WO2013149355A1 - Uso de angiotensina 1-9 en asociacion para prevenir la hipertension arterial - Google Patents

Uso de angiotensina 1-9 en asociacion para prevenir la hipertension arterial Download PDF

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WO2013149355A1
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angiotensin
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PCT/CL2012/000016
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María Paz OCARANZA JERALDINO
Jorge Emilio JALIL MILAD
Sergio Alejandro LAVANDERO GONZALEZ
Mario Martín CHIONG LAY
Luis Fernando MICHEA ACEVEDO
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Pontificia Universidad Catolica De Chile
Universidad De Chile
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    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca

Definitions

  • the present invention is focused on the field of the renin-angiotensin-aldosterone system, and in particular on the angiotensin- (1-9) peptide or its derivatives that are chemical or biological equivalents.
  • the present invention relates to the use of the angiotensin- (1-9) peptide and / or its derivatives and its anti-hypertensive effects, specifically to prevent, reverse, inhibit and / or decrease arterial hypertension and / or to induce vasodilation.
  • this invention includes the field of raising the concentration in the blood and / or tissues of the angiotensin- (l-9) peptide by the enhanced endogenous production of angiotensin- (l-9) through a vector that expresses ECA2, enzyme responsible for the endogenous production of angiotensin- (l -9).
  • Hypertension is a risk factor for the development of cardiovascular diseases (CV).
  • ENS National Health Survey
  • ENS National Health Survey
  • WHO World Health Organization
  • the increase in blood pressure is considered one of the main CV risk factors since its chronic increase ends up damaging white organs such as heart, arteries, kidney and brain (Varagic & Frohlich, J. Mol. Cell. Cardiol. 34: 1435-42, 2002).
  • SRAA renin-angiotensin-aldosterone system
  • RCT angiotensin-I converting enzyme
  • AHT arterial hypertension
  • the SRAA cascade begins with the action of renin on circulating angiotensinogen of hepatic origin. This reaction produces angiotensin I, which is physiologically inactive. Angiotensin I is transformed into the biologically active octapeptide angiotensin II, by the action of ECA (Okunishi et al., Jpn J. Pharmacol. 62: 207-10, 1993). ECA is a zinc-dependent metallopeptidase found predominantly in the lung, but also in the heart, blood vessels, kidney and also in the plasma (Campbell, J. Cardiovasc. Pharmacol. 10: S1-S8, 1987; Johnston and cois , J. Hypertens. Suppl.
  • tissue angiotensin II is also produced by other enzymes such as chymase and tissue plasminogen activating factor (Reilly and cois, J. Biol. Chem. 257: 8619-22, 1982; Gibbons & Dzau, N. Engl. J. Med. 19: 1431-8, 1994).
  • the RCT is also responsible for the catabolism and inactivation of vasodilators such as bradikinins (BKs) (Tschópe et al. J Cardiovasc Pharmacol. 39: 478-87, 2002).
  • the SRAA is involved in the development of the HTA (Dzau, J Hypertens Suppl. 6: 7-12, 1988;
  • Angiotensin II exerts its action in white cells through protein-coupled receptors
  • RAT1 and RAT2 subtypes 1 and 2 (RAT1 and RAT2, respectively) (Berry et al. Am J Physiol. 281: H2337- H2365, 2001; from Gasparo. Drugs 62: 1-10, 2002).
  • the activation of RAT1 produces most of the cardiovascular actions of angiotensin II such as vasoconstriction, mitogenic and hypertrophic effects, inflammatory response and retention of water and salt (from Gasparo and cois, J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 1: 151-8, 2000 ).
  • RAT2 exerts effects such as apoptosis, natriuresis and vasodilation mediated by BKs and nitric oxide (NO) (from Gasparo and cois, J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 1: 151-8, 2000).
  • ECA-2 homologous angiotensin-I converting enzyme
  • ECA2 has been found mainly in epithelium of the renal tubule, macrophages, cardiomyocytes, endothelium of small and large arteries and smooth muscles of these vessels (Burell and cois, Eur. Heart J. 26: 369-75, 2005) .
  • ECA2 has a 40% homology in its catalytic domain with ECA and is an ectoenzyme, whose catalytic sites are oriented towards the extracellular space and is, therefore, hydrolyzes extracellular peptides.
  • ECA2 is susceptible to separation and release from the cell surface and has a topology of an integral protein of Type I membrane.
  • ECA-2 differs from ECA in its substrate specificity and in the absence of inhibition by classic ACE inhibitors.
  • ECA2 competes with ECA for the hydrolysis of the inactive angiotensin I decapeptide to form angiotensin- (1-9) (Donoghue et al, J. Mol. Cell Cardiol. 35: 1043-53, 2003), so both the amount of angiotensin I available for the generation of angiotensin II decreases due to the action of ACE.
  • angiotensin- (l-9) on heart and kidney have not been described (Danilczyk & Penninger, Circ. Res.
  • angiotensin- (l-9 ) potentiates angiotensin II-mediated vasoconstriction in rat aortic rings and has vasopressor effects in conscious rats (Huang et al., J. Biol. Chem. 278: 15532-40, 2003).
  • angiotensin- (1-9) levels are higher than angiotensin II levels (Johnson, Peptides 10: 489-92, 1989) and that this peptide accumulates in animals treated with ACE inhibitors (Drummer, Biochem. Pharmacol. 39: 513-8, 1990).
  • ECA2 has greater catalytic efficiency (400 times) to hydrolyse angiotensin II than angiotensin I and form the vasodilator peptide angiotensin- (1-7) (Donoghue et al., Circ. Res. 87: el-9, 2000; Vickers and cois, J. Biol. Chem. 277: 14838-43, 2003; Rice et al., Biochem. J. 383: 45-51, 2004). The latter is also generated by the hydrolysis of angiotensin I by neutral endopeptidase (NEP), prolyl endopeptidases or ECA (Welches and cois, Life Sci.
  • NEP neutral endopeptidase
  • prolyl endopeptidases prolyl endopeptidases
  • ECA2 plays a central role in balancing the vasoconstrictor and proliferative activity of angiotensin II via its RAT1, by increasing angiotensin- (1-7) levels (Der Sarkissian et al., Prog. Biophys. Mol Biol. 91: 163-98, 2005).
  • angiotensin- (1-9) and / or its derivatives have effects that prevent, reverse, inhibit and / or decrease arterial hypertension and / or effects that induce vasodilation.
  • Angiotensins correspond to angiotensinogen derived peptides that are obtained by proteolysis. These peptides are:
  • Angiotensinogen * Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-Ser
  • Angiotensin I Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu
  • Angiotensin II Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
  • Angiotensin III Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
  • Angiotensin-IV Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
  • Angiotensin- (l-9) Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His
  • Des-aspartate-angiotensin I has been described for use in the treatment and / or prevention of cardiac hypertrophy (US 5,773,415) and neointimal formation or restenosis (US 6,100,237).
  • Angiotensin II is involved in the control of volemia, blood pressure, cardiac hypertrophy and neointimal formation.
  • the activation of RAT1 by angiotensin II enhances cardiac hypertrophy (Dostal & Baker, Am. J. Hypertens., 5: 276-280, 1991), neointimal formation (Osterrieder and cois, Hypertension. 18: 1160-4, 1991; Daemen and cois, Circ. Res. 68: 450-6, 1991), stimulates vasocontriction, sodium retention and the production of reactive oxygen species (ROS) (Berry and cois, Am J Physiol 281: H2337-H2365, 2001).
  • ROS reactive oxygen species
  • Angiotensin III mediates the induction of natriuresis dependent on the AT2 receptor. It induces vasoconstriction and release of aldosterone (Fyhrquist & Saijonmaa, J. Intern. Med. 264: 224-36, 2008).
  • Angiotensin IV a secondary metabolite of angiotensin II, has antihypertrophic actions and also inhibits neointimal formation (EP 1846017).
  • Angiotensin- (1-7) is involved in the actions opposed to angiotensin II. It has been described as a peptide that induces vasodilation, is antihypertensive and antifibrotic (Katovich et al., Curr. Hypertens. Rep. 10: 227-32, 2008). Results of our laboratory in an experimental model of late remodeling after myocardial infarction (AMI), showed greater enzymatic activity of ACE and angiotensin II levels and decreased enzyme activity of ECA-2 and angiotensin levels - (1-9) (Ocaranza and cois, Hypertension 48: 572-8, 2006).
  • applications CL3736-2008 and PCT / CL 2009000029 also comprise a method to prevent, reverse, inhibit and / or decrease cardiovascular, pulmonary, cerebral or renal remodeling, which consists in raising the concentration in the blood and / or tissues of the peptide.
  • angiotensin- (1-9) or its derivatives by means of a pharmaceutical composition containing a vector that expresses ECA2, enzyme responsible for the endogenous production of angiotensin- (1-9).
  • These vectors correspond to adeno virus, retrovirus, lentivirus or adeno-associated virus that contains the gene that codes for ECA2.
  • angiotensin- (l-9) peptide in the control of blood pressure and / or control of vasculature dilation, nor are there described medical uses of angiotensin- ( l-9) and / or its derivatives in medicine, particularly in the treatment of arterial hypertension, nor as an agent to induce vasodilation.
  • the present invention relates and solves the problem of ignorance about the actions of angiotensin- (1-9) on blood pressure and / or vasodilation and describes the antihypertensive and / or vasodilatory effects of this peptide and provides procedures to raise the concentration plasma and / or tissue angiotensin- (l-9).
  • angiotensin- (1-9) There are several procedures to raise the plasma and / or tissue concentration of angiotensin- (1-9).
  • the elevation of plasma and / or tissue levels of angiotensin- (l-9) is associated with phenomena of reduction of arterial hypertension and / or induction of vasodilation.
  • the elevation of the plasma concentration of angiotensin- (1-9) can be achieved through:
  • the present invention corresponds to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an effective amount of angiotensin- (1-9) or its derivatives and at least one pharmaceutically acceptable carrier, excipient, stabilizer, diluent and / or adjuvant.
  • the present invention also describes the use of said pharmaceutical composition for the preparation of medicaments useful for preventing, reversing, inhibiting and / or decreasing arterial hypertension and / or inducing vasodilation.
  • the present invention describes the use of the angiotensin- (1-9) peptide or its derivatives to make medicaments and / or pharmaceutical compositions that serve to prevent, reverse, inhibit and / or decrease arterial hypertension and / or induce vasodilation, especially in animals or individuals, more especially in patients who need such treatment, and even more specifically in hypertensive patients.
  • the present invention also provides, through the use of angiotensin- (1-9) and / or its derivatives, a method of preventing, reversing, inhibiting and / or decreasing arterial hypertension and / or inducing vasodilation.
  • this invention also comprises a method for preventing, reversing, inhibiting and / or decreasing arterial hypertension and / or inducing vasodilation which consists in raising the concentration in the blood and / or tissues of the angiotensin- (1-9) peptide or its derivatives by means of a pharmaceutical composition containing a vector that expresses ECA2, an enzyme responsible for the endogenous production of angiotensin- (1-9).
  • vectors correspond to adenovirus, retrovirus, lentivirus or adeno-associated virus that contains the gene that codes for ECA2.
  • the method of preventing, reversing, inhibiting and / or decreasing arterial hypertension and / or inducing vasodilation in an individual or an animal comprises administering to the patient an effective amount of angiotensin- (1-9) and / or at least one derivative of angiotensin- (1-9).
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of angiotensin- (1-9) and / or at least one angiotensin- (1-9) derivative and at least one excipient, carrier, diluent, stabilizer and / or pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • the composition is preferably for the use of prevention, reversal, inhibition and / or decrease of arterial hypertension and / or induction of vasodilation in an individual or animal that needs such treatment, and comprises administering such pharmaceutical composition to the patient.
  • the patient can be human or animal.
  • said patient is an individual or hypertensive animal.
  • the use of said drug or pharmaceutical composition seeks to raise the plasma and / or tissue levels of angiotensin- (1-9) and / or at least one of its derivatives. Particularly it is sought to raise the levels of said peptides in the organism, particularly in the plasma and / or vascular bed.
  • the medicament or pharmaceutical composition of the present invention which contains an effective amount of angiotensin- (1-9) and / or at least one angiotensin- derivative (1-9) can be applied by all known routes of medication administration. described.
  • said medication or pharmaceutical composition will be applied by injection and / or parenteral route (for example, and without the intention of excluding any other route, intravenous, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intradermal, subcutaneous and by inhalation, by the use of pharmaceutical compositions for continuous release, by the use of continuous-release pumps, suppositories, and orally).
  • Said administration may be single dose, multiple dose or continuous administration.
  • Angiotensin- (1-9) and / or its derivatives, pharmaceutical compositions containing it (s) and / or medications containing it (s) according to the present invention may be solid or liquid, including tablets. , wafers, dragees, tablets, capsules, suspensions, or solutions, containing at least one pharmaceutically acceptable excipient, carrier, diluent, stabilizer and / or adjuvant.
  • Excipients, carriers, diluents, stabilizers and / or pharmaceutically acceptable adjuvants for the preparation of pharmaceutical compositions or medicaments of the invention are very well known in the state of the art, and can be of a solid, liquid nature or mixtures of both.
  • compositions or medicaments can take the form of tablets, pills, pills, capsules, dragees, wafers, powder, coated formulations, sustained release formulations, erodible formulations, implanted devices or components derived from said apparatus, microsphere formulations, solutions, suspensions, elixirs, aerosols and the like, among others.
  • carriers, diluents and / or liquid excipients to water, saline, dextrose solution and glycol solution, especially when the parenteral and / or injection route is used as the route of administration.
  • the carrier and / or diluent may also be an oil, such as those derived from petroleum, animal and / or vegetable oils or synthetic oils.
  • oils in the invention include peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, corn oil, marigold oil, among others.
  • Preferred excipients of the invention include starch, cellulose, talc, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, magnesium stearate, sodium stearate, glycerol monostearate, sodium chloride, dehydrated skim milk, glycerol, propylene glycol, water, ethanol, among others.
  • Other transporters, diluents, stabilizers, excipients and / or adjuvants, which are not named here, are obvious to an expert in the state of the art.
  • composition or medicament of the present invention may be subject to conventional pharmaceutical processes, such as sterilization, and may contain other conventional pharmaceutical additives such as preservatives, stabilizers, emulsifying agents, wetting agents, salts for adjusting the osmotic pressure, buffers or buffers. to regulate the pH, among others.
  • Conveyors, stabilizers, diluents, excipients and / or adjuvants and their formulations can be found in Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15 “Ed .; Mack Publishing Co., Easton (1975); see for example pages 1405-1412 and 1461-1487.
  • compositions generally contain an effective amount of the active compound together at an adequate amount of one or more transporters, stabilizers, diluents, excipients and / or adjuvants, in such a way that it allows to prepare the dose and the form suitable for the appropriate administration of angiotensin- (1-9) and / or its derivatives To the patient
  • the particular dosage of a pharmaceutical composition or medicament to be administered to the subject will depend on many variables including the state of the disease, the severity of the disease, the administration scheme , the age, the physical characteristics of the subject, etc.
  • the appropriate doses can be established using clinical approaches according to those understood in the field.
  • angiotensin- (1-9) and / or at least one of its derivatives, the medicament or the pharmaceutical composition of the present invention can be co-administered with at least one pharmaceutical compound.
  • the "at least one pharmaceutical compound” is an angiotensin-I converting enzyme inhibitor, an angiotensin II receptor antagonist (RAT1), a calcium L-channel antagonist, a Rho kinase inhibitor, an inhibitor of renin and / or a diuretic.
  • RAT1 an angiotensin-I converting enzyme inhibitor
  • RAT1 an angiotensin II receptor antagonist
  • the administration of any of these pharmaceutical compounds are capable per se of raising the plasma concentration of angiotensin- (1-9).
  • angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitors examples include lisinopril, enalapril, captopril, zofenopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril and fosinopril.
  • angiotensin II receptor antagonists (RAT1) are valsartan, telmisartan, losar ⁇ an, irbesartan, olmesartan, candesartan, eprosartan and saralasin.
  • antagonists of calcium channels are dihydropyridines (nicardipine, nifedipine, amlodipine, felodipine, nitrendipine, nisoldipine, isradipine, nimodipine), benzothiazepines (diltiazem, clentiazem) and phenylalkylamines (verapamil, gallopamil, anipamilo, R05967, falipamilo ).
  • Rho kinase inhibitors are fasudyl, hydroxyfasudil, 3- (4-pyridyl) -lH-indole, (S) - (+) - 2-methyl-l - [(4-methyl-5-isoquinolinyl) sulfonyl] homopiperazine , N- (4-pyridyl) -N'- (2,4,6-trichlorophenyl) urea.
  • renin inhibitors are Aliskiren and Remikiren.
  • diuretics examples include thiazide diuretics (bendroflumethiazide, benzitiazida, chlorothiazide, chlorthalidone, hydrochlorothiazide, hydroflumethiazide, indapamide, methyclothiazide, metolazone, polythiazide, quinethazone, trichlormethiazide, xipamide), loop diuretics (furosemide, torsemide, bumetanide, ethacrynic acid), carbonic anhydrase inhibitor diuretics (acetazolamide, dorzolamide), potassium-sparing diuretics that are sodium channel inhibitors (amiloride, triamterene), potassium-sparing diuretics that are aldosterone antagonists (spironolactone, canrenoate, eplerenone) and osmotic diuretics (mannitol).
  • thiazide diuretics bendroflumethi
  • the present invention also considers as part of the invention to increase the plasma and / or tissue levels of angiotensin- (1-9) through an increase in its production and / or inhibition of its degradation. Also the present invention involves the exacerbation, activation and / or induction of intracellular transductional signals activated by angiotensin- (1-9) and / or its derivatives.
  • the increase in the production of angiotensin- (1-9) and / or its derivatives can be obtained through the increase or overexpression of ECA2.
  • the increase in the activity of ECA2 can be achieved through the inhibition of ACE, specifically with the use of inhibitors of this enzyme, particularly drugs already known in the state of the art such as lisinopril, enalapril, captopril, zofenopril, ramipril , quinapril, perindopril, benazepril and fosinopril.
  • the Overexpression of ECA2 can be achieved through the introduction into the body of one or several copies of the gene that codes for ECA2.
  • the introduction of the gene that codes for ECA2 into the organism is achieved through techniques already described in the state of the art and includes the use of naked DNA, liposomes (particularly cationic liposomes) and by the use of viral vectors.
  • the use of adenoviral, retroviral, lentiviral vectors and adeno-associated viruses containing within their genetic material the gene encoding ECA2 is described very particularly, and without the intention of excluding any other viral vector.
  • said gene to be active requires that its expression be commanded by a promoter and the gene ends in a terminator.
  • the vectors mentioned in this patent include flanking the gene that encodes ECA2 to a promoter and terminator.
  • the vectors containing the gene coding for ECA2 contain DNA sequences that are important for increasing the stability of the mRNA, as well as sequences that allow normal translation of the mRNA into protein.
  • various promoter structures that allow constitutive or regulated expression of the genes of interest are very well known in the state of the art.
  • the present invention also considers that the promoter that regulates the expression of the gene coding for ECA2 is of a constitutive nature or of a regulated nature by means of gene induction or repression.
  • angiotensin- (1-9) is used as an example of angiotensin- (1-9) and / or its derivatives.
  • rat is used as an example of a mammal to which the method of treatment can be applied and tested for the use of angiotensin- (1-9) and / or its derivatives in the form of a drug and / or pharmaceutical composition.
  • Animal models for studying arterial hypertension and vasodilation, including small mammals such as the rat are very well accepted in the state of the art (Pinto et al. Cardiovasc Res. 39: 77-88, 1998). The use of the rat model does not exclude its use in humans or another type of animal that requires such treatment.
  • arterial hypertension is understood as the abnormal increase in blood pressure.
  • the abnormal increase in blood pressure in humans corresponds to pressures equal to or greater than 90 mmHg diastolic and / or 140 mmHg systolic.
  • the increase in systolic and diastolic blood pressure may be due to an increase in cardiac output or an increase in peripheral resistance.
  • the increase in cardiac output may be due to an increase in heart rate and / or increased cardiac ejection volume.
  • Ejection volume is the volume of blood expelled by the ventricle (equal right or left) in a cardiac cycle; understanding that in a healthy heart this corresponds to an electric cycle and a mechanical cycle, synchronized.
  • Heart rate is the number of heart cycles in a minute.
  • the ejection fraction in turn depends on two factors: mechanical activity and afterload.
  • the mechanical activity of the heart depends on the force of contraction (which according to Frank-Starling's law is proportional to the final diastolic volume) and contractility.
  • Afterload is the force that opposes the outflow of blood from the ventricle during systole; or it can be defined as the degree of stress on the ventricle wall along the ventricular systole.
  • the increase in peripheral resistance may be due to an increase in blood volume, an increase in blood viscosity and / or a decrease in blood vessel caliber. Resistance to blood flow determined by the tone of the vascular musculature and by the caliber of the blood vessels.
  • Vasodilation is the ability of blood vessels (arteries and veins) to dilate (increase the caliber) against chemical stimuli secreted by inflammatory cells, the endothelium (nitric oxide), nerve afferents or drugs. This generates a decrease in blood pressure when it occurs in the arterial territory.
  • An effective amount refers to the dose of angiotensin- (1-9) and the period of time necessary to achieve the necessary therapeutic result, that is, to prevent, reverse, inhibit and / or decrease arterial hypertension and / or induce vasodilation.
  • the effective amount may depend on many factors, such as the disease progression status, age, sex, weight of the individual, the presence of other diseases, the intake of other drugs simultaneously, of race, among other things.
  • the invention seeks to raise the plasma and / or tissue concentration of angiotensin- (1-9) to values greater than 10 fmol / g, more especially to values greater than 20 fmol / g, even more specifically to values greater than 40 fmol / g, and even more specifically at values greater than 80 fmol / g.
  • An angiotensin- (1-9) derivative refers to any mutation, fragment, part or portion of angiotensin- (1-9) that includes molecules with substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acids to angiotensin- (l-9) in order to mimic its biological and / or physiological effect, enhance its biological and / or physiological effect, increase its biological and / or physiological effect, increase its bioavailability, increase its stability, increase its absorption, increase its plasma and / or tissue half-life, alter its binding to plasma proteins, increase its affinity with its receptor, decrease its degradation, or any other biological, physiological, pharmacological and / or pharmaceutical property that is of interest to improve its therapeutic action.
  • the angiotensin- (1-9) derivatives obtained by amino acid substitution correspond to the substitution of one amino acid for another amino acid or for another molecule that may correspond to an amino acid derivative. In this case it is sought to obtain a derivative that is functionally, structurally or stereochemically similar or homologous to angiotensin- (1-9).
  • An angiotensin- (1-9) derivative also includes mimotopes, or peptides, or mimetic analogs and includes molecules that contain unnatural amino acids as well as molecules that do not correspond to amino acids but behave or have functions and / or activities similar to amino acids.
  • Angiotensin- (1-9) derivatives also include modifications such as glycosylations, amidations, acetylations, hydroxylations, methylations, ethylations, esterifications, among others, which in general are modifications of the side chains of the amino acids or molecules that are part of the angiotensin- (1-9) or its derivatives. They are also considered as part of an angiotensin- (1-9) derivative to the introduction of cross-linking molecules that allow this peptide to be linked to a more structure. great to help with its physicochemical and / or pharmaceutical properties.
  • the crosslinking molecule may have different chain lengths in such a way as to zoom in or out of angiotensin- (1-9) or its derivatives of the larger molecule.
  • Angiotensin- (1-9) derivatives may also correspond to chemically modified derivatives that help stabilize a three-dimensional structure that is more favorable to mimic its biological and / or physiological effect, enhance its biological and / or physiological effect, raise its effect biological and / or physiological, increase its bioavailability, increase its stability, increase its absorption, increase its plasma and / or tissue half-life, alter its binding to plasma proteins, increase its affinity with its receptor, decrease its degradation, or any other property biological, physiological, pharmacological and / or pharmaceutical that is of interest to improve its therapeutic action.
  • Examples of unconventional or non-natural amino acids and / or their derivatives which may be incorporated during peptide synthesis include the use of, but are not limited to, norleucine, 4-amino butyric acid, 4-amino-3- acid. hydroxy-5-phenylpentanoic acid, 6- aminohexanoic acid, t-butylglycine, norvaline, phenylglycine, ornithine, sarcosine, 4-amino-3- hydroxy-6-methylheptanoic acid, 2-thienyl alanine and / or D-isomers of amino acids.
  • D-amino-D-methylbutyrate acid cyclopentylalanine, aminocyclopropane carboxylic acid, cyclohexylalanine, aminoisobutyric acid, aminonorbornyl carboxylic acid, D-alanine, D-arginine, D-aspartic acid, D-cysteine, D-glutamine, D-glutamic acid, D-histidine, D-isoleucine, D-leucine, D-lysine, D-methionine, D-ornithine, D-phenylalanine, D-proline, LN-Methylalanine, LN-Methylaginine, LN-Methylasparagine, LN-Methylaspartic Acid, LN-Methylcysteine, LN-Methylglutamine, LN- methylglutamic, cyclohe
  • angiotensin- (1-9) and / or its derivatives and pharmaceuticals or pharmaceutical compositions containing it (s) in rat is exemplified in particular, it is understood that the present invention is extends to the use of angiotensin- (1-9) and / or its derivatives and pharmaceuticals or pharmaceutical compositions that it (s) contains according to the invention to any mammal, for example, and not intended to limit them to, humans, mice, rabbits, primates, dogs, cats, pets in general, farm animals, etc. DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 Preventive effect of angiotensin- (1-9) in hypertrophy of the aortic wall of hypertensive rats by administration of angiotensin II.
  • Top bar 0.5 mm and bottom bar 50 ⁇ .
  • Figure 2. Effect of. the administration of angiotensin- (l-9) continues in the luminal area of thoracic aortas of hypertensive rats by infusion of angiotensin II. Values represent the average ⁇ SEM. N 9-12.
  • FIG. 1 Effect of angiotensin- (1-9) on cardiomyocyte hypertrophy induced by Ang II in vivo.
  • Male normotensive rats were randomized to receive angiotensin II in the presence or absence of angiotensin- (1-9) and A779 for two weeks.
  • FIG. 10 Effect of continuous administration of angiotensin- (1-9) on cardiomyocyte hypertrophy of hypertensive rats due to pressure overload.
  • N 7-12.
  • S Sham rats
  • GB Goldblatt hypertensive rats
  • GB- angiotensin- (l- 9) Goldblatt rats hypertensive with angiotensin- (l-9)
  • * p ⁇ 0.05 vs S, # p ⁇ 0.05 vs GB significant ANOVA post ).
  • Figure 1 Effect of angiotensin- (1-9) in reducing aortic wall hypertrophy of hypertensive rats due to pressure overload.
  • Top bar 0.5 mm and bottom bar 50 ⁇ .
  • Figure 13 Effect of continuous administration of angiotensin- (1-9) in reducing the thickness of the thoracic middle aortic tunic (GTM) of hypertensive rats due to pressure overload.
  • the values represent the average ⁇ SEM.
  • N 9-1 .
  • Figure 17 Effect of continuous administration of angiotensin- (1-9) on the protein levels of collagen I in the aortic wall of hypertensive rats due to pressure overload.
  • FIG. 18 Effect of continuous administration of angiotensin- (1-9) in hypertensive myocardial fibrosis due to pressure overload.
  • FVCT volumetric fraction of total collagen
  • Figure 20 Effect of angiotensin- (1-9) on ED-1 levels of the aortic wall of hypertensive rats due to pressure overload. Cross sections of thoracic aorta were immunostained with anti-ED-1. * p ⁇ 0.05 vs S, # p ⁇ 0.05 vs GB (significant ANOVA post).
  • FIG. 21 Effect of angiotensin- (1-9) on vasodilation of rat mesenteric arteries.
  • the diameter of control arteries was determined with endothelium (o), treated with phenylephrine ( ⁇ , vasoconstriction control), without endothelium (A) and treated with L-NNA ( ⁇ , nitric oxide synthetase inhibitor), in the presence of different dose of angiotensin- (l-9).
  • MOI multiplicities of infection
  • FIG. 23 Effect of ECA2 overexpression in hypertensive cardiac hypertrophy due to pressure overload. After one week of infection with the adenoviral vector, the ventricle was removed, treated, cut and measured as described in materials and method.
  • C) Evaluation of the perimeter of cardiomyocytes. Values are presented as mean ⁇ SEM, N 5-8. * p ⁇ 0.05 vs S, # p ⁇ 0.05 vs GB, ⁇ p ⁇ 0.05 vs GB-AdECA2.
  • FIG. 24 Effect of ECA2 overexpression on the volumetric fraction of total ventricle collagen.
  • S Sham rats
  • GB Goldblatt rats
  • GB-AdECA2) Goldblatt hypertensive rats infected with AdECA2 angiotensin- (l-9)
  • GB-AdGFP Goldblatt hypertensive rats infected with AdGFP. Photos taken in 40X.
  • B) Quantification of the volumetric fraction of collagen. Values are presented as mean ⁇ SEM, N 7-12. * p ⁇ 0.05 vs S, #p ⁇ 0.05 vs GB (significant ANOVA post).
  • the rats were subjected to the angiotensin II infusion model (Grobe et al. Am J Physiol. 292: H736-42, 2007).
  • the animals were randomly separated into the following experimental groups: controls (Sham or pseudoperations), infused with angiotensin II (300 ng / kg min), infused with angiontensin II and angiotensin- (l-9) [300 ng / kg min and 602 ng / kg min, respectively] and finally infused with angiotensin II, angiotensin- (l-9) and the angiotensin receptor antagonist- (l-7), A779 (300 ng / kg min, 602 ng / Kg min and 100 ng / kg min, respectively).
  • the pumps operated at a flow of 0.5 ⁇ / ⁇ . and were implanted in the right jugular vein through a catheter housed in an intrascapular subcutaneous pocket, under anesthesia ketamine HCl / xylazine (35 and 7 mg / kg i.p., respectively), for a period of 14 days.
  • the experimental groups were made up of 6-12 rats. Data were expressed as average + S.E.M. For the comparisons, statistical analysis was used with ANOVA followed by Student-Newman-Keuls t test. Statistical analysis was performed using the SPSS 10.0 statistical program. A value of p ⁇ 0.05 is considered statistically significant.
  • Systolic blood pressure was determined by the plethysmographic method in the animals' tail. To do this, the rats were gently anesthetized with ethyl ether. The measurement was performed once a week by researchers blind to the treatment (Ocaranza et al. J Hypertens. 20: 413-20, 2002).
  • HC degree of cardiac hypertrophy
  • Aortic hypertrophy was determined by morphometry. Cuttings of the descending aorta of 5 ⁇ thick were used, which were previously fixed in Bouin (1.3% picric acid, 9.5% formaldehyde and 4.8% acetic acid) for 24 h, included in paraffin and stained with hematoxylin. -eosin, to then be examined in a light microscope as described by Igase and cois (Am J Physiol. 289: H1013-9, 2005). Briefly, images of the aortas were captured by a video camera (Nikon) attached to a microscope (Nikon), and projected on a monitor; by using the Nis-Element software. The lumen (AL) and total (AT) areas were calculated and recorded.
  • the area of the middle tunic (ATM) was obtained from the difference of the AT and the AL of the aorta.
  • the thickness of the middle tunic (GTM) was defined as the region bounded by the outer elastic sheet (LEE) and the inner elastic sheet (LEI).
  • the middle portion of the left ventricle (VI) was dehydrated at room temperature in Bouin for 24 h and subsequently included in paraffin. Cuts 10-15 Dm thick were taken and stained with Hematoxylin-Eosin, and then examined under a light microscope, in order to observe their general morphological characteristics.
  • the size of the cardiomyocytes was determined as described by Nakamura and cois (Circulation; 98: 794-9, 1998). Briefly, the images of the cells were captured using a Nikon DS Fil camera and projected to a monitor using software. The area and perimeter of the cardiomyocytes was measured and recorded, using the Nis-Element program (Ocaranza et al. J Hypertens, 28: 1054-64, 2010). All measurements were performed by a blind observer and at least 80 cell images per animal were analyzed, which were randomly selected. 4. Morphometric evaluation of the development of cardiac fibrosis
  • TGF and 33 denaturation cycles at 94 ° C for 1 min, hybridization at 52 ° C for 1 min and elongation at 72 ° C for 1 min.
  • 5'- AAGCCCTGTATTCCGTCTCC-3 ' and antisense 5 ' -CAACGCCATCTATGAGAAAACC-3 ⁇ MCP-1 38 cycles of 1 min were used as a sense splitter. at 92 ° C, 1 min at 53 ° C, 1 min at 72 ° C and then 10 min at 72 ° C.
  • the nucleotide sequences of the sense and antisense splitters were 5 '-CAGGTCTCTGTCACGCTTCT-3' and 5 -GTGCTTCAGGTGGTTGTGG-3 ', respectively.
  • the intensity of the bands was quantified by densitometry and normalized with respect to the 18S band of ribosomal RNA.
  • collagen I For the determination of collagen I, 30 ⁇ g of total protein was used and for TGF-1 50 ⁇ g diluted in SDS reducing buffer (50 mM tris-HCl, pH 7.4, 10% NP-40, 1M NaCl, Na deoxycholate 5%, EDTA 10 mg / mL, SDS 10%, aprotinin 1 mg / mL, leupeptin 0.1 mg / mL, PMSF 10 n M), separated by electrophoresis in 7% SDS-PAGE gels and transferred to 0.2 ⁇ nitrocellulose membranes at 300 mA for 1 h. Protein transfer was verified by staining with Ponceau red.
  • the membranes were blocked in skim milk solution / PBS-Tween 20 0.05% at 7% for 1:30 h at room temperature and after 3 washes of 10 min with wash solution (0.5% milk in PBS-Tween 0.05%) was incubated overnight with the anti-collagen I antibody (1: 3000 dilution) or anti TGFp-1 (1/2500 dilution) in wash solution with constant stirring at 4 ° C. After 3 washes of 10 min with washing solution, the secondary anti-rabbit antibody was added in 1: 10,000 dilution by incubating for 2 h at room temperature. Finally, after 3 washes, it was revealed with chemiluminescent substrate for subsequent quantification of the intensity of bands by densitometry (Ocaranza and cois. J Cardiovasc Pharmacol. 40: 246-54, 2004).
  • Immuno staining was performed using the streptavidin-biotin-peroxidase method with the ED-1 inflammation marker. This is a glycoprotein expressed primarily in the lysosomal membrane of active macrophages (Leskovar et al. JExp Biol. 203: 1783-1795,2000).
  • the samples were deparaffinized, rehydrated and treated with 10% H 2 0 2 in methanol for 1 h.
  • the tissues were then incubated with anti-ED-1 monoclonal antibody (clone MCA341R, Serotec) diluted 1/1000 in 1% BSA prepared in PBS-0.05% Tween 20 overnight at 4 ° C in a humid chamber.
  • the sections were washed three times with 1x PBS-0.05% Tween 20, pH 7.4 for 5 min and incubated with the second biotinylated antibody for 30 min at room temperature.
  • the tissues were then washed again and incubated with the streptavidin peroxidase complex for 30 min at room temperature.
  • Angiotensin- (1-9) prevents the increase in blood pressure and vascular remodeling induced by the infusion of angiotensin II.
  • Group 1 corresponding to rats infused with saline (sham).
  • Group 2 corresponding to rats infused with only angiotensin II.
  • Group 3 corresponding to rats co-founded with angiotensin II and angiotensin- (1-9) and Group 4, corresponding to rats co-infused with angiotensin II, angiotensin- (l-9) and A779. 2.
  • Systolic blood pressure corresponding to rats infused with rats saline (sham).
  • Group 2 corresponding to rats infused with only angiotensin II.
  • Group 3 corresponding to rats co-founded with angiotensin II and angiotensin- (1-9) and Group 4, corresponding to rats co-infused with angiotensin II, angiotensin- (l-9) and A779.
  • Angiotensin II infusion-induced arterial hypertension significantly increased the thickness of the middle tunic (GTM) ( Figures 1 and 3), without changes in the area of the vascular lumen (AL) ( Figure 2).
  • An increase in the area ratio of the middle tunic (ATM) / AL ( Figure 4) was observed in rats with angiotensin II compared to the control rats ( Figures IB and 1F vs FiglA and 1E).
  • Confusion with angiotensin- (1-9) significantly prevented the increase in GTM ( Figure 3) and ATM / AL induced by infusion with angiotensin II ( Figure 4). This effect was not affected by the administration of A779 ( Figures ID, 1H, 3 and 4). No differences in LA were observed between the different experimental groups ( Figure 2).
  • angiotensin II increased the cell area by 37% (204 ⁇ 1 vs 282 ⁇ 2 ⁇ 2 , p ⁇ 0.001, Figure 5A) and the perimeter by 18% (56.1 ⁇ 0.2 vs 66.2 ⁇ 0.3 ⁇ , p ⁇ 0.001,
  • FIG. 5B with respect to the Sham control group.
  • Co-administration of angiotensin- (1-9) prevented the increase in cardiomyocyte induced by angiotensin II (Figure 5A), showing a significant decrease of 20% in the cell area (282 ⁇ 2 vs 227 ⁇ 2 ⁇ 2 , p ⁇ 0.001, Figure 5 A) and of 1 1% in the cell perimeter (66.2 ⁇ 0.3 vs 59, 1 ⁇ 0.3 ⁇ , p ⁇ 0.001, Figure 5B), with respect to the group infused only with angiotensin II.
  • angiotensin- (l-9) is a precursor of angiotensin- (l-7), the receptor antagonist Mas, A779 was used to rule out the participation of angiotensin- (l-7) in the effects of angiotensin- (l- 9).
  • Figure 5 A shows that A779 did not inhibit the antihypertrophic effect of angiotensin- (1-9), since this peptide also decreased the cell area by 31% (282 ⁇ 1 vs 195 ⁇ 2 ⁇ 2 , p ⁇ 0.001, Figure 5B) and the perimeter by 15.5% (66.2 ⁇ 0.3 vs 55.9 ⁇ 0.2 ⁇ , p ⁇ 0.001, Figure 5B) with respect to the group infused with angiotensin II alone.
  • angiotensin II significantly increased the levels of vascular inflammation determined through the increase of the mRNA for TGF- ⁇ with respect to its sham control (12.8 times more) (Figure 6), without differences in the mRNA levels of MCP- l ( Figure 6).
  • the administration of angiotensin- (l-9) significantly decreased TGF- ⁇ -mRNA levels by 62.5% ( Figure 6), while MCP-l mRNA showed no differences ( Figure 7).
  • Collagen I increased significantly in rats with angiotensin II hypertension compared to their sham control group (4.5 times, Figure 8).
  • results shown in this example show that: A) Systolic blood pressure increased significantly in rats with chronic administration of angiotensin II. B) The administration of angiotensin- (1-9) prevented hypertension and its effect was independent of angiotensin- (1-7). C) angiotensin- (1-9) prevented hypertrophy of the aortic wall by angiotensin II. The antihypertrophic effect of angiotensin- (l-9) was direct and does not depend on angiotensin- (l-7) (it was not inhibited with A779). D) Angiotensin II increased TGF- ⁇ expression levels and collagen content in the aortic wall.
  • angiotensin- (l-9) in the dose used prevented the expression of the vascular remodeling markers studied and its effect was independent of angiotensin- (l-7).
  • Example 5 Angiotensin- (1-9) reverses the increase in blood pressure and cardiovascular remodeling in the Goldblatt model (GB, 2 kidneys, 1 pinch)
  • PC Body weight
  • MC cardiac mass
  • MCR relative cardiac mass
  • Table 2 summarizes the PC, PAS and MCR of the Sham, GB and GB + angiotensin- (1-9) rats. No differences were observed in the PCs of the three experimental groups evaluated, although the PCs in the Gb + angiotensin- (1-9) rats were smaller. While MC increased significantly in hypertensive animals compared to control animals (0.93 ⁇ 0.04 vs. 0.74 ⁇ 0.01, p ⁇ 0.03, respectively). Angiotensin- (1-9) significantly decreased MC in rats with HT compared to untreated GB animals (0.84 ⁇ 0.03 vs. 0.9 3 ⁇ 0.04 g, respectively, Table 2).
  • the sham rats showed systolic blood pressure levels in the normotension ranges and close to 110 mmHg between week 1 and 6 of the trial ( Figure 9).
  • GB rats significantly increased systolic blood pressure from week 1 post surgery which remained elevated and significantly higher during the 6 week duration of the trial.
  • the continuous administration of angiotensin- (l-9) to GB rats from week 4 post surgery decreased by 15% and significantly systolic blood pressure from week 1 post administration and was maintained during the 2 weeks of test duration (Figure 9).
  • the antihypertensive effect of angiotensin- (l-9) was not reversed with the co-administration of the angiotensin receptor inhibitor- (l-7) A779 ( Figure 9).
  • Collagen I increased significantly in hypertensive rats with respect to their sham control group (5 times, Figure 17).
  • the administration of angiotensin- (l-9) reduced the increase of collagen in the aortic wall by 54% and the co-administration of A779 did not change the effect of angiotensin- (l-9) ( Figure 17).
  • the volumetric fraction of total collagen (FVCT) was shown to be significantly higher in GB rats compared to sham rats (6.5 ⁇ 1 and 3.7 ⁇ 1 ⁇ respectively, Figure 18).
  • FVCT volumetric fraction of total collagen
  • Example 6 Determination of the vasoactive effect of angiotensin- (1-9). Contractility studies in mesenteric artery
  • Small caliber mesenteric arteries (200-300 micrometers) were isolated, surgical tissue was removed surgically, under stereoscopic magnifying glass (Olympus SZ61). The arteries they were perfused intraluminally in a thermoregulated bath, under pressure and controlled flow, with perfusion solution (modified Krebs, KRB) of the following composition, in mmol / L: NaCl, 130; CaCl 2 , 2.5; NaHC0 3 , 25; MgSO 4 , 1.2; NaH 2 P0 4 , 1.2; KC1, 4.7; glucose, 5.5, pH 7.4. Before use, KRB was gasified with mixture 95% 0 2 and 5% C0 2 .
  • the artery was cannulated with glass micropipette (164 ⁇ external diameter), secured with 5-0 silk suture.
  • the arteries were pre-fused with 10-20 ⁇ 7 ⁇ of KRB, so as to achieve transmural pressure of 60 mmHg. After a rest period of 20 minutes, each artery was incubated in the presence of vasoconstrictor (100 ⁇ phenylephrine) for two minutes and agonist of the production of endothelial NO (1 ⁇ acetylcholine). These stimuli allowed to verify the viability of the middle tunic and the endothelium.
  • the artery was washed and after a new period of equilibrium, it was used to test direct vasoconstrictor effects of angiotensin- (1-9), or vasodilator effects after pre-contraction with phenylephrine.
  • vasoconstrictor effects of angiotensin- (1-9) or vasodilator effects after pre-contraction with phenylephrine.
  • the endothelium was removed by mechanical abrasion.
  • Example 7 Effect of angiotensin- (1-9) on vasodilation.
  • Angiotensin- (1-9) increased dose-dependently, the diameter of the resistance arteries with intact endothelium compared to the arteries in which it removed its endothelium (Fig 21).
  • arteries stimulated with a known vasocontrictor agent such as phenylephrine were used.
  • the mesenteric arteries were matched with angiotensin- (1-9) in conjunction with a nitric oxide synthase inhibitor (LNAME).
  • L-NAME decreased the vasodilator effect of angiotensin- (l-9), whereby the vasodilator mechanism of action of angiotensin- (l-9) is dependent on nitric oxide ( Figure 21).
  • ECA-2 homologous angiotensin-1 converting enzyme
  • the ECA2 gene (human Genebank access code: NM 021804; rat Genebank access code: NM 001012006) was initially subcloned into the viral adeno plasmid pDC316 (Microbix Byosystem Inc). Positive clones were confirmed by sequencing. Subsequently, plasmid pDC316 containing the gene for ECA2 was co-transfected with the viral adeno plasmid pBHGlox (delta) El, 3Cre in HEK293 cells. The recombinant adenovirus was obtained by homologous recombination between the two plasmids according to the procedure described by Hardy and cois (J. Virol. 71: 1842-9, 1997).
  • FIG. 22 shows the overexpression of ECA2 in cardiomyocytes in culture using different multiplicities of infection (MOI) with an adenovirus that overexpresses ECA-2. Basically, it is not possible to detect the presence of ECA-2 in cardiomyocytes in culture, but by expressing ECA-2 using an adenovirus it is possible to raise ECA-2 levels several hundred times ( Figure 22).
  • rat Genebank access code: NM 001012006) in the lentiviral plasmid
  • PHAGE-PGK The lentiviruses were manufactured in HEK293T cells by simultaneous cotransfection of the lentiviral vector containing the cDNA for ECA2 and the pCMVdeltaR8.9 and pHCMV-G according to the procedure described by Zufferey and cois (J Virol. 72: 9873-80, 1998). Confirmation that the lentivirus produced overexpressed ECA2 was performed by transduction of cardiomyocytes from rat neonata in culture with different multiplicities of infection (MOI) with the lentivirus expressing ECA2. Overexpression of ECA2 was verified by determining protein levels of ECA2 by Western blotting, and by enzymatic activity of ECA2.
  • MOI multiplicities of infection
  • the retroviruses were manufactured in HEK293T cells by simultaneous co-transfection of the retroviral vector containing the cDNA for ECA2 and the vectors pHIT60 (for gal-pol) and pCVG (for VSV-G) according to the procedure described by Yu & Kwon (Methods in Molecular Biology, vol.
  • ECA2 Volume 1: Production and In Vivo Applications, Edited by: JM Le Doux O Humana Press, Totowa, NJ, pages 1-16).
  • MOI multiplicities of infection
  • NM_021804; rat Genebank access code: NM 001012006) in the plasmid of the adeno-associated virus pAAV-MCS (Stratagene). Adeno-associated viruses were made in cells
  • HEK293T by simultaneous cotransfection of the adeno-associated virus vector containing the cDNA for ECA2 and pAAV-RC vectors (pAAV-helper or pRC, which contains the rep and cap genes) and pAdV-Helper (or pHelper, which carries the E2A, E4 and VA-RNAs genes) according to the procedure described by Stratagene .
  • Confirmation that the adeno-associated virus produced overexpressed ECA2 was performed by transduction of neonata rat cardiomyocytes in culture with different multiplicities of infection (MOI) with the adeno-associated virus that expresses ECA2.
  • MOI multiplicities of infection
  • Overexpression of ECA2 was verified by determining protein levels of ECA2 by Western blotting and by enzymatic activity of ECA2.
  • Example 9 Intracardiac and blood vessel administration of viral vectors that overexpress the homologous angiotensin-1 converting enzyme (ECA-2).
  • the infection of the animals was carried out according to the technique described by Coleman and cois (Physiol Genomics 12: 221-8, 2003). Briefly, 150 D IO g male normotensive rats were randomized to GB operation and pseudooperated (sham) rats were used as controls. Five weeks after surgery, rats with established arterial hypertension> 140 mmHg were randomized to intra-myocardial infection as described by Hajjar and cois (Circ. Res. 86; 616-621, 2000), with an adenoviral vector that expresses the ECA2 (AdECA2) or green fluorescent protein (GFP).
  • AdECA2 adenoviral vector that expresses the ECA2
  • GFP green fluorescent protein
  • the rats were anesthetized with ketamine and xylazine in doses of 50 mg / kg / weight and 10 mg / kg / weight, respectively, intraperitoneally, after which they were intubated laryngeal via a soft 18-gauge catheter, and were ventilated with a tidal volume of approximately 2 mL at 60 cycles / min (SAR-830 mechanical fan for small animals).
  • a thoracotomy was performed at the level of the fifth left intercostal space, and a 24-gauge catheter with 30 adenoviral, lentiviral solution or sterile adeno-associated virus was introduced into the left ventricular chamber.
  • PC Body weight
  • MC cardiac mass
  • MCR relative cardiac mass
  • the MC in the GB rats was significantly higher compared to their control group (943 ⁇ 20 vs 740 ⁇ 20) as well as the MCR (387 ⁇ 16 vs 334 ⁇ 13).
  • Myocardial infection with AdECA2 or AdGFP did not modify the MCR compared to what was observed in GB rats (Table 4). While, the MC was significantly lower in the AdECA2 and AdGFP rats (Table 4).
  • TABLE 4 Effect of intramyocardial infection with AdECA2 on body weight, cardiac mass and relative cardiac mass of hypertensive rats due to pressure overload parameters S GB GB-AdGFP
  • the sham rats showed systolic blood pressure levels in the normotension ranges and close to 110 mmHg between week 1 and 6 of the trial (Table 5).
  • GB rats significantly increased (42%) systolic blood pressure from week 1 post surgery which remained elevated and significantly higher during the 6 week duration of the trial.
  • Intramyocardial infection of GB rats with AdECA2 from week 5 post surgery significantly decreased by 15%, blood pressure at week post administration (Table 5).
  • the GB-AdGFP group also showed a significant decrease in SBP (- 22%, Table 5).
  • PAS sem 1 14 ⁇ 3 133 ⁇ 6 * 125 ⁇ 7 * # 142 ⁇ 6 *
  • PAS sem 6 1 10 ⁇ 3 156 ⁇ 3 * 133 ⁇ 9 * "122 ⁇ 5
  • the perimeter of the cardiomyocytes of the hypertensive rats was significantly greater compared to their sham controls (20%, Figure 23 C).
  • Overexpression of ECA2 in hypertensive rats significantly decreased the cardiomyocyte perimeter compared to that observed in GB rats (-17%, Figure 23C).
  • the perimeter of rats infected with GFP showed to be smaller than GB rats (-8%), this effect was smaller than that observed with AdECA2.
  • the total collagen content was significantly higher in hypertensive rats compared to their sham control group (6.5 ⁇ 0.8 vs. 3.7 ⁇ 0.4, respectively, Figure 24).
  • the intramyocardial infection of AdECA2 significantly decreased the collagen content compared to hypertensive rats (3.6 ⁇ 1.7 vs. 6.5 ⁇ 2.4, respectively, Figure 24).
  • the collagen content in rats infected with AdGFP was similar to that obtained in GB rats ( Figure 24).

Abstract

La presente invención está relacionada con el uso del péptido angiotensina-(l-9) o péptidos derivados de él que son análogos biológicos o químicos para preparar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación. Además, esta invención comprende también un vector que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina II homologa (ECA2) que permite elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9). Este vector puede ser adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus adenoasociados que contiene el gen que codifica para ECA2. Esta invención permite la administración de angiotensina-(l-9) o sus derivados en forma oral, inyectable, infusión continua por bomba, o elevar sus niveles en el organismo mediante tratamiento conjunto con inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina-I, con antagonistas del receptor de angiotensina II (ARA II), con inhibidores de Rho kinasa, con inhibidores de renina, con antagonistas de los canales L de calcio y/o con diuréticos

Description

USO DE ANGIOTENSINA 1-9 EN ASOCIACION PARA PREVENIR LA HIPERTENSION ARTERIAL
MEMORIA DESCRIPTIVA
La presente invención está centrada en el campo del sistema renina-angiotensina-aldosterona, y en particular en el péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados que son equivalentes químicos o biológicos. En particular, la presente invención se relaciona con el uso del péptido angiotensina- (1-9) y/o sus derivados y sus efectos anti-hipertensivos, específicamente para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o para inducir vasodilatación. Además, esta invención incluye el campo de elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9) mediante la producción endógena aumentada de angiotensina-(l-9) a través de un vector que expresa ECA2, enzima responsable de la producción en forma endógena de angiotensina-(l -9).
La hipertensión arterial (HTA) es un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares (CV). La última encuesta Nacional de Salud (ENS) efectuada en el año 2003 mostró que la HTA presenta una prevalencia de un 33,7% en la población general. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), el incremento de la presión arterial, es considerado uno de los principales factores de riesgo CV ya que su aumento crónico termina dañando órganos blanco como corazón, arterias, riñon y cerebro (Varagic & Frohlich, J. Mol. Cell. Cardiol. 34:1435-42, 2002).
Una mayor activación del sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), específicamente de la vía clásica con mayor actividad de la enzima convertidora de angiotensina-I (ECA) y niveles elevados de angiotensina II, se han identificado como importantes determinantes de la etiología de la hipertensión arterial (HTA), la insuficiencia cardiaca, en los procesos fisiopatológicos de remodelado cardiovascular, disfunción diastólica y alteraciones en la vasodilatación de arterias de resistencia. Tanto la ECA como angiotensina II representan e los principales blancos terapéuticos del tratamiento actual de la HTA (Varagic & Frohlich, J. Mol. Cell. Cardiol. 34: 1435-42, 2002).
La cascada del SRAA se inicia con la acción de renina sobre el angiotensinógeno circulante de origen hepático. Esta reacción produce angiotensina I, la cual es fisiológicamente inactiva. Angiotensina I se transforma al octapéptido biológicamente activo angiotensina II, por acción de la ECA (Okunishi y cois, Jpn J. Pharmacol. 62:207-10, 1993). La ECA es una metalopeptidasa dependiente de zinc que se encuentra predominantemente en el pulmón, pero además en corazón, vasos sanguíneos, riñon y además en el plasma (Campbell, J. Cardiovasc. Pharmacol. 10:S1-S8, 1987; Johnston y cois, J. Hypertens. Suppl. 10:S13-26, 1992). En humanos, la angiotensina II tisular es producida además por otras enzimas como quimasa y factor activador de plasminógeno tisular (Reilly y cois, J. Biol. Chem. 257:8619-22, 1982; Gibbons & Dzau, N. Engl. J. Med. 19: 1431-8, 1994). La ECA también es responsable del catabolismo e inactivación de vasodilatadores como las bradikininas (BKs) (Tschópe y cois. J Cardiovasc Pharmacol. 39:478- 87, 2002).
El SRAA está involucrado el desarrollo de la HTA (Dzau, J Hypertens Suppl. 6:7-12, 1988;
Bader y cois, Exp. Physiol. 85:713-731 , 2000; Bader y cois, J Mol Med. 79:76-102, 2001), en aspectos de resistencia a insulina (Henriksen & Jacob, Diabetes Obes. Metab. 5: 214-22, 2003;
Yavuz y cois, J. Renin. Angiotensin Aldosterone Syst. 4:197-203, 2003), metabolismo del óxido nítrico (Liu y Person, Hypertension 43:649-53, 2004), estrés oxidativo (Zhou y cois, Am. J.
Hypertension 17: 167-71, 2004) e hipertrofia cardiaca y del músculo liso vascular (Higashi y cois, Circ. Res. 93:767-75, 2003; Yamakawa y cois, Eur J Pharmacol. 478:39-46, 2003).
La angiotensina II ejerce su acción en células blanco a través de receptores acoplados a proteína
G, subtipos 1 y 2 (los RAT1 y RAT2, respectivamente) (Berry y cois. Am J Physiol. 281 :H2337- H2365, 2001 ; de Gasparo. Drugs 62:1-10, 2002). La activación del RAT1 produce la mayoría de las acciones cardiovasculares de angiotensina II como vasoconstricción, efectos mitogénicos e hipertróficos, respuesta inflamatoria y retención de agua y sal (de Gasparo y cois, J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 1 :151-8, 2000). Estos efectos son mediados vía una compleja interacción de vías de señalización intracelular que involucran diversas fosfolipasas (PLC, PLD, PLA2), estimulación de la NAD(P)H oxidasa y especies reactivas de oxígeno (02 ", H202), activación de la transcripción de genes (protooncogenes: c-fos, c-jun, c-myc), y activación de tirosinas kinasas (Src, JAK/STAT, FAK, Pyk2, pl30Cas y PI3-kinasa). Algunas de estas acciones pueden ser mediadas, directamente o indirectamente, por transactivación de receptores de tirosina kinasa (Touyz & Berry, Braz. J. Med. Biol. Res. 35: 1001-15, 2002). A diferencia de las acciones mediadas por el RAT1, el RAT2 ejerce efectos como apoptosis, natriuresis y vasodilatación mediada por BKs y óxido nítrico (NO) (de Gasparo y cois, J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 1 : 151-8, 2000).
Recientemente, se ha descubierto una vía paralela del SRA iniciada por la enzima convertidora de angiotensina-I homologa (ECA-2) (Donoghue y cois, Circ. Res. 87:el-9, 2000; Tipnis y cois, J. Biol. Chem. 275: 33238-43, 2000). Originalmente, esta enzima se encontró en testículo, riñon y corazón, pero estudios posteriores por PCR en tiempo real mostraron que también se expresa en el tracto gastrointestinal, cerebro, pulmón, aorta e hígado (Harmer y cois, FEBS Lett. 532: 107-10, 2002; Ferrario, Hypertension 47:515-21, 2006). A nivel celular, la ECA2 se ha encontrado principalmente en epitelio del túbulo renal, macrófagos, cardiomiocitos, endotelio de pequeñas y grandes arterias y musculatura lisa de estos vasos (Burell y cois, Eur. Heart J. 26:369-75, 2005). La ECA2 presenta un 40% de homología en su dominio catalítico con la ECA y es una ectoenzima, cuyos sitios catalíticos se orientan hacia el espacio extracelular y es, por lo tanto, hidroliza péptidos extracelulares. Además, como la ECA, la ECA2 es susceptible de separarse y liberarse de la superficie celular y presenta una topología de una proteína integral de membrana tipo I. A pesar de esta similitud, ECA-2 difiere de la ECA en su especificidad a sustrato y en la ausencia de inhibición por inhibidores clásicos de la ECA.
En el SRAA, la ECA2 compite con la ECA por la hidrólisis del decapéptido inactivo angiotensina I para formar angiotensina-(l-9) (Donoghue y cois, J. Mol. Cell Cardiol. 35:1043- 53, 2003), por lo tanto disminuye la cantidad de angiotensina I disponible para la generación de angiotensina II por la acción de ECA. Aunque los efectos de angiotensina-(l-9) en corazón y riñon no han sido descritos (Danilczyk & Penninger, Circ. Res. 98:463-71, 2006), existen diversos estudios que muestran que la angiotensina-(l-9) potencia la vasoconstricción mediada por angiotensina II en anillos aórticos de ratas y que tiene efectos vasopresores en ratas concientes (Huang y cois, J. Biol. Chem. 278: 15532-40, 2003). Además, se ha encontrado en plasma humano y de ratas, que los niveles de angiotensina-(l-9) son mayores a los de angiotensina II (Johnson, Peptides 10:489-92, 1989) y que este péptido se acumula en animales tratados con inhibidores de ECA (Drummer, Biochem. Pharmacol. 39:513-8, 1990). Otros estudios indican que angiotensina-(l-9) favorece la unión de la bradikinina a su receptor B2 probablemente por cambios conformacionales en el complejo ECA- receptor B2 (Erdos y cois, J. Mol. Cell. Cardiol. 34: 1569-76, 2002).
La ECA2 presenta mayor eficiencia catalítica (400 veces) para hidrolizar angiotensina II que angiotensina I y formar el péptido vasodilatador angiotensina-(l-7) (Donoghue y cois, Circ. Res. 87: el-9, 2000; Vickers y cois, J. Biol. Chem. 277: 14838-43, 2003; Rice y cois, Biochem. J. 383:45-51, 2004). Este último también se genera por la hidrólisis de la angiotensina I por acción de la endopeptidasa neutra (NEP), prolil endopeptidasas o la ECA (Welches y cois, Life Sci. 52: 1461-80, 1993; Vickers y cois, J. Biol. Chem. 277: 14838-43, 2003). Por lo tanto, la ECA2 tiene un papel central en el balance de la actividad vasoconstrictora y proliferativa de la angiotensina II vía su RAT1, al aumentar los niveles de angiotensina-(l-7) (Der Sarkissian y cois, Prog. Biophys. Mol. Biol. 91 :163-98, 2005). Sin embargo, no existen antecedentes que indiquen si angiotensina-(l-9) y/o sus derivados tienen efectos que previenen, revierten, inhiben y/o disminuyen la hipertensión arterial y/o efectos que inducen vasodilatación.
Las angiotensinas corresponden a péptidos derivados del angiotensinógeno que se obtienen por proteólisis. Estos péptidos son:
Angiotensinógeno*: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-Ser
Angiotensina I: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu
Angiotensina II: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
Angiotensina III: Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
Angiotensina-IV: Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
Angiotensina-(l-9): Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His
Angiotensina-( 1 -7) : Asp- Arg- Val-Tyr-Ile-His-Pro
*E1 primer aminoácido de las secuencias corresponde al extremo amino terminal. R: resto de la secuencia el angiotensinógeno.
Se han descrito varias funciones fisiológicas y biológicas para las diversas angiotensinas.
• Des-aspartato-angiotensina I ha sido descrita para ser usada en el tratamiento y/o prevención de la hipertrofia cardiaca (US 5.773.415) y formación de la neoíntima o reestenosis (US 6.100.237).
• Angiotensina II está involucrada en el control de la volemia, la presión arterial, la hipertrofia cardiaca y formación de la neoíntima. La activación del RAT1 por angiotensina II potencia la hipertrofia cardiaca (Dostal & Baker, Am. J. Hypertens., 5:276-280, 1991), formación de neoíntima (Osterrieder y cois, Hypertension. 18:1160-4, 1991; Daemen y cois, Circ. Res. 68:450-6, 1991), estimula la vasocontricción, la retención de sodio y la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) (Berry y cois, Am J Physiol 281 :H2337-H2365, 2001). • Angiotensina III media la inducción de natriuresis dependiente del receptor AT2. Induce vasoconstricción y liberación de aldosterona (Fyhrquist & Saijonmaa, J. Intern. Med. 264:224- 36, 2008).
• Angiotensina IV, un metabolito segundario de angiotensina II, tiene acciones antihipertróficas y también inhibe la formación de neoíntima (EP 1846017).
• Angiotensina-(l-7) está involucrada en las acciones opuestas a angiotensina II. Se ha descrito que es un péptido que induce vasodilatación, es antihipertensivo y antifibrótico (Katovich y cois, Curr. Hypertens. Rep. 10:227-32, 2008). Resultados de nuestro laboratorio en un modelo experimental de remodelado tardío post infarto al miocardio (IAM), mostraron mayor actividad enzimática de la ECA y de los niveles de angiotensina II y disminución de la actividad enzimática de la ECA-2 y de los niveles de angiotensina-(l-9) (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006). Estos cambios favorecieron la fíbrosis miocárdica y hipertrofia ventricular patológica (Ocaranza y cois, Rev. Chil. Cardiol. 26:63-76, 2007). La inhibición de la ECA con enalapril o el bloqueo del receptor tipo 1 de angiotensina II (RATl) previnieron la disminución de la actividad de ECA-2 y aumentaron significativamente los niveles de angiotensina-(l -9) (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006; Ocaranza y cois, Rev. Chil. Cardiol. 26:63-76, 2007). Estos resultados sugirieron una interacción entre ECA y ECA-2 en el remodelado miocárdico post IAM como también que la angiotensina-(l-9) más que la angiotensina-(l-7) actuarían como un contrarregulador de la angiotensina II (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006).
Recientemente, presentamos solicitudes de patentes de invención presentada en Chile CL3736- 2008 e Internacional PCT/CL 2009000029 relacionada con una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) o sus derivados y al menos un transportador, excipiente, estabilizante, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Además, dicha invención describe el uso de la composición farmacéutica y del péptido angiotensina-(l-9) o péptidos derivados de él que son análogos biológicos o químicos para la elaboración de medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, cerebral o renal. Además, las solicitudes CL3736-2008 y PCT/CL 2009000029 comprenden también un método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, cerebral o renal que consiste en elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados mediante una composición farmacéutica que contiene un vector que expresa ECA2, enzima responsable de la producción en forma endógena de angiotensina-(l-9). Estos vectores corresponden a adeno virus, retrovirus, lentivirus o virus adenoasociados que contiene el gen que codifica para ECA2. La solicitudes CL3736-2008 y PCT/CL 2009000029 permiten la administración de angiotensina-(l-9) o sus derivados en forma oral, inyectable, infusión continua por bomba, o elevar sus niveles en el organismo mediante tratamiento con inhibidores de la ECA, con antagonistas del receptor de angiotensina II (ARA II), con inhibidores de Rho kinasa, con antagonistas de los canales L de calcio y/o con diuréticos.
Sin embargo, en el estado del arte no existen descritos efectos biológicos para el péptido angiotensina-(l-9) en el control de la presión arterial y/o control de la dilatación de la vasculatura, tampoco existen descritos usos médicos de angiotensina-(l-9) y/o sus derivados en medicina, particularmente en el tratamiento de la hipertensión arterial, ni tampoco como agente para inducir la vasodilatación. En la presente invención se relaciona y resuelve el problema de desconocimiento sobre las acciones de angiotensina-(l-9) sobre la presión arterial y/o vasodilatación y describe los efectos antihipertensivos y/o vasodilatadores de este péptido y provee procedimientos para elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Existen varios procedimientos para elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9). La elevación de los niveles plasmáticos y/o tisular de angiotensina-(l-9) está asociado con fenómenos de reducción de la hipertensión arterial y/o inducción de vasodilatación. En la presente invención describimos que la elevación de la concentración plasmática de angiotensina-(l-9) puede lograrse a través de:
a) Administración del péptido angiotensina-(l-9) (ver ejemplos 1, 4 y 5).
b) Administración de un gen que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina I homologa (ECA2), enzima responsable de la producción endógena de angiotensina-(l-9) (ver ejemplos 6, 7 y 8).
La presente invención corresponde a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) o sus derivados y al menos un transportador, excipiente, estabilizante, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La presente invención también describe el uso de dicha composición farmacéutica para la elaboración de medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación. Además, la presente invención describe el uso del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados para elaborar medicamentos y/o composiciones farmacéuticas que sirven para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación, especialmente en animales o individuos, más especialmente en pacientes que necesitan tal tratamiento, y aún más específicamente en pacientes hipertensos. La presente invención también provee, a través del uso de la angiotensina-(l -9) y/o sus derivados, de un método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación.
Además, esta invención comprende también un método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación que consiste en elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados mediante una composición farmacéutica que contiene un vector que expresa ECA2, enzima responsable de la producción en forma endógena de angiotensina-(l-9). Estos vectores corresponden a adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus adenoasociados que contiene el gen que codifica para ECA2. De acuerdo a la invención, el método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación en un individuo o un animal, comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) y/o al menos un derivado de angiotensina- (1-9). La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) y/o al menos un derivado de angiotensina-(l-9) y, al menos, un excipiente, transportador, diluyente, estabilizante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición es preferentemente para el uso de la prevención, reversión, inhibición y/o disminución de la hipertensión arterial y/o inducción de vasodilatación en un individuo o animal que necesita tal tratamiento, y comprende administrar tal composición farmacéutica al paciente. El paciente puede ser humano o animal. En particular, dicho paciente es un individuo o animal hipertenso. El uso de dicho medicamento o composición farmacéutica busca elevar los niveles plasmáticos y/o tisulares de angiotensina-(l-9) y/o, al menos, uno de sus derivados. Particularmente se busca elevar los niveles de dicho péptidos en el organismo, particularmente en el plasma y/o lecho vascular.
El medicamento o composición farmacéutica de la presente invención, que contiene una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) y/o al menos un derivado de angiotensina-(l-9) puede ser aplicado por todas las vías conocidas de administración de medicamentos descritas. En forma particular, dicho medicamento o composición farmacéutica se aplicará por vía inyectable y/o parenteral (por ejemplo, y sin ánimo de excluir ninguna otra vía, intravenoso, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea y por inhalación, por el uso de composiciones farmacéuticas de liberación continua, por el uso de bombas de liberación continua, por supositorios, y por vía oral). Dicha administración puede ser de una única dosis, múltiple dosis o administración continua.
La angiotensina-(l-9) y/o sus derivados, composiciones farmacéuticas que lo(s) contiene(n) y o medicamentos que lo(s) contiene(n) de acuerdo con la presente invención pueden ser sólidos o líquidos, incluyendo tabletas, obleas, grageas, comprimidos, cápsulas, suspensiones, o soluciones, que contiene al menos un excipiente, transportador, diluyente, estabilizante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Excipientes, transportadores, diluyentes, estabilizantes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones farmacéuticas o medicamentos de la invención son muy bien conocidos en el estado del arte, y pueden ser de naturaleza sólida, líquida o mezclas de ambos. De esta manera las composiciones farmacéuticas o medicamentos pueden tomar forma de tabletas, pildoras, pastillas, cápsulas, grageas, obleas, polvo, formulaciones recubiertas, formulaciones de liberación sostenida, formulaciones erodibles, aparatos implantados o componentes derivados de dichos aparatos, formulaciones de microesferas, soluciones, suspensiones, elíxires, aerosoles y similares, entre otros. Se prefiere como transportadores, diluyentes y/o excipientes líquidos a agua, solución salina, solución de dextrosa y solución de glicoles, especialmente cuando se utiliza la vía parenteral y/o de inyección como vía de administración. El transportador y/o diluyente, puede ser también un aceite, como por ejemplo aquellos derivados del petróleo, aceites de origen animal y/o vegetal o aceites sintéticos. Ejemplos particulares de aceites preferidos en la invención incluyen a aceite de maní, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo, aceite de maíz, aceite de maravilla, entre otros. Entre los excipientes preferidos por la invención se incluyen al almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, sílica gel, estearato de magnesio, estearato de sodio, glicerol monoestearato, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propilénglicol, agua, etanol, entre otros. Otros transportadores, diluyentes, estabilizantes, excipientes y/o adyuvantes, que no están nombrados aquí, son obvios para un experto en el estado del arte. La composición o el medicamento de la presente invención puede ser sujeto a procesos farmacéuticos convencionales, tales como esterilización, y puede contener otros aditivos farmacéuticos convencionales tales como preservantes, estabilizantes, agentes emulsificantes, agentes humectantes, sales para ajustar la presión osmótica, amortiguadores o tampones para regular el pH, entre otros. Transportadores, estabilizantes, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes y sus formulaciones pueden encontrarse en Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15" Ed.; Mack Publishing Co., Easton (1975); ver por ejemplo las páginas 1405-1412 y 1461-1487. Tales composiciones contienen, en general, una cantidad efectiva del compuesto activo junto a una cantidad adecuada de uno o varios transportadores, estabilizantes, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes, de tal manera que permita preparar la dosis y la forma adecuada para la administración apropiada de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados al paciente. En la práctica de los métodos de tratamiento de la invención, la dosificación particular de una composición farmacéutica o medicamento a ser administrado al sujeto dependerá de muchas variables incluyendo el estado de la enfermedad, la severidad de la enfermedad, el esquema de administración, la edad, las características físicas del sujeto, etc. Las dosis apropiadas pueden establecerse usando aproximaciones clínicas según los entendidos en el campo.
Además, la angiotensina-(l-9) y/o, al menos, uno de sus derivados, el medicamento o la composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrado en conjunto con, al menos, un compuesto farmacéutico. El "al menos un compuesto farmacéutico" es un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina-I, un antagonista del receptor de angiotensina II (RAT1), un antagonista de los canales L de calcio, un inhibidor de Rho kinasa, un inhibidor de la renina y/o un diurético. La administración de cualquiera de estos compuestos farmacéuticos son capaces per se de elevar la concentración plasmática de angiotensina-(l-9). En las solicitudes de patentes de invención presentada en Chile CL3736-2008 e Internacional PCT/CL 2009000029, y en los documentos Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006 y Ocaranza y cois, Rev. Chil. Cardiol. 26:63-76, 2007, describimos previamente que la administración de un inhibidor de enzima convertidora (enalapril) o la administración de un antagonista del receptor de angiotensina II (candesartan) aumentan los niveles plasmáticos y/o tisulares de angiotensina-(l- 9)·
Ejemplos de inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA) son el lisinopril, enalapril, captopril, zofenopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril y fosinopril. Ejemplos de antagonistas del receptor de angiotensina II (RAT1) son valsartán, telmisartán, losarían, irbesartán, olmesartán, candesartán, eprosartán y saralasina. Ejemplos de antagonistas de los canales L de calcio son las dihidropiridinas (nicardipino, nifedipino, amlodipino, felodipino, nitrendipino, nisoldipino, isradipino, nimodipino), las benzotiazepinas (diltiazem, clentiazem) y las fenilalquilaminas (verapamilo, galopamilo, anipamilo, R05967, falipamilo). Ejemplos de inhibidores de Rho kinasa son fasudil, hidroxifasudil, 3-(4-piridil)-lH-indol, (S)-(+)-2-metil-l-[(4-metil-5-isoquinolinil)sulfonil] homopiperazina, N-(4-piridil)-N'- (2,4,6- triclorofenil) urea. Ejemplos de inhibidores de la renina son Aliskiren y Remikiren. Ejemplos de diuréticos son los diuréticos tiazídicos (bendroflumetiazida, benzitiazida, clorotiazida, clortalidona, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, indapamida, meticlotiazida, metolazona, politiazida, quinetazona, triclormetiazida, xipamida), los diuréticos de asa (furosemida, torasemida, bumetanida, ácido etacrínico), los diuréticos inhibidores de la anhidrasa carbónica (acetazolamida, dorzolamida), los diuréticos ahorradores de potasio que son inhibidores de los canales de sodio (amilorida, triamtereno), los diuréticos ahorradores de potasio que son antagonistas de la aldosterona (espironolactona, canrenoato, eplerenona) y los diuréticos osmóticos (manitol).
La presente invención también considera como parte del invento aumentar los niveles plasmáticos y/o tisulares de angiotensina-(l-9) a través de un aumento de su producción y/o inhibición de su degradación. También la presente invención involucra la exacerbación, activación y/o inducción de las señales transduccionales intracelulares activadas por angiotensina-(l-9) y/o sus derivados.
El aumento de la producción de angiotensina-(l-9) y/o sus derivados se puede obtener a través del aumento o sobreexpresión de la ECA2. El aumento de la actividad de la ECA2 puede lograrse a través de la inhibición de la ECA, específicamente con el uso de inhibidores de esta enzima, particularmente fármacos ya conocidos en el estado del arte como son el lisinopril, enalapril, captopril, zofenopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril y fosinopril. La sobreexpresión de la ECA2 se puede lograr a través de la introducción dentro del organismo una o varias copias del gen que codifica para ECA2. La introducción del gen que codifica para ECA2 al organismo se logra a través de técnicas ya descrita en el estado del arte e incluyen el uso de DNA desnudo, liposomas (particularmente liposomas catiónicos) y por el uso de vectores virales. En la presente invención se describe muy particularmente, y sin ánimo de excluir cualquiera otro vector viral, el uso de vectores adenovirales, retrovirales, lentivirales y virus adenoasociados que contienen dentro de su material genético el gen que codifica para ECA2. Es también conocido en el estado del arte que dicho gen para ser activo requiere que su expresión esté comandado por un promotor y el gen termine en un terminador. Los vectores mencionados en esta patente incluyen flanqueando al gen que codifica a la ECA2 a un promotor y un terminador. También es parte de la presente invención que los vectores que contiene el gen que codifica para ECA2 contenga secuencias de DNA que son importante para aumentar la estabilidad del mRNA, así como de secuencias que permitan la normal traducción del mRNA en proteína. Asimismo, es muy bien conocido en el estado del arte diversas estructuras de promotores que permiten lograr la expresión constitutiva o regulada de los genes de interés. La presente invención también considera que el promotor que regula la expresión del gen que codifica para la ECA2 sea de naturaleza constitutiva o de naturaleza regulada por medio de inducción o represión génica.
En la presente invención se utiliza angiotensina-(l-9) como un ejemplo de angiotensina-(l-9) y/o sus derivados. Además se utiliza rata como un ejemplo de mamífero al cual se puede aplicar el método de tratamiento y ensayar el uso de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados en forma de medicamento y/o composición farmacéutica. Modelos animales para estudiar hipertensión arterial y vasodilatación, incluyendo a mamíferos pequeños tales como a la rata son muy bien aceptados en el estado del arte (Pinto y cois. Cardiovasc Res. 39:77-88, 1998). El uso del modelo de rata no excluye su uso en humanos u otro tipo de animal que requiera dicho tratamiento. En la presente invención se entiende por hipertensión arterial al aumento anormal de la presión arterial. El aumento anormal de la presión arterial en humanos corresponde a presiones iguales o superiores a 90 mmHg diastólica y/o 140 mmHg sistólica. El aumento de la presión arterial sistólica y diastólica puede deberse a un aumento del gasto cardíaco o a un aumento de la resistencia periférica. El aumento del gasto cardíaco puede deberse a un aumento de la frecuencia cardíaca y/o aumento del volumen de eyección cardíaco. El volumen de eyección es el volumen de sangre expulsado por el ventrículo (igual derecha o izquierda) en un ciclo cardíaco; entendiéndose que en un corazón sano este corresponde a un ciclo eléctrico y un ciclo mecánico, sincronizados. La frecuencia cardíaca es el número de ciclos cardíacos en un minuto. La fracción de eyección a su vez depende de dos factores: actividad mecánica y postcarga. La actividad mecánica del corazón depende de la fuerza de contracción (que según la ley de Frank- Starling es proporcional al volumen diastólico final) y de la contractilidad. La postcarga es la fuerza que se opone a la salida de sangre del ventrículo durante la sístole; o bien puede ser definida como el grado de estrés en la pared del ventrículo a lo largo de la sístole ventricular. El aumento de la resistencia periférica puede deberse a un aumento del volumen sanguíneo, aumento de la viscosidad sanguínea y/o a una disminución del calibre de los vasos sanguíneos. Resistencia al flujo de sangre determinada por el tono de la musculatura vascular y por el calibre de los vasos sanguíneos.
La vasodilatación es la capacidad de los vasos sanguíneos (arterias y venas) de dilatarse (aumentar el calibre) frente a estímulos químicos secretados por células inflamatorias, el endotelio (óxido nítrico), aferencias nerviosas o fármacos. Esto genera una disminución de la presión arterial cuando ocurre en el territorio arterial.
Una cantidad efectiva se refiere a la dosis de angiotensina-(l-9) y al período de tiempo necesario para alcanzar el resultado terapéutico necesario, es decir, prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación. La cantidad efectiva puede depender de muchos factores, tales como el estado de avance de la enfermedad, la edad, el sexo, el peso del individuo, la presencia de otras enfermedades, de la ingesta de otros medicamentos en forma simultánea, de raza, entre otras cosas. En esta patente, la invención busca elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9) a valores superiores a 10 fmol/g, más especialmente a valores superiores a 20 fmol/g, aún más específicamente a valores superiores a 40 fmol/g, y aún más específicamente a valores superiores a 80 fmol/g.
Un derivado de angiotensina-(l-9) se refiere a cualquier mutación, fragmento, parte o porción de la angiotensina-(l-9) que incluye moléculas con sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos a la angiotensina-(l-9) con el objeto de imitar su efecto biológico y/o fisiológico, potenciar su efecto biológico y/o fisiológico, elevar su efecto biológico y/o fisiológico, incrementar su biodisponibilidad, incrementar su estabilidad, incrementar su absorción, incrementar su vida media plasmática y/o tisular, alterar su unión a proteínas plasmáticas, aumentar su afinidad con su receptor, disminuir su degradación, o cualquier otra propiedad biológica, fisiológica, farmacológica y/o farmacéutica que sea de interés para mejorar su acción terapéutica. Los derivados de angiotensina-(l-9) obtenidos por sustitución de aminoácidos corresponden a la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido o bien por otra molécula que puede corresponder a un derivado de aminoácido. En este caso se busca obtener un derivado que sea funcionalmente, estructuralmente o estereoquímicamente similar u homólogo a angiotensina-(l-9). Un derivado de angiotensina-(l-9) también incluye a mimótopos, o péptidos, o análogos miméticos e incluyen moléculas que contienen aminoácidos no naturales así como moléculas que no corresponden a aminoácidos pero se comportan o tienen funciones y/o actividades similares a los aminoácidos. Los derivados de angiotensina-(l-9) también incluyen modificaciones como glicosilaciones, amidaciones, acetilaciones, hidroxilaciones, metilaciones, etilaciones, esterificaciones, entre otros, que en general son modificaciones de las cadenas laterales de los aminoácidos o moléculas que forman parte de la angiotensina-(l-9) o sus derivados. También están considerados como parte de un derivado de angiotensina-(l-9) a la introducción de moléculas entrecruzadoras que permitan unir este péptido a una estructura más grande que ayude con sus propiedades fisicoquímicas y/o farmacéuticas. La molécula entrecruzadora puede tener distintos largos de cadena de manera tal de acercar o alejar a la angiotensina-(l-9) o sus derivados de la molécula mayor. Los entrecruzadores pueden ser homo o bifuncionales, tales como los imido ésteres bifuncionales que tienen grupo metilo como espaciadores entre n=l a 6 de largo de cadena, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida y reactivos hétero-bifuncionales que habitualmente contienen una parte amino-reactiva tal como la N-hidroxisuccinimida y otra parte que es reactiva específicamente a otro o al mismo grupo funcional. Los derivados de angiotensina-(l-9) también pueden corresponder a derivados modificados químicamente que ayuden a estabilizar una estructura tridimensional que sea más favorable para imitar su efecto biológico y/o fisiológico, potenciar su efecto biológico y/o fisiológico, elevar su efecto biológico y/o fisiológico, incrementar su biodisponibilidad, incrementar su estabilidad, incrementar su absorción, incrementar su vida media plasmática y/o tisular, alterar su unión a proteínas plasmáticas, aumentar su afinidad con su receptor, disminuir su degradación, o cualquier otra propiedad biológica, fisiológica, farmacológica y/o farmacéutica que sea de interés para mejorar su acción terapéutica.
Ejemplos de aminoácidos no convencionales o no naturales y/o sus derivados los cuales pueden ser incorporados durante la síntesis de los péptidos incluyen el uso de, pero no están limitados a, norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6- aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3- hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienil alanina y/o D-isómeros de los aminoácidos. Otros ejemplos de aminoácidos no convencionales o no naturales y/o sus derivados son: ácido D-amino-D- metilbutirato, ciclopentilalanina, ácido aminociclopropano-carboxílico, ciclohexilalanina, ácido aminoisobutírico, ácido aminonorbornil-carboxílico, D-alanina, D-arginina, ácido D-aspártico, D-cisteina, D-glutamina, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-leucina, D-lisina, D- metionina, D-ornitina, D-fenilalanina, D-prolina, L-N-metilalanina, L-N-metilarginina, L-N- metilasparagina, ácido L-N-metilaspártico, L-N-metilcisteina, L-N-metilglutamina, ácido L-N- metilglutámico, ciclohexil L-N-metilhistidina, L-N-metilisoleucina, L-N-metilleucina, L-N- metillisina, L-N-metilmetionina, L-N-metilnorleucina, L-N-metilnorvalina, L-N-metilornitina, L-N-metilfenilalanina, L-N-metilprolina, L-N-metilserina, L-N-metiltreonina, L-N- metiltriptofano, L-N-metiltirosina, L-N-metilvalina, L-N-metiletilglicina, D-serina, D-treonina, D-triptofano, D-tirosina, D-valina, D-a-metilalanina, D-N-metilarginina, D-N-metilasparagina, D-a-metilaspartato, D-a-metllcIsteina, D-a-metilglutamina, D-a-metilhistidina, D-a- metilisoleucina, D-a-metilleucina, D-a-metillisina, D-a-metilmetionina, D-a-metilornitina, D-a- metilfenilalanina, D-a-metilprolina, D-a-metilserina, D-a-metiltreonina, D-a-metiltriptofano, D- α-metiltirosina, D-a-metilvalina, D-N-metilalanina, D-N-metilarginina, D-N-metilasparagina, D-N-metilaspartato, D-N-metilcisteina, D-N-metilglutamina, D-N-metilglutamato, D-N-metilhistidina, D-N-metilisoleucina, D-N-metilleucina, L-N-metil-t-butilglicina, L-norleucina, L-norvalina, a-metil-aminoisobutirato, α-metil-a-aminobutirato, a- metilciclohexilalanina, a-metilciclopentilalanina, α-metil-a-naftilalanina, a-metilpenicillamina, N-(4-aminobutil)glicina, N-(2-aminoetil)glicina, N-(3-aminopropil)glicina, N-amino-a- metilbutirato, α-naftilalanina, N-bencilglicina, N-(2-carbamiletil)glicina, N- (carbamilmetil)glicina, N-(2-carboxietil)glicina, N-(carboximetil)glicina, N-ciclobutilglicina, N- cicloheptilglicina, N-ciclohexilglicina, N-ciclodecilglicina, N-ciclododecilglicina, N- ciclooctilglicina, N-ciclopropilglicina, N-cicloundecilglicina, N-(2,2-difeniletil)glicina, N-(3,3- difenilpropil)glicina, N-(3-guanidinopropil)glicina, N-(l-hidroxietil)glicina, N- (hidroxietil)glicina, N-(imidazoliletil))glicina, N-(3-indolilietil)glicina, D-N-metillisina, N-metilciclohexilalanina, D-N-metilornitina, N-metilglicina, N-metilaminoisobutirato, N-(l- metilpropil)glicina, N-(2-metilpropil)glicina, D-N-metiltriptofano, D-N-metiltirosina, D-N- metilvalina, ácido -aminobutírico, L-t-butilglicina, L-etilglicina, L-homofenilalanina, L- - metilarginina, L-metilaspartato, L-metilcisteina, L-metilglutamina, L-metilhistidina, L- metilisoleucina, L-metilleucina, L-metilmetionina, L-metilnorvalina, L-metilfenilalanina, L- metilserina, L-metiltriptofano, L-metilvalina, N-(N-(2,2-difeniletil) carbamilmetil)glicina, 1- carboxi- 1 -(2,2-difenil-etilamino)ciclopropano, N-metil-a-aminobutirato, D-N-metilmetionina, N-metilciclopentilalanina, D-N-metilfenilalanina, D-N-metilprolina, D-N-metilserina, D-N- metiltreonina, N-(l-metiletil)glicina, N-metil-a-naftilalanina, N-metilpenicillamina, N-(p- hidroxifenil)glicina, N-(tiometil)glicina, penicillamina, L-N-metilalanina, L-a-metilasparagina, L-a-metil-t-butilglicina, L-metiletilglicina, L-a-metilglutamato, L-a-metilhomofenilalanina, N- (2-metiltioetil)glicina, L-a-metillisina, L-a-metilnorleucina, L-a-metilornitina, L-a-metilprolina, L-D-metiltreonina, L-a-metiltirosina, L-N-metilhomofenilalanina, y N-(N-(3,3-difenilpropil) carbamilmetil)glicina.
Un equivalente, análogo y/o homólogo químico de angiotensina-(l-9) como se describió más arriba, comparte similitudes conformacionales y/o funcionales con angiotensina-(l-9), pero no necesariamente deriva de angiotensina-(l-9). De esta manera se puede diseñar un equivalente químico que imite ciertas propiedades biológicas y/o fisiológicas de la angiotensina-(l-9).
Aunque en la presente invención está ejemplificado en forma particular el uso de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados y medicamentos o composiciones farmacéuticas que lo(s) contiene(n) en rata, se entiende que la presente invención se extiende al uso de la angiotensina- (1-9) y/o sus derivados y medicamentos o composiciones farmacéuticas que lo(s) contiene(n) de acuerdo a la invención a cualquier mamífero, por ejemplo, y sin ánimo de limitarlos a, humanos, ratón, conejos, primates, perros, gatos, mascotas en general, animales de granja, etc. DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. Efecto preventivo de la angiotensina-(l-9) en la hipertrofia de la pared aórtica de ratas hipertensas por administración de angiotensina II. Cortes transversales, paneles A, B, C y D (4X) y E, F, G y H (40x) de aortas torácicas de animales Sham (Ay E), angiotensina II (B y F), angiotensina II/1-9 (C y G) y angiotensina II/1 -9/A779 (D y H). Barra superior 0,5 mm y barra inferior 50 μιη. Figura 2. Efecto de. la administración continúa de angiotensina-(l-9) en el área luminal de aortas torácicas de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9- 12.
Figura 3. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en el grosor de la túnica media de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los valores representan el promedio ± SEM. p<0,05 v/s angiotensina II, *p<0,05 vs Sham (después de ANO VA). N=9-12.
Figura 4. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en el ATM/ AL de pared aórtica de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los valores representan el promedio ±SEM. pO,05 v/s Ang II, *p<0,05 vs. Sham (después de ANO VA). N=9- 12.
Figura 5. Efecto de angiotensina-(l-9) en la hipertrofia del cardiomiocito inducida por Ang II in vivo. Ratas macho normotensas se randomizaron a recibir angiotensina II en presencia o ausencia de angiotensina-(l-9) y A779 por dos semanas. A. Microfotografía de un corte transversal de ventrículo izquierdo teñido con hematoxilina y eosina (400X). Barra de escala, 50 μιη. B. Cuantificación del área del cardiomiocito y C. Cuantificación del perímetro del cardiomiocito. Los resultados se presentan como promedio ± SEM (n=9-12). *** p<0,001 vs
Sham; p<0,001 vs angiotensina II, p<0,001 vs angiotensina II + angiotensina-(l-9) (post ANO VA significativo).
Figura 6. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles de mRNA para TGF-β en la pared aórtica de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los niveles de mRNA TGF-β se normalizaron con respecto a la banda 18S del RNA ribosomal. Los valores representan el promedio ± SEM, N = 8. p<0,05 vs angiotensina II, *p<0,05 vs Sham (post ANOVA significativo).
Figura7. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles de mRNA para MCP-1 en la pared aórtica de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los niveles de mRNA MCP-1 se normalizaron con respecto a la banda 18S del RNA ribosomal. Los valores representan el promedio ±SEM. N=8 Figura 8. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles proteicos de colágeno I en la pared aórtica de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los valores obtenidos por Western blot representan el promedio ± SEM. N=8-12. Como control de carga se usó β-actina. p < 0,05 vs angiotensina II, *p < 0,05 vs Sham (post ANOVA significativo).
Figura 9. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en la presión arterial sistólica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión, modelo GB (2k, 1 clip). Los resultados corresponden al promedio ±SEM, con un N= 7-12. *p<0.05 vs Sham, p<0.05 vs GB (después de ANOVA).♦: ratas normotensas,■: ratas hipertensas GB, A : ratas hipertensas con tratamiento de angiotensina-(l-9), ·: ratas hipertensas con tratamiento de angiotensina-(l-9) y A779 (inhibidor del receptor de angiotensina-( 1 -7)).
Figura 10. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en la hipertrofia cardíomiocitaria de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. En cortes transversales de ventrículos y teñidos con hematoxilina-eosina, se analizó el área (A) y el perímetro (B) de los cardiomiocitos. N= 7-12. S= ratas Sham, GB = ratas Goldblatt hipertensas, GB- angiotensina-(l- 9) = ratas Goldblatt hipertensas con angiotensina-(l-9), *p<0.05 vs S, #p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).
Figura 1 1. Efecto de la angiotensina-(l-9) en reducir la hipertrofia de la pared aórtica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Cortes transversales, paneles A, B, C y D (4X) y E, F, G y H (40x) de aortas torácicas de animales Sham (Ay E), angiotensina II (B y F), angiotensina II/ 1 - 9 (C y G) y angiotensina II/1-9/A779 (D y H). Barra superior 0,5 mm y barra inferior 50 μπι.
Figura 12. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en reducir el área de la túnica media (ATM) de aortas torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-12. *p<0.05 vs S, p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).
Figura 13. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en reducir el grosor de la túnica media de aortas (GTM) torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-1.2. *p<0.05 vs S, p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).
Figura 14. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en reducir la razón área túnica media/área luminal (ATM/AL) de aortas torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-12.*p<0.05 vs S, p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).
Figura 15. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en el área luminal (AL) de aortas torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-12.
Figura 16. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en el área total de aortas torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-12.
Figura 17. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles proteicos de colágeno I en la pared aórtica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores obtenidos por Western blot representan el promedio ±SEM. N=3-12. Símbolos: # p<0.05 vs GB, *p<0.05 vs Sham (post ANOVA significativo).
Figura 18. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en la fibrosis miocárdica hipertensiva por sobrecarga de presión. En cortes transversales de ventrículo teñidos con rojo picrosirius (3 A), se determinó la fracción volumétrica de colágeno total (FVCT). N= 7-12. Barra= 100 um. Abreviaturass: S= ratas Sham, GB=ratas Goldblatt, GB- angiotensina-(l-9) = ratas Goldblatt hipertensas con angiotensina-(l-9), *p<0.05 vs S, #p < 0.05 vs GB (post ANOVA significativo).
Figura 19. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles proteicos de TGFP-l en la pared aórtica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores obtenidos por Western blot representan el promedio ± SEM. N=8-12. Como control de carga se usó β- actina. #p<0,05 vs angiotensina II, *p<0,05 vs Sham (post ANOVA significativo). Figura 20. Efecto de angiotensina-(l-9) en los niveles de ED-1 de la pared aórtica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Cortes transversales de aorta torácica fueron inmunoteñidos con anti-ED-1. *p<0.05 vs S, #p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).
Figura 21. Efecto de angiotensina-(l-9) sobre la vasodilatación de arterias mesentéricas de rata. Se determinó el diámetro de arterias controles con endotelio (o), tratadas con fenilefrina (·, control de vasoconstricción), sin endotelio (A) y tratados com L-NNA (Δ, inhibidor de la óxido nítrico sintetasa), en presencia de distintas dosis de angiotensina-(l-9).
Figura 22. Sobrexpresión de ECA2 por transducción adenoviral en cardiomiocitos en cultivo. Cardiomiocitos en cultivo se transdujeron con un adenovirus que sobreexpresa ECA-2, usando distintas multiplicidades de infección (MOI). Los MOIs utilizados fueron, carril 1 : MOI=0, carril 2: MOI=1000, carril 3: MOI=2000, carril 4: MOI=3000; carril 5: MOI=4000. Después de 48 h de incubación a 37°C en un incubador con 5% C02/95% aire, las células se Usaron y se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS y posterior western blot, usando un anticuerpo policlonal anti-ECA2.
Figura 23. Efecto de la sobre expresión de la ECA2 en la hipertrofia cardiaca hipertensiva por sobrecarga de presión. Luego de una semana de la infección con el vector adenoviral, el ventrículo fue extraído, tratado, cortado y medido tal como se describe en materiales y método. A) Imagen representativa de los cardiomiocitos de ratas Sham, Goldblatt (GB), Goldblatt tratadas con AdECA2 (GB-AdECA2) y Goldblatt tratadas con AdGFP (GB-AdGFP). La barra equivale a 50 μπι. Fotos tomadas en 40X. B) Cuantificación del área de cardiomiocitos. C) Evaluación del perímetro de cardiomiocitos. Los valores se presentan como promedio ± SEM, N= 5-8. *p<0.05 vs S, # p<0.05 vs GB,† p<0.05 vs GB-AdECA2.
Figura 24. Efecto de la sobrexpresión de ECA2 en la fracción volumétrica de colágeno total del ventrículo. A) Imagen representativa de cortes transversales de ventrículo teñidos con rojo picrosirius. Barra- 100 μηι. Abreviaciones: S= ratas Sham, GB=ratas Goldblatt, GB-AdECA2)= ratas Goldblatt hipertensas infectadas con AdECA2 angiotensina-(l-9), GB-AdGFP= ratas Goldblatt hipertensas infectadas con AdGFP. Fotos tomadas en 40X. B) Cuantifícación de la fracción volumétrica de colágeno. Los valores se presentan como promedio ± SEM, N= 7-12. *p<0.05 vs S, #p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Diseño experimental y animales.
Se usaron ratas macho Sprague-Dawley normotensas de 200 ± 10 g, provenientes del Bioterio Central de la Pontificia Universidad Católica de Chile (PUC). Los experimentos se realizaron acorde a la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (NIH N° 85-23,1985) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Bienestar Animal de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
1. Diseño experimental de modelo de hipertensión arterial inducida por infusión de angiotensina II.
Las ratas se sometieron al modelo de infusión de angiotensina II (Grobe y cois. Am J Physiol. 292: H736-42, 2007). Los animales se separaron al azar en los siguientes grupos experimentales: controles (Sham o pseudoperados), infundidas con angiotensina II (300 ng/kg min), infundidas con angiontensina II y angiotensina-(l-9) [300 ng/kg min y 602 ng/Kg min, respectivamente] y finalmente infundidas con angiotensina II, angiotensina-(l-9) y el antagonista del receptor de angiotensina-(l-7), A779 (300 ng/kg min, 602 ng/Kg min y 100 ng/kg min, respectivamente). En todos los casos las bombas operaron a un flujo de 0.5 μί/η. y se implantaron en la vena yugular derecha a través de un catéter a alojadas en un bolsillo subcutáneo intraescapular, bajo anestesia ketamina HCl/xilazina (35 and 7 mg/kg i.p., respectivamente), por un periodo de 14 días.
2. Diseño experimental de modelo de hipertensión arterial mediante pinzamiento arterial renal (procedimiento Goldblatt, GB, 2 ríñones, 1 pinzado). Se utilizaron ratas normotensas Lewis (peso 150□ 10 g) las cuales se separaron al azar al grupo modelo de hipertensión experimental o GB (Ocaranza y cois. J Hypertens. 20:413-20, 2002) o grupo control (S). Este último correspondió a animales pseudo operados. Todos los animales se mantuvieron bajo condiciones controladas de luz y oscuridad y tuvieron libre acceso a agua y comida. Las ratas GB a la 4 semanas post cirugía y con hipertensión arterial superior a 140mmHg, se randomizaron para la administración crónica de angiotensina-(l-9) por bomba osmótica (602 ng kg 'min"1) vía yugular durante dos semanas. Los animales se n sacrificaron después de las 6 semanas post-cirugías.
3. Análisis estadístico
Los grupos experimentales estuvieron conformados por 6-12 ratas. Los datos se expresaron como promedio + S.E.M. Para las comparaciones se usó análisis estadístico con ANOVA seguido de prueba de t de Student- Newman-Keuls. El análisis estadístico se realizó usando el programa estadístico SPSS 10.0. Un valor de p<0,05 es considerado como estadísticamente significativo.
Ejemplo 2. Estudios hemodinámicos y funcionales
La presión arterial sistólica (PAS) se determinó por el método pletismográfico en la cola de los animales. Para ello, las ratas se anestesiaron suavemente con éter etílico. La medición se realizó una vez por semana por investigadores ciegos al tratamiento (Ocaranza y cois. J Hypertens. 20:413-20, 2002).
Ejemplo 3. Evaluación del remodelado cardiaco y vascular
1. Evaluación de la hipertrofia cardiaca
El grado de hipertrofia cardíaca (HC) se cuantificó por la relación entre la masa cardiaca (MC), el peso corporal (PC) y masa cardiaca relativa (MCR; [MC/PC]* 100) (Ocaranza y cois, J Hypertens 28: 1054-64, 2010). ' 2. Evaluación de la hipertrofia de la aorta
La hipertrofia aórtica se determinó por morfometría. Se usaron cortes de la aorta descendente de 5 μιη de grosor que fueron previamente fijados en Bouin (ácido pícrico 1,3%, formaldehido 9,5% y ácido acético 4,8%) por 24 h, incluidos en parafina y teñidos con hematoxilina-eosina, para después ser examinados en un microscopio de luz acuerdo a lo descrito por Igase y cois (Am J Physiol. 289: H1013-9, 2005). Brevemente, las imágenes de las aortas se capturaron mediante una cámara de video (Nikon) fijada a un microscopio (Nikon), y proyectadas en un monitor; mediante el uso del software Nis-Element.. Se calculó y registró las áreas del lumen (AL) y total (AT). El área de la túnica media (ATM) se obtuvo de la diferencia del AT y el AL de la aorta. El grosor de la túnica media (GTM) se definió como la región delimitada por la lámina elástica externa (LEE) y la lámina elástica interna (LEI).
3. Análisis morfológicos y morfométricos del tejido cardiaco
La porción media del ventrículo izquierdo (VI) se deshidrató a temperatura ambiente en Bouin por 24 h y posteriormente se incluyó en parafina. Se tomaron cortes de 10-15 Dm de grosor y se tiñeron con Hematoxilina-Eosina, para después ser examinados en un microscopio de luz, con el fin de observar sus características morfológicas generales. El tamaño de los cardiomiocitos se determinó de acuerdo a lo descrito por Nakamura y cois (Circulation; 98:794-9, 1998). Brevemente, las imágenes de las células se capturaron mediante una cámara Nikon DS Fil y proyectadas a un monitor mediante un software. Se midió y registró el área y perímetro de los cardiomiocitos, utilizando el programa Nis-Element (Ocaranza y cois. J Hypertens, 28:1054-64, 2010). Todas las mediciones se realizaron por un observador ciego y se analizaron, al menos, 80 imágenes celulares por animal, las que se seleccionaron aleatoriamente. 4. Evaluación morfométrica del desarrollo de fibrosis cardiaca
Se utilizaron cortes de 5 μηι de ventrículo, previamente incluido en Bouin, los cuales se trataron con rojo picrosirio. El tejido se examinó bajo microscopio de luz, las imágenes se capturaron con cámara Nikon DS Fil y proyectadas a un monitor. Se utilizó el programa Matlab, con el cual se midió el contenido de colágeno intersticial según el procedimiento descrito por Ocaranza y cois (J Cardiovasc Pharmacol. 40,246-54, 2002).
5. Evaluación de la inflamación de la aorta a través de los niveles de mRNA de TGF-β y MCP-1 Se siguió el procedimiento descrito por Ocaranza y cois (Hypertension 48:572-8, 2006). Brevemente, el RNA total de la aorta se aisló por el método del trizol y se cuantificó por espectroscopia a 260 nm/280 nm. El cDNA se obtuvo por transcripción reversa a partir de 1,5 μg de RNA total tratado con DNAsa. Los ensayos de PCR se realizaron usando los siguientes protocolos de amplificación y secuencias de partidores (Ocaranza y cois. J Cardiovasc Pharmacol. 40:246-54, 2004), TGF i 33 ciclos de denaturación a 94°C por 1 min, hibridización a 52°C por 1 min y elongación a 72°C por 1 min. Como partidor sentido se usó 5'- AAGCCCTGTATTCCGTCTCC-3 ' y antisentido 5'-CAACGCCATCTATGAGAAAACC-3\ MCP-1 38 ciclos de 1 min. a 92°C, 1 min a 53°C, 1 min a 72°C y posteriormente 10 min a 72 °C. Las secuencias nucleotídicas de los partidores sentido y antisentido fueron 5 '-CAGGTCTCTGTCACGCTTCT-3 ' y 5 -GTGCTTCAGGTGGTTGTGG-3 ' , respectivamente. La intensidad de las bandas se cuantificó por densitometría y se normalizó con respecto a la banda 18S del RNA ribosomal.
6. Niveles proteicos de colágeno I y TGFp-l
Para la determinación de colágeno I, se utilizaron 30 μg de proteína total y para TGF -l 50 μg diluidas en tampón reductor SDS (50 mM tris-HCl, pH 7,4, NP-40 10%, NaCl 1M, deoxicolato de Na 5%, EDTA 10 mg/mL, SDS 10%, aprotinina 1 mg/mL, leupeptina 0.1 mg/mL, PMSF 10 n M), se separaron por electroforesis en geles SDS-PAGE al 7% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de 0,2 μηι a 300 mA durante 1 h. La transferencia de proteínas se verificó por tinción con rojo Ponceau. Posteriormente, las membranas se bloquearon en solución de leche descremada/PBS-Tween 20 0,05% al 7% durante 1 :30 h a temperatura ambiente y después de 3 lavados de 10 min con solución de lavado (leche 0.5% en PBS-Tween 20 0,05%) se incubó durante toda la noche con el anticuerpo anti-colágeno I (dilución 1 :3000) o anti TGFp-l (dilución 1/2500) en solución de lavado con agitación constante a 4°C. Después de 3 lavados de 10 min con solución de lavado se agregó el anticuerpo secundario anti-conejo en dilución 1 : 10000 incubándose por 2 h a temperatura ambiente. Finalmente, después de 3 lavados se reveló con sustrato quimioluminiscente para posterior cuantificación de la intensidad de bandas por densitometría (Ocaranza y cois. J Cardiovasc Pharmacol. 40:246-54, 2004).
7.- Inmunohistoquímica para la determinación de células inflamatorias (ED-1)
La inmuno tinción se realizó usando el método estreptavidina-biotina-peroxidasa con el marcador de inflamación ED-1. Este es una glicoproteína expresada principalmente en la membrana lisosomal de macrófagos activos (Leskovar y col. JExp Biol. 203: 1783-1795,2000).
Para bloquear la peroxidasa endógena, las muestras se desparafinaron, rehidrataron y trataron con 10% H202 en metanol por 1 h. Luego, los tejidos se incubaron con anticuerpo monoclonal anti ED-1 (clon MCA341R, Serotec) diluido 1/1000 en 1% BSA preparado en PBS-0,05% Tween 20 toda la noche a 4°C en cámara húmeda. Las secciones se lavaron tres veces con lx PBS-0.05% Tween 20, pH 7,4 por 5 min y se incubaron con el segundo anticuerpo biotinilado por 30 min a temperatura ambiente. A continuación los tejidos se lavaron nuevamente y se incubaron con el complejo estreptavidina-peroxidasa por 30 min a temperatura ambiente. Los sitios immunoreactivos se visualizaron con 3,3 '-diaminobenzidina. Las preparaciones se contra- tifleron con hematoxilina, deshidrataron, aclararon con xilol y montaron con Permaunt (Fisher). Ejemplo 4. Angiotensina-(l-9) previene el aumento de la presión arterial y el remodelado vascular inducido por la infusión de angiotensina II.
1. Grupos experimentales
Se establecieron 4 grupos experimentales de ratas descritas en el ejemplo 1. Grupo 1, correspondiente a ratas a las que se les infundió salino (sham). Grupo 2, correspondiente a ratas a las que se les infundió sólo angiotensina II. Grupo 3, correspondiente a ratas a las que se les coinfundió angiotensina II y angiotensina-(l-9) y Grupo 4, correspondiente a ratas a las que se les co-infundió angiotensina II, angiotensina-(l-9) y A779. 2. Presión arterial sistólica
No hubo diferencia significativa en la masa corporal (MC) de los 4 grupos experimentales. Sin embargo, la MV y la MCR fueron menores para las ratas con infusión de angiotensina II v/s las ratas con angiotensina II/ 1-9, angiotensina II/ 1-9/A779 y sham. La PAS fue significativamente mayor (13 %) en las ratas infundidas con angiotensina II respecto a las angiotensina-(l-9)+A779. Mientras que, la coadministración de angiotensina-(l-9) o de angiotensina-(l-9)+A779 disminuyeron de igual forma la PAS respecto de las angiotensina II (-10% y -13 %, respectivamente, Tabla 1).
TABLA 1 : Efecto de angiotensina (1-9) en el peso corporal, masa cardiaca y presión arterial sistólica de ratas hipertensas por administración de angiotensina II
Parámetro Sham Ang II Ang II/1-9 AngII/l-9/A779
(n=12) (n=12) (n=12) (n=9)
MC (g) 280±19 260 ±25 255±24 279±28
MV (mg) 938±16 899±28 984±26*# 1042±34*
MCR (MV/MC) 332±17 348±18* 386±36" 377±33# PAS Inicial 119±9 121±9 123±11 121±5
PAS lasem 116±10 130±4* 141±9*# 139±5*#
PAS 2asem 118±8 154±10* 139±1 1 * 135±9*ff
La hipertensión arterial se definió como el promedio de las presión arterial sistólica de las ratas Sham + 3DS = 141mmHg. Los resultados representan el promedio ± SEM. *p<0.05 v/s Sham, # p<0.05 v/s angiotensina II (post ANO VA significativo). Abreviaturas: Ang = angiotensina, MC= masa corporal, MV= masa cardíaca, VI= ventrículo izquierdo, MCR= masa relativa cardíaca, PAS= presión arterial sistólica
3. Hipertrofia vascular
La hipertensión arterial inducida por infusión de angiotensina II aumentó significativamente el grosor de la túnica media (GTM) (Figuras 1 y 3), sin cambios en el área del lumen (AL) vascular (Figura 2). Se observó un aumento de la razón área de la túnica media (ATM)/AL (Figura 4) en las ratas con angiotensina II respecto a las ratas controles (Figuras IB y 1F vs FiglA y 1E). La confusión con angiotensina-(l-9) previno significativamente el aumento del GTM (Figura 3) y del ATM/ AL inducida por infusión con angiotensina II (Figura 4). Este efecto no fue afectado por la administración de A779 (Figuras ID, 1H, 3 y 4). No se observaron diferencias en el AL entre los diferentes grupos experimentales (Figura 2).
4. - Determinación de la hipertrofia cardiomiocitaria inducida por la administración de angiotensina II
La administración de angiotensina II aumentó el área celular en un 37% (204 ± 1 vs 282 ± 2 μηι2, p < 0,001, Figura 5A) y el perímetro en un 18% (56,1 ± 0,2 vs 66,2 ± 0,3 μηι, p < 0,001,
Figura 5B), respecto al grupo control Sham. La co-administración de angiotensina-(l -9) previno el aumento del tamaño del cardiomiocito inducido por angiotensina II (Figura 5A), mostrando una disminución significativa en un 20% en el área celular (282 ± 2 vs 227 ± 2 μηι2, p < 0,001, Figura 5 A) y del 1 1% en el perímetro celular (66,2 ± 0,3 vs 59,1 ± 0,3 μηι, p < 0,001, Figura 5B), respecto al grupo infundido solo con angiotensina II.
Dado que angiotensina-(l-9) es precursor de angiotensina-(l-7), se utilizó el antagonista del receptor Mas, A779 para descartar la participación de angiotensina-(l-7) en los efectos de angiotensina-(l-9). La Figura 5 A muestra que A779 no inhibió el efecto antihipertrófico de angiotensina-(l-9), ya que igualmente este péptido disminuyó el área celular en un 31% (282 ± 1 vs 195 ± 2 μηι2, p < 0,001, Figura 5B) y el perímetro en un 15,5% (66,2 ± 0,3 vs 55,9 ± 0,2 μηι, p < 0,001, Figura 5B) respecto al grupo infundido solo con angiotensina II. La coadministración de angiotensina-(l-9), A779 junto con angiotensina II fue más efectivo en reducir el área (14%, 227 ± 2 vs 195 ± 2 μηι2, p < 0,001, Figura 5 A) y perímetro (5%, 59,1 ± 0,3 vs 55,9 ± 0,2 μιη, p < 0,001, Figura 5B) respecto al grupo experimental que recibió solo angiotensina-(l -9) en presencia de angiotensina II. 5. Niveles de mR A de TGF-β y MCP- 1
La administración de angiotensina II aumentó significativamente los niveles de inflamación vascular determinado a través del aumento del mRNA para TGF- β respecto a su control sham (12,8 veces más) (Figura 6), sin diferencias en los niveles de mRNA de MCP-l (Figura 6). La administración de angiotensina-(l-9) disminuyó significativamente los niveles de mRNA de TGF-βϋ en un 62,5% (Figura 6), mientras que el mRNA de MCP-l no mostró diferencias (Figura 7).
4. Niveles proteicos de colágeno I por Western blot
El colágeno I aumentó significativamente en las ratas con hipertensión por angiotensina II respecto a su grupo control sham (4,5 veces, Figura 8). La administración de angiotensina-(l-9) previno en un 60% el aumento de colágeno de la pared de la aorta y la coadminstración de A779 no modificó el efecto de la angiotensina-(l-9) (Figura 8).
En resumen, los resultados mostrados en este ejemplo muestran que: A) La presión arterial sistólica aumentó significativamente en las ratas con administración crónica de angiotensina II. B) La administración de angiotensina-(l-9) previno la hipertensión y su efecto fue independiente de angiotensina-(l -7). C) angiotensina-(l-9) previno la hipertrofia de la pared aórtica por angiotensina II. El efecto antihipertrófico de angiotensina-(l-9) fue directo y no depende de angiotensina-(l-7) (no fue inhibido con A779). D) La angiotensina II aumentó los niveles de expresión de TGF-β y el contenido de colágeno en la pared aórtica. angiotensina-(l-9) en la dosis usadas previno la expresión de los marcadores de remodelado vascular estudiados y su efecto fue independiente de angiotensina-(l-7). Estos resultados muestran claramente que angiotensina-(l-9) previene la hipertensión arterial y el remodelado de la pared aórtica.
Ejemplo 5. Angiotensina-(l-9) revierte el aumento de la presión arterial y el remodelado cardiovascular en el modelo Goldblatt (GB, 2 ríñones, 1 pinzado)
1. Peso corporal (PC), masa cardiaca (MC) y masa cardiaca relativa (MCR).
La Tabla 2 resume el PC, PAS y la MCR de las ratas Sham, GB y GB+angiotensina-(l-9). No se observaron diferencias en los PC de los tres grupos experimentales evaluados, aunque los PC en las ratas Gb+angiotensina-(l-9) fueron menores. Mientras que la MC se elevó significativamente en los animales hipertensos respecto a los animales control (0,93 ± 0,04 vs 0,74 ± 0,01, p < 0,03, respectivamente). angiotensina-(l-9) disminuyó significativamente la MC en las ratas con HTA respecto a los animales GB sin tratar (0, 84 ± 0,03 vs 0,9 3± 0,04 g, respectivamente, Tabla 2). La MCR mostró un aumento significativo en las ratas GB vs las Sham (400 ± 1 vs 330 ± 1, p < 0,04, respectivamente). La administración de angiotensina-(l-9) disminuyó la MCR en las ratas hipertensas (380 ± 2 vs 400 ± 1), aunque no alcanzó diferencias estadísticamente significativas (Tabla 2). TABLA 2: Efecto de angiotensina-(l-9) en el peso corporal, masa cardiaca y masa cardiaca relativa de ratas hipertensas por pinzamiento de la arteria renal (modelo Goldblatt)
GB GB.Ang-{l-9) GB-Ang-(1-9 A779
N 12 8 7
PC (g) 225 ± 12 248 ± 14 238 ± 6 245 ± 21 j
MCR (mg/g) 0,68 ± 0,01 1,01 ± 0,03* 0,84 ± 0,04 *# 0,83 ± 0,10 *
MC (g) 0,33 ± 0,02 0,41 ± 0,01* 0,37 ± 0,02 0,34 ± 0,01
Los resultados representan el promedio ± SEM. S: sham; Ang: angiotensina; GB:
Goldblatt; PC: Peso corporal; PAS: presión arterial sistólica; MCR: Masa cardiaca relativa; MC: Masa cardiaca. *p < 0,05 vs S, #p < 0,05 vs GB (post ANO VA significativo).
2. Presión arterial sistólica
Las ratas sham mostraron niveles de presión arterial sistólica en los rangos de normotensión y cercanos a los 110 mmHg entre la semana 1 y 6 del ensayo (Figura 9). Las ratas GB aumentaron significativamente la presión arterial sistólica a partir de la semana 1 post cirugía la cual se mantuvo elevada y significativamente mayor durante las 6 semanas de duración del ensayo. La administración continua de angiotensina-(l-9) a las ratas GB a partir de la semana 4 post cirugía disminuyó en un 15% y significativamente la presión arterial sistólica a partir de la semana 1 post administración y se mantuvo durante las 2 semanas de duración del ensayo (Figura 9). El efecto antihipertensivo de angiotensina-(l-9) no fue revertido con la coadministración del inhibidor del receptor de angiotensina-(l-7) A779 (Figura 9).
3. Determinación morfométrica de la hipertrofia miocárdica hipertensiva.
La evaluación del área y perímetro de los cardiomiocitos en las ratas hipertensas mostraron aumentos significativos respecto a las ratas sham (218 ± 2 vs 203 ± 2 μπι2 y 60 ± 1 vs 55 ± 1 μηι, respectivamente) (Figura 10). Sin embargo, la administración de angiotensina-(l-9) disminuyó el área y el perímetro de los cardiomiocitos en un 16% y un 22% respectivamente, en comparación con las ratas hipertensas (Figura 10). El efecto antihipertrófico de angiotensina-(l-9), no fue revertido con la coadministración del inhibidor del receptor de angiotensina-(l-7) A779 (Figura 10).
4. Hipertrofia vascular
La hipertensión arterial inducida por pinzamiento de la arteria renal aumentó significativamente el área de la túnica media (ATM), grosor de la túnica media (GTM) y la razón ATM/área luminal (AL) (Figuras 1 1-14) respecto al grupo control, sin cambios en el AL (Figura 15) y el área total (Figura 16). La confusión con angiotensina-(l-9) redujo significativamente el aumento del ATM, GTM y del ATM/AL (Figuras 1 1-14). El efecto de angiotensina-(l-9) efecto no fue afectado por la administración de A779 (Figuras 1 1-14). 5. Niveles proteicos de colágeno I en la pared aórtica
El colágeno I aumentó significativamente en las ratas hipertensas con respecto a su grupo control sham (5 veces, Figura 17). La administración de angiotensina-(l-9) redujo en un 54% el aumento de colágeno de la pared de la aorta y la coadministración de A779 no modificó el efecto de la angiotensina-(l-9) (Figura 17).
6.- Contenido ventricular de colágeno total
La fracción volumétrica de colágeno total (FVCT) mostró ser significativamente mayor en las ratas GB en comparación con las ratas sham (6,5 ± 1 y 3,7 ± 1 □□ respectivamente, Figura 18). Al tratar las ratas GB con angiotensina-(l-9), se observó una disminución significativa de la FVCT en un 41% con respecto a las ratas hipertensas sin tratamiento (3,8 ± 1 vs 6,5 ± 1,□□ respectivamente). La FVCT de las ratas GB+ angiotensina-(l-9) alcanzaron valores semejantes a las ratas normotensas (Figura 18)
7.- Niveles TGFD-1 y ED-1 en la pared aórtica y ventrículo izquierdo?
La hipertensión arterial aumentó significativamente la inflamación vascular determinada a través del aumento de los niveles para TGF -l y ED-1 respecto a su control sham (3,0 y 3,7 veces, respectivamente, Figuras 19 y 20). La administración de angiotensina-(l-9) disminuyó significativamente los niveles de TGF-pDy ED-1 D D en un 47% y 82%, respectivamente (Figuras 19 y 20), mientras que el A779 no alteró el efecto de angiotensina-(l-9) (Figuras 19 y 20).
A nivel del ventrículo izquierdo, los niveles de ED-1 mostraron un aumento significativo en las ratas GB vs los animales Sham (Tabla 3). La administración de angiotensina-(l-9) disminuyó significativamente los ED-1 en los ventrículos de las ratas hipertensas. El antagonista A779 no modificó el efecto de angiotensina-(l-9) (Tabla 3).
TABLA 3: Efecto de angiotensina-(l-9 ) en el contenido ventricular de ED-1
Los resultados representan el promedio ± SEM. PC: Peso corporal, PAS: presión arterial sistólica, MCR: Masa cardiaca relativa, MC: Masa cardiaca. *p<0,05 vs S, #p<0,05 vs GB
Figure imgf000037_0001
n presencia de ED-1
Número moderado de ED-1 GB 7 2* 20-40 distribuidos homogéneamente
Bajo número de EDI y
GB- angiotensina-(l-9) 7 1# 0-20
aislados
Bajo número de EDI y
GB- angiotensina-(l-9)-A779 4 1# 0-20
aislados
(después de ANO VA). *p<0,05 vs S, #p<0,05 vs GB (post ANOVA significativo).
Ejemplo 6. Determinación del efecto vasoactivo de angiotensina-(l -9). Estudios de contractilidad en arteria mesentérica
Se determinó el cambio de diámetro de arterias de resistencia de la rata (mesentéricas), prefundidas y presurizadas en condiciones fisiológicas, en respuesta a diferentes sustancias según metodología previamente descrita (González y cois. Hypertension. 45; 853-9, 2005).
Brevemente, ratas machos (Sprague Dawley, 150-200 grs.) fueron sacrificadas para disección del territorio vascular mesentérico, evitando manipulación directa de tejido arterial o venoso.
Arterias mesentéricas de pequeño calibre (200-300 micrómetros) fueron aisladas, eliminándose tejido adventicial en forma quirúrgica, bajo lupa estereoscópica (Olympus SZ61). Las arterias fueron perfundidas vía intraluminal en un baño termorregulado, a presión y flujo controlado, con solución de perfusión (Krebs modificado, KRB) de la siguiente composición, en mmol/L: NaCl, 130; CaCl2, 2.5; NaHC03, 25; MgS04, 1.2; NaH2P04, 1.2; KC1, 4.7; glucosa, 5.5, pH 7.4. Antes de su utilización, KRB se gasificó con mezcla 95% 02 y 5% C02. Para la perfusión, la arteria fue canulada con micropipeta de vidrio (164 μ diámetro externo), asegurada con sutura de seda 5-0. Las arterias fueron prefundidas con 10-20 μΙ7ηιϊη de KRB, de modo de lograr presión transmural de 60 mmHg. Después de periodo de reposo de 20 minutos, cada arteria fue incubada en presencia de vasoconstrictor (100 μΜ fenilefrina) por dos minutos y agonista de la producción de NO endotelial (1 μΜ acetilcolina). Estos estímulos permitieron comprobar la viabilidad de la túnica media y el endotelio. En los casos en que se observó respuestas adecuadas, la arteria fue lavada y tras nuevo periodo de equilibrio, fue utilizada para probar efectos vasoconstrictores directos de angiotensina-(l-9), o efectos vasodilatadores después de pre-contracción con fenilefrina. Para evaluar la participación de factores endoteliales en el potencial efecto vasoactivo de angiotensina-(l-9), en algunos experimentos se eliminó el endotelio por abrasión mecánica.
Ejemplo 7. Efecto de la angiotensina-(l-9) sobre la vasodilatación.
Angiotensina-(l-9) aumentó de manera dosis- dependiente, el diámetro de las arterias de resistencia con endotelio intacto en comparación con las arterias en las cuales removió su endotelio (Fig 21). Como control positivo del ensayo se usaron arterias estimuladas con un conocido agente vasocontrictor como fenilefrina. Para determinar el mecanismo vasodilatador de angiotensina-(l-9), se coincubaron las arterias mesentéricas con angiotensina-(l-9) en conjunto con un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (LNAME). Se observó que L-NAME disminuyó el efecto vasodilatador de angiotensina-(l-9), por lo cual el mecanismo de acción vasodilatador de angiotensina-(l-9) es dependiente de óxido nítrico (Figura 21). Ejemplo 8. Obtención de vectores virales que sobreexpresan la enzima convertidora de angiotensina-1 homologa (ECA-2)
1. Obtención de un adenovirus que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.
Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano código de acceso Genebank: NM 021804; rata código de acceso Genebank: NM 001012006) en el plasmidio adeno viral pDC316 (Microbix Byosystem Inc). Los clones positivos se confirmaron por secuenciación. Posteriormente, el plasmidio pDC316 conteniendo el gen para ECA2 se cotransfectó con el plasmidio adeno viral pBHGlox(delta)El,3Cre en células HEK293. El adenovirus recombinante se obtuvo por recombinación homologa entre los dos plasmidios según el procedimiento descrito por Hardy y cois (J. Virol. 71 :1842-9, 1997). La confirmación de que el adenovirus producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el adenovirus que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot y por actividad enzimática de la ECA2. En la Figura 22 se observa la sobreexpresión de ECA2 en cardiomiocitos en cultivo usando distintas multiplicidades de infección (MOI) con un adenovirus que sobreexpresa ECA-2. Basalmente, no es posible detectar la presencia de ECA-2 en cardiomiocitos en cultivo, pero mediante la expresión e ECA-2 usando un adenovirus es posible elevar varios cientos de veces los niveles de ECA-2 (Figura 22).
2. Obtención de un lentivirus que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.
Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano= código de acceso Genebank:
NM 021804; rata= código de acceso Genebank: NM 001012006) en el plasmidio lentiviral
PHAGE-PGK. Los lentivirus se fabricaron en células HEK293T por cotransfección simultánea del vector lentiviral conteniendo el cDNA para ECA2 y los vectores pCMVdeltaR8.9 y pHCMV-G según el procedimiento descrito por Zufferey y cois (J Virol. 72:9873-80, 1998). La confirmación de que el lentivirus producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el lentivirus que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot, y por actividad enzimática de la ECA2.
3. Obtención de un retrovirus que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.
Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano = código de acceso Genebank: NM 021804; rata= código de acceso Genebank: NM 001012006) en el plasmidio retro viral pCnBgSN (o cualquier otro plasmidio retroviral). Los retrovirus se fabricaron en células HEK293T por cotransfección simultánea del vector retroviral conteniendo el cDNA para ECA2 y los vectores pHIT60 (para gal-pol) y pCVG (para VSV-G) según el procedimiento descrito por Yu & Kwon (Methods in Molecular Biology, vol. 433: Volume 1 : Production and In Vivo Applications, Edited by: J. M. Le Doux O Humana Press, Totowa, NJ, páginas 1-16). La confirmación de que el retrovirus producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el retrovirus que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot y por actividad enzimática de la ECA2.
4. Obtención de un virus adenoasociado que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.
Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano= código de acceso Genebank:
NM_021804; rata= código de acceso Genebank: NM 001012006) en el plasmidio del virus adenoasociado pAAV-MCS (Stratagene). Los virus adenoasociados se fabricaron en células
HEK293T por cotransfección simultánea del vector del virus adenoasociado conteniendo el cDNA para ECA2 y los vectores pAAV-RC (pAAV-helper o pRC, que contiene los genes rep y cap) y pAdV-Helper (o pHelper, que porta los genes E2A, E4 y VA-RNAs) según el procedimiento descrito por Stratagene. La confirmación de que el virus adenoasociado producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el virus adenoasociado que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot y por actividad enzimática de la ECA2.
Ejemplo 9. Administración intracardiaca y en vasos sanguíneos de vectores virales que sobreexpresan la enzima convertidora de angiotensina-1 homologa (ECA-2).
La infección de los animales se llevó a cabo según la técnica descrita por Coleman y cois (Physiol Genomics 12:221-8, 2003). Brevemente, ratas macho normotensas de 150 D IO g se randomizaron a operación GB y como controles se usaron ratas seudooperadas (sham). Cinco semanas post cirugía, las ratas con hipertensión arterial establecida >140 mmHg se randomizaron a infección intra-miocárdica tal como lo describe Hajjar y cois (Circ. Res. 86; 616-621, 2000), con un vector adenoviral que sobre expresa la ECA2 (AdECA2) o la proteína fluorescente verde (GFP). Las ratas se anestesiaron con ketamina y xilazina en dosis de 50 mg/Kg/peso y 10 mg/Kg/peso, respectivamente, por vía intraperitoneal, tras lo cual se les intubó por vía laríngea mediante un catéter blando 18-gauge, y se ventiló con un volumen corriente de aproximadamente 2 mL a 60 ciclos/min (ventilador mecánico SAR-830 para animales pequeños). Se realizó una toracotomía a nivel del quinto espacio intercostal izquierdo, y se introdujo un catéter 24-gauge con 30 de solución adenoviral, lentiviral o virus adenoasociado estéril en la cámara ventricular izquierda. Después de la instalación de un tubo de drenaje para la remoción de aire y sangre, se cerró la incisión, se permitió la recuperación de los animales y se les devolvió a sus respectivas jaulas. La mortalidad de esta. cirugía bordeó el 20 % y ha sido establecida para la transferencia génica a largo plazo del tejido miocárdico (para detalles ver Methods in Molecular Biology, vol. 219: Cardiac Cell and Gene Transfer, Edited by: J. M. Metzger O Humana Press Inc., Totowa, NJ). A la semana después de la infección, las ratas se eutanasiaron. Ejemplo 10. La sobreexpresión de ECA-2 reduce la hipertensión arterial y el remodelado ventricular hipertensivo
1. Peso corporal (PC), masa cardiaca (MC) y masa cardiaca relativa (MCR).
El PC en las ratas AdECA2 fue significativamente menor (-21 %) respecto a las ratas GB y sham. No se observaron diferencias en el PC entre las ratas AdECA2 y AdGFP (Tabla 4).
La MC en la ratas GB fue significativamente mayor respecto a su grupo control (943±20 vs 740±20) como también la MCR (387 ± 16 vs 334 ± 13). La infección miocárdica con AdECA2 o AdGFP no modificó la MCR respecto a lo observado en las ratas GB (Tabla 4). Mientras que, la MC fue significativamente menor en las ratas AdECA2 y AdGFP (Tabla 4). TABLA 4: Efecto de la infección intramiocárdica con AdECA2 en el peso corporal, masa cardiaca y masa cardiaca relativa de ratas hipertensas por sobrecarga de presión parámetros S GB GB-AdGFP
N 8 8 8 5
PC (g) 257 ± 7 245 ± 10 193 ± 7* 211 ± 11* 20
MCR (mg/g) 330 ± 13 387 ± 16* 495 ± 19 " 476 ± 73*
MC (g) 0,740 ± 0,02 0,943 ± 0,02* 0,812 ± 0,02* 0,980 ± 0,01 *T Los resultados representan el promedio ± SEM. PC: Peso corporal, MCR: Masa cardiaca relativa, MC: Masa cardiaca. *p<0,05 vs S, #p<0,05 vs GB,† p<0,05 vs GB-AdECA2 (post ANO VA significativo). 2. Presión arterial sistólica
Las ratas sham mostraron niveles de presión arterial sistólica en los rangos de normotensión y cercanos a los 110 mmHg entre la semana 1 y 6 del ensayo (Tabla 5). Las ratas GB aumentaron significativamente (42%) la presión arterial sistólica a partir de la semana 1 post cirugía la cual se mantuvo elevada y significativamente mayor durante las 6 semanas de duración del ensayo. La infección intramiocárdica de las ratas GB con AdECA2 a partir de la semana 5 post cirugía disminuyó significativamente en un 15%, la presión arterial a la semana post administración (Tabla 5). El grupo GB-AdGFP también mostró una disminución significativa de la PAS (- 22%, Tabla 5).
TABLA 5: Efecto de la infección intramiocárdica con AdECA2 en la presión arterial sistólica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión
¡r " "<SB . ' GB-AdECA2 GB-AdGFP
N 8 8 8 5
PAS inicial 1 13 ± 3 1 10 ± 2 1 10 ± 4 113 ± 4
PAS sem 1 1 14 ± 3 133 ± 6* 125 ± 7*# 142 ± 6*
PAS sem 5 110 ± 3 157 ±4* 175 ± 7* " 163 ± 7*
PAS sem 6 1 10 ±3 156 ± 3* 133 ± 9*" 122 ± 5
Los resultados representan el promedio ± SEM. PAS: presión arterial sistólica. *p<0,05 vs S, #p<0,05 vs GB (post ANO VA significativo). 3. - Hipertrofia cardiomiocitaria hipertensiva
La hipertensión aumentó significativamente el área de los cardiomiocitos respecto a sus controles sham (217 ± 2 vs 203 ± 1 , respectivamente, Figura 23 A). La infección miocárdica con AdECA2 disminuyó significativamente el área de los cardiomiocitos respecto al grupo GB (- 25%, respectivamente, Figura 23B). El grupo experimental correspondiente al control de infección con GFP no mostró diferencias en el área cardiomiocitaria respecto a las ratas hipertensas (Figuras 23A y B).
El perímetro de los cardiomiocitos de las ratas hipertensas fue significativamente mayor respecto a sus controles sham (20%, Figura 23 C). La sobreexpresión de ECA2 en ratas hipertensas disminuyó significativamente el perímetro cardiomiocitario respecto a lo observado en las ratas GB (-17%, Figura 23C). Aunque, el perímetro de las ratas infectadas con GFP mostraron ser menores que las ratas GB (-8%), este efecto fue menor al observado con AdECA2.
4. - Fibrosis cardiaca hipertensiva
El contenido de colágeno total fue significativamente mayor en las ratas hipertensas respecto a su grupo control sham (6.5 ± 0.8 vs 3.7 ± 0.4, respectivamente, Figura 24). La infección intramiocárdica de AdECA2 disminuyó significativamente el contenido de colágeno respecto a las ratas hipertensas (3.6 ± 1.7 vs 6.5 ± 2.4, respectivamente, Figura 24). El contenido de colágeno en las ratas infectadas con AdGFP fue similar a lo obtenido en las ratas GB (Figura 24).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial.
2. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para inducir vasodilatación.
3. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el daño cardiovascular, renal, pulmonar, cerebral que se produce en la hipertensión arterial.
4. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde dichos medicamentos son de forma farmacéutica inyectable.
5. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde dichos medicamentos liberan en forma continua el péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido al interior del organismo.
6. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde la liberación de dichos medicamentos se logra con una bomba de liberación continúa.
7. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde dicha liberación continua se realiza a la sangre, intramuscularmente, intradérmicamente, subcutáneamente o intraperitonealmente.
8. Uso del péptido angiotensina-(l -9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde dichos medicamentos son de forma farmacéutica oral o rectal.
9. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para sobreexpresar la enzima convertidora de angiotensina I homologa (ECA2).
10. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos donde la sobreexpresión de la enzima convertidora de angiotensina I homologa (ECA2) se obtiene por adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus, lentivirus .
1 1. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido y al menos un compuesto farmacéutico seleccionado de inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina I, antagonistas del receptor de angiotensina II (ARA II), inhibidores de Rho kinasa, inhibidores de la renina, antagonistas de los canales L de calcio y diuréticos CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial.
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