WO2013100655A1 - 벼흰잎마름병 방제용 조성물 - Google Patents

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WO2013100655A1
WO2013100655A1 PCT/KR2012/011624 KR2012011624W WO2013100655A1 WO 2013100655 A1 WO2013100655 A1 WO 2013100655A1 KR 2012011624 W KR2012011624 W KR 2012011624W WO 2013100655 A1 WO2013100655 A1 WO 2013100655A1
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WO
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rice
leaf blight
composition
mjm4426
staurosporin
Prior art date
Application number
PCT/KR2012/011624
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English (en)
French (fr)
Inventor
김정구
이충환
서주원
이인애
Original Assignee
대한민국(농촌진흥청장)
명지대학교 산학협력단
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/28—Streptomyces

Definitions

  • the present invention relates to a composition for controlling rice blight blight comprising staurosporin produced from Streptomyces lubrora bendula MJM4426 strain.
  • the symptoms of rice leaf blight appear in small edges of water on the edges of the lower leaves, and dry scabs of germs are formed on the surface. After several days of onset, the lesions turn yellow, and the leaves die as they dry up from the tip of the leaves. In highly susceptible varieties, there is an acute form in which the rice suddenly dies after transplanting the seedlings to the peak of the grain. Symptoms of mature leaves after the peaking season have small patterns that seem to be wet with water at the edge of the leaves 5-6 cm below. When morning dew forms, the milky dew forms on the surface of the lesion, and it can be seen that it dries and remains a yellow scab.
  • the lesion grows to yellow to orange, and the boundary with healthy leaf tissue becomes water-soaked needles. Lesions are formed on one or both edges of the leaf and progress, later spreading to the leaf central veins and expanding in a wave shape. As the disease progresses further, the yellowish white lesions turn white to gray white and become dirty colors as they are contaminated by by-products.
  • Xanthomonas oryzae pv. Oryzae is a gram-negative aerobic bacterium with monopoles and rods. Yellow colonies are formed on the solid medium, the growth rate is rather slow, and the optimum growth temperature is 26-30 ° C. Bacteria that have dried on diseased pathogens and pathogens that remain in diseased and dead plants can live for more than eight months, but die in a short period of time in hot and humid environments.
  • the pathogenic ecology causes the pathogens to overwinter in the rhizome, rhizome, or diseased rice straw, among the weeds commonly found in waterways and reservoirs.
  • Overwintering pathogens become the primary source of infection and enter the paddy fields and then invade the drainage lines or pores of rice leaves in contact with the water to form lesions.
  • the pathogens propagated in the lesions become secondary infectious agents and are discharged into the paddy field or transmitted by direct contact between the lesions and healthy rice tissue. Strong winds damage rice, making it easier for invading pathogens, and carrying pathogens leaked from lesions in the wind and transporting more than 50m.
  • Staurosporin was already isolated in 1977 from Streptomyces Staurosporeus cultures and tested for antimicrobial activity. In the course of this experiment it was also found that the compound was active against yeast microorganisms and fungi (MIC of about 3 to 25 mcg / ml) in the form of hydrochloride, LD50 of 6.6 mg / kg (mouse, intraperitoneal).
  • U.S. Patent No. 5,093,330 describes staurosporin and its N-substituted derivatives as agents for tumor suppression and inflammation inhibition, antibacterial and atherosclerosis, cardiovascular and central nervous system disorders
  • Korean Patent No. 10 -0698449 discloses from age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, retinopathy of premature infants, branch retinal vein occlusion and central retinal vein occlusion, comprising a compound of formula (I) or a salt thereof as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient Described are pharmaceutical compositions for the treatment and / or prophylaxis of selected ocular angiogenic diseases.
  • the present invention is to provide a composition for the control of rice white leaf blight inhibiting the activity of rice white leaf blight.
  • the present invention is to provide a method for controlling rice blight blight.
  • the present invention provides a composition for controlling rice blight blight comprising staurosporin of the general formula (I):
  • the staurosporin is a kind of microbial alkaloids produced by Streptomyces, and has the formula C 28 H 26 N 4 O 3 , molecular weight 466. It is a protein kinase inhibitor and induces apoptosis.
  • the present invention provides a composition for controlling rice leaf blight disease, wherein the staurosporin is derived from Streptomyces rubrolavendulae MJM4426 strain.
  • the present invention provides a composition for controlling rice white leaf blight disease, characterized in that the rice plant blight is a plant disease caused by bacteria of the genus Xanthomonas.
  • the show greater resistance activity than the natural phenolic compounds in Pseudomonas fluorescens gram negative tumefaciens DAPG (2,4-diacetylphloroglucinol) and bit switch repto My process star wooroseu porous derived star right cephalosporin alkaloid inhibitory activity is known to plant pathogens It was found experimentally (Example 3).
  • It provides a method for producing staurosporin having a rice white leaf blight control activity comprising a.
  • (e) performing a mass spectrometry on the collected material may further comprise the step of identifying staurostatin.
  • the organic solvent of step (b) may be any solvent having an appropriate polarity that is not mixed with water, but a solvent such as ethyl acetate is preferable to organic chlorine solvents such as methylene chloride and chloroform, which have long residual effects and cause environmental pollution.
  • composition for controlling rice bran leaf blight comprising Streptomyces lubrorabendula MJM4426 strain or its culture filtrate, which produces sturosporin according to the present invention.
  • Including the staurosporin as an active ingredient to prepare a fungicide for controlling rice blight blight disease to prepare a composition for the control of rice blight blight disease by mixing fillers, weighting agents, surfactants and the like commonly used in the art to which the present invention belongs. It is possible to do
  • the present invention provides a method for controlling white rice leaf blight, characterized in that the treatment composition for controlling the present invention to rice, rice seeds or cultivated soil of rice.
  • the present invention provides a strain Streptomyces rubrolavendulae MJM4426 (Accession No. KCTC 12340BP) having rice leaf blight control activity.
  • composition for controlling white rice leaf blight according to the present invention can minimize the damage of rice cultivation area by inhibiting the white rice blight causing the biggest damage of rice, which is one of the three largest plants in the world.
  • Figure 2 is a view showing an experimental design for the identification of staurosporin derived from Streptomyces lubrorabendula MJM4426 strain.
  • Figure 3 shows the results of the analysis of staurosporin and standard staurosporine derived from the Streptomyces lubrorabendula MJM4426 strain by UPLC-Q-TOF / MS (ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry) It is the chromatogram peak (A) and spectrum pattern (B) shown.
  • Figure 4 is a graph showing the results of screening rice leaf explants of staurosporin and DPAG (2,4-diacetylphloroglucinol) derived from the strain Treptomyces Rubrorabendula MJM4426.
  • GSS medium soluble starch 1%, glucose 2%, soybean meal 2.5%, beef extract 0.1%, yeast extract 0.4%, NaCl 0.2%, K 2 HPO 4 0.025%, and CaCO3 0.2%, pH 7.2
  • Fermentation was carried out for 7 days at 28 °C shaking the incubator at 200 rpm.
  • the full-length 16S rDNA (SEQ ID NO: 1) of the Streptomyces strain was obtained from the universal primer set 27F (5'-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3 ') and 1492R (5'-GGA TAC CTT GTT ACG). ACT T-3 ') and the sequence was analyzed on the NCBI homepage (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
  • the isolated Streptomyces strain has 99% homology with Streptomyces lubrorabendula. Therefore, the isolated Streptomyces strain was named Streptomyces rubrolavendulae MJM4426 ( Streptomyces rubrolavendulae MJM4426), and was registered in the rare useful microbial extraction bank ECUM ( http://www.ecum.or.kr ). It was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, an international depository organization. The deposit number is KCTC 12340BP. The strain may be distributed by the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology and the International University of Korea.
  • the supernatant was extracted with ethyl acetate by centrifugation of 10 L of Streptomyces lubrorabendula MJM4426.
  • the extract was partitioned by Sephadex LH-20 column chromatography and showed activity in the 14th fraction.
  • the active fractions were separated by C 18 reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) every minute for 1 hour and compound A (compound A) was obtained at 41 minutes (FIG. 2).
  • Xanthomonas oryzae pv. Inhibitory concentrations were measured in vitro to screen the antibacterial activity of staurosporin against Oryzae KACC 10331 (hereinafter referred to as 'Xoo'). The MIC value was determined by the concentration when the growth of bacteria was suppressed to 2% or less.
  • Staurosporin Compound A derived from Streptomyces lubrorabendula MJM4426 strain showed a MIC value of 256 ⁇ g / ml (Table 1).
  • Streptomyces sterurospor-derived staurosporin showed a MIC value of 200 ⁇ g / ml
  • Gram-negative bacterium DAPG (2,4-diacetylphloroglucinol) showed a 4 ⁇ g / ml MIC value.
  • Inhibitory activity of rice leaf blight on rice leaf explants comprising Xoo culture medium was performed in 96-well plates using a 2-fold serial dilution method. The efficacy was converted to% of diseased leaf area (DLA%, Diseased Leaf Area%), and the severity of plant disease was assessed with DLA%.
  • the infection area of rice leaf explants was measured by image conversion using Adobe photoshop CS2 and analysis of the image by image analysis program. Staurosporin was found to inhibit Xoo infection of rice leaf explants. Streptomyces sterurosporus-derived staurosporin and DPAG were used as positive controls, and the MIC value was determined as the lowest concentration when the lesion leaf area was suppressed to 10% or less (FIG. 4).

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Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주로부터 생산되는 스타우로스포린을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 벼흰잎마름병 방제용 조성물은 세계 3대 식물 중 하나인 벼의 가장 큰 피해를 야기하는 벼흰잎마름병을 억제하여 벼 재배 지역의 피해를 최소화할 수 있다.

Description

벼흰잎마름병 방제용 조성물
본 발명은 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주로부터 생산되는 스타우로스포린을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물에 관한 것이다.
벼흰잎마름병의 병징은 묘판 후기에 아래 잎의 가장자리에 물에 젖은 듯한 작은 병반이 나타나며, 그 표면에 분출된 세균의 마른 딱지가 형성된다. 발병된 지 며칠이 지나면 병반이 노란색으로 변하게 되고, 잎의 끝부분부터 하얗게 마르면서 잎이 죽게 된다. 감수성이 매우 높은 품종에서는 묘를 이앙한 후부터 분얼 최성기까지의 벼가 갑자기 말라죽는 급성형 병징이 있는데 잎에서는 뚜렷한 병징이 없고, 잎의 가장자리나 잎 끝에 좁쌀보다 작은 세균의 마른 딱지가 보일 뿐이다. 분얼 최성기 이후 성숙된 잎에 나타난 병증상은 5∼6cm 아래의 잎 가장자리에 물에 젖은 듯한 작은 무늬가 생긴다. 아침 이슬이 맺힐 때 이 병반의 표면에는 옅은 우유빛의 이슬이 맺히며, 이것이 말라서 황색의 딱지로 남아 있는 것을 볼 수 있다. 7∼3일간 병이 진전되면 병반이 커지면서 황색∼등황색이 되고, 건강한 잎조직과의 경계는 물에 젖은 듯한 수침상으로 된다. 병반은 잎의 한쪽 또는 양쪽 가장자리에 형성되어 진전되며, 후에 잎 중앙맥까지 번지며 물결 모양으로 확대된다. 병이 더 진전되면 황백색 병반이 백색∼회백색으로 변하고, 부생균에 의해 오염되면서 더러운 색깔로 변한다.
벼흰잎마름병원균인 Xanthomonas oryzae pv. Oryzae는 그람음성의 호기성 세균으로서 단극모를 가지고 있고, 막대 모양이다. 고체배지 상에서 황색의 집락(colony)을 형성하며, 자라는 속도는 다소 느리고, 생육 최적온도는 26∼30℃이다. 병반에 말라붙은 세균덩어리나 병들어 죽은 식물체 속에 남아 있는 병원세균은 8개월 이상 살 수 있으나, 고온 ·다습한 환경에서는 짧은 시일 내에 죽는다.
발병을 일으키는 생태는 병원세균은 수로나 저수지에 흔히 볼 수 있는 잡초 중에 겨풀, 나도겨풀의 근권이나 병든 볏짚에서 월동한다. 월동한 병원세균들이 1차전염원이 되어 논물에 유입된 후 수면에 접촉된 벼잎의 배수선이나 기공으로 침입하여 병반을 형성하게 된다. 병반에서 증식된 병원세균이 2차 전염원이 되어 논물 속으로 배출되거나 직접 병반과 건전한 벼 조직의 접촉에 의하여 전염된다. 강한 바람은 벼에 상처를 주어 병원세균이 침입하기 쉽게 하고, 병반부에서 누출된 병원세균을 바람에 실어 50m 이상 운반한다. 또한 태풍에 동반된 많은 비로 인해 벼가 물에 잠기게 되면 배수선이나 기공을 통한 병원세균의 침입이 더욱 쉬워진다. 7월 평균기온이 22∼24℃로 저온일 때, 7월의 강수량이 200 mm 이상으로 많은 비가 올 때, 15 m/sec 이상의 강풍이 불 때 이 병의 발생이 특히 많아진다. 모판이나 본답에서 질소비료를 많이 주게 되면 벼가 감수성으로 되어 이 병의 발병을 촉진시킨다.
스타우로스포린은 스트렙토마이세스 스타우로스포레우스(Streptomyces Staurosporeus) 배양균으로부터 1977년에 이미 분리되었으며, 항미생물 활성에 대해 시험되었다. 이 실험의 과정에서 화합물이 염산염 형태로 LD50이 6.6 ㎎/㎏(마우스, 복강내)인 효모류 미생물 및 균류(약 3 내지 25 mcg/㎖의 MIC)에 대해 활성을 가지는 것 또한 발견되었다.
또한 이 스타우로스포린이 프로테인키나제 C(랫트의 뇌로부터)에 대해 강한 억제작용을 갖는다는 것이 스크리닝으로 입증되었다〔참조; Tamaoki, T.; Nomoto, H.; Takahashi, I.; Kato, Y.; Morimoto, M.; and Tomita, F.:Biochem. and Biophys. Research Commun. 135(NO.2), 397∼402 (1986).]
미국특허 제5,093,330호에는 스타우로스포린 및 이의 N-치환된 유도체가 종양 억제 및 염증 억제, 항균, 및 동맥 경화증, 심장혈관계 및 중추신경계 질환의 퇴치에 사용되는 약제로서 기술되어 있으며, 대한민국 특허 제10-0698449호에는 활성 성분으로서의 화학식 I의 화합물 또는 그의 염, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 노후관련 황반 변성, 당뇨병성 망막증, 미숙아의 망막증, 망막정맥분지폐쇄증 및 망막중심정맥폐쇄증으로부터 선택된 안구 혈관신생 질환의 치료 및(또는) 예방용 제약 조성물로 기술되어 있다.
또한 대한민국 공개특허 제2008-0067654호에는 육종, PAX3/FKHR 전위와 관련된 증식성 질환, 폐포성 횡문근육종 등과 같은 증식성 질환의 진행 지연 또는 치료용으로서의 스타우로스포린 용도가 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2008-0015384호에는 ras 또는 FGFR3 신호전달 경로 및/또는 c-fos 전사와 관련된 질환 치료용으로서 스타우로스포린의 용도가 개시되어 있다.
본 발명은 벼흰잎마름병의 활성을 억제하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 벼흰잎마름병을 방제하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1의 스타우로스포린을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다:
[화학식Ⅰ]
Figure PCTKR2012011624-appb-I000001
상기 스타우로스포린은 스트렙토마이세스가 생산하는 미생물 알칼로이드의 일종으로 화학식 C28H26N4O3, 분자량 466이다. 단백질 인산화효소 저해제이며 세포자살을 유도한다.
본 발명은 상기 스타우로스포린이 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426(Streptomyces rubrolavendulae MJM4426) 균주에서 유래된 것을 특징으로하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 벼흰잎마름병이 잔토모나스 속 세균에 의해 발생되는 식물병임을 특징으로하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 한 구체예에서, 신규한 균주 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426(기탁번호 KCTC 12340BP) 유래 스타우로스포린이 벼흰잎마름병을 유발하는 병원균 Xanthomonas oryzae pv. Oryzae KACC 10331에 대한 우수한 항균활성을 가진다는 것이 확인되었다.
특히, 식물병원체에 대한 억제 활성이 알려진 자연 페놀 화합물인 Pseudomonas fluorescens 그람음성박테리움 DAPG(2,4-diacetylphloroglucinol)와 스트렙토마이세스 스타우로스포러스 유래 스타우로스포린 알칼로이드보다 더 큰 저항활성을 보임을 실험적으로 밝혔다(실시예 3).
다른 측면에서, 본 발명은
(a)스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426(Streptomyces rubrolavendulae MJM4426) 균주를 배양하는 단계;
(b)상기 배양물을 유기용매로 추출하는 단계;
(c)상기 추출물에 대해 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 수득하는 단계; 그리고
(d)상기 활성분획을 정제하는 단계;
를 포함하는 벼흰잎마름병 방제 활성을 가지는 스타우로스포린의 제조방법을 제공한다.
상기 활성분획을 수득하는 단계 후에, (e) 상기 수집된 물질에 대해 질량분석을 수행하여 스타우로스타린을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 (b)단계의 유기용매는 물과 섞이지 않는 적절한 극성도의 용매는 모두 가능하나 잔효가 길어 환경오염을 유발하는 염화메틸렌, 클로로포름 등의 유기염소계 용매 보다 아세트산에틸 등의 용매가 바람직하다.
본 발명에 따른 스타우로스포린을 생산하는 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주 또는 그 배양 여액을 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제공한다.
상기 스타우로스포린을 유효성분으로 포함하여 벼흰잎마름병 방제용 살균제를 제조하기 위하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 충전제, 중량제, 계면활성제 등을 혼합하여 벼흰잎마름병 방제용 조성물을 제조하는 것이 가능하다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 방제용 조성물을 벼, 벼의 종자 또는 벼의 재배 토양에 처리하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병 방제 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 벼흰잎마름병 방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426(Streptomyces rubrolavendulae MJM4426)(기탁번호 KCTC 12340BP) 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 벼흰잎마름병 방제용 조성물은 세계 3대 식물 중 하나인 벼의 가장 큰 피해를 야기하는 벼흰잎마름병을 억제하여 벼 재배 지역의 피해를 최소화할 수 있다.
도 1은 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주에서 유래된 스타우로스포린의 화학식이다.
도 2는 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주에서 유래된 스타우로스포린의 동정을 위한 실험계획을 나타낸 도면이다.
도 3은 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주에서 유래된 스타우로스포린과 표준 스타우로스포린을 UPLC-Q-TOF/MS(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry)로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램 피크(A)과 스팩트럼 패턴(B)이다.
도 4는 트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주에서 유래된 스타우로스포린과 DPAG(2,4-diacetylphloroglucinol)의 벼잎 외식편 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 벼흰잎마름병에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426( Streptomyces rubrolavendulae MJM4426) 균주의 분리 및 동정
임실군(전북, 한국)에서 얻은 1g의 토양 샘플을 세척하여 60℃에서 30분 동안 가열하였다. 스트렙토마이세스를 분리하기 위해 샘플을 HV(Humic acid vitamin) 한천 배지로 옮겼다. 그리고 녹말-카제인 KNO3 아가(녹말1%, KNO3 0.2%, K2HPO4 0.2%, NaCl 0.2%, 카제인 0.03%, MgSO4ㅇ7H2O 0.005%, CaCO3 0.002%, FeSO4ㅇ7H2O 0.001% 및 아가1.8%)에 박테리아 배양물이 코팅되었고 28℃에서 3 주 동안 배양되었다.
순수한 스트렙토마이세스를 10 L의 GSS 배지 (가용 녹말 1%, 글루코스 2%, 대두박 2.5%, 쇠고기 추출물 0.1%, 효모 추출물 0.4%, NaCl 0.2%, K2HPO4 0.025%, 및 CaCO3 0.2%, pH 7.2)에서 발효시키고 16개의 2 L 삼각 플라스크에 650 ml씩 나누어 담았다. 발효는 배양기를 200 rpm으로 흔들면서 28℃에서 7일간 수행하였다.
스트렙토마이세스 균주의 전장 16S rDNA(서열번호 1)를 유니버셜 프라이머 세트(universal primer set)인 27F (5'-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3') 및 1492R (5'-GGA TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였고, 상기 서열을 NCBI 홈페이지 (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 분석하였다.
그 결과 분리된 스트렙토마이세스 균주는 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라와 99%의 상동성을 가짐을 확인하였다. 따라서 분리된 스트렙토마이세스 균주를 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 (Streptomyces rubrolavendulae MJM4426)로 명명하였으며, 희귀유용미생물추출은행 ECUM (http://www.ecum.or.kr)에 등록하였다. 그리고 국제기탁기관인 한국생명공학연구원에 기탁하였고 기탁번호는 KCTC 12340BP이다. 상기 균주는 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 및 한국 명지대학교에서 분양받을 수 있다.
<실시예 2> 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주로부터 벼흰잎마름병에 항균 활성을 갖는 스타우로스포린의 분리 및 동정
스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 10 L를 원심분리하여 상등액을 에틸아세테이트로 추출하였다. 상기 추출물을 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피로 분획하였고, 14번째 분획에서 활성을 나타냈다. 활성 분획을 1시간 동안 매분 마다 C18 RP-HPLC(reverse-phase high-performance liquid chromatography)로 분리하였고 41분에 화합물 A(compound A)를 수득하였다(도 2). 수득한 을 분자량을 UPLC-Q-TOF/MS로 분석한 결과, 크로마토그램은 4.88분에서 피크를 나타내고 화합물 A의 분자량은 [M+H]+ 467.2086m/z, 분자식은 C28H26N4O3 이었다. 표준 스타우로스포린의 이론적인 UPLC-Q-TOF/MS 값은 [M+H]+ 467.2081m/z, 크로마토그램은 4.86분에서 피크를 나타내므로 화합물 A는 스타우로스포린으로 동정되었다(도 3).
<실시예 3>스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주 유래 스타우로스포린의 in vitro와 벼잎 외식편에서의 활성 실험
Xanthomonas oryzae pv. Oryzae KACC 10331 (이하, 'Xoo'라고 한다)에 대한 스타우로스포린의 항균 활성을 스크리닝 하기 위해 in vitro 에서 최소저해농도(inhibitory concentrations, MIC)를 측정하였다. MIC값은 균의 성장이 2% 이하로 억제될 때의 농도로 결정하였다. 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426 균주 유래 스타우로스포린(화합물 A)은 256 ㎍/㎖의 MIC값을 보였다(표 1). 대조군으로 스트렙토마이세스 스타우로스포러스 유래 스타우로스포린은 200 ㎍/㎖의 MIC값을 보였고, 그람음성박테리움 DAPG(2,4-diacetylphloroglucinol)는 4 ㎍/㎖ MIC값을 나타냈다.
표 1
MIC (㎍/ml)
인 비트로 벼잎 외식편
화합물 A 256 0.5
스타우로스포린 200 0.5
DAPG 4 32
Xoo 배양 배지를 포함하는 벼잎 외식편에서 벼흰잎마름병의 억제 활성을 2배 연속 희석법을 사용하여 96웰 플레이트에서 수행하였다. 그 효능은 병변 잎 면적의 % (DLA %, Diseased Leaf Area%)로 변환하였으며, DLA%로 식물병의 심각성을 평가하였다. 벼잎 외식편의 감염 면적은 우선 Adobe photoshop CS2를 이용한 이미지 변환 후 그 이미지를 이미지 분석 프로그램으로 분석하여 측정하였다. 스타우로스포린이 벼잎 외식편의 Xoo 감염을 억제하는 것을 확인하였다. 스트렙토마이세스 스타우로스포러스 유래 스타우로스포린과 DPAG를 양성 대조군으로 사용하였으며, MIC값은 병변 잎 면적이 10% 이하로 억제될 때의 최저 농도로 결정하였다(도 4).

Claims (6)

  1. 하기 화학식Ⅰ의 스타우로스포린을 유효성분으로 포함하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물:
    [화학식Ⅰ]
    Figure PCTKR2012011624-appb-I000002
  2. 제1항에 있어서,
    상기 스타우로스포린은 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426(Streptomyces rubrolavendulae MJM4426) 균주(기탁번호 KCTC 12340BP)에서 유래된 것인 벼흰잎마름병 방제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 벼흰잎마름병은 잔토모나스 속 세균에 의해 발생되는 식물병임을 특징으로 하는 벼흰잎마름병 방제용 조성물.
  4. (a)스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426(Streptomyces rubrolavendulae MJM4426) 균주를 배양하는 단계;
    (b)상기 배양물을 유기용매로 추출하는 단계;
    (c)상기 추출물에 대해 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 수득하는 단계; 그리고
    (d)상기 활성분획을 정제하는 단계;
    를 포함하는 벼흰잎마름병 방제 활성을 가지는 스타우로스포린의 제조방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방제용 조성물을 벼, 벼의 종자 또는 벼의 재배 토양에 처리하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병 방제 방법.
  6. 벼흰잎마름병 방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 루브로라벤둘라 MJM4426(Streptomyces rubrolavendulae MJM4426)(기탁번호 KCTC 12340BP) 균주.
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