JP6142038B2 - 多能性幹細胞の培養方法及びこれに用いるポリペプチド - Google Patents
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Description
これらの霊長類の全能性又は多能性幹細胞(これらの両者を総称して、本発明では単に「多能性幹細胞」と称する。)を培養する場合には、未分化状態で長期間にわたって維持することが要求される。未分化状態の多能性幹細胞を長期間培養するためには、一般に、マウス繊維芽細胞等のフィーダー細胞が用いられる。
しかしながら、このようなペプチドは培養器に対する吸着性が一様に低いため、培養器にて対して化学的に結合させる工程を必要とする。例えば、Nature Biotechnology, 2010, Vol.28, No.6, pp.606-610では、培養器の細胞培養表面にアクリレートを導入して、ペプチドを共有結合させることが開示されているが、この方法ではペプチドを結合させる培養表面を自由に選択することが出来ず、汎用性、簡便性に劣る上、上記ペプチドだけでは、胚性肝細胞(ESC)及び誘導性多能性幹細胞(iPS)を培養するための細胞培養性能として充分とは言えない。さらに、特表2012−502664公報には、グリコサミノグリカン(GAG)に結合するペプチドが開示されており、グリコサミノグリカンに結合する部位を利用してESC及びiPSの長期培養および維持に使用することが記載されている。しかしながら、GAGに対する結合部位だけでは、ESC及びiPSを培養するための細胞培養性能として充分とは言えない。
[1] 配列番号3で示されるアミノ酸配列の1番目〜55番目のアミノ酸配列と、配列番号3で示されるアミノ酸配列の270番目〜277番目であって但し274番目のシステイン残基がセリン残基に置換されているアミノ酸配列と、配列番号3で示されるアミノ酸配列の295番目〜373番目のアミノ酸配列と、をN末端側から順に含み、142個〜170個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。
[2] 142個〜150個のアミノ酸残基からなる、[1]に記載のポリペプチド。
[3] 支持担体の細胞培養表面に、[1]又は[2]に記載のポリペプチドを付与して、ポリペプチド被覆培養表面を得ること、及び、前記ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養すること、を含む、多能性幹細胞の培養方法。
[4] 前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導型多能性幹細胞、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚細胞からなる群より選択される少なくとも一種である[3]に記載の多能性幹細胞の培養方法。
[5] 前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞である[3]又は[4]に記載の多能性幹細胞の培養方法。
[6] 前記多能性幹細胞を、異種動物由来成分及び血清由来成分の非存在下で培養する[3]〜[5]のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養方法。
[7] 前記ポリペプチドの前記細胞培養表面への付与量が261pmol/cm2〜1000pmol/cm2である[3]〜[6]のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養方法。
[8] 細胞培養表面を有する支持担体と、前記支持担体の細胞培養表面上に配置された[1]又は[2]に記載のポリペプチドと、を有する培養器。
また、所定の配列を含む第2の領域が、培養器の表面に対する吸着性に寄与することが本発明において見いだされた。このようなアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドは、培養器への良好な接着性を示し、前記第1の領域と共にポリペプチドに含まれることによって、培養期間中に培養器の細胞培養表面から剥がれることなく、多能性幹細胞を、未分化状態を維持しながら長期にわたって増殖させることができる。また、本発明のポリペプチドは、培養中の未分化状態の多能性幹細胞を、培養器の表面からの剥がれを抑制しつつ増殖させることができ、培養操作における取扱い性を向上させることができる。
この結果、本発明によれば、多能性幹細胞の未分化状態での増殖を促進すると共に、化学結合による培養器への固定処理を必要とせず、工業的に生産可能なポリペプチドを得ることができる。
また本発明のポリペプチドを用いた培養方法によれば、多能性幹細胞をより低コスト、かつ簡便な操作にて培養することができ、医療用途のみならず研究分野での需要に対しても広く貢献することができる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書では、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当該技術分野で周知の一文字表記(例えば、グリシン残基を「G」)又は三文字表記(例えば、グリシン残基を「Gly」)で表記する場合がある。
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「%」は、特に断らない限り、アミノ酸(又はイミノ酸)残基の個数を基準とする。
本明細書におけるアミノ酸配列に関する「同一性」とは、BLASTパッケージ(Ausubelら、1999 Short Protocols in Molecular Biology、4thEd − Chapter 18を参照)を用いて計算される値を指すことができる。例えば、配列番号2に対して同一性50%以上とは、BLASTにおけるMax.Identitiesの値が50以上であることを示す。
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSAGTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
本発明にかかるポリペプチド(培養用ポリペプチド)は、(1)CSYYQSC(配列番号1)で示されるアミノ酸配列を含み、培養器への吸着能を有する40個〜450個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、又は、以下の第1の領域と第2の領域とを含み、40個〜450個のアミノ酸残基からなるポリペプチドである:
(1)CSYYQSC(配列番号1)で示されるアミノ酸配列及びRGDで示されるアミノ酸配列(以下、単にRGD配列と称する)からなる群より選択される少なくとも一方を含む第1の領域と、
(2)(2−i)PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN(配列番号2)で示されるアミノ酸配列、(2−ii)配列番号2で示されるアミノ酸配列と50%以上の同一性を有し、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列、又は(3−iii)配列番号2で示されるアミノ酸配列に対して1個〜30個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失され、培養器への吸着能を有するアミノ酸配列を含む第2の領域。
配列番号1で示されるアミノ酸配列は、ビトロネクチンのアミノ酸配列における25番目〜31番目の7アミノ酸残基に相当する。また、RGD配列は、ビトロネクチンのアミノ酸配列における45番目〜47番目の3アミノ酸残基に相当する細胞接着性モチーフである。これらのアミノ酸配列はいずれも、天然ビトロネクチンの比較的N末端側に位置する配列であり、未分化多能性幹細胞との接着性を発揮し、その結果、未分化状態に維持された多能性幹細胞を増殖可能にしていると推測される。このため、これらのアミノ酸配列のいずれも含まないポリペプチドでは、細胞接着性に劣り、本発明の効果を得ることができない。ただし、本発明は、この理論に拘束されない。
なお、配列番号1で示されるアミノ酸配列における2つのシステイン残基は、これら両者間で架橋していてもよい。これにより、配列番号1で示されるアミノ酸配列において高次構造が形成されて、多能性幹細胞との接着性が向上する傾向がある。
前記第1の領域は、配列番号1で示されるアミノ酸配列及びRGD配列に加えて、(1a)〜(1c)のアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも1つを含むことができ、細胞接着性及び細胞増殖性の観点から、配列番号1で示されるアミノ酸配列及びRGD配列の双方を含み、且つ、配列番号3で示されるアミノ酸配列の1番目〜55番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又はこれに近似した若しくはその一部のアミノ酸配列を有することが好ましい。
また、前記培養用ポリペプチドは、前記ヘパリン結合ドメインを含むことにより、前記培養用ポリペプチドの親水性を担保し、ポリペプチドの疎水凝集を抑制する傾向がある。この結果、前記培養用ポリペプチドが精製しやすくなり、製造効率を高めることができる。
ここで培養皿表面に残存するポリペプチドの量は、ポリペプチドを認識する抗体との結合量を定量するELISA(Enzyme−Linked Immunosorbent Assay)法又は、吸着したポリペプチドを加水分解し、生じたアミノ酸をHPLCなどによって定量することにより測定できる。
(3)配列番号3で示されるアミノ酸配列のうち、56番目〜341番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第3の領域、及び、
(4)配列番号3で示されるアミノ酸配列のうち、374番目〜459番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及びその部分アミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる第4の領域。
中でも、培養皿への吸着性に加えて、ポリペプチド作製時に疎水凝集を抑制しやすいという点で、374番目〜379番目が好ましく、選択するアミノ酸数を減らすことによって疎水凝集が軽減される傾向がある。
また、前記培養用ポリペプチドのGRAVY値は、調整容易性の観点から、第3及び第4の領域を構成するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基数の増減、アミノ酸残基の置換、欠失、付加等により調整されることが好ましく、特に、第3の領域を構成するアミノ酸配列の長さを調整することがより好ましい。
遺伝子組み換え技術により本発明の培養用ポリペプチドを得る場合、具体的にはまず、対象となるアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、目的とするポリペプチドが産生されるので、培養物から目的とするポリペプチドを常法により回収することにより、本発明にかかるポリペプチドを得ることができる。
また、上記ポリペプチド(A)は、アミノ酸残基数が80個〜250個であることが好ましい。
更に、上記ポリペプチド(A)は、更にGRAVY値が−2.0〜−0.95であり、アミノ酸残基数が80個〜250個のポリペプチドであることが好ましい。
また更に、上記ポリペプチド(A)は、更にGRAVY値が−1.70〜−0.975であり、アミノ酸残基数が80個〜250個のポリペプチドであることが好ましい。
また、上記ポリペプチド(A)又は(B)は、アミノ酸残基数が100個〜250個であることが好ましい。
更に、上記ポリペプチド(A)又は(B)は、更にGRAVY値が−2.0〜−0.95であり、アミノ酸残基数が100個〜250個のポリペプチドであることが好ましい。
また更に、上記ポリペプチド(A)又は(B)は、更にGRAVY値が−1.70〜−0.975であり、アミノ酸残基数が100個〜250個のポリペプチドであることが好ましい。
また更に、上記ポリペプチド(A)又は(B)は、更にGRAVY値が−1.70〜−0.975であり、アミノ酸残基数が100個〜170個のポリペプチドであることが好ましい。
前記培養用ポリペプチドの一例を以下に挙げるが、本発明はこれらに限定されない。
本発明の多能性幹細胞の培養方法は、支持担体の細胞培養表面に前記培養用ポリペプチドを付与して、培養用ポリペプチド被覆培養表面を得ること(以下、培養表面調製工程という)、及び、前記培養用ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養すること(以下、培養工程という)、を含む。
本発明の培養方法は、多能性幹細胞を未分化状態で保持することができる第1のドメインと培養器への良好に吸着することができる第2のドメインとを有する前記培養用ポリペプチドを培養表面に吸着させて、その上に多能性幹細胞を播種して培養するので、多能性幹細胞を、細胞培養表面からの剥がれによる離脱を抑制しつつ、未分化状態を維持して培養することができる。
なかでも、本発明において好ましく適用される多能性幹細胞の例には、iPS細胞を挙げることができる。
なお、霊長類動物としては、ヒト、サル、ゴリラなどが挙げられ、前記培養用ポリペプチドと同属となるヒトであることが特に好ましい。本発明に適用される成分又は物質が、霊長類動物に由来する成分又は物質であれば、同種動物由来の成分又は物質として本発明に好ましく適用可能である。
更に、前記培養方法では、前記多能性幹細胞を異種動物由来成分及び血清成分の非存在下で培養することが好ましい。これにより、よりいっそう、異種動物由来成分の混入を排除することができる。
コーティングは、前記コーティング溶液を付与した後、所定時間、例えば30分〜24時間程度保持すればよく、これにより特別な処理を要せずに、培養表面に前記培養用ポリペプチドを被覆することができる。
多能性幹細胞の播種密度及び培養については、特に制限はなく、一般に行われる条件をそのまま適用すればよい。例えば、1×103個/cm2〜1×105個/cm2程度の播種密度として、上述した培養及び継代条件にて培養すればよい。また10μm〜100μmの細胞塊を1個/cm2〜5個/cm2程度の播種密度として上述した培養及び継代条件にて培養してもよい。
本発明において培養器とは、細胞培養に用いられる表面を有する支持担体を指す。このような支持担体としては、当業界で細胞培養用支持担体として周知のものをそのまま用いることができる。支持担体の例には、プラスチック(例えば、ポリスチレン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂)、ガラス、微孔質のフィルター(例えば、セルロース、ナイロン、ガラス繊維、ポリエステルそしてポリカーボネート)、バッチ式又は連続式で細胞培養において、あるいは遺伝子工学(例えばバイオリアクター等)において用いられるバイオリアクター用材料(中空繊維チューブ又はマイクロキャリアビーズを含めてもよい。)及び、ポリエチレンテレフタレート、Teflon(登録商標)、セラミック及びその関連ポリマー材料等を含めてもよい。
また、前記支持担体は、プラズマ重合薄膜により培養表面が被覆された支持担体であってもよい。
本培養器は、前述した本発明にかかる培養用ポリペプチドを備えた培養表面を有しているので、培養表面に対して前記培養用ポリペプチドが良好に吸着しており、前記培養用ポリペプチド上に多能性幹細胞を播種した場合には、取扱い性よく、未分化状態を維持させた状態で多能性幹細胞を増殖させることができる。
ここで、培養器における培養表面とは、細胞を播種し成育する際に、細胞が付着し得る表面を意味する。
吸着処理工程については、前記培養方法において前記培養用ポリペプチド被覆培養表面調製工程で説明した事項をそのまま適用することができる。
<ポリペプチドの調製>
PCRを利用した常法にて、表2及び表3に示すアミノ酸配列を有するRCP−1〜RCP−17の各ポリペプチドをコードする遺伝子配列を増幅した。なお、RCP−11は天然ヒトビトロネクチンの配列に相当する。なお、各ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列(配列番号3)における位置を、表2及び表3中、「NOTE」欄に示す。ただし、各ポリペプチドのアミノ酸配列には、表中に記載された対応する範囲の天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列に対して付加、削除、又は置換されたアミノ酸配列が含まれる場合がある。なお、RCP−1〜RCP−10及びRCP−17は、上述した配列番号4〜13及び配列番号38で示されるアミノ酸配列のそれぞれに対して、1位にメチオニンを有する以外は、同一のアミノ酸配列を有する。
また凝集有無については、以下のG、A及びBで評価した。結果を表4に併せて示す。
G:凝集物形成が見られない。
A:粒径100nm程度の粒子形成が認められる。
B:粒径1mm以上の可視凝集の形成が認められる。
<培養皿への吸着性評価>
上記の方法により得られた各ポリペプチドを、所定のバッファにて、0〜200pmol/cm2の所定の最終濃度でウェルへ添加できるように希釈し、プラズマ処理済ポリスチレン製96ウェルプレート(Tissue Culture―Treated、Falcon社)に64μLずつ添加した。37℃、2時間インキュベートして各ポリペプチドをプレートに吸着させた後、PBSで2回洗浄し、RCP−1〜RCP−16の各ポリペプチド被覆表面を得た。
<細胞接着性評価1>
上記ポリペプチドへのヒトiPS細胞(「Tic」:細胞番号No.JCRB1331:独立行政法人 医薬基盤研究所[567−0085 大阪府茨木市彩都あさぎ7丁目6番8号]より分譲)の細胞接着性評価は、以下のとおりに行った。
ヒトiPS細胞を維持するためのフィーダー細胞として、EmbryoMax(登録商標)(初代マウス胚性線維芽細胞:ハイグロマイシン耐性、マイトマイシンC処理済み, C57/BL6由来、継代3代目)(Millipore社)を使用し、DMEM(Invitrogen社)、10% (v/v) ウシ胎児血清培地を使用して24時間培養し、T25フラスコ(Corning社)上に接着させた。ヒトiPS細胞用培地は、表5の組成のものに、FGF−2(Sigma−aldrich社)を最終濃度10ng/mlとなるように添加したものを使用した。
<細胞接着性評価2>
表7に示すポリペプチドをFmoc固相合成法にて合成した。天然ビトロネクチンを130pmol/cm2の濃度で吸着させた表面を作製した後、100μMの上記合成ペプチドを添加した細胞懸濁液を30,000cells/ウェルの割合で播種した。播種24h後の接着細胞数を、<細胞接着性評価1>と同様の手法にて算出した。結果を表7に示す。表7中、細胞接着率については、合成ペプチドを含まない培養液での細胞接着率を100とした相対値とした。n=3。
<増殖評価>
上記<細胞接着性評価1>と同様に回収したiPS細胞を、RCP−1、11及び天然ヒトビトロネクチンを吸着させた96ウェルプレートに対し、250cells/ウェルの割合で播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内で8日間培養した。各経時後の接着細胞数を、上記<細胞接着性評価1>と同様の方法で計測し、増殖曲線を得た。増殖曲線を図2に示す。なお図2において黒菱形はRCP−1を用いた例、黒四角はRCP−11を用いた例を示す。
同様にRCP−1〜10及びRCP−17と、比較対照として、Human Recombinant Laminin−511をそれぞれ表8に示す添加濃度となるように、試料1〜12を調製し、上記<細胞接着性評価1>と同様にして各ポリペプチドを吸着させた96ウェルプレートに対して5000cells/ウェルの割合で播種し、37℃、CO2インキュベーター内で3日間培養した。3日後の細胞数を上記<細胞接着性評価1>と同様の方法で計測した。結果を表8に示す。
また表8より、RCP−1〜RCP−10及びRCP−17はいずれも、ビトロネクチンと同じ細胞外マトリクスであるラミニンよりも細胞増殖率が高いことがわかる。このような高い細胞増殖率は、配列番号3における274番目のシステイン残基をセリン残基に置換しても同様に得られることがわかる。
さらに、表8より、CSYYQSCの配列及びRGD配列と、PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNの配列の双方を含むRCP−1〜RCP−10及びRCP−17はいずれも高い細胞増殖性を示すことがわかった。
<細胞接着性評価3>
RCP−1を、125pmol/cm2〜1000pmol/cm2の濃度にPBSで調整して使用した以外は、前記<細胞接着性評価1>と同様にして細胞接着性を評価した。結果を表9に示す。表9中、細胞接着率については、天然ビトロネクチンを130pmol/cm2の濃度で吸着させた培養器に対する細胞接着率を100とした場合の相対値とした。n=3。
<未分化維持評価>
上記<細胞接着性評価1>と同様に回収したiPS細胞を、TeSR2中に懸濁した。上記<細胞接着性評価1>で用いた試料1、試料2、試料5、試料6及び試料7をそれぞれ、上記<細胞接着性評価1>と同様にして吸着させた6ウェルプレート(Tissue culture−treated, Falcon社)にiPS細胞を播種し、37℃、CO2インキュベーター内で培養した。培地は播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。6日毎に前述と同様の方法にて継代を行った。それぞれの試料上で培養したiPS細胞の形態を図3に示す。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
Claims (8)
- 配列番号3で示されるアミノ酸配列の1番目〜55番目のアミノ酸配列と、
配列番号3で示されるアミノ酸配列の270番目〜277番目であって但し274番目のシステイン残基がセリン残基に置換されているアミノ酸配列と、
配列番号3で示されるアミノ酸配列の295番目〜373番目のアミノ酸配列と、
をN末端側から順に含み、142個〜170個のアミノ酸残基からなるポリペプチド。 - 142個〜150個のアミノ酸残基からなる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 支持担体の細胞培養表面に、請求項1又は請求項2に記載のポリペプチドを付与して、ポリペプチド被覆培養表面を得ること、及び
前記ポリペプチド被覆培養表面上に、多能性幹細胞を播種して培養すること、
を含む、多能性幹細胞の培養方法。 - 前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導型多能性幹細胞、体性幹細胞、受精卵内部細胞塊細胞、及び初期胚からなる群より選択される少なくとも一種である請求項3に記載の多能性幹細胞の培養方法。
- 前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞である請求項3又は請求項4に記載の多能性幹細胞の培養方法。
- 前記多能性幹細胞を、異種動物由来成分及び血清由来成分の非存在下で培養する請求項3〜請求項5のいずれか1項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
- 前記ポリペプチドの前記細胞培養表面への付与量が、261pmol/cm2〜1000pmol/cm2である請求項3〜請求項6のいずれか1項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
- 細胞培養表面を有する支持担体と、前記支持担体の細胞培養表面上に配置された請求項1又は請求項2に記載のポリペプチドと、を有する培養器。
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