WO2013141604A1 - 그물말 과 조류로부터의 바이오에탄올 제조방법 - Google Patents

그물말 과 조류로부터의 바이오에탄올 제조방법 Download PDF

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WO2013141604A1
WO2013141604A1 PCT/KR2013/002299 KR2013002299W WO2013141604A1 WO 2013141604 A1 WO2013141604 A1 WO 2013141604A1 KR 2013002299 W KR2013002299 W KR 2013002299W WO 2013141604 A1 WO2013141604 A1 WO 2013141604A1
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hydrolysis
species
algae
acid
solution
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PCT/KR2013/002299
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김진석
김진철
김슬기
뉴엔마이꾸옹
고은혜
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한국화학연구원
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G33/00—Cultivation of seaweed or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing bioethanol from the family (Family Hydrodictyaceae) algae biomass and its saccharified solution. [Background technology]
  • Plant resources suitable for this should be one of the following factors: 1) minimization of food and feed security; 2) relatively good ability to reduce carbon dioxide or reduce pollution during growth; I believe that the economic value of the product is high and the economic efficiency must be provided.
  • a plant that satisfies these factors relatively high is algae, also called system 3rd generation biomass.
  • algae are high in species with high levels of certain components and are almost free of lignin, making process development cheaper than fibrous biomass (containing 15-30% lignin). It can also be grown using waste carbon dioxide or various wastewater. Therefore, the maximum use of these positive functions can create multiple effects of C0 2 reduction / environmental purification / alternative energy and eco-friendly industrial raw material production. Many efforts are being made in the discovery and improvement of species, the production of algal biomass, or the development of technologies for their use. Algae's industrial applications are in the areas of health foods and functional drugs, pigment production, aquaculture feeds, and cosmetic materials prior to the experience of rising oil prices (Karina., Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 146: 60-78 (2007).
  • the present inventors made an earnest research effort in order to achieve the above-mentioned problem of the prior art and the technical requirements of the art.
  • the present invention has been completed by developing a method for producing bioethane at low cost from a net carbohydrate, a net carbohydrate-rich algae biomass, and a saccharifying solution of algal origin, which has not yet been reported for its application.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a saccharified solution from the net and algae.
  • the invention provides a process for the preparation of bioethanol from Family Hydrodictyaceae algae comprising the following steps: Method for preparing bioethane from Family Hydrodictyaceae algae comprising the following steps:
  • Family Hydrodictyaceae algae used as biomass in the present invention include various nets and algae known in the art.
  • the nets and algae that can be used in the present invention are hydrodicion ⁇ Hydrodictyon sp.), IPediastn sp.), Sorastrum ⁇ Sorastmm sp.), Eustropsis sp.
  • Nandella (Fernandinelia sp.), Lakunastrum ⁇ LacLmastnwi sp.), Monactinus sp.), Paradoxia sp.), Parapediastrum sp.), Pseudopedias trum sp., Sparerastrum ⁇ (Sphaerastruw sp.), Star Uridium ⁇ (Stauridhm sp.) And Tetrapedia sp.)
  • the nets and algae usable in the present invention are selected from the group consisting of Hydrodityon ⁇ Hydrodictyon sp.), Pediastru sp.) And Sorastn i sp.) One or two or more algae, most preferably hydrodythion ⁇ (Jiydrodictyon sp.).
  • the net salt and algae among the freshwater green algae are selected in the present invention, and the carbohydrate content is up to 50-70% by weight, in particular glucose and mannose as the main monosaccharides. It is a high carbohydrate biomass that can produce up to 30-60% by weight of glucose content by weight of biomass.
  • the net and algae used in the present invention are so easy that they can be used only as an esophagus when collecting / selecting a sample, so that the samples are supplied at low energy / low cost to other microalgal processes that must be collected through centrifugation or filtration. It can be used for washing, dehydration, drying and powdering.
  • net horses and algae are free of lignin and carbohydrates are usually 50-70% by weight, and the most frequently used fermentation of charcoal sugar (glucose and mannose) is more than 90% by weight. There is an advantage.
  • the net and algae are living; Dry body; Residue remaining after leaching filtration with lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms; Residue remaining after extraction with water, a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms or a continuous solvent thereof using an organic purification apparatus; And one or two or more kinds of mixtures selected from residues obtained by extracting lipid components using an organic solvent.
  • the net horse and algae applied to the present invention can be collected directly in the open air, or used by grinding the living body or dry body obtained through the culturing process with fine particles, depending on the sample directly without grinding It can be applied to saccharification.
  • the sample of the net and algae applied to the present invention may be subjected to a separate extraction process as follows in order to produce a high-quality saccharified solution while increasing the added value, before adding to the saccharification process.
  • high quality refers to a state prepared to be suitable for fermentation because of a high content of hexasaccharides (glucose, mannose, etc.) in the saccharified solution and a low content of inhibitors that inhibit the fermentation.
  • the biological and dry algae of the collected nettles are extracted with 70-10 W of methane or ethanol, and then the residue (solid content) remaining after the extraction is used for the preparation of high concentration monosaccharides, or (ii ) also extracted by using a Soxhlet apparatus to a bird of the net end of the living body or the dried body successively with water or water and ethanol and then, after extraction using a remaining residue in the production of monosaccharide, or (iii) biological i or dried body
  • the algae of Family Hydrodictyaceae can be extracted with an organic solvent (such as chloroform + methanol), and the residues left after the extraction can be used to produce high concentrations of monosaccharides.
  • the nets and algae of step ( a ) preferably have a solids content of 30% by weight.
  • step (a) the sample feed of the net and algae for the saccharification solution can be supplied either initially or dividedly, and the final supplied solid content is preferably 1-30% by weight of the culture solution. It can be put in.
  • the saccharification solution obtained in step (a) comprises (i) a hydrolysis catalyst; (ii) polysaccharide degrading enzymes; (iii) hydrolysis catalysts and polysaccharide degrading enzymes; Or (iv) hydrothermal and polysaccharide degrading enzymes.
  • the hydrolysis catalyst includes various hydrolysis catalysts known in the art, and preferably, sulfuric acid, hydrochloric acid, bric acid, nitric acid, acetic acid, perchloric acid, phosphoric acid, para-luluenesulfonic acid (/ rtoluene sulfonic acid, PTSA ) And one or two or more acid catalysts selected from solid acids (e.g. citric acid, oxalic acid, various amino acids, maleic acid, phthalic acid, fumaric acid and sulfamic acid) or aqueous potassium, sodium hydroxide, calcium hydroxide and aqueous ammonia solution.
  • solid acids e.g. citric acid, oxalic acid, various amino acids, maleic acid, phthalic acid, fumaric acid and sulfamic acid
  • aqueous potassium sodium hydroxide, calcium hydroxide and aqueous ammonia solution.
  • alkali catalysts selected may be used.
  • the saccharification using the hydrolysis catalyst is carried out by primary hydrolysis and secondary hydrolysis at a temperature of 20-200 ° C for 0.5-6 hours.
  • a temperature of 20-200 ° C for 0.5-6 hours.
  • secondary hydrolysis for 1 hour at 121 ° C.
  • the polysaccharide degrading enzyme used in the preparation of the saccharification liquid includes various polysaccharide degrading enzymes known in the art, and preferably, cellulase, ⁇ -glucosidase, ⁇ _agarase, ⁇ -galactosidase, endo-1,4- ⁇ -glucanase, ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, amyloglucosidase, laminarinase, ⁇ -D-glucosidase, ⁇ -D-glucose
  • the polysaccharide degrading enzyme can supply both the required amount immediately after the feed of the net and algae, but can be dividedly added according to the conditions.
  • the temperature control after the polysaccharide degrading enzyme supply may vary depending on the timing of enzyme addition and the optimum conditions for the enzyme reaction, and according to a preferred embodiment of the present invention, the reaction is repeated for 0.5-5 days at 20-60 ° C.
  • the process of obtaining a saccharified solution using the polysaccharide degrading enzyme is performed to minimize the salt concentration of the complete layer solution when the enzyme reaction to produce a high concentration saccharified liquid, preferably, distilled water or 0.01 mM to 1.0 M Saccharification is carried out in a complete solution of the range.
  • the saccharification solution obtained from the net and algae may be carried out using hydrothermal and polysaccharide degrading enzymes.
  • hydrothermal water means distilled water of 80-20 (TC.
  • the hydrothermal water is added to the net and algae samples prior to the addition of the polysaccharide degrading enzyme.
  • TC distilled water
  • a hydrolysis reaction may be performed by injecting a polysaccharide degrading enzyme, while obtaining a saccharified solution using a hydrolysis catalyst or a polysaccharide degrading enzyme. The process is preferably carried out to minimize the production of fermentation inhibitors.
  • biomass is subjected to high temperature / high pressure treatment or acid hydrolysis to increase glycosylation efficiency.
  • sugars undergo chemical conversion, which leads to hydroxymethyl furfural (HMF) and furfural. Is produced, which is undesirable because it acts as a strong inhibitor of fermentation strains. Therefore, the reaction should be carried out under conditions that can be inhibited to produce such fermentation inhibitors.
  • HMF hydroxymethyl furfural
  • Hydroxymethyl full fural is a crystal of C 6 3 ⁇ 40 3 , melting point of 31.5 ° C. It is easily dissolved in organic solvents such as water and alcohol, and is easily oxidized by air and light.
  • Fulfural is a colorless liquid with a molecular formula C 2 H 2 0 2 , boiling point 161.8 ° C., having an aldehyde-like fragrance. It is automatically oxidized by air and light, and coloring is easy to occur. Industrially, it is obtained by heating sugar of grains with an acid, and is used as a raw material and a solvent of resin. It is the main component of volatile carbonyl compounds produced by heating monosaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides in foods, and is one of the indicators of component change caused by deterioration of quality during processing, processing or storage of foods. Are treated.
  • the saccharified solution obtained according to step (a) of the present invention has a hydroxymethylpulfural, a furfural or a mixture thereof of 0.07% by weight or less (preferably containing 5% glucose Saccharification solution), more preferably 0.00001-0.07% by weight.
  • Monosaccharides obtained through step (a) of the present invention include a variety of monosaccharides known in the art, preferably, galactose, galactose Derivatives (such as galacturonic acid), 3, 6-anhydrogalactose, xylose, glucose, rhamnose, xylose and mannose, or one or two or more mixed monosaccharides, more preferably glucose, Mannose or their mixed monosaccharides.
  • step (b) adds the product of step (a) as a carbon source to the culture medium of the microorganism to prepare bioethane.
  • Microorganisms used in the present invention include any microorganism that produces bioethanol as a metabolite.
  • various bioethanol producing bacteria known in the art are used, and preferably, Saccharomyces Saccharomyces species [eg, Saccharomyces cerevisiae] S. cerevisiae], epoch! Schi zosaccharomyces species [e.g. 5. pombe], pichia (/ cA / a) species [e.g. Pichia ⁇ anomala ⁇ , papia ( ⁇ /// s) species (e.g., pan ivu lata), Kluyveromyces OT / i / jrerOTyces species [e.g., Cluiberomyces marcia (F.
  • Saccharomyces Saccharomyces species eg, Saccharomyces cerevisiae] S. cerevisiae]
  • Schi zosaccharomyces species e.g. 5. pombe
  • pichia (/ cA / a) species e.g. Pichia ⁇
  • Candida (Csy3 ⁇ 4 // o) species e.g. Candida Crucei (C. kruse /)]
  • Thalaromises (7 / aro3 ⁇ 4 es) species e.g. Sony ( ⁇ . Emersonii) ⁇ , re ay3 ⁇ 4M7j es species [e.g. Bretanomises Brookxensis], paki Solen ( ⁇ ay ⁇ o / »7) species [e.g. Pachysolene tannophilus], Zfe /? Arj / z7yces species [e.g.
  • Cultivation of the microorganisms in step (b) is performed by the saccharification liquid obtained in step (a)
  • Can be carried out according to conventional culture methods known in the art Karlin, J., et. al., Biochemistry of Bacterial Growth, 3rd ed.Oxford: Blackwel 1, 1982; Meyne 11, GG, et al., Theory and Practice in Experimental Bacteriology, 2nd ed.Cambridge: Cambridge University Press, 1970; Gerhardt, P., ed., Manual of Methods for General Bacteriology, Washington: Am. Soc.Microbiol, 1981).
  • the saccharified solution as a carbon source in the culturing process, it may include a nitrogen source, such as yeast extract and peptone.
  • step (a) and step (b) of the process for producing a bioethanol of the present invention proceeds separately separated. Separation of the saccharification and fermentation process can be more efficiently achieved by culturing the microorganisms producing the desired organic matter by enabling further processing, such as improving the purity or removal of fermentation inhibitors prior to applying the obtained saccharification solution to the microorganism culture .
  • the method further comprises the step of concentrating the saccharified solution obtained in step (a) between step ( a ) and step (b).
  • a concentration process may be included following glycosylation to minimize chemical interference or growth inhibitory substance.
  • Concentration of the saccharified solution may be used, for example, centrifugal vacuum drying or membrane pervaporation, but is not limited thereto, and various concentration methods known in the art may be used. Specifically, after the supernatant is taken through the saccharified solution by centrifugation, a saccharified solution containing a high content of glucose may be obtained by drying under reduced pressure.
  • Bioethanol produced by the production method of the present invention provides bioethanol with economical sugar production costs without competing with food resources based on non-edible resources.
  • the bioethanol is for transportation It will be provided after fuel or as a raw material for the production of various chemicals, contributing to the production of alternative chemicals.
  • the present invention provides a method for producing a saccharification solution comprising the step of contacting the family (Family Hydrodictyaceae) algae and polysaccharide degrading enzyme, hydrolysis catalyst or a mixture of polysaccharide degrading enzyme and hydrolysis catalyst to provide.
  • the nettle and algae are very useful for obtaining chemical saccharification liquids for various purposes because they are very easy to chemically and chemically saccharify, show high glycosylation rate without special pretreatment after collection, and are unlikely to discharge by-products. Can be.
  • Net horses and algae according to the present invention has a very easy biochemical / chemical glycosylation characteristics can be used directly after collection, and even when using a dry body shows a high glycosylation rate without special pretreatment, which is a lower cost
  • the economic feasibility of saccharification and low emission of environmental pollutants during the saccharification process will greatly contribute to the production of industrial biochemical products.
  • Bioethane prepared according to the present invention will serve as fuel for transportation or as a raw material for the production of various chemicals, contributing to the production of alternative petroleum chemicals.
  • Figure 1 is a schematic of the process for producing a high concentration of monosaccharides using a net horse and algae according to the production method of the present invention and the production of bioethanol through fermentation from its saccharified liquid.
  • 2 is a graph showing the amount of glucose produced and the expected value during secondary hydrolysis of high concentration net solids.
  • Figure 3 is a graph showing the productivity difference of three bioethanol production strains in the production of bioethane using HR saccharification liquid SC7017, ZM1534, SC7928 is ccAsrOTyces cerevisiae CTC7017, Zymonas mobilis C, Saccharomyces cerevisiae, respectively o /? 77as mobilis subsp.
  • HE enzyme hydrolysis
  • HA acid hydrolysis
  • HC acid + enzyme hydrolysis
  • HWC hydrothermal + enzyme hydrolysis
  • the relative proportion of total carbohydrate in the freshwater algae of the collected freshwater algae was investigated. It was 50-65% based on dry weight, and the main sugar components of the net malt obtained after hydrolysis were glucose and mannose.
  • the glucose and mannose content obtained by enzymatic hydrolysis with a net sample containing 64.6% of total carbohydrates was 46.82 ⁇ 0.46 g per 100 g of dried biomass and The yield of hexose (glucose + mannose) by enzymatic hydrolysis was 0.48 g at 10.56 sul was 88.8% based on total carbohydrates and 57.4% based on biomass dryness.
  • WEFS Water-extractive free solids
  • EFS Water & ethanol-extractive free solids
  • EFS which is free of water and ethanol extract
  • 2 g of dry powder sample is placed in a thimble (28X100 mm) and extracted for about 8 hours at 25C C using 190 m £ of water. Again extracted with 190 ⁇ ⁇ ethanol at 150 ° C 3-4 hours, the residue was taken to dry at 45 ° C for 1 day to prepare.
  • Acid hydrolysis is a dry powder sample prepared as above (powder, WEFS and EFS).
  • the glycosylation and glucose production patterns according to the solid content were identified to prepare a saccharified solution of various concentrations.
  • the plant material was harvested and dehydrated in a greenhouse grown in a greenhouse, then dried in a convention oven at 45 ° C. for 1 day, and then crushed with a blender to use finely crushed powder as an experimental material (HR-d23 and HR). — D31). The sample was found to contain around 35% and 45% glucose content, respectively.
  • the enzyme solution was added in proportion to the solid content.
  • the amount of enzyme used was 0.2 + 0.04 per gram of dry matter.
  • Enzymes are celase (Celluclast Cone BG, manufactured by Novozymes, used for 5 times dilution, indicated by ⁇ ') and ⁇ -glucosidase (expressed as Sigma C6105, ⁇ 2' below).
  • the mixture was hydrolyzed while incubated at 50 ° C and 170 rpm for 2 days, and glucose production in the saccharified solution was analyzed and quantified by a biochemical analyzer (YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT).
  • a biochemical analyzer YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT
  • Table 2 shows the glucose content obtained through the enzymatic hydrolysis from the net sample
  • Table 3 is a table showing the reducing sugar content obtained through enzymatic hydrolysis from the net sample.
  • Example 2 the same method as in Example 1 was carried out to find out how much hydroxymethylfurfural and fufural are produced with the enzyme hydrolyzed mesh sample, and to predict whether the fermentation strain is inhibited.
  • the plant material was harvested and dehydrated in a greenhouse grown in a greenhouse, and then dried at 45 ° C. for 1 day in the convention Aubonn, and then crushed with a blender to use finely crushed powder as an experimental material (HR-d23 and HR). -d31).
  • the sample was found to contain around 35% and 45% glucose content, respectively.
  • Enzymes are cellulase (Celluclast Cone BG, Novozymes, 5 times dilution, used in the following 'E1') and ⁇ -glucosidase (Sigma C6105, shown as # 2 ') was used.
  • Various concentrations of enzyme solution El + E2 (5: l) were added to these samples aseptically, and the amount of enzyme used was 0.02-0.2 + 0.004-0.04 ⁇ ⁇ per 1 g of (E1 + E2) dry matter.
  • glucose production in the saccharified solution was analyzed and quantified by a biochemical analyzer (YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT).
  • a biochemical analyzer YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT
  • Table 5 shows the changes in glucose and reducing sugar content obtained through treatment of various concentrations of hydrolase from high concentration net samples (25% solids). HAI stands for Hour after incubation.
  • HR harvested and grown in greenhouse conditions was dried and powdered, which was then used as experimental material (HR-dl3).
  • Acids used for acid hydrolysis are sulfuric acid and hydrochloric acid and the hydrolysis methods and conditions (solid content, acid concentration, temperature and time, etc.) will be shown in the results.
  • the content of glucose, reducing sugar, hydroxymethylfufural (HMF) and fufural in the hydrolyzate was investigated in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • Example 5 Preparation of Sugar Solution through Mixed Hydrolysis in High Concentration Net Solids
  • high quality sugar solution having low sugar content and a low fermentation inhibitor
  • it must first be able to be saccharified with a high concentration of solid content. It is necessary to develop a process with a high glycation rate and a short saccharification time.
  • hydrolysis at high solids content decreases the glycation rate due to various causes.
  • the experiment was conducted to develop a method for producing saccharified solution more efficiently with a high concentration of net sample by using both acid and enzyme hydrolysis.
  • the plant material was harvested and dehydrated in a greenhouse grown in a greenhouse, then dried in a convention oven at 45 ° C. for 2 days, and then pulverized with a blender to use finely divided powder as an experimental material (HR—d23). This sample was found to contain about 35% glucose content.
  • the amount of enzyme used was 0.02-0.2 (E1) + 0.004— 0.04 (E2) ml per gram of dry matter. It was. Subsequently, the cells were hydrolyzed while incubated at 5 rpm for 5 days (C, 170 rpm), and glucose production in the saccharified solution was analyzed and quantified by a biochemical analyzer (YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT). Reducing sugar content, hydroxymethylfurfural and fufural content for the sample
  • the concentrations of hydroxymethylfurfural and fufural in the saccharified solution were examined. Regardless of the enzyme treatment, the hydroxymethylfurfural concentration was about 0.016-0.018%, and the furfural content was much lower than that of 0.0015-0.0022% (Table 10). This is lower than the HMF of 0.022% in two-stage acid hydrolysis (Example 4) and reportedly 50% at 0.265% concentration for E. coli (fec3 ⁇ 4e / 7 / a coli, ⁇ . It was reported to inhibit% growth and at 0.1-0.5% against other strains (Almeida. Appl. Microbiol. Biotechnol, 82: 625-638 (2009)). Since the solution contained more than 50 times lower than the growth inhibitory activity concentration of hydroxymethyl fulfural, it was predicted that the possibility of not inhibiting the fermentation strain was very high.
  • high concentration sugar solutions should be prepared and provided as a substrate for biological conversion.
  • Plant material is dehydrated by harvesting net horses grown in a greenhouse.
  • Aseptically filtered sterilized glycosylase E1 + E2 solution was added in an amount of 0.2 + 0.04 ml per 1 g of dry matter, and then hydrolyzed while incubating at 50 ° C and 170 rpm for 2 days.
  • the glycosylated sample was taken from the primary supernatant by centrifugation (8000 rpm, 20 minutes), and then sterile water was added and suspended, followed by centrifugation under the same conditions to obtain the secondary supernatant.
  • the primary and secondary supernatants were collected and mixed, and then water and solvent were dried with a reduced pressure drier while adding an appropriate amount of alcohol.
  • the glucose content in the sugar concentrate was determined by diluting the sample with distilled water. Analyze and quantify with an analyzer (YSI 2710).
  • the method of filtration of water in the saccharified solution was first considered in order to obtain a sugar concentrate more efficiently assuming a large amount of saccharified liquid produced. That is, 6 g of HR-d23 dry sample was added to a 500 1 Erlenmeyer flask, and 50 mM citrate buffer (pH 4.8) was added to 100 ⁇ , followed by autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes, followed by saccharification in the same manner as described above. After centrifugation, saccharol was obtained.
  • Dry sample 40 g was added to a 2000 ni ⁇ Erlenmeyer flask to prepare saccharified solution under higher capacity and lower buffer strength with net-grown and algae dry powder samples (HR-d7).
  • Enzymes used were Cellase (Celluclast 1.5 L, manufactured by Novozymes, represented by ⁇ ⁇ '), ⁇ -glucosidase (denoted by Sigma C6105 ⁇ 2'), and ⁇ -amylase (Sigma A8220, ⁇ 3 'below).
  • amyloglucosidase (Sigma A7095, represented by VII4 'below). Aseptically filtered sterilized glycosylase E1 + E2 + E3 + E4 solution was added 0.2, 0.04, 0.2 and 0.2 ⁇ per 1 g of dry matter, respectively, and then hydrolyzed at 50 ° C and 170 rpm for 2 days.
  • the glycosylated sample was taken from the primary supernatant by centrifugation (8000 rpm, 40 minutes), the mixture was added with sterile water, suspended and centrifuged under the same conditions to obtain the secondary supernatant.
  • the primary and secondary supernatants were collected and mixed, and then water and solvent were dried with a reduced pressure drier while adding an appropriate amount of alcohol.
  • the glucose content in the sugar concentrate was analyzed and quantified by biochemical analyzer (YSI 2710) by diluting the sample with distilled water.
  • the composition of the sugar solution for fermentation depends on the type of biomass, unless the sugar component is separated through complete purification.
  • a specific component that affects fermentation exists in a specific biomass, and the reaction to the microbial species It may vary. Therefore, when fermentation is carried out with a biomass-derived sugar solution, it is necessary to investigate all the cases to find a microorganism having an optimum efficiency in bioethanol production. In this example, we tried to find out whether there is a difference in productivity of bioethane against HR sugar solution among microbial strains that are used for producing bioethane.
  • Strains used in this example is my process to the saccharide two systems of ⁇ ⁇ ] a) ⁇ ] ⁇ ] ⁇ ] (Saccharomyces cerevisiae KCTC7017, Saccharomyces cerevisiae KCTC7928) and Xi thigh eggplant Mo ⁇ less (Zymo / nas mobilis subsp. Mobilis KCTC1534 A total of three species were used.
  • HR saccharification liquid preparation was carried out as in Example 2. For bioethanol production, HR saccharification solution and yeast extract 20 g + peptone 10 g / lL mixed medium were sterilized at 121 ° C. for 20 minutes, and then mixed (final volume 50 mL).
  • Bioethanol-producing strains pre-incubated for 20 hours at 30 ° C. 2.
  • U inoculated in sterilized medium and N 2 gas was injected for 10 minutes to remove oxygen and then incubated for 48 hours at 120 rpm, 30 ° C.
  • the supernatant obtained by centrifugation at 8000 rpm for 20 minutes was analyzed for ethanol.
  • Ethanol analysis was performed by adding 0.05 ml of sample to 1 ml of distilled water using Megazyme ethanol KIT, adding 0.1 ml of pyrophosphate complete solution, 0.1 ml of NAD +, and 0.01 ml of aldehyde dihydrogenase for 2 minutes, and then absorbing at 340 nm. Was measured (A1).
  • Optimum conditions for biomass saccharification (hydrolysis) for practical use depend on the physicochemical properties of the biomass. And the obtained saccharified liquid should be well fermented, so it is important to establish the technology so that saccharification and fermentation can be well linked in terms of efficiency and economic efficiency.
  • the hydrolysis (glycosylation) of HR was performed at low cost, and the glycosylation efficiency and bioethane productivity of various HR saccharification methods were examined to explore glycosylation (hydrolysis) method which is more useful for fermentation.
  • Enzymatic Hydrolysis 6 g of HR dry powder was added to a 500 mL Erlenmeyer flask, and 0.05 mL of citric acid complete solution (pH 4.8) was added, followed by autoclaving at 120C for 20 minutes. After aseptically adding enzyme solution (E1 + E2 is added 0.2 + 0.04mL / g biomass), it is hydrolyzed by incubating at 50 ° C, 150rpm for 2 days, and the glycosylated sample is removed by centrifugation to remove the residue. I was.
  • Acid Hydrolysis The hydrolysis was carried out by a two-step hydrolysis method. That is, in the first hydrolysis, HR dryness: 72% sulfuric acid was changed to lg: 1.5 mL and reacted at 60 ° C for 1 hour, and then 23.5 mL of distilled water was added (final sulfuric acid concentration: 2.88%, S / L: 4%). Secondary hydrolysis in aluminum counterunger for 1 hour at 12 CTC. After completion of reaction, the final pH of the hydrolyzate was adjusted to 5-6 using CaC0 3 , followed by centrifugation. Supernatant was taken through.
  • Combined hydrolysis This was carried out by enzymatic hydrolysis after weak acid pretreatment. Weak acid pretreatment was added to the dried sample lO.Og in 2% HC1 40mL (25% S / L), sterilized for 20 minutes at 120 ° C using an autoclave. Thereafter, a certain amount of 0.1 M citric acid complete solution was added thereto, and the mixture was concentrated with NaOH and adjusted to pH 4.8-5.0. Thereafter, E1 + E2 enzyme was injected into the weak acid solution with 0.2 + 0.04 mL / g biomass water and then enzymatic hydrolyzed at 50 C and 150 rpm for 24 hours.
  • Hydrothermal Pretreatment-Enzymatic Hydrolysis The hydrolysis was carried out by hydrolysis after enzymatic hydrolysis.
  • the hot water pre-treatment was carried out in a reaction tank containing the dried HR sample 10Og into 40mL (25% S / L) of distilled water, and the high temperature treatment at 150 ° C. for 30 minutes. Then, a certain amount of 0.1M citric acid complete solution was added, neutralized with HC1, and adjusted to pH 4.8-5.0. Thereafter, E1 + E2 enzyme was injected into the hot water solution at a level of 0.2 + 0.04 mL / g biomass, and then the enzyme was hydrolyzed for 50C, 150rpm, and 24hr. Fermentation for Producing Bioethane
  • the HR saccharification solution and yeast extract 20 g + peptone 10 g / lL mixed medium prepared under the above conditions were sterilized at 121 ° C. for 20 minutes, respectively, and then mixed (final volume 50 mL). After incubation for 20 hours at 30 ° C. to produce bioethane strain Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae, KCTC7017) inoculated 2.5ml in sterile medium and injecting N 2 gas for 10 minutes to remove oxygen Incubated for 48 hours at 120 rpm, 30 ° C. After incubation, ethane was analyzed with the supernatant obtained by centrifugation at 8000 rpm for 20 minutes. Analytical Method
  • D-glucose analysis was performed by the manufacturer using a biochemistry analyzer (YSI 2700 SELECTTM, YSI Life Sciences, USA) using an assay kit with 2.5 g / L D-glucose and 1.5 g / L standard L-lactic acid. Quantification
  • Reducing sugar quantification was performed by mixing the DNS reagent, including DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) with the sample for 5 minutes and 30 seconds in a 100 ° C water bath, the absorbance was measured at 540 ⁇ with a spectrophotometer.
  • the standard curve of reducing sugar was prepared by diluting D-glucose by concentration, reacting with DNS reagent in the same manner as the sample, and measuring the absorbance.
  • Quantitation was carried out by HPLC (Waters, USA) analysis in the same manner as in Example 1.
  • the column used Comosil 5C18-MS-11 (4X150 Korea), the mobile phase was gradientd by 100% distilled water (Pump A) and 100% methane (Pump B), flow rate 0.6 ni / min, measurement wavelength was 280 nm.
  • the hydrolysis method that can obtain a lot of sugars based on HR biomass building that is, the method of higher glycosylation efficiency is HE (enzyme hydrolysis) and HA (acid hydrolysis), respectively. %, 35, 6% glucose could be obtained (Table 12). Table 12 Comparison of sugar production from HR biomass according to various hydrolysis methods
  • the conversion rate of bioethanol from initial reducing sugar was high as HE> HWOHC> HA.
  • HC showed the lowest tendency, which can be assumed to be the effect of the fermentation inhibitor ⁇ HMF + Fulfural> which may occur during the first acid hydrolysis (Table 13).
  • the remaining non-converted reducing sugar at the end of fermentation was the highest in HC because it was a sugar solution obtained from high solids content, which is considered to be relatively high in the amount of other impurities.
  • the HR-d7 sample was hydrolyzed to obtain a saccharified solution by enzymatic hydrolysis at 63 ⁇ 4) solid content, and then concentrated to prepare a highly concentrated HR sugar solution (HRHS7) having a glucose content of about 13.9%.

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Abstract

본 발명은 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류 바이오매스 및 이의 당화액으로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 그물말 과 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 당화액을 탄소원으로 이용하여 미생물을 배양하여 바이오에탄올을 제조하는 단계를 포함하는 그물말 과(Family Hydrodictyaceae) 조류로부터 바이오에탄올의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 그물말 과 조류로부터의 화학물질 생산은 옥수수 및 밀과 같은 식용자원이 아닌 비식용자원인 조류(algae)를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고, 안정적으로 자원의 공급이 가능하며, 당화가 용이한 재료이기 때문에 저비용으로 화학물질을 생산할 수 있다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 바이오에탄올은 수송용 연료로 제공되거나 여러 가지 화학제품 생산의 원료물질로 제공되어 석유대체 화학물질 생산에 기여할 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
그물말 과 조류로부터의 바이오에탄을 제조방법
【기술 분야】
본 발명은 그물말 과 (Family Hydrodictyaceae) 조류 바이오매스 및 이의 당화액으로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다. 【배경 기술】
석유자원의 고갈， 에너지 수요 증가, 지구온난화와 C02 배출 문제， 환경규제 강화 등의 여러 문제에 직면한 상황에서 미래 환경과 자원고갈을 슬기롭게 대비하기 위해서는 필수적으로 식물자원 (바이오매스)의 효율적 활용기술 개발이 필요하다. 이에 적합한 식물자원은 다음의 몇 가지 요인 즉， 1) 식량 및 사료 확보와의 층돌이 최소화 될 것， 2) 생장시 이산화탄소 저감 또는 환경오염 경감 능력이 상대적으로 우수할 것， 3) 생산성이 뛰어나거나 생산물의 산업적 가치가 높아 경제성이 높을 것 등이 필수적으로 구비되어야 한다고 본다. 상기 요인을 비교적 높게 만족시키는 식물은 계 3세대 바이오매스라고도 일컫는 조류 (algae)이다. 특히 조류 중에는 특정 성분이 고함량 존재하는 종들이 많고 리그닌이 거의 없기 때문에 섬유질계 바이오매스 (리그닌 15-30% 함유)보다 값싼 공정개발이 가능하다. 그리고 폐이산화탄소 또는 각종 폐수를 활용하여 재배할 수도 있다. 따라서 이러한 긍정적 기능들을 최대한 활용하면 C02 저감 /환경정화 /대체에너지 및 친환경 산업원료 생산의 다중효과를 창출할 수 있어 과학계에서는 이에 큰 기대를 가지고 넜으며 최근 들어 많은 연구자들이 보다 이용가치가 높은 조류종의 발굴 및 개선, 조류 바이오매스의 생산 또는 이의 활용기술 개발에 많은 노력을 투입하고 있다. 조류 (algae)의 산업적 응용은 유가 상승 경험 이전의 경우 건강식품 및 기능성의약품, 색소생산， 양식사료， 화장품 소재 등의 분야로 (Karina., Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 146 :60-78(2007)) 제한되어 왔었으나 유가상승 경험 이후에는 대체에너지원 확보를 위한 미세조류 연구가 전 세계적으로 대단한 열풍으로 진행되고 있다. 바이오디젤 생산기술 개발에 보다 집증되고 있지만 (Scott., Current Opinion in Biotechnology, 21： 1-10(2010)； Mat a., Renewable and Sustainable Energy Reviews, 14:217232(2010)), 미세조류 및 해양거대조류를 이용한 바이오에탄올 또는 바이오부탄을 등의 생산기술도 보고되고 있다 (Ge., Renewable Energy. 36:84-89(2011)； Harun. , Renewable and Sustainable Energy Reviews, In press(2011)； Adams., J . Appl . Phycol. , 21:569574(2009)； Lee. , J. Korean Ind. Eng. Chew. 20(3) :290- 295(2009)； Isa. , Journal of the Japan Institute of Energy, 88:912- 917(2009)； Ueno . , Journal of Ferment at ion and Bioengineering. 86(1) :38-43(1998)； Brennan과 Owende, Renew. Sustain. Energy Rev. 14:557577(2010)； John. , Bioresource Technology, 102:186-193(2011); Choi., Bioresource Technology 101:5330-5336(2010)； 강., 대한민국특허 제 10-0908425호, 2009; 김., 대한민국 공개특허번호 게 10-2009-0025221호, 2009； 이., 대한민국 공개특허 제 10-2010— 0125104호, 2010; 장.， 대한민국특허 제 10-0919299호, 2009). 그러나 본 발명의 그물말과 조류로부터 바이오에탄올을 생산하는 기술에 대해서는 아직 보고된 바 없다. 지금까지 산업화 수준에서의 바이오매스 기원 바이오에탄올 생산 사례들을 보면, 이들의 생산 원료가 주로 옥수수, 밀, 고구마, 감자 등으로서 식품， 사료등과 경쟁하기 때문에 앞으로는 이들과 경쟁이 적은 비식용자원 (목질계, 조류 등)으로부터 원료의 대체 확보가 요구되고 있다. 그런데 이 경우 해결해야할 가장 큰 도전중의 하나는 생산비용의 절감이다. 식용자원과는 달리 비식용자원의 경우 전처리， 당화가 보다 어렵고 고농도 당용액 또는 발효억제물질 함유량이 낮은 당용액을 제조하기 위해서는 추가 공정이 요구되기 때문이다. 그리고 자원의 종류마다 화학적 조성 및 물리적 구조에 차이가 있기 때문에 각각의 종에 최적화된 당용액 생산 방법이 개발되어야 하는 바, 보다 온화한 조건에서 당화될 수 있는 종을 선발， 사용하는 것이 당화물 생산비용 절감에 있어서 매우 중요한 요소가 된다ᅳ 한편 발효의 경우도 균주에 따라 여러 당을 모두 소화하는 계통이 있기는 하지만 대부분 몇 가지 당 (글루코오스, 프락토오스， 포도당 둥)을 우선적으로 선호함에 따라 이들 탄수화물이 상대적으로 높게 생산될 수 있는 자원을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 비식용 자원 중에서 발효에 유용한 당이 많이 함유되어 있는 것을 골라 저비용 /친환경적으로 당화물을, 제조한 다음, 이를 발효 기질로서 사용하여 보다 경제적으로 바이오에탄을을 생산 (당화 /발효 분리공정)하는 것이 본 산업 분야에서 지속적으로 추구해야 할 과제 중의 하나이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점 및 당업계의 기술적 요구를 달성하기 위하여， 예의연구 노력하였다. 그 결과, 그 활용에 대해 아직 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스인 그물말 과 조류 기원의 당화액으로부터 바이오에탄을을 저비용으로 제조할 수 있는 방법을 개발함으로써， 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 그물말 과 조류로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 그물말 과 조류로부터 당화액을 제조하는 방법을 제 Ϋ하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
[기술적 해결방법: I
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음 단계를 포함하는 그물말 과 (Family Hydrodictyaceae) 조류로부터 바이오에탄올의 제조방법을 제공한다: 다음의 단계를 포함하는 그물말 과 (Family Hydrodictyaceae) 조류로부터 바이오에탄을의 제조방법:
(a) 그물말 과 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득하는 단계 ; 및
(b) 상기 당화액을 탄소원으로 이용하여 사카로마이세스
( Saccharomyces) 종， 시조사카로마이세스 (5 /?/ c»sa :/?ar(¾?yc7es) 종， 피키아 {Pichia) 종, 파피아 (/¾///a) 종， 클루이베로미세스 Of/ y erowyces) 종, 칸디다 종， 탈라로미세스 (7a/ar(^yces) 종， 브레타노미세스
{Brettanomyces) 종， 파키솔렌 (/ ^o/«2) 종， 데바리오미세스 ( Debar yomyces) 종, 이스케리치아 0 zer/cA/ ) 종 및 지모모나스 {Zymomonas) 종으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 미생물을 배양하여 바이오에탄을을 수득하는 단계 .
본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점 및 당업계의 기술적 요구를 달성하기 위하여， 예의연구 노력하였다. 그 결과， 그 활용에 대해 아작 보고된 바 없는 탄수화물 고함유 조류 바이오매스인 그물말 과 조류 기원의 당화액으로부터 바이오에탄올을 저비용으로 제조할 수 있는 방법을 개발하였다. 그물말 과 조류 바이오매스 (biomass) 기원의 당화액으로부터 바이오에탄올를 제조하기 위한 본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다: 단계 (a): 그물말 과 (Family Hydrodictyaceae) 조류로부터의 당화액 수득 우선， 그물말 과 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득한다.
본 발명에서 바이오매스로 이용되는 그물말 과 (Family Hydrodictyaceae) 조류는 당업계에 공지된 다양한 그물말 과 조류를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 이용 가능한 그물말 과 조류는 히드로딕티온 ^ Hydrodictyon sp.), 훈장말 쏙 iPediastn sp.), 소라스트럼 쏙 Sorastmm sp.), 유아스트롭시스 쏙 Euastropsis sp.), 페르난디넬라 속 {Fernandinelia sp.), 라쿠나스트럼 ^ LacLmastnwi sp.), 모나크티누스 속 Monactinus sp.), 파라독시아 쏙 Paradoxia sp.), 파라페디아스트럼 쏙 Parapediastrum sp.), 슈도페디아스트럼 ( Pseudopedias trum sp.), 스패라스트럼 ^ ( Sphaerastruw sp.), 스타우리디움 ^{Stauridhm sp.) 및 테트라페다아 쏙 Tetrapedia sp.)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 이용 가능한 그물말 과 조류는 히드로딕티온 ^ Hydrodictyon sp.), 훈장말 속 Pediastru sp.) 및 소라스트럼 쏙 Sorastn i sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 조류이고, 가장 바람직하게는 히드로딕티온 ^(Jiydrodictyon sp . )이다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면， 본 발명에는 담수 녹조류 중 그물말 과 조류를 선택되며, 이는 탄수화물 함량이 50-70 중량%까지 되며, 특히 주요 단당류로서 글루코오스 및 만노오스를 포함하고ᅵ 효소 당화 시 글루코오스 함량이 바이오매스 중량대비 30-60 중량 %까지 생산될 수 있는 탄수화물 고함유 바이오매스이다.
본 발명에서 이용되는 그물말 과 조류는 시료의 수집 /선별 시 단순히 건지개로만 이용해도 될 정도로 용이하여 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수집해야만 하는 다른 미세조류의 공정에 바해 저에너지 /저비용으로 시료를 공급받을 수 있으며， 세척， 탈수, 건조 및 분말화 등의 작업도 매우 간편한 장점올 가진다. 또한， 그물말 과 조류는 리그닌이 없고 탄수화물이 보통 50-70 중량 % 차지하고 있으며， 특히 발효에 가장 많이 활용되는 육탄당 (글루코오스 및 만노오스) 함량 비율이 90 중량 % 이상 차지함으로써 기타 조류 종들에 비해 매우 유리한 장점이 있다.
한편， 본 발명에 있어서， 그물말 과 조류는 생체; 건조체; 탄소수 1 내지 5의 저급 알코올로 침출 여과 후 남은 잔사물; 유기물 정제 장치를 이용하여 물， 탄소수 1 내지 5의 저급 알코을 또는 이들의 연속 용매로 추출 후 남은 잔사물; 및 유기용매를 이용하여 지질성분을 추출하고 남은 잔사물로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 흔합물을 사용할 수 있다. 보다 상세하게는， 본 발명에 적용되는 그물말 과 조류는 야외에서 직접 수집하거나, 배양과정을 통해서 얻어진 생체 또는 건조체를 고운 입자로 마쇄하여 이용할 수 있으며, 시료에 따라서는 마쇄 없이 직접 당화에 적용하여 사용할 수 있다 .
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적용되는 그물말 과 조류의 시료는 당화공정에 투입 전， 부가가치를 높이면서 고품질의 당화액을 제조하기 위하여 다음과 같이 별도의 추출과정을 거칠 수 있다. 상기 용어 "고품질" 이란 당화액 내에 6탄당 (글루코오스， 만노오스 등) 함량이 높고 발효에 저해역할을 하는 억제물질의 함량이 낮아서 발효에 적합하도록 제조된 상태를 말한다.
이를 위해 본 발명에서는 (i) 수집된 그물말 과의 생체 및 건조체 조류를 70-10W의 메탄을 또는 에탄올로 추출한 다음， 추출 후 남은 잔사 (고형분)를 고농도의 단당류의 제조에 이용하거나， (ii) 또한 생체 또는 건조체의 그물말 과의 조류를 속슬렛 장치를 이용하여 물 또는 물과 에탄을로 연속하여 추출한 다음, 추출 후 남은 잔사를 단당류의 제조에 사용하거나, 또는 (iii) 생체 ᅵ 또는 건조체의 그물말 과 (Family Hydrodictyaceae)의 조류를 유기용매 (예컨대， 클로로포름 +메탄올)를 가지고 지질성분을 추출한 다음, 추출 후 남은 잔사를 고농도의 단당류의 제조에 사용할 수도 있다.
단계 (a)의 그물말 과 조류는 바람직하게는 고형분 함량이 1一 30 중량 %이다.
단계 (a)에서 당화액 수득을 위한 그물말 과 조류의 시료 공급은 초기에 모두 공급하거나 또는 분할하여 공급할 수 있으며， 최종 공급된 고형분 함량은, 바람직하게는， 배양액 무게대비 1-30 중량%까지 투입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 단계 (a)의 당화액 수득은 ( i ) 가수분해 촉매; (ii) 다당류 분해효소; (iii) 가수분해 촉매 및 다당류 분해효소; 또는 (iv) 열수 및 다당류 분해효소를 이용하여 실시 할 수 있다. 상기 가수분해 촉매는 당업계에 공지된 다양한 가수분해 촉매를 포함하고， 바람직하게는, 황산， 염산， 브름산, 질산， 아세트산， 과염소산, 인산, 파라-를루엔설폰산 (/rtoluene sulfonic acid, PTSA) 및 고체산 (예컨대， 구연산, 옥살산， 각종 아미노산， 말레산， 프탈산， 푸마르산 및 설파민산)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 암모니아 수용액으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알칼리 촉매를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 가수분해 촉매를 이용한 당화액의 수득은, 20-200 °C의 온도에서 0.5-6시간 동안 1차 가수분해 및 2차 가수분해시킴으로써 실시한다. 예를 들어， 30°C의 온도에서 1시간 동안 1차 가수분해 후， 121°C에서 1시간 동안 2차 가수분해시킴으로써 실시한다.
또한, 본 발명에 있어서 당화액의 제조에 이용되는 다당류 분해효소는 당업계에 공지된 다양한 다당류 분해효소를 포함하고, 바람직하게는， 셀를라아제， β-글루코시다아제, β_아가라제， β_ 갈락토시다제， 엔도 -1,4- β-글루카나제， α—아밀라아제， β-아밀라아제， 아밀로글루코시다아제， 라미나린나아제， α-D-글루코시다아제, β-D- 글루코시다아제 , 수크라아제 , 말타아제， 이소말타아제 , 락타아제， 드리할라제 및 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 흔합 분해효소를 포함한다.
다당류 분해효소의 공급은 그물말 과 조류의 시료 공급 직후에 필요량 모두를 공급할 수 있으나 조건에 따라 분할하여 투입할 수 있다. 다당류 분해효소 공급 후의 온도조절은 효소 투입시기와 효소 반응 최적조건에 따라 달라질 수 있으며， 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 20-60 °C에서 0.5-5일 동안 반웅시킨다.
또한, 상기 다당류 분해효소를 이용한 당화액 수득과정은， 품질이 우수한 고농도 당화액을 제조하기 위해 효소 반웅 시 완층액 염 농도가 최소화되도록 당화를 실시하며, 바람직하게는, 증류수 또는 0.01 mM 내지 1.0 M 범위의 완층액에서 당화를 실시한다.
본 발명에서 그물말과 조류로부터의 당화액 수득은 열수 및 다당류 분해 효소를 이용하여 실시될 수도 있다. 본 명세서에서 용어 "열수 "는 80- 20(TC의 증류수를 의미한다. 바람직하게는, 열수는 다당류 분해효소를 투입하기 전에 그물말 과 조류의 시료에 가해진다. 예를 들어 , 100— 150°C의 열수를 건조시료에 흔합한 뒤 일정시간 고온처리를 한 후， 다당류 분해효소를 주입하여 가수분해 반응을 진행할 수 있다. 한편 가수분해 촉매 또는 다당류 분해효소를 이용한 당화액의 수득 과정은， 발효억제물질 생성을 최소화 하도록 실시하는 것이 바람직하다. 일반적으로 당화효율을 높이기 위해 바이오매스를 고온 /고압처리 하거나, 산 가수분해 처리를 하게 되는데 이 작업과정에서 당이 화학적 전환을 일으켜 하이드록시메틸풀푸랄 (Hydroxymethyl furfural, HMF) 및 풀푸랄 (Furfural)이 생성되고， 이는 발효 균주의 강력한 저해제로 작용하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서， 이러한 발효억제물질이 생성되는 것을 가능한 억제되는 조건 하에서 반응을 진행하여야 한다. 예컨대, 가수분해를 이용한 화학적 가수분해의 경우는 발효 억제물질 생성을 최소화하기 위해서 낮은 반웅온도와 반웅시간을 설정하는 것이 바람직하다. 하이드록시메틸풀푸랄은 C6¾03, 융점 31.5°C의 결정으로， 물, 알코올 등의 유기용매에 쉽게 용해되며, 공기, 빛에 의해 자동 산화되에색이 일어나기 쉽다. 신선식품 (fresh foods)에는 거의 함유되어 있지 않으나， 당 -함유 식품을 건조, 가열, 장기보관 증에 자연적으로 생긴다. 옥수수： 등의 당류를 약산성하에 가열함으로써 공업적으로 얻어지고ᅳ 의약, 농약의 중간체 합성에 이용되고 있다. 시험관 연구 및 마우스 실험에서 하이드록시메틸풀푸랄은 독성 및 발암 가능성이 제기되고 있지만， 아직은 인간에 있어 하이드록시메틸풀푸랄의 섭취와 질병간의 관계에 대해서. 알려진 것은 없다.
풀푸랄은 분자식 C2H202, 비점 161.8°C의 무색 액체로, 알데히드와 유사한 향기를 갖는다. 공기, 빛에 의해 자동산화되어 착색이 일어나기 쉽고， 공업적으로는 곡류의 당을 산과 가열함으로써 얻고 수지의 원료， 용제로서 사용된다. 또한 식품에 있어서 단당, 올리고당， 다당류의 가열에 의해 생성하는 휘발성 카보닐 화합물의 주성분이며， 식품의 처리, 가공 또는 저장 중 생기는 품질저하에 의한 성분변화의 지표의 하나로서 하이드록시메틸풀푸랄과 동시에 취급된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 단계 (a)에 따라 수득한 당화액은 하이드록시메틸풀푸랄， 풀푸랄 또는 이들의 흔합물이 0.07 중량 % 이하 (바람직하게는, 5% 글루코오스 함유 당화액 기준으로), 보다 바람직하게는 0.00001-0.07중량 %이다.
본 발명의 단계 (a)를 통해 수득되는 단당류는 당업계에 공지된 다양한 단당류를 포함하며, 바람직하게는， 갈락토오스, 갈락토오스 유도체 (갈락튜론산 등)， 3, 6-안하이드로갈락토오스， 크실로오스, 글루코오스, 람노오스， 크실로오스 및 만노오스로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 흔합 단당류이며, 보다 바람직하게는, 글루코오스， 만노오스 또는 이들의 흔합 단당류이다. 단계 (b): 미생물을 배양한 바이오에탄올의 제조
이어， 단계 (b)는 상기 미생물의 배양 배지에 탄소원으로써 상기 단계 (a)의 결과물을 첨가하여 바이오에탄을을 제조한다.
본 발명에서 이용되는 미생물은 바이오에탄올을 대사산물로 생성하는 어떠한 미생물도 포함한다.
본 발명의 방법이 바이오에탄을을 생산하기 위하여 실시하는 경우에는 당업계에 공지된 다양한 바이오에탄올 생성 균이 이용되며， 바람직하게는 사카로마이 ^^ Saccharomyces) 종 [예컨대， 사카로마이세스 세레비지애 ( S. cerevisiae) ]， 시조 ！ 로口}이세스 ( Schi zosaccharomyces) 종 [예컨대， 시조사카로마이세스 품브 (5. pombe)], 피키아 (/ cA/a) 종 [예컨대， 피키아 아노말라 (Λ anomala)}, 파피아 (^///s) 종 [예컨대, 파피아 패니클라타 ( pan ivu lata)], 클루이베로미세스 OT/i/jrerOTyces) 종 [예컨대， 클루이베로미세스 마르시아너스 (/f. marx/anus)], 칸디다 (Csy¾//o ) 종 [예컨대， 칸디다 크루세이 (C. kruse/)], 탈라로미세스 (7 /aro¾ es) 종 [예컨대， 탈라로미세스 이멀소니 (Γ. emersonii)}, 브레타노미세스 ( re ay¾M7j es) 종 [예컨대 브레타노미세스 브룩세렌시스 ( . bruxellensis)], 파키솔렌 (尸 a y^o/»7) 종 [예컨대, 파키솔렌 타노필러스 tannophilus) ] , 데바리오미세스 (Zfe/?arj /z7yces) 종 [예컨대， 데바리오미세스 한세니 hansenii)], 이스케리치아 0 c7er/c?/a) 종 [(예컨대, 이스케리치아 콜라이 ( . Co//)] , 및 지모모나스 ( J OT S) 종 [예컨대， 지모모나스 모빌리스 ( . mobilis)], 종으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물이고， 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 (5acc?a/ /¾ cas cerevisiae) 또는 지모모나스 모빌리스 ( . mobilis) 이며， 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 ( Saccharomyces cerevisiae) °} ^ .
단계 (b)에서 미생물의 배양은 단계 (a)에서 수득한 당화액을 이용하여 당업계에 공지된 통상적인 배양 방법에 따라 실시할 수 있다 (Kubitschek, H. E. , Introduction to Research with Continuous Cultures. Englewood Cliffs, N.J.： Prentice-Hal 1 , Inc. , 1970； Mandelstam, J. , et al. , Biochemistry of Bacterial Growth, 3rd ed. Oxford:Blackwel 1， 1982； Meyne 11 , G.G. , et al . , Theory and Practice in Experimental Bacteriology, 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press , 1970； Gerhardt , P., ed. , Manual of Methods for General Bacteriology, Washington: Am. Soc. Microbiol, 1981). 배양 과정에서 탄소원으로서의 당화액 이외에 질소원을 포함할 수 있으며, 예컨대 효모 추출액 및 펩톤을 포함할 수 있다.
본 발명의 주요한 특징 중 하나는, 본 발명의 바이오에탄올 제조방법의 단계 (a) 및 단계 (b)는 순차적으로 분리되어 진행된다. 당화 및 발효과정의 분리는 수득한 당화액을 미생물 배양에 적용하기에 앞서 순도 향상 또는 발효저해물질의 제거 등 추가적인 가공이 가능하게 함으로써 목적 유기물을 생산하는 미생물의 배양을 보다 효율적으로 달성할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 방법은 상기 (a) 단계와 상기 (b) 단계 사이에 상기 (a) 단계에서 수득한 당화액을 농축하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명에 따르면， 목적 미생물의 효율적인 배양을 위해 유용한 당이 가능한 최대로 많이 함유되면서 화학적 간섭 또는 생육억제물질이 최소화 되도록 당화에 이어 농축과정이 포함될 수 있다. 당화액의 농축은 예를 들어 원심분리 감압건조 또는 막투과증발법이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 다양한 농축방법이 이용될 수 있다. 구체적으로는, 당화한 용액을 원심분리를 통해 상등액을 취한 후, 이어 감압건조를 통해 글루코오스가 고함량으로 포함된 당화액을 수득할 수 있다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 바이오에탄올은 비식용자원을 원료로 하여 식량자원과 경쟁 위치에 있지 않으면서, 당화물 생산비용이 경제적인 바이오에탄올을 제공한다. 또한, 상기 바이오에탄올은 수송용 연료후 제공되거나 여러 가지 화학제품 생산의 원료물질로 제공되어 석유대체 화학물질 생산에 기여할 것이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 그물말 과 (Family Hydrodictyaceae) 조류와 다당류 분해효소， 가수분해 촉매 또는 다당류 분해효소 및 가수분해 촉매의 흔합물을 접촉시키는 단계를 포함하는 당화액 제조방법을 제공한다.
상술한 바와 같이， 그물말 과 조류는 생화학적 /화학적 당화가 매우 용이하고 수집 후 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 나타낼 뿐만 아니라 부산물의 배출가능성도 낮아 다양한 목적의 당화액의 수득원으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
【유리한 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 그물말 과 조류로부터의 화학물질 생산은 옥수수 및 밀과 같은 식용자원이 아닌 비식용자원인 조류 (algae)를 활용하기 때문에 바이오매스의 산업적 수요가 높아졌을 때 식품 가격 폭등 및 윤리적 문제의 발생 소지가 없고， 안정적으로 자원의 공급이 가능하다.
(b) 본 발명에 따른 그물말 과 조류는 생화학적 /화학적 당화가 매우 용이한 특징을 가져 수집 후 생체를 직접 사용할 수 있고, 건조체를 이용할 때에도 특별한 전처리 없이도 높은 당화율을 나타내며， 이는 보다 저비용으로 당화할 수 있는 경제성 뿐 아니라 당화공정시 환경오염물질 배출가능성도 낮아 향후 산업바이오화학제품 생산에 크게 기여할 것이다.
(c) 본 발명에 따라 제조된 바이오에탄을은 수송용 연료로 제공되거나 여러 가지 화학제품 생산의 원료물질로 제공되어 석유대체 화학물질 생산에 기여할 것이다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 제조방법에 따른 그물말 과 조류를 이용한 고농도의 단당류를 수득하고 이의 당화액으로부터 발효를 통해 바이오에탄올을 생산하는 방법에 대한 공정을 모식화한 것이다. 도 2는 고농도 그물말 고형분의 2차 가수분해 시 글루코즈 생성량 및 기대치을 나타내는 그래프이다. 도 3은 HR 당화액을 이용한 바이오에탄을 생산성에 있어서 세가지 바이오에탄올 생산균주의 생산성 차이를 나타낸 그래프로서 SC7017, ZM1534, SC7928은 각각 사카로마이세스 세리비시에 ccAsrOTyces cerevisiae CTC7017, 자이모모나스 모빌리스 C o/ ?77as mobilis subsp . mobilis CTC1534)， 사카로마이세스 세리비시에 ( Saccharomyces cerevisiae KCTC7928) 미생물 균주를 나타낸다. 도 4는 네가지 가수분해 (당화) 방법에 따른 바이오에탄올 생산성 및 환원당 전환율을 나타낸 그래프이다. 여기서 HE는 효소가순분해， HA는 산가수분해, HC는 산+효소가수분해, HWC는 열수 +효소가수분해를 의미한다. 【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 " "는 별도의 언급이 없는 경우, 고체 /고체는 (중량 /중량) , 고체 /액체는 (중량 /부피) , 그리고 액체 /액체는 (부피 /부피) %이다.
사전 실험결과， 수집된 담수조류 중 그물말 과의 대표적인 히드로딕티온 쏙 {HydrocHctyon sp.) 그물말에 대하여 총탄수화물의 상대적 함량 비율을 조사해 볼 때, 생육단계 및 배양 환경에 따라 다소 변화가 있지만 대략 건물중을 기준하여 50-65% 이고， 가수분해 후 얻어진 그물말의 주요 당성분은 글루코오스 및 만노오스였다. 즉 총탄수화물이 64.6%이었던 그물말 시료를 가지고 효소가수분해를 통해 얻어진 글루코오스 및 만노오스의 함량은 건조된 바이오매스 100 g 당 46.82 ±0.46 g 및 10.56士 0.48 g로서 효소가수분해에 의한 육탄당 (글루코오스 +만노오스) 수득율은 총탄수화물 기준 88.8%, 바이오매스 건물증 기준 57.4%였다. 이는 미세조류로부터의 당생성율에 있어서 '현재까지 보고된 결과들 증에서 매우 높은 수준이다. 그리고 이러한 결과는 그물말 시료가 발효용, 바이오리파이너리 또는 바이오에너지용 바이오매스로서 매우 우수한 품질의 재료가 될 수 있음을 의미하는 바, 그 이유는 대부분의 상업용 발효균주는 오탄당보다 육탄당을 잘 이용하며 육탄당 중에서도 글루코오스가 다량 함유된 시료를 가장 선호하기 때문이다.
또한 그물말과 조류는 다른 조류들에 비해 온화한 조건에서도 상대적으로 당화가 매우 잘되는 특징을 가지고 있다 (한잡초지 32:85-97, 2012). 따라서 그물말과 조류로부터 바이오연료 또는 바이오화학제품 생산의 원료물질이 되는 바이오에탄을을 보다 경제적으로 생산하는 제반 기술을 확립하는 것은 산업적으로 매우 중요한 일이 된다. 실시예 1: 저농도 고형분 함량 (0.34% S/L)에서의 산 가수분해에 따른 그물말로부터의 글루코오스 생산
그물말의 산가수분해에 따른 글루코오스 생성정도를 알아보기 위하여 실험하였다.
식물재료는 45°C에서 1일 건조된 그물말 시료를 분말화 하여 1-2 腿 체에 통과하였다. 물 추출성분이 제거된 고형분 (Water-extractive free solid; WEFS)과 물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분 시료는 (Water & ethanol-extractive free solid; EFS) 다음과 같이 제조하였다: 물 추출성분이 제거된 고형분 (WEFS) 제조의 경우， 2 g의 건조 분말시료를 심블 (thimble, 28x100 匪)에 넣고 190 m의 물을 이용하여 25CTC에서 약 8시간 추출한 다음， 잔사를 취하여 45°C에 1일 동안 건조시켜 조제하였다. 물 및 에탄올 추출성분이 제거된 고형분 (EFS) 제조의 경우는 2 g의 건조 분말시료를 심블 (thimble, 28X100 誦)에 넣고 190 m£의 물을 이용하여 25C C에서 약 8시간 추출한 후， 이를 다시 190 ιη^ 에탄올로 150°C에서 3- 4시간 추출한 후, 잔사를 취하여 45°C에 1일 동안 건조시켜 조제하였다. 산 가수분해는 상기와 같이 준비된 건조분말시료 (분말, WEFS 및 EFS)
0.3 g을 취한 다음 Ί2 황산 3 ^를 넣고, 30°C 항온기에 1시간 두었다가 (1차 가수분해, 5-10분 마다 교반)， 이후 증류수를 가하여 1-4%로 회석한 다음 마개를 한 후， 위 아래로 흔들어 흔합시켜 121°C에서 1시간 가수분해하였다 (2차 가수분해). 그 후 가수분해물을 탄산칼슘 (calcium carbonate)으로 중화하였다.
중화된 그물말 가수분해물을 막여과 및 원심분리한 후， 고성능 액체크로마토그래피 분석 (디텍터: 코로나디텍터, Corona detector)을 실시하였다. 글루코오스 정량을 위해서 글루코오스 표준곡선과 동일조건에서의 글루코오스 손실률 (loss factor)을 구하여 환산해 주었다. 상기 시료에 대해 산 가수분해 후 생성된 글루코오스 함량을 분석한 결과, 하기 표 1에서 확인할 수 있듯이 속슬렛 추출을 하지 않은 시료는 건조물 100 g당 38.22 g의 글루코오스를 생성하였고, 물 추출성분이 제거된 고형분 (WEFS), 물 및 에탄을 추출성분이 제거된 고형분 (EFS)은 각각 56.35 g 및 53.72 g의 글루코오스 생성량을 나타내었다.
추출 후 남은 잔사 (WEFS 및 EFS)가 무처리의 경우 보다 글루코오스의 함량 높은데, 이는 추출물이 제거된 상태에서 셀를로오스 성분을 가진 조직이 상대적으로 높게 포함되었기 때문이다 (표 1).
【표 1】
Figure imgf000016_0001
한편， 바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 고농도 당용액을 제조하여 생물학적 전환을 위한 발효용 기질로서 제공하여야 한다. 이때 중요하게 고려되어야 할 사항은 발효에 유용한 당이 가능한 한 최대로 많이 함유되면서 발효균주의 생육을 저해하는 물질이 최소화되어야한다. 그런데 일반적으로 당화효율을 높이기 위해 바이오매스를 고온 /고압처리 하거나， 산 가수분해 처리를 하게 되는데 이 작업과정에서 당이 화학적 전환을 일으켜 하이드록시메틸풀푸랄 (Hydroxymethyl furfural, HMF) 및 풀푸랄 (furfural )이 생성되고， 이는 발효균주의 강력한 저해제로 보고되고 있다 . 따라서 산 가수분해하는 과정에서 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄이 어느 정도 생성되는지를 알아보고 발효균주의 억제여부를 예측해 보고자 실험하였다.
발효억제물질의 분석은 고성능 액체크로마토그래피 (Waters, 미국)로 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄을 정량하였다. 컬럼은 Comosil 5C18-MS- 11(4X150 mm)을 사용하였고， 이동상은 100% 증류수 (펌프 A)와 100% 메탄올 (펌프 B)로 시간별 구배를 두었으며, 유량은 0.6 m£/min, 측정 파장은 280 ran이었다.
그 결과， 물 및 에탄올 추출 후 남은 잔사 시료 (EFS)를 고압멸균기에서 산 가수분해 한 경우, 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 생성량이 각각 건조물 1 g당 3.8 mg 및 3.3 mg으로서 하이드록시메틸풀푸랄이 풀푸랄보다 약간 높게 생성됨을 확인할 수 있었다. 이를 근간으로 그물말 건조시료로부터 산 가수분해를 통해 5 » 글루코오스 함량의 당농축액을 제조했을 때 포함될 수 있는 퓨란 유도체 총량은 약 0.07%가 되는 것으로 추측할 수 있었고, 이는 보고된 문헌올 통해서 볼 ^ UJ/neic/a. Appl. Microbiol. Biotechnol, 82:625-638(2009)) 발효균주를 심하게 억제하지는 않을 것으로 판단되었다. 실시예 2: 효소가수분해 ί· 통한 당화액 제조
그물말 시료에 대해 고형분 함량에 따른 당화 및 글루코오스 생성 패턴을 파악하여 여러 농도의 당화액을 제조하기 위하여 실험하였다.
식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45°C에서 컨벤션 오븐에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다 (HR-d23 및 HR— d31). 본 시료는 글루코오스 함량이 각각 35% 및 45% 내외 함유되는 것으로 조사되었다.
250 li^ 삼각 플라스크에 상기 건조시료를 고형분 함량이 2-10%(w/v) 되도톡 넣고 0.05 M 시트레이트 완층액 (pH 4.8) 23.9 mi 및 1% NaN3 1.1 ^를 가한 다음， 120°C에서 20분 고압살균하였다.
무균상에서 효소용액을 고형분 함량에 비례하여 가하였는바， 사용된 효소량은 E1 + E2를 건조물 1 g당 0.2 + 0.04 수준이었다. 이때 사용된 효소는 셀를라아제 (Celluclast Cone BG, Novozymes사 제품， 5배 희석하여 사용, 하기 Έΐ' 으로 표시) 및 β-글루코시다아제 (Sigma C6105, 하기 Έ2' 로 표시)이다. 이후 50°C, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고， 당화액내의 글루코오스 생성정도를 생화학 분석기 (YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT)로 분석 및 정량하였다. 아울러 동일 시료에 대해 환원당 함량을 보고된 방법에 (T. Matrai et al . Inter. J. Food. Microbiol. 61:187-191， 2000) 따라 분석하였다.
그 결과, 그물말 건조시료의 고형분의 함량이 6% 될 때 까지는 어떠한 장애 없이 2% 고형분 함량에서와 비슷한 글루코오스 생성량을 나타내었지만 8-10% 고형분 함량에서는 '이보다 약간 낮은 당화율을 나타내었다 (표 2 및 표 3). 그러나 2% 고형분 처리구의 87—93% 정도는 글루코오스가 생산되었기 때문에 산업공정상의 경제적 측면으로 볼 때에 큰 차이가 없을 것으로 판단되었다. 결국 HR-d23 및 HR-d31의 10%(w/v) 고형분 함량 시료를 가지고 효소가수분해 할 때， 농축과정 없이도 각각 3.3 및 4.0% 내외의 글루코오스 당용액 (환원당 기준으로 볼 때는 4.4 및 5.1% 당용액)을 생산할 수 있었다 (표 2 및 표 3). 이는 목질계 바이오매스로부터 얻어지는 1차 당화액의 당농도가 보통 1-2%인 것에 비해 훨씬 효율이 높은 생산성을 보인다. 표 2는 그물말 시료로부터 효소가수분해를 통해 얻어진 글루코오스 함량을 나타낸 것이고， 표 3은 그물말 시료로부터 효소가수분해를 통해 얻어진 환원당 함량을 나타낸 표이다.
Figure imgf000018_0001
【표 3】
Figure imgf000019_0001
아울러 실시예 1에서와 같은 방법으로 상기 효소가수분해 한 그물말 시료를 가지고 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄이 어느 정도 생성되는지를 알아보고 발효균주의 억제여부를 예측해 보고자하였다.
고형물 함량이 2-10¾(w/v)이 되도록 하여 효소당화시킨 시료의 퓨란 유도체를 분석한 결과, 하기 표 4에서도 확인할 수 있듯이, 하이드록시메틸풀푸랄은 미량 검출되었으나 풀푸랄은 검출되지 않았다.
상기의 결과를 바탕으로 그물말 건조시료로부터 10% 글루코오스 함량의 당농축액을 제조했을 때 포함될 수 있는 하이드록시메틸풀푸랄의 농도가 15-28.3 ppm (0.12-0.23 mM)임을 확인할 수 있었다 (표 4). 보고에 의하면 하이드록시메틸풀푸랄의 경우 대장균 (Escherichia coli, E. coli)에 대해 0.265% 농도에서 50% 생육을 저해하고， 기타 균주에 대해서 0.1- 0.5%에서 저해하는 것으로 보고된 바 (Almeida. Ap l . Microbiol. Biotechnol, 82： 625-638(2009) ) , 이에 준하면 본 그물말 유래 당용액 (10% 글루코오스 함량)은 하이드톡시메틸풀푸랄의 생육저해활성 농도 보다 50배 이상 낮게 함유되어 있기 때문에 발효균주를 전혀 저해하지 않음을 예측할 수 있었다. 표 4의 고형분 함량은 효소가수분해가 48시간 동안 50°C, 150 rpm 회전배양조건에서 진행되었으며， ND는 'Not Determined'를 의미한다. 【표 4】
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실시예 3: 고농도 그물말 고형분에 따른 당화액 제조
당함량이 높으면서 발효억제물질이 낮은 소위 "고품질 당용액" 을 경제적으로 얻기 위해서는 우선 고농도 고형분함량을 가지고 당화할 수 있어야 하며 이후 당화율이 높으면서 당화시간이 짧은 공정을 개발하는 것이 필요하다. 그런데 일반적으로 고농도 고형분 함량에서의 가수분해는: 여러 원인에 의해 당화율이 감소된다. 본 실시예에서는 열 (heat) 및 효소가수분해를 겸용함으로서 그물말 시료 고농도 함량을 가지고 보다 효율적으로 당화액을 생산하는 방법을 개발하고자 실험하였다.
식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45°C에서 컨벤션 오본에 1일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다 (HR-d23 및 HR-d31). 본 시료는 글루코오스 함량이 각각 35% 및 45% 내외 함유되는 것으로 조사되었다.
125 삼각 폴라스크에 상기 건조시료 5 g 및 20 iwl 증류수에 넣어 25%(w/v) 고형분 함량이 되도록 한 다음 121°C에서 20분 고압살균하였다. 그 후 NaN3가 포함된 0.顶 시트레이트 버퍼 (1% NaN3 8.4 ml 및 버퍼 91.6 mi, pH 4.8) 23.88 ^를 주입한 다음， 1M HC1 용액을 가하여 pH를 4.8- 5.0으로 조정해 주었다. 효소는 셀를라아제 (Celluclast Cone BG, Novozymes사 제품， 5배 회석하여 사용， 하기 'E1' 으로 표시) 및 β- 글루코시다아제 (Sigma C6105, 하기 Έ2' 로 표시)를 사용하였다. 무균상에서 이들 시료에 여러 농도의 효소용액 El + E2(5:l)를 가하였는바， 사용된 효소량은 (E1+E2) 건조물 1 g당 0.02-0.2 + 0.004-0.04 ιιι^ 수준이었다. 이후 5()°C, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해하고， 당화액내의 글루코오스 생성정도를 생화학 분석기 (YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT)로 분석 및 정량하였다. 아을러 동일 시료에 대해 환원당 함량을 보고된 방법에 (T. Matrai et al . Inter. J. Food. Microbiol. 61:187- 191(2000)) 따라 분석하였다.
그 결과， 공급된 효소량이 그물말 건조시료 g당 0.12 mi 미만으로 낮을 때는 당생성 정도도 낮고 생성 속도도 늦어 2일간 당화를 하여야 했으나 효소량이 0.12 이상일 때는 당화가 24시간 반옹으로 거의 종료되었고 효소량이 0.24 처리된 것과 당농도의 차이가 없었다. 즉 본 방법을 통해서도 농축과정 없이 HR-d23 및 HR-d31 시료를 가지고 각각 3.1 및 4.2% 내외의 글루코오스 당용액 (환원당 기준으로 볼 때는 3.8 및 5.0% 당용액)을 생산할 수 있었다 (표 5). 그리고 효소량을 초기 결정농도의 절반으로 감소시켜도 당화에는 큰 지장이 없었으며， 보다 고농도의 고형분 함량을 (25% S/L) 한꺼번에 고압멸균 할 수 있어 보다 경제적인 당화공정을 수립할 수 있을 것이다. 표 5는 고농도 그물말 시료로부터 (25% 고형분) 여러 농도의 가수분해효소 처리를 통해 얻어진 글루코오스 및 환원당 함량 변화를 보여준다. HAI는 접종 후 시간 (Hour after incubation)을 나타낸다.
【표 5]
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실시예 4: 고농도 그물말 고형분에서의 산가수분해를 통한 당용액 제조
바이오매스 가수분해 방법 중에서 효소가수분해는 산가수분해에 비해 비용이 높은 것으로 알려지고 있다. 본 실시예에서는 산가수분해만을 통해 그물말 시료를 효율적으로 가수분해 할 수 있는 보다 효율적인 방법 및 최적조건을 알아보기 위해 실험하였다.
온실조건에서 재배하여 수확한 HR을 건조시켜 분말로 만든 다음 이를 실험재료로 사용하였다 (HR-dl3). 산 가수분해를 위해 사용된 산은 황산 및 염산이며 가수분해 방법 및 조건 (고형분 함량， 산농도， 온도 및 시간 등)은 결과에 제시될 것이다. 산가수분해 효과를 알기 위해서 가수분해물 내의 글루코오스, 환원당, 하이드록시메틸풀푸랄 (HMF) 및 풀푸랄 함량을 실시예 1 및 실시예 2에서와 같은 방법으로 조사하였다.
사전 실험에서 실용적으로 의미가 있는 고형분 함량 (2% w/v 이상)에서의 산 농도별 및 반웅온도별 산가수분해 효과를 실험한 결과, 2 ) 산농도에서 120°C, 1시간 반응의 경우 가장 바람직하였다. 그리하여 그물말 (HR dl3) 2-8% 고형분 함량에서 2% 황산으로 산가수분해 (1단계 가수분해, one-step hydrolysis)를 실시하였다. 그 결과 표 6에서와 같이 고형분 함량 증가에 따른 글루코오스 생성량에는 큰 차이가 없었으나 4% 고형분 함량에서의 글루코오스 생성량이 27.4 g/100g DW로 가장 높은 경향을 나타내었다. 그러나 본 방법에 의해서는 효소당화 방법 (고형분 함량이 2% 및 8 ) S/L 이었을 때 생성된 글루코오스 함량이 각각 40.8 ±2.52 및 37.47±0.31 g/100g DM 이었음)보다 상당히 낮은 결과를 보여주어 산가수분해 자체만으로는 당화율이 효소당화의 73% 정도에 그치는 경향이었다. 【표 6]
Figure imgf000023_0001
이를 개선하기 위해 2단계 가수분해 (two-step hydrolysis)를 검토하였다. 즉 여러 무게의 그물말 건조시료에 72% 황산 1 11 을 넣고 30°C에서 1시간동안 1차 가수분해 한 후 24 증'류수를 가한 다음 120°C에서 1시간 반웅하였다. 그 결과 기대수치에는 미치지 못하지만 4% 고형분 함량까지는 글루코오스 생성량이 29.3 g/100g DM 이상으로서 1단계 가수분해에 비해 당화가 더 잘 이루어졌다 (도 3).
상기 2단계 가수분해를 보다 최적화시키기 위하여 그물말 고형분 함량을 4% (w/v)로 고정시키고 1차 가수분해시의 산처리 부피 및 온도를 조정하였다. 그 결과 1차 가수분해 시 HR 건조중 :72% 황산의 비를 1 g : 1.5 m£로 하여 60°C에서 1시간 동안 반웅시킨 다음， 증류수 23.5 ^를 가한 후 4% 고형분 함량에서 120 °C 1시간 가수분해하면 가장 바람직한 결과를 얻게 되었다 (표 7). 이 경우 1.1— 2.2%의 글루코오스 및 1.8-2.9%의 환원당 함량을 가진 당용액을 얻을 수 있었 HR 건물중 기준으로 볼 때 30-35%가 글루코오스로 5으54%가 환원당으로 전환될 수 있는 조건이었으며 (고형분 함량을 낮추어 최적 조건에서 산가수분해 했을때의 85-90% 수준임), 이 때 생성되는 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 함량은 227.5 mg/L 및 40 mg/L 이하 수준이었다 (표 7). 한편 HR-C113의 효소당화의 경우, 고형분 함량이 2% 및 8> S/L 이었을 때 생성된 글루코오스 함량이 각각 40.8±2.52 및 37.47±0.31 g/100g DM 이었는데 결국 4% 고형분 함량에서 당화시킬 경우 (2차 가수분해 기준)， 산가수분해만을 통해서도 글루코오스를 효소당화의 90-95%까지 수득할 수 있기 때문에 본 공정은 저비용 당화액 조제에 층분히 적용될 수 있을 것으로 보여졌다. 【표 7]
Figure imgf000024_0001
실시예 5: 고농도 그물말 고형분에서의 흔합가수분해를 통한 당용액 제조 당함량이 높으면서 발효억제물질이 낮은 소위 "고품질 당용액" 을 경제적으로 얻기 위해서는 우선 고농도 고형분함량을 가지고 당화할 수 있어야 하며 이후 당화율이 높으면서 당화시간미 짧은 공정을 개발하는 것이 필요하다. 그런데 일반적으로 고농도 고형분 함량에서의 가수분해는 여러 원인에 의해 당화율이 감소된다. 본 실시예에서는 산 (acid) 및 효소가수분해를 겸용함으로서 그물말 시료 고농도 함량올 가지고 보다 효율적으로 당화액을 생산하는 방법을 개발하고자 실험하였다.
식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를 45°C에서 컨벤션 오븐에 2일 동안 건조시킨 후 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다 (HR— d23). 본 시료는 글루코오스 함량이 35% 내외 함유되는 것으로 조사되었다.
125 ml 삼각 플라스크에 상기 건조시료 5 g을 2% 염산 20 에 넣어
25%(w/v) 고형분 함량이 되도록 한 다음 121°C에서 20분 고압살균하였다. 그 후 NaN3가 포함된 0.1M 시트레이트 버퍼 (1% NaN3 8.4 + 버퍼 91.6 ml, pH 4.8) 23.88 ^를 주입한 다음, 10N NaOH 용액을 가하여 pH를 4.8- 5.0으로 조정해 주었다. 효소가수분해를 위해 사용된 효소는 셀를라아제 (Celluclast Cone BG, Novozymes사 제품, 5배 희석하여 사용, 하기 ΈΙ' 으로 표시) 및 β-글루코시다아제 (Sigma C6105, 하기 Έ2' 로 표시)이다. 무균상에서 시료에 여러 농도의 효소용액 El + E2(5:l)를 가하였는바， 사용된 효소량 (E1+E2)은 건조물 1 g당 0.02-0.2(E1) +0.004— 0.04(E2) ml 수준이었다. 이후 5( C , 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고， 당화액내의 글루코오스 생성정도를 생화학 분석기 (YSI Incorporated, YSI 2700 SELECT)로 분석 및 정량하였다. 아울러 동일 시료에 대해 환원당 함량, 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 함량을 실시예
1 및 실시예 2에서와 같은 방법으로 조사하였다.
그 결과 24시간 반응까지는 증류수보다 약산처리 이후 효소처리한 샘플에서 글루코오스의 생성량이 높게 나타났다. 그러나 48시간 반웅의 경우는 E1+E2 효소처리량이 g 건물중당 0.06 이하에서만 대조구 (증류수 처리)보다 약산처리에서 글루코오스 생성량이 높게 나타났고 효소처리량 0.12 mi 이상에서는 두 처리 간에 차이가 없었다 (표 8). 이는 약산처리로 인해 보다 적은 효소량으로 보다 빨리 당화시킬 수 있음을 나타낸다. 특히 약산처리된 시료의 당화는 효소 첨가량에 관계없이 24시간이면 당화가 거의 종료되는 특징을 보였다 (표 8). 그리고 24시간 반웅한 당화액 내의 글루코오스 및 환원당 농도는 각각 3.4-3.6% 및 5.2-5.4%로， 효소가수분해만을 실시했던 것과 비교하여 유사하거나 오히려 높은 결과를 ¾ 보여주었다 (표 9). 그런데 HR-d23보다 탄수화물함량이 높은 시료 (예, HR- d31)를 가지고 당화시킬 경우는 이보다 더 높은 당농도의 당화액을 얻을 수 있을 것이다.
한편 당화액내의 하이드록시메틸풀푸랄 및 풀푸랄 농도를 조사하였다. 효소처리량에 상관없이 하이드록시메틸풀푸랄 농도는 0.016-0.018% 정도였고, 풀푸랄 함량은 이보다 훨씬 낮은 0.0015-0.0022%를 나타내었다 (표 10). 이는 2단계 산 가수분해에서 HMF가 0.022% 이었던 것보다 낮은 수치이며 (실시예 4) 보고에 의하면 하이드록시메틸풀푸랄의 경우 대장균 (fec¾e/ 7/a coli, Ε. 에 대해 0.265% 농도에서 50% 생육을 저해하고， 기타 균주에 대해서 0.1-0.5%에서 저해하는 것으로 보고된 바 (Almeida. Appl . Microbiol. Biotechnol, 82:625-638(2009)), 이에 준하면 본 방법의 그물말 유래 당용액은 하이드록시메틸풀푸랄의 생육저해활성 농도 보다 50배 이상 낮게 함유되어 있기 때문에 발효균주를 저해하지 않을 가능성이 매우 높음을 예측할 수 있었다.
따라서 약산과 효소가수분해를 겸용하는 본 방법은 2 고형분 함량 조건에서 당화수득율의 감소 없이 보다 빠르게 시료를 당화시키면서 고품질의 당화액을 얻을 수 있는 유용한 방법임올 확인할 수 있었다. 【표 8】
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
【표 10】
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실시예 6: 다른 형태의 그물말 고형물로부터 당농축액 생산
바이오매스 기원 당용액으로부터 화학제품 원료물질을 생산하기 위해서는 고농도 당용액올 제조하여 생물학적 전환용 기질로서 제공하여야 한다.
이를 위해서는 유용한 당이 가능한 최대로 많이 함유되면서 화학적 간섭 또는 생육억제물질이 최소화되도록 조제하는 기술이 확보되어야 한다. 본 실시예에서는 몇 가지 처리된 그물말 시료를 가지고 당화 및 농축과정을 통해 고농도 당용액을 제조하는 방법을 실험하고자 하였다.
식물재료는 온실에서 배양한 그물말을 수확하여 탈수시킨 다음 이를
45°C에서 컨벤션 오본에 1일 동안 건조시킨 후, 믹서기로 분쇄하여 잘게 부서진 상태의 분말을 실험재료로 사용하였다 (HR-d2 및 HR-dl6).
당농축액 제조는 그물말 건조시료， 물 추출물이 제거된 잔사 (WEFS) 및 물 /에탄올 추출물이 제거된 잔사 (EFS)를 가지고 제조하였다. 물 및 에탄올로의 추출은 실시예 1에서와 같았다.
상기와 같이 조제된 건조분말시료 (분말， WEFS 및 EFS)를 가지고 당화액올 제조하기 위해서는 건조시료 (6 g)를 500 mi 삼각 플라스크에 넣고 0.05 M 시트레이트 완층용액 (pH 4.8) 100 ^올 가한 다음, 120°C에서 20분 고압살균 하였다. 사용된 효소는 셀를라아제 (Celluclast Cone. BG.， Novozymes사 제품， 5qo 회석하여 사용, 하기 Έΐ' 으로 표시) 및 β- 글루코시다아제 (Sigma C6105, 하기 Έ2' 로 표시)이다. 무균상에서 여과멸균된 당화효소 E1 + E2 용액을 각각 건조물 1 g 당 0.2+0.04 ml 양으로 가한 후 50°C, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 하였다. 당화가 끝난 시료는 원심분리를 (8000 rpm, 20분) 통해 1차 상등액을 취하고， 이어 멸균수를 넣고 부유시킨 다음 동일한 조건으로 원심분리하여 2차 상등액을 취하였다. 1차 및 2차 상등액을 수집하여 흔합한 다음 적당량의 알코을을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다. 당농축액 내의 글루코오스 함량은 시료를 증류수에 희석하여 생화학 분석기 (YSI 2710)로 분석 및 정량하였다.
그 결과， HR-dl6 건조시료의. 양을 6¾)(w/v)로 하여 당화시킨 다음 이로부터 당농축액을 제조할 경우, 120 g의 건조 HR에서 약 133.8 g의 당농축액을 얻을 수 있었다. 이에 동일 무게의 멸균수와 흔합하여 글루코오스 함량이 15.6%인 당농축액을 제조할 수 있었다. 한편 WEFS 및 EFS 48 g을 동일한 방법으로 조제하였을 때 약 40g 내외의 당농축액을 얻을 수 있었고 아를 동일 무게의 멸균수와 흔합하여 얻어진 당용액 (약 70 )의 글루코오스 함량은 각각 15.8 및 18% 정도였다 (표 11). 이는 WEFS 및 EFS를 이용했을 때 직접 분말화한 건조시료보다 약간 더 높은 고농도 당용액을 제조할 수 있음을 시사해 주지만 물 /에탄올 추출 경비 등올 고려하면 그 효과가 낮을 수 있지만 물 /에탄올 추출물이 어떤 용도가 있을 경우엔 본 방법도 매우 유용하리라 여겨진다. 한편 물 /에탄을 추출물 제거 없이 직접 분말화한 그물말과 시료를 가지고 당용액을 조제하여도, 적어도 글루코오스 함량이 10% 이상이 되면서 발효에 직접 적용할 수 있는 정도의 용액을 손쉽게 확보할 수 있음을 확인할 수 있었다.
【표 11】
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한편 대량의 당화액 생산을 가정해서 보다 효율적으로 당농축액을 얻고자 1차적으로 당화액내의 물을 여과하는 방안을 검토하였다. 즉, HR- d23 건조시료 6 g을 500 1 삼각 플라스크에 넣고 50 mM 시트레이트 버퍼 (pH 4.8) 100 ^을 가한 다음, 120°C에서 20분 동안 고압살균하고ᅳ 상기와 같은 방법으로 당화를 실시한 후 원심분리를 통해 당화액올 수득하였다. 수회 실험을 통해 모은 당화액 (MFHS 라고 명명함) 10.6 L를 4 " PVDF 증공사 모들을 통해 여과하여 일부 물을 제거시킨 것을 위에서와 같이 적당량의 알코을을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조시켰다. 그 결과 초기 당화액 (글루코오스 함량 1.14%)을 중공사 모들로 여과했을 때의 글루코오스 함량은 2.14%로서 약 2배로 농축되었고 여과된 용액 내의 당함량은 거의 무시할 정도였다. MFHS 1차 농축액 2， 500 만을 취하여 감압건조기를 사용하여 추가 농축한 결과， 완전 농축시 128.5 g 얻어졌으며 여기에 동일 무게의 멸균수를 넣어 섞어준 다음 (총 257.0 g) 발효용 당용액을 조제하였는 바 (MFHS 2차 농축액)， 이때의 글루코오스 함량은 13.5±1.6%(w/w) 이었다. 따라서 본 방법을 통해 대량의 당화액을 적어도 글루코오스 함량이 10% 이상이 되면서 발효에 직접 적용할 수 있는 정도의 당농축액을 보다 빠르게 확보할 수 있음을 확인할 수 있었다. 실시예 7: 그물말 조류로부터 글루코오스 고함유 당용액 HRHS-3 및 HRHS-7 조제
온실에서 배양된 그물말 과 조류 건조분말시료 (HR-d7)를 가지고 보다 높은 용량과 낮은 완층용액강도 (buffer strength) 하에서 당화액을 제조하기 위해서 건조시료 (40 g)를 2000 ni^ 삼각 플라스크에 넣고 0.1 mM 시트레이트 완층용액 (pH 4.8) 500 ^를 가한 다음, 120t;에서 30분 고압살균 하였다. 사용된 효소는 셀를라아제 (Celluclast 1.5 L, Novozymes사 제품, 하기 ΈΙ' 으로 표시)， β-글루코시다아제 (Sigma C6105 하기 Έ2' 로 표시)， α-아밀라아제 (Sigma A8220 , 하기 Έ3' 로 표시) 및 아밀로글루코시다아제 (Sigma A7095, 하기 Έ4' 로 표시)이다. 무균상에서 여과멸균된 당화효소 E1 + E2 + E3 + E4 용액을 각각 건조물 1 g 당 0.2， 0.04, 0.2 및 0.2 ^양으로 가한 후 50 °C, 170 rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시켰다.
당화가 끝난 시료는 원심분리를 (8000 rpm, 40분) 통해 1차 상등액을 취하고 이어 멸균수를 넣고 부유시킨 다음 동일한 조건으로 원심분리하여 2차 상등액을 취하였다. 1차 및 2차 상등액을 모아 흔합한 다음 적당량의 알코을을 가하면서 감압건조기로 물 및 용매를 건조하였다. 당농축액 내의 글루코오스 함량은 시료를 증류수에 회석하여 생화학 분석기 (YSI 2710)로 분석 및 정량하였다.
그 결과， HRHS7의 경우 총 120 g의 건조 그물말에서 약 250 g의 당농축액을 수득할 수 있었고, 대략의 글루코오스 함량은 13.9% 정도였다. 실시예 8: 미생물간의 바이오에탄을생산성 차이
완전 정제를 통해 당성분만 분리하지 않는 이상, 발효용 당용액의 조성은 바이오매스의 종류에 따라 다르며 특히 발효에 영향을 미치는 특정 성분이 특정 바이오매스에 존재할 가능성이 있고 이에 대한 반웅은 미생물 종에 따라 다를 수 있다. 따라서 바이오매스 유래 당용액을 가지고 발효를 실시할 경우엔 각각의 경우를 모두 조사하여 바이오에탄올 생산에 있어 최적의 효율을 가지는 미생물을 발굴하는 것이 필요하다. 본 실시예에서는 바이오에탄을생산에 많이 사용되는 미생물 균주간에 HR 당용액에 대한 바이오에탄을 생산성 차이가 있는지를 알아보고자 하였다. 본 실시예에서 사용한 균주는 2계통의 사카로마이세스 λ\] a) ΰ] Λ] Ο] ( Saccharomyces cerevisiae KCTC7017, Saccharomyces cerevisiae KCTC7928)와 자이모모나스 모^리스 (Zymo/ nas mobilis subsp. mobilis KCTC1534)로서 총 3종을 사용하였다. HR 당화액 준비는 실시예 2와 같이 실시하였다. 바이오에탄올 생산을 위해서는 HR 당화용액과 효모 추출물 20 g + 펩톤 10 g/lL 흔합 배지를 121 °C에서 20분동안 각각 멸균한 후 이들을 흔합하였다 (최종 부피 50mL). 30°C에서 20시간 사전 전배양한 바이오에탄올 생성 균주를 멸균된 배지에 2. U 접종하고 N2 가스를 10분 동안 주입하여 산소를 제거시킨 후 120rpm, 30°C에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 8000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 얻은 상징액을 가지고 에탄올 분석을 하였다. 에탄올 분석은 Megazyme ethanol KIT를 사용하여 증류수 1 ml 에 시료 0.05 ml를 넣을 후 피로포스페이트 완층액 0.1 ml, NAD+ 0.1 ml, 알데하이드 디하이드로게네이즈 0.01 ml를 첨가하여 2분 동안 반웅 시킨 다음 340 nm에서 흡광도를 측정하였다 (A1). 또한 알코을 디하이드로게네이즈를 첨가하여 5분 동안 반응 시킨 후 340nm에서 흡광도를 측정하여 (A2) 제시된 계산법에 의하여 에탄올을 정량하였다 (Megazyme Ethanol Assay Procedure K-ETOH 02/11).
그 결과 도 3에서 보는 바와 같이 3가지 균주 모두에서 우수한 에탄올 생산성 (ll-12g/L)을 나타내었다. 따라서 HR 당화액은 다양한 바이오에탄올 생산 균주에 대해 적용이 가능함을 확인하였다. 실시예 9: Saccharowyces cerevisiae 7017 균주를 이용한 그물말 당화액으로부터의 바이오에탄을 생산
1. 그물말 당화방법간의 바이오에탄올 생산성 비교
실용화를 위한 바이오매스 당화 (가수분해) 최적조건은 바이오매스의 물리화학적 성질에 따라 다르다. 그리고 얻어진 당화액은 발효가 잘 되어야 함으로 궁극적으로 당화와 발효가 효율성과 경제성 측면에서 잘 연계될 수 있도록 기술을 확립하는 것이 중요하다. 본 실시예에서는 HR의 가수분해 (당화)를 보다 저비용으로 수행함과 동시에 발효에도 보다 유용한 당화 (가수분해)방법을 탐색하고자 여러가지 HR 당화방법 간의 당화효율 및 바이오에탄을 생산성을 실험하였다.
(1) 재료 및 방법
온실조건에서 재배하여 수확한 HR-d23-26올 건조시켜 분말로 만든 다음 이를 실험재료로 사용하였다. 가수분해 방법으로서 4가지를 선정하여 아래와 같이 실시하였으며 가수분해 효과를 알기 위해서 가수분해물 내의 글루코오스 환원당， HMF 및 풀푸랄 함량을 조사하였고, 실제 발효에 미치는 효과를 비교하기 위하여 바이오에탄올 생산성 발효실험을 실시하였다. 가수분해 (당화) 방법
0. 효소가수분해 (HE): HR 건조분말 6g을 500mL 삼각 플라스크에 넣고 0.05M 시트르산 완층액 (pH 4.8) lOOmL를 가한 다음， 120C에서 20분 오토클래이빙 하였다. 무균상에서 효소용액을 가한 후 (E1+E2를 0.2+0.04mL/g 바이오매스를 가함) 50°C， 150rpm에 2일 동안 배양하면서 가수분해 시키고, 당화가 끝난 시료는 원심분리를 통해 잔사를 제거시켰다.
0. 산가수분해 (HA): Two-step hydrolysis method로 수행하였다. 즉 1차 가수분해 시 HR 건조증: 72% 황산을 lg ： 1.5mL로 하여 60°C에서 1시간 반웅시킨 다음， 증류수 23.5mL를 가한 후 (최종황산농도: 2.88%， S/L: 4%) 12CTC에서 1시간 동안 알루미늄 반웅기에서 2차 가수분해시켰다. 반웅 종료 후 CaC03를 이용하여 가수분해물 최종 pH를 5-6으로 맞춘 다음, 원심분리를 통해 상등액을 취하였다.
0. 복합 가수분해 (Combined hydrolysis, HC): 약산 전처리 후 효소 가수분해를 실시하는 방법으로 수행하였다. 약산 전처리는 HR 건조시료 lO.Og을 2% HC1 40mL (25% S/L)에 넣고， 고압멸균기를 이용하여 120°C 20분 멸균처리 하였다. 그 후 일정량의 0.1M 시트르산 완층액을 넣고 NaOH로 증화시켜 pH 4.8-5.0로 조정하였다. 그 후 상기 약산처리액에 E1+E2 효소를 0.2+0.04mL/g 바이오매스 수춘으로 주입한 다음 50C, 150rpm으로 24시간 동안 효소 가수분해시켰다,
0. 열수전처리-효소가수분해 (HWC): 열수 전처리 후 효소가수분해를 실시하는 방법으로 수행하였다. 열수 전처리는 HR 건조시료 lO.Og을 반웅기에 담고 증류수 40mL (25% S/L)에 넣고， 150°C에서 30분 간 고온처리하였다. 그 후 일정량의 0.1M 시트르산 완층액을 넣고 HC1로 중화시켜 pH 4.8— 5.0로 조정하였다. 그 후 상기 열수처리액에 E1+E2 효소를 0.2+0.04mL/g 바이오매스 수준으로 주입한 다음 50C, 150rpm, 24hr동안 효소가수분해시켰다. 바이오에탄을 생산을 위한 발효
바이오에탄올 생산을 위해서는 위와 같이 각각의 조건으로 제조된 HR 당화용액과 효모 추출물 20 g + 펩톤 10 g/lL 흔합 배지를 121 °C에서 20분 동안 각각 멸균한 후 이들을 흔합하였다 (최종 부피 50mL). 30°C에서 20시간 사전 배양한 바이오에탄을 생성 균주 사카로마이세스 세리비시에 {Saccharomyces cerevisiae, KCTC7017) 를 멸균된 배지에 2.5ml 접종하고 N2 가스를 10분 동안 주입하여 산소를 제거시킨 후 120rpm, 30°C에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 8000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 얻은 상징액을 가지고 에탄을 분석을 하였다. 분석 방법
0. D-글루코오스
D-글루코오스 분석은 Biochemistry analyzer (YSI 2700 SELECTTM, YSI Life Sciences, USA)를 이용하여 D-글루코오스 2.5 g/L 와 L-락티산 1.5 g/L 표준용액과 분석 키트를 사용하여 제조사에서 제시된 방법으로 정량하였다.
0. 환원당 정량
환원당 정량은 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)를 포함한 DNS 시약을 시료와 흔합하여 100 °C 워터베스에서 5분 30초 동안 반응시킨 후 분광광도계로 540讓에서 흡광도를 측정하였다. 환원당의 표준곡선은 D- 글루코오스를 농도별로 희석하여 시료와 동일하게 DNS 시약과 반웅 시킨 후 흡광도를 측정하여 작성하였다.
0. HMF 및 풀푸랄 함량 조사
실시예 1에서와 같은 방법으로 HPLC(Waters, 미국) 분석을 통해 정량하였다. 컬럼은 Comosil 5C18-MS-11(4X150 國)을 사용하였고, 이동상은 100% 증류수 (펌프 A)와 100% 메탄을 (펌프 B)로 시간별 구배를 두었으며 , 유량은 0.6 ni /min, 측정 파장은 280 nm이었다.
0. 에탄올 분석
Megazyme ethanol KIT를 사용하여 증류수 1 ml 에 시료 0.05 ml를 넣을 후 피로포스페이트 완층액 0.1 ml, NAD+ 0.1 ml, 숍데하아드 디하이드로게네이즈 0.01 ml를 첨가하여 2분 동안 반응시킨 다음 340nm에서 흡광도를 측정하였다 (A1). 또한 알코을 디하이드로게네이즈를 첨가하여 5분 동안 반웅 시킨 후 340nm에서 흡광도를 측정하여 (A2) 제시된 계산법에 의하여 에탄올을 정량하였다 (Megazyine Ethanol Assay Procedure K-ET0H 02/11).
(2) 결과 및 고찰
가수분해 방법간 당화효율 비교
0. 고농도 당용액을 제조하기 위해서는 HC (약산+효소가수분해) 또는 丽 C (열수+효소가수분해) 방법이 우수하였고 각각 3.3%， 3.6%의 글루코오스를 함유하는 용액을 얻을 수 있었다 (표 12). 이는 고형분 함량이 높은 상태에서 당화되었기 때문이다.
0. HR 바이오매스 건물중을 기준하여 당을 많이 얻을 수 있는 가수분해 방법， 즉 당화효율이 보다 높은 방법은 HE (효소가수분해)와 HA (산가수분해)로서 각각 건물 (dried matter)로부터 36.4%, 35, 6%의 글루코오스를 얻을 수 있었다 (표 12). 【표 12】 여러 가지 가수분해 방법에 따른 HR바이오매스로부터의 당생산 비교
Figure imgf000034_0001
ο· 가수분해시 생성되는 HMF 및 풀푸랄 함'량은 HE < HWC < HA < HC 순으로 높았다 (표 13). 이들은 발효억제물질로서 알려져 있기 때문에 낮을수록 바람직하다.
0. 환원당의 경우는 산 가수분해 시 발생하는 풀푸랄알데하이드 성분도 함께 검출되기 때문에 상호 비교하기에는 어려웠다.
【표 13】 HR의 가수분해로 생산된 당화 용액의 HMF와 풀푸랄 농도
Figure imgf000034_0002
가수분해 방법별 당용액의 에탄을 발효능
0. 본 실험의 회분식 발효에서 상대적으로 높은 농도의 바이오에탄올을 제조하기 위해서는 HC와 HWC 방법이 우수하였고 각각 20.0g/L, 17.8g/L의 에탄올을 함유하는 용액을 얻을 수 았었다. 이는 고형분 함량이 높은 상태에서 당화되어 당용액 농도가 높았기 때문이다 (도 4).
0. HR 바이오매스 건물중을 기준하여 바이오에탄을을 많이 얻을 수 있는 가수분해 방법， 즉 당화효율 및 발효율이 보다 높은 방법은 HE로서 본 실험에 사용된 HR 건물 (dried matter)로부터 28.8¾>의 바이오에탄을을 얻을 수 있었다. 이는 다른 바오이매스로부터 생산된 바이오에탄올 생산성보다 높은 수치를 나타낸다 (Choi et al. Ap l . Chem. Eng. 23 :279ᅳ 283， 2012； Lee et al . Bioresource Tech. 99:2736—2741, 2008) . 특히 본 HR에서는 특별한 전처리없이 직접 효소당화를 통해서 얻은 생산성이기 때문에 전처리를 수행한 다른 바이오매스에 비해서 경제성이 우수한 것으로 판단되었다.
0. 초기환원당으로부터 바이오에탄올 전환율은 HE>HWOHC>HA으로 높았다. 네가지 방법중 HC가 가장 낮은 경향을 보였는데 이는 1차 산가수분해시 발생될 수 있는 <HMF+풀푸랄 > 이라는 발효 억제물질의 영향이 (표 13) 가정될 수 있다. 한편 발효 종료 시 남아있는 비전환 환원당은 HC에서 가장 높았는데 이는 고농도 고형분 함량으로부터 얻어진 당용액이었기 때문에 다른 블순물 흔합량이 상대적으로 많기 때문으로 여겨진다.
0. 종합적으로 볼 때， 산 가수분해 방법 이외의 당화방법을 통해 얻어진 당용액 모두는 에탄올 발효에 적합한 것으로 여겨졌다. 이들 방법 중 실용화를 위해 어떠한 방법을 활용할지에 대해서는 당용액 농도， 당화 /발효비용 등을 종합적으로 고려하여 선택될 수 있다.
2. HRHS7 당화액 (고농도 효소당화액) 공급을 통한 바이오에탄올 생산
HR-d7 시료를 6¾) 고형분 함량 조건에서 효소가수분해하여 당화액을 얻은 다음 이를 농축시켜 글루코오스 함량이 약 13.9%인 고농도 HR 당용액 (HRHS7)을 제조하였다.
500 삼각플라스크에서 실험하였는 바， 20 g/L 효모추출물 및 5 g/L 펩톤이 함유된 용액 34 ^에 회석된 HRHS 용액 4.8 g을 넣고 이를 121°C에서 20분 고압멸균하였다. HRHS 공급으로 인한 초기 환원당 함량은 80 g/L 및 100 g/L였다. 실온으로 식힌 다음 미리 생장시킨 5. cerevisiae, CTC7107 균주를 최종 10% 농도가 되도록 4 mi 주입하였다. 그 후 발효 도중에 생긴 C02가 밖으로 배출되도록 플라스크에 단방향 공기 밸브를 장착시키고， 질소가스를 홀려 혐기조건으로 만든 다음 30°C, 150 rpi에서 72시간 동안 배양하였다. 발효가 종료된 다음에는 일정 시료를 취해 생성된 바이오에탄을 함량을 에탄을 바이오분석 키트를 이용하여 정량하였고, 아울러 소모된 환원당 함량을 보고된 방법 (T. Matrai et al . Inter. J. Food. Microbiol. 61: 187-191(2000))에 따라 분석하였다. 그 결과 표 12에서와 같이 초기 환원당 함량이 80 g/L 및 100 g/L인 당화액을 사용하여 발효시킬 경우 바이오에탄올이 각각 28.8 g/L 및 35 g/L 생성되었고 수율은 각각 81.9% 및 79.3%를 나타내었다. 수율 (%)은 100X{에탄올 / [(초기 환원당 -잔존 환원당 )X0.56]}로 산출하였다. 이러한 결과는 바이오매스에 직접 바이오에탄올 생산균주를 접촉시키는 동시 당화 /발효 공정을 통해 바이오에탄올을 생산할 때에 최적조건의 회분식 발효에서 18-23g/L의 바이오에탄올이 생산되었던 것에 비해 크게 향상된 생산성올 나타내었다. 【표 14】
Figure imgf000036_0001
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 그물말 과 (Family Hydrodictyaceae) 조류로부터 바이오에탄올의 제조방법:
(a) 그물말 과 조류를 당화시켜 단당류를 포함하는 당화액을 수득하는 단계 ; 및
(b) 상기 당화액을 탄소원으로 이용하여 사카로마이세스 ( Saccharomyces) 종, 2：^1-7}≤.^1- °} ) ^ ( Schi zosaccharo yces) 종， 피 ?1ώ} {Pichia) 종, 파피아 (/¾///a) 종， 클루이베로미세스 0¾7¾ / /»ᅳ rces) 종, 칸디다 (< ·ώ) 종， 탈라로미세스 (7 /a/ ¾ ces) 종, 브레타노미세스 (Brettano/nyces) 종， 파키솔렌 (/¾ yso/«?) 종, 데바리오미세스 {Debaryo yces) 종， 이스케리치아 0¾ ?er/c?/s) 종 및 지모모나스 {Zymonionas) 종으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 미생물을 배양하여 바이오에탄올을 수득하는 단계.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 그물말 과 조류는 히드로딕티온 ^ fydrodictyon sp.), 훈장말 쏙 iPediastnim sp.) 및 소라스트럼 쏙 Sorastni sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 조류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (a)는 ( i ) 가수분해 촉매; (ii) 다당류 분해효소; (iii) 가수분해 촉매 및 다당류 분해효소; 또는 (iv) 열수 및 다당류 분해효소를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법 .
【청구항 4】
제 3 항에 있어서, 상기 가수분해 촉매는 (i) 황산， 염산， 브름산， 잘산， 아세트산, 포름산, 과염소산， 인산， 파라-를루엔설폰산 (P- toluenesulfonic acid, PTSA) 및 고체산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 산 촉매 또는 (ii) 수산화칼륨， 수산화나트륨， 수산화칼슘 및 암모니아 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알칼리 촉매이고， 상기 가수분해 촉매를 이용하여 20-200°C의 온도에서 1—6시간 동안 1차 가수분해 후， 20-200 °C의 온도에서 1-6시간 동안 2차 가수분해 하여 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
【청구항 5]
제 3 항에 있어서， 상기 다당류 분해효소는 셀를라아제， β- 글루코시다아제， β-아가라제, β-갈락토시다제， 엔도 -1,4- β-글루카나제, α-아밀라아제， β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제， 라미나린나아제， α-D-글루코시다아제， β— D-글루코시다아제， 수크라아제， 말타아제， 이소말타아제 및 락타아제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 흔합 분해효소이고 상기 다당류 분해효소를 이용하여 증류수 또는 0.01 mM-1.0 M 범위의 완층액에서 20-60°C , 0.5-5일 반응시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법 .
【청구항 6】
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 가수분해촉매를 이용하여 20- 200°C의 온도에서 1-6시간 동안 1차 가수분해 후， 다당류 분해효소를 이용하여 증류수 또는 0.01 mM-1.0 M 범위의 완충액에서 20—60 °C， 0.5-5일 반웅시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
【청구항 7】
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 (a) 단계와 상기 (b) 단계 사이에 상기 (a) 단계에서 수득한 당화액을 농축하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8】
제 1 항에 있어서, 상기 당화액은 하이드록시메틸풀푸랄 (Hydroxymethyl furfural, HMF), 풀푸랄 (furfural ) 또는 이들의 흔합물이 0.07 중량 % 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법. 【청구항 9】
그물말 과 (Family Hydrodictyaceae) 조류와 다당류 분해효소， 가수분해 촉매 또는 다당류 분해효소 및 가수분해 촉매의 흔합물을 접촉시키는 단계를 포함하는 당화액 제조방법. 【청구항 10】
제 9 항에 있어서， 상기 그물말 과 조류는 히드로딕티온 ^ iydrodictyon sp.), 훈장말 쏙 Pediastrum sp.) 및 소라스트럼 쏙 iSorastr sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 조류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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