WO2013083040A1 - 氟西汀治疗色素脱色疾病的用途 - Google Patents

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fluoxetine
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trp
protein
melanin
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尚靖
廖莎
金�雨
田晓丽
赵国瑞
周佳
王倩
宠司林
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中国药科大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders

Definitions

  • the invention relates to the field of medicine, in particular to the use of fluoxetine for the treatment of pigment decolorization diseases. Background technique
  • Depigmentation skin disease is a common type of acquired hypopigmented skin disease caused by loss of melanocytes in the skin or decreased or decreased melanin function. Such as white hair is a common pigmentation disease, involving a wide range of people. Another skin irritability, vitiligo, occurs in all parts of the world and can affect all ethnic groups, which seriously affects the normal life of patients. At present, the treatment of pigmented skin disease is still difficult, and the recurrence rate is high.
  • the existing pigment-enhancing drugs themselves do not promote the synthesis of pigments, and the clinically used topical topical pigmentation drugs (such as psoralen) are often difficult to function effectively and are photosensitive. Therefore, the need to develop therapeutically effective drugs is becoming increasingly urgent.
  • Fluoxetine chemical name N-methyl- ⁇ -[4-(trifluoromethyl)phenoxy]phenylpropylamine, clinically used as the hydrochloride salt of fluoxetine, the trade name is 100 Prozac®, developed by Eli Lilly and Company, was first listed in the United States in 1987. It was applied in English, French, German, Japanese, and other countries. It was registered in China in 1996 (X960445). Its molecular formula is C 17 H 18 F 3 NO ⁇ HC1, the molecular weight is 345.79, the hydrochloride is white crystal, and the melting point is 179-182 ° C (decomposition).
  • the main pharmacological action of fluoxetine is to selectively inhibit the reuptake of serotonin by the presynaptic membrane of the central nervous system, so it is also known as selective serotonin reuptake inhibitor.
  • Fluoxetine is well absorbed orally and is not affected by food. The plasma concentration reached a peak at 6 to 8 h, and the half-life of the active metabolite desfluoxetine was 7 to 10 days. Renal excretion is the main elimination route: about 80% of the drugs are in the urine and 15% are in the stool. Fluoxetine is basically metabolized by the liver, and liver disease can affect its elimination.
  • Fluoxetine mainly acts selectively on the serotoninergic system, and has a weak effect on the cholinergic system, the adrenergic system, and the histamine system, so it inhibits tricyclic, heterocyclic, and monoamine oxidases with traditional antidepressants. Compared with the agents, the agents have good curative effect, less adverse reactions, high safety and good tolerance. Common side effects include intestinal discomfort and neurological disorders such as anorexia, nausea, headache, insomnia, and sweating. Although fluoxetine is widely used clinically and has few side effects, its effect on skin pigment synthesis has never been studied. Summary of the invention
  • the present invention discloses a therapeutic use of fluoxetine, i.e., its use in the treatment of pigment depigmentation disorders, particularly in the treatment of white hair and vitiligo.
  • Part I Effect of fluoxetine on melanin synthesis in B16F10 mouse melanoma cell line.
  • B16F10 cells in good exponential growth phase were digested and counted.
  • the cells were resuspended in high glucose DMEM containing 10% fetal bovine serum, and the cells were seeded in 96-well culture plates at a seeding density of 2.2 ⁇ 10 4 / Ml, inoculum size 180 ⁇ l/well, set at 37°C, incubated in 5% C0 2 incubator for 24 hours; add different concentrations of fluoxetine hydrochloride, 20 ⁇ l/well, culture for 72 hours; add 20 ⁇ 1 ⁇ , 37° per well The reaction was carried out for 4 hours in a C incubator; the supernatant was aspirated, 150 ⁇ DMSO was added to each well, and shaken on a plate shaker for 10 minutes; the absorbance of each well was measured at a wavelength of 570 nm using a microplate reader, and the cells were counted. Proliferation rate, the results are shown in Figure 1.
  • Fluoxetine (0.1-10 ⁇ ) showed lower toxicity and lower cancer-promoting effects on B16F10 melanoma cells.
  • B16F10 cells in good exponential growth phase, digest, count, and inoculate the cells in 6-well plates at a concentration of about lxlO 5 / ml, inoculum volume of 2 ml / well, set at 37 ° C, 5% C0 2 Incubate for 24 hours in the incubator; replace high glucose DMEM medium containing 2.5% fetal bovine serum, 1.8ml/well, add fluoxetine hydrochloride at different concentrations, 0.2ml/well, culture for 72 hours; wash twice with PBS, collect cells In the doff tube, each tube was added with ⁇ non-denaturing lysate (containing 1 nM PM SF), lysed at 4 °C for 20 min, centrifuged at 4 °C, 12000 r/min for 10 min, and the supernatant was taken for protein quantification (BCA method).
  • BCA method protein quantification
  • Fluoxetine can significantly promote the melanin content of B16F10 cells.
  • B16F10 cells in the exponential growth phase were harvested, digested, counted, and the cells were seeded in a 6-well plate. The cells were treated as the same group. The cells were collected 72 h later, and the cell lysate was added. The supernatant was centrifuged to determine the protein concentration by BCA. After that, adjust the protein lysate to the same concentration, mix with an equal volume of 2 times loading buffer, boil for 5 min, and perform SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis; after electrophoresis, transfer the protein with 100 V voltage for 1 h.
  • fluoxetine significantly increased the protein expression of MITF, tyrosinase (TYR) and tyrosinase-related protein 1 (TRP-1) in B16F10 cells, and the difference was significant; There was no significant effect on the protein level of tyrosinase-related protein 2 (TRP-2).
  • Fluoxetine can increase melanin content by increasing the expression of important melanin synthesis proteins (MITF, TYR, TRP1) in B16F10 cells.
  • the normal human primary melanocytes in the exponential growth phase are harvested, digested, counted, and the cells are seeded in a 96-well culture plate at a seeding density of 5 ⁇ 10 4 /ml, and the inoculum size is 180 ⁇ l/well, set at 37 ° C.
  • Fluoxetine has no significant effect on the proliferation of human primary melanocytes and shows low toxicity.
  • Fluoxetine can significantly promote the melanin content of human primary melanocytes.
  • the primary melanocytes in the exponential growth phase were harvested, digested, counted, and the cells were seeded in a 6-well plate, and the cells were treated as the same group. After 72 hours, the cells were collected, the cell lysate was added, and the supernatant was centrifuged to obtain the supernatant BCA.
  • fluoxetine significantly increased the protein expression of human primary melanocytes MITF, tyrosinase (TYR) and tyrosinase-related protein 1 (TRP-1). Significant; no significant effect on protein levels of tyrosinase-related protein 2 (TRP-2).
  • Fluoxetine can increase melanin content by increasing the expression of important proteins of melanin synthesis in human primary melanocytes (MITF, TYR, TRP-1).
  • Part III Effect of fluoxetine on hair follicle melanin and melanin synthesis protein expression in C57BL/6 mice.
  • I Effect of fluoxetine on melanin synthesis in hair follicle of C57BL/6 mice
  • Photographs of the back skin of the mice showed that the skin color of the depilatory area of the fluoxetine group was significantly deeper than that of the vehicle control group on the 12th day of administration.
  • the animals were sacrificed after the 12th day of administration, and skin samples were taken for Western Blotting experiments. Take a certain amount of C57BL/6 mouse skin tissue, cut it, add tissue lysate and protease inhibitor, homogenize and extract protein; BCA method to determine protein concentration, adjust protein lysate to the same concentration, and equal volume 2 Mix the sample buffer, boil for 5 min, and perform SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis. After electrophoresis, transfer the protein to the NC membrane with 100 V voltage transfer for 1 h, using TBST with 5% skim milk.
  • the animals were sacrificed after dosing on day 12 and skin samples were taken parallel to the spinal line.
  • the skin tissue was fixed in 10% formaldehyde for 48 h, embedded in paraffin, sectioned longitudinally along the hair follicle (4 ⁇ ), and subjected to sputum and immunohistochemical staining.
  • HE staining Conventional hematoxylin-eosin staining.
  • Immunohistochemical staining section dewaxing hydration, incubated with 3% hydrogen peroxide at room temperature for 10 min, PBS rinse for 5 min, repeated 3 times.
  • fluoxetine significantly increased the hair loss synchronization skin area of C57BL/6 mice, and the hair follicle melanocyte tyrosinase (TYR) and tyrosinase-related protein located above the dermal papilla Protein expression of 1 (TRP-1) and tyrosinase-related protein 2 (TRP-2).
  • TRP-1 hair follicle melanocyte tyrosinase
  • TRP-2 tyrosinase-related protein located above the dermal papilla Protein expression of 1
  • TRP-2 tyrosinase-related protein 2
  • Figure 1 shows the effect of fluoxetine on the growth of B16F10 cells.
  • Figure 2 is the effect of fluoxetine on tyrosinase activity of B16F10 cells
  • Figure 3 is the effect of fluoxetine on the melanin content of B16F10 cells.
  • Figure 4 shows the effect of fluoxetine on the expression of melanin synthesis proteins MITF, TYR, TRP-1 and TRP-2 in B16F10 cells.
  • Figure 5 is a gray scale scan of fluoxetine on the melanin synthesis important proteins MI16, TYR, TRP-1 and TRP-2 of B16F10 cells.
  • Figure 6 shows the effect of fluoxetine on the proliferation of human primary melanocytes.
  • Figure 7 is the effect of fluoxetine on human primary melanocyte tyrosinase activity
  • Figure 8 is the effect of fluoxetine on melanin content in human primary melanocytes
  • Figure 9 shows the effect of fluoxetine on the expression of important proteins MITF, TYR, TRP-1 and TRP-2 in human primary melanocytes.
  • Figure 10 shows the gray scale scanning results of fluoxetine on melanin synthesis important proteins MITF, TYR, TRP-1 and TRP-2 in human primary melanocytes.
  • Figure 11 shows the color of the back skin of C57BL/6 mice on day 12 of fluoxetine administration.
  • Figure 12 shows the effect of fluoxetine on the expression of MITF, TYR, TRP-1 and TRP-2 proteins in hair follicle melanocytes of C57BL/6 mice.
  • Figure 13 is a grayscale scan of fluoxetine versus C57BL/6 mouse hair follicle melanocytes MITF, TYR, TRP-1 and TRP-2 bands.
  • Figure 14 shows the immunohistochemical results of important proteins in hair follicle melanogenesis of C57BL/6 mice.

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Abstract

本发明公开了氟西汀治疗色素脱色疾病的用途，特别是治疗白癜风和白发的用途。

Description

氟西汀治疗色素脱色疾病的用途 技术领域
本发明涉及医药领域， 具体涉及氟西汀治疗色素脱色疾病的用途。 背景技术
色素脱失性皮肤病是由于皮肤黑素细胞缺失或合成黑素功能降低、 受损而引起的一 类常见的后天性色素减退性皮肤病。如白发为常见的色素脱失疾病，涉及人群广泛。 另皮肤疑难症白癜风， 此类皮肤病在世界各地均有发生， 可以累及所有民族， 其严 重影响患者的正常生活。 目前色素脱失性皮肤病的治疗仍较困难， 且复发率高。而现有 的增色素药物本身的促进色素合成作用不显著， 且临床多用的局部外涂增色素药 （如补 骨脂素） 往往难以有效的发挥作用， 且具光敏性。 因此， 开发疗效确切的治疗药物的需 求日趋紧迫。
氟西汀 （fluoxetine), 化学名为 N-甲基 -γ-[4- (三氟甲基)苯氧基]苯基丙胺， 临床用的 是氟西汀的盐酸盐， 商品名为百忧解 （Prozac®), 由美国礼来公司开发， 1987年在美首 次上市， 先后在英、 法、 德、 日等国家应用， 1996年在我国注册 （X960445 )。 其分子式 为 C17H18F3NO · HC1, 分子量为 345.79， 盐酸盐为白色结晶， 熔点为 179— 182°C (分解）。
氟西汀的主要药理作用在于选择性地抑制中枢神经系统突触前膜对 5-羟色胺的再摄 取， 故又称为选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂。 氟西汀口服的吸收良好， 吸收不受食物影 响。 血药浓度 6〜 8 h达峰值， 其活性代谢产物去甲氟西汀半衰期为 7〜 10d。 肾排泄是主 要的消除途径： 约 80 % 的药物排在尿液中， 15 %的药物排在大便中。 氟西汀基本上经 肝代谢， 肝病可以影响其消除。 在临床上用于成人抑郁症、 强迫症和神经性贪食症的治 疗， 还用于治疗具有或不具有广场恐惧症的惊恐症。 氟西汀主要选择性作用于 5-羟色胺 能系统， 对胆碱能系统、 肾上腺素能系统和组胺系统的作用很弱， 所以与传统的抗抑郁 药三环类、 杂环类和单胺氧化酶抑制剂类相比具有疗效好、 不良反应轻而少、 安全性高、 耐受性好的特点。 其常见的不良反应有肠道不适和神经失调， 如厌食、 恶心、 头痛、 失 眠、 流汗等。 虽然氟西汀临床应用广泛、 副作用少， 但其对皮肤色素合成的影响从未被 研究。 发明内容
本发明公开了氟西汀的一种治疗用途， 即其可用于治疗色素脱色性疾病的用途， 特 别是治疗白发、 白癜风的用途。
下面是本发明的部分药效学试验及结果：
第一部分： 氟西汀对 B16F10小鼠黑素瘤细胞系黑素合成的影响。
一、 氟西汀对 B16F10细胞增值的影响
MTT法测定细胞增值率：
取处于指数生长期状态良好的 B16F10细胞， 消化、 计数， 用含 10%胎牛血清的高 糖 DMEM培养液重悬细胞， 将细胞接种于 96孔培养板中， 接种密度为 2.2xl04个 /ml， 接种量为 180μ1/孔， 置 37°C， 5% C02培养箱中培养 24小时； 加入不同浓度的盐酸氟西 汀， 20μ1 /孔， 培养 72小时； 每孔加入 20μ1 ΜΤΤ， 37°C培养箱中反应 4小时； 吸除上清 液， 每孔加入 150 ^ DMSO， 平板摇床上振摇 10分钟； 用微孔板测读仪在波长为 570nm 处测定每孔的吸光值， 计算细胞增殖率， 结果见图 1。
实验结果： 与空白对照组相比， 氟西汀给药组（0.1-10μΜ) 对 B16F10细胞生长无显 著性影响 （Ρ〉0.05 )。
实验结论： 氟西汀 （0.1-10 μΜ) 对 B16F10黑素瘤细胞显示出较低的毒性及较低的 促癌作用。
二、 氟西汀对 B16F10细胞酪氨酸酶活性的影响。
L-DOPA氧化法测定酪氨酸酶活性：
取处于指数生长期状态良好的 B16F10细胞， 消化， 计数， 将细胞接种于 6孔板中， 接种浓度约 lxlO5个 /ml， 接种量为 2 ml/孔， 置 37°C， 5% C02 培养箱中培养 24小时； 换含 2.5%胎牛血清的高糖 DMEM培养基， 1.8ml/孔， 加入不同浓度盐酸氟西汀， 0.2ml/ 孔， 培养 72小时； PBS洗 2遍， 收集细胞于 doff管中， 每管加入 ΙΟΟμΙ非变性裂解液 (含 1 nM PM SF), 4°C裂解 20 min, 4°C， 12000 r/min离心 10min，取上清用于蛋白定量 (BCA 法)，计算蛋白浓度；取含 30 μ§蛋白体积加入 96孔板，用 PBS (0.1 Μ, ρΗ 6.8)定量至 100 μ1， 再加入 0.01% L-DOPA 100μ1， 每一浓度设定 3个复孔， 37°C 避光孵育 60 min， 波长 475 nm处测定 OD 值。 计算每 μ§蛋白的吸光度值， 结果以百分率表示， 结果见图 2。 图 2中与对照组相比， * P<0.05，** P<0.01。 PSO为补骨脂素。
实验结果： 与空白对照组相比， 氟西汀显著促进 B16F10细胞的酪氨酸酶活性； 氟西 汀 1， 5μΜ 时， Ρ<0.05; 氟西汀 10 μΜ 时， Ρ<0.01 ; 最高浓度时， 酶活提高率与阳性药 补骨脂素接近。
实验结论： 氟西汀具显著的促进 B16F10黑素瘤细胞黑素合成限速酶-酪氨酸酶活性 效应。
三、 氟西汀对 B16F10细胞黑素含量的影响。
NaOH裂解法测定黑色素含量：
取处于指数生长期状态良好的 B16F10细胞， 消化， 计数， 将细胞接种于直径 10 cm 培养皿中， 接种量为 3xl05个 /皿， 置 37°C， 5% C02 培养箱中培养 24小时； 将培养基换 为含 2.5%胎牛血清的高糖 DMEM培养基， 并加入不同浓度盐酸氟西汀， 培养 72小时； PBS 洗 2 遍， 收集细胞， 加入 300ul非变性裂解液 (；含 InM PMSF), 4 °C裂解 20 min; 4 °C， 12000 r/min离心 10 min， 取上清用于蛋白定量 (BCA法)， 计算总蛋白含量； 下层 黑色素沉淀加入 200 μΐ NaOH (含 10% DMSO) ， 置于 80°C 水浴箱中裂解 2小时； 用 黑素标准品绘制标准黑素含量曲线;将溶解完全的黑素以 200 μΐ /孔加入 96孔板中，405nm 处测定吸光度值，计算每毫克蛋白的黑素含量，结果见图 3。图 3中与对照组相比， * P<0.05， ** P<0.01。 PSO为补骨脂素。
实验结果： 与空白对照组相比， 氟西汀 （1-10 μΜ) 显著增加 B16F10细胞的黑素含 量， 氟西汀 ΙμΜ 时， ΡΟ.05; 氟西汀 5， 10 μΜ 时， Ρ<0.01， 且提高率超过阳性药补骨 脂素。
实验结论： 氟西汀可显著促进 B16F10细胞黑素含量。
四、 氟西汀对 B16F10细胞黑素合成重要蛋白 TYR， TRP-1, TRP-2及 MITF表达的影响。
Western Blotting法检测黑素合成重要蛋白的表达：
取处于指数生长期状态良好的 B16F10细胞， 消化， 计数， 将细胞接种于 6孔板中， 同上分组进行药物处理， 72 h后收集细胞， 加入细胞裂解液， 离心取上清 BCA法测定 蛋白浓度后， 调整蛋白裂解液到相同浓度， 与等体积的 2倍上样缓冲液混匀， 煮沸 5 min 后进行 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳； 电泳完毕后， 用 100 V电压转移 l h将蛋白转 至测 NC 膜上， 用含 5% 脱脂牛奶的 TBST ( 0. 05%Tween- 20)封闭 1 h; 将膜分别与溶 于封闭液中的 TYR、 TRP-K TRP-2 MITF及 β-actin—抗 ( 1： 200) 4°C孵育过夜， TBST 洗 5 min， 3次； 后加入相应二抗 （1 : 4 000) 孵育 lh， TBST洗 3 次， 每次 5 min; 将 膜浸没于配置好的 ECL超敏感光混合液， 计时 5min， 暗室中采 X线片压膜发光； 经显 影及定影获得结果， 并采用 Bio- Rad 公司 Quantity one 软件分析结果。 结果见图 4、 图 5。 图中与对照组相比， * P<0.05，** P<0.01。 FLU表示氟西汀。
实验结果： 与空白对照组相比， 氟西汀可显著提高 B16F10细胞 MITF、 酪氨酸酶 (TYR)及酪氨酸酶相关蛋白 1 (TRP-1 ) 的蛋白表达， 差异具显著性； 而对酪氨酸酶相 关蛋白 2 (TRP-2) 的蛋白水平无明显影响。
实验结论： 氟西汀可通过提高 B16F10细胞黑素合成重要蛋白（MITF、 TYR、 TRP1 ) 的表达而增加黑素含量。
第二部分： 氟西汀对正常人原代黑素细胞黑素合成的影响
一、 氟西汀对人原代黑素细胞增值的影响
MTT法测定细胞增值率：
取处于指数生长期状态良好的正常人原代黑素细胞， 消化、 计数， 将细胞接种于 96 孔培养板中， 接种密度为 5xl04个 /ml， 接种量为 180μ1/孔， 置 37°C， 5% C02培养箱中 培养 24小时； 加入不同浓度的盐酸氟西汀， 培养 72小时； 每孔加入 20μ1 ΜΤΤ， 37°C 培养箱中反应 4小时； 吸除上清液， 每孔加入 150 ^ DMSO， 平板摇床上振摇 10分钟； 用微孔板测读仪在波长为 570nm处测定每孔的吸光值， 计算细胞增殖率。 结果见图 6。
实验结果： 与空白对照组相比， 氟西汀给药组对正常人原代黑素细胞生长无显著性 影响 （P〉0.05 )。
实验结论： 氟西汀对人原代黑素细胞增殖无显著影响， 且显示出较低的毒性。
二、 氟西汀对人原代黑素细胞酪氨酸酶活性的影响
L-DOPA氧化法测定酪氨酸酶活性：
取处于指数生长期状态良好的人原代黑素细胞， 消化， 计数， 将细胞接种于 6孔板 中， 接种浓度约 lxlO5个 /ml， 接种量为 2 ml/孔， 置 37°C， 5% C02 培养箱中培养 24小 时； 加入不同浓度盐酸氟西汀， 培养 72小时； PBS洗 2遍， 收集细胞于 doff管中， 每 管加入 80μ1非变性裂解液 (含 I nM PM SF), 4°C裂解 20 min， 4°C， 12000 r/min离心 lOmin, 取上清用于蛋白定量 (BCA法)， 计算蛋白浓度； 取含 10 μ§蛋白体积加入 96孔 板， 用 PBS (0.1 Μ，ρΗ 6.8)定量至 100 μ1， 再加入 0.01% L-DOPA 100μ1， 每一浓度设定 3 个复孔， 37°C 避光孵育 60 min， 波长 475 nm处测定 OD 值。计算每 μ§蛋白的吸光度 值， 结果以百分率表示， 结果见图 7。 图中与对照组相比， * P<0.05，** P<0.01。 PSO表 示补骨脂素。 实验结果： 与空白对照组相比， 氟西汀显著促进人原代黑素细胞的酪氨酸酶活性（P <0.01 )； 且氟西汀 5、 ΙΟ μΜ时， 酶活提高率超过阳药补骨脂素。
实验结论： 在所试浓度内， 氟西汀具显著的促进人原代黑素细胞黑素合成限速酶-酪 氨酸酶活性效应。
三、 氟西汀对人原代黑素细胞黑素含量的影响
NaOH裂解法测定黑色素含量：
取处于指数生长期状态良好的人原代黑素细胞， 消化， 计数， 将细胞接种于 6孔板 中， 接种浓度约 lxlO5个 /ml， 接种量为 2 ml/孔， 置 37°C， 5% C02 培养箱中培养 24小 时； 加入不同浓度盐酸氟西汀， 培养 72小时； PBS 洗 2 遍， 收集细胞， 加入 80 μ1非 变性裂解液 (含 InM PMSF), 4。C裂解 20 min; 4 °C， 12000 r/min离心 10 min， 取上清 用于蛋白定量 (BCA法)， 计算总蛋白含量； 下层黑色素沉淀加入 100 μΐ NaOH (含 10% DMSO) ， 置于 80°C 水浴箱中裂解 2小时； 用黑素标准品绘制标准黑素含量曲线； 将溶 解完全的黑素以 100 μΐ /孔加入 96孔板中， 405nm处测定吸光度值， 计算每毫克蛋白的 黑素含量， 结果见图 8。 图中与对照组相比， * P<0.05，** P<0.01。 PSO为补骨脂素。
实验结果： 与空白对照组相比， 氟西汀显著增加人原代黑素细胞的黑素含量， (P<0.01 )， 且提高率接近或超过阳性药补骨脂素。
实验结论： 氟西汀可显著促进人原代黑素细胞黑素含量。
四、氟西汀对人原代黑素细胞黑素合成重要蛋白 TYR， TRP-1, TRP-2及 MITF表达的影响。 Western Blotting法检测黑素合成重要蛋白的表达：
取处于指数生长期状态良好的人原代黑素细胞， 消化， 计数， 将细胞接种于 6孔板 中， 同上分组进行药物处理， 72 h后收集细胞， 加入细胞裂解液， 离心取上清 BCA法 测定蛋白浓度后， 调整蛋白裂解液到相同浓度， 与等体积的 2倍上样缓冲液混匀， 煮沸 5 min后进行 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳； 电泳完毕后， 用 100 V电压转移 1 h将蛋 白转至测 NC 膜上， 用含 5% 脱脂牛奶的 TBST ( 0. 05%Tween- 20) 封闭 1 h; 将膜分别 与溶于封闭液中的 TYR、 TRP-K TRP-2 MITF及 β-actin—抗 （1 : 200) 4°C孵育过夜， TBST洗 5 min, 3次； 后加入相应二抗（1 : 4 000)孵育 lh， TBST洗 3 次， 每次 5 min; 将膜浸没于配置好的 ECL超敏感光混合液， 计时 5min， 暗室中采 X线片压膜发光； 经 显影及定影获得结果， 并采用 Bio- Rad 公司 Quantity one 软件分析结果。 结果见图 9、 图 10。 图中与对照组相比， * P<0.05， ** P<0.01。 FLU表示氟西汀。 实验结果： 与空白对照组相比， 氟西汀可显著提高人原代黑素细胞 MITF、 酪氨酸酶 (TYR)及酪氨酸酶相关蛋白 1 (TRP-1 ) 的蛋白表达， 差异具显著性； 而对酪氨酸酶相 关蛋白 2 (TRP-2) 的蛋白水平无明显影响。
实验结论： 氟西汀可通过提高人原代黑素细胞黑素合成重要蛋白 （MITF、 TYR、 TRP-1 ) 的表达而增加黑素含量。
第三部分:氟西汀对脱毛同步化 C57BL/6小鼠毛囊黑素及黑素合成蛋白表达的影响。 一、 氟西汀对 C57BL/6小鼠皮肤毛囊黑素合成的影响
C57BL/6小鼠适应性伺养后，于实验前 1天，用松香 /石蜡混合物脱去动物背部毛发， 以诱导同步的毛囊生长周期。 动物随机分为溶媒对照组 （生理盐水） 和氟西汀给药组 (20mg/kg)， 每组 10只。 参考临床给药方法， 灌胃给药， 每天一次， 连续给药 12天。 于给药第 12天拍照记录小鼠背部皮肤颜色情况。 结果见图 11。
实验结果： 小鼠背部皮肤照片显示， 给药第 12天时， 与溶媒对照组相比， 氟西汀给 药组小鼠脱毛区皮肤颜色显著加深。
实验结论：氟西汀灌胃给药 12天，可显著促进脱毛同步化 C57BL/6小鼠皮肤的黑素 合成。
二、 Western Blotting法检测 C57BL/6小鼠毛囊黑素合成重要蛋白的表达
于第 12天给药后处死上述动物， 采集皮肤样本进行 Western Blotting实验。 取一定 量的 C57BL/6小鼠皮肤组织， 剪碎， 加入组织裂解液和蛋白酶抑制剂， 均浆并提取蛋白 质； BCA法测定蛋白浓度后， 调整蛋白裂解液到相同浓度， 与等体积的 2倍上样缓冲液 混匀， 煮沸 5 min后进行 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳； 电泳完毕后， 用 100 V电压 转移 l h将蛋白转至测 NC 膜上， 用含 5% 脱脂牛奶的 TBST ( 0. 05%Tween- 20) 封闭 1 h; 将膜分别与溶于封闭液中的 TYR、 TRP-1、 TRP-2 MITF及 β-actin—抗（1 : 200) 4°C 孵育过夜， TBST洗 5 min， 3次； 后加入相应二抗 （1 : 4 000) 孵育 lh， TBST洗 3 次， 每次 5 min; 将膜浸没于配置好的 ECL超敏感光混合液， 计时 5min， 暗室中采 X线片 压膜发光； 经显影及定影获得结果， 并采用 Bio- Rad 公司 Quantity one 软件分析结果。 结果见图 12、 图 13。 图中与对照组相比， * P<0.05，** P<0.01。 FLU表示氟西汀组。
实验结果： 与空白对照组相比， 氟西汀可显著提高 C57BL/6小鼠脱毛同步化皮肤毛 囊 MITF、酪氨酸酶（TYR)、酪氨酸酶相关蛋白 1 (TRP-1 )及酪氨酸酶相关蛋白 2 (TRP-2) 的蛋白表达， 差异具显著性。 实验结论： 氟西汀可通过提高 C57BL/6小鼠脱毛同步化皮肤毛囊黑素细胞中黑素合 成重要蛋白的表达而增加毛囊黑素含量。
三、 免疫组化法检测 C57BL/6小鼠毛囊黑素合成重要蛋白的表达
于第 12天给药后处死上述动物， 平行于脊柱线采集皮肤样本。皮肤组织固定于 10% 甲醛 48 h， 石蜡包埋， 沿毛囊纵向切片（4μηι)， 分别进行 ΗΕ、免疫组化染色。 HE 染色： 常规苏木素 -伊红染色。免疫组织化学染色：切片脱蜡水化， 3 %过氧化氢室温孵育 lO min, PBS冲洗 5 min， 重复 3次。 热抗原修复后滴加山羊血清封闭液封闭 20 min， 加入兔源 TYR、 TRP-1及 TRP-2抗体 4°C孵育过夜。 PBS冲洗 3次后加入 TRITC标记的山羊抗兔 IgG， 37 °C 孵育 30 min， PBS冲洗 3次， 每 5 min。 加入抗荧光淬灭剂， 封片。 用一抗稀 释液代替一抗重复上述过程作为阴性对照实验。 每只动物选取 2张皮肤切片， 每张随机 选取 5个视野， 用荧光显微镜拍照记录。 结果见图 14。 途中比例尺： 20 μηι; dp, 毛乳 头。
实验结果：与空白对照组相比，氟西汀可显著提高 C57BL/6小鼠脱毛同步化皮肤区， 位于毛乳头上方的毛囊黑素细胞酪氨酸酶 （TYR)、 酪氨酸酶相关蛋白 1 ( TRP-1 ) 及酪 氨酸酶相关蛋白 2 ( TRP-2) 的蛋白表达。
实验结论： 与 Western Blotting结果一致， 氟西汀可通过提高 C57BL/6小鼠脱毛同步 化皮肤毛囊黑素细胞中黑素合成重要蛋白的表达而增加毛囊黑素含量。 附图说明
图 1是氟西汀对 B16F10细胞生长的影响
图 2是氟西汀对 B16F10细胞酪氨酸酶活性的影响
图 3是氟西汀对 B16F10细胞黑素含量的影响
图 4是氟西汀对 B16F10细胞黑素合成重要蛋白 MITF， TYR, TRP-1及 TRP-2蛋白表达的 影响
图 5是氟西汀对 B16F10细胞黑素合成重要蛋白 MITF， TYR, TRP-1及 TRP-2条带灰度扫 描结果
图 6是氟西汀对人原代黑素细胞增值的影响
图 7是氟西汀对人原代黑素细胞酪氨酸酶活性的影响
图 8是氟西汀对人原代黑素细胞黑素含量的影响 图 9是 氟西汀对人原代黑素细胞黑素合成重要蛋白 MITF, TYR, TRP-1及 TRP-2蛋白表 达的影响
图 10是氟西汀对人原代黑素细胞黑素合成重要蛋白 MITF, TYR, TRP-1及 TRP-2条带灰 度扫描结果。
图 11是氟西汀给药第 12天脱毛同步化 C57BL/6小鼠背部皮肤颜色情况
图 12是氟西汀对 C57BL/6小鼠毛囊黑素细胞 MITF, TYR, TRP-1及 TRP-2蛋白表达的影 响
图 13是氟西汀对 C57BL/6小鼠毛囊黑素细胞 MITF, TYR, TRP-1及 TRP-2条带灰度扫描 结果
图 14是 C57BL/6小鼠毛囊黑素合成重要蛋白免疫组化结果

Claims

权利要求书 、 氟西汀用于制备治疗和 /或预防色素脱色疾病的药物的用途。 、 权利要求 1的用途， 其中色素脱色疾病是白癜风。
、 权利要求 1的用途， 其中色素脱色疾病是白发。
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