WO2013149355A1 - Uso de angiotensina 1-9 en asociacion para prevenir la hipertension arterial - Google Patents

Abstract

La presente invención está relacionada con el uso del péptido angiotensina-(l-9) o péptidos derivados de él que son análogos biológicos o químicos para preparar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación. Además, esta invención comprende también un vector que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina II homologa (ECA2) que permite elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9). Este vector puede ser adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus adenoasociados que contiene el gen que codifica para ECA2. Esta invención permite la administración de angiotensina-(l-9) o sus derivados en forma oral, inyectable, infusión continua por bomba, o elevar sus niveles en el organismo mediante tratamiento conjunto con inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina-I, con antagonistas del receptor de angiotensina II (ARA II), con inhibidores de Rho kinasa, con inhibidores de renina, con antagonistas de los canales L de calcio y/o con diuréticos

Description

USO DE ANGIOTENSINA 1-9 EN ASOCIACION PARA PREVENIR LA HIPERTENSION ARTERIAL

MEMORIA DESCRIPTIVA

La presente invención está centrada en el campo del sistema renina-angiotensina-aldosterona, y en particular en el péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados que son equivalentes químicos o biológicos. En particular, la presente invención se relaciona con el uso del péptido angiotensina- (1-9) y/o sus derivados y sus efectos anti-hipertensivos, específicamente para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o para inducir vasodilatación. Además, esta invención incluye el campo de elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9) mediante la producción endógena aumentada de angiotensina-(l-9) a través de un vector que expresa ECA2, enzima responsable de la producción en forma endógena de angiotensina-(l -9).

La hipertensión arterial (HTA) es un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares (CV). La última encuesta Nacional de Salud (ENS) efectuada en el año 2003 mostró que la HTA presenta una prevalencia de un 33,7% en la población general. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), el incremento de la presión arterial, es considerado uno de los principales factores de riesgo CV ya que su aumento crónico termina dañando órganos blanco como corazón, arterias, riñon y cerebro (Varagic & Frohlich, J. Mol. Cell. Cardiol. 34:1435-42, 2002).

Una mayor activación del sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), específicamente de la vía clásica con mayor actividad de la enzima convertidora de angiotensina-I (ECA) y niveles elevados de angiotensina II, se han identificado como importantes determinantes de la etiología de la hipertensión arterial (HTA), la insuficiencia cardiaca, en los procesos fisiopatológicos de remodelado cardiovascular, disfunción diastólica y alteraciones en la vasodilatación de arterias de resistencia. Tanto la ECA como angiotensina II representan e los principales blancos terapéuticos del tratamiento actual de la HTA (Varagic & Frohlich, J. Mol. Cell. Cardiol. 34: 1435-42, 2002).

La cascada del SRAA se inicia con la acción de renina sobre el angiotensinógeno circulante de origen hepático. Esta reacción produce angiotensina I, la cual es fisiológicamente inactiva. Angiotensina I se transforma al octapéptido biológicamente activo angiotensina II, por acción de la ECA (Okunishi y cois, Jpn J. Pharmacol. 62:207-10, 1993). La ECA es una metalopeptidasa dependiente de zinc que se encuentra predominantemente en el pulmón, pero además en corazón, vasos sanguíneos, riñon y además en el plasma (Campbell, J. Cardiovasc. Pharmacol. 10:S1-S8, 1987; Johnston y cois, J. Hypertens. Suppl. 10:S13-26, 1992). En humanos, la angiotensina II tisular es producida además por otras enzimas como quimasa y factor activador de plasminógeno tisular (Reilly y cois, J. Biol. Chem. 257:8619-22, 1982; Gibbons & Dzau, N. Engl. J. Med. 19: 1431-8, 1994). La ECA también es responsable del catabolismo e inactivación de vasodilatadores como las bradikininas (BKs) (Tschópe y cois. J Cardiovasc Pharmacol. 39:478- 87, 2002).

El SRAA está involucrado el desarrollo de la HTA (Dzau, J Hypertens Suppl. 6:7-12, 1988;

Bader y cois, Exp. Physiol. 85:713-731 , 2000; Bader y cois, J Mol Med. 79:76-102, 2001), en aspectos de resistencia a insulina (Henriksen & Jacob, Diabetes Obes. Metab. 5: 214-22, 2003;

Yavuz y cois, J. Renin. Angiotensin Aldosterone Syst. 4:197-203, 2003), metabolismo del óxido nítrico (Liu y Person, Hypertension 43:649-53, 2004), estrés oxidativo (Zhou y cois, Am. J.

Hypertension 17: 167-71, 2004) e hipertrofia cardiaca y del músculo liso vascular (Higashi y cois, Circ. Res. 93:767-75, 2003; Yamakawa y cois, Eur J Pharmacol. 478:39-46, 2003).

La angiotensina II ejerce su acción en células blanco a través de receptores acoplados a proteína

G, subtipos 1 y 2 (los RAT1 y RAT2, respectivamente) (Berry y cois. Am J Physiol. 281 :H2337- H2365, 2001 ; de Gasparo. Drugs 62:1-10, 2002). La activación del RAT1 produce la mayoría de las acciones cardiovasculares de angiotensina II como vasoconstricción, efectos mitogénicos e hipertróficos, respuesta inflamatoria y retención de agua y sal (de Gasparo y cois, J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 1 :151-8, 2000). Estos efectos son mediados vía una compleja interacción de vías de señalización intracelular que involucran diversas fosfolipasas (PLC, PLD, PLA2), estimulación de la NAD(P)H oxidasa y especies reactivas de oxígeno (0₂ ^", H₂0₂), activación de la transcripción de genes (protooncogenes: c-fos, c-jun, c-myc), y activación de tirosinas kinasas (Src, JAK/STAT, FAK, Pyk2, pl30Cas y PI3-kinasa). Algunas de estas acciones pueden ser mediadas, directamente o indirectamente, por transactivación de receptores de tirosina kinasa (Touyz & Berry, Braz. J. Med. Biol. Res. 35: 1001-15, 2002). A diferencia de las acciones mediadas por el RAT1, el RAT2 ejerce efectos como apoptosis, natriuresis y vasodilatación mediada por BKs y óxido nítrico (NO) (de Gasparo y cois, J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 1 : 151-8, 2000).

Recientemente, se ha descubierto una vía paralela del SRA iniciada por la enzima convertidora de angiotensina-I homologa (ECA-2) (Donoghue y cois, Circ. Res. 87:el-9, 2000; Tipnis y cois, J. Biol. Chem. 275: 33238-43, 2000). Originalmente, esta enzima se encontró en testículo, riñon y corazón, pero estudios posteriores por PCR en tiempo real mostraron que también se expresa en el tracto gastrointestinal, cerebro, pulmón, aorta e hígado (Harmer y cois, FEBS Lett. 532: 107-10, 2002; Ferrario, Hypertension 47:515-21, 2006). A nivel celular, la ECA2 se ha encontrado principalmente en epitelio del túbulo renal, macrófagos, cardiomiocitos, endotelio de pequeñas y grandes arterias y musculatura lisa de estos vasos (Burell y cois, Eur. Heart J. 26:369-75, 2005). La ECA2 presenta un 40% de homología en su dominio catalítico con la ECA y es una ectoenzima, cuyos sitios catalíticos se orientan hacia el espacio extracelular y es, por lo tanto, hidroliza péptidos extracelulares. Además, como la ECA, la ECA2 es susceptible de separarse y liberarse de la superficie celular y presenta una topología de una proteína integral de membrana tipo I. A pesar de esta similitud, ECA-2 difiere de la ECA en su especificidad a sustrato y en la ausencia de inhibición por inhibidores clásicos de la ECA.

En el SRAA, la ECA2 compite con la ECA por la hidrólisis del decapéptido inactivo angiotensina I para formar angiotensina-(l-9) (Donoghue y cois, J. Mol. Cell Cardiol. 35:1043- 53, 2003), por lo tanto disminuye la cantidad de angiotensina I disponible para la generación de angiotensina II por la acción de ECA. Aunque los efectos de angiotensina-(l-9) en corazón y riñon no han sido descritos (Danilczyk & Penninger, Circ. Res. 98:463-71, 2006), existen diversos estudios que muestran que la angiotensina-(l-9) potencia la vasoconstricción mediada por angiotensina II en anillos aórticos de ratas y que tiene efectos vasopresores en ratas concientes (Huang y cois, J. Biol. Chem. 278: 15532-40, 2003). Además, se ha encontrado en plasma humano y de ratas, que los niveles de angiotensina-(l-9) son mayores a los de angiotensina II (Johnson, Peptides 10:489-92, 1989) y que este péptido se acumula en animales tratados con inhibidores de ECA (Drummer, Biochem. Pharmacol. 39:513-8, 1990). Otros estudios indican que angiotensina-(l-9) favorece la unión de la bradikinina a su receptor B2 probablemente por cambios conformacionales en el complejo ECA- receptor B2 (Erdos y cois, J. Mol. Cell. Cardiol. 34: 1569-76, 2002).

La ECA2 presenta mayor eficiencia catalítica (400 veces) para hidrolizar angiotensina II que angiotensina I y formar el péptido vasodilatador angiotensina-(l-7) (Donoghue y cois, Circ. Res. 87: el-9, 2000; Vickers y cois, J. Biol. Chem. 277: 14838-43, 2003; Rice y cois, Biochem. J. 383:45-51, 2004). Este último también se genera por la hidrólisis de la angiotensina I por acción de la endopeptidasa neutra (NEP), prolil endopeptidasas o la ECA (Welches y cois, Life Sci. 52: 1461-80, 1993; Vickers y cois, J. Biol. Chem. 277: 14838-43, 2003). Por lo tanto, la ECA2 tiene un papel central en el balance de la actividad vasoconstrictora y proliferativa de la angiotensina II vía su RAT1, al aumentar los niveles de angiotensina-(l-7) (Der Sarkissian y cois, Prog. Biophys. Mol. Biol. 91 :163-98, 2005). Sin embargo, no existen antecedentes que indiquen si angiotensina-(l-9) y/o sus derivados tienen efectos que previenen, revierten, inhiben y/o disminuyen la hipertensión arterial y/o efectos que inducen vasodilatación.

Las angiotensinas corresponden a péptidos derivados del angiotensinógeno que se obtienen por proteólisis. Estos péptidos son:

Angiotensinógeno*: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-Ser

Angiotensina I: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu

Angiotensina II: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

Angiotensina III: Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

Angiotensina-IV: Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

Angiotensina-(l-9): Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His

Angiotensina-( 1 -7) : Asp- Arg- Val-Tyr-Ile-His-Pro

*E1 primer aminoácido de las secuencias corresponde al extremo amino terminal. R: resto de la secuencia el angiotensinógeno.

Se han descrito varias funciones fisiológicas y biológicas para las diversas angiotensinas.

• Des-aspartato-angiotensina I ha sido descrita para ser usada en el tratamiento y/o prevención de la hipertrofia cardiaca (US 5.773.415) y formación de la neoíntima o reestenosis (US 6.100.237).

• Angiotensina II está involucrada en el control de la volemia, la presión arterial, la hipertrofia cardiaca y formación de la neoíntima. La activación del RAT1 por angiotensina II potencia la hipertrofia cardiaca (Dostal & Baker, Am. J. Hypertens., 5:276-280, 1991), formación de neoíntima (Osterrieder y cois, Hypertension. 18:1160-4, 1991; Daemen y cois, Circ. Res. 68:450-6, 1991), estimula la vasocontricción, la retención de sodio y la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) (Berry y cois, Am J Physiol 281 :H2337-H2365, 2001). • Angiotensina III media la inducción de natriuresis dependiente del receptor AT2. Induce vasoconstricción y liberación de aldosterona (Fyhrquist & Saijonmaa, J. Intern. Med. 264:224- 36, 2008).

• Angiotensina IV, un metabolito segundario de angiotensina II, tiene acciones antihipertróficas y también inhibe la formación de neoíntima (EP 1846017).

• Angiotensina-(l-7) está involucrada en las acciones opuestas a angiotensina II. Se ha descrito que es un péptido que induce vasodilatación, es antihipertensivo y antifibrótico (Katovich y cois, Curr. Hypertens. Rep. 10:227-32, 2008). Resultados de nuestro laboratorio en un modelo experimental de remodelado tardío post infarto al miocardio (IAM), mostraron mayor actividad enzimática de la ECA y de los niveles de angiotensina II y disminución de la actividad enzimática de la ECA-2 y de los niveles de angiotensina-(l-9) (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006). Estos cambios favorecieron la fíbrosis miocárdica y hipertrofia ventricular patológica (Ocaranza y cois, Rev. Chil. Cardiol. 26:63-76, 2007). La inhibición de la ECA con enalapril o el bloqueo del receptor tipo 1 de angiotensina II (RATl) previnieron la disminución de la actividad de ECA-2 y aumentaron significativamente los niveles de angiotensina-(l -9) (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006; Ocaranza y cois, Rev. Chil. Cardiol. 26:63-76, 2007). Estos resultados sugirieron una interacción entre ECA y ECA-2 en el remodelado miocárdico post IAM como también que la angiotensina-(l-9) más que la angiotensina-(l-7) actuarían como un contrarregulador de la angiotensina II (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006).

Recientemente, presentamos solicitudes de patentes de invención presentada en Chile CL3736- 2008 e Internacional PCT/CL 2009000029 relacionada con una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) o sus derivados y al menos un transportador, excipiente, estabilizante, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Además, dicha invención describe el uso de la composición farmacéutica y del péptido angiotensina-(l-9) o péptidos derivados de él que son análogos biológicos o químicos para la elaboración de medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, cerebral o renal. Además, las solicitudes CL3736-2008 y PCT/CL 2009000029 comprenden también un método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, cerebral o renal que consiste en elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados mediante una composición farmacéutica que contiene un vector que expresa ECA2, enzima responsable de la producción en forma endógena de angiotensina-(l-9). Estos vectores corresponden a adeno virus, retrovirus, lentivirus o virus adenoasociados que contiene el gen que codifica para ECA2. La solicitudes CL3736-2008 y PCT/CL 2009000029 permiten la administración de angiotensina-(l-9) o sus derivados en forma oral, inyectable, infusión continua por bomba, o elevar sus niveles en el organismo mediante tratamiento con inhibidores de la ECA, con antagonistas del receptor de angiotensina II (ARA II), con inhibidores de Rho kinasa, con antagonistas de los canales L de calcio y/o con diuréticos.

Sin embargo, en el estado del arte no existen descritos efectos biológicos para el péptido angiotensina-(l-9) en el control de la presión arterial y/o control de la dilatación de la vasculatura, tampoco existen descritos usos médicos de angiotensina-(l-9) y/o sus derivados en medicina, particularmente en el tratamiento de la hipertensión arterial, ni tampoco como agente para inducir la vasodilatación. En la presente invención se relaciona y resuelve el problema de desconocimiento sobre las acciones de angiotensina-(l-9) sobre la presión arterial y/o vasodilatación y describe los efectos antihipertensivos y/o vasodilatadores de este péptido y provee procedimientos para elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Existen varios procedimientos para elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9). La elevación de los niveles plasmáticos y/o tisular de angiotensina-(l-9) está asociado con fenómenos de reducción de la hipertensión arterial y/o inducción de vasodilatación. En la presente invención describimos que la elevación de la concentración plasmática de angiotensina-(l-9) puede lograrse a través de:

a) Administración del péptido angiotensina-(l-9) (ver ejemplos 1, 4 y 5).

b) Administración de un gen que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina I homologa (ECA2), enzima responsable de la producción endógena de angiotensina-(l-9) (ver ejemplos 6, 7 y 8).

La presente invención corresponde a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) o sus derivados y al menos un transportador, excipiente, estabilizante, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La presente invención también describe el uso de dicha composición farmacéutica para la elaboración de medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación. Además, la presente invención describe el uso del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados para elaborar medicamentos y/o composiciones farmacéuticas que sirven para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación, especialmente en animales o individuos, más especialmente en pacientes que necesitan tal tratamiento, y aún más específicamente en pacientes hipertensos. La presente invención también provee, a través del uso de la angiotensina-(l -9) y/o sus derivados, de un método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación.

Además, esta invención comprende también un método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación que consiste en elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados mediante una composición farmacéutica que contiene un vector que expresa ECA2, enzima responsable de la producción en forma endógena de angiotensina-(l-9). Estos vectores corresponden a adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus adenoasociados que contiene el gen que codifica para ECA2. De acuerdo a la invención, el método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación en un individuo o un animal, comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) y/o al menos un derivado de angiotensina- (1-9). La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) y/o al menos un derivado de angiotensina-(l-9) y, al menos, un excipiente, transportador, diluyente, estabilizante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición es preferentemente para el uso de la prevención, reversión, inhibición y/o disminución de la hipertensión arterial y/o inducción de vasodilatación en un individuo o animal que necesita tal tratamiento, y comprende administrar tal composición farmacéutica al paciente. El paciente puede ser humano o animal. En particular, dicho paciente es un individuo o animal hipertenso. El uso de dicho medicamento o composición farmacéutica busca elevar los niveles plasmáticos y/o tisulares de angiotensina-(l-9) y/o, al menos, uno de sus derivados. Particularmente se busca elevar los niveles de dicho péptidos en el organismo, particularmente en el plasma y/o lecho vascular.

El medicamento o composición farmacéutica de la presente invención, que contiene una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) y/o al menos un derivado de angiotensina-(l-9) puede ser aplicado por todas las vías conocidas de administración de medicamentos descritas. En forma particular, dicho medicamento o composición farmacéutica se aplicará por vía inyectable y/o parenteral (por ejemplo, y sin ánimo de excluir ninguna otra vía, intravenoso, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea y por inhalación, por el uso de composiciones farmacéuticas de liberación continua, por el uso de bombas de liberación continua, por supositorios, y por vía oral). Dicha administración puede ser de una única dosis, múltiple dosis o administración continua.

La angiotensina-(l-9) y/o sus derivados, composiciones farmacéuticas que lo(s) contiene(n) y o medicamentos que lo(s) contiene(n) de acuerdo con la presente invención pueden ser sólidos o líquidos, incluyendo tabletas, obleas, grageas, comprimidos, cápsulas, suspensiones, o soluciones, que contiene al menos un excipiente, transportador, diluyente, estabilizante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Excipientes, transportadores, diluyentes, estabilizantes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones farmacéuticas o medicamentos de la invención son muy bien conocidos en el estado del arte, y pueden ser de naturaleza sólida, líquida o mezclas de ambos. De esta manera las composiciones farmacéuticas o medicamentos pueden tomar forma de tabletas, pildoras, pastillas, cápsulas, grageas, obleas, polvo, formulaciones recubiertas, formulaciones de liberación sostenida, formulaciones erodibles, aparatos implantados o componentes derivados de dichos aparatos, formulaciones de microesferas, soluciones, suspensiones, elíxires, aerosoles y similares, entre otros. Se prefiere como transportadores, diluyentes y/o excipientes líquidos a agua, solución salina, solución de dextrosa y solución de glicoles, especialmente cuando se utiliza la vía parenteral y/o de inyección como vía de administración. El transportador y/o diluyente, puede ser también un aceite, como por ejemplo aquellos derivados del petróleo, aceites de origen animal y/o vegetal o aceites sintéticos. Ejemplos particulares de aceites preferidos en la invención incluyen a aceite de maní, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo, aceite de maíz, aceite de maravilla, entre otros. Entre los excipientes preferidos por la invención se incluyen al almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, sílica gel, estearato de magnesio, estearato de sodio, glicerol monoestearato, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propilénglicol, agua, etanol, entre otros. Otros transportadores, diluyentes, estabilizantes, excipientes y/o adyuvantes, que no están nombrados aquí, son obvios para un experto en el estado del arte. La composición o el medicamento de la presente invención puede ser sujeto a procesos farmacéuticos convencionales, tales como esterilización, y puede contener otros aditivos farmacéuticos convencionales tales como preservantes, estabilizantes, agentes emulsificantes, agentes humectantes, sales para ajustar la presión osmótica, amortiguadores o tampones para regular el pH, entre otros. Transportadores, estabilizantes, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes y sus formulaciones pueden encontrarse en Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15" Ed.; Mack Publishing Co., Easton (1975); ver por ejemplo las páginas 1405-1412 y 1461-1487. Tales composiciones contienen, en general, una cantidad efectiva del compuesto activo junto a una cantidad adecuada de uno o varios transportadores, estabilizantes, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes, de tal manera que permita preparar la dosis y la forma adecuada para la administración apropiada de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados al paciente. En la práctica de los métodos de tratamiento de la invención, la dosificación particular de una composición farmacéutica o medicamento a ser administrado al sujeto dependerá de muchas variables incluyendo el estado de la enfermedad, la severidad de la enfermedad, el esquema de administración, la edad, las características físicas del sujeto, etc. Las dosis apropiadas pueden establecerse usando aproximaciones clínicas según los entendidos en el campo.

Además, la angiotensina-(l-9) y/o, al menos, uno de sus derivados, el medicamento o la composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrado en conjunto con, al menos, un compuesto farmacéutico. El "al menos un compuesto farmacéutico" es un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina-I, un antagonista del receptor de angiotensina II (RAT1), un antagonista de los canales L de calcio, un inhibidor de Rho kinasa, un inhibidor de la renina y/o un diurético. La administración de cualquiera de estos compuestos farmacéuticos son capaces per se de elevar la concentración plasmática de angiotensina-(l-9). En las solicitudes de patentes de invención presentada en Chile CL3736-2008 e Internacional PCT/CL 2009000029, y en los documentos Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006 y Ocaranza y cois, Rev. Chil. Cardiol. 26:63-76, 2007, describimos previamente que la administración de un inhibidor de enzima convertidora (enalapril) o la administración de un antagonista del receptor de angiotensina II (candesartan) aumentan los niveles plasmáticos y/o tisulares de angiotensina-(l- 9)·

Ejemplos de inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA) son el lisinopril, enalapril, captopril, zofenopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril y fosinopril. Ejemplos de antagonistas del receptor de angiotensina II (RAT1) son valsartán, telmisartán, losarían, irbesartán, olmesartán, candesartán, eprosartán y saralasina. Ejemplos de antagonistas de los canales L de calcio son las dihidropiridinas (nicardipino, nifedipino, amlodipino, felodipino, nitrendipino, nisoldipino, isradipino, nimodipino), las benzotiazepinas (diltiazem, clentiazem) y las fenilalquilaminas (verapamilo, galopamilo, anipamilo, R05967, falipamilo). Ejemplos de inhibidores de Rho kinasa son fasudil, hidroxifasudil, 3-(4-piridil)-lH-indol, (S)-(+)-2-metil-l-[(4-metil-5-isoquinolinil)sulfonil] homopiperazina, N-(4-piridil)-N'- (2,4,6- triclorofenil) urea. Ejemplos de inhibidores de la renina son Aliskiren y Remikiren. Ejemplos de diuréticos son los diuréticos tiazídicos (bendroflumetiazida, benzitiazida, clorotiazida, clortalidona, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, indapamida, meticlotiazida, metolazona, politiazida, quinetazona, triclormetiazida, xipamida), los diuréticos de asa (furosemida, torasemida, bumetanida, ácido etacrínico), los diuréticos inhibidores de la anhidrasa carbónica (acetazolamida, dorzolamida), los diuréticos ahorradores de potasio que son inhibidores de los canales de sodio (amilorida, triamtereno), los diuréticos ahorradores de potasio que son antagonistas de la aldosterona (espironolactona, canrenoato, eplerenona) y los diuréticos osmóticos (manitol).

La presente invención también considera como parte del invento aumentar los niveles plasmáticos y/o tisulares de angiotensina-(l-9) a través de un aumento de su producción y/o inhibición de su degradación. También la presente invención involucra la exacerbación, activación y/o inducción de las señales transduccionales intracelulares activadas por angiotensina-(l-9) y/o sus derivados.

El aumento de la producción de angiotensina-(l-9) y/o sus derivados se puede obtener a través del aumento o sobreexpresión de la ECA2. El aumento de la actividad de la ECA2 puede lograrse a través de la inhibición de la ECA, específicamente con el uso de inhibidores de esta enzima, particularmente fármacos ya conocidos en el estado del arte como son el lisinopril, enalapril, captopril, zofenopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril y fosinopril. La sobreexpresión de la ECA2 se puede lograr a través de la introducción dentro del organismo una o varias copias del gen que codifica para ECA2. La introducción del gen que codifica para ECA2 al organismo se logra a través de técnicas ya descrita en el estado del arte e incluyen el uso de DNA desnudo, liposomas (particularmente liposomas catiónicos) y por el uso de vectores virales. En la presente invención se describe muy particularmente, y sin ánimo de excluir cualquiera otro vector viral, el uso de vectores adenovirales, retrovirales, lentivirales y virus adenoasociados que contienen dentro de su material genético el gen que codifica para ECA2. Es también conocido en el estado del arte que dicho gen para ser activo requiere que su expresión esté comandado por un promotor y el gen termine en un terminador. Los vectores mencionados en esta patente incluyen flanqueando al gen que codifica a la ECA2 a un promotor y un terminador. También es parte de la presente invención que los vectores que contiene el gen que codifica para ECA2 contenga secuencias de DNA que son importante para aumentar la estabilidad del mRNA, así como de secuencias que permitan la normal traducción del mRNA en proteína. Asimismo, es muy bien conocido en el estado del arte diversas estructuras de promotores que permiten lograr la expresión constitutiva o regulada de los genes de interés. La presente invención también considera que el promotor que regula la expresión del gen que codifica para la ECA2 sea de naturaleza constitutiva o de naturaleza regulada por medio de inducción o represión génica.

En la presente invención se utiliza angiotensina-(l-9) como un ejemplo de angiotensina-(l-9) y/o sus derivados. Además se utiliza rata como un ejemplo de mamífero al cual se puede aplicar el método de tratamiento y ensayar el uso de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados en forma de medicamento y/o composición farmacéutica. Modelos animales para estudiar hipertensión arterial y vasodilatación, incluyendo a mamíferos pequeños tales como a la rata son muy bien aceptados en el estado del arte (Pinto y cois. Cardiovasc Res. 39:77-88, 1998). El uso del modelo de rata no excluye su uso en humanos u otro tipo de animal que requiera dicho tratamiento. En la presente invención se entiende por hipertensión arterial al aumento anormal de la presión arterial. El aumento anormal de la presión arterial en humanos corresponde a presiones iguales o superiores a 90 mmHg diastólica y/o 140 mmHg sistólica. El aumento de la presión arterial sistólica y diastólica puede deberse a un aumento del gasto cardíaco o a un aumento de la resistencia periférica. El aumento del gasto cardíaco puede deberse a un aumento de la frecuencia cardíaca y/o aumento del volumen de eyección cardíaco. El volumen de eyección es el volumen de sangre expulsado por el ventrículo (igual derecha o izquierda) en un ciclo cardíaco; entendiéndose que en un corazón sano este corresponde a un ciclo eléctrico y un ciclo mecánico, sincronizados. La frecuencia cardíaca es el número de ciclos cardíacos en un minuto. La fracción de eyección a su vez depende de dos factores: actividad mecánica y postcarga. La actividad mecánica del corazón depende de la fuerza de contracción (que según la ley de Frank- Starling es proporcional al volumen diastólico final) y de la contractilidad. La postcarga es la fuerza que se opone a la salida de sangre del ventrículo durante la sístole; o bien puede ser definida como el grado de estrés en la pared del ventrículo a lo largo de la sístole ventricular. El aumento de la resistencia periférica puede deberse a un aumento del volumen sanguíneo, aumento de la viscosidad sanguínea y/o a una disminución del calibre de los vasos sanguíneos. Resistencia al flujo de sangre determinada por el tono de la musculatura vascular y por el calibre de los vasos sanguíneos.

La vasodilatación es la capacidad de los vasos sanguíneos (arterias y venas) de dilatarse (aumentar el calibre) frente a estímulos químicos secretados por células inflamatorias, el endotelio (óxido nítrico), aferencias nerviosas o fármacos. Esto genera una disminución de la presión arterial cuando ocurre en el territorio arterial.

Una cantidad efectiva se refiere a la dosis de angiotensina-(l-9) y al período de tiempo necesario para alcanzar el resultado terapéutico necesario, es decir, prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial y/o inducir vasodilatación. La cantidad efectiva puede depender de muchos factores, tales como el estado de avance de la enfermedad, la edad, el sexo, el peso del individuo, la presencia de otras enfermedades, de la ingesta de otros medicamentos en forma simultánea, de raza, entre otras cosas. En esta patente, la invención busca elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9) a valores superiores a 10 fmol/g, más especialmente a valores superiores a 20 fmol/g, aún más específicamente a valores superiores a 40 fmol/g, y aún más específicamente a valores superiores a 80 fmol/g.

Un derivado de angiotensina-(l-9) se refiere a cualquier mutación, fragmento, parte o porción de la angiotensina-(l-9) que incluye moléculas con sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos a la angiotensina-(l-9) con el objeto de imitar su efecto biológico y/o fisiológico, potenciar su efecto biológico y/o fisiológico, elevar su efecto biológico y/o fisiológico, incrementar su biodisponibilidad, incrementar su estabilidad, incrementar su absorción, incrementar su vida media plasmática y/o tisular, alterar su unión a proteínas plasmáticas, aumentar su afinidad con su receptor, disminuir su degradación, o cualquier otra propiedad biológica, fisiológica, farmacológica y/o farmacéutica que sea de interés para mejorar su acción terapéutica. Los derivados de angiotensina-(l-9) obtenidos por sustitución de aminoácidos corresponden a la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido o bien por otra molécula que puede corresponder a un derivado de aminoácido. En este caso se busca obtener un derivado que sea funcionalmente, estructuralmente o estereoquímicamente similar u homólogo a angiotensina-(l-9). Un derivado de angiotensina-(l-9) también incluye a mimótopos, o péptidos, o análogos miméticos e incluyen moléculas que contienen aminoácidos no naturales así como moléculas que no corresponden a aminoácidos pero se comportan o tienen funciones y/o actividades similares a los aminoácidos. Los derivados de angiotensina-(l-9) también incluyen modificaciones como glicosilaciones, amidaciones, acetilaciones, hidroxilaciones, metilaciones, etilaciones, esterificaciones, entre otros, que en general son modificaciones de las cadenas laterales de los aminoácidos o moléculas que forman parte de la angiotensina-(l-9) o sus derivados. También están considerados como parte de un derivado de angiotensina-(l-9) a la introducción de moléculas entrecruzadoras que permitan unir este péptido a una estructura más grande que ayude con sus propiedades fisicoquímicas y/o farmacéuticas. La molécula entrecruzadora puede tener distintos largos de cadena de manera tal de acercar o alejar a la angiotensina-(l-9) o sus derivados de la molécula mayor. Los entrecruzadores pueden ser homo o bifuncionales, tales como los imido ésteres bifuncionales que tienen grupo metilo como espaciadores entre n=l a 6 de largo de cadena, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida y reactivos hétero-bifuncionales que habitualmente contienen una parte amino-reactiva tal como la N-hidroxisuccinimida y otra parte que es reactiva específicamente a otro o al mismo grupo funcional. Los derivados de angiotensina-(l-9) también pueden corresponder a derivados modificados químicamente que ayuden a estabilizar una estructura tridimensional que sea más favorable para imitar su efecto biológico y/o fisiológico, potenciar su efecto biológico y/o fisiológico, elevar su efecto biológico y/o fisiológico, incrementar su biodisponibilidad, incrementar su estabilidad, incrementar su absorción, incrementar su vida media plasmática y/o tisular, alterar su unión a proteínas plasmáticas, aumentar su afinidad con su receptor, disminuir su degradación, o cualquier otra propiedad biológica, fisiológica, farmacológica y/o farmacéutica que sea de interés para mejorar su acción terapéutica.

Ejemplos de aminoácidos no convencionales o no naturales y/o sus derivados los cuales pueden ser incorporados durante la síntesis de los péptidos incluyen el uso de, pero no están limitados a, norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6- aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3- hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienil alanina y/o D-isómeros de los aminoácidos. Otros ejemplos de aminoácidos no convencionales o no naturales y/o sus derivados son: ácido D-amino-D- metilbutirato, ciclopentilalanina, ácido aminociclopropano-carboxílico, ciclohexilalanina, ácido aminoisobutírico, ácido aminonorbornil-carboxílico, D-alanina, D-arginina, ácido D-aspártico, D-cisteina, D-glutamina, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-leucina, D-lisina, D- metionina, D-ornitina, D-fenilalanina, D-prolina, L-N-metilalanina, L-N-metilarginina, L-N- metilasparagina, ácido L-N-metilaspártico, L-N-metilcisteina, L-N-metilglutamina, ácido L-N- metilglutámico, ciclohexil L-N-metilhistidina, L-N-metilisoleucina, L-N-metilleucina, L-N- metillisina, L-N-metilmetionina, L-N-metilnorleucina, L-N-metilnorvalina, L-N-metilornitina, L-N-metilfenilalanina, L-N-metilprolina, L-N-metilserina, L-N-metiltreonina, L-N- metiltriptofano, L-N-metiltirosina, L-N-metilvalina, L-N-metiletilglicina, D-serina, D-treonina, D-triptofano, D-tirosina, D-valina, D-a-metilalanina, D-N-metilarginina, D-N-metilasparagina, D-a-metilaspartato, D-a-metllcIsteina, D-a-metilglutamina, D-a-metilhistidina, D-a- metilisoleucina, D-a-metilleucina, D-a-metillisina, D-a-metilmetionina, D-a-metilornitina, D-a- metilfenilalanina, D-a-metilprolina, D-a-metilserina, D-a-metiltreonina, D-a-metiltriptofano, D- α-metiltirosina, D-a-metilvalina, D-N-metilalanina, D-N-metilarginina, D-N-metilasparagina, D-N-metilaspartato, D-N-metilcisteina, D-N-metilglutamina, D-N-metilglutamato, D-N-metilhistidina, D-N-metilisoleucina, D-N-metilleucina, L-N-metil-t-butilglicina, L-norleucina, L-norvalina, a-metil-aminoisobutirato, α-metil-a-aminobutirato, a- metilciclohexilalanina, a-metilciclopentilalanina, α-metil-a-naftilalanina, a-metilpenicillamina, N-(4-aminobutil)glicina, N-(2-aminoetil)glicina, N-(3-aminopropil)glicina, N-amino-a- metilbutirato, α-naftilalanina, N-bencilglicina, N-(2-carbamiletil)glicina, N- (carbamilmetil)glicina, N-(2-carboxietil)glicina, N-(carboximetil)glicina, N-ciclobutilglicina, N- cicloheptilglicina, N-ciclohexilglicina, N-ciclodecilglicina, N-ciclododecilglicina, N- ciclooctilglicina, N-ciclopropilglicina, N-cicloundecilglicina, N-(2,2-difeniletil)glicina, N-(3,3- difenilpropil)glicina, N-(3-guanidinopropil)glicina, N-(l-hidroxietil)glicina, N- (hidroxietil)glicina, N-(imidazoliletil))glicina, N-(3-indolilietil)glicina, D-N-metillisina, N-metilciclohexilalanina, D-N-metilornitina, N-metilglicina, N-metilaminoisobutirato, N-(l- metilpropil)glicina, N-(2-metilpropil)glicina, D-N-metiltriptofano, D-N-metiltirosina, D-N- metilvalina, ácido -aminobutírico, L-t-butilglicina, L-etilglicina, L-homofenilalanina, L- - metilarginina, L-metilaspartato, L-metilcisteina, L-metilglutamina, L-metilhistidina, L- metilisoleucina, L-metilleucina, L-metilmetionina, L-metilnorvalina, L-metilfenilalanina, L- metilserina, L-metiltriptofano, L-metilvalina, N-(N-(2,2-difeniletil) carbamilmetil)glicina, 1- carboxi- 1 -(2,2-difenil-etilamino)ciclopropano, N-metil-a-aminobutirato, D-N-metilmetionina, N-metilciclopentilalanina, D-N-metilfenilalanina, D-N-metilprolina, D-N-metilserina, D-N- metiltreonina, N-(l-metiletil)glicina, N-metil-a-naftilalanina, N-metilpenicillamina, N-(p- hidroxifenil)glicina, N-(tiometil)glicina, penicillamina, L-N-metilalanina, L-a-metilasparagina, L-a-metil-t-butilglicina, L-metiletilglicina, L-a-metilglutamato, L-a-metilhomofenilalanina, N- (2-metiltioetil)glicina, L-a-metillisina, L-a-metilnorleucina, L-a-metilornitina, L-a-metilprolina, L-D-metiltreonina, L-a-metiltirosina, L-N-metilhomofenilalanina, y N-(N-(3,3-difenilpropil) carbamilmetil)glicina.

Un equivalente, análogo y/o homólogo químico de angiotensina-(l-9) como se describió más arriba, comparte similitudes conformacionales y/o funcionales con angiotensina-(l-9), pero no necesariamente deriva de angiotensina-(l-9). De esta manera se puede diseñar un equivalente químico que imite ciertas propiedades biológicas y/o fisiológicas de la angiotensina-(l-9).

Aunque en la presente invención está ejemplificado en forma particular el uso de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados y medicamentos o composiciones farmacéuticas que lo(s) contiene(n) en rata, se entiende que la presente invención se extiende al uso de la angiotensina- (1-9) y/o sus derivados y medicamentos o composiciones farmacéuticas que lo(s) contiene(n) de acuerdo a la invención a cualquier mamífero, por ejemplo, y sin ánimo de limitarlos a, humanos, ratón, conejos, primates, perros, gatos, mascotas en general, animales de granja, etc. DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Efecto preventivo de la angiotensina-(l-9) en la hipertrofia de la pared aórtica de ratas hipertensas por administración de angiotensina II. Cortes transversales, paneles A, B, C y D (4X) y E, F, G y H (40x) de aortas torácicas de animales Sham (Ay E), angiotensina II (B y F), angiotensina II/1-9 (C y G) y angiotensina II/1 -9/A779 (D y H). Barra superior 0,5 mm y barra inferior 50 μιη. Figura 2. Efecto de. la administración continúa de angiotensina-(l-9) en el área luminal de aortas torácicas de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9- 12.

Figura 3. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en el grosor de la túnica media de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los valores representan el promedio ± SEM. p<0,05 v/s angiotensina II, *p<0,05 vs Sham (después de ANO VA). N=9-12.

Figura 4. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en el ATM/ AL de pared aórtica de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los valores representan el promedio ±SEM. pO,05 v/s Ang II, *p<0,05 vs. Sham (después de ANO VA). N=9- 12.

Figura 5. Efecto de angiotensina-(l-9) en la hipertrofia del cardiomiocito inducida por Ang II in vivo. Ratas macho normotensas se randomizaron a recibir angiotensina II en presencia o ausencia de angiotensina-(l-9) y A779 por dos semanas. A. Microfotografía de un corte transversal de ventrículo izquierdo teñido con hematoxilina y eosina (400X). Barra de escala, 50 μιη. B. Cuantificación del área del cardiomiocito y C. Cuantificación del perímetro del cardiomiocito. Los resultados se presentan como promedio ± SEM (n=9-12). *** p<0,001 vs

Sham; p<0,001 vs angiotensina II, p<0,001 vs angiotensina II + angiotensina-(l-9) (post ANO VA significativo).

Figura 6. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles de mRNA para TGF-β en la pared aórtica de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los niveles de mRNA TGF-β se normalizaron con respecto a la banda 18S del RNA ribosomal. Los valores representan el promedio ± SEM, N = 8. p<0,05 vs angiotensina II, *p<0,05 vs Sham (post ANOVA significativo).

Figura7. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles de mRNA para MCP-1 en la pared aórtica de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los niveles de mRNA MCP-1 se normalizaron con respecto a la banda 18S del RNA ribosomal. Los valores representan el promedio ±SEM. N=8 Figura 8. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles proteicos de colágeno I en la pared aórtica de ratas hipertensas por infusión de angiotensina II. Los valores obtenidos por Western blot representan el promedio ± SEM. N=8-12. Como control de carga se usó β-actina. p < 0,05 vs angiotensina II, *p < 0,05 vs Sham (post ANOVA significativo).

Figura 9. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en la presión arterial sistólica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión, modelo GB (2k, 1 clip). Los resultados corresponden al promedio ±SEM, con un N= 7-12. *p<0.05 vs Sham, p<0.05 vs GB (después de ANOVA).♦: ratas normotensas,■: ratas hipertensas GB, A : ratas hipertensas con tratamiento de angiotensina-(l-9), ·: ratas hipertensas con tratamiento de angiotensina-(l-9) y A779 (inhibidor del receptor de angiotensina-( 1 -7)).

Figura 10. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en la hipertrofia cardíomiocitaria de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. En cortes transversales de ventrículos y teñidos con hematoxilina-eosina, se analizó el área (A) y el perímetro (B) de los cardiomiocitos. N= 7-12. S= ratas Sham, GB = ratas Goldblatt hipertensas, GB- angiotensina-(l- 9) = ratas Goldblatt hipertensas con angiotensina-(l-9), *p<0.05 vs S, ^#p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).

Figura 1 1. Efecto de la angiotensina-(l-9) en reducir la hipertrofia de la pared aórtica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Cortes transversales, paneles A, B, C y D (4X) y E, F, G y H (40x) de aortas torácicas de animales Sham (Ay E), angiotensina II (B y F), angiotensina II/ 1 - 9 (C y G) y angiotensina II/1-9/A779 (D y H). Barra superior 0,5 mm y barra inferior 50 μπι.

Figura 12. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en reducir el área de la túnica media (ATM) de aortas torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-12. *p<0.05 vs S, p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).

Figura 13. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en reducir el grosor de la túnica media de aortas (GTM) torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-1_.2. *p<0.05 vs S, p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).

Figura 14. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en reducir la razón área túnica media/área luminal (ATM/AL) de aortas torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-12.*p<0.05 vs S, p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).

Figura 15. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en el área luminal (AL) de aortas torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-12.

Figura 16. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en el área total de aortas torácicas de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores representan el promedio ± SEM. N=9-12.

Figura 17. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles proteicos de colágeno I en la pared aórtica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores obtenidos por Western blot representan el promedio ±SEM. N=3-12. Símbolos: # p<0.05 vs GB, *p<0.05 vs Sham (post ANOVA significativo).

Figura 18. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en la fibrosis miocárdica hipertensiva por sobrecarga de presión. En cortes transversales de ventrículo teñidos con rojo picrosirius (3 A), se determinó la fracción volumétrica de colágeno total (FVCT). N= 7-12. Barra= 100 um. Abreviaturass: S= ratas Sham, GB=ratas Goldblatt, GB- angiotensina-(l-9) = ratas Goldblatt hipertensas con angiotensina-(l-9), *p<0.05 vs S, #p < 0.05 vs GB (post ANOVA significativo).

Figura 19. Efecto de la administración continua de angiotensina-(l-9) en los niveles proteicos de TGFP-l en la pared aórtica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Los valores obtenidos por Western blot representan el promedio ± SEM. N=8-12. Como control de carga se usó β- actina. ^#p<0,05 vs angiotensina II, *p<0,05 vs Sham (post ANOVA significativo). Figura 20. Efecto de angiotensina-(l-9) en los niveles de ED-1 de la pared aórtica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión. Cortes transversales de aorta torácica fueron inmunoteñidos con anti-ED-1. *p<0.05 vs S, ^#p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).

Figura 21. Efecto de angiotensina-(l-9) sobre la vasodilatación de arterias mesentéricas de rata. Se determinó el diámetro de arterias controles con endotelio (o), tratadas con fenilefrina (·, control de vasoconstricción), sin endotelio (A) y tratados com L-NNA (Δ, inhibidor de la óxido nítrico sintetasa), en presencia de distintas dosis de angiotensina-(l-9).

Figura 22. Sobrexpresión de ECA2 por transducción adenoviral en cardiomiocitos en cultivo. Cardiomiocitos en cultivo se transdujeron con un adenovirus que sobreexpresa ECA-2, usando distintas multiplicidades de infección (MOI). Los MOIs utilizados fueron, carril 1 : MOI=0, carril 2: MOI=1000, carril 3: MOI=2000, carril 4: MOI=3000; carril 5: MOI=4000. Después de 48 h de incubación a 37°C en un incubador con 5% C02/95% aire, las células se Usaron y se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS y posterior western blot, usando un anticuerpo policlonal anti-ECA2.

Figura 23. Efecto de la sobre expresión de la ECA2 en la hipertrofia cardiaca hipertensiva por sobrecarga de presión. Luego de una semana de la infección con el vector adenoviral, el ventrículo fue extraído, tratado, cortado y medido tal como se describe en materiales y método. A) Imagen representativa de los cardiomiocitos de ratas Sham, Goldblatt (GB), Goldblatt tratadas con AdECA2 (GB-AdECA2) y Goldblatt tratadas con AdGFP (GB-AdGFP). La barra equivale a 50 μπι. Fotos tomadas en 40X. B) Cuantificación del área de cardiomiocitos. C) Evaluación del perímetro de cardiomiocitos. Los valores se presentan como promedio ± SEM, N= 5-8. *p<0.05 vs S, # p<0.05 vs GB,† p<0.05 vs GB-AdECA2.

Figura 24. Efecto de la sobrexpresión de ECA2 en la fracción volumétrica de colágeno total del ventrículo. A) Imagen representativa de cortes transversales de ventrículo teñidos con rojo picrosirius. Barra- 100 μηι. Abreviaciones: S= ratas Sham, GB=ratas Goldblatt, GB-AdECA2)= ratas Goldblatt hipertensas infectadas con AdECA2 angiotensina-(l-9), GB-AdGFP= ratas Goldblatt hipertensas infectadas con AdGFP. Fotos tomadas en 40X. B) Cuantifícación de la fracción volumétrica de colágeno. Los valores se presentan como promedio ± SEM, N= 7-12. *p<0.05 vs S, #p<0.05 vs GB (post ANOVA significativo).

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Diseño experimental y animales.

Se usaron ratas macho Sprague-Dawley normotensas de 200 ± 10 g, provenientes del Bioterio Central de la Pontificia Universidad Católica de Chile (PUC). Los experimentos se realizaron acorde a la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (NIH N° 85-23,1985) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Bienestar Animal de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

1. Diseño experimental de modelo de hipertensión arterial inducida por infusión de angiotensina II.

Las ratas se sometieron al modelo de infusión de angiotensina II (Grobe y cois. Am J Physiol. 292: H736-42, 2007). Los animales se separaron al azar en los siguientes grupos experimentales: controles (Sham o pseudoperados), infundidas con angiotensina II (300 ng/kg min), infundidas con angiontensina II y angiotensina-(l-9) [300 ng/kg min y 602 ng/Kg min, respectivamente] y finalmente infundidas con angiotensina II, angiotensina-(l-9) y el antagonista del receptor de angiotensina-(l-7), A779 (300 ng/kg min, 602 ng/Kg min y 100 ng/kg min, respectivamente). En todos los casos las bombas operaron a un flujo de 0.5 μί/η. y se implantaron en la vena yugular derecha a través de un catéter a alojadas en un bolsillo subcutáneo intraescapular, bajo anestesia ketamina HCl/xilazina (35 and 7 mg/kg i.p., respectivamente), por un periodo de 14 días.

2. Diseño experimental de modelo de hipertensión arterial mediante pinzamiento arterial renal (procedimiento Goldblatt, GB, 2 ríñones, 1 pinzado). Se utilizaron ratas normotensas Lewis (peso 150□ 10 g) las cuales se separaron al azar al grupo modelo de hipertensión experimental o GB (Ocaranza y cois. J Hypertens. 20:413-20, 2002) o grupo control (S). Este último correspondió a animales pseudo operados. Todos los animales se mantuvieron bajo condiciones controladas de luz y oscuridad y tuvieron libre acceso a agua y comida. Las ratas GB a la 4 semanas post cirugía y con hipertensión arterial superior a 140mmHg, se randomizaron para la administración crónica de angiotensina-(l-9) por bomba osmótica (602 ng kg 'min^"1) vía yugular durante dos semanas. Los animales se n sacrificaron después de las 6 semanas post-cirugías.

3. Análisis estadístico

Los grupos experimentales estuvieron conformados por 6-12 ratas. Los datos se expresaron como promedio + S.E.M. Para las comparaciones se usó análisis estadístico con ANOVA seguido de prueba de t de Student- Newman-Keuls. El análisis estadístico se realizó usando el programa estadístico SPSS 10.0. Un valor de p<0,05 es considerado como estadísticamente significativo.

Ejemplo 2. Estudios hemodinámicos y funcionales

La presión arterial sistólica (PAS) se determinó por el método pletismográfico en la cola de los animales. Para ello, las ratas se anestesiaron suavemente con éter etílico. La medición se realizó una vez por semana por investigadores ciegos al tratamiento (Ocaranza y cois. J Hypertens. 20:413-20, 2002).

Ejemplo 3. Evaluación del remodelado cardiaco y vascular

1. Evaluación de la hipertrofia cardiaca

El grado de hipertrofia cardíaca (HC) se cuantificó por la relación entre la masa cardiaca (MC), el peso corporal (PC) y masa cardiaca relativa (MCR; [MC/PC]* 100) (Ocaranza y cois, J Hypertens 28: 1054-64, 2010). ^' 2. Evaluación de la hipertrofia de la aorta

La hipertrofia aórtica se determinó por morfometría. Se usaron cortes de la aorta descendente de 5 μιη de grosor que fueron previamente fijados en Bouin (ácido pícrico 1,3%, formaldehido 9,5% y ácido acético 4,8%) por 24 h, incluidos en parafina y teñidos con hematoxilina-eosina, para después ser examinados en un microscopio de luz acuerdo a lo descrito por Igase y cois (Am J Physiol. 289: H1013-9, 2005). Brevemente, las imágenes de las aortas se capturaron mediante una cámara de video (Nikon) fijada a un microscopio (Nikon), y proyectadas en un monitor; mediante el uso del software Nis-Element.. Se calculó y registró las áreas del lumen (AL) y total (AT). El área de la túnica media (ATM) se obtuvo de la diferencia del AT y el AL de la aorta. El grosor de la túnica media (GTM) se definió como la región delimitada por la lámina elástica externa (LEE) y la lámina elástica interna (LEI).

3. Análisis morfológicos y morfométricos del tejido cardiaco

La porción media del ventrículo izquierdo (VI) se deshidrató a temperatura ambiente en Bouin por 24 h y posteriormente se incluyó en parafina. Se tomaron cortes de 10-15 Dm de grosor y se tiñeron con Hematoxilina-Eosina, para después ser examinados en un microscopio de luz, con el fin de observar sus características morfológicas generales. El tamaño de los cardiomiocitos se determinó de acuerdo a lo descrito por Nakamura y cois (Circulation; 98:794-9, 1998). Brevemente, las imágenes de las células se capturaron mediante una cámara Nikon DS Fil y proyectadas a un monitor mediante un software. Se midió y registró el área y perímetro de los cardiomiocitos, utilizando el programa Nis-Element (Ocaranza y cois. J Hypertens, 28:1054-64, 2010). Todas las mediciones se realizaron por un observador ciego y se analizaron, al menos, 80 imágenes celulares por animal, las que se seleccionaron aleatoriamente. 4. Evaluación morfométrica del desarrollo de fibrosis cardiaca

Se utilizaron cortes de 5 μηι de ventrículo, previamente incluido en Bouin, los cuales se trataron con rojo picrosirio. El tejido se examinó bajo microscopio de luz, las imágenes se capturaron con cámara Nikon DS Fil y proyectadas a un monitor. Se utilizó el programa Matlab, con el cual se midió el contenido de colágeno intersticial según el procedimiento descrito por Ocaranza y cois (J Cardiovasc Pharmacol. 40,246-54, 2002).

5. Evaluación de la inflamación de la aorta a través de los niveles de mRNA de TGF-β y MCP-1 Se siguió el procedimiento descrito por Ocaranza y cois (Hypertension 48:572-8, 2006). Brevemente, el RNA total de la aorta se aisló por el método del trizol y se cuantificó por espectroscopia a 260 nm/280 nm. El cDNA se obtuvo por transcripción reversa a partir de 1,5 μg de RNA total tratado con DNAsa. Los ensayos de PCR se realizaron usando los siguientes protocolos de amplificación y secuencias de partidores (Ocaranza y cois. J Cardiovasc Pharmacol. 40:246-54, 2004), TGF i 33 ciclos de denaturación a 94°C por 1 min, hibridización a 52°C por 1 min y elongación a 72°C por 1 min. Como partidor sentido se usó 5'- AAGCCCTGTATTCCGTCTCC-3 ^' y antisentido 5^'-CAACGCCATCTATGAGAAAACC-3\ MCP-1 38 ciclos de 1 min. a 92°C, 1 min a 53°C, 1 min a 72°C y posteriormente 10 min a 72 °C. Las secuencias nucleotídicas de los partidores sentido y antisentido fueron 5 '-CAGGTCTCTGTCACGCTTCT-3 ' y 5 -GTGCTTCAGGTGGTTGTGG-3 ' , respectivamente. La intensidad de las bandas se cuantificó por densitometría y se normalizó con respecto a la banda 18S del RNA ribosomal.

6. Niveles proteicos de colágeno I y TGFp-l

Para la determinación de colágeno I, se utilizaron 30 μg de proteína total y para TGF -l 50 μg diluidas en tampón reductor SDS (50 mM tris-HCl, pH 7,4, NP-40 10%, NaCl 1M, deoxicolato de Na 5%, EDTA 10 mg/mL, SDS 10%, aprotinina 1 mg/mL, leupeptina 0.1 mg/mL, PMSF 10 n M), se separaron por electroforesis en geles SDS-PAGE al 7% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de 0,2 μηι a 300 mA durante 1 h. La transferencia de proteínas se verificó por tinción con rojo Ponceau. Posteriormente, las membranas se bloquearon en solución de leche descremada/PBS-Tween 20 0,05% al 7% durante 1 :30 h a temperatura ambiente y después de 3 lavados de 10 min con solución de lavado (leche 0.5% en PBS-Tween 20 0,05%) se incubó durante toda la noche con el anticuerpo anti-colágeno I (dilución 1 :3000) o anti TGFp-l (dilución 1/2500) en solución de lavado con agitación constante a 4°C. Después de 3 lavados de 10 min con solución de lavado se agregó el anticuerpo secundario anti-conejo en dilución 1 : 10000 incubándose por 2 h a temperatura ambiente. Finalmente, después de 3 lavados se reveló con sustrato quimioluminiscente para posterior cuantificación de la intensidad de bandas por densitometría (Ocaranza y cois. J Cardiovasc Pharmacol. 40:246-54, 2004).

7.- Inmunohistoquímica para la determinación de células inflamatorias (ED-1)

La inmuno tinción se realizó usando el método estreptavidina-biotina-peroxidasa con el marcador de inflamación ED-1. Este es una glicoproteína expresada principalmente en la membrana lisosomal de macrófagos activos (Leskovar y col. JExp Biol. 203: 1783-1795,2000).

Para bloquear la peroxidasa endógena, las muestras se desparafinaron, rehidrataron y trataron con 10% H₂0₂ en metanol por 1 h. Luego, los tejidos se incubaron con anticuerpo monoclonal anti ED-1 (clon MCA341R, Serotec) diluido 1/1000 en 1% BSA preparado en PBS-0,05% Tween 20 toda la noche a 4°C en cámara húmeda. Las secciones se lavaron tres veces con lx PBS-0.05% Tween 20, pH 7,4 por 5 min y se incubaron con el segundo anticuerpo biotinilado por 30 min a temperatura ambiente. A continuación los tejidos se lavaron nuevamente y se incubaron con el complejo estreptavidina-peroxidasa por 30 min a temperatura ambiente. Los sitios immunoreactivos se visualizaron con 3,3 ^'-diaminobenzidina. Las preparaciones se contra- tifleron con hematoxilina, deshidrataron, aclararon con xilol y montaron con Permaunt (Fisher). Ejemplo 4. Angiotensina-(l-9) previene el aumento de la presión arterial y el remodelado vascular inducido por la infusión de angiotensina II.

1. Grupos experimentales

Se establecieron 4 grupos experimentales de ratas descritas en el ejemplo 1. Grupo 1, correspondiente a ratas a las que se les infundió salino (sham). Grupo 2, correspondiente a ratas a las que se les infundió sólo angiotensina II. Grupo 3, correspondiente a ratas a las que se les coinfundió angiotensina II y angiotensina-(l-9) y Grupo 4, correspondiente a ratas a las que se les co-infundió angiotensina II, angiotensina-(l-9) y A779. 2. Presión arterial sistólica

No hubo diferencia significativa en la masa corporal (MC) de los 4 grupos experimentales. Sin embargo, la MV y la MCR fueron menores para las ratas con infusión de angiotensina II v/s las ratas con angiotensina II/ 1-9, angiotensina II/ 1-9/A779 y sham. La PAS fue significativamente mayor (13 %) en las ratas infundidas con angiotensina II respecto a las angiotensina-(l-9)+A779. Mientras que, la coadministración de angiotensina-(l-9) o de angiotensina-(l-9)+A779 disminuyeron de igual forma la PAS respecto de las angiotensina II (-10% y -13 %, respectivamente, Tabla 1).

TABLA 1 : Efecto de angiotensina (1-9) en el peso corporal, masa cardiaca y presión arterial sistólica de ratas hipertensas por administración de angiotensina II

Parámetro Sham Ang II Ang II/1-9 AngII/l-9/A779

(n=12) (n=12) (n=12) (n=9)

MC (g) 280±19 260 ±25 255±24 279±28

MV (mg) 938±16 899±28 984±26*^# 1042±34*

MCR (MV/MC) 332±17 348±18* 386±36" 377±33^# PAS Inicial 119±9 121±9 123±11 121±5

PAS l^asem 116±10 130±4* 141±9*^# 139±5*^#

PAS 2^asem 118±8 154±10* 139±1 1 * 135±9*^ff

La hipertensión arterial se definió como el promedio de las presión arterial sistólica de las ratas Sham + 3DS = 141mmHg. Los resultados representan el promedio ± SEM. *p<0.05 v/s Sham, ^# p<0.05 v/s angiotensina II (post ANO VA significativo). Abreviaturas: Ang = angiotensina, MC= masa corporal, MV= masa cardíaca, VI= ventrículo izquierdo, MCR= masa relativa cardíaca, PAS= presión arterial sistólica

3. Hipertrofia vascular

La hipertensión arterial inducida por infusión de angiotensina II aumentó significativamente el grosor de la túnica media (GTM) (Figuras 1 y 3), sin cambios en el área del lumen (AL) vascular (Figura 2). Se observó un aumento de la razón área de la túnica media (ATM)/AL (Figura 4) en las ratas con angiotensina II respecto a las ratas controles (Figuras IB y 1F vs FiglA y 1E). La confusión con angiotensina-(l-9) previno significativamente el aumento del GTM (Figura 3) y del ATM/ AL inducida por infusión con angiotensina II (Figura 4). Este efecto no fue afectado por la administración de A779 (Figuras ID, 1H, 3 y 4). No se observaron diferencias en el AL entre los diferentes grupos experimentales (Figura 2).

4. - Determinación de la hipertrofia cardiomiocitaria inducida por la administración de angiotensina II

La administración de angiotensina II aumentó el área celular en un 37% (204 ± 1 vs 282 ± 2 μηι², p < 0,001, Figura 5A) y el perímetro en un 18% (56,1 ± 0,2 vs 66,2 ± 0,3 μηι, p < 0,001,

Figura 5B), respecto al grupo control Sham. La co-administración de angiotensina-(l -9) previno el aumento del tamaño del cardiomiocito inducido por angiotensina II (Figura 5A), mostrando una disminución significativa en un 20% en el área celular (282 ± 2 vs 227 ± 2 μηι², p < 0,001, Figura 5 A) y del 1 1% en el perímetro celular (66,2 ± 0,3 vs 59,1 ± 0,3 μηι, p < 0,001, Figura 5B), respecto al grupo infundido solo con angiotensina II.

Dado que angiotensina-(l-9) es precursor de angiotensina-(l-7), se utilizó el antagonista del receptor Mas, A779 para descartar la participación de angiotensina-(l-7) en los efectos de angiotensina-(l-9). La Figura 5 A muestra que A779 no inhibió el efecto antihipertrófico de angiotensina-(l-9), ya que igualmente este péptido disminuyó el área celular en un 31% (282 ± 1 vs 195 ± 2 μηι², p < 0,001, Figura 5B) y el perímetro en un 15,5% (66,2 ± 0,3 vs 55,9 ± 0,2 μηι, p < 0,001, Figura 5B) respecto al grupo infundido solo con angiotensina II. La coadministración de angiotensina-(l-9), A779 junto con angiotensina II fue más efectivo en reducir el área (14%, 227 ± 2 vs 195 ± 2 μηι², p < 0,001, Figura 5 A) y perímetro (5%, 59,1 ± 0,3 vs 55,9 ± 0,2 μιη, p < 0,001, Figura 5B) respecto al grupo experimental que recibió solo angiotensina-(l -9) en presencia de angiotensina II. 5. Niveles de mR A de TGF-β y MCP- 1

La administración de angiotensina II aumentó significativamente los niveles de inflamación vascular determinado a través del aumento del mRNA para TGF- β respecto a su control sham (12,8 veces más) (Figura 6), sin diferencias en los niveles de mRNA de MCP-l (Figura 6). La administración de angiotensina-(l-9) disminuyó significativamente los niveles de mRNA de TGF-βϋ en un 62,5% (Figura 6), mientras que el mRNA de MCP-l no mostró diferencias (Figura 7).

4. Niveles proteicos de colágeno I por Western blot

El colágeno I aumentó significativamente en las ratas con hipertensión por angiotensina II respecto a su grupo control sham (4,5 veces, Figura 8). La administración de angiotensina-(l-9) previno en un 60% el aumento de colágeno de la pared de la aorta y la coadminstración de A779 no modificó el efecto de la angiotensina-(l-9) (Figura 8).

En resumen, los resultados mostrados en este ejemplo muestran que: A) La presión arterial sistólica aumentó significativamente en las ratas con administración crónica de angiotensina II. B) La administración de angiotensina-(l-9) previno la hipertensión y su efecto fue independiente de angiotensina-(l -7). C) angiotensina-(l-9) previno la hipertrofia de la pared aórtica por angiotensina II. El efecto antihipertrófico de angiotensina-(l-9) fue directo y no depende de angiotensina-(l-7) (no fue inhibido con A779). D) La angiotensina II aumentó los niveles de expresión de TGF-β y el contenido de colágeno en la pared aórtica. angiotensina-(l-9) en la dosis usadas previno la expresión de los marcadores de remodelado vascular estudiados y su efecto fue independiente de angiotensina-(l-7). Estos resultados muestran claramente que angiotensina-(l-9) previene la hipertensión arterial y el remodelado de la pared aórtica.

Ejemplo 5. Angiotensina-(l-9) revierte el aumento de la presión arterial y el remodelado cardiovascular en el modelo Goldblatt (GB, 2 ríñones, 1 pinzado)

1. Peso corporal (PC), masa cardiaca (MC) y masa cardiaca relativa (MCR).

La Tabla 2 resume el PC, PAS y la MCR de las ratas Sham, GB y GB+angiotensina-(l-9). No se observaron diferencias en los PC de los tres grupos experimentales evaluados, aunque los PC en las ratas Gb+angiotensina-(l-9) fueron menores. Mientras que la MC se elevó significativamente en los animales hipertensos respecto a los animales control (0,93 ± 0,04 vs 0,74 ± 0,01, p < 0,03, respectivamente). angiotensina-(l-9) disminuyó significativamente la MC en las ratas con HTA respecto a los animales GB sin tratar (0, 84 ± 0,03 vs 0,9 3± 0,04 g, respectivamente, Tabla 2). La MCR mostró un aumento significativo en las ratas GB vs las Sham (400 ± 1 vs 330 ± 1, p < 0,04, respectivamente). La administración de angiotensina-(l-9) disminuyó la MCR en las ratas hipertensas (380 ± 2 vs 400 ± 1), aunque no alcanzó diferencias estadísticamente significativas (Tabla 2). TABLA 2: Efecto de angiotensina-(l-9) en el peso corporal, masa cardiaca y masa cardiaca relativa de ratas hipertensas por pinzamiento de la arteria renal (modelo Goldblatt)

GB GB.Ang-{l-9) GB-Ang-(1-9 A779

N 12 8 7

PC (g) 225 ± 12 248 ± 14 238 ± 6 245 ± 21 j

MCR (mg/g) 0,68 ± 0,01 1,01 ± 0,03* 0,84 ± 0,04 *^# 0,83 ± 0,10 *

MC (g) 0,33 ± 0,02 0,41 ± 0,01* 0,37 ± 0,02 0,34 ± 0,01

Los resultados representan el promedio ± SEM. S: sham; Ang: angiotensina; GB:

Goldblatt; PC: Peso corporal; PAS: presión arterial sistólica; MCR: Masa cardiaca relativa; MC: Masa cardiaca. *p < 0,05 vs S, #p < 0,05 vs GB (post ANO VA significativo).

2. Presión arterial sistólica

Las ratas sham mostraron niveles de presión arterial sistólica en los rangos de normotensión y cercanos a los 110 mmHg entre la semana 1 y 6 del ensayo (Figura 9). Las ratas GB aumentaron significativamente la presión arterial sistólica a partir de la semana 1 post cirugía la cual se mantuvo elevada y significativamente mayor durante las 6 semanas de duración del ensayo. La administración continua de angiotensina-(l-9) a las ratas GB a partir de la semana 4 post cirugía disminuyó en un 15% y significativamente la presión arterial sistólica a partir de la semana 1 post administración y se mantuvo durante las 2 semanas de duración del ensayo (Figura 9). El efecto antihipertensivo de angiotensina-(l-9) no fue revertido con la coadministración del inhibidor del receptor de angiotensina-(l-7) A779 (Figura 9).

3. Determinación morfométrica de la hipertrofia miocárdica hipertensiva.

La evaluación del área y perímetro de los cardiomiocitos en las ratas hipertensas mostraron aumentos significativos respecto a las ratas sham (218 ± 2 vs 203 ± 2 μπι² y 60 ± 1 vs 55 ± 1 μηι, respectivamente) (Figura 10). Sin embargo, la administración de angiotensina-(l-9) disminuyó el área y el perímetro de los cardiomiocitos en un 16% y un 22% respectivamente, en comparación con las ratas hipertensas (Figura 10). El efecto antihipertrófico de angiotensina-(l-9), no fue revertido con la coadministración del inhibidor del receptor de angiotensina-(l-7) A779 (Figura 10).

4. Hipertrofia vascular

La hipertensión arterial inducida por pinzamiento de la arteria renal aumentó significativamente el área de la túnica media (ATM), grosor de la túnica media (GTM) y la razón ATM/área luminal (AL) (Figuras 1 1-14) respecto al grupo control, sin cambios en el AL (Figura 15) y el área total (Figura 16). La confusión con angiotensina-(l-9) redujo significativamente el aumento del ATM, GTM y del ATM/AL (Figuras 1 1-14). El efecto de angiotensina-(l-9) efecto no fue afectado por la administración de A779 (Figuras 1 1-14). 5. Niveles proteicos de colágeno I en la pared aórtica

El colágeno I aumentó significativamente en las ratas hipertensas con respecto a su grupo control sham (5 veces, Figura 17). La administración de angiotensina-(l-9) redujo en un 54% el aumento de colágeno de la pared de la aorta y la coadministración de A779 no modificó el efecto de la angiotensina-(l-9) (Figura 17).

6.- Contenido ventricular de colágeno total

La fracción volumétrica de colágeno total (FVCT) mostró ser significativamente mayor en las ratas GB en comparación con las ratas sham (6,5 ± 1 y 3,7 ± 1 □□ respectivamente, Figura 18). Al tratar las ratas GB con angiotensina-(l-9), se observó una disminución significativa de la FVCT en un 41% con respecto a las ratas hipertensas sin tratamiento (3,8 ± 1 vs 6,5 ± 1,□□ respectivamente). La FVCT de las ratas GB+ angiotensina-(l-9) alcanzaron valores semejantes a las ratas normotensas (Figura 18)

7.- Niveles TGFD-1 y ED-1 en la pared aórtica y ventrículo izquierdo?

La hipertensión arterial aumentó significativamente la inflamación vascular determinada a través del aumento de los niveles para TGF -l y ED-1 respecto a su control sham (3,0 y 3,7 veces, respectivamente, Figuras 19 y 20). La administración de angiotensina-(l-9) disminuyó significativamente los niveles de TGF-pDy ED-1 D D en un 47% y 82%, respectivamente (Figuras 19 y 20), mientras que el A779 no alteró el efecto de angiotensina-(l-9) (Figuras 19 y 20).

A nivel del ventrículo izquierdo, los niveles de ED-1 mostraron un aumento significativo en las ratas GB vs los animales Sham (Tabla 3). La administración de angiotensina-(l-9) disminuyó significativamente los ED-1 en los ventrículos de las ratas hipertensas. El antagonista A779 no modificó el efecto de angiotensina-(l-9) (Tabla 3).

TABLA 3: Efecto de angiotensina-(l-9 ) en el contenido ventricular de ED-1

Los resultados representan el promedio ± SEM. PC: Peso corporal, PAS: presión arterial sistólica, MCR: Masa cardiaca relativa, MC: Masa cardiaca. *p<0,05 vs S, #p<0,05 vs GB

n presencia de ED-1

Número moderado de ED-1 GB 7 2* 20-40 distribuidos homogéneamente

Bajo número de EDI y

GB- angiotensina-(l-9) 7 1^# 0-20

aislados

Bajo número de EDI y

GB- angiotensina-(l-9)-A779 4 1^# 0-20

aislados

(después de ANO VA). *p<0,05 vs S, #p<0,05 vs GB (post ANOVA significativo).

Ejemplo 6. Determinación del efecto vasoactivo de angiotensina-(l -9). Estudios de contractilidad en arteria mesentérica

Se determinó el cambio de diámetro de arterias de resistencia de la rata (mesentéricas), prefundidas y presurizadas en condiciones fisiológicas, en respuesta a diferentes sustancias según metodología previamente descrita (González y cois. Hypertension. 45; 853-9, 2005).

Brevemente, ratas machos (Sprague Dawley, 150-200 grs.) fueron sacrificadas para disección del territorio vascular mesentérico, evitando manipulación directa de tejido arterial o venoso.

Arterias mesentéricas de pequeño calibre (200-300 micrómetros) fueron aisladas, eliminándose tejido adventicial en forma quirúrgica, bajo lupa estereoscópica (Olympus SZ61). Las arterias fueron perfundidas vía intraluminal en un baño termorregulado, a presión y flujo controlado, con solución de perfusión (Krebs modificado, KRB) de la siguiente composición, en mmol/L: NaCl, 130; CaCl₂, 2.5; NaHC0₃, 25; MgS0₄, 1.2; NaH₂P0₄, 1.2; KC1, 4.7; glucosa, 5.5, pH 7.4. Antes de su utilización, KRB se gasificó con mezcla 95% 0₂ y 5% C0₂. Para la perfusión, la arteria fue canulada con micropipeta de vidrio (164 μ diámetro externo), asegurada con sutura de seda 5-0. Las arterias fueron prefundidas con 10-20 μΙ7ηιϊη de KRB, de modo de lograr presión transmural de 60 mmHg. Después de periodo de reposo de 20 minutos, cada arteria fue incubada en presencia de vasoconstrictor (100 μΜ fenilefrina) por dos minutos y agonista de la producción de NO endotelial (1 μΜ acetilcolina). Estos estímulos permitieron comprobar la viabilidad de la túnica media y el endotelio. En los casos en que se observó respuestas adecuadas, la arteria fue lavada y tras nuevo periodo de equilibrio, fue utilizada para probar efectos vasoconstrictores directos de angiotensina-(l-9), o efectos vasodilatadores después de pre-contracción con fenilefrina. Para evaluar la participación de factores endoteliales en el potencial efecto vasoactivo de angiotensina-(l-9), en algunos experimentos se eliminó el endotelio por abrasión mecánica.

Ejemplo 7. Efecto de la angiotensina-(l-9) sobre la vasodilatación.

Angiotensina-(l-9) aumentó de manera dosis- dependiente, el diámetro de las arterias de resistencia con endotelio intacto en comparación con las arterias en las cuales removió su endotelio (Fig 21). Como control positivo del ensayo se usaron arterias estimuladas con un conocido agente vasocontrictor como fenilefrina. Para determinar el mecanismo vasodilatador de angiotensina-(l-9), se coincubaron las arterias mesentéricas con angiotensina-(l-9) en conjunto con un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (LNAME). Se observó que L-NAME disminuyó el efecto vasodilatador de angiotensina-(l-9), por lo cual el mecanismo de acción vasodilatador de angiotensina-(l-9) es dependiente de óxido nítrico (Figura 21). Ejemplo 8. Obtención de vectores virales que sobreexpresan la enzima convertidora de angiotensina-1 homologa (ECA-2)

1. Obtención de un adenovirus que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.

Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano código de acceso Genebank: NM 021804; rata código de acceso Genebank: NM 001012006) en el plasmidio adeno viral pDC316 (Microbix Byosystem Inc). Los clones positivos se confirmaron por secuenciación. Posteriormente, el plasmidio pDC316 conteniendo el gen para ECA2 se cotransfectó con el plasmidio adeno viral pBHGlox(delta)El,3Cre en células HEK293. El adenovirus recombinante se obtuvo por recombinación homologa entre los dos plasmidios según el procedimiento descrito por Hardy y cois (J. Virol. 71 :1842-9, 1997). La confirmación de que el adenovirus producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el adenovirus que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot y por actividad enzimática de la ECA2. En la Figura 22 se observa la sobreexpresión de ECA2 en cardiomiocitos en cultivo usando distintas multiplicidades de infección (MOI) con un adenovirus que sobreexpresa ECA-2. Basalmente, no es posible detectar la presencia de ECA-2 en cardiomiocitos en cultivo, pero mediante la expresión e ECA-2 usando un adenovirus es posible elevar varios cientos de veces los niveles de ECA-2 (Figura 22).

2. Obtención de un lentivirus que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.

Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano= código de acceso Genebank:

NM 021804; rata= código de acceso Genebank: NM 001012006) en el plasmidio lentiviral

PHAGE-PGK. Los lentivirus se fabricaron en células HEK293T por cotransfección simultánea del vector lentiviral conteniendo el cDNA para ECA2 y los vectores pCMVdeltaR8.9 y pHCMV-G según el procedimiento descrito por Zufferey y cois (J Virol. 72:9873-80, 1998). La confirmación de que el lentivirus producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el lentivirus que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot, y por actividad enzimática de la ECA2.

3. Obtención de un retrovirus que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.

Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano = código de acceso Genebank: NM 021804; rata= código de acceso Genebank: NM 001012006) en el plasmidio retro viral pCnBgSN (o cualquier otro plasmidio retroviral). Los retrovirus se fabricaron en células HEK293T por cotransfección simultánea del vector retroviral conteniendo el cDNA para ECA2 y los vectores pHIT60 (para gal-pol) y pCVG (para VSV-G) según el procedimiento descrito por Yu & Kwon (Methods in Molecular Biology, vol. 433: Volume 1 : Production and In Vivo Applications, Edited by: J. M. Le Doux O Humana Press, Totowa, NJ, páginas 1-16). La confirmación de que el retrovirus producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el retrovirus que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot y por actividad enzimática de la ECA2.

4. Obtención de un virus adenoasociado que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.

Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano= código de acceso Genebank:

NM_021804; rata= código de acceso Genebank: NM 001012006) en el plasmidio del virus adenoasociado pAAV-MCS (Stratagene). Los virus adenoasociados se fabricaron en células

HEK293T por cotransfección simultánea del vector del virus adenoasociado conteniendo el cDNA para ECA2 y los vectores pAAV-RC (pAAV-helper o pRC, que contiene los genes rep y cap) y pAdV-Helper (o pHelper, que porta los genes E2A, E4 y VA-RNAs) según el procedimiento descrito por Stratagene. La confirmación de que el virus adenoasociado producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el virus adenoasociado que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot y por actividad enzimática de la ECA2.

Ejemplo 9. Administración intracardiaca y en vasos sanguíneos de vectores virales que sobreexpresan la enzima convertidora de angiotensina-1 homologa (ECA-2).

La infección de los animales se llevó a cabo según la técnica descrita por Coleman y cois (Physiol Genomics 12:221-8, 2003). Brevemente, ratas macho normotensas de 150 D IO g se randomizaron a operación GB y como controles se usaron ratas seudooperadas (sham). Cinco semanas post cirugía, las ratas con hipertensión arterial establecida >140 mmHg se randomizaron a infección intra-miocárdica tal como lo describe Hajjar y cois (Circ. Res. 86; 616-621, 2000), con un vector adenoviral que sobre expresa la ECA2 (AdECA2) o la proteína fluorescente verde (GFP). Las ratas se anestesiaron con ketamina y xilazina en dosis de 50 mg/Kg/peso y 10 mg/Kg/peso, respectivamente, por vía intraperitoneal, tras lo cual se les intubó por vía laríngea mediante un catéter blando 18-gauge, y se ventiló con un volumen corriente de aproximadamente 2 mL a 60 ciclos/min (ventilador mecánico SAR-830 para animales pequeños). Se realizó una toracotomía a nivel del quinto espacio intercostal izquierdo, y se introdujo un catéter 24-gauge con 30 de solución adenoviral, lentiviral o virus adenoasociado estéril en la cámara ventricular izquierda. Después de la instalación de un tubo de drenaje para la remoción de aire y sangre, se cerró la incisión, se permitió la recuperación de los animales y se les devolvió a sus respectivas jaulas. La mortalidad de esta. cirugía bordeó el 20 % y ha sido establecida para la transferencia génica a largo plazo del tejido miocárdico (para detalles ver Methods in Molecular Biology, vol. 219: Cardiac Cell and Gene Transfer, Edited by: J. M. Metzger O Humana Press Inc., Totowa, NJ). A la semana después de la infección, las ratas se eutanasiaron. Ejemplo 10. La sobreexpresión de ECA-2 reduce la hipertensión arterial y el remodelado ventricular hipertensivo

1. Peso corporal (PC), masa cardiaca (MC) y masa cardiaca relativa (MCR).

El PC en las ratas AdECA2 fue significativamente menor (-21 %) respecto a las ratas GB y sham. No se observaron diferencias en el PC entre las ratas AdECA2 y AdGFP (Tabla 4).

La MC en la ratas GB fue significativamente mayor respecto a su grupo control (943±20 vs 740±20) como también la MCR (387 ± 16 vs 334 ± 13). La infección miocárdica con AdECA2 o AdGFP no modificó la MCR respecto a lo observado en las ratas GB (Tabla 4). Mientras que, la MC fue significativamente menor en las ratas AdECA2 y AdGFP (Tabla 4). TABLA 4: Efecto de la infección intramiocárdica con AdECA2 en el peso corporal, masa cardiaca y masa cardiaca relativa de ratas hipertensas por sobrecarga de presión parámetros S GB GB-AdGFP

N 8 8 8 5

PC (g) 257 ± 7 245 ± 10 193 ± 7* 211 ± 11* 20

MCR (mg/g) 330 ± 13 387 ± 16* 495 ± 19 " 476 ± 73*

MC (g) 0,740 ± 0,02 0,943 ± 0,02* 0,812 ± 0,02* 0,980 ± 0,01 *^T Los resultados representan el promedio ± SEM. PC: Peso corporal, MCR: Masa cardiaca relativa, MC: Masa cardiaca. *p<0,05 vs S, #p<0,05 vs GB,^† p<0,05 vs GB-AdECA2 (post ANO VA significativo). 2. Presión arterial sistólica

Las ratas sham mostraron niveles de presión arterial sistólica en los rangos de normotensión y cercanos a los 110 mmHg entre la semana 1 y 6 del ensayo (Tabla 5). Las ratas GB aumentaron significativamente (42%) la presión arterial sistólica a partir de la semana 1 post cirugía la cual se mantuvo elevada y significativamente mayor durante las 6 semanas de duración del ensayo. La infección intramiocárdica de las ratas GB con AdECA2 a partir de la semana 5 post cirugía disminuyó significativamente en un 15%, la presión arterial a la semana post administración (Tabla 5). El grupo GB-AdGFP también mostró una disminución significativa de la PAS (- 22%, Tabla 5).

TABLA 5: Efecto de la infección intramiocárdica con AdECA2 en la presión arterial sistólica de ratas hipertensas por sobrecarga de presión

¡r ^{" "}<SB . ^' GB-AdECA2 GB-AdGFP

N 8 8 8 5

PAS inicial 1 13 ± 3 1 10 ± 2 1 10 ± 4 113 ± 4

PAS sem 1 1 14 ± 3 133 ± 6* 125 ± 7*^# 142 ± 6*

PAS sem 5 110 ± 3 157 ±4* 175 ± 7* " 163 ± 7*

PAS sem 6 1 10 ±3 156 ± 3* 133 ± 9*" 122 ± 5

Los resultados representan el promedio ± SEM. PAS: presión arterial sistólica. *p<0,05 vs S, #p<0,05 vs GB (post ANO VA significativo). 3. - Hipertrofia cardiomiocitaria hipertensiva

La hipertensión aumentó significativamente el área de los cardiomiocitos respecto a sus controles sham (217 ± 2 vs 203 ± 1 , respectivamente, Figura 23 A). La infección miocárdica con AdECA2 disminuyó significativamente el área de los cardiomiocitos respecto al grupo GB (- 25%, respectivamente, Figura 23B). El grupo experimental correspondiente al control de infección con GFP no mostró diferencias en el área cardiomiocitaria respecto a las ratas hipertensas (Figuras 23A y B).

El perímetro de los cardiomiocitos de las ratas hipertensas fue significativamente mayor respecto a sus controles sham (20%, Figura 23 C). La sobreexpresión de ECA2 en ratas hipertensas disminuyó significativamente el perímetro cardiomiocitario respecto a lo observado en las ratas GB (-17%, Figura 23C). Aunque, el perímetro de las ratas infectadas con GFP mostraron ser menores que las ratas GB (-8%), este efecto fue menor al observado con AdECA2.

4. - Fibrosis cardiaca hipertensiva

El contenido de colágeno total fue significativamente mayor en las ratas hipertensas respecto a su grupo control sham (6.5 ± 0.8 vs 3.7 ± 0.4, respectivamente, Figura 24). La infección intramiocárdica de AdECA2 disminuyó significativamente el contenido de colágeno respecto a las ratas hipertensas (3.6 ± 1.7 vs 6.5 ± 2.4, respectivamente, Figura 24). El contenido de colágeno en las ratas infectadas con AdGFP fue similar a lo obtenido en las ratas GB (Figura 24).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial.

2. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para inducir vasodilatación.

3. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el daño cardiovascular, renal, pulmonar, cerebral que se produce en la hipertensión arterial.

4. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde dichos medicamentos son de forma farmacéutica inyectable.

5. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde dichos medicamentos liberan en forma continua el péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido al interior del organismo.

6. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde la liberación de dichos medicamentos se logra con una bomba de liberación continúa.

7. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde dicha liberación continua se realiza a la sangre, intramuscularmente, intradérmicamente, subcutáneamente o intraperitonealmente.

8. Uso del péptido angiotensina-(l -9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos, donde dichos medicamentos son de forma farmacéutica oral o rectal.

9. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para sobreexpresar la enzima convertidora de angiotensina I homologa (ECA2).

10. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos donde la sobreexpresión de la enzima convertidora de angiotensina I homologa (ECA2) se obtiene por adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus, lentivirus .

1 1. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido y al menos un compuesto farmacéutico seleccionado de inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina I, antagonistas del receptor de angiotensina II (ARA II), inhibidores de Rho kinasa, inhibidores de la renina, antagonistas de los canales L de calcio y diuréticos CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir la hipertensión arterial.