WO2013077228A1 - microRNAを有効成分とするIMPDH阻害剤 - Google Patents

microRNAを有効成分とするIMPDH阻害剤 Download PDF

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    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs

Definitions

  • the present invention relates to an inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) inhibitor containing microRNA as an active ingredient.
  • IMPDH inosine monophosphate dehydrogenase
  • MicroRNA (hereinafter sometimes referred to as “miRNA”) is a single-stranded RNA consisting of about 22 to 25 bases that does not encode proteins. To date, more than 5,000 miRNAs have been registered. It is a functional small RNA involved in cell proliferation, differentiation and development, and plays an important role in the control of gene expression. miRNAs are transcribed from DNA in the form of longer RNAs as precursors in the nucleus, synthesized as pri-miRNAs, converted to pre-miRNAs by Drosha and transported to the cytoplasm.
  • This pre-miRNA becomes a double-stranded RNA of about 22-25 bases by the action of Dicer, one of the RNA is released, and the remaining strand is incorporated into a RISC (RNA-induced silencing complex) complex, Involved in gene function control.
  • the miRNA in the RISC complex binds to the 3 ′ untranslated region (3′UTR) of the target gene mRNA. Since miRNA suppresses protein synthesis of mRNA without degrading the target mRNA, it is impossible to find a true target gene by a technique for examining mRNA variation such as an mRNA array.
  • the miRNA binding mode does not form a pair in the entire sequence, but binds around the 8 'base region (called the seed sequence) on the 5' side of the miRNA and includes a mismatch as a whole. To do. This makes it difficult to search for the target gene of miRNA, and the target gene group cannot be found with simple base sequence alignment analysis software.
  • Inosine monophosphate dehydrogenase (hereinafter referred to as “IMPDH”) is an enzyme associated with de novo synthesis of guanosine nucleotides.
  • the synthesis of nucleotides in an organism is generally required for the cell division and replication of the organism. Nucleotide synthesis in mammals is achieved through one of two pathways, the nascent pathway and the recycling pathway. Increased IMPDH activity has been observed in rapidly proliferating human leukocyte cell lines and other tumor cell lines, suggesting that IMPDH may be a target for immunosuppressive and anticancer therapies. It is also known that IMPDH is involved in virus replication in virus-infected cell lines.
  • IMPDH has attracted attention in the development of various pharmaceuticals, for example, it can be considered as an immunosuppressant, anticancer agent, antivascular hyperproliferative agent, anti-inflammatory agent, antifungal agent, anti-psoriasis and antiviral agent. It is done.
  • IMPDH inhibitors As IMPDH inhibitors, immunosuppressive agents such as mycophenolic acid (MPA) derivatives, antiviral agents such as ribavirin, and anticancer agents such as purine metabolism inhibitors have been put into practical use.
  • MPA mycophenolic acid
  • antiviral agents such as ribavirin
  • anticancer agents such as purine metabolism inhibitors
  • Patent Documents 1 to 5 Various patent applications (Patent Documents 1 to 5) have been filed for novel IMPDH inhibitors, and all of the substances disclosed in these patent documents are low molecular compounds.
  • IMPDH inhibitors have problems such as having side effects, and development of more effective IMPDH inhibitors is desired.
  • An object of the present invention is to provide a novel IMPDH inhibitor using miRNA.
  • microRNA 19a (miR-19a) of miRNA can suppress IMPDH protein biosynthesis by acting on mRNA of IMPDH gene.
  • the headline and the present invention were completed.
  • this invention consists of the following. 1.
  • An IMPDH inhibitor containing one or more oligonucleotides selected from the following 1) to 5) as active ingredients: 1) an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA); 2) an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA); 3) an oligonucleotide having a base sequence in which 1 to 3 nucleotides are substituted, deleted, inserted or added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2; 4) an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the oligonucleotide shown in any one of 1) to 3 above; 5) An oligonucleotide encoding the oligonucleotide according to any one of 1) to 4) above.
  • the IMPDH inhibitor according to item 1 above which comprises an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or 2 as an active ingredient.
  • 3. The IMPDH inhibitor according to item 1 or 2, comprising a vector into which any of the oligonucleotides described in item 1 or 2 is inserted.
  • the oligonucleotide of the present invention that is, 1) the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA); 2) the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA); 3) the above SEQ ID NO: 1 or 2
  • an oligonucleotide consisting of a complementary base sequence On the other hand, an oligonucleotide consisting of a complementary base sequence; 5)
  • the oligonucleotide encoding the oligonucleotide according to any one of 1) to 4) described above is biosynthesized
  • IMPDH inhibitor can function as an IMPDH inhibitor. Since it can function as an IMPDH inhibitor, it may be an immunosuppressant, anticancer agent, antivascular hyperproliferative agent, anti-inflammatory agent, antifungal agent, anti-psoriasis, and antiviral agent.
  • Example 1 It is a figure which shows the state of a gene when the miRNA target site
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having confirmed the luciferase activity at the time of introduce
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having confirmed the luciferase activity at the time of introduce
  • Example 2 It is a photograph figure which shows the result of having confirmed the biosynthesis of each protein at the time of introduce
  • Example 3 It is a figure which shows the result of having analyzed the difference in the mRNA expression level by the presence or absence of miRNA by adding antisense strand miRNA and knocking down miRNA about each mRNA of IMPDH1 and NPEPL1 by RT-PCR method.
  • Example 4 It is a figure which shows the result of having analyzed the difference in the mRNA expression level by the presence or absence of miRNA by adding antisense strand miRNA and knocking down miRNA about each mRNA of IMPDH1 and NPEPL1 by RT-PCR method.
  • the present invention relates to an inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) inhibitor containing a specific oligonucleotide as an active ingredient.
  • IMPDH inosine monophosphate dehydrogenase
  • the oligonucleotide as an active ingredient contained in the IMPDH inhibitor in the present specification contains one or more of any oligonucleotide selected from 1) to 5): 1) an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA); 2) an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA); 3) an oligonucleotide having a base sequence in which 1 to 3 nucleotides are substituted, deleted, inserted or added to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2; 4) an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the oligonucleotide shown in any one of 1) to 3 above; 5) An oligonucleotide encoding the oligonucleotide according to any one of 1) to 4) above.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1 can be referred to from FIG.
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a sequence showing miR-19a
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 2 in FIG. 1 is a reverse sequence almost complementary to the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the miRNA precursor pri-miRNA has a hairpin loop structure (stem loop structure) that includes the miRNA sequence and the complementary reverse sequence.
  • complementary does not necessarily mean that they are completely complementary, and is unpaired due to mismatch (corresponding base is not complementary), bulge (no base corresponding to one strand), etc. A combined portion may be included.
  • the length of the oligonucleotide as an active ingredient is not limited as long as it has a function of suppressing the biosynthesis of IMPDH protein.
  • the oligonucleotide as the active ingredient of the present invention may be an oligonucleotide capable of expressing miRNA having a function of suppressing biosynthesis of IMPDH protein.
  • the oligonucleotide when it is a mature form of miRNA, it can be 15 to 30 bases, preferably 20 to 25 bases.
  • an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, ie, miR-19a or miR-19a * is used.
  • the oligonucleotide as the active ingredient may be included in the precursor form of miRNA.
  • the precursor type of miRNA is usually about 80 to 120 bases in size.
  • it when preparing a vector capable of expressing an oligonucleotide as the active ingredient, it can be prepared by introducing an oligonucleotide of about 240 bases containing a miRNA precursor into the vector.
  • the oligonucleotide showing the miRNA precursor reference can be made to the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 3 in FIG.
  • the target gene of miR-19a was analyzed by a proteomics analysis method, but any known method may be used as long as it can analyze the target gene of miRNA, and any type that will be developed in the future.
  • the analysis can be performed by a method, and the analysis method itself is not particularly limited.
  • the oligonucleotide as an active ingredient may be designed and synthesized by any method known in the art.
  • it can be synthesized by a known nucleic acid synthesis reaction.
  • it is possible to synthesize independently using a commercially available synthesizer, or to request synthesis using a contract service.
  • the IMPDH inhibitor of the present invention is considered to be an immunosuppressive agent, anticancer agent, antivascular hyperproliferative agent, anti-inflammatory agent, antifungal agent, anti-psoriasis, and antiviral agent.
  • the IMPDH inhibitor of the present invention can be administered with a therapeutically effective amount of oligonucleotide according to the intended purpose.
  • the administration method is not particularly limited as long as it is an administration method in which an oligonucleotide as an active ingredient is delivered to a target site such as a pathogenic cell or virus and can exert its function.
  • administration of the oligonucleotide of the present invention only requires expression of an oligonucleotide, such as miR-19a, as an active ingredient at the target site.
  • the oligonucleotide as the active ingredient of the present invention can be appropriately administered together with the oligonucleotide itself or a vector into which the oligonucleotide has been introduced.
  • a viral vector such as a retrovirus, adenovirus, or Sendai virus
  • a non-viral vector such as a liposome, polymer-based nanoparticle, cholesterol conjugate, cyclodextran complex, polyethyleneimine polymer, or protein complex is used as the vector. can do.
  • the oligonucleotide as an active ingredient of the present invention and a vector containing the oligonucleotide can be administered together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, local administration to the target site, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, nasal administration, intraperitoneal administration, vaginal administration, anal administration, oral administration, intraocular administration, intrathecal It can be administered by an administration method such as administration.
  • Formulations for topical administration include ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquid or powder formulations, and carriers are conventional, such as aqueous, powder or oily bases, thickeners, etc.
  • a carrier can be used as desired.
  • formulations suitable for intravenous, subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal administration include antioxidants, buffers, sugar preparations, suspensions, thickeners, dispersants, stabilizers and preservatives.
  • An aqueous or non-aqueous solution or emulsion that can contain any one selected from:
  • each antisense strand miRNA was made into anti-miR-LNA by using artificial nucleic acid (Locked Nucleic Acid: LNA TM ) for 4 bases at the 5 ′ end and 4 bases at the 3 ′ end.
  • LNA TM Artificial Nucleic Acid
  • anti-miR-19a anti-miR-20a, or anti-miR-92
  • anti-miR-LNA anti-miR-LNA into which LNA is introduced.
  • Each antisense strand miRNA was commissioned to Gene Design Corporation.
  • Anti-miR-19a, anti-miR-20a which is an antisense strand miRNA (anti-miR-LNA) against miR-19a, miR-20a and miR-92, on MCF-7 cells (human breast cancer-derived cell line), the variation in the expression level of each corresponding miRNA when introduced anti-miR-92, real-time PCR (TaqMan (R) Real-time PCR method, TaqMan MicroRNA Assay kit; Applied Biosystems, Inc.) was confirmed by.
  • anti-miR-LNA antisense strand miRNA
  • MCF-7 cells human breast cancer-derived cell line
  • MCF-7 cells are seeded in a 24-well culture plate and cultured for 24 hours in OPTI-MEM medium (Invitrogen) containing 10% calf serum. It was introduced using a reagent, Invitrogen).
  • OPTI-MEM medium Invitrogen
  • RNA is extracted using RNA extraction reagent (Isogen, Nippon Gene) 24 hours, 48 hours and 72 hours later, and the expression level of each miRNA is determined by real-time PCR Confirmed.
  • RNA extraction reagent Isogen, Nippon Gene
  • the expression level of each miRNA at 0 hours after introduction of each antisense strand miRNA was measured and set to 100.
  • FIG. 2 when each antisense strand miRNA was introduced, it was confirmed that the expression level of each miRNA was reduced, and the expression level of each miRNA was the lowest at 48 hours after introduction. confirmed. In particular, it was confirmed that anti-miR-19a against miR-19a could most effectively reduce the expression of the corresponding miRNA, ie miR-19a.
  • the protein extracted from MCF-7 cells was subjected to two-dimensional electrophoresis treatment, and then the fluorescently stained gel image was detected and quantified using image analysis software, and the amount of protein biosynthesis between the two groups was determined. The difference was compared and analyzed (see FIG. 4).
  • 123 protein spots where a significant increase in the amount of biosynthesis was observed were cut out using a liquid chromatography mass spectrometer (Agilent Nanoflow LC / MS / MS system), The protein of each spot was identified (see FIGS. 5-8).
  • a study was conducted to narrow down the true target protein of miRNA from the 123 proteins analyzed in Reference Example 2 above.
  • miRNA binding region analysis software is used to select a gene mRNA corresponding to the identified protein in the 3'UTR region that has a target sequence to which each miRNA binds, and then PPP2R2A (protein phosphatase 2 (formerly 2A) ), ARHGAP1 (Rho GTPase activating protein 1), IMPDH1 (IMP dehydrogenase 1) and NPEPL1 (Homo sapiens aminopeptidase-like 1) (see Fig. 9).
  • PPP2R2A protein phosphatase 2 (formerly 2A)
  • ARHGAP1 Rho GTPase activating protein 1
  • IMPDH1 IMP dehydrogenase 1
  • NPEPL1 Homo sapiens aminopeptidase-like 1
  • Example 1 Action 1 of each miRNA on target gene 1
  • the action of each miRNA on the target candidate gene and the amount of biosynthesis of the target protein were confirmed by luciferase reporter analysis.
  • luciferase reporter plasmids were prepared in which the miRNA target sequences (forward direction) of these genes were each arranged on the 3 ′ UTR side of the luciferase gene (see FIG. 10).
  • the luciferase reporter plasmid in which each miRNA target sequence was arranged was introduced into HEK293 cells.
  • a control was one in which each miRNA target sequence (reverse direction) was introduced. Each was compared for luciferase activity.
  • the target sequence for miR-20a (SEQ ID NO: 4) of the PPP2R2A gene consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (5'-TAGGTAAGGGTAGGGCACTTTT-3 '), and for miR-19a (SEQ ID NO: 1) of the ARHGAP1 gene
  • the target sequence consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (5′-TCATGTATTTCACCGTTTGCACTTTT-3 ′).
  • the target sequence for miR-19a of the IMPDH1 gene is SEQ ID NO: 7 (5′-TGAGTGGTCCACAGATTTGCACT-3 ′) and SEQ ID NO: 8
  • the target sequence for miR-19a of the NPEPL1 gene consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 (5'-GATCTTTTACCTCACTTTGCACT-3 ') (see FIG. 10).
  • Example 2 Action 2 of each miRNA on target gene 2
  • the action confirmation test of each miRNA against the target gene was performed by measuring the luciferase activity when each miRNA was allowed to act on each antisense strand miRNA (anti-miR-LNA).
  • Anti-miR-19a, anti-miR-20a and anti-miR-92 shown in Reference Example 1 were used as the antisense strand miRNA.
  • the luciferase reporter plasmid prepared in Example 1 and each corresponding antisense strand miRNA were simultaneously introduced into HEK293 cells to knock down each miRNA. Random sequence LNA was used as a control instead of antisense strand miRNA, and luciferase activity was compared for each.
  • Example 4 Action 4 of each miRNA on target gene 4 miRNA is thought to inhibit protein synthesis without degrading mRNA. From the results of Example 3, it was confirmed that IMPDH1 protein and NPEPL1 protein increased in the presence of antisense strand miRNA (anti-miR-LNA) corresponding to miR-19a. Therefore, in this example, the difference in mRNA expression level depending on the presence or absence of miRNA was analyzed by RT-PCR for IMPDH1 and NPEPL1 mRNA. As a result, it was confirmed that even when the antisense strand miRNA was added and the miRNA was knocked down, the mRNA expression level related to the target protein was not affected (FIG. 14).
  • miR-19a the target genes of miR-19a are the IMPDH1 gene and the NPEPL1 gene, and in particular, affect the biosynthesis of the IMPDH1 protein. Therefore, it was confirmed that miR-19a can function as an IMPDH1 inhibitor.
  • the oligonucleotide according to miR-19a of the present invention acts on the mRNA of the IMPDH gene, suppresses the biosynthesis of the IMPDH protein, and can function as an IMPDH inhibitor. Since the oligonucleotide of the present invention can function as an active ingredient of an IMPDH inhibitor, the IMPDH inhibitor containing the oligonucleotide of the present invention as an active ingredient is used as an immunosuppressive agent, anticancer agent, antivascular hyperproliferative agent. It could be an anti-inflammatory, antifungal, anti-psoriatic, and antiviral agent. In particular, it is considered that the IMPDH inhibitor of the present invention can exert an antiviral effect by acting on a virus regardless of the mutation of the virus caused by the use of a conventional antiviral agent.

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Abstract

miRNAによる新規なIMPDH阻害剤を提供する。miRNAのうち、miR-19aに係るオリゴヌクレオチドを有効成分とするIMPDH阻害剤による。miR-19aに係るオリゴヌクレオチドは、以下の１）～５）から選択されるいずれかに示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである：１）配列番号１（UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA）に示す塩基配列；２）配列番号２（AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA）に示す塩基配列；３）上記配列番号１又は２に示す塩基配列に対して１～３個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列；４）上記１）～３のいずれか１に示すオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列；５）上記１）～４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列。上記オリゴヌクレオチドは、IMPDH遺伝子のmRNAに作用することでIMPDH蛋白の生合成を抑制し、IMPDH阻害剤として機能しうる。

Description

microRNAを有効成分とするIMPDH阻害剤
　本発明は、microRNAを有効成分とするイノシン一リン酸脱水素酵素（inosine 5'-monophosphate dehydrogenase:IMPDH）阻害剤に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願２０１１－２５７１５８号優先権を請求する。
　microRNA（以下、「miRNA」という場合もある。）は、蛋白をコードしていない約22～25塩基からなる一本鎖RNAで、これまでに約5,000個以上のmiRNAが登録されている。細胞の増殖、分化、発生に関わっている機能性低分子RNAであり、遺伝子発現の制御において重要な役割を担っている。miRNAは、核内で前駆体としてより長いRNAの形でDNAから転写され、pri-miRNAとして合成され、Droshaによってpre-miRNAとなり細胞質に運ばれる。このpre-miRNAはDicerの作用により約22～25塩基の二本鎖RNAとなり、一方のRNAが放出され、残された鎖がRISC（RNA-induced silencing complex）複合体に取込まれ、miRNAとして遺伝子機能制御に関与する。RISC複合体中のmiRNAは、標的となる遺伝子mRNAの3'非翻訳領域(3'UTR)に結合する。miRNAは標的mRNAを分解することなくmRNAの蛋白合成を抑制するために、mRNAアレイのようなmRNAの変動を調べる技術では真の標的遺伝子を見出すことが不可能である。また、miRNAの結合様式は、全配列がペアを形成するのではなく、miRNAの5'側の約8塩基（シード配列と呼ばれる）領域を中心として結合し、全体としてミスマッチを含んだ形で結合する。このことが、miRNAの標的遺伝子の探索を困難なものにしており、単純な塩基配列同士のアライメント解析ソフトでは標的遺伝子群は見いだせない。
　イノシン一リン酸脱水素酵素（以下、「IMPDH」という。）はグアノシンヌクレオチドのde novo合成に関連する酵素である。生物におけるヌクレオチド類の合成は一般に生物の細胞分裂および複製に必要とされる。哺乳類におけるヌクレオチド合成は新生経路と再利用経路の二経路のうちの一方を通じて実現される。増殖の早いヒト白血球細胞系や、その他の腫瘍細胞系において、IMPDHの活性上昇が観察されており、IMPDHが免疫抑制療法や抗癌療法のための標的となり得ることが示唆される。また、ウイルスに感染した細胞系におけるウイルスの複製において、IMPDHが関与することも知られている。これらのことから、IMPDHは種々の医薬品の開発において着目されており、例えば免疫抑制剤、抗癌剤、抗血管過増殖剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗乾癬、及び抗ウイルス剤となり得ると考えられる。
　IMPDH阻害剤として、マイコフェノール酸（mycophenolic acid; MPA）誘導体などの免疫抑制剤、リバビリン等の抗ウイルス剤、プリン代謝阻害薬等の抗癌剤等が実用化されている。新規なIMPDH阻害剤については各種特許出願（特許文献１～５）がなされているが、これらの特許文献に開示される物質は、いずれも低分子化合物である。IMPDH阻害剤は副作用を有するなど問題点があり、さらに効果的なIMPDH阻害剤の開発が望まれている。
特開2001-261663号公報 特表2003-503408号公報 特表2002-539258号公報 特表2002-528533号公報 特表2001-526638号公報
　本発明は、miRNAによる新規なIMPDH阻害剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、miRNAのうちmicroRNA 19a（miR-19a）がIMPDH遺伝子のmRNAに作用することでIMPDH蛋白の生合成を抑制うることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下よりなる。
１．以下の１）～５）から選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを１種又は２種以上を有効成分として含有する、IMPDH阻害剤：
１）配列番号１（UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）配列番号２（AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）上記配列番号１又は２に示す塩基配列に対して１～３個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）上記１）～３のいずれか１に示すオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）上記１）～４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチド。
２．配列番号１及び／又は２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、前項１に記載のIMPDH阻害剤。
３．前項１又は２に示すいずれかのオリゴヌクレオチドが挿入されたベクターを含む前項１又は２に記載のIMPDH阻害剤。
　本発明のオリゴヌクレオチド、すなわち１）配列番号１（UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；２）配列番号２（AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；３）上記配列番号１又は２に示す塩基配列に対して１～３個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；４）上記１）～３のいずれか１に示すオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；５）上記１）～４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチドは、IMPDH遺伝子のmRNAに作用することでIMPDH蛋白の生合成を抑制し、IMPDH阻害剤として機能しうることが確認された。IMPDH阻害剤として機能しうることから、免疫抑制剤、抗癌剤、抗血管過増殖剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗乾癬、及び抗ウイルス剤となり得ると考えられる。
ヒトのmiR-19aステムループを示す図である。 MCF-7細胞に、miR-19a、miR-20a、miR-92に対するアンチセンス鎖miRNA（anti-miRNA Locked Nucleic Acid: anti-miR-LNA）であるanti-miR-19a、anti-miR-20a、anti-miR-92を導入したときに、対応するmiRNAの発現量の変動を、TaqMan Real-time PCR法により確認した結果を示す図である。（参考例１） 各アンチセンス鎖miRNAをMCF-7細胞に導入した場合の、MCF-7細胞による蛋白の生合成を二次元電気泳動により確認した結果を示す写真図である。（参考例２） MCF-7細胞から抽出した蛋白を二次元電気泳動後、蛍光染色したゲルイメージ像について、画像解析ソフトを用いて約2000スポット蛋白の検出及び定量し、両群間の蛋白生合成量の差を比較解析したもののうち、PPP2R2A、ARHGAP1、IMPDH1及びNPEPL1の４種の結果を示す写真図である。（参考例２） 二次元電気泳動により得られたスポットの一つについて蛋白を質量分析計にて分析した結果を示す図である。ここではPPP2R2Aが同定された。（参考例３） 二次元電気泳動により得られたスポットの一つについて蛋白を質量分析計にて分析した結果を示す図である。ここではARHGAP1が同定された。（参考例３） 二次元電気泳動により得られたスポットの一つについて蛋白を質量分析計にて分析した結果を示す図である。ここではIMPDH1が同定された。（参考例３） 二次元電気泳動により得られたスポットの一つについて蛋白を質量分析計にて分析した結果を示す図である。ここではNPEPL1が同定された。（参考例３） 各候補遺伝子のmiRNA標的部位を示す図である。（実施例１） 候補遺伝子に対する各miRNAの作用を確認するために、各候補遺伝子のmiRNA標的部位をルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR側に導入したときの遺伝子の状態を示す図である。（実施例１） 各候補遺伝子のmiRNA標的部位を配置したルシフェラーゼレポータープラスミドをHEK293細胞内に導入した場合のルシフェラーゼ活性を確認した結果を示す図である。（実施例１） 各候補遺伝子のmiRNA標的部位を配置したルシフェラーゼレポータープラスミドと各アンチセンス鎖miRNAをHEK293細胞内に導入した場合のルシフェラーゼ活性を確認した結果を示す図である。（実施例２） MCF-7細胞内に各アンチセンス鎖miRNAを導入した場合の各蛋白の生合成を、ウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す写真図である。（実施例３） IMPDH1及びNPEPL1の各mRNAについて、アンチセンス鎖miRNAを加えてmiRNAをノックダウンすることによるmiRNAの有無によるmRNA発現量の違いをRT-PCR法により解析した結果を示す図である。（実施例４）
　本発明は、特定のオリゴヌクレオチドを有効成分とするイノシン一リン酸脱水素酵素（inosine 5'-monophosphate dehydrogenase:IMPDH）阻害剤に関する。
　本明細書におけるIMPDH阻害剤に含まれる有効成分としてのオリゴヌクレオチドは、１）～５）から選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを１種又は２種以上を含有する：
１）配列番号１（UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）配列番号２（AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）上記配列番号１又は２に示す塩基配列に対して１～３個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）上記１）～３のいずれか１に示すオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）上記１）～４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチド。
　上記において、配列番号１に記載の塩基配列は図１より参照することができる。図１において、配列番号１に記載の配列はmiR-19aを示す配列であり、図１の配列番号２に示す配列は、配列番号１に記載の配列に対してほぼ相補的な逆向きの配列となる。背景技術の欄でも説明したように、miRNAの前駆体であるpri-miRNA（primary miRNA）はmiRNAの配列と、それに相補的な逆向きの配列とを含むヘアピンループ構造（ステムループ構造）をとる。本明細書において、相補的とは、必ずしも完全に相補的であることを意味せず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。
　本発明において、有効成分としてのオリゴヌクレオチドは、IMPDH蛋白の生合成を抑制する機能を有する限りその長さを問わない。本発明の有効成分としてのオリゴヌクレオチドは、IMPDH蛋白の生合成を抑制する機能を有するmiRNAを発現可能なオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、オリゴヌクレオチドがmiRNAの成熟型である場合は15～30塩基とすることができ、好ましくは20～25塩基である。最も好ましくは、配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、即ちmiR-19a又はmiR-19a*が挙げられる。前記有効成分としてのオリゴヌクレオチドは、miRNAの前駆体型に含まれていてもよい。miRNAの前駆体型は通常80～120塩基前後の大きさである。例えば前記有効成分としてのオリゴヌクレオチドを発現可能なベクターを作製する場合に、miRNA前駆体を含む約240塩基程度のオリゴヌクレオチドをベクターに導入して作製することができる。miRNA前駆体を示すオリゴヌクレオチドの例として、図１の配列番号３に示すオリゴヌクレオチドを参照することができる。
　本発明では、miR-19aの標的遺伝子を確認した結果、miR-19aがIMPDH蛋白の生合成を抑制しうることを確認した。本発明において、miR-19aの標的遺伝子は、プロテオミクス解析方法により解析したが、miRNAの標的遺伝子を解析可能な方法であれば、既存の公知の方法であってもよいし、今後開発されるあらゆる方法により解析することができ、解析方法自体は特に限定されない。
　本発明のIMPDH阻害剤において、有効成分としてのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知のいずれの手法により設計し、合成してもよい。例えば、公知の核酸合成反応により合成することができる。例えば、市販の合成機を用いて独自に合成することもできるし、受託サービスを利用して合成依頼することもできる。
　本発明のIMPDH阻害剤は、免疫抑制剤、抗癌剤、抗血管過増殖剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗乾癬、及び抗ウイルス剤となり得ると考えられる。本発明のIMPDH阻害剤は、それぞれの使用目的に応じて治療上有効量のオリゴヌクレオチドを投与することができる。投与方法としては、有効成分としてのオリゴヌクレオチドが病原細胞やウイルス等の標的部位に送達され、その機能を発揮しうる投与方法であればよく、特に限定されない。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの投与により、標的部位において有効成分としてのオリゴヌクレオチド、例えばmiR-19aが発現されればよい。
　本発明の有効成分としてのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドそのもの、又はオリゴヌクレオチドを導入したベクターとともに適宜投与することができる。ベクターとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、リポソーム、ポリマーベースのナノ粒子、コレステロール結合体、シクロデキストラン複合体、ポリエチレンイミンポリマー又は蛋白複合体などの非ウイルスベクターを利用することができる。
　本発明の有効成分としてのオリゴヌクレオチドや、当該オリゴヌクレオチドを含むベクターは、薬学上許容される担体と共に投与することができる。投与方法としては、例えば標的部位に局所投与するほか、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、腹腔内投与、経膣投与、肛門投与、経口投与、眼内投与、髄腔内投与などの投与方法により投与することができる。局所投与のための製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、座薬、スプレー、液体又は粉末の製剤が挙げられ、担体としては水性、粉末又は油性基材、増粘剤等の通常の担体が所望に応じて使用されうる。また、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与や腹腔内投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、糖調剤、懸濁剤、増粘剤、分散剤、安定剤や保存剤などから選択されるいずれかを適宜含みうる水性又は非水性の溶液や乳剤などが挙げられる。
　本発明の理解を助けるために、本発明を実施するまでの予備検討としての参考例を示し、さらに実施例、比較例、実験例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものでないことはいうまでもない。
（参考例１）miRNAのアンチセンス鎖遺伝子の導入による各miRNA発現量の確認
　本参考例では、miR-19a（配列番号１）、miR-20a（配列番号４）及びmiR-92について、各アンチセンス鎖miRNAの導入による各miRNAの発現抑制効果を確認した。ここで、各アンチセンス鎖miRNAは、それぞれの5'末端の４塩基及び3'末端の４塩基に人工核酸（Locked Nucleic Acid:LNATM）を用い、anti-miR-LNAとした。以降の参考例及び実施例において、単にanti-miR-19a、anti-miR-20a、anti-miR-92という場合は、各々についてLNAが導入されたanti-miR-LNAを意味する。各アンチセンス鎖miRNAは、ジーンデザイン株式会社に合成依頼した。
　MCF-7細胞（ヒト乳ガン由来細胞株）に、miR-19a、miR-20a及びmiR-92に対するアンチセンス鎖miRNA（anti-miR-LNA）であるanti-miR-19a、anti-miR-20a、anti-miR-92を導入したときの各対応するmiRNAの発現量の変動を、リアルタイムPCR法（TaqMan(R) Real-time PCR法、TaqMan MicroRNA Assay kit; Applied Biosystems社）により確認した。
　MCF-7細胞を24穴培養プレートに播種し、10%子牛血清を含むOPTI-MEM培地（インビトロジェン社）にて培養24時間後に、各アンチセンス鎖miRNA（50nM）を遺伝子導入試薬（リポフェクタミン2000試薬、インビトロジェン社）を用いて導入した。
　アンチセンス鎖miRNAを各々MCF-7細胞へ導入後、24時間、48時間及び72時間経過後にRNA抽出試薬（Isogen、ニッポンジーン社）を用いてRNAを抽出し、各miRNAの発現量をリアルタイムPCR法にて確認した。コントロールとして、各アンチセンス鎖miRNA導入0時間目の各miRNAの発現量を測定し、100とした。その結果、図２に示すように、各アンチセンス鎖miRNAを導入した場合について、各miRNAの発現量が低下することが確認され、導入48時間目で各miRNAの発現量が最も低下することが確認された。特に、miR-19aに対するanti-miR-19aが、最も効果的に対応するmiRNA、即ちmiR-19aの発現を低下させうることが確認された。
（参考例２）二次元電気泳動による解析
　本参考例では、参考例１に記載の各アンチセンス鎖miRNA（anti-miR-LNA）をMCF-7細胞に導入した場合と、コントロールとして、MCF-7細胞内mRNAに全く反応しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであって、LNAを導入したもの（以降、「ランダム配列LNA」）を導入した場合についてMCF-7細胞による蛋白の生合成を二次元電気泳動により確認した（図３参照）。即ち、各アンチセンス鎖miRNAをMCF-7細胞に導入することで、各miRNAの発現を抑制し、その結果として生合成に変動のある蛋白を確認することで、各種miRNAの標的蛋白を確認した。
　MCF-7細胞から抽出した蛋白を二次元電気泳動処理した後、蛍光染色したゲルイメージ像について、画像解析ソフトを用いて約2000スポット蛋白を検出し、定量し、両群間の蛋白生合成量の差を比較解析した（図４参照）。アンチセンス鎖miRNAを導入したときに、生合成量の有意な上昇が認められた蛋白123個のスポットを切り出し、液体クロマトグラフィー質量分析計（アジレント社ナノフローLC/MS/MSシステム）を用いて、各スポットの蛋白を同定した（図５～８参照）。上記参考例２で解析した123個の蛋白からmiRNAの真の標的蛋白を絞り込む為の検討を行った。
　ここではmiRNA結合領域解析ソフトを用いて、同定された蛋白に対応する遺伝子mRNAの3'UTR領域に、各miRNAが結合する標的配列があるものを選択し、PPP2R2A (protein phosphatase 2 (formerly 2A)) 、ARHGAP1 (Rho GTPase activating protein 1)、IMPDH1 (IMP dehydrogenase 1)及びNPEPL1 (Homo sapiens aminopeptidase-like 1)の４種に絞り込んだ（図９参照）。
（実施例１）標的遺伝子に対する各miRNAの作用１
　本実施例では、標的候補遺伝子に対する各miRNAの作用及び標的蛋白の生合成量をルシフェラーゼ（Luciferase）レポーター解析により確認した。
　参考例１で絞り込んだ４種の標的候補遺伝子について、これらの遺伝子のmiRNA標的配列（正方向）を各々ルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR側に配置したルシフェラーゼレポータープラスミドを作製した（図１０参照）。当該各miRNA標的配列を配置させたルシフェラーゼレポータープラスミドを各々HEK293細胞に導入した。各miRNA標的配列（逆方向）を導入したものをコントロールとした。各々についてルシフェラーゼ活性を比較検討した。その結果、４種の標的候補遺伝子の全てに対して、各miRNA標的配列（正方向）の導入によりルシフェラーゼ活性の減少が確認された（図１１）。すなわち、各標的候補遺伝子のmiRNA標的配列に対して各miRNAが作用することでルシフェラーゼ蛋白の生合成が抑制されているものと考えられた。
　上記において、PPP2R2A遺伝子のmiR-20a（配列番号４）に対する標的配列は、配列番号５（5'-TAGGTAAGGGTAGGGCACTTTT-3'）に示す塩基配列からなり、ARHGAP1遺伝子のmiR-19a（配列番号１）に対する標的配列は配列番号６（5'-TCATGTATTTCACCGTTTGCACTTTT-3')に示す塩基配列からなり、同様にIMPDH1遺伝子のmiR-19aに対する標的配列は配列番号７（5'-TGAGTGGTCCACAGATTTGCACT-3'）及び配列番号８（5'-GTCGAAGGCTTTAACTTTGCACA-3'）に示す塩基配列からなり、NPEPL1遺伝子のmiR-19aに対する標的配列は配列番号９（5'-GATCTTTTACCTCACTTTGCACT-3')に示す塩基配列からなる（図１０参照）。
（実施例２）標的遺伝子に対する各miRNAの作用２
　本実施例では、各miRNAを各アンチセンス鎖miRNA（anti-miR-LNA）で作用させたときのルシフェラーゼ活性の測定により、標的遺伝子に対する各miRNAの作用確認試験を行った。アンチセンス鎖miRNAは、参考例１に示すanti-miR-19a、anti-miR-20a及びanti-miR-92を用いた。実施例１で作製したルシフェラーゼレポータープラスミドと、対応する各アンチセンス鎖miRNAを同時にHEK293細胞に導入してmiRNAを各々ノックダウンさせた。アンチセンス鎖miRNAのかわりにランダム配列LNAをコントロールとし、各々についてルシフェラーゼ活性を比較検討した。
　その結果、４種の標的遺伝子候補すべてについて、アンチセンス鎖miRNAの導入によりルシフェラーゼ活性が復活することが確認された（図１２）。すなわち、アンチセンス鎖miRNAの導入により対応する各miRNAが抑制され、その結果各遺伝子の標的配列を介して抑制されていたルシフェラーゼの生合成が回復しているものと考えられた。本実施例の結果からも各標的候補遺伝子のmiRNA標的配列に対して、各miRNAが作用していることが確認された。
（実施例３）標的遺伝子に対する各miRNAの作用３
　本実施例では、各miRNAに対応する各アンチセンス鎖miRNA（anti-miR-LNA）をMCF-7細胞に導入したときの蛋白の生合成に及ぼす影響を確認した。その結果、miR-19aに対応するアンチセンス鎖miRNA（anti-miR-19a）をMCF-7細胞に導入した場合に、IMPDH1蛋白及びNPEPL1蛋白が増加することが確認された（図１３）。
（実施例４）標的遺伝子に対する各miRNAの作用４
　miRNAは、mRNAを分解することなく、蛋白合成阻害を行うと考えられている。実施例３の結果により、miR-19aに対応するアンチセンス鎖miRNA（anti-miR-LNA）存在下では、IMPDH1蛋白及びNPEPL1蛋白が増加することが確認された。そこで、本実施例ではIMPDH1及びNPEPL1の各mRNAについて、miRNAの有無によるmRNA発現量の違いをRT-PCR法により解析した。
　その結果、アンチセンス鎖miRNAを加えてmiRNAをノックダウンしても、標的蛋白に関するmRNAの発現量には影響を与えていないことが確認された（図１４）。
　以上より、miR-19aの標的遺伝子はIMPDH1遺伝子及びNPEPL1遺伝子であり、特にIMPDH1蛋白の生合成に影響を及ぼすことが明らかとなった。従って、miR-19aはIMPDH1抑制剤として機能しうることが確認された。
　以上詳述したように、本発明のmiR-19aに係るオリゴヌクレオチドは、IMPDH遺伝子のmRNAに作用し、IMPDH蛋白の生合成を抑制し、IMPDH阻害剤として機能しうることが確認された。本発明のオリゴヌクレオチドがIMPDH阻害剤の有効成分として機能しうることから、当該機能により、本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有するIMPDH阻害剤は、免疫抑制剤、抗癌剤、抗血管過増殖剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗乾癬、及び抗ウイルス剤となり得ると考えられる。特に、ウイルスに対して作用させることで、従来の抗ウイルス剤を用いた場合などによるウイルスの突然変異にかかわらず、本発明のIMPDH阻害剤は抗ウイルス作用を発揮しうるものと考えられる。

Claims (3)

  1. 以下の１）～５）から選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを１種又は２種以上を有効成分として含有する、イノシン一リン酸脱水素酵素阻害剤：
    １）配列番号１（UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
    ２）配列番号２（AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA）に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
    ３）上記配列番号１又は２に示す塩基配列に対して１～３個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
    ４）上記１）～３のいずれか１に示すオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
    ５）上記１）～４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチド。
  2. 配列番号１及び／又は２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、請求項１に記載のイノシン一リン酸脱水素酵素阻害剤。
  3. 請求項１又は２に示すいずれかのオリゴヌクレオチドが挿入されたベクターを含む請求項１又は２に記載のイノシン一リン酸脱水素酵素阻害剤。
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KANZAKI H. ET AL.: "Identification of direct targets for the miR-17-92 cluster by proteomic analysis", PROTEOMICS, vol. 11, no. 17, September 2011 (2011-09-01), pages 3531 - 3539 *
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