WO2013053838A1 - Procédé de préparation de glucans à partir d'aspergillus niger - Google Patents

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WO2013053838A1
WO2013053838A1 PCT/EP2012/070184 EP2012070184W WO2013053838A1 WO 2013053838 A1 WO2013053838 A1 WO 2013053838A1 EP 2012070184 W EP2012070184 W EP 2012070184W WO 2013053838 A1 WO2013053838 A1 WO 2013053838A1
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Philippe Richard VAESEN
Olivier Yvette Marcel BAUM
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Kitozyme
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Definitions

  • the present invention relates to a process for preparing glucans from Aspergillus Niger, the Beta-glucans thus obtained, and their uses.
  • beta-glucans from various substrates of natural origin, for example beta (1, 4) glucans derived from cereals, beta (1, 3) (1, 6) glucans derived from yeast and mushrooms.
  • beta (1, 4) glucans derived from cereals beta (1, 3) (1, 6) glucans derived from yeast and mushrooms.
  • EP 0759 089 discloses that glucans derived from Saccharomyces cerevisiae provide various beneficial effects to fish and other animals.
  • Various chemical or biochemical treatments are carried out to eliminate beta- (1-6) -linked glucan chains, in particular by treatment with beta- (1 -6) -glucanase.
  • the degree of branching of lateral links on the beta-glucan skeleton depends on the genus, the species, and the strain of the organism considered.
  • the degree of branching is important for the macromolecular structure of glucans which is linked to immunostimulatory properties.
  • Aspergillus niger is known primarily as a source of chitin to produce chitosan. Aspergillus niger mycelium is a by-product of A. niger fermentation for citric acid production. Methods of obtaining chitosan from A. niger are for example described in the international application KitoZyme WO03068824. Glucans are an insoluble by-product obtained during the preparation of chitosan. The glucans resulting from the chitosan preparation are discarded. It can be seen from the teaching of international applications WO0168714 and WO03086281, which do not envisage the subsequent treatment of insoluble glucans.
  • glucans can be obtained as an insoluble by-product during the preparation of chitosan, the methods known to date do not allow industrial exploitation of glucans coproduced with chitosan obtained from chitin. In addition, the degree of purity of glucans is generally not satisfactory.
  • the chitosan preparation process of the international application WO03068824 of KitoZyme does not make it possible to obtain glucans with satisfactory purity since the glucans are in the form of chitin-glucan copolymers.
  • This international application indicates that a chitin-glucan copolymer may possess from 30 to 50% (m / m) of chitin and between 50 and 70% of beta-glucans.
  • Aspergillus niger glucans or “Aspergillus niger glucans”, or “Aspergillus niger originated glucans", or “Aspergillus niger glucans”, are meant beta-glucans obtained or susceptible to be obtained from the organism Aspergillus niger, and in particular from mycelium Aspergillus niger. This name can be transposed to other products than glucans, such as chitosan or chitin.
  • glucans according to the present invention, but this designation relates more specifically to an extract of Aspergillus niger comprising predominantly in bulk glucans, the remainder of the extract being constituted by impurities in the sense of the invention, that is to say compounds other than glucans.
  • glucans or "beta-glucans” are used here as synonyms.
  • immunostimulation glucans is meant glucans having properties promoting the immunostimulation of at least one reference marker of the immune system, such as, for example, the neutrophils of the innate immune system.
  • the present invention aims to provide an industrial process for the preparation of glucans from Aspergillus niger.
  • the present invention in particular aims to improve the yield of a process for preparing glucans from Aspergillus niger.
  • the present invention in particular to improve the yield of a process for preparing glucans from Aspergillus niger with the co-production of chitosan.
  • the present invention also aims to purify glucans from Aspergillus niger according to an industrial process.
  • Another object of the present invention is to obtain or prepare immunostimulatory glucans, in particular for the stimulation of the immune system of an animal or of a human being, especially by oral nutrition, application to the skin, etc.
  • the invention relates to a method or method for preparing glucan from Aspergillus niger mycelium, said method comprising: (i) at least partial deacetylation of Aspergillus niger mycelium; (ii) acid treatment of the deacetylated or partially deacetylated mycelium, preferably after purification and / or washing, to obtain insoluble glucan and soluble chitosan, said acidic treatment comprising contacting the deacetylated mycelium with an acidic solution; (iii) the separation of soluble chitosan on the one hand, and insoluble glucan on the other; (iv) an alkaline treatment of glucan comprising contacting glucan with an alkaline solution to flocculate glucan; and (v) drying the flocculated glucan to obtain a glucan powder.
  • the glucan of the invention is never 100% pure, but includes secondary substances.
  • secondary substances it is possible to note the presence of ash, lipids, chitin and / or chitosan or other polysaccharides (for example mannan), which one seeks to minimize, with a view to improving the purity thereof. with the intended use.
  • deacetylation of chitin is meant the total or partial deacetylation of chitin because chitosan may comprise a degree of acetylation more or less high.
  • the deacetylation (step (i)) is carried out by bringing the mycelium into contact with an alkaline material, preferably bringing hydroxide ions, and preferably with sodium hydroxide (NaOH), at a concentration of a temperature, and for a time sufficient to deacetylate the chitin to chitosan with preferably a minimum yield of 4% to chitosan, and preferably greater than 9% and obtain a chitosan preferably having a degree of acetylation, that is, that is to say a molar proportion of N-acetyl-D-glucosamine units along the chitosan chains, from 0 to 50%, and preferably from 10 to 25%.
  • an alkaline material preferably bringing hydroxide ions, and preferably with sodium hydroxide (NaOH), at a concentration of a temperature, and for a time sufficient to deacetylate the chitin to chitosan with preferably a minimum yield of
  • the alkaline solution comprises a concentration greater than 40% (mass / volume) of alkaline material providing hydroxyl ions relative to the total mass of the alkaline solution.
  • yield is meant the mass ratio expressed in% of the dry mass of the fraction containing chitosan (chitosan and its impurities) on the dry mass of the starting mycelium.
  • a solution of sodium hydroxide of concentration 50% (mass / volume) is used.
  • the Aspergillus niger esX mycelium is mixed with a concentrated alkaline solution.
  • the alkaline solution is chosen from an aqueous solution of sodium or potassium hydroxide, carbonate or sodium bicarbonate.
  • the ratio by mass of the alkaline material with respect to chitin is between 0.1 to 5, and preferably between 0.3 to 3, and more preferably from 0.5 to 1.5 (m / m). .
  • the treatment with the alkaline solution of the Aspergillus niger mycelium is carried out at a temperature of between 50 and 1 ⁇ 20, and more preferably between 80 and 1 ° C.
  • the mycelium can be brought into contact with the alkaline solution, then a gradual rise in temperature can be achieved. For example the temperature reaches 110 ° C in 2 hours, then the temperature is maintained for 6 hours, then the resulting suspension is transferred to the next step in 1 hour, the temperature decreases to room temperature.
  • the deacetylation step itself is carried out for a period of between 30 minutes and 10 hours, and preferably between 3 and 8 hours.
  • deacetylation can be carried out by bringing the mycelium into contact with the alkaline solution for a period of between 4 and 7 hours, then increasing the temperature with maintenance at a temperature of between 50 and 120 ° C., and even more preferably between 80 and 120 ° C.
  • the insoluble fraction in an alkaline medium can be separated from the soluble fraction by filtration and / or centrifugation.
  • the insoluble alkali fraction obtained after deacetylation is preferably suspended, then diluted, filtered and washed with water. This or these steps are typically performed as necessary.
  • the alkaline solution is recovered after this first step, concentrated, recycled and reused for the deacetylation of chitin.
  • the method of the invention may comprise the pretreatment of Aspergillus niger mycelium.
  • the mycelium is preferably washed, and concentrated and / or dried. This allows according to one variant to use a mycelium completely or partially discolored.
  • the white or beige color may be advantageous for applications such as pharmacy, nutraceutical, cosmetic, or in the food industry. Filtered / washed mycelium advantageously provides an improvement in the yield of chitosan and / or glucan.
  • This step is carried out under conditions making it possible to obtain a soluble fraction and an insoluble fraction.
  • the insoluble fraction in an alkaline medium is brought into contact with an acid solution according to step (ii), the pH being advantageously adjusted to a value of less than 6.5, and preferably less than 5.5, by adding an acid such as for example chosen from hydrochloric acid, lactic acid, formic acid, glutamic acid, phthalic acid, succinic acid, glycolic acid, citric acid and, preferably, acetic acid.
  • the reaction may for example be carried out at room temperature or any other temperature favoring the separation of the soluble fraction containing chitosan from the insoluble fraction containing glucan.
  • An acidic solution having a concentration of between 0.1 and 1 N can be used as an acidic solution.
  • an 80% solution of acetic acid is used.
  • the acid treatment of step (ii) comprises the addition of an organic acid until a pH of between 3 and 5.5 is obtained, and preferably between 3.5 and 4.5. .
  • the acid treatment of step (ii) comprises or consists of the addition of acetic acid to the deacetylated mycelium obtained in step (i), optionally washed, dried and / or concentrated.
  • step (ii) the alkaline residue is removed by several washes with water.
  • the separation according to step (iii) is carried out by separation using a continuous nozzle centrifuge. More particularly, for this centrifugation step can be used a nozzle separator type centrifuge or self-debirking type (eg NA7), or a high performance BTUX vortex separator type centrifuge (both). types of centrifuge NA7 or BTUX being marketed respectively by Westfalia and AlfaLaval).
  • the method of the invention may comprise an additional step (iiia) for treating the soluble chitosan obtained in step (iii) to separate the insoluble glucan, this additional step possibly being repeated one or more times.
  • the insoluble glucan obtained according to this additional step (iiia) may be added to the insoluble glucan recovered in step (iii).
  • step (iiia) implements a decanter with centrifugal force (for example a Sedicanteur marketed by Flottweg, which compared to a conventional clarifier has a biconical bowl and a higher centrifugal speed than a conventional decanter ).
  • a decanter comprises a solid bowl centrifuge and a conveyor screw. It can typically develop a centrifugal force of 6,000 to 10,000g. The speed of the bowl, the speed of the screw and the layer height are set by the skilled person to optimize the performance of the machine.
  • the glucan according to the invention is insoluble in water at room temperature and at acid pH, less than 7. Chitosan is soluble under these conditions.
  • the insolubility of glucans makes it possible to purify them.
  • the flocculation step advantageously makes it possible to separate the glucans by industrial means and in a time allowing a profitable industrial exploitation.
  • the alkaline solution used in the flocculation step (iv) comprises or consists of lime, for example in the form of 30% lime milk (Ca (OH) 2 ) (calcium hydroxide), which precipitates in a solid easily recoverable and resists the mechanical constraints of conditioning by allowing recovery of glucans with a degree of purity in fine satisfactory.
  • lime for example in the form of 30% lime milk (Ca (OH) 2 ) (calcium hydroxide), which precipitates in a solid easily recoverable and resists the mechanical constraints of conditioning by allowing recovery of glucans with a degree of purity in fine satisfactory.
  • the alkaline solution of flocculation step (iv) comprises or consists of a mixture of sodium hydroxide (NaOH) and milk of lime (Ca (OH) 2 ).
  • a weight ratio of sodium hydroxide / lime (calcium hydroxide) of 1/2 to 1/10, and preferably of about 2 to 1/6 (preferably about 1 / 3.5).
  • This step is preferably followed or controlled by pHmetry. It is preferred to stop the addition of alkaline solution when the pH becomes greater than 9 and preferably greater than 10.
  • Flocculation of glucan is important to allow separation easily exploitable industrially. It is preferred to use a sodium hydroxide / calcium hydroxide mixture in order to limit calcium ion intake in glucans to avoid generating excess ash.
  • the presence of lime advantageously confers a glucans texture facilitating their separation in an industrial equipment. This also allows a reduction in separation times which is industrially very interesting.
  • This flocculation step is also important to allow drying of glucan (via a dryer type "flash dryer") in the form of powder.
  • glucan is in the form of an alkaline suspension (pH greater than 10).
  • Step (iva) additional purification of glucans
  • the glucan obtained in step (iv) may optionally be re-purified before the drying step, in order to adapt the purity of the glucan to the intended use, in particular to increase the purity, for example by decreasing the residual ash content in glucan.
  • This additional step comprises bringing the glucans into contact with a solution for solubilizing chitosan and then removing the solubilized chitosan by separation.
  • This additional purification step is advantageous if it is desired to increase the proportion by mass of glucan beyond 80% relative to the total mass of the final product.
  • the additional purification step preferably comprises contacting the flocculated glucans with an acidic solution.
  • the acid solution in question has a pH of greater than 5 and less than 7, and even more preferably between 6 and 6.6.
  • Acetic acid is preferably used to prepare this acidic solution.
  • a separation can be carried out with a filter press or decanter, basket centrifuge, high centrifugal force decanter (Sedicanteur®), or band filter.
  • the glucan obtained according to step (v) can then be dried.
  • This step is advantageously carried out by introducing the glucan obtained in the previous step (step (iv) or (iva)) into a drying device to remove the residual liquids.
  • glucan drying flash dryer
  • This drying may optionally be followed by granulation.
  • the final product is then packaged.
  • steps (i) and (ii), (ii) and (iii), (iii) and (iv), and / or (iv) and v) it is possible to perform different treatments.
  • These treatments may for example consist of one or more washes, purifications, concentrations, separations, and / or one or more other treatments intended to improve the yield and / or purification of the products obtained according to the process of the invention.
  • the process of the invention does not comprise a glucan oxidation step.
  • the method of the present invention makes it possible to improve the yield of chitosan by transforming a maximum amount of chitin into chitosan ("deacetylation") while recovering glucan satisfactorily, and preferably so as to be able to valorize them as an immunostimulatory agent.
  • the present invention relates to a method for co-preparation of chitosan and glucan from Aspergillus niger, said method comprising the glucan preparation according to the method of preparation described above, including any variant and any embodiment particular, possibly combined with each other, and the preparation of chitosan.
  • the invention in another aspect, relates to a method for the production of chitosan and glucans from chitin of Aspergillus niger origin comprising the following steps: (a) bringing chitin into contact with a basic solution for deacetylating at least partially chitin and recover a soluble fraction in an alkaline medium and an insoluble fraction in an alkaline medium, (b) contacting the insoluble fraction in an alkaline medium with an acidic solution, to obtain a soluble fraction of chitosan, more or less acetylated, and an insoluble fraction comprising glucans and then (c) further treating chitosan to wash, purify, and optionally dry it, said method also comprising treating the glucans obtained in step (b) to wash, purify, and optionally dry them.
  • the alkali-soluble fraction obtained after step (a) is generally discarded because it contains different salts, proteins, and hydrolysed soluble glucans.
  • the soluble chitosan obtained in step (b) may be contacted with a chitin deacetylase enzyme to obtain chitosan.
  • the prepared chitosan may be of high molecular weight.
  • the chitosan may also be of low or medium average molecular weight.
  • low average molecular weight is meant average molecular weight less than 100,000.
  • high average molecular weight is meant a chitosan having an average molecular mass greater than 100,000.
  • the chitosan is of very low average molecular weight, that is to say less than 50,000.
  • chitosan has an average molecular weight of between 10,000 and 50,000.
  • the average molecular weights are determined by measurement with a Ubbelohde type capillary viscometer or by steric exclusion chromatography with light scattering detection (SEC-MALLS) or by triple detection (for example with the Viscotek Triple Detector Array Max System). It is possible to hydrolyze chitosan to reduce its molecular weight.
  • chitosan is obtained by controlling the degree of acetylation.
  • chitosan having a controlled degree of acetylation is meant a product whose degree of acetylation, i.e. the proportion of N-acetyl-glucosamine units can be adjusted in a controlled manner.
  • the process of the invention for extracting glucan and chitosan from the Aspergillus niger mycelium lasts less than 12 hours, and preferably less than 10 hours. .
  • Beta-qlucan According to another aspect, the invention relates to beta-glucan derived from Aspergillus niger obtainable by a method as defined according to the invention, including any variant and any particular embodiment, possibly combined with each other.
  • the glucan of the invention is suitable for animal feed, in particular that its composition is suitable for animal feed.
  • glucan has a glucan content greater than 50%, preferably greater than 55%, and more preferably greater than 60%, especially for animal feed.
  • the glucan of the invention is suitable for application in humans, in particular for oral administration or application to the skin, and in particular food grade, cosmetic and / or pharmaceutical.
  • the glucan has a purity greater than 70%, preferably greater than 75%, and more preferably greater than 80%, especially for applications in humans. These percentages are expressed as weight of glucan relative to the total mass of wet product.
  • wet product is meant the finished product with its residual water content, which is in a preferred variant of 4 to 10%.
  • the process of the invention preserves the bioactivity of the glucan obtained, that is to say its ability to modulate the immune system.
  • the literature shows that the activity of beta (1, 3) -glucan strongly depends on its structure (glycosidic bonds, branching, etc.), which can be affected by the treatments it undergoes.
  • the glucan obtained according to the process of the invention has an activity of modulation of the immune system, as demonstrated by oral administration in the fish Pimephales promelas, whose parameters of the innate immune system are studied.
  • the glucan obtained has a high proportion of beta- (1 -3) glycoside bonds, for example greater than 70% relative to the total number of glucan bonds. It is known that the higher the proportion of beta- (1 -3) bonds, the better the immunostimulatory properties.
  • This glucan is advantageously obtained without the use of a beta-glucanase enzyme.
  • the glucan of the invention comprises less than 15% by weight of chitosan with respect to the total mass of wet product.
  • Such glucans are satisfactory for oral administration in animals.
  • the glucan comprises less than 10% by weight of chitosan relative to the mass of wet product.
  • the percentage by mass of chitosan present in glucan can be analyzed according to the chitosan extraction method by precipitation / washing / weighing.
  • the glucan of the invention comprises less than 10% of ash. It is also possible to obtain 5% of ash, and possibly less than 3% of ash with respect to the mass of wet product.
  • the glucan of the invention comprises less than 5% lipid, and less than 1% protein relative to the wet moist mass.
  • the glucan of the invention does not comprise detectable chitin.
  • the invention also relates to beta-glucan from Aspergillus niger for the modulation of the immune system of a human being or an animal.
  • An animal to which the glucan of the invention may be administered is typically selected from commercial animals, racing animals (horses, dogs), pets, and aquaculture fish.
  • glucan is intended for improving the functions of the immune system, for example neutrophils with regard to oral administration, and Langerhans cells with regard to application to the skin.
  • glucan is intended to increase the degranulation capacity and the activity of neutrophils.
  • the invention also covers a dietary supplement composition for humans or animals, comprising glucan from Aspergillus niger as defined above including any variant and any particular embodiment, possibly combined with each other.
  • the present invention also covers a solid food for fish, characterized in that it comprises glucan from Aspergillus niger as defined above.
  • a solid food for fish characterized in that it comprises glucan from Aspergillus niger as defined above.
  • such food comprises a starch-providing substance, a protein-providing substance, a lipid-providing substance, optionally a mixture of antibiotics, and optionally a mixture of minerals and vitamins, optionally antioxidant substances, optionally digestive enzymes, possibly microorganisms with probiotic activity, possibly fibers with prebiotic activity.
  • the starch-providing substances are generally derived from cereals such as, for example, soybean, corn, wheat, oats, or barley.
  • protein-providing substances are fish meal, soybean meal, dehydrated whey, soy protein, soy flour, blood meal, plasma protein, dehydrated skim milk, concentrate of whey protein, rapeseed meal, corn gluten meal, wheat gluten meal, yeast, sunflower meal.
  • the lipid-providing substances are generally selected from soybean oil, lecithin, coconut oil, whey lipids, lard oil, or sheep tallow.
  • the present invention further encompasses a pharmaceutical composition comprising glucan from Aspergillus niger as defined above.
  • the invention also covers a pharmaceutical composition comprising glucan from Aspergillus Niger as defined above.
  • the invention also covers a cosmetic composition comprising glucan from Aspergillus niger ⁇ e ⁇ as defined above.
  • the invention relates to the use of glucans for applications in the medical, pharmaceutical, nutraceutical, cosmetic, agricultural, food, textile, and / or environmental fields.
  • the chitosan obtained according to the process of the invention can be used in various applications, and typically as those described in the application WO03068824 of KitoZyme.
  • the chitosan and glucan obtained according to the process of the invention can be used in the form of micro-, milli- or nanoparticles, which can be prepared by techniques known to those skilled in the art (for example: Polymeric Biomaterials, S Dimitriu ED, Marcel Dekker, 2002, Chap 1).
  • the glucan of the present invention is essentially insoluble directly in any solvent at 25 ° C at atmospheric pressure.
  • Glucan can be prepared as a powder or lyophilized fiber.
  • the glucan of the invention may be mixed with one or more active substances, and one or more excipients.
  • the invention also covers a formulation comprising the glucan of the invention.
  • the glucan of the invention can be prepared in the form of capsules, tablets, powder, gel, film, emulsion, or suspension.
  • Glucan can also be included in delivery systems, such as vectors for example to be delivered at the level of the small intestine.
  • Glucan can be included in food matrices such as bars, beverages, baked goods, or dairy products.
  • the glucan of the invention may be formulated into a topically applicable composition. It may in particular be cosmetic or pharmaceutical compositions applicable topically (applied to a keratin material, for example the skin). Such compositions may comprise cosmetically or pharmaceutically active ingredients (active ingredients) and / or topically acceptable excipients, known to those skilled in the cosmetics or pharmacy field. Specific examples of formulations according to the invention comprising glucan are oil-in-water and water-in-oil emulsions. The invention covers lipsticks and lip balms containing glucan.
  • the glucan according to the present invention is preferably micronized, it is that is, reduced size of the glucan or glucan-containing particles to a size less than one millimeter and preferably less than 500 microns ( ⁇ ).
  • the diameter of 70%, and preferably 90%, of the particles is less than 350 microns (0.7) ⁇ 355 ⁇ m, preferably d (0.9) ⁇ 355 ⁇ m), preferably less than 100 microns, in particular for formulations of the oil-in-water and water-in-oil emulsion type, and preferably less than 50 microns for lipsticks and lip balm.
  • the particle size is that obtained by laser diffractometry.
  • the glucan can be used after sieving.
  • a fish feed composition is formulated as a gel comprising a premix of powder with 50% protein and vitamin C mixed with hot water ( ⁇ ' ⁇ ) in a 1: 1 ratio to which the compounds of the invention are added, for example at a concentration of 0.1 to 5 g / kg of food.
  • the gel formed after mixing is typically granulated (0.1 -1 mm) just before use to feed the fish.
  • FIG. 1 represents a schematic diagram of a variant of the method of the invention comprising steps (i) to (v);
  • FIG. 2 is a schematic diagram of another variant of the process of the invention comprising steps (i) to (v), and additional purification of the glucans according to step (iva);
  • FIG. 5 represents the evolution of the CD54 marker in a monocyte population as a function of the concentration of beta-glucan in the medium
  • FIG. 6 shows the evolution of the CD54 marker in a population of plasmacytoid dendritic cells as a function of the beta-glucan concentration in the medium
  • FIG. 7 represents the production of Interleukin 6 (IL-6) as a function of the beta-glucan concentration
  • FIG. 8 represents the production of Tumor Necrosis factor alpha (TNF- ⁇ ) as a function of the concentration of beta-glucan;
  • FIG. 9 represents the production of Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha (MIP-1 oc) as a function of the concentration of beta-glucan.
  • each example has a general scope.
  • the beta-glucan content is determined using an enzymatic method, according to a method adapted from the Megazyme kit method (reference K-EBHLG).
  • the validation of the method carried out using the software E-noval (Arlenda) calculated an uncertainty of ⁇ 3% on the value and a limit of acceptance of ⁇ 10% .:
  • a quantity of 20 mg +/- 0.1 mg of beta-glucan powder is suspended in a volume of 0.4 ml of 2N potassium hydroxide solution with stirring for 30 minutes in an ice-bath.
  • the mixture is incubated with a mixture of enzymes exo-1,3-glucanase, endo-1,3,3-glucanase, ⁇ -glucosidase and chitinase suspension (Megazyme) for 16 hours at 40 ° C.
  • GOPOD glucose oxidase plus peroxidase and 4-aminoantipyrine compound diluted in buffer composed of p-hydroxybenzoic acid and sodium azide
  • the beta-glucan content is determined by measuring the absorbance by UV spectrometry, compared with the calibration curve.
  • the beta-glucan content is expressed in g of beta-glucan per 100g of wet beta-glucan. Determination of the water content
  • the loss on drying is determined using a thermodynamic method based on the European Pharmacopoeia 2.2.32 (“Loss on drying") method, with an accuracy of ⁇ 0.15% of the value.
  • the change from the Pharmacopoeia method concerns the choice of equipment (moisture analyzer instead of oven), without this having a significant impact on the value and the achievement of the results.
  • a known amount of beta-glucan powder is heated to 105 ° C, and mass loss is measured continuously using a calibrated moisture analyzer (Ohaus MB 45) until it reaches a value less than 1 mg per 90 seconds. When this value is reached, the weight of the loss on drying is calculated by subtracting the value of the dry matter from the total mass.
  • the water content is expressed in g of water per 100g of wet beta-glucan.
  • the method of analyzing the ash content is based on that of the
  • European Pharmacopoeia 2.4.16 A porcelain crucible is weighed. A known amount of beta-glucan is placed in the porcelain crucible and heated for 10h at 600 ° C in a calibrated muffle furnace (Carbolite, 201). After combustion, the porcelain crucible containing the beta-glucan of the sample is weighed. The ash content is expressed in g of water per 100 g of wet product. The ash content is expressed in grams of ash per 100 grams of wet product.
  • the protein content is determined according to a method based on total protein hydrolysis and spectrophotometric assay, according to the steps:
  • beta-glucan powder 1 - 1 g is suspended in a volume of 10 ml of concentrated sodium hydroxide solution (10N) prepared from sodium hydroxide R (European Pharmacopeia), at 130 ° C. for 90 minutes. minutes.
  • beta-glucan thus hydrolysed is then neutralized to pH 6.9-7.1 and the total volume adjusted to 50ml.
  • ninhydrin / hydrindantine solution 500 mg of ninhydrin and 150 mg of hydrindantine in 100 ml of ethylene glycol monoethyl ether is then added to the solution prepared in step 3 (1.1 ml) to give form an absorbing complex at wavelength 570nm.
  • the protein content is expressed in g of water per 100g of wet product.
  • Validation of the method using the E-novalet software gives an uncertainty of the method of ⁇ 10% of the value and a limit of acceptance of ⁇ 25%.
  • the determination of the amount of lipids is based on Regulation (EC) No 152/2009 of 27-01-2009. The uncertainty on the value is ⁇ 0.7%.
  • the lipid content is expressed in g of water per 100 g of wet product.
  • composition of the sugars is carried out by gas chromatography of the sugars after solubilization by total hydrolysis of beta-glucan and derivatization of the sugars according to the methods described in Merkle and Poppe (1994) Methods Enzymol. 230: 1-15 and York, et al. (1985) Methods Enzymol. 1 18: 3-40.
  • beta-glucan powder 1 - 0.3 mg are methanolysed with 1M hydrochloric acid in methanol at 80 ° C. for 16 hours.
  • the resulting derivatives (per-O-trimethylsilyl-TMS) are analyzed by gas chromatography in comparison with an external calibration curve made with a standard for each sugar.
  • the sugar content is expressed in g of sugar per 100 g of wet beta-glucan which has been solubilized by hydrolysis.
  • beta-glucan powder 1 - 3mg of beta-glucan powder are solubilized in dimethylsulfoxide
  • the complex is then acetylated using a trifluoroacetic acid / acetic anhydride mixture.
  • the complex concentration is determined by gas chromatography with detection by mass spectrometry, compared with an external calibration curve made with a standard for each sugar.
  • glycosidic linkages between the glucose units are expressed in g per 100 g of each identified individual wet sugar (in this case, glucose).
  • Aspergillus niger mycelium is a by-product of citric acid fermentation.
  • the mycelium is passed through a pressure band filter to be pressed and washed.
  • the mycelium at the outlet of the pressure band filter has a solids content of 18% by weight.
  • the mycelium is then dried in a rotary dryer ("rotary dryer” type) and then in a pneumatic dryer (“flash dryer” type).
  • the type of A. niger mycelium may influence the purity of chitosan.
  • the example shown below shows the difference in yield and purity between two mycelium, one unwashed after harvesting citric acid (black), the other pressed / washed after harvesting citric acid (beige color).
  • the purity of the chitosan obtained is in adequacy with targeted applications. In addition, these conditions make it possible to preserve a large part of the insoluble glucan and thus to be able to recover them.
  • a conical mixer (of the "Conical Mixer” type) which is, for example, for the invention a conical reactor of 4 m 3 equipped with a jacket for heating the reaction medium up to 120 ° C. vs.
  • the agitation of the mixture is provided by a worm mounted on an orbital arm which travels around the periphery of the reactor at a rate of about 2 revolutions / min.
  • a nozzle centrifuge is used, and in particular a high performance vortex nozzle separator type centrifuge ("BTUX").
  • BTUX vortex nozzle separator type centrifuge
  • the proportions are measured after centrifugation by determining the volumes in a test tube.
  • the percentage of insoluble in the filtrates corresponds to the amount of glucans that still remains in the chitosan solution.
  • the best setting for the "BTUX” is when the pump runs at 20% of the maximum speed, as indicated by the high glucan concentration ( ⁇ 95%) that reveals a limited loss of chitosan.
  • the last fraction of glucan present in the chitosan solution (15%) is separated by passage in a "sedative-type" equipment.
  • the speed of the pump is adjusted according to the amount of insoluble present in the soluble fraction (chitosan) and the concentration of insoluble fraction (glucan).
  • a proportion of insoluble in the filtrates is aimed at between 8 and 12%. This setting makes it possible to have a low content of soluble fraction in the low insoluble fraction ( ⁇ 5%).
  • a nozzle centrifuge can also be used.
  • the nozzle centrifuge is a solid / liquid separation equipment.
  • the solid / liquid suspension is separated by the high speed rotation (HFA 8000 rpm / BTUX 7000 rpm) of a bowl that separates the fine solid particles from the liquid phase and concentrates them via nozzles. This high speed separation is accentuated thanks to a high filtration surface (plates).
  • the soluble fraction containing chitosan and optionally residual glucan is then passed through a high centrifugal separation separator, such as a "sedative-type" apparatus.
  • the Sedicer / Decanter is a solid / liquid separation equipment.
  • the solid / liquid suspension is separated by the high speed rotation (sedimentant 4800 rpm / decanter 3500 rpm) of a bowl that separates the fine solid particles from the liquid phase and evacuate them with a worm placed inside this bowl. Adjustments are therefore made to optimize the recovery of glucan without significantly affecting the soluble fraction comprising chitosan from a purity and yield point of view.
  • Example 3 Recovery of glucan
  • the sodium hydroxide / lime mixture is used to effect flocculation of the glucan at a pH of about 10.
  • the dryness corresponds to the percentage by mass of dry matter relative to the total mass of the cake recovered after concentration, typically with a filter press.
  • N ° 1 the conditions of the test N ° 1 are the best: 1 .6g of
  • the resulting product has a content of less than 10% ash, which is suitable for animal nutrition.
  • the glucans are then concentrated in a filter press, or decanter, or band filter, or basket centrifuge in order to be able to proceed with their drying.
  • a filter press or decanter, or band filter, or basket centrifuge in order to be able to proceed with their drying.
  • the filter press is a solid / liquid separation equipment. It allows to separate, under pressure, a suspension by frontal filtration of the solid particles through a filter medium (synthetic fabrics) held between two rigid trays.
  • the space 2 rigid trays makes it possible to harvest the dehydrated solid part thanks to the internal pressure of the filter.
  • the liquid clarified portion is recovered via a cross tube collecting the filtrate of each filter medium.
  • the concentrated solution is dried by a pneumatic dryer ("flash dryer").
  • the "flash dryer” is a drying equipment that can recover a fine powder from a moist and compact product.
  • the wet product is fed via a worm into the drying chamber.
  • a flow of hot air entrains and dries the solid particles and carries them through a classifier.
  • the speed of rotation of the classifier makes it possible to control the size of the dry particles, if they are too large, they fall back into the drying chamber equipped with a grinder, are crushed and won by the flow of air.
  • the classifier is passed, the airflow and the particles are separated in a cyclone.
  • the fine powder is recovered under the cyclone and the air is filtered through a bag filter to be discharged to the outside.
  • glucan was treated after separation in the nozzle centrifuge (BTUX type).
  • This solution of glucan with a pH between 3.5 and 4.8 (acetic acid) is treated by addition of soda and lime so as to reach a pH greater than 10 (weight ratio of soda / lime of 1 / 5.6 (121 of sodium hydroxide at 30% and 901 lime at 30%, ie 4.8 and 27 kg respectively.) Soda is added to allow a pH greater than 4.8 to be obtained, then the lime is added in order to obtain a precipitate in the form of floc (pH 10).
  • the glucan thus precipitated was concentrated by a filter press in order to eliminate the water and to obtain the glucan in solid form at approximately 20% of dry matter.
  • the dryer (“flash dryer”) is fed to recover 155 kg of a reference glucan powder L15.
  • Example 5 Additional purification of glucan on an industrial scale
  • Glucan is resuspended in water after being precipitated and concentrated.
  • the pH is adjusted between 6 and 7 by adding acetic acid to solubilize the chitosan still present.
  • the suspension is sent for separation, for example in a filter press.
  • glucans were treated after separation in the nozzle centrifuge (BTUX type).
  • This solution of glucans with a pH between 3.5 and 4.8 (acetic acid) was treated by adding sodium hydroxide and lime so as to reach a pH greater than 10 (151% of 30% NaOH and 70% of lime).
  • Glucan thus precipitated was injected into a filter press in order to be concentrated.
  • the glucan was resuspended in a tank with 10m 3 of osmosis water.
  • the pH of the suspension was adjusted to 6.4 with a volume of 171 of 80% acetic acid.
  • the suspension was reinjected into a filter press in order to be concentrated.
  • the concentrated glucan was dried in a flash dryer. It was recovered 150kg of reference glucan L37.
  • the glucans used for the studies are described in Table 9.
  • the glucan of A. niger origin of reference L1 1 is that of example 4.
  • the glucan resulting from yeast of reference "glucan” is a commercial product intended for the animal feed.
  • the A. niger glucan of reference L15 is prepared in the following manner, on an industrial scale:
  • step iii 3m 3 of insoluble fraction at the exit of BTUX (step iii) are harvested.
  • the glucan solution was treated by addition of 50I of 30% sodium hydroxide so as to reach a pH greater than 1 1.
  • the treated glucans were injected into the filter press in order to be concentrated (removal of water).
  • promelas fish is commonly used as a model for toxicological and immunological studies (Russom et al In: Environmental Toxicol Chem 16: 948 (1997)) Its innate cellular immune system is representative of the innate immune system of many animal 'man.
  • Two beta-glucans from A.niger and produced as described in Examples 4 and 6 are incorporated into a powdered fish feed, as described by Palic et al in: Developmental Comparative Immunol 30: 817 (2006), at doses of 5g / kg and 4g / kg respectively.
  • Beta-glucan derived from yeast is incorporated in fish feed at a dose of 5 g / kg.
  • the objective of this test is to verify that supplementation of fish with beta-glucans from A.niger stimulates neutrophil activity on the one hand, and that pre-supplementation with beta-glucans from A.niger avoids the reduction of immune defenses linked to stress on the other hand.
  • the marker for neutrophil activity is the effect on degranulation of primary neutrophil granules, which is determined by the release of myeloperoxidase (MPO) from the primary granules of neutrophils that were isolated from the kidneys of fish and stimulated by ionophore calcium, according to the method described by Palic et al. in: Developmental Comparative Immunol 30: 817 (2006).
  • Fish supplementation with the 3 types of beta-glucan (L1 1-5%, L15-4% and L4-5%) is first studied for 21 days in normal conditions, without stress: it leads to increased degranulation compared to control (Figure 3).
  • Beta-glucan compound from A.niger used for this study is a grade for use in human nutrition.
  • the sample was treated before carrying out the study, in particular to eliminate bacterial endotoxins potentially present:
  • the sample is ground to obtain a particle size of about 70 ⁇ ( ⁇ (0.9) ⁇ 70 ⁇ ). It was then sterilized by ethylene oxide and then treated with NaOH to eliminate bacterial endotoxins, endotoxins being known to stimulate the immune system.
  • glucan Blood collected from healthy volunteers was exposed for 24 hours to increasing amounts of glucan ranging from 0.1 mg / mL to 1000 mg / mL.
  • the glucan according to the present invention is capable of inducing the production of Interleukin 6 (IL-6) (FIG. 7) and Tumor Necrosis Factor alpha (TNF- ⁇ ) (FIG. 8), in particular starting from 100 ⁇ g / ml. as well as Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha (MIP-1 oc) from 1 g / ml ( Figure 9).
  • IL-6 Interleukin 6
  • TNF- ⁇ Tumor Necrosis Factor alpha
  • MIP-1 oc Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha
  • G-CSF Granulocyte Colony Stimulating Factor
  • GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
  • IL-1 ⁇ Interleukin 1 beta
  • Glucan according to the present invention allows the activation of the immune cells of a human being and induces the production of cytokines, thereby demonstrating its benefit for use as an active agent in an immunostimulatory pharmaceutical composition of a human.
  • the glucan used in the following examples has a composition according to Example 8, without subsequent treatment for the elimination of bacterial endotoxins potentially present.
  • the particle size distribution of beta-glucan is preferably as follows:
  • the diameter of 90% (d (0.9)) of the particles is less than 350 microns, preferably less than 100 microns for oil-in-water and water-in-oil emulsions, and preferably less than 50 microns for reds. lip balms and lip balms (measured by laser diffractometry).
  • EXAMPLE 9.1 Anti-aging moisturizing composition containing beta-glucan from A niger.
  • This formulation has the following composition:
  • This formulation has the following composition Table 12
  • Viscosity (Brookfield, 20 ⁇ C at 20 rpm): 4000 mPa.s
  • Viscosity (Brookfield, 20 ⁇ 20 rpm): 40300 mPa.s

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Abstract

La présente demande concerne une méthode de préparation du glucan issu d'Aspergillus niger caractérisée en ce qu'elle comprend (i) la déacétylation au moins partielle de mycélium d'Aspergillus niger; (ii) un traitement acide du mycélium déacétylé ou partiellement déacétylé, de préférence après purification et/ou lavage, pour obtenir du glucan insoluble et du chitosane soluble, ledit traitement acide comprenant la mise en contact du mycélium déacétylé avec une solution acide; (iii) la séparation du chitosane soluble d'une part, et d'autre part du glucan; (iv) un traitement alcalin du glucan comprenant la mise en contact du glucan avec une solution alcaline pour faire floculer les glucans; et (v) le séchage des glucans floculés pour obtenir une poudre de glucan. La présente invention concerne également les glucans ainsi obtenus, des compositions les comprenant, et leurs utilisations. Les glucans de l'invention peuvent être utilisés comme agents immunostimulants.

Description

Procédé de préparation de glucans à partir d'Aspergillus niger
La présente invention concerne un procédé préparation de glucans à partir d'Aspergillus Niger, les Beta-glucans ainsi obtenus, et leurs utilisations.
II est connu depuis bien longtemps de préparer des beta-glucans à partir de différents substrats d'origine naturelle, par exemple des beta(1 ,4)glucans issus de céréales, beta(1 ,3)(1 ,6)glucans issus de levure et de champignons. Notamment, il est particulièrement connu de préparer les glucans à partir de levures, comme typiquement Saccharomyces cerevisiae. Le brevet EP 0759 089 décrit que les glucans dérivés de Saccharomyces cerevisiae procurent des effets bénéfiques variés aux poissons et à d'autres animaux. Différents traitements chimiques ou biochimiques sont réalisés pour éliminer les chaînes de glucans à liaisons beta-(1 -6), notamment grâce à un traitement par une beta-(1 -6)-glucanase. Ces traitements sont envisagés pour améliorer l'activité immunostimulante des glucans en augmentant la proportion des glucans à liaisons du type beta(1 -3), qui seraient liés à l'activité précitée. Cependant la littérature évoque les fortes divergences de structure selon l'origine des glucans. On peut typiquement se reporter à l'article de Novak (Novak et al., Development of Views on Beta-Glucan Composition and Structure, Biology an Chemistry of Beta Glucans, vol. 01 ,201 1 ,1 -9). Cet article enseigne que les préparations de glucans sont hétérogènes selon l'organisme employé pour les extraire. Du fait de cette hétérogénéité, il est difficile de connaître exactement la structure des glucans et de tirer toute conclusion hâtive relativement à leurs propriétés, notamment biologique. En particulier le degré de branchements de chaînons latéraux sur le squelette beta-glucan dépend du genre, de l'espèce, et de la souche de l'organisme considéré. Or le degré de branchements est important pour la structure macromoléculaire des glucans qui est liée aux propriétés immunostimulantes.
Aspergillus niger est connu principalement comme source de chitine pour produire du chitosane. Le mycélium d'Aspergillus niger est un sous-produit de la fermentation de A. niger pour la production d'acide citrique. Des procédés d'obtention de chitosane à partir dA. niger sont par exemple décrits dans la demande internationale de KitoZyme WO03068824. Les glucans sont un sous-produit insoluble obtenu lors de la préparation de chitosane. Les glucans résultants de la préparation de chitosane sont écartés. On peut le constater de l'enseignement des demandes internationales WO0168714 et WO03086281 , qui n'envisagent pas le traitement ultérieur des glucans insolubles.
A priori il n'existe pas d'étude spécifique concernant les glucans obtenus à partir d'Aspergillus niger. Or comme décrit ci-dessus, la structure complexe des glucans ne permet pas de s'avancer sur les propriétés immunostimulantes des glucans d'origine d'Aspergillus niger. Toute conclusion dans ce sens ne serait qu'une pure spéculation.
D'autre part, si les glucans peuvent être obtenu comme sous-produit insoluble lors de la préparation de chitosane, les procédés connus à ce jour ne permettent pas une exploitation industrielle des glucans coproduits avec le chitosane obtenu à partir de chitine. De plus le degré de pureté des glucans n'est généralement pas satisfaisant. Le procédé de préparation de chitosane de la demande internationale WO03068824 de KitoZyme ne permet pas l'obtention de glucans avec une pureté satisfaisante puisque les glucans sont sous forme de copolymères chitine-glucans. Cette demande internationale indique qu'un copolymère chitine-glucans peut posséder de 30 à 50% (m/m) de chitine et entre 50 et 70% de beta-glucans. Cependant il s'agit d'un copolymère possédant des liaisons entre la chitine et les glucans. Ce produit des glucans liés à la chitine sous forme de copolymère. Pour la production de chitosane à partir de chitine, la chitine est transformée en utilisant une solution alcaline dans des conditions « agressives » afin de déacétyler la chitine. Or ces conditions laissent penser que les glucans obtenus comme sous-produit présenteront une structure suffisamment détériorée pour que l'on n'envisage pas de les utiliser comme glucans immunostimulants, ce qui explique que l'art antérieur écarte cette fraction.
Dans la présente demande :
Par « glucans d'Aspergillus niger » ou « glucans à partir d'Aspergillus niger », ou « glucans d'origine Aspergillus niger », ou « glucans issus d'Aspergillus niger », on entend des beta-glucans obtenus ou susceptibles d'être obtenus à partir de l'organisme Aspergillus niger, et en particulier à partir de mycélium d'Aspergillus niger. Cette appellation est transposable à d'autres produits que les glucans, comme au chitosane ou à la chitine.
D'autre part il est fait référence à des « glucans » selon la présente invention, mais cette désignation concerne plus précisément un extrait d'Aspergillus niger comprenant majoritairement en masse des glucans, le reste de l'extrait étant constituée par des impuretés au sens de l'invention, c'est-à-dire des composés autres que les glucans.
Les termes « glucans » ou de « beta-glucans » sont utilisés ici comme synonymes. Par « glucans immunostimulants » on entend des glucans présentant des propriétés favorisant l'immunostimulation d'au moins un marqueur de référence du système immunitaire, comme par exemple les neutrophiles du système immunitaire inné.
La présente invention a pour but de fournir un procédé industriel de préparation de glucans à partir d'Aspergillus niger.
La présente invention a en particulier pour but d'améliorer le rendement d'un procédé de préparation de glucans à partir d'Aspergillus niger. La présente invention a notamment pour but d'améliorer le rendement d'un procédé de préparation de glucans à partir d'Aspergillus niger avec la coproduction de chitosane. La présente invention a aussi pour but de purifier des glucans à partir d'Aspergillus niger selon un procédé industriel.
La présente invention a encore pour but d'obtenir ou de préparer des glucans immunostimulants notamment pour la stimulation du système immunitaire d'un animal ou d'un être humain, notamment par nutrition orale, application sur la peau, etc....
Il a été découvert de manière surprenante que les buts ci-dessus peuvent être satisfaits par la présente invention.
L'invention concerne en particulier un procédé ou une méthode de préparation de glucan issu du mycélium d'Aspergillus niger, ladite méthode comprenant : (i) la déacétylation au moins partielle de mycélium d'Aspergillus niger ; (ii) un traitement acide du mycélium déacétylé ou partiellement déacétylé, de préférence après purification et/ou lavage, pour obtenir du glucan insoluble et du chitosane soluble, ledit traitement acide comprenant la mise en contact du mycélium déacétylé avec une solution acide ; (iii) la séparation du chitosane soluble d'une part, et d'autre part du glucan insoluble, ; (iv) un traitement alcalin du glucan comprenant la mise en contact du glucan avec une solution alcaline pour faire flocculer le glucan ; et (v) le séchage du glucan floculé pour obtenir une poudre de glucan.
Le glucan de l'invention n'est jamais pur à 100 %, mais comprend des substances secondaires. Parmi les substances secondaires on peut relever la présence de cendres, de lipides, de chitine et/ou de chitosane ou autres polysaccharides (par exemple le mannane), que l'on cherche à minimiser, en vue d'en améliorer la pureté en adéquation avec l'utilisation envisagée. Par « déacétylation de la chitine » on entend la déacétylation totale ou partielle de la chitine car le chitosane peut comprendre un degré d'acétylation plus ou moins élevé.
Étape (i) de déacétylation
Avantageusement, la déacétylation (étape (i)) est effectuée par une mise en contact du mycélium avec une matière alcaline, de préférence apportant des ions hydroxyde, et de préférence avec de l'hydroxyde de sodium (NaOH), à une concentration, à une température, et pendant une durée suffisante pour déacétyler la chitine en chitosane avec de préférence un rendement minimum de 4% en chitosane, et de préférence supérieur à 9% et obtenir un chitosane présentant de préférence un degré d'acétylation, c'est-à-dire une proportion molaire d'unités N-acétyl-D-glucosamine le long des chaînes de chitosane, de 0 à 50%, et de préférence de 10 à 25%. Selon un mode préféré, la solution alcaline comprend une concentration supérieure à 40% (masse/volume) de matière alcaline apportant des ions hydroxyle par rapport à la masse totale de la solution alcaline. On entend par rendement : le rapport massique exprimé en % de la masse sèche de la fraction contenant le chitosane (chitosane et ses impuretés) sur la masse sèche de mycélium de départ. On utilise par exemple une solution de d'hydroxyde de sodium de concentration 50% (masse/volume).
Selon une variante, le mycélium d'Aspergillus niger esX mélangé avec une solution alcaline concentrée. De préférence la solution alcaline est choisie parmi une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou de potassium, le carbonate ou bicarbonate de soude. Avantageusement le ratio en masse de la matière alcaline par rapport à la chitine est compris entre 0, 1 à 5, et de préférence entre 0,3 à 3, et encore de préférence de 0,5 à 1 ,5 (m/m).
De préférence le traitement par la solution alcaline du mycélium d'Aspergillus niger se réalise à une température comprise entre 50 et 1 20 ^, et encore de préférence entre 80 et 1 20 ° C.
On peut dans un premier temps mettre en contact le mycélium avec la solution alcaline, puis réaliser une montée en température progressive. Par exemple la température atteint 1 1 0 °C en 2 heures, puis on maintient la température pendant 6 heures, puis on transfère la suspension obtenue vers l'étape suivante en 1 heure, la température diminue jusqu'à la température ambiante.
Selon un autre mode préféré, l'étape de déacétylation en elle-même est réalisée pendant une période comprise entre 30 minutes et 10 heures, et de préférence entre 3 et 8 heures.
Il est préférable de réaliser une déacétylation poussée en température et en durée de réaction pour augmenter le rendement en chitosane (conformément au tableau 3 des exemples). On peut par exemple réaliser la déacétylation par la mise en contact du mycélium avec la solution alcaline pendant une durée comprise entre 4 et 7 heures, puis augmenter la température avec un maintien à une température comprise entre 50 et 120 °C, et encore de préférence entre 80 et 120 ° C.
La fraction insoluble en milieu alcalin peut-être séparée de la fraction soluble par filtration et/ou centrifugation.
La fraction alcaline insoluble obtenue après déacétylation est de préférence mise en suspension, puis diluée, filtrée et lavée à l'eau. Cette ou ces étapes sont typiquement réalisées autant que nécessaire.
De préférence la solution alcaline est récupérée après cette première étape, concentrée, recyclée et réutilisée pour la déacétylation de la chitine. Avant l'étape de déacétylation, la méthode de l'invention peut comprendre le traitement préalable du mycélium d 'Aspergillus niger. Le mycélium est de préférence lavé, et concentré et/ou séché. Ceci permet selon une variante d'utiliser un mycélium totalement ou partiellement décoloré. La couleur blanche ou beige peut-être avantageuse pour des applications comme en pharmacie, nutraceutique, cosmétique, ou dans l'industrie alimentaire. Un mycélium filtré/lavé apporte avantageusement une amélioration du rendement en chitosane et/ou en glucan.
Étape (ii) de traitement acide
Cette étape s'effectue dans des conditions permettant l'obtention d'une fraction soluble et d'une fraction insoluble. La fraction insoluble en milieu alcalin est mise en contact avec une solution acide selon l'étape (ii), le pH étant avantageusement ajusté à une valeur inférieure à 6,5, et de préférence inférieur à 5,5, par l'ajout d'un acide comme par exemple choisi parmi l'acide chlorhydrique, lactique, formique, glutamique, phtalique, succinique, glycolique, citrique, et de préférence l'acide acétique. La réaction peut par exemple être réalisée à température ambiante ou tout autre température favorisant la séparation de la fraction soluble contenant le chitosane de la fraction insoluble contenant le glucan.
On peut utiliser comme solution acide une solution acide présentant une concentration comprise entre 0,1 à 1 N. On utilise par exemple une solution à 80% d'acide acétique.
Avantageusement, le traitement acide de l'étape (ii) comprend l'ajout d'un acide organique jusqu'à l'obtention d'un pH compris entre 3 et 5,5, et de préférence entre 3,5 et 4,5.
De préférence le traitement acide de l'étape (ii) comprend ou consiste en l'ajout d'acide acétique au mycélium déacétylé obtenu à l'étape (i), éventuellement lavé, séché et/ou concentré.
De préférence, préalablement à l'étape (ii) le résidu alcalin est éliminé par plusieurs lavages à l'eau.
Étape (iii) de séparation du glucan et du chitosane
De préférence, la séparation selon l'étape (iii) est effectuée par une séparation à l'aide d'une centrifugeuse continue à buses. Plus particulièrement, on peut utiliser pour cette étape de centrifugation une centrifugeuse à assiettes de type séparateur à buses ou de type auto-débourbeur (par ex. NA7), ou une centrifugeuse à assiettes de type séparateur à buses vortex haute performance BTUX (ces deux types de centrifugeuse NA7 ou BTUX étant respectivement commercialisées par les sociétés Westfalia et AlfaLaval).
Selon une variante, la méthode de l'invention peut comprendre une étape supplémentaire (iiia) de traitement du chitosane soluble obtenu à l'étape (iii) pour séparer le glucan insoluble, cette étape supplémentaire pouvant être éventuellement répétée une ou plusieurs fois. Le glucan insoluble obtenu selon cette étape supplémentaire (iiia) peut être ajouté au glucan insoluble récupéré à l'étape (iii).
Selon une variante préférée, l'étape (iiia) met en œuvre un décanteur avec force centrifuge (par exemple un Sédicanteur commercialisé par Flottweg, qui par rapport à un décanteur traditionnel présente un bol biconique et une vitesse centrifuge plus élevée qu'un décanteur classique). Un tel décanteur comprend une centrifugeuse à bol plein et une vis convoyeuse. Il peut développer typiquement une force centrifuge de 6 000 à 10,000g. La vitesse du bol, la vitesse de la vis ainsi que la hauteur de couche sont fixés par l'homme du métier pour optimiser les performances de la machine.
Étape (iv) de séparation du chitosane et de « conditionnement par floculation » du glucan
Le glucan selon l'invention est insoluble dans l'eau à température ambiante et à pH acide, inférieur à 7. Le chitosane est soluble dans ces conditions. L'insolubilité des glucans permet de les purifier. L'étape de floculation permet avantageusement de séparer les glucans par des moyens industriels et en un temps permettant une exploitation industrielle rentable.
Il a été découvert de manière surprenante dans la présente invention qu'un simple traitement avec une solution d'hydroxyde de sodium avant séchage ne permet pas une séparation du liquide satisfaisante. En particulier il a été découvert que le produit, obtenu par mise en contact de l'extrait insoluble obtenu selon l'étape (iii), n'est pas suffisamment résistant mécaniquement pour réaliser une séparation solide/liquide satisfaisante. Le produit se dénature et l'on ne peut pas récupérer un pourcentage satisfaisant de glucan dans l'extrait final. En réalisant l'étape de floculation selon la présente invention, on rend le produit plus résistant mécaniquement à une étape de séparation solide-liquide. On peut déshydrater au moins partiellement les glucans, éliminer l'eau plus facilement, et ainsi récupérer extrait final avec un contenu en cendres plus faible et donc un contenu en glucan plus élevé.
De préférence la solution alcaline utilisée à l'étape (iv) de floculation comprend ou est constituée de chaux, par exemple sous forme de lait de chaux à 30% (Ca(OH)2) (hydroxyde de calcium), qui précipite en un solide facilement récupérable et qui résiste aux contraintes mécaniques de conditionnement en permettant une récupération des glucans avec un degré de pureté in fine satisfaisant.
Selon une variante, la solution alcaline de l'étape (iv) de floculation comprend ou est constituée d'un mélange de d'hydroxyde de sodium (NaOH) et de lait de chaux (Ca(OH)2). Lorsqu'on utilise un tel mélange hydroxyde de sodium/chaux (hydroxyde de calcium), on préfère un rapport massique hydroxyde de sodium/chaux (hydroxyde de calcium) de 1/2 à 1/10, et de préférence d'environ 1/2 à 1/6 (de préférence environ 1 /3,5).
Cette étape est de préférence suivie ou contrôlée par pHmétrie. On préfère arrêter l'ajout de solution alcaline lorsque le pH devient supérieur à 9 et de préférence supérieur à 10.
La floculation du glucan est importante pour permettre une séparation facilement exploitable industriellement. Il est préféré d'utiliser un mélange hydroxyde de sodium /hydroxyde de calcium afin de limiter l'apport d'ions calcium dans les glucans pour éviter de générer des cendres en excès. La présence de chaux permet avantageusement de conférer une texture des glucans facilitant leur séparation dans un équipement industriel. Ceci permet en outre une diminution des temps de séparation ce qui est industriellement très intéressant.
Il est important de réaliser l'étape de floculation pour améliorer la productivité et la pureté des glucans résultants. Cette étape de floculation est également importante pour permettre un séchage du glucan (par l'intermédiaire d'un sécheur de type « flash dryer ») sous forme de poudre.
Généralement après l'étape de floculation le glucan se présente sous la forme d'une suspension alcaline (pH compris supérieur à 10). Étape (iva) de purification supplémentaire des glucans
Le glucan obtenu à l'étape (iv) peut éventuellement/optionnellement être de nouveau purifiés avant l'étape de séchage, en vue d'adapter la pureté du glucan à l'utilisation envisagée, en particulier d'augmenter la pureté, par exemple en diminuant la teneur en cendres résiduelle dans le glucan. Cette étape supplémentaire comprend la mise en contact des glucans avec une solution pour solubiliser le chitosane puis éliminer le chitosane solubilisé par séparation.
Cette étape de purification supplémentaire est avantageuse si l'on souhaite augmenter la proportion en masse du glucan au-delà de 80% par rapport à la masse totale du produit final.
L'étape de purification supplémentaire comprend de préférence la mise en contact des glucans floculés avec une solution acide. De préférence la solution acide considérée présente un pH compris supérieur à 5 et inférieur à 7, et encore de préférence entre 6 et 6,6. On utilise de préférence l'acide acétique pour préparer cette solution acide.
On peut réaliser une séparation au filtre-presse ou au décanteur, centrifugeuse à panier, décanteur à force centrifuge élevée (Sédicanteur®), ou filtre à bande.
On peut ensuite sécher le glucan obtenu conformément à l'étape (v).
Étape (v) de séchage du glucan
Cette étape est avantageusement réalisée en introduisant le glucan obtenu à l'étape précédente (étape (iv) ou (iva)) dans un dispositif de séchage pour éliminer les liquides résiduels.
Ces dispositifs sont connus de l'homme du métier.
Avantageusement, on peut utiliser un séchage du glucan (« flash dryer »), en vue d'obtenir une poudre fine de couleur beige à légèrement brune.
Ce séchage peut éventuellement être suivi d'une granulation. Le produit final est ensuite emballé.
Entre chaque étape décrite ci-dessus, c'est-à-dire entre les étapes (i) et (ii), (ii) et (iii), (iii) et (iv), et/ou (iv) et (v), il est possible de réaliser différents traitements. Ces traitements peuvent par exemple consister en un ou plusieurs lavages, purifications, concentrations, séparations, et/ou un ou plusieurs autres traitements destinés à améliorer le rendement et/ou la purification des produits obtenus selon le procédé de l'invention.
Selon une variante, le procédé de l'invention ne comprend pas d'étape d'oxydation du glucan.
Le procédé de la présente invention permet d'améliorer le rendement en chitosane, en transformant une quantité maximale de chitine en chitosan (« déacétylation ») tout en récupérant du glucan de manière satisfaisante, et de préférence afin de pouvoir les valoriser comme agent immunostimulant.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de co- préparation de chitosane et du glucan à partir d'Aspergillus niger, ladite méthode comprenant la préparation de glucan selon la méthode de préparation décrite précédemment, incluant toute variante et tout mode de réalisation particulier, éventuellement combinés entre eux, et la préparation de chitosane.
L'invention concerne notamment selon un autre aspect une méthode pour la production de chitosane et de glucans à partir de chitine d'origine d'Aspergillus niger comprenant les étapes subséquentes: (a) la mise en contact de chitine avec une solution basique pour déacétyler au moins partiellement la chitine et récupérer une fraction soluble en milieu alcalin et une fraction insoluble en milieu alcalin, (b) la mise en contact de la fraction insoluble en milieu alcalin avec une solution acide, pour obtenir une fraction soluble de chitosane, plus ou moins acétylé, et une fraction insoluble comprenant des glucans, puis (c) le traitement ultérieur de chitosane pour le laver, le purifier, et éventuellement le sécher, ladite méthode comprenant également le traitement des glucans obtenus à l'étape (b) pour les laver, les purifier, et éventuellement les sécher.
Les différentes étapes (i) à (v), y compris leurs variantes s'appliquent à cet aspect également.
La fraction soluble en milieu alcalin obtenue après l'étape (a) est généralement écartée car elle contient différents sels, des protéines, et des glucans hydrolysés solubles.
Selon une variante, le chitosane soluble obtenu à l'étape (b) peut être mis en contact avec une enzyme du type chitine déacétylase pour obtenir le chitosane.
Le chitosane préparé peut-être de haute masse moléculaire. Le chitosane peut être également de masse moléculaire moyen faible ou moyen.
Par masse moléculaire moyen faible, on entend masse moléculaire moyenne inférieure à 100.000. Par haute masse moléculaire moyenne on entend un chitosane présentant une masse moléculaire moyenne supérieure à 100.000. De préférence le chitosane est de très faible masse moléculaire moyenne, c'est-à-dire inférieure à 50.000. De préférence le chitosane possède une masse moléculaire moyenne comprise entre 10.000 et 50.000. Les masses moléculaires moyennes sont déterminées par mesure avec un viscosimètre capillaire de type Ubbelohde ou par chromatographie d'exclusion stérique avec détection par diffusion de lumière (SEC-MALLS) ou par triple détection (par exemple avec le Viscotek Triple Detector Array max System). Il est possible d'hydrolyser le chitosane afin de diminuer sa masse moléculaire.
Avantageusement, le chitosane est obtenu en contrôlant le degré d'acétylation.
Par les termes « chitosane ayant un degré d'acétylation contrôlé » on entend un produit dont le degré d'acétylation, c'est-à-dire la proportion des unités N-acétyl-glucosamine peut être ajustée de manière contrôlée.
Pour le traitement du chitosane, on peut se reporter notamment aux conditions décrites dans la demande WO03068824 de KitoZyme.
Il est également intéressant de souligner que, selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention d'extraction du glucan et du chitosane à partir du mycélium d'Aspergillus niger dure moins de 12 heures, et de préférence moins de 10 heures.
Beta-qlucan L'invention concerne selon un autre aspect le beta-glucan issu d'Aspergillus niger susceptible d'être obtenu par une méthode telle que définie selon l'invention, incluant toute variante et tout mode de réalisation particulier, éventuellement combinés entre eux.
Selon une variante, le glucan de l'invention est adapté à l'alimentation animale, notamment que sa composition est adaptée à l'alimentation animale. En particulier, le glucan présente une teneur en glucan supérieure à 50%, de préférence supérieure à 55%, et de préférence encore supérieure à 60%, notamment pour l'alimentation animale.
Selon une autre variante, le glucan de l'invention est adapté à une application chez l'homme, notamment pour son administration orale ou application sur la peau, et en particulier de qualité alimentaire, cosmétique et/ou pharmaceutique. De préférence, le glucan présente une pureté supérieure à 70%, de préférence supérieure à 75%, et de préférence encore supérieure à 80%, notamment pour des applications chez l'homme. Ces pourcentages sont exprimés en masse de glucan par rapport à la masse totale de produit humide. On entend par produit humide, le produit fini avec sa teneur en eau résiduelle, qui est selon une variante préférée de 4 à 10 %.
Il a été constaté après l'analyse du glucan obtenus qu'il présente en majorité des liaisons glycosidiques entre les unités glucose de type beta-(1 ,3). Il a été notamment constaté de manière très surprenante que le procédé de l'invention préserve la bioactivité du glucan obtenu, c'est-à-dire sa capacité à moduler le système immunitaire. Comme mentionné ci-dessus, la littérature montre que l'activité du beta(1 ,3)-glucan dépend fortement de sa structure (liaisons glycosidique, branchements, etc .), qui peut être affectée par les traitements qu'il subit. Contrairement à ce que l'on pouvait penser, malgré les conditions très hydrolysantes utilisées pour la déacétylation de la chitine en chitosane, le glucan obtenu selon le procédé de l'invention présente une activité de modulation du système immunitaire, comme démontré par administration orale chez le poisson Pimephales promelas dont on étudie les paramètres du système immunitaire inné.
De préférence le glucan obtenu présente une forte proportion de liaisons glycosidiques de type beta-(1 -3), comme par exemple supérieure à 70% par rapport au nombre total de liaisons des glucans. Il est connu que plus la proportion de liaisons de type beta-(1 -3) est importante, meilleure seront les propriétés immunostimulantes.
Ce glucan est obtenu avantageusement sans l'utilisation d'une enzyme du type beta-glucanase.
De préférence le glucan de l'invention comprend moins de 15% en masse de chitosane par rapport à la masse totale de produit humide. De tels glucans sont satisfaisants pour l'administration orale chez l'animal. Selon un mode de réalisation, le glucan comprend moins de 10% en masse de chitosane par rapport à la masse de produit humide. Ces glucans sont adaptés à l'administration chez l'homme, orale ou sur la peau.
On peut analyser le pourcentage en masse de chitosane présent dans le glucan selon la méthode d'extraction du chitosane par précipitation/lavage/pesée.
De préférence, le glucan de l'invention comprend moins de 10% de cendres. Il est également possible d'obtenir 5% de cendres, et éventuellement moins de 3% de cendres par rapport à la masse de produit humide.
De préférence, le glucan de l'invention comprend moins de 5% de lipides, et moins de 1 % de protéines par rapport à la masse humide humide.
De préférence, le glucan de l'invention ne comprend pas de chitine détectable. On peut chercher à détecter la présence de chitine par la méthode de dosage des sucres après hydrolyse et dérivatisation (« derivatization » en anglais), telle que décrite dans les exemples. Propriétés immunomodulantes
L'invention concerne encore le beta-glucan issus d'Aspergillus niger pour la modulation du système immunitaire d'un être humain ou d'un animal.
Un animal auquel peut être administré le-glucan de l'invention est typiquement choisi parmi les animaux de rente, les animaux de course (chevaux, chiens), les animaux de compagnie, et les poissons d'aquaculture.
Selon une variante, le-glucan est destiné à l'amélioration des fonctions du système immunitaire, par exemple les neutrophiles en ce qui concerne l'administration orale, et les cellules de Langerhans en ce qui concerne l'application sur la peau.
Selon une autre variante, le glucan est destiné à augmenter la capacité de dégranulation et l'activité des neutrophiles.
L'invention couvre encore une composition de complément alimentaire pour l'être humain ou l'animal, comprenant du glucan issu d'Aspergillus niger tel que défini précédemment incluant toute variante et tout mode de réalisation particulier, éventuellement combinés entre eux.
La présente invention couvre également une nourriture solide pour poissons, caractérisée en ce qu'elle comprend du glucan issu d'Aspergillus niger tel que défini précédemment. Typiquement, une telle nourriture comprend une substance apportant de l'amidon, une substance apportant des protéines, une substance apportant des lipides, éventuellement un mélange d'antibiotiques, et éventuellement un mélange de minéraux et de vitamines, éventuellement des substances antioxydantes, éventuellement des enzymes digestives, éventuellement des microorganismes à activité probiotique, éventuellement des fibres à activité prébiotique. Les substances apportant de l'amidon sont généralement dérivées de céréales comme par exemple de soja, maïs, blé, avoine, ou orge. Les substances apportant des protéines sont par exemple une farine de poisson, un tourteau de soja, ou un lactosérum déshydraté, des protéines de soja, une farine de soja, une farine de sang, des protéines plasmatiques, un lait écrémé déshydraté, un concentré de protéines de lactosérum, une farine de colza, une farine de gluten de maïs, une farine de gluten de blé, des levures, une farine de tournesol. Les substances apportant des lipides sont généralement choisies parmi l'huile de soja, la lécithine, l'huile de coco, des lipides de lactosérum, l'huile de lard, ou le suif de mouton.
La présente invention couvre encore une composition pharmaceutique comprenant du glucan issu d'Aspergillus niger\e\ que défini précédemment.
L'invention couvre aussi une composition pharmaceutique comprenant du glucan issu d'Aspergillus Niger tel que défini précédemment.
L'invention couvre aussi une composition cosmétique comprenant du glucan issu d'Aspergillus niger \e\ que défini précédemment.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation de glucans pour des applications dans le domaine médical, pharmaceutique, nutraceutique, cosmétique, l'agriculture, l'agroalimentaire, textile, et/ou environnementale. Utilisation générale du chitosane et du glucan - Formulations
Le chitosane obtenu selon le procédé de l'invention peut être utilisé dans différentes applications, et typiquement comme celles décrites dans la demande WO03068824 de KitoZyme.
Le chitosane et le glucan obtenus selon le procédé de l'invention peuvent être utilisés sous forme de micro-, milli- ou nano-particules, qui peuvent être préparées par des techniques connues de l'homme du métier (par exemple : Polymeric Biomaterials, S Dimitriu ED, Marcel Dekker, 2002, Chap. 1 ).
Le glucan de la présente invention est essentiellement insoluble directement dans tout solvant à 25°C à la pression atmosphérique. Le glucan peut être préparé sous forme de poudre ou fibres lyophilisées.
Le glucan de l'invention peut être mélangé avec une ou plusieurs substances actives, et un ou plusieurs excipients. Ainsi l'invention couvre également une formulation comprenant le glucan de l'invention.
Le glucan de l'invention peut être préparé sous forme de gélules, comprimés, poudre, gel, film, émulsion, ou suspension. Le glucan peut être également inclus dans des systèmes de délivrance, comme des vecteurs par exemple pour être délivré au niveau de l'intestin grêle. Le glucan peut être inclus dans des matrices alimentaires comme par exemple des barres, des boissons, des produits de boulangerie, ou des produits laitiers.
Selon une variante, le glucan de l'invention peut être formulé dans une composition applicable par voie topique. Il peut s'agir en particulier de compositions cosmétiques ou pharmaceutiques applicables par voie topique (appliquée sur une matière kératinique, par exemple la peau). De telles compositions peuvent comprendre des ingrédients cosmétiquement ou pharmaceutiquement actifs (principes actifs) et/ou des excipients acceptables topiquement, connus de l'homme du métier du domaine des cosmétiques ou de la pharmacie. Des exemples particuliers de formulations selon l'invention comprenant le glucan sont les émulsions huile-dans-eau et eau-dans-huile. L'invention couvre les rouges à lèvres et les baumes à lèvres contenant le glucan.
Pour une meilleure formulation dans des compositions applicables sur la peau et permettre un ressenti agréable d'une composition homogène et sans particules solides détectables à l'œil nu ou par la peau, le glucan selon la présente invention est de préférence micronisé, c'est-à-dire subi une réduction de la taille des particules de glucan ou contenant le glucan à une dimension inférieure au millimètre et de préférence inférieure à 500 microns (μηι). Il est avantageux que le diamètre de 70%, et de préférence de 90%, des particules soit inférieur à 350 microns ^(0.7)<355μηι, de préférence d(0.9)<355μm), de préférence inférieur à 100 microns, en particulier pour des formulations du type émulsions huile-dans-eau et eau-dans-huile, et de préférence inférieur à 50 microns pour des rouges à lèvres et baume à lèvres. La granulométrie est celle obtenue par diffractométrie au laser.
Selon une variante, le glucan peut être utilisé après tamisage.
Par exemple, une composition alimentaire pour poisson est formulée sous forme d'un gel comprenant un pré-mélange de poudre avec 50% de protéines et de vitamine C mélangée avec de l'eau chaude (ΘΟ 'Ό) dans un rapport 1 :1 , auquel on ajoute les composés de l'invention par exemple à une concentration de 0,1 à 5 g/kg de nourriture. Le gel formé après mélange est typiquement granulé (0,1 -1 mm) juste avant utilisation pour nourrir les poissons.
Sur les figures :
- - La figure 1 représente un diagramme schématique d'une variante du procédé de l'invention comprenant les étapes (i) à (v) ;
- la figure 2 représente un diagramme schématique d'une autre variante du procédé de l'invention comprenant les étapes (i) à (v), et une purification supplémentaire des glucans selon l'étape (iva); - la figure 3 représente un histogramme de dégranulation des granules primaires de neutrophiles après supplémentation des poissons avec les beta-glucans L1 1 (5g/kg de nourriture), L15 (4g/kg) et les beta-glucans issus de levure (glucan = L04, 5g/kg) pendant 8 jours, sans appliquer de stress aux poissons ;
- la figure 4 représente un histogramme de l'indice de burst oxydatif après supplémentation des poissons avec les beta-glucans L1 1 (5g/kg de nourriture), L15 (4g/kg) et les beta-glucans issus de levure (glucan = L04, 5g/kg) pendant 8 jours, avec un stress appliqué aux poissons après le jour 7 ;
- la figure 5 représente l'évolution du marqueur CD54 dans une population de monocytes en fonction de la concentration de beta-glucan dans le milieu ;
- la figure 6 représente l'évolution du marqueur CD54 dans une population de cellules dendritiques plasmacytoïdes en fonction de la concentration de beta- glucan dans le milieu ;
- la figure 7 représente la production d'Interleukin 6 (IL-6) en fonction de la concentration de beta-glucan ;
- la figure 8 représente la production de Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-oc) en fonction de la concentration de beta-glucan ;
- la figure 9 représente la production de Macrophage Inflammatory protein 1 alpha (MIP-1 oc) en fonction de la concentration de beta-glucan.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention.
Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité.
Ainsi, chaque exemple a une portée générale.
D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. EXEMPLES
Méthodes analytiques Dosage du contenu en beta-qlucan
La teneur en beta-glucan est déterminée en utilisant une méthode enzymatique, selon une méthode adaptée de la méthode du kit de Megazyme (référence K-EBHLG). La validation de la méthode réalisée à l'aide du logiciel E-noval (Arlenda) a calculé une incertitude de ± 3% sur la valeur et une limite d'acceptance de ± 10%.:
1 - Une quantité de 20mg +/-0.1 mg de poudre de beta-glucan est suspendue dans un volume de 0.4 ml de solution d'hydroxyde de potassium 2N sous agitation pendant 30 minutes dans un bain glacé.
2- Le pH de la suspension est ensuite ajusté à 4.0 à 4.5 par ajout d'une solution d'acétate de sodium de concentration 1 .2M à pH 7.
3- Le mélange est incubé avec un mélange d'enzymes exo-1 ,3-3-glucanase, endo-1 ,3-3-glucanase, β-glucosidase et chitinase en suspension (Megazyme) pendant 16 heures à 40 °C.
4- Après dilution et centrifugation, un aliquote est recueilli pour déterminer la teneur en glucose avec le réactif GOPOD (composé de glucose oxidase plus peroxidase and 4-aminoantipyrine dilué dans un tampon composé d'acide p-hydroxybenzoique et d'azide de sodium).
Une calibration externe est établie avec une solution de glucans issus de levures, Megazyme) de concentration 0, 5, 10, 15, 20 et 25mg dans un volume V de solution d'hydroxyde de sodium 2N et ayant subit les étapes 1 à 4 ci-dessus.
Le contenu en beta-glucan est déterminé par la mesure de l'absorbance par spectrométrie UV, par comparaison avec la courbe de calibration.
Le contenu en beta-glucan est exprimé en g de beta-glucan pour 100g de beta- glucan humide. Dosage du contenu en eau
La perte à la dessiccation est déterminée en utilisant une méthode thermog ravi m étriqué basée sur la méthode de la Pharmacopée Européenne 2.2.32 (« Perte à la dessiccation »), avec une précision de ± 0.15% de la valeur. La modification par rapport à la méthode de la Pharmacopée porte dans le choix de l'équipement (analyseur d'humidité au lieu d'une étuve), sans que cela n'ait un impact significatif sur la valeur et l'obtention des résultats. En bref, une quantité connue de poudre de beta-glucan est chauffée à 105°C, et la perte de masse est mesurée en continu en utilisant un analyseur d'humidité calibré (Ohaus MB 45) jusqu'à atteindre une valeur inférieure à 1 mg par 90 secondes. Lorsque cette valeur est atteinte, le poids de la perte à la dessiccation est calculé en soustrayant la valeur de la matière sèche de la masse totale.
Le contenu en eau est exprimé en g d'eau pour 100g de beta-glucan humide.
Dosage du contenu en cendres
La méthode d'analyse du contenu en cendres est basée sur celle de la
Pharmacopée Européenne 2.4.16. Un creuset de porcelaine est pesé. Une quantité connue de beta-glucan est placée dans le creuset de porcelaine et chauffé pendant 10h à 600 °C dans un four à moufle calibré (Carbolite, 201 ). Après combustion, le creuset en porcelaine contenant le beta-glucan de l'échantillon est pesé. Le contenu en cendres est exprimé en g d'eau pour 100g de produit humide. Le contenu en cendres est exprimé en g de cendres pour 100g de produit humide.
Dosage du contenu en protéines
Le contenu en protéines est déterminé selon une méthode basée sur l'hydrolyse totale des protéines et dosage spectrophotométrique, selon les étapes :
1 - 1 g de poudre de beta-glucan est mise en suspension dans un volume de 10ml de solution d'hydroxyde de sodium concentrée (10N) préparée à partir d'hydroxyde de sodium R (Pharmacopée Européenne), à 130°C pendant 90 minutes.
2- La solution de beta-glucan ainsi hydrolysé est alors neutralisée à pH 6.9-7.1 et le volume total ajusté à 50ml.
3- 100μΙ de cette solution sont prélevés et 1 ml de tampon acétate 0,5 M à pH 5,1 sont ajoutés.
4- 1 ml de solution ninhydrine/hydrindantine (500 mg de ninhydrine et 150 mg de hydrindantine dans 100ml d'éther monoéthylique de l'ethylèneglycol) est ensuite ajouté à la solution préparée lors de l'étape 3 (1 ,1 ml) pour former un complexe absorbant à la longueur d'onde 570nm.
5- L'absorbance de cette solution est mesurée par spectrophotométrie avec un spectrophotomètre calibré selon la Pharmacopée Européenne 2.2.25 (« Spectrophotométrie d'absorption, l'ultraviolet et visible »). Une courbe de calibration externe est établie avec une solution d'albumine sérique bovine (BSA, BioChemika, fraction V, lot n ° S41084, Fluka) aux concentrations 0, 2, 4, 6 et 8mg ayant subi les mêmes étapes 1 à 5 que le beta glucan.
Le contenu en protéines est exprimé en g d'eau pour 100g de produit humide.
La validation de la méthode est réalisée à l'aide du logiciel E-novalet donne une incertitude sur la méthode de ± 10% de la valeur et une limite d'acceptance de ± 25%.
Dosage du contenu en lipides
La détermination de la quantité de lipides est basé sur la réglementation (CE) N °152/2009 du 27-01 -2009. L'incertitude sur la valeur est de ± 0.7%. Le contenu en lipides est exprimé en g d'eau pour 100g de produit humide.
Caractérisation des proportions en unité de répétition de type sucre
La composition des sucres est réalisée par chromatographie gazeuse des sucres après solubilisation par hydrolyse totale du beta-glucan et dérivatisation des sucres selon les méthodes décrites dans Merkle and Poppe (1994) Methods Enzymol. 230 : 1-15 et York, et al. (1985) Methods Enzymol. 1 18 :3-40.
1 - 0.3mg de poudre de beta-glucan sont méthanolysés avec de l'acide chlorydrique 1 M dans du méthanol à 80 °C pendant 16 heures.
2- Les échantillons sont ensuite traités par traitement avec du Tri-Sil (Pierce) à 80 °C pendant 30 minutes.
Les dérivés résultants (per-O-trimethylsilyl-TMS) sont analysés par chromatographie gazeuse par comparaison avec une courbe de calibration externe faite avec un standard pour chaque sucre.
La teneur en sucres est exprimée en g de sucre pour 100g de beta-glucan humide ayant été solubilisé par hydrolyse.
Caractérisation des enchaînements entre les unités de répétition
L'analyse des enchaînements glycosidiques entre les unités glucose a été réalisé selon la méthode décrite par York et al (1985)- Methods Enzymol. 118 :3-40).
1 - 3mg de poudre de beta-glucan sont solubilisés dans le diméthylsulfoxide
2- Les échantillons sont ensuite ensuite partiellement methylés selon la méthode décrite par Ciukan and Kerek ( 1984) dans Carbohydr. Res. 131 . -209-217, avec du butyl-lithium et iodure de méthyle : les échantillons sont soumis à un traitement avec de l'hydroxyde de sodium pendant 15 minutes suivi d'un traitement à l'iodure de méthyle pendant 45 minutes (ce procédé est réalisé deux fois). 3- Le complexe est alors hydrolysé dans par réaction avec de l'acide trifluoroacétique 2M (2 heures à 121 °C)
4- Le complexe est ensuite acétylé en utilisant un mélange acide trifluoroacétique/anhydride acétique
5- La concentration en complexe est déterminée par chromatographie gazeuse avec détection par spectrométrie de masse, par comparaison avec une courbe de calibration externe faite avec un standard pour chaque sucre.
Les enchaînements glycosidiques entre les unités glucose sont exprimés en g pour 100g de chaque sucre individuel humide identifié (dans ce cas, le glucose).
Exemple 1 : préparation du mycélium d'Aspergillus niger
Le mycélium d'Aspergillus niger est un sous-produit de la fermentation d'acide citrique.
Après l'étape de fermentation, le mycélium est passé sur un filtre à bande pressante afin d'être pressé et lavé. Le mycélium en sortie de filtre à bande pressante possède un pourcentage en matière sèche de 18% en masse. Le mycélium est ensuite séché dans un sécheur rotatif (de type « rotary dryer ») et puis dans un sécheur pneumatique (de type « flash dryer ») .
Composition du mycélium
Le mycélium d'Aspergillus niger est conforme aux spécifications du Tableau 1 . Tableau 1
Figure imgf000019_0001
Le type de mycélium 6' A. niger peut avoir une influence sur la pureté du chitosane. L'exemple présenté ci-dessous montre la différence de rendement et de pureté entre deux mycélium, l'un non lavé après récolte de l'acide citrique (de couleur noire), l'autre pressé/lavé après récolte de l'acide citrique (de couleur beige). Tableau 2
Figure imgf000020_0001
En comparant les chitosanes, on remarque que l'on obtient un rendement plus élevé au départ du mycélium pressé/lavé. Au niveau de la pureté, la coloration du chitosane obtenu à partir du mycélium non lavé est également plus foncée. La turbidité d'une solution de chitosane à 1 % (v/m) dans l'acide acétique 1 % est aussi plus élevée que celle d'une solution de chitosane obtenu à partir du mycélium pressé/lavé. La teneur en glucan lorsque l'on utilise le mycélium pressé/lavé peut être diminuée en dessous de 10% en masse par rapport à la masse totale de chitosane. Exemple 2 : Co-préparation industrielle de chitosane et de glucans
Des premiers tests ont été réalisés au laboratoire.
Les conditions de la réaction de déacétylation de la chitine contenue dans le mycélium suivantes ont été testées :
Tableau 3
Figure imgf000021_0001
Selon ces conditions, on peut obtenir les caractéristiques du chitosane et du glucan suivantes :
Tableau 4
Référence A B C
Masse de 2.35g sec 1 .95g sec 3g sec
chitosane
récupérée (g)
Rendement (%) 7.8% 6.5% 10.0%
Glucan (% m/m) 17.7% 26.3% 12.0%
Degré 32.7% 38.9% /
d'acétylation
(mol%)
Viscosité 4.7 4.35 /
apparente
(mPa.s)
Rendement en ND ND 6.54g
glucan On remarque que les conditions de déacétylation ont un impact sur les rendements en chitosane et en glucan.
Les résultats montrent qu'il est préférable de réaliser des conditions de réaction de déacétylation plus poussées en termes de température et de durée pour augmenter le rendement en chitosane.
Les conditions qui donnent les meilleurs rendements en chitosane sont dès lors appliquée à l'échelle industrielle dans les exemples qui suivent sont : 6 heures de déacétylation, suivi d'une montée en température jusqu'à 1 10 °C qui dure 2 heures, suivi d'un maintien de cette température pendant 6 heures, suivi d'un transfert du mélange réactionnel pendant 1 heure.
La pureté du chitosane obtenu est en adéquation avec applications visées. De plus, ces conditions permettent de préserver une grande partie du glucan insoluble et donc de pouvoir les récupérer.
Pour un procédé industriel on peut utiliser un mélangeur conique (de type « Conical Mixer ») qui est par exemple pour l'invention un réacteur conique de 4 m3 équipé d'une double enveloppe permettant de chauffer le milieu réactionnel jusqu'à 120°C. L'agitation du mélange est assurée par une vis sans fin montée sur un bras orbital qui parcourt la périphérie du réacteur à raison d'environ 2 tours/min. Séparation qlucan/chitosane Équipement industriel
Une fois la déacétylation effectuée il est procédé à des lavages à l'eau afin d'éliminer la soude. Après ces étapes de lavages, la suspension est mise à pH 4 par ajout d'acide acétique concentré. Le chitosane est soluble et le glucan est insoluble.
Pour séparer les deux fractions, il a été testé différents équipements industriels. De préférence on utilise une centrifugeuse à buse, et en particulier une centrifugeuse à assiettes de type séparateur à buses vortex haute performance (« BTUX »). L'homme du métier optimise les réglages de cet équipement pour séparer le plus efficacement le chitosane du glucan, notamment en tenant compte du rendement en chitosane et en glucan, et de leurs puretés respectives..
Les réglages de la centrifugeuse à buse « BTUX » sont réalisés afin de concentrer suffisamment le glucan pour qu'une partie minimale de chitosane se retrouve dans la fraction insoluble comprenant le glucan (Tableau 5). Tableau 5
Figure imgf000023_0001
La mesure des proportions se fait après centrifugation par détermination des volumes dans un tube à essai.
Le pourcentage d'insolubles dans les filtrats correspond à la quantité de glucans qu'il reste encore dans la solution de chitosane.
Dans cet exemple, le meilleur réglage de la « BTUX » est celui où la pompe fonctionne à une vitesse de 20% de la vitesse maximale, comme indiqué par la concentration de glucan élevée (<95%) qui révèle une perte limitée en chitosane. La dernière fraction de glucan présent dans la solution de chitosane (15%) est séparée par passage dans un équipement de type « Sédicanteur ». La vitesse de la pompe est réglée en fonction de la quantité d'insoluble présente dans la fraction soluble (chitosane) et de la concentration de fraction insoluble (glucan). Il est visé une proportion d'insoluble dans les filtrats comprise entre 8 et 12%. Ce réglage permet d'avoir une faible teneur en fraction soluble dans la fraction insoluble faible (<5%).
Pour un procédé industriel, on peut également utiliser une centrifugeuse à buses. La centrifugeuse à buses est un équipement de séparation solide/liquide. La suspension solide/liquide est séparée grâce à la rotation à haute vitesse (HFA 8000 rpm / BTUX 7000 rpm) d'un bol qui permet de séparer les particules solides fines de la phase liquide et de les concentrer via des buses. Cette séparation à haute vitesse est accentuée grâce à une surface de filtration élevée (assiettes).
Afin d'augmenter le rendement en glucan, on fait ensuite passer la fraction soluble contenant le chitosane et le glucan éventuellement résiduel dans un décanteur à séparation par force centrifuge élevée, comme un appareillage du type « Sédicanteur ».
Le Sédicanteur/décanteur est un équipement de séparation solide/liquide. La suspension solide/liquide est séparée grâce à la rotation à haute vitesse (Sédicanteur 4800 rpm / Décanteur 3500 rpm) d'un bol qui permet de séparer les particules solides fines de la phase liquide et de les évacuer à l'aide d'une vis sans fin placée à l'intérieur de ce bol. Les réglages sont donc effectués afin d'optimiser la récupération du glucan sans affecter significativement la fraction soluble comprenant le chitosane d'un point de vue de la pureté et du rendement. Exemple 3 : Récupération du glucan
Objectif : Les conditions de ce traitement permettent de pouvoir récupérer la totalité des glucans en sortie de la « BTUX » et du « Sédicanteur ». Une productivité élevée avec une pureté acceptable (teneur en glucan >60%) sont visées.
Le choix du mode de précipitation a un impact très important sur la productivité de la ligne de production et sur la pureté du glucan. En effet, une précipitation à l'hydroxyde de sodium uniquement ne permet pas une séparation aisée dans le filtre-presse.
Pour favoriser la séparation, la précipitation l'aide de lait de chaux a été testé. Ce type d'additif permet d'obtenir des flocs (par floculation). Ce type de texture du précipité permet une séparation plus facile dans un équipement industriel et une diminution avantageuse du temps de séparation.
De préférence, il est utilisé le mélange hydroxyde de sodium/chaux pour réaliser la floculation du glucan à un pH d'environ 10.
La proportion entre soude et chaux du mélange récupéré a été est variée à l'échelle laboratoire, afin de vérifier comment limiter l'apport en calcium dans glucan final (Tableau 6).
Tableau 6
Figure imgf000025_0001
La siccité correspond au pourcentage en masse de matière sèche par rapport à la masse totale du gâteau récupéré après concentration, typiquement avec un filtre presse. A l'échelle laboratoire, les conditions de l'essai N °1 sont les meilleures : 1 .6g de
NaOH et 4.2g de CaO (rapport massique de 1 / 2,5 environ).
Le produit résultant présente une teneur inférieure à 10% de cendres, ce qui est adapté à la nutrition animale.
Il est important d'éliminer la phase aqueuse de manière suffisante avant passage dans le sécheur pneumatique (« flash dryer ») pour obtenir une pureté en glucan importante. .
Les glucans sont ensuite concentrés dans un filtre-presse, ou décanteur, ou filtre à bande, ou centrifugeuse à panier afin de pouvoir procéder à leur séchage. Industriellement, on préfère réaliser la concentration en utilisant un filtre-presse :
Le filtre-presse est un équipement de séparation solide/liquide. Il permet de séparer, sous pression, une suspension par filtration frontale des particules solides au travers d'un média filtrant (toiles synthétiques) maintenu entre 2 plateaux rigides.
L'espace 2 plateaux rigides permet de récolter la partie solide déshydratée grâce à la pression interne du filtre. La partie clarifiée liquide est récupérée via un tube transversal récoltant le filtrat de chaque média filtrant. Le séchage de la solution concentrée est réalisé par un sécheur pneumatique (« flash dryer »).
Le « flash dryer » est un équipement de séchage qui permet de récupérer une poudre fine au départ d'un produit humide et compact. Le produit humide est alimenté via une vis sans fin dans la chambre de séchage. Dans cette chambre de séchage, un flux d'air chaud entraine et sèche les particules solides et les emporte au travers d'un classificateur. La vitesse de rotation du classificateur permet de contrôler la taille des particules sèches, si elles sont trop grandes, elles retombent dans la chambre de séchage équipée d'un broyeur, se font broyées et remportées par le flux d'air. Une fois le classificateur passé, le flux d'air et les particules sont séparées dans un cyclone. La poudre fine est récupérée sous le cyclone et l'air est filtré au travers d'un filtre à manches pour être rejeté à l'extérieur.
Exemple 4 : Production industrielle de beta-glucan adapté à l'alimentation animale
Dans cet exemple, 2.77m3 de glucan ont été traités après séparation dans la centrifugeuse à buse (type BTUX). Cette solution de glucan avec un pH compris entre 3.5 et 4.8 (acide acétique) est traitée par ajout de soude et de chaux de façon à atteindre un pH supérieur à 10 (rapport massique soude/chaux de 1/5,6 (121 de soude à 30% et 901 de chaux à 30%, soit 4,8 et 27kg respectivement). La soude est ajoutée pour permettre l'obtention d'un pH supérieur à 4.8, puis la chaux est ajoutée afin d'obtenir un précipité sous forme de flocs (pH 10).
Le glucan ainsi précipité a été concentré par un filtrepresse afin d'éliminer l'eau et d'obtenir le glucan sous forme solide à environ 20% de matière sèche. Après cette étape de concentration, on alimente le sécheur (« flash dryer »), afin de récupérer 155kg d'une poudre de glucan de référence L15.
Les caractéristiques du glucan ainsi produit sont décrites au Tableau 7. Tableau 7
Figure imgf000027_0001
Exemple 5 : Purification supplémentaire du glucan à l'échelle industrielle
Le glucan est remis en suspension dans l'eau après avoir été précipité et concentré. Le pH est ajusté entre 6 et 7 par ajout d'acide acétique afin de solubiliser le chitosane encore présent. La suspension est envoyée pour séparation, par exemple dans un filtre-presse.
Dans cet exemple, 4m3 de glucans ont été traités après séparation dans la centrifugeuse à buse (type BTUX). Cette solution de glucans avec un pH compris entre 3,5 et 4,8 (acide acétique) a été traitée par ajout de soude et de chaux de façon à atteindre un pH supérieur à 10 (151 de NaOH 30% et 701 de lait de chaux). Le glucan ainsi précipité a été injecté dans un filtre-presse afin d'être concentré. Le glucan a été remis en suspension dans une cuve avec 10m3 d'eau osmosée. Le pH de la suspension a été ajusté à 6,4 avec un volume de 171 d'acide acétique 80%.
La suspension a été réinjectée dans un filtre-presse afin d'être concentrée. Le glucan concentré a été séché au « flash dryer ». Il a été récupéré 150kg de glucan de référence L37.
Les caractéristiques du glucan ainsi produit sont décrites au Tableau 8.
Tableau 8
L37
Glucan (% m/m humide) 90
Eau (% m/m humide) 3.12
Cendres (% m/m humide) 1 .5
Protéines (% m/m humide) 0.21
Lipides (% m/m humide) 4.1 Exemple 6 : Préparation et caractéristiques des lots de glucan utilisés pour l'étude in vivo des propriétés immunomodulantes
Les glucans utilisés pour les études sont décrits au Tableau 9. Le glucan d'origine A. niger de référence L1 1 est celui de l'exemple 4. Le glucan issu de levure de référence « glucan » est un produit commercial destiné à l'alimentation animale.
Le glucan d'origine A. niger de référence L15 est préparé de la manière suivante, à l'échelle industrielle :
3m3 de fraction insoluble à la sortie de la BTUX (étape iii) sont récoltés. La solution de glucan a été traitée par ajout de 50I d'hydroxyde de sodium 30% de façon à atteindre un pH supérieur à 1 1 . Les glucans traités ont été injectés dans le filtre presse afin d'être concentrés (élimination de l'eau).
Afin d'abaisser la teneur en cendres (hydroxyde de sodium), 3m3 d'eau osmosée ont été injectée dans le filtre presse. Les glucans sous forme solides ont ensuite été séchés au flash dryer, et 70kg de poudre de glucan de référence L15 sont récoltés.
Tableau 9
Figure imgf000028_0001
Exemple 7 - Etude in vivo de l'effet du beta-glucan issu d'A.niger sur les fonctions du système immunitaire inné de poissons adultes Pimephales promelas en l'absence de stress et placés sous stress.
Le poisson Pimephales promelas est couramment utilisé comme modèle pour des études toxicologiques et immunologiques (Russom et al. In : Environmental Toxicol Chem 16 :948 (1997). Son système immunitaire cellulaire inné est représentatif du système immunitaire inné de nombreuses espèces animales et de l'homme. Deux beta-glucans issus d'A.niger et produits comme décrit aux exemples 4 et 6 (références L1 1 et L15) sont incorporés dans une nourriture pour poisson en poudre, comme décrit par Palic et al in : Developmental Comparative Immunol 30:817 (2006), aux doses de 5g/kg et 4g/kg respectivement. Le beta-glucan issu de levure ( « glucan ») est incorporé à la nourriture pour poissons à la dose de 5g/kg.
Des poissons adultes Pimephales promelas sont divisés en plusieurs cuves selon la nourriture qu'ils reçoivent : contrôle (nourriture seule) ou nourriture supplémentée avec un des deux beta-glucans, issus de A.niger (références L1 1 et L15) et un beta-glucan issu de levure (référence « glucan »), ou avec le myristate acétate phorbol (PMA, contrôle positif).
Les poissons sont nourris tous les jours. Pour la moitié des poissons de chaque cuve, un stress est ensuite appliqué 7 jours après le début de l'étude, selon une méthode qui mime une manipulation des poissons et leur surnombre, telle que décrite par Palic et al. in : Aquaculture 254:675 (2006). En effet, le stress provoque une perte d'efficacité des défenses immunitaires innées, en particulier des fonctions des neutrophiles comme par exemple le « burst oxydatif » (émission massive de forme active de l'oxygène) après stimulation par le PMA et la dégranulation des granules primaires. Le test a pour objectif de vérifier que la supplémentation des poissons avec les beta-glucans issus d'A.niger permet de stimuler l'activité des neutrophiles d'une part, et que la pré-supplémentation avec les beta-glucans issus d'A.niger permet d'éviter la diminution des défenses immunitaires liée à un stress d'autre part.
Le marqueur de l'activité des neutrophiles est l'effet sur la dégranulation des granules primaires des neutrophiles, qui est déterminé par la libération de la myeloperoxidase (MPO) par les granules primaires des neutrophiles qui ont été isolés au départ des reins des poissons et stimulé par le calcium ionophore, selon la méthode décrite par Palic et al. in : Developmental Comparative Immunol 30:817 (2006). La supplémentation des poissons avec les 3 types de beta-glucan (L1 1 à 5%, L15 à 4% et L4 à 5%) est d'abord étudiée pendant une durée de 21 jours en conditions normales, sans stress : elle entraîne une augmentation de la dégranulation par rapport au contrôle (Figure 3). Les effets des 2 glucans issus d'A.niger (L1 1 et L15) sont comparables à ceux du glucan issu de levure (« glucan »). Ensuite, l'effet de la supplémentation des poissons par les 3 types de beta-glucan sur la réaction au stress appliqué au septième jour est étudiée : elle entraîne une augmentation de la dégranulation des neutrophiles par rapport au groupe contrôle « stressé » après l'application du stress (Figure 4). Ce résultat confirme que les beta(1 ,3) glucans issus d'A.niger sont bioactifs et immunostimulants aux doses administrées aux poissons, à un niveau comparable à celui d'un beta-glucan issu de levure.
Exemple 8 - Etude ex-vivo sur cellules de sang humaines
8.1 .- Beta-glucan utilisé pour cette étude
Le composé Beta-glucan issu d'A.niger utilisé pour cette étude est un grade pour usage en nutrition humaine.
Ce grade peut être caractérisé comme suit (tableau 10) :
Tableau 10
Figure imgf000030_0001
L'échantillon a été traité avant de réaliser l'étude, en particulier pour éliminer les endotoxines bactériennes potentiellement présentes : L'échantillon est broyé pour obtenir une granulométrie d'environ 70μηι (ά(0.9)<70μιτι). Il a ensuite été stérilisé par l'oxyde d'éthylène puis traité par NaOH afin d'éliminer les endotoxines bactériennes, les endotoxines étant connues pour stimuler le système immunitaire.
8.2 - Activation de cellules immunitaires
Du sang prélevé sur des volontaires sains a été exposé pendant 24h à des quantités croissantes de glucan (grade selon l'exemple 8.1 ) allant de 0,1 mg/mL à 1000 mg/mL. L'activation de cellules immunitaires a ensuite été mesurée grâce à des marqueurs de membrane cellulaire, notamment CD54, par cryométrie de flux. Une activation claire des monocytes (Figure 5) et des cellules dendritiques plasmacytoïdes (Figure 6) a été observée par le beta-glucan selon la présente invention, et ce d'autant plus lorsque le beta-glucan est utilisé à 100μg/mL.
8.3 - Induction de cytokines
Du sang prélevé sur des volontaires sains a été exposé pendant 24h à des quantités croissantes de glucan allant de 0,1 mg/mL à 1000 mg/mL.
La production de cytokines dans le milieu a ensuite été mesurée par multiplex. Le glucan selon la présente invention est capable d'induire la production d'Interleukin 6 (IL-6) (Figure 7) et de Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-oc) (Figure 8), en particulier à partir de 100μg/mL, ainsi que de la Macrophage Inflammatory protein 1 alpha (MIP-1 oc) dès ^g/mL (Figure 9). La production d'autres cytokines, telles que le Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF), Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM- CSF) et Interleukin 1 beta (IL-1 β), est aussi augmentée en présence de beta-glucan selon la présente invention, et cela en suivant un effet dose-réponse.
Le glucan selon la présente invention permet l'activation les cellules immunitaires d'un être humain et d'induire la production de cytokines, montrant ainsi son bénéfice pour son utilisation comme agent actif dans une composition pharmaceutique immunostimulante d'un être humain.
Exemple 9 - Formulations cosmétique
Le glucan utilisé dans les exemples suivants présente une composition selon l'exemple 8, sans traitement ultérieur d'élimination des endotoxines bactériennes potentiellement présentes.
Afin de préparer des formulations acceptables en cosmétique, c'est à dire pour une application topique, la distribution des tailles de particules de beta-glucan est de préférence celle suivante :
Le diamètre de 90% (d(0.9)) des particules est inférieur à 350 microns, de préférence inférieur à 100 microns pour des émulsions huile-dans-eau et eau-dans- huile, et de préférence inférieure à 50 microns pour des rouges à lèvres et des baumes à lèvres (mesuré par diffractométrie au laser). EXAMPLE 9.1 - Composition hydratante anti-âge contenant du beta-glucan issu d'A niger.
Cette formulation présente la composition suivante :
Tableau 11
Figure imgf000032_0001
q.s. quant t su sante pour atte n re
Procédure
1 . Mélanger les composants de la phase A, et faire fondre approximativement à eO '
2. Dissoudre les ingrédients de la phase B ensemble
3. Ajouter des composants de la phase C au mélange 1 tout en agitant
4. Ajoutez les mélanges 2 et 3 tout en agitant à 250 tr/min, laissez refroidir
5. Ajoutez la phase D au mélange 4 à 35° C
6. Ajuster le pH du mélange 5 avec la phase E à une valeur comprise entre 6.0 et 6.5
7. Finir par homogénéiser.
EXAMPLE 9.2- Lotion pour bébé contenant du beta-glucan issu d'A niger.
Cette formulation présente la composition suivante Tableau 12
Figure imgf000033_0001
Procédure
1 . Mélanger les composants de la phase A, et faire fondre approximativement à 80 ° C
2. Mélanger les ingrédients de la phase B
3. Ajouter la phase C au mélange 2 et mélanger avec une forte agitation jusqu'à obtenir une solution claire et homogène 4. Ajoutez la phase D au mélange 3 tout en mélangeant bien et en chauffant à 80 °C
5. Ajoutez la phase E au mélange 4 et mélanger jusqu'à obtenir une solution homogène
6. Ajoutez la phase F au mélange 1 et mélanger
7. Ajoutez le mélange 5 au mélange 6 et mélanger à 300 tr/min jusqu'à ce que la température diminue
8. Ajuster le pH avec la phase G à 5.5
9. Finir par homogénéiser.
Résultats
pH: 5.45
Viscosité (Brookfield, 20 <C à 20 rpm): 4000 mPa.s
Stabilité: satisfaisante après 12 semaines à température ambiante (20 °C), 40 ^ et 45°C
EXAMPLE 9.3- Crème hydratante contenant du beta-glucan issu d'A niger. Cette formulation présente la composition suivante :
Tableau 13
Figure imgf000035_0001
E Citric acid 10% q.s.
Procédure
1 . Mélanger les composants de la phase A, et faire fondre approximativement à δΟ 'Ό
2. Dissoudre les ingrédients de la phase B
3. Ajouter des composants de la phase C au mélange 1 tout en agitant
4. Ajoutez les mélanges 2 et 3 tout en agitant à 250 tr/min, laissez refroidir
5. Ajoutez la phase D au mélange 4 à 35° C
6. Ajuster le pH du mélange 5 avec la phase E à une valeur comprise entre 6.0 et 6.5
7. Finir par homogénéiser.
Résultats
pH: 6.30
Apparence: crème blanche onctueuse
Viscosité (Brookfield, 20 <€, 20 rpm): 40300 mPa.s
Stabilité: satisfaisante après 12 semaines à température ambiante (20 °C), 40 ^ et
45 °C

Claims

REVENDICATIONS
1 . - Méthode de préparation de glucan issu d'Aspergillus niger caractérisée en ce qu'elle comprend (i) la déacétylation au moins partielle de mycélium d'Aspergillus niger ; (ii) un traitement acide du mycélium déacétylé ou partiellement déacétylé, de préférence après purification et/ou lavage, pour obtenir du glucan insoluble et du chitosane soluble, ledit traitement acide comprenant la mise en contact du mycélium déacétylé avec une solution acide ; (iii) la séparation du chitosane soluble d'une part, et d'autre part du glucan insolubles ; (iv) un traitement alcalin du glucan comprenant la mise en contact du glucan avec une solution alcaline pour faire floculer le glucan ; et (v) le séchage du glucan floculés pour obtenir une poudre de glucan.
2. - Méthode, selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la solution alcaline de l'étape (iv) comprend ou est constituée d'un mélange d'hydroxyde de sodium (NaOH) et d'hydroxyde de calcium (Ca(OH)2).
3. - Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'étape (iv) comprend un rapport massique hydroxyde de sodium/ hydroxyde de calcium de 1/2 à 1/10, entre l'hydroxyde de sodium et l'hydroxyde de calcium.
4. - Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la séparation est effectuée par une séparation centrifuge continue à buse.
5. - Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape supplémentaire (iiia) de traitement du chitosane soluble obtenu à l'étape (iii) pour en séparer le glucan insoluble, qui est ajouté au glucan insoluble récupéré à l'étape (iii).
6. - Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la déacétylation est effectuée par mise en contact du mycélium avec une matière alcaline, et de préférence l'hydroxyde de sodium (NaOH), à une concentration, à une température, et pendant une durée suffisantes pour déacétyler la chitine en chitosane avec un rendement minimum de 4% en chitosane et un degré de déacétylation de 0 à 50%, et de préférence de 10 à 25%.
7.- Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que préalablement à l'étape (ii) le pH est diminué par un ou plusieurs lavages à l'eau.
8.- Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le traitement acide de l'étape (ii) comprend l'ajout d'un acide organique jusqu'à l'obtention d'un pH compris entre 3 et 5,5, et de préférence entre 3,5 et 4,5.
9. - Méthode, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le traitement acide de l'étape (ii) comprend ou consiste en l'ajout d'acide acétique au mycélium déacétylé obtenu à l'étape (i).
10. - Méthode de co-préparation de chitosane et de glucan à partir d'Aspergillus niger, caractérisée en ce qu'elle comprend la préparation de glucan selon l'une quelconque des revendications précédentes, et la préparation de chitosane.
1 1 . - Beta-glucan issu d'Aspergillus niger susceptible d'être obtenu par une méthode telle que définie à l'une quelconque des revendications précédentes.
12.- Beta-glucan issu d'Aspergillus niger, selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce qu'il est adapté à l'alimentation animale.
13. - Beta-glucan issu d'Aspergillus niger, selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce qu'il est adapté à une application chez l'être humain.
14. - Beta-glucan issu d'Aspergillus niger pour la modulation du système immunitaire d'un être humain ou d'un animal.
15. - Beta-glucan issu d'Aspergillus niger selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'amélioration des fonctions du système immunitaire inné, en particulier les fonctions des neutrophiles.
16.- Composition de complément alimentaire pour l'être humain ou l'animal, caractérisée en ce qu'elle comprend du beta-glucan issu d'Aspergillus niger tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 1 à 15.
17.- Nourriture solide pour poissons, caractérisée en ce qu'elle comprend du beta- glucan issu d'Aspergillus niger tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 1 à 15.
18.- Composition pharmaceutique comprenant du beta-glucan issu d'Aspergillus niger\e\ que défini à l'une quelconque des revendications 1 1 à 15.
19. - Composition pharmaceutique immunostimulante comprenant du beta-glucan issu d'Aspergillus niger tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 1 à 15.
20. - Composition cosmétique comprenant du beta-glucan issu d'Aspergillus niger tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 1 ou 13.
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