WO2007126150A1

WO2007126150A1 - 癌の新規治療用組成物

Info

Publication number: WO2007126150A1
Application number: PCT/JP2007/059548
Authority: WO
Inventors: Takashi Takahashi; Kiyoshi Yanagisawa; Hirotaka Osada
Original assignee: National University Corporation Nagoya University; Aichi Prefecture
Priority date: 2006-04-27
Filing date: 2007-04-27
Publication date: 2007-11-08
Also published as: JPWO2007126150A1

Abstract

本発明は、ヒト染色体13q31.3に存在するOncomiR-1/C13orf25のイントロン3の3'側半分又はその一部の配列を有する核酸、該染色体に存在するmiR-17-5p及び/又はmiR20のmiRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸を有効成分として含み、これらの核酸が、miR-17-5p及び/又はmiR20が過剰発現している癌の増殖を抑制しかつ細胞しを誘導する活性を有する、癌を治療するための医薬組成物に関する。

Description

明細書癌の新規治療用組成物技術分野

本発明は、 microRNAである miR- 17_5p又は miR- 20a対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 OncomiR- l/C13orf25のイントロン 3部分等の核酸を含む癌の治療用組成物に関する。背景技術

microRNA (以下、「miRNA」と称する）は、 22塩基程度の極く小さな RNA分子として機能する種を超えてよく保存された遺伝子である。 miRNA はしばしばクラスタ一を成してゲノム上に存在し、 RNA ポリメレース II によって転写され、さらに Drosh と Dicerによって成熟型 (mature form) へとプロセッシングされ、 raRNA の 3 ' 非翻訳領域に結合し標的遺伝子の mRNAから蛋白への翻訳を阻害すると考えりれ飞レヽる (Ambros, V. , MicroRNA pathways in ι丄 ies and worms： growtn, death: fat, stress, and t iming, " Cell 2003 ; 113 : 673- 676)。

これまでに、極めて僅かな数のマイクロ RNAに関して、癌の発症や進展に関与している可能性が示唆されている。本発明者らが報告した代表的な miRNAの一つである let- 7の発現低下と肺癌の臨床病態への関わり及びその細胞生物学的役割 lakamizawa, J. et al .， Reduced expression of the丄 et - 7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperat ive survival, Cancer Res 2004；64：3753-3756) は、その後米国の研究者らによって追認されるとともに let - 7の標的が RAS遺伝子であることが報告されている（Johnson, SM et al. , RAS is regulated by the let - 7 microRNA family, " Cel l 2005 ; 120 : 635 - 647)。また、 miR-15a及び miR - 16- 1 miRNAの慢性リンパ性白血病における発現低下が報告され " レヽる (し al in, GA et al. , requent del et ions and down-regulation of microRNA genes miR15 and miRlり at 13ql4 in chronic lymphocytic leukemia, Proc Natl Acad Sc i U S A 2002 ; 99 : 15524- 15529)。本発明者らは、ヒト染色体 13q31. 3に存在する 7個の miRNAを含む miR - 17 - 92 raiRNA クラスターの遺伝子増幅と過剩発現が肺癌に検出されること、また肺癌細胞株の増殖を促進する作用があることを最近報告した（Hayashita, Y. et al. ，

Po丄 ycistromc miRNA cluster, miR - 17 - 92, is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation, " Cancer Res. 2005； 65 : 9628-9632)。時を同じくして、 Heらにより B細胞リンパ腫において同様の知見が報告された（He: L et a丄. ， A microRNA polycistron as a potential human oncogene, Nature 2005；435：828-833) ₀ また、この miRNA クラスターに存在する raiR- 17- 5p 又は miR-20aによって制御されている標的遺伝子として、転写因子である E2F1遺伝子力 S同定されてレヽる (0' Donnell, KA et al.， "c一 Myc— regulated microRNAs modulate E2F1 expression, " Nature 2005 ; 435 : 839 - 43)。具体的には、 0' Donnell らは、 E2F1は c - Mycの標的であること、 E2F1の発現が HeLa細胞株（子宮頸癌細胞株）において miR_17- 5p又は miR- 20aによって負に制御され、それゆえこれらの c- myc によって調節される raiRNAが腫瘍抑制活性をもつ可能性があること、これに対してリンパ腫ではこれらの miRNAが発癌活性をもつ可能性があること、などを記載している。

この関連で、 Ambion社（USA)は、 miR- 17- 92 miRNA関連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを「Anti- miR™ miRNA Inhibitors を販売している（Nucleic Acid Research 2005； 33 : 1290-1297)。ここで Inhibitorsは、 miR - 18、 miR - 19a、 miR- 20、 miR- 106、 raiR-92のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 HeLa (子宮頸癌細胞株）と A549 (肺癌細胞株）で細胞増殖に対する効果を調べているが、 HeLaでは無効であり、 A549では miR- 19aのアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ増殖抑制という結果を得ている一方、 miR - 18, 20， 106， 92 のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは効果がなかったと報告されている。発明の開示

これまで、上で述べたように、 miR - 17 - 92クラスターが c- mycによって調節されており、一方、 C- _myc の下流標的である転写因子 E2F1 が該クラスターの miR-17-5a及び miR- 20aによって負に制御されていることまでは知られていた。しかし、ヒト由来の癌腫において miR-l⁷-92クラスターがどのようにして癌の発生に機能するかが理解されていなかった。また、上記の報告から miR - 17 - 5p及び miR20aが癌の発生に何らかの関わりがあるかもしれないことは推測されるが、それらの発現又は活性の抑制が、実際に、癌細胞'の増殖抑制や細胞死の誘導を引き起こすかどうかを調べた報告はない。さらにまた、 miR - 17 - 92 クラスターの下流に存在する OncomiR- l/Cl³orf²5 の一部が癌の調節に関わることについては全く報告がなかった。

このような状況において、本発明者らは、 miR- 17 -⁹² miRNAクラスターに含まれる各種の miRNA に対するアンチセンスオリゴヌクレチドを用いてそれぞれの miRNAを抑制して検討を加えた結果、 miR-17-5p及び miR20aの抑制が低濃度で特定の癌の増殖抑制と細胞死誘導を引き起こすこと、また、 OncomiR - l/C13orf25 の一部、特にイントロン 3部分、が癌の増殖を阻害する活性をもつことを初めて見出した。このような新規な知見により、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド及び OncomiR- l/C13orf25のィントロン 3部分が癌治療のために有用であることが判明した。発明の概要

本発明は、以下のように要約される。

本発明は、その一の態様により、下記の核酸：

(a) 配列番号 1又は 12 の配列からなる miR- 17- 5pアンチセンスオリゴヌタレォチド、

(b) 配列番号 7又は 13の配列からなる miR- 20aアンチセンスオリゴヌクレオチド、

(c) 配列番号 1又は 12或いは配列番号 7又は 13の配列と 85%以上、 90%以上又は 95 %以上の同一性を有する 18〜25 ヌクレオチドの配列からなり、かつ miR-17-5p又は miR - 20aの生物活性を抑制することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド、

(d) miR- 17- 5p前駆体のアンチセンス配列において配列番号 1又は 12の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 (e) miR-20前駆体のアンチセンス配列において配列番号 7又は 13の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 '

(f) 前記（a)、（b)、（c)、（d)又は（e)のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾体であって、 locked nucleic acid (LNA)、 2， -0-メチル基又は 2， - 0 -メトキシェチル基を少なくとも 1つ有する修飾体、並びに、

(g) 前記（a)、（b)、（、（d)又は（e)のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコ一ドする DNA配列、それに対応する RNA配列、又は該 DNA配列を含む発現べクタ — DNAヽ

からなる群かち選択される 1又は複数の核酸を有効成分として含み、かつ該核酸が miR- 17 - 5p及び/又は miR20が過剰発現している癌の増殖を抑制する及び/又は細胞死を誘導する活性を有する、癌の治療のための医薬組成物を提供する。

本発明の実施形態において、前記核酸が、配列番号 12の配列（ここで、塩基 G 及び Cが LNAによって置換されている）からなる miR- 17 - 5pアンチセンスオリゴヌクレオチド、配列番号 13の配列（ここで、塩基 G及び Cが LNAによって置換されている）からなる miR-20aアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの混合物である。

本発明の実施形態において、前記癌が、肺癌、膝臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢 '胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される。

本発明はまた、別の態様により、 OncomiR- l/C13orf25のイントロン 3の 3 ' 側半分又はその一部の DNA、それに対応する RNA、又は該 DNAを含むベクター DNA、からなる群から選択される核酸を有効成分として含み、かつ該核酸が癌の増殖抑制活性及び/又は細胞死誘導活性を有する、癌の治療のための医薬組成物を提供する。

本発明の実施形態において、前記癌は、肺癌、脬臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢'胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される。

本発明の実施形態において、前記ィントロン 3の 3 ' 側半分の DNAの塩基配列が、配列番号 14によって示される配列、又はその配列と 90%以上、 95%以上、 97°/o以上、 98%以上又は 99%以上の同一性を有する配列である。

本発明の別の実施形態において、前記ィントロン 3の 3 ' 側半分の一部の DNA の塩基配列が、配列番号 15によって示される配列、又は配列番号 15によって示される配列の 15塩基以上の部分配列、又は配列番号 14によって示される配列において少なくとも配列番号 15によって示される配列を含む配列、或いはそれらの配列と 90%以上、 95%以上、 97%以上、 98%以上又は 99%以上の同一性を有する配列である。

本発明はまた、別の態様により、本発明の上記医薬組成物の各々を、肺癌、腠臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢'胆管癌及び肝臓癌なる群から選択される癌をもつ患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。

本明細書で使用する「miR-17 - 5p」及び「miR- 20a」という用語は、ヒト染色体 13q31. 3上の raiR-17-92 クラスターに存在する miRNAを指す。このクラスタ一には、上記 miRNA以外に 17 - 3p、 18、 19a、 19b_l及び 92-1 として表される miRNA も存在している。

本明細書で使用する「同一性」という用語は、「miR- 17- 5p」又は「miR- 20a」の各アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号 1又は 12或いは配列番号 7又は 13)との％同一性を表すときに使用される。同一性は、配列間にギヤップを導入して或いはギヤップを導入しないで塩基の同一性を比較することによって決定され、全塩基数に対する同一塩基数の百分率で表わすことができる。 miRNA については種を超えてその保存性が高いことも知られていることから、ヒト以外の哺乳動物（例えばマウス、ブタ、サルなど）由来の miRNAホモログについて、例えば、 GenBankや UniGeneなどの配列データベースを利用する力 \ 或いは BLASTプログラムを使用してホモロジ一検索を行うことによって、同一性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を見出すことも可能であろう。

本発明によれば、配列番号 1又は 12或いは配列番号 7又は 13の配列との同一性は少なくとも 85%、好ましくは少なくとも 90%以上、さらに好ましくは 95% 以上であり、また、配列番号 14又は配列番号 15の配列との同一性は少なくとも 90%以上、 95%以上、 97%以上、 98%以上又は 99%以上であり、これらの場合、配列は 1若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入又は付加を含むことができる。ここで、数個とは 1〜10の整数を指す。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数が 22とするとき、 85%同一性であれば約 3個の塩基の置換が可能である。

本明細書で使用する「過剰発現」という用語は、「miR-17- 5p」又は「miR- 20a」が、癌組織若しくは癌細胞において、正常又は非癌の組織若しくは細胞（対照）と比べて統計学的に有意に発現又は存在していることを意味する。ここで、「統計学的に有意」とは、 miRNAの発現レベルが対照と比べて 1. 5倍以上、 2倍以上、 3 倍以上、 4倍以上、又は 5倍以上高いことをいう。 miRNAの発現レベルは、例えば Northern blot分析によって決定することができる。

本明細書で使用する「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、「miR - 17_5p」又は「miR- 20a」の配列、或いはそれらと相同性の高い配列、に結合することができる完全に又は部分的に相補的な配列（すなわち、アンチセンス配列）を有するオリゴヌクレオチドを意味する。該オリゴヌクレオチドは、 DNA であってもよいし、又は RNAであってもよいし、又は塩基が化学修飾された誘導体であってもよレ、。

本明細書で使用する riocked nucleic acid (LNA) Jという用語は、 Sigma社（USA)、 Exiqon社（デンマーク）などから入手可能なコンホメーシヨンが制限された核酸類似体を指す。 LNAは、下記の DNA及び RNAの構造と対比されるように、リボヌクレオシドの 2 '部位の酸素原子と 4'部位の炭素原子がメチレンを介して結合している下記の 2 つの環状構造をもつ核酸である（Curr Opin Drug Discov Devel . 2004, 7 : 188—94 ; Nucleic Acids Res 2003, 31 : 3185—93 ; Nucleic Acids 2005, 33 : 439-47)。下記の構造中、 Bは塩基を表わす。

LNA - Locked Nucleic Add DNA RNA

本明細書で使用する「miR- 17- 5p又は miR- 20aの生物活性」という用語は、癌の発生及び癌細胞の増殖に関わる活性を指す。本明細書で使用する r0ncomiR-l/C13orf25J という用語は、ヒト染色体 13q31. 3 に存在し miR-17- ⁹2 mRNAクラスターを含む図 1Aに示す構造を有する。図面の簡単な説明

図 1は、 miR- 17- 5p、 miR-20a、 miR- 18又は miR- 19aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS ; ここで、 G及ぴ Cは全て LNAで置換されている）の単独或いは併用によるヒト癌細胞株 Calu6株及び HeLa株の生存又は増殖に及ぼす影響

(図 1A〜1B)、 FACS解析の結果（図 1(〜 1D)、ならびに、ヒト癌細胞株 (Calu6) に対して、図に示したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ここで、 G及ぴ Cは全て LNAで置換されている）を作用したときの、 miRNAの発現の程度を Northern blot 法で解析した結果を示し、ここで SCは、 Scrambled すなわち同一の G、 A、 T、 C 比で配列を無作為にゲノム上の他の遺伝子と相同性がないものに変更したものを表す（図 1E〜1F)。図 1A及び 1Bにおいて、白丸は、 Scrambledオリゴヌクレオチドを表し、黒丸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを表わす。また、図 1Fにおいて、 let7は、対照として、無関係の miRNAである let7の発現を表わし、 5Sは、検体量の比較の目的で、 5S リボゾームの発現を表わす。

図 2は、 miR-17- 5p及び miR- 20aの更なる標的である RBL2/pl30の同定を示す（図 2A〜2D)。具体的には、図 2Aは、 RBL2 (pi 30) · RBI · RBL1 (pl07) · E2F1 に対する各々の抗体を用いたウェスタンブロット解析結果を示し、図 2B は、 RBL2 (pl30) の 3 ' 非翻訳領域に検出される 2箇所の miR- 17- 5_P/miR-20a推定標的部位を示し、図 2Cは、図 2Bの推定標的部位を下流に挿入したシフェラーゼレポーターと、表記のオリゴヌクレオチドとを共導入したときのシフヱラーゼ活性を示し、図 2D は、 miR- 17- 92を高発現していないヒト癌細胞株 A549細胞における、表記のオリゴヌクレオチドの生存又は増殖に及ぼす影響を示す。図 2Cにおいて、白色バーは pCMV一 Luc を表し、黒色バーは pRBL2— T1+T2 を表す。図 2D において、白丸は Scrambled オリゴヌクレオチドを表し、黒丸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを表わす。また、 AS及び SCは上記の意味を有する。

図 3は、 miR- 17- 5p、 miR- 18、 miR- 19a、 miR- 20a及び miR- 92- 1、並びにそれらに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS)の各ヌクレオチド配列（ここで、 G 及び Cは全て LNAで置換されている）を示す。

図 4は、 OncomiR- l/C13orf25のイントロン 3の 3 ' 半分（3， intron3)が、癌の増殖抑制領域であることを示し（図 4A及ぴ 4B)、図 4Cは、前記増殖抑制が主に 3 ' intron3の保存領域（conserved) 2 (C2)に存在することを示し、図 4D、 4 E及ぴ 4F は、二本鎖 RNA依存的プロティンキナーゼ PKR及びカスパーゼ 7のタンパク分解酵素活性の活性化と部分的に関与する C2の同定を示す。具体的には、図 4Dは、 PKRのリン酸化を検出する抗体を用いたウェスタンブロット解ォを示し、図 4Eは、 RNA構造解析ソフト Mfold (Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31, 3406-15， 2003)による、 C2の推定二次構造（ここで、 4つの領域を Rl， R2, R3, R4と表示した）を示し、図 4F は、活性化カスパーゼ 7特異的抗体を用いたゥヱスタンプロット解析を示す。また、図 4中、 VCはインサートを持たない対照の発現ベクター（pcDNA3 vector (.Invitrogen, Carlsbad, し A, USA)の neomycin抵 ¾TL遺 1κナを puromycin抵遺 125ナに置換した改変発現ベクター）を表す。発明を実施するための最良の形態

本発明における癌治療用の医薬組成物は、特定の癌に対して有効であるという特徴を有している。このような癌には、肺癌、膝臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢 '胆管癌及び肝臓癌が含まれる。いずれの癌でも、正常又は非癌（組織若しくは細胞）と比べて miR-17-5p 及び miR-20aが過剰発現している。一方、上記 miRNAを全く又は実質的に発現していない癌細胞に対しては、本発明の有効成分は効果を示さない。

上記癌に対し効能を示す有効成分としての核酸は、ヒト 13番染色体 q31. 3 (「13 q 31. 3」と称する）に存在する miR_17 - 92クラスター上の microRNA (5，側から 3，側に向かって配置される 17- 5p， 17- 3p， 18， 19a, 20a, 19b- 1及び 92 - 1 miRNA) のうち miR- 17- 5p及び/又は miR- 20aのみを選択的に発現抑制又は活性（若しくは機能、例えば癌細胞の増殖促進作用）抑制することができる。本発明によれば、そのような核酸の例は、 miR- 17- 5p又は miR- 20aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（それぞれ、配列番号 1又は 12、或いは配列番号 7又は 13)、或いはその混合物である。これらのオリゴヌクレオチドは、 3 つの塩基のみが相違するだけであり、したがって髙ぃ同一性を有しているため、 miR- 17 - 5a アンチセンスオリゴヌクレオチドは miR- 17- 5p及ぴ miR- 20aの双方の生物活性を抑制することができるし、また miR- 20a アンチセンスオリゴヌクレオチドは miR - 20a 及び miR-17-5pの生物活性をともに抑制することができる。

miRNAの発現の程度は、癌細胞から全 RNAを抽出し、 Northern blot法にて、具体的には、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて小 RNAを分離し、核酸用ブロッテイング膜に転写し、 miRNA 特異的プローブを用いるハイブリダィゼーションを含む手段によって判定することができる。

全 RNAの抽出は、ィ列 7ば proteinase K及び phenol/chlorof orm/isoamyl al cohol を使用する方法、 guanidium/CsCl法などによって行うことができる（Ausubel ら， Short Protocol s in Mol ecular Biology, Third Edition, 1995， John Wi ley & Sons, Inc. ) ₀

miRNA等の小 RNAを分離するための変性ポリアタリルァミドゲル電気泳動は、約 7〜8M尿素とホルムアミドを含む約 15〜20%のアクリルアミドゲルを用いて行つの力ょレヽ (Ausubel ら, Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, 1995， John Wi l ey & Sons, Inc. ) ₀

核酸プロッティングは、泳動ゲルからブロッティング膜への電気的移動によつて行う。このとき、膜として、例えば Zeta - Probe GT Blotting Membranes (Bio - Rad 社、 USA)、 Hybond N⁺ nylon membranes (Amersham 社、 USA)などを使用することができる。

ハイブリダィゼーションは、 [ γ - ³²P] ATP と T4 polynucleotide kinaseを用いて末端放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブと、ブロッテイング膜上の miRNAとのハイブリダイゼーシヨンを、 7% SDS及び 0. 5% sodium PPIを含む 0. 25M sodium phosphate (pH7. 2)溶液を用いて行ったのち、 0. 2〜2 X SSC及び 0. 1〜1% SDS にて 37〜68°Cで洗浄を行う。検出は、オートラジオグラフィ一によつて行い、 Imaging plateにて露光しシグナルを得る。

miRNAの生物活性は、 5 %血清添加 RPMI 1640培養液を含む well plateに約 8 X 10⁴個の癌細胞を撒き、翌日とそのさらに 2日後に l ipofection法にて 0〜100nM の範囲の種々の濃度の上記 miRNAを細胞に導入し 37°Cで培養したのち、約 4日後に細胞の生存率を比色法にて測定することによって求めることができる。 lipofectionのために、例えば l ipofectamine (Invitrogen社、 USA)、正電荷コレステロール誘導体（Okayama, R. et al. , FEBS Lett. 1997； 408 : 232-234)、他のカチオン性リポソーム（Cl inical Cancer Research 1999； 59 : 4325- 4333)などを使用することができる。 miRNA等の核酸をリボソーム内に封入し、この複合体を細胞と接触させてェンドサイトーシスを利用して細胞内に複合体を導入することができる。

核酸の細胞内導入の他の例は、ウィルスベクターによる感染を利用する方法 (transfection) , 微量注入法などを含むが、これらに限定されない。

本発明の核酸にはさらに、 miR - 17- 5p又は miR - 20aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（すなわち、配列番号 1又は 12、或いは配列番号 7又は 13) と 85%以上、 90%以上又は 95%以上の同一性を有する 18〜25、好ましくは 21〜 23、ヌクレオチドの配列からなり、かつ miR-17-5p又は miR- 20aの生物活性 (例えば癌細胞の増殖促進作用）を抑制することができる、 DNA又は RNAアンチセンスオリゴヌクレオチドも含まれる。

このような改変体は、 miR-17- 5p又は miR - 20aと部分的に相補的な配列を有しており、 miR- 17- 5p又は miR- 20aの生物活性（例えば癌細胞の増殖促進作用）を抑制できる限り、上記の％同一性の範囲内で配列番号 1又は配列番号 7の配列においてヌクレオチドの欠失、置換、挿入又は付加を含むことができる。

本発明において有効成分としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、 miR- 17- 5p前駆体のアンチセンス配列において配列番号 1又は 12の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いは miR- 20前駆体のァンチセンス配列において配列番号 7又は 13の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。 miRNAである miR - 17- 5p及ぴ miR-20はいずれも、マイクロ RNAに関する既知の知見から、前駆体が存在し、核内のそれらの 500b〜l k bの前駆体 RNAから RNA分解酵素の作用によって約 300 bの前駆体 RNAに分解され、さらに RNA分解酵素によつて約 70bの前駆体 RNAに分解され、その後、核外に移行し細胞質にて約 20bの miRNAとなると考えられる（H. Osada and T. Takahashi, Carcinogenesis 2007, 28 : 2-12)。したがって、約 20 b〜約 lkb の間のサイズの miR- 17- 5p前駆体及び miR- 20前駆体、又はそれに対応する DNA、のアンチセンス配列において、配列番号 1又は 12、或いは配列番号 7又は 13、の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内である。

本発明の上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA/RNA合成装置を使用して合成することができる。このような装置は市販されており、例えば Appl ied Biosystems 社（USA)の 3400 DNA Synthesizer, Biosset 社（USA)の ASM - 800 DNA Synthesizerなどが挙げられる。

本発明の上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも 1つの核酸修飾基によって化学修飾されていてもよい。そのような修飾基としては、例えば locked nucleic acid (LNA)、 2， -0-メチル基及び 2， -0 -メトキシェチル基が挙げられる。これらの修飾は、塩基、好ましくは全ての又は一部の G及ぴ（：、を LNA で置換するか、或いは塩基を 2 ' -0 -メチル基及び 2 ' - 0 -メトキシェチル基で修飾することを含む。修飾によって、オリゴヌクレオチドの安定性が高まるとともに、 LNA を含む核酸の場合、その構造が RNA 様になり標的 RNA に対する親和性 (affinity)を高めることができる。また、 RNase-Hによる標的 RNA切断を妨げないように 5， -end及び 3 ' -endのみを例えば 2， -0-メチル基で修飾した「gapmer」構造の有用性も報告されている（Krutzfeldt, J. et al. , Nature 2005； 438 : 685-689)。しかし、本発明では、上記の修飾は、効果の強弱には幾分影響する可能性はあるが、非修飾体と比べて本質的な差異はないと考えられる。

本発明の核酸はさらに、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコ一ドする DNA配列を含む発現べクタ一 DNAを含むことができる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドをコ一ドする DNA配列又はその改変配列は、それぞれ配列番号 12、配列番号 13に示される以下の配列：

5' - ACTACCTGCACTGTAAGCACTTTG- 3，（配列番号 12)

5' - CTACCTGCACTATAAGCACTTTA- 3，（配列番号 13)

或いは、上記の配列と 85%以上、 90%以上又は 95%以上の同一性を有する配列である。本発明のベクターは、適するプロモーター、ターミネータ一、ポリアデニル化部位、選択マーカーなどとともに上記の DNA配列を含む。ベクターとしては、例えばプラスミド、コスミド、ウィルスベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウイルス、レンチウィルスなど)などを挙げることができ、哺乳動物細胞内での使用に適する任意のベクター、プロモーター、ターミネータ一、ポリアデニル化部位、選択マーカーが好ましい。

本発明はまた、別の態様により、 OncomiR- l/C13orf25のイントロン 3の 3，側半分又はその一部の DNA、それに対応する RNA、又は該 DNAを含むベクター DNA、からなる群から選択される核酸を有効成分として含み、かつ該核酸が癌の増殖抑制活性及び/又は細胞死誘導活性を有する、癌、以下のものに限定されないが、肺癌、膝臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢'胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される癌、の治療のための医薬組成物を提供する。ここで前記イントロン 3の 3，側半分は、図 4Aにおいて「3 ' intron3j として示されている領域である。

本発明の実施形態によれば、前記ィントロン 3の 3 ' 側半分の DNA配列が配列番号 14によって示される配列、又はその配列と 90%以上、 95%以上、 97%以上、 98%以上又は 99%以上の同一性を有する配列である。

さらにまた、前記イントロン 3の 3 ' 側半分の一部の DNA配列が、図 4Aに示される保存領域 2 (C2)の配列、すなわち配列番号 15によって示される配列、又は配列番号 15 によって示される配列の 15塩基以上の部分配列、又は配列番号 14 によって示される配列において少なくとも配列番号 15 によって示される配列を含む配列、或いはそれらの配列と 90%以上、 95%以上、 97%以上、 98%以上又は 99%以上の同一性を有する配列であるが、癌増殖抑制活性及び/又は細胞死誘導活性を有する配列である。ここで、部分配列は、配列番号 15によって示される配列において、連続する 15以上、 18〜25又はそれ以上、 18〜30又はそれ以上、 18〜 40又はそれ以上、 18〜50又はそれ以上、 18〜70又はそれ以上、 18〜100又はそれ以上、 18〜150又はそれ以上、 18〜200又はそれ以上、 18〜250又はそれ以上、 18 〜300又はそれ以上、 18〜350又はそれ以上、 18〜400又はそれ以上、 18〜450又はそれ以上、 18〜500又はそれ以上、 18〜550又はそれ以上、 18〜600又はそれ以上、 18〜650又はそれ以上、の塩基からなる配列である。

本発明の OncomiR- l/C13orf25のイントロン 3に由来する領域が、癌の増殖抑制作用及び/又は細胞死誘導作用という極めて重要な制御機能をもつことが今回判明した。このような制御機能は、イントロン 3の 3，側半分の領域に存在し、特に C²領域に存在することが分かった（図 4B及び 4C)。このような領域をコードする DNA又は RNA核酸は、本発明の癌の治療のために有効に使用することができる。核酸をベクターとして使用するときには、前記 DNAをベクターに組み込む。改変体及びベクターについては、上記の説明をここにも適用でき、また、遺伝子組換え技術につレヽては、 Ausubelら， Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, 1995， John Wi ley & Sons, Inc.、 Sambrook , Molecular Cloning A Laboratory Manual (3^rd ed. ) , 2001， Cold Spr ing Harbor Laboratory Press などに記載されている慣用技術を使用することができる。

本発明の上記核酸は、単独で又は組み合わせて、特定の癌の治療のために使用することができる。癌は、 miR- 17- 5p及び/又は miR20が過剰発現している癌であり、例えば肺癌、膝臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢'胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される。本発明の核酸は、このような癌の増殖を抑制しかつ細胞死を誘導することが可能である。

したがって、本発明は、上記の核酸の 1又は複数を含む癌の治療用の医薬組成物を提供する。

医薬組成物には、有効成分としての上記の核酸とともに、担体を含むことができる。担体は、液体又は固体製剤を処方するための任意の剤であり、例えば生理食塩液、滅菌水、緩衝液などが含まれる。組成物にはさらに、保存剤、安定剤などを含むことができる。好ましい製剤は、例えば注射剤、特に癌組織に直接注入可能な製剤である。そのような製剤として好適な例、有効性成分がカチオン性リポソームに封入された製剤である。或いは、凍結乾燥製剤であり、使用時に生理食塩水などで希釈するような形態である。

本発明の医薬組成物の治療効果は、 LD₅。/EC₅。の測定に基づいて決定することができる。ここで LD₅。は、毒性を表し集団の 50%の致死量を、 EC₅。は、治療指数を表し集団の 50%の治療有効量をそれぞれ表す。組成物の用量は、例えば約 10〜約 ΙΟΟηΜである。特に約 50〜； LOOnMの範囲の用量では癌細胞がほぼ完全に細胞死を起こす。また、ベクター、特にウィルスベクターの場合、その用量は例えば 10⁵ 〜10¹² pfu/mlである。しかし、実際の投与量は、患者の状態、年齢、性別、重症度などによって医師が決めるべきものである。

本発明の医薬組成物は、上記の特定の癌をもつ患者に投与することによって、癌の増殖及び進行を抑制し、非癌組織に影響せずに癌を選択的に死滅させることが可能である。投与のための有効成分としての上記アンチセンスオリゴヌクレオチド核酸及び OncomiR - l/C13orf25のイントロン 3の 3 '半分領域をコードする核酸は、単独で又は組み合わせて使用することができる。好ましい投与形態は、非ベクターの核酸であるが、これは一過的な作用を可能とし副作用を有意に軽減できるからである。また、投与は、外科的手術、局所投与或いは静脈内投与などによって行うことができる。

以下に、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。実施例

実施例 1

実験方法

1 . ヒト癌細胞株

ヒト肺癌細胞株（Calu6， ACC-LC-176) 及びヒト子宮頸癌細胞株（HeLa) を、 5 %牛胎児血清（Invitrogen)添加 RPMI1640培地（Gibco)を用いて 5 %C0₂存在下で培養し、以下の実験に使用した。 Calu6及び HeLa株はそれぞれ愛知県がんセンター研究所（Nagoya、 Japan) から入手した。

2 . アンチセンスオリゴヌクレオチド

miR-17-92 miRNAクラスターに含まれる miRNA及ぴそれと極めて相同性の高い配列をもつ miRNAの塩基配列と、実験に用いたそれらの miRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は以下のとおりである（図 3)。

miR-17-5p AS 5， - ACUACCUGCACUGUAAGCACUUUG-3 ' (配列番号 1) miR-17-5p 3' -UGAUGGACGUGACAUUCGUGAAAC-5，（配列番号 2) miR-18 AS 5' -UAUCUGCACUAGAUGCACCUUA-3，（配列番号 3)

miR-18 3' -AUAGACGUGAUCUACGUGGAAU-5 ' (配列番号 4)

miR - 19a AS 5' - UCAGUUUUGCAUAGAU而 GCACA- 3 (配列番号 5)

miR - 19a 3' - AGUCAAAACG画 CUAAACGUGU- 5 (配列番号 6)

miR - 20a AS 5， - CUACCUGCACUAUAAGCACUUUA - 3 (配列番号 7)

miR - 20a 3' -GAUGGACGUGAUAUUCGUGAAAU-5 (配列番号 8)

miR- 92-1 AS 5' - CAGGCCGGGACAAGUGCAAUA- 3 ' (配列番号 34)

miR— 92—1 3' -GUCCGGCCCUGUUCACGUUAU-5 ' (配列番号 35)

なお、実験に用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その G及び Cが Locked Nucleic Ac idによって置換されたオリゴ DNA鎖を用いた。

3 . Northern blot解析

1 X 10⁶個の Calu6又は HeLa細胞を 10cm dishに撒き、翌日の transf ectionはオリゴヌクレオチドを 10nMの最終濃度で l ipofectamin 2000 (Invitrogen社、 USA) を使用して行った。その 2日後に前回と同じ条件で再度 transfectionを行った細胞から acid-phenol法にて RNAを抽出した。 miRNA の Northern blotは 5 μ gの RNA を用し、 15% denaturing polyacrylamide gel を用レヽて行！/ヽ、さら ίこ RNA を Zeta-Probe GT Blotting Membranes (Bio- Rad社、 USA)に overnightで転写した。用いた Probeは、下記のとおりである。

raiR- 17- 5p 5 ' - ACTACCTGCACTGTAAGCACTTTG- 3，（配列番号 12)

miR- 20a 5 ' - CTACCTGCACTATAAGCACTTTA- 3 ' (配列番号 13)

let- 7 5， - TACTATACAACCTACTACCTCAATTTGCC- 3 ' (配列番号 9)

5S 5 ' -ATTAGCTTCCGAGATCAGACGA-3 ' (配列番号 10)

これらのオリゴヌクレオチドを [ γ - ³²P]ATP と T4 polynucleotide kinaseを用いて end-label ing でラベルしてプローブを作製した。 0. 25M sodium phosphate (pH7. 2) , 7% SDS, 0. 5% sodium PPI 溶液を用いて、 prehybridization と hybridizationを行った。 Overnightの hybridizat ion後に、 washを 2 X SSC+1% SDS にて 37°Cで行い、 Imaging plateにて露光しシグナルを得た。 4 . MTT解析

5 %牛胎児血清（Invitrogen)添加 RPMI 1640 培地（Gibco)を含む 6 wel l plate の各 wel lに 8 X 10⁴個の細胞を撒き、翌日に iniR- 17- 5p ' miR- 20a等として表記のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号 1， 3， 5， 7， 34) 又はスクランブルオリゴヌクレオチド（配列番号 11、 1δ〜19) を最終濃度が 5ηΜ、 10ηΜ、 20ηΜになるようこ、 l ipof ectamine 2000を用!/、て transfect ionを行った。翌日、 6well plate の lwel l分を 24well plateの 4well分に撒きなおし、さらにその翌日には、前回と同様な条件で 2回目の transfect ionを行った。その 2 日後に TetraColarOne (Seikagaku社、 Japan; を用！/ヽて colorimetric assav■δτίτ 7 _a

5 . FACS解析

5 %牛胎児血清（Invitrogen)添加 RPMI 1640培地（Gibco)を含む 6cm dishに 2 X 10⁵個の細胞を撒き、 LNA-オリゴヌクレオチドの最終濃度が 10nM になるように transfectionした。翌日細胞を 2分の 1に分け、再度 6cm dishに撒きなおした。その翌日に、前回と同じ条件で 2度目の transfect ionを行った。さらにその翌々日に細胞を freezing buf f er (0. 5% NP-40 を含有する）にて懸濁し、 propidium iodide (Sigma- Aldrich)にて染色したのち、 FACS Cal ibur (BD Biosciences 社) にて DNA含量を測定し、付属する Cel l Quest及び Modif itプログラムにて解析した。

なお、上記の実験で使用したスクランブルオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有している。

scramble— miR- 17 - 5p 5， - TAACGTCACTTCGACTGAACTGCT- 3，（配歹 IJ番号 11) scramble— miR- 18a 5， - CTTAGTACTGTACAAGACTCT- 3 ' (配列番号 16)

scramble— miR- 19a 5 ' - GTCTATTGGTATATCTAACYGCA- 3 ' (配列番号 17) scramble— miR- 20a 5 ' - ATCTCATACTACACTTGAACACT- 3 ' (配列番号 18) scramble— miR - 92 5， - GCATCAAGACGGTCAGAGCGA- 3，（配列番号 19)

(但し、上記の配列において、 Gと Cは全て LNAで置換されている。 ) 6 . miRNA抑制活性のルシフエラーゼァッセィ

RBL2の 3， - UTR中、 2つの miR- 17- 5p/miR- 20aが標的とする部位に対応するオリゴヌクレオチドを、 pCMV-Lucレボーターのホタルルシフェラーゼ遗伝子の停止コドンの下流にクローン化した。これらの RBL2レポーター（RBL2-T1+T2) を、 2度目の LNAトランスフエクシヨンの翌日、 Fugene6 (Roche)を使用して、 1/9量の pRL - TK と共に Calu6中にトランスフエクトした。レポータ一活性を翌日測定し、ホタルルシフェラーゼ活性をゥミシイタケルシフェラーゼ活性で標準化した。

7. ウェスタンプロット解析

LNA—オリゴヌクレオチドのトランスフエクション翌日、 SDSサンプル緩衝液を用いて細胞溶解物を回収した。この細胞溶解サンプル中での推定標的遺伝子産物の改変を、マウスモノクローナル抗 RB2 抗体（BD bioscience)、抗 RB 抗体（BD bioscience)、抗 pl07抗体（BD bioscience)及び抗 E2F1抗体（Santa Cruz)を用いて調べた。内部対照として、マウスモノクローナル抗 _ α —チューブリン抗体 (Sigma) を用いて、再度厳密に調べた。解析結果

miR17_5p及び miR- 20aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる増殖抑制：

miR- 17- 92クラスター内に存在するどの miRNAが癌細胞の増殖を抑制するための治療標的となり得るのか検討を行つた。各グァニン及びシトシン残基に LNAを取り込んだアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、 miR- 17- 5p、 miR- 18、 muiR - 19a及び miR - 20a及び miR - 92-1 の発現抑制を行ったところ、ノーザンプロット解析により、 miR- 17- 5p と miR- 20aの間に高度に相同的な性質により起こる顕著な相互抑制が見られる一方、対応する miRNAの特異的抑制が確認された（図 1E 及ぴ 1F)。MTTアツセィにより、 Calu6、ACC- LC- 176 (データ示さず）及び Hela細胞において miR - 17-5p及び miR-20aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフエクトすることにより細胞増殖が顕著に減少することが明らかとなった (図 1A)。一方、それぞれの G、 A、 T、 C比を保って配列をスクランブルしたオリゴヌクレオチド（SC) ではそのような增殖抑制効果は見られなかった。

一方、 miR- 17- 92クラスターに属する miRNAの中で、 miR - 18及ぴ miR- 19aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはそのような抑制効果を示さなかった（図 IB) 。miR - 92 - 1 を抑制することにより、細胞増殖がわずかに抑制された。この結果は、癌細胞の増殖における役割という点で、 miR-17- 92の複数の miRNA間での明らかな違いを示した。さらに、 FACS解析により、miR- 17 - 5p及ぴ miR - 20aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを単独でまたは組み合わせて transfection した Calu6では、 subGl細胞集団の増加が明らかに認められ、アポトーシスが誘導されている事を示唆するものと考えられた（組み合わせによる処理のデータを図 1C 及び 1Dに示す）。

上記の実験により、 miR - 17- 5p、 miR- 20aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、癌細胞に対する優れた増殖抑制と細胞死誘導効果をもつことが明らかとなった。したがって、これらの組成物は癌の新規治療薬として有用であろう。 miR-17- 5p及び miR- 20a用の付加的真性標的としての RBL2/pl30の同定：次に、本発明者らは、 miR-17- 5p及び miR- 20aに着目し、 E2F1 に加えて標的遺伝子を探索した。コンピューターベースのアルゴリズム（Target Scan並びに Pictar) により推定した数百個の遺伝子のうち、細胞増殖と癌との明らかな関連に基づいて Rbフアミリーのメンバーを選択した。ウェスタンブロット解析の結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドを transfectionした Calu6細胞では、スクランブルォリゴヌクレオチドと比較して、 RBL2/_P130 の発現に顕著な増加を示した（図 2A)。さらに、 RB1でもアンチセンスオリゴヌクレオチド transfectionにより、軽度の発現上昇が認められたが、 RBLl/pl07では、有意と判断しうる変化は認められなかつた。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理に対する最も顕著な反応は、それぞれ 1つの結合可能部位を有する RB1及び RBLl/pl07ではなく、 2つの結合可能部位を有する RBL2/pl30で観察された。従って、 RBL2/pl30が実際に、これらの miRNAにより直接制御されるのかどうかを調べた。アンチセンスで処理した Ca 1 u⁶細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の 3 ' UTR領域に揷入された RBL2/p 130 の 2つの結合可能部位のうち、少なくとも一方の部位のみを有するか、またはその両方の部位を共に有する、レポーター構築物を用いて調べた（図 2A)。miR- 17 - 5p 及び/又は miR- 20a のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理に反応してルシフエラーゼ活性の明らかな增加が観察された（図² C)。さらにまた、 RBL2 (_P130)の 3 ' 非翻訳領域に検出される 2箇所の miR - 17- 5p/miR- 20a推定標的部位が決定され（図 2B)、また、 miR- 17- 92が高発現していない A549癌細胞株ではアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞の生存及び増殖に影響しないことを確認した（図 2D)。実施例 2

材料と方法

細胞培養及び OncomiR- 1断片発現用構築物

前述したように、実施例 1に記載のヒト癌細胞株はすべて RPMI 1640/5°/。FCS中、 37°C、5%C0₂の存在下培養した。発現用構築物には、下記の OncomiR- 1 遺伝子 (chrl3： 90798074-90804870) の断片を使用した（miRNAs+3' イントロン 3； 90800465-90804480, miRNAs； 90800659-90802399 (miR- 17-92 クラスターを有する EcoRI-Hpal断片）、 3 ' イン卜ロン 3； 90802399-90804480、 C1； 90802329 - 90803170、 C2 ; 90803146-908096及び C3 ; 90803876 - 90804480) )。これらの断片は PCRにより増幅し、ピュー口マイシン耐性遺伝子を担持する改変 pcDNA3ベクター（Invitrogen、 Carlsbad、CA)中にクローン化した。細胞増殖アツセィ

OncomiR- 1断片の各発現ベクターを、リポフエクタミン 2000 (Invitrogen)を用いてトランスフエクトし、ピューロマイシンにより選択した（2 g/mLで 2 日間、その後は 0. 5 z g/mL) ₀ トランスフエクションの 10 日後、テトラカラーワン (生化学工業、東京、日本）を用いて細胞増殖を測定した。 LNA-アンチセンスオリゴヌクレオチドを、リボフェクタミン 2000を用いて細胞株にトランスフエクトし、 3 日目に再度トランスフエクトし、最初のトランスフエクションから 4 日後に細胞増殖を測定した。細胞増殖のルシフェラーゼアツセィ

ルシフヱラーゼレポーター活性を、細胞增殖を反映したものとして選択剤を使用せずに測定した。 A549細胞は、 1/10量の pRL-TKレポーター（Promega)と共に各 miRNA発現ベクターに三重に共トランスフエクシヨンした。 CMV駆動型（ホタル）ルシフェラーゼレポーター（pCMV-Luc) の使用によっても同様の結果が得られた (データ示さず）。トランスフヱクシヨンの翌日、トランスフヱクトした培養皿中の培養細胞をそれぞれ 4分割し、その後、デュアル一ルシフェラーゼレポーターァッセィシステム (Promega) を使用して 3日目まで毎日ルシフェラーゼ活性を測定した。結果

miR-17-92に隣接する増殖抑制領域の同定

miR-17-92の機能解析を進めていく過程において、 OncoraiR- l/C13orf25のィントロン 3の 3，側半分を含有することにより、腫瘍 miRNAクラスターの有無に関らず、ヒト癌細胞株の増殖が著しく抑制されることが判つた（図 4B)。イントロン 3 の 3 ' 側半分を厳密に検查することにより、 3つの進化的に保存された領域の存在が明らかになった（図 4A)。そこで、それら 3つの領域のいずれが細胞増殖抑制活性を有するかどうか検討を行った結果、保存領域 2 (C2)がその機構に深く関与することが示唆された（図 4C) 。更なる検討の結果、こめ C2領域による細胞増殖抑制機構の一部は、二本鎖 RNA依存的プロティンキナーゼ PKR及びカスパーゼ 7 のタンパク分解酵素活性を活性化することによるものである可能性が示唆された (図 4D及び図 4F)。しかしながら、 C2の推定二次構造に基づく本発明者らの試みは、 C2領域内の原因部分を究明することにはならなかった（図 4E)。考察

上記の実験では、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより miR- 17- 5p 及び miR-20a を抑制すると、肺癌細胞に顕著にアポトーシスを誘発することが明らかになった。これは、肺癌などの各種の癌タイプに有効な新規の治療方法となり得ることを示唆している。 miR- 17-5p及ぴ miR- 20aは、 3 ' 側の非翻訳領域の標的部位に結合することにより E2F1を直接抑制することが予め示された。従って、アポトーシスの誘発は、これらの miRNA による抑制から解除されることによる E2F1 の誘発と、それに続く偶発的な細胞周期の S期への進行とに、部分的に関連しているとレ、うことができる。さらに、上記の実験結果から、肺癌細胞の增殖は miR-18又は miR- 19 に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理により顕著に抑制されなかったことが判った。これは、これらの miRNAが 0ncomiR_l/C13orf25 の同一の転写ュニット内で第三者的であり、細胞の増殖及び生存には直接関与せず、腫瘍発症 ·進展における異なる役割を担う可能性を示唆している。

発癌機構を考慮した上での miR_17-5p及ぴ miR- 20aの更なる標的分子の探索により、RBL2/pl30が実際にそれらの miRNAの直接的な標的であるという確かな証拠を得ることができた。骨髄間質幹細胞中の RBL2/pl30の過剰発現は、アポトーシスの顕著な増加につながることが示されている。しカゝし、 BrdU陽性の細胞周期細胞の割合に対する重要でない作用のみが観察された。これは、過剰発現された RB の効果、すなわち、 S期及び TUNEL陽性細胞の明らかな減少、と明らかに対照的である。この関連で、 miR- 17-5p及び miR- 20aは、各 miRNA単一の標的部位を有する Rbファミリ一の他の 2つのメンバーである RB1及び RBLl/pl07を制御すると考えられる。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理された RB1 及び RBLl/pl07のアップレギユレーションは、 Calu6細胞においてはあまり見られなかつた。

miRNA による遺伝子発現の複雑な微調整は、目的の細胞内で発現された各種遺伝子の発現プロファイルの関係だけでなく、相同性の度合いや標的部位の数という特異な影響を恐らく受ける。従って、 miR - 17-92 の過剰発現を伴う癌細胞の生存はある程度、 E2F1及び RBフアミリ一のメンバ一間、ならびにそれらの未だ同定されていなレ、標的遺伝子間の、微調整された miRNA仲介のバランスに依存することは考えられないことではない。更なる研究が必要なのは明らかであるが、新規な癌特異的治療方針を、癌細胞の合成致死性を誘発すると思われる微妙なバランスのアンチセンスオリゴヌクレオチド主体の揺らぎに基づき最終的には確立することができる。しかし、この関連で、これら miRNA を低レベルで発現する A549 細胞において、上記処理による顕著な抑制は見られなかった。これは、「0ncomiR依存性」の存在の可能性を示唆している。

0ncomiR-l/C13orf25は、リンパ腫において、遺伝子増幅領域に存在し miR- 17- 92 を発現する運搬体として作用することが示されている（L. He et al. , Nature 2005_: 435 : 828 - 833)。しかし、この報告は、保存された阻害性ゲノム領域が miR - 17 - 92 と共に発現すること力おそらく PKR が仲介するアポトーシス経路の活性化によつて、 miR- 17-92の増殖促進効果を相殺する、という本発明者らの観察と矛盾すると思われる。この明らかな矛盾は、 2 つの悪性腫瘍の細胞起源の差を反映していると言うことができるが、イントロン 3の阻害効果は子宮類癌ゃ腌臓癌のような他のヒト癌細胞株に同様に見られることを、本発明者らは既に確認している（データ示さず）。 miRNAは、ポリシストロン性クラスターとしてしばしば RNAポリメラーゼ Πにより転写されることが提示されている力 S、ゲノム構造との関係において詳細に解析された例はほとんどない。従って、上記の実験は、ヒトゲノムにおいてそのように稀な例である miR - 17- 92に関する極めて重要な知見を、さらに提示するものである。本研究において、本発明者らがその存在を明らかとしたヒトゲノム上の miR- 17-92クラスター 3，側領域の 3つの機能配列は、マウスゲノム上の miR-17-92クラスターの 3，側の領域に同様に保存され存在することから、 C2領域に見られる増殖抑制機能も進化的意味で保存されているものと推定できる。

要約すると、 1 ) miR- 17- 5p及ぴ miR - 20aを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドが miR - 17- 92miRNA クラスターを過剰発現する癌細胞においてアポトーシス (細胞死) を効果的に誘発する、 2 ) OncomiR- l/C13orf25のイントロン 3は腫瘍増殖阻害効果を有する、という本発明者らの知見は、新規な癌治療方法を提供する。また、 miR- 17-92 クラスターの更なる標的遺伝子の同定は、これら miRNA の過剰発現が癌細胞に対しいかに選択的利点を与えるかを十分に理解するために重要である。産業上の利用可能性

本発明に係る miR- 17 - 5p及び/又は miR - 20aに対するアンチセンスオリゴヌクレォチド、 OncomiR- l/C13orf25のイントロン 3の 3，側半分又はその一部の配列を有する核酸などの核酸は、 miR-17 - 5p又は miR- 20aを過剩発現する癌の細胞増殖を抑制し、細胞死を誘導することから、そのような癌の治療のために有用である。上で開示した配列番号 14及び 15の配列は、以下のとおりである。

(配列番号 14) 3， intron3 (chl3 ; nt90802399- nt90804480) 2082 bp :

(配列番号 15) Conserved2 (Chl3 ; nt90803146- nt90803896) 751 bp :

CAGATGAGTGAGCAAGTTGATAATGGCCTCA

Claims

請求の範囲

1 - 下記の核酸：

(a) 配列番号 1又は 12 の配列からなる miR - 17- 5p アンチセンスオリゴヌクレォチド、

(b) 配列番号 7又は 13 の配列からなる miR- 20aアンチセンスオリゴヌクレオチド、

(c) 配列番号 1又は 12或いは配列番号 7又は 13の配列と 85%以上、 90%以上又は 95 %以上の同一性を有する 18〜25 ヌクレオチドの配列からなり、かつ miR- 17- 5p又は miR- 20aの生物活性を抑制することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド、

(d) miR- 17-5p前駆体のアンチセンス配列において配列番号 1又は 12の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、

(e) miR-20前駆体のアンチセンス配列において配列番号 7又は 13の配列を含む塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、

(f) 前記（a)、（b)、 (c)ヽ (d)又は（e)のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾体であって、 locked nucleic acid (LNA)、 2 ' -0-メチル基又は 2， - 0-メトキシェチル基を少なくとも 1つ有する修飾体、並びに、

(g) 前記（a)、 (b)、 (c)、（d)又は（e)のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコ一ドする DNA配列、それに対応する RNA配列、又は該 DNA配列を含む発現べクタ — DNA、

からなる群から選択される 1又は複数の核酸を有効成分として含み、かつ該核酸が miR - 17 - 5p及び/又は miR20が過剰発現している癌の増殖を抑制する及び/又は細胞死を誘導する活性を有する、癌の治療のための医薬組成物。

2 . 前記核酸が、配列番号 12の配列（ここで、塩基 G及び Cが LNAによって置換されている）からなる miR - 17- 5_Pアンチセンスオリゴヌクレオチド修飾体、配列番号 13の配列（ここで、塩基 G及ぴ Cが LNAによって置換されている）からなる miR - 20a 了ンチセンスオリゴヌクレオチド修飾体、又はそれらの混合物である、請求項 1に記載の医薬組成物。

3 . 前記癌が、肺癌、膊臓癌、子宮頸、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌；大腸癌、胆襄'胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される、請求項 1又は 2に記載の医薬組成物。

4 . ヒト染色体 13q31. 3に存在する OncomiR- l/C13orf25のイントロン 3の 3 ' 側半分又はその一部の DNA、それに対応する RNA、又は該 DNAを含むベクター環 A、からなる群から選択される核酸を有効成分として含み、かつ擎核酸が癌の増殖抑制活性及び/又は細胞死誘導活性を有する、癌の治療のための医薬組成物。

5 . 前記ィントロン 3の 3 ' 側半分の DNAの塩基配列が、配列番号 14によって示される配列、又はその配列と 90%以上、 95%以上、 97%以上、 98%以上又は 99% 以上の同一性を有する配列である、請求項 4に記載の医薬組成物。

6 . 前記ィントロン 3の 3，側半分の一部の DNAの塩基配列が、配列番号 15によつて示される配列、又は配列番号 15によって示される配列の 15塩基以上の部分配列、又は配列番号 14によって示される配列において少なくとも配列番号 15によって示される配列を含む配列、或いはそれらの配列と 90%以上、 95%以上、 97% 以上、 98%以上又は 99%以上の同一性を有する配列である、請求項 4に記載の医薬組成物。

7 . 前記癌が、肺癌、膝臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢'胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される、請求項 4に記載の医薬組成物。

8 . 請求項 1に記載の医薬組成物を、肺癌、睥臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢 '胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される癌をもつ患者に投与することを含む、癌の治療方法。

9 . 請求項 4に記載の医薬組成物を、肺癌、腌臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、大腸癌、胆嚢 *胆管癌及び肝臓癌からなる群から選択される癌をもつ患者に投与することを含む、癌の治療方法。