WO2013136026A1 - Production d'acide caprique en mode mixotrophe par botryococcus - Google Patents

Production d'acide caprique en mode mixotrophe par botryococcus Download PDF

Info

Publication number
WO2013136026A1
WO2013136026A1 PCT/FR2013/050543 FR2013050543W WO2013136026A1 WO 2013136026 A1 WO2013136026 A1 WO 2013136026A1 FR 2013050543 W FR2013050543 W FR 2013050543W WO 2013136026 A1 WO2013136026 A1 WO 2013136026A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
botryococcus
culture
microalgae
capric acid
pmol
Prior art date
Application number
PCT/FR2013/050543
Other languages
English (en)
Inventor
Khadidja Romari
Cindy MERLET
Pierre Calleja
Original Assignee
Fermentalg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fermentalg filed Critical Fermentalg
Priority to EP13715326.8A priority Critical patent/EP2825630A1/fr
Priority to JP2014561498A priority patent/JP2015513893A/ja
Publication of WO2013136026A1 publication Critical patent/WO2013136026A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the invention relates to a mixotrophic culture method of a microalga of the genus Botryococcus, in particular species of Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus. It allows the enrichment of microalgae grown and capric acid (also known as decanoic acid, C10: 0 and C10) compared to the conditions in classical autotrophic where capric acid is almost absent. In the presence of a discontinuous and / or variable light illumination, the method makes it possible to obtain a very high biomass yield. The method thus makes it possible to select Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus strains of a mixotrophic nature, and having a high yield of capric acid.
  • Microalgae are photosynthetic microorganisms of autotrophic nature, that is to say having the ability to grow autonomously by photosynthesis.
  • microalgae species found in freshwater or oceans are usually autotrophic, that is, they can only grow by photosynthesis. For these, the presence in their environment of carbon substrates or organic material is not favorable to them and does not improve their growth.
  • a number of microalgae species, from families and from very different origins do not appear to be strictly autotrophic. Thus some of them, called heterotrophic, are able to develop in the total absence of light, by fermentation, that is to say by exploiting the organic matter.
  • Other microalgae species, for which photosynthesis remains essential for their development are able to take advantage of both photosynthesis and organic matter present in their environment. These intermediate species, called mixotrophs, can be grown both in the presence of light and organic matter.
  • Microalgae are currently the subject of many industrial projects because some species are able to accumulate or secrete significant amounts of lipids, including hydrocarbons and fatty acids. Such fatty acids, including polyunsaturated fatty acids and saturated fatty acids, have many industrial applications.
  • Capric acid (also known as decanoic acid, C10: 0 or C10) is a saturated fatty acid with the chemical formula C10H20O. It has no double bond.
  • Capric acid is used in several industrial sectors, for example as a solvent for inks, a degreasing agent, and as an emollient in cosmetic formulations and in soaps. It is also used in the manufacture of perfumes, lubricants, plastics and dyes. Glycerol esters of capric acid are used in foods and dietary products.
  • capric acid is mainly obtained by the plant production route (in particular coconut oil and palm kernel oil) or by chemical means.
  • Capric acid accounts for 6 to 10% of total fatty acids in coconut oil, and 3 to 14% of total fatty acids in palm kernel oil. This low yield of capric acid has the consequence of making this production route expensive.
  • Capric acid also known as decanoic acid, C10: 0 or C10
  • C10 0 or C10
  • CrOa chromium trioxide
  • capric acid by microalgae is not known.
  • the production of capric acid by microalgae represents an advantageous alternative compared to the production by the chemical way as well as by the vegetable route, for the reasons mentioned above.
  • the taxonomic classification of eukaryotic algae contains 14 phyla.
  • species of the different classes composing these phyla which produce fatty acids
  • there are significant variations in the content of microalgae in lipids including hydrocarbons and polyunsaturated fatty acids and saturated fatty acids.
  • the relative proportions of lipids, in particular in the lipid profiles vary according to the species and the culture conditions.
  • the cultures can be carried out in autotrophic, mixotrophic or heterotrophic conditions depending on the strain, the temperature, the light conditions and the size of the fermenters.
  • crops can also be grown in one-liter containers, in a laboratory, in photobioreactors, and in 100,000-liter containers or in open ponds (several hectares).
  • energy expenditure and other resources such as labor and the ease of continuing cultivation must be taken into account by developing ideal growing conditions.
  • the microalgae be grown under optimal conditions to increase the yield of (s) fatty acid (s) to produce.
  • it is preferable to have the highest possible yield for example, above 50 g / l of dry matter and more than 60% of fatty acids relative to the dry matter).
  • Botryococcus braunii is the species that has so far been the most studied because of the quality of its hydrocarbons and its ability to be grown in autotrophic mode.
  • the cultivation of this green algae, ponderedly highly pigmented, is generally carried out under conditions of high brightness, between 500 and 1500 ⁇ . m "2 , s " 1 .
  • B. braunii var. Showa is known to accumulate up to 30% of its dry weight in botryococcenes.
  • the fatty chains of these botryococcenes comprise between 30 and 37 carbon atoms [Plant Patent US 6, 169]. The genome of this strain is currently being sequenced.
  • Botryococcus braunii var. Ninsei has been reported to secrete botryococcal to extracellular matrix [US 2006/0265800].
  • This secretion has the effect of making the Botryococcus colonies floating relative to their liquid culture medium, which advantageously makes it possible to harvest the algae loaded with botryococcenes on the surface of the culture medium.
  • Botryococcus braunii strain B70 isolated by Tanoi and Kawaachi, [Tanoi and Kawaachi (2011) Effects of carbon source on growth and morphology of Botryococcus braunii, J. Appl Phycol. 23: 25-33], is able to grow under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic conditions. In the presence of glucose in dark or bright conditions, the cells and granules containing the oil had a size significantly greater than that obtained in the absence of glucose.
  • the strains concerned are respectively named FCC 828 (CCAP 807/6) and FCC 841 (CCAP 807/4).
  • the strain FCC 828 belongs to the species of Botryococcus braunii and the strain FCC 841 belongs to the species Botryococcus sudeticus. These strains were deposited on 20 October 2010 with the CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Scotland, United Kingdom) in accordance with the provisions of the Treaty of Budapest.
  • the cultivation and selection process consisted more particularly of cultivating the microalgae under conditions of mixotrophy with an organic carbon substrate.
  • the light input can be continuous, that is to say in classic mixotrophy mode.
  • Culture can also be carried out in the presence of a variable and / or discontinuous illumination, especially in the form of flashes, with a range of light intensity variations and a specific frequency.
  • the yield of capric acid by the microalgae cultivated in mixotrophic mode is 30 to 80% of the total fatty acids.
  • the yield of biomass, and thus of capric acid is improved by using the process in the presence of a discontinuous variable illumination, in particular in the form of flashes. Under such growing conditions, the yield of microalgae to capric acid may be greater than 55% of total fatty acids.
  • Percentage of fatty acids from the FCC 828 strain (CCAP 807/6) and the FCC 841 strain (CCAP 807/4) in autotrophic and mixotrophic culture.
  • CCAP 807/6 Percentage of fatty acids from the FCC 828 strain
  • CCAP 841 strain CCAP 807/4
  • the percentage of the respective fatty acids relative to the percentage of total lipids appears in white for the autotrophic conditions and in black for the mixotrophic conditions.
  • the subject of the present invention is therefore a process for the cultivation of microalgae of the genus Botryococcus, in particular of the Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus species in the mixotrophic mode, for the production of capric acid.
  • the culture can be carried out in "classical" mixotrophy mode, that is to say with a contribution of natural light (outdoor culture) or a continuous and constant light supply.
  • the culture is carried out under conditions of continuous or discontinuous illumination and / or variable over time.
  • the illumination has intensity variations whose amplitude is generally between 5 ⁇ . m “2 , s “ 1 and 1000 pmol. m “2 , s “ 1 , preferably between 30 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 . These variations can generally take place between 2 and 3600 times per hour, preferably between 2 and 200 times per hour.
  • These cultivation conditions make it possible to provide a defined quantity of light.
  • This luminous contribution may comprise phases of illumination discontinuous and / or variable, with intensity variations that may have the same or different amplitudes.
  • the illumination can be in particular in the form of flashes.
  • This process has the advantage of increasing the yield of biomass obtained from the culture. It also has the advantage of enriching the microalgae thus cultured in capric acid.
  • This method can also be used to select strains of the genus Botryococcus, particularly Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus species of mixotrophic nature, and having a high yield of capric acid.
  • the mixotrophic culture of this microalgae is preferably carried out in the presence of 5 mM to 1 M, preferably from 50 mM to 800 mM, more preferably from 70 mM to 600 mM, and more preferably from 100 mM to 500 mM of an organic carbon substrate.
  • the supply of the substrate is ensured continuously during the culture, to allow the cells to accumulate a high concentration of lipids. Additional substrate is added to the culture medium during the culture process to maintain a constant concentration.
  • This organic carbon substrate preferably comprises, in pure form or as a mixture: glucose, cellulose derivatives, lactate, starch, lactose, sucrose, acetate and / or glycerol.
  • the preferred substrate is sodium acetate.
  • the organic carbon substrate contained in the culture medium may consist of complex molecules or a mixture of substrates.
  • Products resulting from the biotransformation of starch, for example from corn, wheat or potato, in particular starch hydrolysates, which consist of small molecules, constitute, for example, substrates carbonates adapted to the mixotrophic culture of microalgae according to the invention.
  • This process is more particularly intended for the implementation of microalgae strains of the genus Botryococcus (Phylum: Chlorophyta, Order: Chlorococcales, Family: Dictyosphaeriaceae) [ITIS Catalog of Life, 2010] selected for their mixotrophic nature, especially for their ability to to be cultivated with a light input greater than 10 ⁇ l, in the medium 3NBBM + V (CCAP - Culture Collection of Algae and Protozoa) in which is added an organic carbon substrate.
  • the organic carbon substrate comprises acetate in a concentration equivalent to or greater than 5 mM.
  • Botryococcus more particularly Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus, can be isolated and selected according to the selection and culture method according to the invention.
  • a representative strain of the strains of Botryococcus braunii according to the invention is the strain FCC 828, isolated by the applicant and filed with the CCAP on October 20, 2010, under the numbers CCAP 807/6.
  • Another representative strain of the Botryococcus sudeticus strains according to the invention is the strain FCC 841, isolated by the applicant and deposited at the CCAP on October 20, 2010, under the number CCAP 807/4.
  • Such strains are capable of producing significant amounts of capric acid when grown in a mixotrophic mode.
  • the biomass yield of these strains is even higher when the light input is variable or discontinuous according to the invention.
  • CCAP 807/6 and CCAP 807/4 belong to the species Botryococcus braunii, race A and Botryococcus sudeticus respectively.
  • the invention relates to any strain of the species Botryococcus braunii or Botryococcus sudeticus, capable of growing in mixotrophic culture conditions, as described in the present application, and capable of producing capric acid.
  • the invention also relates to any species of microalgae of the genus Botryococcus, capable of growing under conditions of mixotrophic culture, as described in the present application, and capable of producing capric acid.
  • the culture of the Botryococcus strains identified in the present application under mixotrophic culture conditions according to the invention makes it possible to produce, under conventional mixotrophic conditions, significant amounts of biomass as well as lipids very rich in capric acid which can represent more than 30%, more than 45%, more than 60%, or more than 75% of the total lipids contained in microalgae (see Figure 1).
  • Figure 1 shows the lipid profiles of FCC 828 and FCC 841 strains grown in mixotrophic mode (with 5mM sodium acetate as organic carbon substrate) or in autotrophic mode.
  • FCC strain 828 ( Figure 1A) grown in autotrophic mode does not produce capric acid.
  • the majority of the fatty acids obtained from the autotrophic culture consist of C18: 1 n9, C18: 3n3, C16: 0, C18: 2n6t, and C20: 5n3 (listed in order of importance).
  • the physiological nomenclature is used in the figure to identify fatty acids.
  • C18: 1n9 is a fatty acid having a carbon chain length of 18 carbons, and a double bond which is located at the level of the ninth carbon from the terminal methyl group.
  • Capric acid now accounts for the majority of the fatty acids obtained, with small percentages of C18: 1 n9, C18: 3n3, C16: 0, C18: 3n3, C18: 2n6t and C20: 5n3.
  • FCC strain 841 (FIG. 1B) cultured in autotrophic mode does not produce capric acid either.
  • the majority of the fatty acids obtained from the autotrophic culture consist of C16: 0, C18: 1 n9, C18: 3n3 and C18: 2n6t (listed in order of importance), and of C20 and C22 chain acids in small quantities .
  • Capric acid is by far the predominant fatty acid obtained, with small percentages of C18: 1 n9, C18: 3n3, C16: 0, C18: 3n3, C18: 2n6t and C20: 5n3.
  • capric acid accounts for more than 70% of the total fatty acids obtained.
  • the culture is carried out in mixotrophic conditions in the presence of a variable and / or discontinuous illumination, in particular in the form of flashes.
  • the biomass obtained with the FCC 828 and FCC 841 strains is 10 to 20%, more generally 20 to 50%, higher than that of a culture with the same strain carried out in conventional mixotrophic mode.
  • conventional mixotrophic mode is meant culture conditions with an identical culture medium, but with a contribution of natural light (outdoor culture) or a continuous and constant light supply.
  • the subject of the invention is thus a process for the cultivation of microalgae of the genus Botryococcus, in particular of the Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus species in the mixotrophic mode, in order to produce capric acid.
  • the invention also relates to such a method in the presence of a variable and / or discontinuous illumination over time, for example in the form of flashes.
  • the subject of the invention is thus a process for the selection of microalgae of the genus Botryococcus, in particular of the Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus species with a mixotrophic nature, and having a high yield of capric acid, in particular in the presence of variable illumination and / or discontinuous over time.
  • the periods of darkness may occupy more than a quarter of the time, preferably half or more of the time, during which the algae are grown.
  • the illumination is discontinuous and more preferably in the form of flashes.
  • a flash within the meaning of the invention, is a short period of illumination, that is to say less than 30 minutes.
  • the duration may be less than 15 minutes, preferably less than 5 minutes or more preferably less than 1 minute.
  • the flash duration may be less than one second.
  • the flash duration can be 1/10 of a second, or 2/10 of a second, or 3/10 of a second, or 4/10 of a second or 5 / 10 of a second, or 6/10 of a second, or 7/10 of a second, or 8/10 of a second, or 9/10 of a second.
  • the illuminance, or flash is usually longer than 15 seconds. It is generally between 5 seconds and 10 minutes, preferably between 10 seconds and 2 minutes, more preferably between 20 seconds and 1 minute.
  • This time period can be between 1 second and 30 minutes, or between 1 second and 36 seconds, or between 1, 2 seconds and 30 seconds, or between 1.44 seconds and 9 seconds, or between 1, 8 seconds. seconds and 6 seconds, or between 2.4 seconds and 4.5 seconds.
  • This frequency can also be between 18 seconds and 30 minutes, preferably between 24 seconds and 6 minutes, more preferably between 36 seconds and 4 minutes, and even more preferably between 72 seconds and 3 minutes.
  • the number of flashes per hour is chosen according to the intensity and duration of the flashes (see below). In general, the intensity of the light provided in the form of flashes is between 5 and 1000 pmol. m "2 , s " 1 , preferably between 5 and 500 ⁇ . m "2 , s " 1 , or 50 and 400 ⁇ .
  • 1 pmol. m “2 , s “ 1 corresponds to 1 ⁇ m “2 , s “ 1 (Einstein), a unit often used in the literature.
  • the intensity of the light is between 50 and 200 pmol.
  • m “2 , s " 1 , the time period of the flash frequency is between 10 seconds and 60 minutes for a flash duration of between 1 second and 1 minute.
  • the illumination may be variable, which means that the illumination is not interrupted by dark phases, but that the light intensity varies over time. This variation in light intensity is regular and can be periodic or cyclic. According to the invention, it is also possible to carry out a light supply combining continuous and discontinuous illumination phases.
  • the light intensity provided to the algae in culture varies at least one times in one hour.
  • the amplitude of this light intensity variation is generally between 5 and 1000, or between 50 and 800, or between 100 and 600 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the intensity of the light can also vary between 5 and 400 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the magnitude of the light intensity variation is between 70 and 300 pmol. m “2 , s " 1 , and more preferably between 100 and 200 pmol. m “2 , s ' 1 .
  • Said luminous intensity can successively reach, under conditions of variable illumination, for example, the values 50 pmol. m “2 , s “ 1 and 100 pmol. m “2 s “ ⁇ or 5 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 , or 50 and 800 pmol. m “2 , s “ 1. several times each hour.
  • Said luminous intensity can successively reach, preferably, the values 50 and 200 pmol. m “2 , s " 1 .
  • said luminous intensity can successively, several times in the hour, for example, the values 0 and 50 ⁇ . m “2 , s “ 1 , the values 0 and 100 pmol.
  • the intensity of the light brought to the culture varies according to the cell density.
  • the denser the culture the more intense the light.
  • the cell density is the number of cells per ml and is measured according to the techniques known to those skilled in the art.
  • the light intensity can be between 5 and 15 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 5 and 10 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the light intensity can be increased to between 15 and 200 pmol. m “2 , s “ 1 , for example, preferably between 20 and 50 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the culture, at the final stage reaches a density between 10 7 and 10 8 cells per ml
  • the light intensity can be increased to between 50 and 400 pmol. m “2 , s “ 1 for example, preferably between 50 and 150 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the intensity of the light may be greater compared to the values mentioned above.
  • the light intensity may be between 5 and 200 pmol. m “2 , s " 1 , preferably between 5 and 100 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the light intensity can be increased to between 30 and 500 pmol. m “2 , s " 1 , for example, preferably between 50 and 400 pmol.
  • the light intensity can be increased to between 100 and 1000 pmol. m “2 , s “ 1 for example, preferably between 200 and 500 pmol. m “2 , s “ 1 .
  • the quantity of light brought to the culture in the hour remains between certain values. It is between about 2000 and 600 000, preferably between 2000 and 300 000 pmol. m "2. It can be between about 4000 and 200 000 pmol. m" 2 per hour.
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 10 pmol. m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 9000 pmol. m "2.
  • the culture is irradiated with 20 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity of 20 pmol. m" 2 s "1, to give a total light output per hour of 12,000 pmol.m -2 .
  • the culture is illuminated with 45 flashes per hour, each flash having a duration of 15 seconds and an intensity of 5 pmol.
  • culture is illuminated with 120 flashes per hour, each having a flash duration of 10 seconds and an intensity of 200 pmol. m" 2 s "1, to give a total light output per hour of 240 000 ⁇ . m "2 .
  • the amount of light provided to the culture per hour may vary depending on the cell density.
  • the total light input in the hour is generally between about 1500 and 8000, preferably 1500 and 6000 ⁇ . m "2 , more preferably between 2000 and 5000 pmol. m " 2 .
  • the total light supply in the hour can be increased to between 6000 and 67000 pmol. m "2 , preferably between 6000 and 50,000 and more preferably between 12,000 and 45,000 pmol m- 2 , for example.
  • the total light contribution in the hour can be increased to between 45,000 and 300,000, for example, preferably between 45,000 and 200,000 pmol. m "2 , and more preferably between 50,000 and 150,000 pmol m- 2 .
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 5 and 10 pmol. m “2 , s " 1 , which gives a total light input per hour of 2250 pmol. m 2 to 4500 pmol m -2 .
  • the intermediate stage at the intermediate stage (at a cell density between 10 6 and 10 7 cells per ml), the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 15 and 50 pmol.
  • the culture is irradiated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 30 seconds and an intensity between 50 and 150 ⁇ m- 2 , s- 1 , which gives a total light output per hour of 45,000 to 135,000 pmol m- 2 .
  • the duration of the flashes is for example less than one minute, or less than one second
  • the culture is illuminated with 30 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 50 and 100 ⁇ .
  • m "2 , s " 1 which gives a total light input per hour of 15,000 pmol. m 2 to 30,000 pmol m -2 .
  • the culture is illuminated with 50 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 200 and 300 pmol. m “2 , s " 1 , which gives a total light output per hour of 100,000 to 150,000 ⁇ . m "2.
  • the culture is illuminated with 120 flashes per hour, each flash having a duration of 10 seconds and an intensity between 350 and 450 pmol m -2 , s -1 , giving a total light output per hour of 420,000 to 540,000 pmol m -2 .
  • the contribution of light in the cultures can be obtained by lamps distributed around the external wall of the fermenters.
  • a clock triggers these lamps for defined lighting times.
  • Fermentors are preferably located in an enclosure away from daylight, which can control the ambient temperature.
  • the culture method according to the invention thus makes it possible to select strains of the genus Botryococcus, in particular species of Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus, of a mixotrophic nature, similar to those isolated by the applicant and deposited with the CCAP under the numbers CCAP 807. / 6 and CCAP 807/4, and having a high yield of capric acid.
  • This cultivation process is characterized in that it comprises the following steps: a) Mixotrophic culture of one or more strains of the genus Botryococcus under discontinuous or variable illumination conditions over time, the illumination exhibiting intensity variations whose amplitude is between 5 pmol. m “2 , s " 1 and 1000, preferably between 5 and 400 ⁇ . m “2" s "1 , these variations occurring between 2 and 3600, preferably 5-400 times per hour,
  • recovery step is meant more particularly the isolation of the strain or strains whose cell number has grown the most during said generations.
  • various strains of the genus Botryococcus in particular of the species Botryococcus braunii or Botryococcus sudeticus, can be cultured, in parallel, on microplates in the same enclosure, with precise monitoring of the conditions and evolution of the strains. different cultures. It is thus easy to know the response of the different strains to discontinuous and / or variable illumination and, where appropriate, to the addition of one or more carbon substrates in the culture medium. Strains that respond favorably to discontinuous and / or variable illumination and to carbon substrates generally offer a better yield for the lipid production in terms of quality (more generous capriic acid in the lipid profile) and quantitative (the lipids contain a proportion higher capric acid).
  • the microalgae can be selected in a fermentor from a heterogeneous population and the preferred variants of which are to be selected by the selection method according to the invention, combining discontinuous and / or variable light, having a range of light intensity and a specific frequency, with mixotrophic culture conditions.
  • the culture is practiced by maintaining the microalgae in cultures over many generations, then an isolation of the components that have become the majority in the culture medium is carried out at the end of the culture.
  • the culture method according to the invention also makes it possible to produce lipids.
  • the method according to the invention also comprises the following steps:
  • lipid recovery step of microalgae, and possibly e) extraction of capric acid recovered lipids.
  • the culture method according to the invention can also be applied to any species of the genus Botryococcus, capable of growing under the mixotrophic conditions according to the invention, and capable of producing capric acid.
  • the culture method according to the invention makes it possible to optimize the production of the biomass obtained from the culture. It also makes it possible to enrich the microalgae thus cultivated with fatty acids, more particularly with capric acid.
  • the invention therefore also aims at optimizing the production of biomass, as well as the production of lipids, in particular fatty acids, via the cultivation of microalgae of the Botryococcus genus of a mixotrophic nature, preferably cultivated or selected according to the methods referred to above, then the recovery of the microalgae thus cultivated to extract the contents lipid, in particular capric acid.
  • the strains of the species Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus are especially concerned.
  • the invention also relates to the microalgae of the genus Botryococcus braunii and of the genus Botryococcus sudeticus, which can be obtained according to the process of the invention as previously described. These microalgae are enriched in capric acid.
  • the total lipids of such microalgae generally comprise more than 30%, more than 45%, more than 60% or more than 75% of the total lipids contained in microalgae.
  • Botryococcus braunii and Botryococcus sudeticus strains in classical and autotrophic mixotrophic mode The cultures of Botryococcus braunii were carried out in 2L fermentors (bioreactors) useful with dedicated automata and computer station supervision.
  • the system is regulated in pH via addition of base (1N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 22 ° C.
  • Stirring is carried out by means of 3 stirring wheels placed on the shaft according to the Rushton configuration (three-blade propellers with downward pumping).
  • the bioreactor is equipped with an external lighting system surrounding the transparent tank.
  • the reactors are inoculated with a pre-culture performed on a stirring table (140 rpm) in a thermostatically controlled enclosure (22 ° C.) and illuminated between 80 and 100 ⁇ E.
  • the pre-cultures and cultures in bioreactors are carried out in the 3NBBM + V medium (CCAP-Culture Collection of Algae and Protozoa), In the case of mixotrophy, organic carbon in the form of sodium acetate (100 and 150 mM) was added to the culture medium.
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (GFC filter filtration, Whatman, then drying in a vacuum oven, 65 ° C and -0.8 bar, for 24 hours minimum before weighing).
  • Lipid extraction methods are known to those skilled in the art and are, for example, described by Bligh, EG and Dyer, WJ (1959).
  • the analysis of the fatty acids is carried out by gas chromatography after trans-esterification of the lipids, according to methods known to those skilled in the art.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention se rapporte à un procédé d'enrichissement en acide caprique de nouvelles souches de microalgues appartenant au genre Botryococcus, en conditions de culture mixotrophe, en présence d'un substrat carboné organique. La biomasse et le rendement en acide caprique obtenu de ces souches est encore supérieur quand l'apport de lumière est variable ou discontinu sous forme de flashs.

Description

Production d'acide caprique en mode mixotrophe par Botrvococcus
L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, d'une microalgue du genre Botryococcus, en particulier des espèces de Botryococcus braunii et de Botryococcus sudeticus. Il permet l'enrichissement des microalgues ainsi cultivées en acide caprique (aussi connu comme l'acide décanoïque, C10 :0 ou C10) par rapport aux conditions en autotrophie classiques, où l'acide caprique est quasi absente. En présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, le procédé permet d'obtenir un très haut rendement en biomasse. Le procédé permet ainsi de sélectionner des souches Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acide caprique.
Préambule
Les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.
Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres.
La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont généralement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matière organique ne leur est pas favorable et n'améliore pas leur croissance. Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique. D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.
Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme coexistent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang, C. et al. (2000) ; Biochemical Engineering Journal, 6 :87-102].
Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment des hydrocarbures et des acides gras. De tels acides gras, comprenant des acides gras polyinsaturés et des acides gras saturés, ont de nombreuses applications industrielles.
L'acide caprique (aussi connu en tant qu'acide décanoïque, C10 :0 ou C10) est un acide gras saturé à la formule chimique C10H20O. Il ne comporte aucune double liaison.
L'acide caprique est utilisé dans plusieurs secteurs industriels, par exemple en tant que solvant pour des encres, agent dégraissant, et en tant qu'émollient dans les formulations cosmétiques et dans les savons. Il est également utilisé dans la fabrication des parfums, des lubrifiants, des plastiques et des teintures. Les esters de glycérol de l'acide caprique sont utilisés dans les aliments et produits diététiques.
A ce jour, la production de l'acide caprique est principalement obtenue par la voie de production végétale (notamment de l'huile de coprah et de palmiste) ou par voie chimique. L'acide caprique représente 6 à 10 % des acides gras totaux dans l'huile de coprah, et 3 à 14 % des acides gras totaux dans l'huile de palmiste. Ce faible rendement d'acide caprique a pour conséquence de rendre coûteuse cette voie de production.
Une voie alternative pour la production d'acide caprique est la synthèse chimique. L'acide caprique (aussi connu comme l'acide décanoïque, C10 :0 ou C10) est couramment préparé par oxydation de décanol en utilisant du trioxyde de chrome (CrOa) en tant qu'agent oxydant, dans des conditions acides, avec un solvant d'acétone. Cette voie de production reste coûteuse, et l'impact sanitaire et environnemental du trioxyde de chrome est important.
De nouvelles sources de production de cet acide gras doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché.
Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de microalgue du genre Botryococcus cultivables en mode mixotrophe, permettant une production d'acide caprique.
A ce jour, à la connaissance du demandeur, la production de l'acide caprique par les microalgues n'est pas connue. La production de l'acide caprique par des microalgues représente une alternative avantageuse par rapport à la production par la voie chimique ainsi que par la voie végétale, pour les raisons citées ci-dessus.
A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que ces dernières recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. (2010) ; Hydrobiologia, 639:153-171].
La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Parmi des espèces des différentes classes composant ces phylums, qui produisent des acides gras, il existe des variations importantes en ce qui concerne la teneur des microalgues en lipides, notamment des hydrocarbures et des acides gras polyinsaturés et acides gras saturés. Par ailleurs, les proportions relatives de lipides, notamment dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture.
Pour mettre en œuvre la production des acides gras par des microalgues à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Par exemple, les cultures peuvent être réalisées en condition autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe selon la souche, la température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources telles que la main d'œuvre et la facilité de poursuivre la culture doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales.
En tout état de cause, il est souhaitable que les microalgues soient cultivées dans les conditions optimales pour augmenter le rendement de(s) l'acide(s) gras à produire. Ainsi, il est préférable d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple au-delà de 50 g/l de matière sèche et plus de 60% d'acides gras par rapport à la matière sèche).
II serait souhaitable de pouvoir obtenir des rendements en acide caprique plus importants pour une exploitation industrielle plus efficace et rentable.
Il est connu, en outre, que certaines souches de microalgues du genre Botryococcus (Chlorophyta, Chlorophyceae, Chlorococcales, Disctyosphaericae) [ITIS, Catalogue of Life, 2010] sont capables de produire des hydrocarbures en quantité non négligeable, notamment des n-alkadiènes, triènes, squalènes méthylés, triterpénoïdes, tétraterpénoïdes et des lycopadiènes. Ces souches produisent, en outre, des hydrocarbures particuliers à longues chaînes carbonées, regroupés sous le nom de botryococcénes. Ces hydrocarbures consistent majoritairement en des triterpènes isoprénoïdes non ramifiés de formule CnH2n-io. Us peuvent être transformés par craquage et raffinage en kérosène ou gasoil. Trois races de B. braunii ont été répertoriées, lesquelles se différencient sur la base des hydrocarbures caractéristiques qu'elles produisent. La race A produit des n-alkadiènes impairs, C25 à C31 , ainsi que des triènes. La race B produit des hydrocarbures triterpénoïdes connus en tant que botryococcénes (CnH2n-io> n=30-37), d'origine isoprénoïde. La race L produit le lycopadiène, un tétraterpène C4o- Botryococcus braunii est l'espèce, qui, à ce jour, a été la plus étudiée, en raison de la qualité de ses hydrocarbures, et de sa facilité à être cultivée en mode autotrophe. La culture de cette algue verte, réputée fortement pigmentée, s'opère généralement en conditions de forte luminosité, entre 500 et 1500 μηιοΙ. m"2, s"1.
La souche B. braunii var. Showa est connue pour accumuler jusqu'à 30 % de son poids sec en botryococcènes. Les chaînes grasses de ces botryococcènes comprennent entre 30 et 37 atomes de carbone [Plant Patent US 6 ,169]. Le génome de cette souche est actuellement en cours de séquençage.
Une variété mutante de cette souche, Botryococcus braunii var. Ninsei a été décrite comme pouvant sécréter les botryococcènes vers la matrice extracellulaire [US 2006/0265800]. Cette sécrétion a pour effet de rendre les colonies de Botryococcus flottantes par rapport à leur milieu de culture liquide, ce qui permet avantageusement de récolter les algues chargées en botryococcènes à la surface du milieu de culture.
La souche Botryococcus braunii B70, isolée par Tanoi et Kawaachi, [Tanoi et Kawaachi (2011 ) Effects of carbon source on growth and morphology of Botryococcus braunii, J. Appl Phycol. 23 :25-33], est capable de croître en conditions autotrophe, hétérotrophe et mixotrophe. En présence de glucose en conditions d'obscurité ou lumineuses, les cellules et les granules contenant l'huile présentaient une taille notablement supérieure à celle obtenue en l'absence de glucose.
Toutefois, aucune souche de Botryococcus n'est connue aujourd'hui pour la production de l'acide caprique. Le demandeur a ainsi recherché parmi les souches de Botryococcus, celles ayant la capacité de produire l'acide caprique.
Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à constater que des souches de microalgues des espèces Botryococcus braunii ainsi que Botryococcus sudeticus, quand elles sont cultivées en mode mixotrophe, permettent une production d'acide caprique. Plus particulièrement, le rendement en acide caprique est amélioré quand les microalgues sont cultivées en mode mixotrophe, en présence d'un éclairement variable discontinu, notamment sous forme de flashs.
Les souches concernées sont respectivement nommées FCC 828 (CCAP 807/6) et FCC 841 (CCAP 807/4). La souche FCC 828 appartient à l'espèce de Botryococcus braunii et la souche FCC 841 appartient à l'espèce Botryococcus sudeticus. Ces souches ont été déposées, le 20 octobre 2010, auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest.
Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie avec un substrat carboné organique. L'apport de lumière peut être continu, c'est-à-dire en mode de mixotrophie classique. La culture peut aussi s'effectuer en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, avec une gamme de variations d'intensité lumineuse et une fréquence spécifique.
L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures ou de moindre intensité lumineuse, perçue généralement comme stressante par les microalgues, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus une production élevée de biomasse, de lipides et plus particulièrement d'acide caprique. Cette mise en œuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle d'acide caprique dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes d'obtention de cet acide.
Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après.
Selon l'invention, le rendement de l'acide caprique par les microalgues cultivées en mode mixotrophe est de 30 à 80 % des acides gras totaux. Le rendement en biomasse, et donc en acide caprique, est amélioré en utilisant le procédé en présence d'un éclairement variable discontinu, notamment sous forme de flashs. Dans de telles conditions de culture, le rendement des microalgues en acide caprique peut être supérieur à 55% des acides gras totaux.
Légende de ia figure
Figure 1 :
Pourcentage des acides gras issus de la souche FCC 828 (CCAP 807/6) et de la souche FCC 841 (CCAP 807/4) en culture autotrophe et mixotrophe. A. Pour la souche FCC 828, le pourcentage des acides gras respectifs par rapport au pourcentage de lipides totaux apparaît en blanc pour les conditions autotrophes et en noir pour les conditions mixotrophes.
B. Pour la souche FCC 841 , le pourcentage des acides gras respectifs par rapport au pourcentage de lipides totaux apparaît en blanc pour les conditions autotrophes et en noir pour les conditions mixotrophes.
Description détaillée
La présente invention a donc pour objet un procédé de culture des microalgues du genre Botryococcus, notamment des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus en mode mixotrophe, pour la production de l'acide caprique. La culture peut être effectuée en mode mixotrophie « classique », c'est-à-dire avec un apport de lumière naturelle (culture en extérieur) ou un apport de lumière continu et constant.
Selon un mode d'invention, la culture s'effectue dans des conditions d'éclairement continu ou discontinu et/ou variable au cours du temps. L'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est généralement comprise entre 5 μητιοΙ. m"2, s"1 et 1000 pmol. m"2, s"1, de préférence entre 30 et 400 μιηοΙ. m"2, s"1. Ces variations peuvent généralement avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure. Ces conditions de culture permettent d'apporter une quantité définie de lumière. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes. L'éclairement peut être notamment sous forme de flashs.
Ce procédé a pour avantage d'augmenter le rendement en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acide caprique. Ce procédé peut être également utilisé pour sélectionner des souches du genre Botryococcus, en particulier des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acide caprique.
La culture en mode mixotrophe de cette microalgue, quelles que soient les conditions d'éclairement, s'effectue préférentiellement en présence de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM d'un substrat carboné organique. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. Ce substrat carboné organique comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol. Le substrat préféré est de l'acétate de sodium.
Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention.
Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre des souches de microalgues du genre Botryococcus (Phylum: Chlorophyta, Ordre : Chlorococcales, Famille : Dictyosphaeriaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans le milieu 3NBBM+ V (CCAP - Culture Collection of Algae and Protozoa) dans lequel est ajouté un substrat carboné organique. De préférence, le substrat carboné organique comprend l'acétate dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM.
Ces souches de Botryococcus, plus particulièrement de Botryococcus braunii et de Botryococcus sudeticus, peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention.
Une souche représentative des souches de Botryococcus braunii selon l'invention est la souche FCC 828, isolée par le demandeur et déposée à la CCAP le 20 octobre 2010, sous les numéros CCAP 807/6. Une autre souche représentative des souches de Botryococcus sudeticus selon l'invention est la souche FCC 841 , isolée par le demandeur et déposée à la CCAP le 20 octobre 2010, sous le numéro CCAP 807/4.
De telles souches sont capables de produire des quantités significatives d'acide caprique quand elles sont cultivées en mode mixotrophe. Le rendement de biomasse de ces souches est encore supérieur quand l'apport en lumière est variable ou discontinu, selon l'invention.
Selon les analyses taxonomiques en cours, les souches CCAP 807/6 et CCAP 807/4 appartiennent aux espèces Botryococcus braunii, race A et Botryococcus sudeticus respectivement. L'invention porte sur toute souche des espèces Botryococcus braunii ou Botryococcus sudeticus, capable de croître en conditions de culture mixotrophe, telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire de l'acide caprique. L'invention porte aussi sur toute espèce de microalgue du genre Botryococcus, capable de croître en conditions de culture mixotrophe, telle que décrite dans la présente demande, et capable de produire de l'acide caprique.
La culture des souches de Botryococcus identifiées dans la présente demande en conditions de culture mixotrophe selon l'invention permet de produire, en conditions de mixotrophie classique, des quantités significatives de biomasse ainsi que des lipides très riches en acide caprique pouvant représenter plus de 30 %, plus de 45 %, plus de 60 %, ou plus de 75 % des lipides totaux contenus dans les microalgues (voir Figure 1).
La Figure 1 représente les profils lipidiques des souches FCC 828 et FCC 841 cultivées en mode mixotrophe (avec 5mM d'acétate de sodium en tant que substrat carboné organique) ou en mode autotrophe. La souche FCC 828 (Figure 1A) cultivée en mode autotrophe ne produit pas d'acide caprique. La majorité des acides gras obtenus de la culture en mode autotrophe consistent en C18 :1 n9, C18 :3n3, C16 :0, C18 :2n6t, et C20:5n3 (listés par ordre d'importance). La nomenclature physiologue est utilisée dans la figure pour identifier des acides gras. Par exemple, C18 :1n9 (acide oléïque) est un acide gras comportant une longueur de chaîne carbonée de 18 carbones, et une double liaison qui se situe au niveau du neuvième carbone à compter du groupement méthyl terminal.
De manière inattendue, le profil des acides gras obtenu de la culture de la souche FCC 828 en mode mixotrophe a changé radicalement. L'acide caprique représente maintenant la majorité des acides gras obtenus, avec des faibles pourcentages de C18 :1 n9, C18 :3n3, C16 :0, C18 :3n3, C18 :2n6t et C20:5n3.
La souche FCC 841 (Figure 1B) cultivée en mode autotrophe ne produit pas d'acide caprique non plus. La majorité des acides gras obtenus de la culture en mode autotrophe consiste en C16 :0, C18 :1 n9, C18 :3n3 et C18 :2n6t (listés par ordre d'importance), et en acides de chaînes C20 et C22 en faibles quantités.
De la même façon que ce que l'on observe pour la souche FCC 828, en mode mixotrophe, le profil de l'acide gras produit par la souche FCC 841 change radicalement en un profil très riche en acide caprique. L'acide caprique est, de loin, l'acide gras majoritaire obtenu, avec des faibles pourcentages de C18 :1 n9, C18 :3n3, C16 :0, C18 :3n3, C18 :2n6t et C20:5n3.
Pour les deux souches, l'acide caprique représente plus de 70 % des acides gras totaux obtenus.
Non seulement l'on observe un changement radical du profil lipidique obtenu des souches FCC 828 et FCC 841 d'une culture en conditions mixotrophes, mais l'on constate également une augmentation importante de la biomasse obtenue. Cette augmentation est de 10 à 20 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode autotrophe.
Selon un mode de l'invention, la culture s'effectue en conditions mixotrophes en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs. Dans ces conditions, la biomasse obtenue avec les souches FCC 828 et FCC 841 est de 10 à 20 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode mixotrophe classique. Par mode mixotrophe classique, on entend des conditions de culture avec un milieu de culture identique, mais avec un apport de lumière naturelle (culture en extérieur) ou un apport de lumière continu et constant.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Botryococcus, notamment des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus en mode mixotrophe, en vue de produire de l'acide caprique. L'invention a aussi pour objet un tel procédé en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps, par exemple sous forme de flashs.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des microalgues du genre Botryococcus, notamment des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acide caprique, en particulier en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps.
II est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en oeuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement.
Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de moins de 30 minutes. La durée peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. Selon certains modes de réalisation de l'invention, la durée du flash peut être de moins d'une seconde. Par exemple, le durée du flash peut être de 1/10 d'une seconde, ou de 2/10 d'une seconde, ou de 3/10 d'une seconde, ou de 4/10 d'une seconde ou de 5/10 d'une seconde, ou de 6/10 d'une seconde, ou de 7/10 d'une seconde, ou de 8/10 d'une seconde, ou de 9/10 d'une seconde. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. Elle est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
En général, le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 3600 par heure. Il peut être, par exemple, compris entre 100 et 3600 flashs par heure. Il peut être également compris entre 20 et 3000, ou entre 400 et 2500, ou entre 600 et 2000, ou entre 800 et 1500 flashs par heure. Il peut être également compris entre 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure. Les flashs peuvent être émis à intervalle régulier ou non dans le temps. En cas d'émission à intervalle régulier, le nombre de flashs par heure correspond alors à une fréquence (F) ayant une période temporelle (T), étant considéré que F = 1/T. Cette période temporelle peut être comprise entre 1 seconde et 30 minutes, ou entre 1 seconde et 36 secondes, ou encore entre 1 ,2 seconde et 30 secondes, ou entre 1 ,44 seconde et 9 secondes, ou entre 1 ,8 seconde et 6 secondes, ou entre 2,4 secondes et 4,5 secondes. Cette fréquence peut être également comprise entre 18 secondes et 30 minutes, préférentiellement entre 24 secondes et 6 minutes, plus préférentiellement entre 36 secondes et 4 minutes, et plus préférentiellement encore entre 72 secondes et 3 minutes. Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est entre 5 et 1000 pmol. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 500 μητιοΙ. m"2, s"1, ou 50 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1, et plus préférentiellement entre 150 et 300 pmol. m"2, s"1. Par définition, 1 pmol. m"2, s"1 correspond à 1 μΕ m"2, s"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.
Selon un mode particulier de l'invention, l'intensité de la lumière est comprise entre 50 et 200 pmol. m"2, s"1, la période temporelle de la fréquence des flashs est comprise entre 10 secondes et 60 minutes pour une durée de flash comprise entre 1 seconde et 1 minute.
Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.
Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (μιηοΙ. m"2, s"1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement comprise entre 5 et 1000, ou entre 50 et 800, ou entre 100 et 600 μιτιοΙ. m"2, s"1. L'intensité de la lumière peut également varier, entre 5 et 400 pmol. m"2, s"1. De préférence, l'amplitude de la variation d'intensité de lumière est entre 70 et 300 pmol. m"2, s"1, et plus préférentiellement entre 100 et 200 pmol. m"2, s'1.
Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50 pmol. m"2, s"1 et 100 pmol. m"2 s"\ ou 5 et 400 μηιοΙ. m"2, s"1, ou 50 et 800 pmol. m"2, s"1. plusieurs fois chaque heure. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, de préférence, les valeurs 50 et 200 pmol. m"2, s"1. Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 μηιοΙ. m"2, s"1, les valeurs 0 et 100 pmol. m"2, s"1 ou préférentiellement encore les valeurs 0 et 200 pmol. m"2, s"1. Elle peut également atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 300 pmol. m"2, s"1, les valeurs 0 et 600 pmol. m"2, s"1, les valeurs 0 et 800 μιτιοΙ. m"2, s"1 ou encore les valeurs 0 et 1000 pmol. m'2, s"1.
Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellules par ml et elle est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art.
Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est comprise entre environ 105 et 5 x105 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 15 μιηοΙ. m"2, s"1, de préférence, entre 5 et 10 pmol. m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 pmol. m"2, s"1, par exemple, de préférence, entre 20 et 50 pmol. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 400 pmol. m"2, s"1 par exemple, de préférence, entre 50 et 150 pmol. m"2, s"1.
Selon certains modes de réalisation, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple de moins d'une minute, ou moins d'une seconde, l'intensité de la lumière peut être plus importante par rapport aux valeurs citées ci-dessus. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est entre environ 105 et 5 x105 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être entre 5 et 200 pmol. m"2, s"1, de préférence, entre 5 et 100 pmol. m"2, s"1. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 30 et 500 pmol. m"2, s"1, par exemple, de préférence, entre 50 et 400 pmol. m"2, s"1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 100 et 1000 pmol. m"2, s"1 par exemple, de préférence, entre 200 et 500 pmol. m"2, s"1.
Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise entre environ 2000 et 600 000, de préférence entre 2000 et 300 000 pmol. m"2. Elle peut être comprise entre environ 4000 et 200 000 pmol. m"2, par heure.
Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 9000 pmol. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 12 000 pmol. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 pmol. m"2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité de 200 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 240 000 μιτιοΙ. m"2.
Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est 105 et 5 x 105 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 8000, de préférence 1500 et 6000 μητιοΙ. m"2, de préférence encore, entre 2000 et 5000 pmol. m"2. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 67 000 pmol. m"2, de préférence, entre 6000 et 50 000 et de préférence encore entre 12 000 et 45 000 pmol. m"2, par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 300 000, par exemple, de préférence, entre 45 000 et 200 000 pmol. m"2, et par exemple, de préférence encore, entre 50 000 et 150 000 pmol. m"2.
Selon un mode de l'invention au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x 105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 2250 pmol. m"2 à 4500 pmol. m"2. Puis au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 pmol. m"2. Puis au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 μηιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 pmol. m"2.
Selon un mode de l'invention, par exemple, quand la durée des flashs est par exemple moins d'une minute, ou moins d'une seconde, au stade initial de la culture (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x 105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 50 et 100 μητιοΙ. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 15 000 pmol. m"2 à 30 000 pmol. m"2. Puis au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules par ml), la culture est illuminée avec 50 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 200 et 300 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 100 000 à 150 000 μιτιοΙ. m"2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 120 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 10 secondes et une intensité entre 350 et 450 pmol. m"2, s"1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 420 000 à 540 000 pmol. m'2.
L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.
Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acide caprique.
Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches du genre Botryococcus, en particulier des espèces de Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus, à caractère mixotrophe, similaires à celles isolées par le demandeur et déposées à la CCAP sous les numéros CCAP 807/6 et CCAP 807/4, et ayant un haut rendement en acide caprique. Ce procédé de culture est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Botryococcus dans des conditions d'éclairement discontinu ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 pmol. m"2, s"1 et 1000, de préférence entre 5 et 400 μιηοΙ. m"2. s"1, ces variations ayant lieu entre 2 et 3600, de préférence 5-400 fois par heure,
b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement
c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées.
Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.
Pour réaliser la sélection des souches, différentes souches du genre Botryococcus, en particulier des espèces Botryococcus braunii ou Botryococcus sudeticus, peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte, avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et/ou variable et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et/ou variable et aux substrats carbonés offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acide caprique plus abondant dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'acide caprique).
Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'une population hétérogène et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention, alliant lumière discontinue et/ou variable, présentant une gamme d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques, avec des conditions de culture mixotrophe. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.
Le procédé de culture selon l'invention permet également de produire des lipides.
Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes :
d) une étape de récupération des lipides des microalgues, et éventuellement e) l'extraction d'acide caprique des lipides récupérés.
Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce du genre Botryococcus, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire de l'acide caprique.
Le procédé de culture selon l'invention permet d'optimiser la production de la biomasse obtenue de la culture. Il permet également d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras, plus particulièrement en acide caprique.
L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production de biomasse, ainsi que la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Botryococcus à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire le contenu lipidique, en particulier l'acide caprique. Les souches des espèces Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus sont spécialement concernées.
Les méthodes d'extraction sélective des lipides, dont l'acide caprique, sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959); A rapid method of total lipid extraction and purification, Carj. J. Biochem. Physiol., 37:911-917].
L'invention porte également sur les microalgues du genre Botryococcus braunii et du genre Botryococcus sudeticus, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Ces microalgues sont enrichies en acide caprique. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 30 %, plus de 45 %, plus de 60 % ou plus de 75 % des lipides totaux contenus dans les microalgues.
Exemple 1
Culture des souches de Botryococcus braunii et Botryococcus sudeticus en mode mixotrophe classique et autotrophe : Les cultures de Botryococcus braunii ont été réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 22°C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au minimum = 100 rpm et au maximum = 250 rpm et Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente.
Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table agitante (140 rpm) en enceinte thermostatée (22°C) et éclairée entre 80 et 100 uE. Les pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu 3NBBM+ V (CCAP-Culture Collection of Algae and Protozoa), Dans le cas de la mixotrophie, le carbone organique sous forme d'acétate de sodium (100 et 150 mM) a été rajouté dans le milieu de culture.
Suivi des cultures :
La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFC, Whatman, puis séchage à l'étuve sous vide, 65°C et -0,8 bar, pendant 24h minimum avant pesée).
Concernant la quantification des lipides totaux, 7.108 cellules/mL ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959).
Analyses des Acides gras
L'analyse des acides gras est réalisée par chromatographie en phase gazeuse après trans-estérification des lipides, selon des méthodes connues de l'homme de métier.
Les résultats sont montrés dans la Figure 1.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'enrichissement en acide caprique d'une microalgue du genre Botryococcus, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une microalgue du genre Botryococcus en mode mixotrophe.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la microalgue est de l'espèce Botryococcus braunii ou de l'espèce Botryococcus sudeticus.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'espèce est la souche Botryococcus braunii FCC 828 (CCAP 807/6) ou la souche Botryococcus sudeticus FCC 841 (CCAP 807/4).
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la culture s'effectue en présence d'un substrat carboné organique à une concentration de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500mM, le substrat carboné étant choisi parmi l'amidon, le lactate, le lactose, le saccharose, l'acétate, le glycérol, le glucose et les dérivés de cellulose et un mélange de ces molécules.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit substrat carboné organique présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM d'acétate de sodium.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape suivante :
a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Botryococcus dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1, ces variations ayant lieu entre 2 et 3600 fois par heure.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 μιηοΙ. m"2, s"1 et 400 μιτιοΙ. m"2, ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure.
8. Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisé en ce que l'amplitude des variations d'intensité est comprise entre 5 et 1000 pmol. m"2, s"1, de préférence entre 30 et 400 μητιοΙ. m"2, s"1, de préférence encore entre 70 et 300 μιηοΙ. m"2, s"1, et plus préférentiellement entre 100 et 200 μητιοΙ. m"2, s"1.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'un flash a une durée comprise entre 1/10 seconde et 10 minutes, de préférence entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence encore entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement encore entre 20 secondes et 1 minute.
11. Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que le nombre de flashs est entre 5 et 3600, de préférence entre 10 et 150, préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement entre 20 et 50 fois par heure.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que l'apport total de lumière par heure en micromoles des photons est entre 2000 et 600 000, de préférence, entre 2000 à 200 000 μιηοΙ. m"2.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes :
b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement
c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées, et éventuellement
d) une étape de récupération des lipides des microalgues, et éventuellement
e) l'extraction d'acide caprique des lipides récupérés.
14. Microalgue du genre Botryococcus braunii ou du genre Botryococcus sudeticus susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 13.
15. Microalgue du genre Botryococcus selon la revendication 14, caractérisée en ce que ses lipides totaux comprennent plus de 30 %, de préférence plus de 45 %, de préférence plus de 60 % et plus préférentiellement plus de 75 % d'acide caprique par rapport au pourcentage total de lipides.
PCT/FR2013/050543 2012-03-16 2013-03-15 Production d'acide caprique en mode mixotrophe par botryococcus WO2013136026A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13715326.8A EP2825630A1 (fr) 2012-03-16 2013-03-15 Production d'acide caprique en mode mixotrophe par botryococcus
JP2014561498A JP2015513893A (ja) 2012-03-16 2013-03-15 ボツリオコッカスによる混合栄養モードでのカプリン酸の産生

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1252379 2012-03-16
FR1252379A FR2988099B1 (fr) 2012-03-16 2012-03-16 Production de l'acide caprique par botryococcus en conditions de culture mixotrophe

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013136026A1 true WO2013136026A1 (fr) 2013-09-19

Family

ID=46754531

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2013/050543 WO2013136026A1 (fr) 2012-03-16 2013-03-15 Production d'acide caprique en mode mixotrophe par botryococcus

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP2825630A1 (fr)
JP (1) JP2015513893A (fr)
FR (1) FR2988099B1 (fr)
WO (1) WO2013136026A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9758756B2 (en) 2012-11-09 2017-09-12 Heliae Development Llc Method of culturing microorganisms using phototrophic and mixotrophic culture conditions
US10240120B2 (en) 2012-11-09 2019-03-26 Heliae Development Llc Balanced mixotrophy method

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USPP6169P (en) 1986-04-15 1988-05-03 The Regents Of The University Of Ca Botryococcus braunii var. Showa
WO1996021723A1 (fr) * 1995-01-13 1996-07-18 Enviro Research Pty. Ltd. Appareil de production de biomasse
US20090265800A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Schultze Dennis L Soybean Cultivar S070149
WO2009134114A1 (fr) * 2008-04-30 2009-11-05 Tet Shin Ho Appareil de culture en masse de microalgues et procédé pour leur culture
WO2012035262A1 (fr) * 2010-09-15 2012-03-22 Fermentalg Procédé de culture d'algues unicellulaires mixotrophes en présence d'un apport lumineux discontinu sous forme de flashs
WO2012056187A2 (fr) * 2010-10-28 2012-05-03 Fermentalg Nouvelles souches de microalgues du genre botryococcus et procede de culture en mode mixotrophe desdites microalgues

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USPP6169P (en) 1986-04-15 1988-05-03 The Regents Of The University Of Ca Botryococcus braunii var. Showa
WO1996021723A1 (fr) * 1995-01-13 1996-07-18 Enviro Research Pty. Ltd. Appareil de production de biomasse
US20090265800A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Schultze Dennis L Soybean Cultivar S070149
WO2009134114A1 (fr) * 2008-04-30 2009-11-05 Tet Shin Ho Appareil de culture en masse de microalgues et procédé pour leur culture
WO2012035262A1 (fr) * 2010-09-15 2012-03-22 Fermentalg Procédé de culture d'algues unicellulaires mixotrophes en présence d'un apport lumineux discontinu sous forme de flashs
WO2012056187A2 (fr) * 2010-10-28 2012-05-03 Fermentalg Nouvelles souches de microalgues du genre botryococcus et procede de culture en mode mixotrophe desdites microalgues

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"ITIS Catalogue of Life", 2010
"ITIS, Catalogue of Life", 2010
ANIRBAN BANERJEE ET AL: "Botryococcus braunii: A Renewable Source of Hydrocarbons and Other Chemicals", CRC CRITICAL REVIEWS IN BIOTECHNOLOGY, CRC PRESS, BOCA RATON, FL, US, vol. 22, 1 January 2002 (2002-01-01), pages 245 - 279, XP009097079, ISSN: 0738-8551, DOI: DOI:10.1080/07388550290789513 *
BLIGH, E.G.; DYER, W.J.: "A rapid method of total lipid extraction and purification", CAN. J. BIOCHEM. PHYSIOL., vol. 37, 1959, pages 911 - 917, XP000998224
DUBINSKY ET AL., HYDROBIOLOGIA, vol. 639, 2010, pages 153 - 171
ELUMALAÏ S ET AL: "Ultra structural and analytical studies of biodiesel producing microalgae (Chlorella vulgaris and Senedesmis sp.) collected from Tamil Nadu, India.", CURRENT BOTANY, vol. 2, no. 6, 2011, pages 19 - 25, XP002688955, ISSN: 2240-4822 *
KOJIMA EIICHI ET AL: "Growth and hydrocarbon production of microalga Botryococcus braunii in bubble column photobioreactors", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 87, no. 6, June 1999 (1999-06-01), pages 811 - 815, XP002647547, ISSN: 1389-1723 *
NATALIA O ZHILA ET AL: "Influence of nitrogen deficiency on biochemical composition of the green alga Botryococcus", JOURNAL OF APPLIED PHYCOLOGY, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DO, vol. 17, no. 4, 1 June 2005 (2005-06-01), pages 309 - 315, XP019247811, ISSN: 1573-5176 *
TANOI TAKAKO ET AL: "Effects of carbon source on growth and morphology of Botryococcus braunii", JOURNAL OF APPLIED PHYCOLOGY, vol. 23, no. 1, 10 June 2010 (2010-06-10), pages 25 - 33, XP019881947 *
TANOI; KAWAACHI: "Effects of carbon source on growth and morphology of Botryococcus braunii", J. APPL PHYCOL., vol. 23, 2011, pages 25 - 33
WEETALL ET AL: "Studies on the nutritional requirements of the oil-producing alga Botryococcus braunii", APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 11, no. 5, 1985, pages 377 - 391, XP008138579 *
YAMAGUCHI K ET AL: "LIPID COMPOSITION OF A GREEN ALGA BOTRYOCOCCUS-BRAUNII", AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 51, no. 2, 1987, pages 493 - 498, XP002688954, ISSN: 0002-1369 *
YANG, C. ET AL., BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, vol. 6, 2000, pages 87 - 102
ZHANG H ET AL: "Mixotrophic cultivation of Botryococcus braunii", BIOMASS AND BIOENERGY MAY 2011 ELSEVIER LTD GBR, vol. 35, no. 5, 17 March 2011 (2011-03-17), pages 1710 - 1715, XP055047238, DOI: DOI:10.1016/J.BIOMBIOE.2011.01.002 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9758756B2 (en) 2012-11-09 2017-09-12 Heliae Development Llc Method of culturing microorganisms using phototrophic and mixotrophic culture conditions
US10240120B2 (en) 2012-11-09 2019-03-26 Heliae Development Llc Balanced mixotrophy method

Also Published As

Publication number Publication date
FR2988099B1 (fr) 2016-03-04
FR2988099A1 (fr) 2013-09-20
EP2825630A1 (fr) 2015-01-21
JP2015513893A (ja) 2015-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2616536B1 (fr) Procédé de culture d'algues unicellulaires mixotrophes en présence d'un apport lumineux discontinu sous forme de flashs
EP2825629B1 (fr) Production d'acide docosahexaenoique et/ou d'acide eicosapentaenoique et/ou de carotenoides en mode mixotrophe par nitzschia
EP2825631B1 (fr) Production d'acide docosahexaénoïque et d'astaxanthine en mode mixotrophe par schizochytrium.
WO2012168663A1 (fr) Nouvelle souche de microalgue du genre odontella pour la production d'epa et de dha en mode de culture mixotrophe
EP3019592B1 (fr) Nouvelle souche de aurantiochytrium et procédé utilisant celle-ci
Santos et al. pH-upshock yields more lipids in nitrogen-starved Neochloris oleoabundans
EP2723876A1 (fr) Nouvelles souches de microalgues du genre isochrysis pour la production d'epa et de dha en mode mixotrophe
EP2844734B1 (fr) Production de lutéine en mode mixotrophe par scenedesmus
WO2013136023A1 (fr) Production d'acide eicosapentaenoïque et/ou d'acide arachidonique en mode mixotrophe par euglena.
WO2013136026A1 (fr) Production d'acide caprique en mode mixotrophe par botryococcus
CA2812579A1 (fr) Nouvelles souches de microalgues du genre botryococcus et procede de culture en mode mixotrophe desdites microalgues
WO2012168662A1 (fr) Procede d'enrichissement en epa de microalgues du genre monodus, cultivees en mode mixotrophe
EP2836586A1 (fr) Production d'acide eicosapentaenoique et/ou d'acide docosahexaenoique en mode mixotrophe par cyclotella
CA3007749A1 (fr) Procede d'enrichissement de protistes en lipides riches en acides gras polyinsatures, en particulier de classe omega 3, et sa mise en oeuvre pour la production de ces protistes enrichis ou de ces lipides
EP2825632A1 (fr) Production de polysaccharides en mode mixotrophe par nostoc
Thangam et al. STUDY ON MARINE CYANOBACTERIUM PLACTONEMA SPECIES IN OSSEIN EFFLUENT AND THEIR GROWTH IN LIPID AND BIODIESEL PRODUCTION

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13715326

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014561498

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013715326

Country of ref document: EP