求項２１項記載のポリペプチド。
  23. 　支持担体の細胞培養表面に、請求項１～請求項２２のいずれか１項記載のポリペプチドを付与して、ポリペプチド被覆培養表面を得ること、及び
    　前記ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養すること、
    　を含む、多能性幹細胞の培養方法。
  24. 　前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導型多能性幹細胞、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚からなる群より選択される少なくとも一種である請求項２３に記載の多能性幹細胞の培養方法。
  25. 　前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞である請求項２３又は請求項２４に記載の多能性幹細胞の培養方法。
  26. 　前記多能性幹細胞を、異種動物由来成分及び血清由来成分の非存在下で培養する請求項２３～請求項２５のいずれか１項記載の多能性幹細胞の培養方法。
  27. 　前記ポリペプチドの前記細胞培養表面への付与量が、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２～１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である請求項２３～請求項２６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
  28. 　細胞培養表面を有する支持担体と、前記支持担体の細胞培養表面上に配置された請求項１～請求項２２のいずれか１項に記載のポリペプチドと、を有する培養器。
PCT/JP2013/062122 2012-05-01 2013-04-24 多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチド WO2013164970A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2872467A CA2872467C (en) 2012-05-01 2013-04-24 Method of culturing pluripotent stem cell, and polypeptide to be used therefor
EP13784603.6A EP2845862B1 (en) 2012-05-01 2013-04-24 Method for incubating pluripotent stem cells and polypeptide to be used therefor
CN201380022493.2A CN104271593B (zh) 2012-05-01 2013-04-24 多能干细胞的培养方法及该方法中使用的多肽
JP2014513364A JP5986627B2 (ja) 2012-05-01 2013-04-24 多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチド
US14/528,197 US20150050737A1 (en) 2012-05-01 2014-10-30 Method for culturing pluripotent stem cell, and polypeptide to be used therefor
US15/291,246 US10407662B2 (en) 2012-05-01 2016-10-12 Method of culturing pluripotent stem cell, and polypeptide to be used therefor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-104816 2012-05-01
JP2012104816 2012-05-01

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/528,197 Continuation US20150050737A1 (en) 2012-05-01 2014-10-30 Method for culturing pluripotent stem cell, and polypeptide to be used therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013164970A1 true WO2013164970A1 (ja) 2013-11-07

Family

ID=49514369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/062122 WO2013164970A1 (ja) 2012-05-01 2013-04-24 多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチド

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20150050737A1 (ja)
EP (1) EP2845862B1 (ja)
JP (2) JP5986627B2 (ja)
CN (1) CN104271593B (ja)
CA (1) CA2872467C (ja)
WO (1) WO2013164970A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014078896A1 (en) * 2012-11-22 2014-05-30 Queensland University Of Technology Complex-formation-modulating agents and uses therefor
WO2015037622A1 (ja) * 2013-09-10 2015-03-19 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の培養方法、培養用キット及び多能性幹細胞培養用培地
WO2015037623A1 (ja) * 2013-09-10 2015-03-19 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の培養方法ならびにこれに用いる多能性幹細胞の培養用キットおよび培地
WO2015064661A1 (ja) * 2013-10-31 2015-05-07 富士フイルム株式会社 ポリペプチド組成物およびこれを用いた多能性幹細胞の培養方法
WO2016006712A1 (ja) * 2014-07-11 2016-01-14 国立研究開発法人産業技術総合研究所 細胞分化ポテンシャル判別法
WO2017026156A1 (ja) * 2015-08-13 2017-02-16 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の培養方法、培養容器の製造方法、培養容器、及び細胞培養用の足場材料

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019113437A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hematopoietic stem cell engraftment

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001017183A (ja) 1999-07-09 2001-01-23 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd 新規な金属プロテアーゼ
JP2010029186A (ja) 2008-07-25 2010-02-12 Becton Dickinson & Co 規定細胞培養表面及び使用方法
JP2010537626A (ja) * 2007-09-04 2010-12-09 クイーンズランド ユニバーシティ オブ テクノロジー フィーダ細胞を含まない培地および培養系
JP2012502664A (ja) 2008-09-19 2012-02-02 ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション 多能性細胞の長期培養のためのペプチド提示表面
JP2012104816A (ja) 2010-11-12 2012-05-31 Avx Corp 固体電解コンデンサ要素

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004023973A2 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 Incyte Corporation Molecules for diagnostics and therapeutics
WO2005007674A2 (en) * 2003-07-11 2005-01-27 Molecular Innovations Anti-human vitronectin antibody and methods for making the same
US8431363B2 (en) * 2008-01-09 2013-04-30 Intrexon Corporation Polynucleotides encoding therapeutic inhibitors of PAI-1
GB201015132D0 (en) * 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
EP3064576B1 (en) * 2013-10-31 2018-10-10 Fujifilm Corporation Polypeptide composition and culture method for pluripotent stem cell using same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001017183A (ja) 1999-07-09 2001-01-23 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd 新規な金属プロテアーゼ
JP2010537626A (ja) * 2007-09-04 2010-12-09 クイーンズランド ユニバーシティ オブ テクノロジー フィーダ細胞を含まない培地および培養系
JP2010029186A (ja) 2008-07-25 2010-02-12 Becton Dickinson & Co 規定細胞培養表面及び使用方法
JP2012502664A (ja) 2008-09-19 2012-02-02 ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション 多能性細胞の長期培養のためのペプチド提示表面
JP2012104816A (ja) 2010-11-12 2012-05-31 Avx Corp 固体電解コンデンサ要素

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUSUBEL ET AL.: "Short Protocols in Molecular Biology", 1999
BIOMATERIALS, vol. 31, no. 32, November 2010 (2010-11-01), pages 8281 - 8218
CELL, vol. 126, no. 4, 25 August 2006 (2006-08-25), pages 663 - 676
CHEN GUOKAI ET AL.: "Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture", NATURE METHODS, vol. 8, no. 5, 2011, pages 424 - 429, XP055092759 *
KLIM R. JOSEPH ET AL.: "A defined glycosaminoglycan-binding substratum for human pluripotent stem cells", NATURE METHODS, vol. 7, no. 12, 2010, pages 989 - 994, XP055061190 *
KYTE J.; DOOLITTLE R. F., J. MOL. BIOL, vol. 157, 1982, pages 105 - 132
MELKOUMIAN ZARA ET AL.: "Synthetic peptide- acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 28, no. 6, 2010, pages 606 - 612, XP002636474 *
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 19, 2001, pages 971 - 974
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 28, no. 6, 2010, pages 606 - 610
NATURE, vol. 448, 19 July 2007 (2007-07-19), pages 313 - 317
PROWSE B.J. ANDREW ET AL.: "Long term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media", BIOMATERIALS, vol. 31, 2010, pages 8281 - 8288, XP027259533 *
See also references of EP2845862A4

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014078896A1 (en) * 2012-11-22 2014-05-30 Queensland University Of Technology Complex-formation-modulating agents and uses therefor
WO2015037622A1 (ja) * 2013-09-10 2015-03-19 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の培養方法、培養用キット及び多能性幹細胞培養用培地
WO2015037623A1 (ja) * 2013-09-10 2015-03-19 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の培養方法ならびにこれに用いる多能性幹細胞の培養用キットおよび培地
US20160244728A1 (en) * 2013-09-10 2016-08-25 Fujifilm Corporation Culture method for pluripotent stem cells and kit and medium for culture of pluripotent stem cells used therein
US20160251613A1 (en) * 2013-09-10 2016-09-01 Fujifilm Corporation Culture method for pluripotent stem cells, culture kit, and medium for pluripotent stem cell culture
US10487307B2 (en) 2013-09-10 2019-11-26 Fujifilm Corporation Culture method for pluripotent stem cells
WO2015064661A1 (ja) * 2013-10-31 2015-05-07 富士フイルム株式会社 ポリペプチド組成物およびこれを用いた多能性幹細胞の培養方法
WO2016006712A1 (ja) * 2014-07-11 2016-01-14 国立研究開発法人産業技術総合研究所 細胞分化ポテンシャル判別法
JPWO2016006712A1 (ja) * 2014-07-11 2017-06-01 国立研究開発法人産業技術総合研究所 細胞分化ポテンシャル判別法
WO2017026156A1 (ja) * 2015-08-13 2017-02-16 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の培養方法、培養容器の製造方法、培養容器、及び細胞培養用の足場材料
JPWO2017026156A1 (ja) * 2015-08-13 2017-12-21 富士フイルム株式会社 多能性幹細胞の培養方法、培養容器の製造方法、培養容器、及び細胞培養用の足場材料

Also Published As

Publication number Publication date
JP6142038B2 (ja) 2017-06-07
JP5986627B2 (ja) 2016-09-06
EP2845862B1 (en) 2018-11-21
US20170022473A1 (en) 2017-01-26
CA2872467A1 (en) 2013-11-07
US20150050737A1 (en) 2015-02-19
EP2845862A4 (en) 2015-11-18
JPWO2013164970A1 (ja) 2015-12-24
JP2016138149A (ja) 2016-08-04
EP2845862A1 (en) 2015-03-11
US10407662B2 (en) 2019-09-10
CA2872467C (en) 2019-05-14
CN104271593A (zh) 2015-01-07
CN104271593B (zh) 2018-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6142038B2 (ja) 多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチド
DK2487236T3 (en) CULTURAL SUBSTANCES FOR HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS AND USE THEREOF
JP5761826B2 (ja) 改変ラミニンおよびその利用
US11999972B2 (en) Fibronectin fragment to be used for stem cell production
JP6388872B2 (ja) ポリペプチド組成物およびこれを用いた多能性幹細胞の培養方法
JP6169710B2 (ja) 多能性幹細胞の培養方法、培養用キット及び多能性幹細胞培養用培地
JP6174155B2 (ja) 多能性幹細胞の培養方法ならびにこれに用いる多能性幹細胞の培養用キットおよび培地
JP6559239B2 (ja) 多能性幹細胞の培養方法、培養容器の製造方法、培養容器、及び細胞培養用の足場材料

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13784603

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014513364

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2872467

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013784603

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE