KR101811701B1

KR101811701B1 - 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법

Info

Publication number: KR101811701B1
Application number: KR1020150187127A
Authority: KR
Inventors: 최용석; 최용현; 이재강; 김영환
Original assignee: 사조동아원 주식회사
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2017-12-26
Also published as: KR20170077880A

Abstract

본 발명은 아라비노자일란(Arabinoxylan) 및 식이섬유가 많이 함유된 밀기울을 직접 섭취하거나 또는 2차 가공제품 예를들면, 제면, 제과 및 제빵등에 첨가하여 섭취시 밀기울에 함유된 수용성 아라비노자일란 및 식이섬유의 이취감과 이물감을 개선하여 물성을 좋게 향상토록 함과 동시에 편리하고 간편하게 섭취할 수 있도록 하여 생체내의 대식세포 활성 및 항염증 향상을 가능하도록 한 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 관한 것으로서,
상기와 같은 본 발명의 구체적인 해결적 수단은,
"밀기울에 15% 수분 함량을 갖도록 가수한 후, 바렐 온도 100℃, 스크류 회전속도 550 RPM 으로 압출성형 하는 압출성형단계; 상기 압출 성형된 밀기울에 원료 중량대비 10배의 증류수를 가수한 후 121℃에서 1시간동안 고압 가열한 후 40~50℃에서 냉각하는 가열 및 냉각단계; 상기 가열후 냉각한 밀기울 100중량부 기준 1.5 중량부의 셀루클라스트(Celluclast) 효소를 투입 2시간동안 교반하는 효소교반단계; 상기 효소처리된 밀기울을 분무건조기로 건조한 후 분쇄기 3,100 RPM으로 분쇄하는 분쇄단계; 로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법과,
상기 가공된 밀기울 0.1~50중량부에 중력, 박력, 강력 밀가루중 어느 하나의 밀가루 50~99.1중량부를 혼합하는 단계를 포함하여 면역기능 향상을 위한 밀가루 프리믹스를 제공토록한 것을 특징으로 하는 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법"을 그 구성적 특징으로 함으로서,
본 발명에 따른 압출성형 및 가열 처리 밀기울 분말을 사용하면, 수용성 아라비노자일란의 함량이 높으면서 식이섬유 함량이 높은 면류·빵류·쿠키류 등의 식품 및 물 또는 우유에 타 먹을 수 있는 즉석 섭취 식품 (Ready to eat food) 제조가 가능하고, 이를 섭취함으로써 면역기능 증대, 아라비노자일란 효과 등의 기능성이 강화된 식품을 간단하게 제조할 수 있는 것이다.

Description

면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법{A working method of bran to improve immune function}

본 발명은 아라비노자일란(Arabinoxylan) 및 식이섬유가 많이 함유된 밀기울을 직접 섭취하거나 또는 2차 가공제품 예를들면, 제면, 제과 및 제빵등에 첨가하여 섭취시 밀기울에 함유된 수용성 아라비노자일란 및 식이섬유의 이취감과 이물감을 개선하여 물성을 좋게 향상토록 함과 동시에 편리하고 간편하게 섭취할 수 있도록 하여 생체내의 대식세포 활성 및 항염증 향상을 가능하도록 한 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 관한 것이다.

밀은 벼과(―科 Gramineae) 밀속(―屬 Triticum)의 풀 또는 그 곡물을 일컫는 것으로서 빵을 만드는 데 쓰는 밀(Triticum vulgare/T. aestivum), 스파게티나 마카로니 같은 파스타를 만드는 데 쓰는 듀럼 밀(T. durum), 케이크·크래커·쿠키·페이스트리·중력분 등에 쓰는 부드러운 콤팍툼 밀(T. compactum) 등이 있다.

건조한 지방에서 자란 밀은 대개 경질(硬質) 밀로 단백질이 11~15％ 함유되어 있고 글루텐 함량이 풍부해서 빵을 만드는 데 가장 적합하고, 반면에 습기찬 지방에서 자란 밀은 연질(軟質) 밀로서 단백질이 8~10％ 함유되어 있고 글루텐 함량이 적어서 케이크·크래커·쿠키·페이스트리, 가정용 밀가루 등에 알맞다.

이와 같은 밀에는 사람이 필요로 하는 주 에너지원으로는 보통 한 알갱이에는 물 12％, 탄수화물 70％, 단백질 12％, 지방 2％, 무기질 1.8％, 조섬유 2.2％ 등이 함유되어 있다. 밀 100g은 약 330㎈의 열량을 낼 수 있다. 소량의 비타민 A가 밀에 들어 있지만 제분과정에서 제거하는 것이 일반적이다.

이하 통상적인 밀 제분과정을 설명하면, 밀의 선별, 이물질 제거, 가수(加水), 조질, 분쇄, 체질, 포장의 공정으로 이루어진다. 즉, 밀의 선별이나 이물질 제거는 보통 정선공정이라고 칭하고 상기와 같이 정선된 밀을 분쇄/분리 용이하게 하기 위하여 적당량의 물과 적정 수분조건을 유지하는 공정을 가수공정이라 하며 그 다음, 롤러등으로 밀의 껍질과 씨눈 씨젖등을 분리하는 공정을 조질 또는 조쇄공정을 거친 후 밀을 누르고 비벼서 미세한 밀가루로 만드는 분쇄공정을 거쳐 분쇄된 밀가루를 체를 이용하여 입자별로 분리하는 체질 또는 사별공정을 거친 후 포장하면 되는 것이다.

이와 같이 제조된 밀가루는 밀의 구성요소에서 껍질을 제외함으로서 실질적인 밀의 영양성분중 대부분을 버리는 문제점을 갖고 있으나 반면에 껍질을 제외함으로서 제빵, 제과 및 제면를 제조한 상태에서 식감이 부드럽고 볼륨감등이 상대적으로 우수하여 대부분은 밀 껍질을 제외하는 즉, 조질 또는 조쇄공정을 반드시 거치는 필수적인 공정으로 여기고 있는 것이 사실이다.

그러나, 밀의 대략적인 구조인 밀 내피, 배유, 배아에서 상기 내피 즉 속껍질인 밀기울은 밀의 제분 과정중 배유(Endosperm) 부분을 밀가루로 생산하며 함께 생산되는 밀 껍질(Bran) 즉, 밀기울은 식이섬유가 약 40~50% 정도 함유되어 있고, 세포벽은 아라비노자일란(Arabinoxylan)으로 구성되어 있어 영양성이 우수한 식품 소재이나, 국내에서 유통되는 밀기울은 대부분 식품으로 사용되지 못하고 대부분 사료 용도로 소비되고 있는 실정이다.

밀기울의 세포벽을 구성하고 있는 다당류는 주로 셀룰로오스(cellulose), 헤미 셀룰로오스(hemicelluloses), 펙틴(pectin)과 비 다당류인 리그닌(lignin) 등으로 구성되어 있고, 이들은 소화효소로 가수분해되지 아니한 즉, 서로 공유 결합, 이온 결합, 소수 결합 등으로 결합되어 조밀하고 단단한 구조를 이루고 있으며,

특히 곡류는 수분함량이 매우 낮아서 구성성분간의 결합이 매우 조밀한 구조를 나타내고 있다.

상기 아라비노자일란은 건조 밀기울 중량의 30% 또는 비전분 다당류의 70% 정도 차지하는 것으로 알려져 있고 아라비노자일란은 L-arabinose와 D-xylose의 중합체로서 페룰산(ferulic acid)과 같은 페놀성 화합물은 아라비노스의 잔기에 부착된다. 상기 아라비노자일란(Arabinoxylan)은 이들 세포벽을 구성하는 다당류의 구성 성분으로 숙주의 저항성을 증강시켜 암, 면역결핍질환, 약물 치료 후 면역능의 억제 등과 같은 질병상태에 대해 효과를 보이고 있으므로, 면역 증강 효과가 있는 생체반응조절제로 주목을 받고 있다.

면역체계는 선천성 면역과 적응 면역으로 구분되되, 선천성 면역은 침입하는 병원체에 대한 신속한 대응을 특징으로 하고 기억작용은 없으나, 적응면역은 항원을 처음 만나서 반응하기까지 수일이 걸리게 되나 기억작용은 습득함으로서 특정식물에서 다당류가 면역활성을 가진다는 증거가 축적되고 있다. 식물 다당류의 치료 가능성을 검토한 연구는 선천성 면역 조절에 초점을 맞추었으며 특히 대식세포에 대한 연구가 대부분을 차지한다.

대식세포는 숙주의 선천면역시스템의 첫번째 방어를 담당하는 것으로서 물리 화학적 장벽을 침투한 외래 미생물의 존재를 검출한다. 대식세포는 '병원체 관련 분자 패턴'을 가진 외래 리간드(ligand)를 인식하는 패턴인식 수용체(PRRs)를 가지는 식세포이다. 패턴인식 수용체는 식균작용이나 염증반응 신호중 하나에 참여하며 스켄빈저 수용체, 렉틴 수용체, Fc 수용체, 보체수용체 같은 식세포 수용체는 표적물질을 잡아 소화하는 파고솜(phagosome)을 형성하고, 표적물질을 내부화시킨다. 다른 한편으로는 toll-like 수용체(TLR) 같은 신호전달 수용체는 NF-kB의 활성화를 통하여 염증반응을 시작한다. NF-kB는 박테리아를 사멸하는 활성산소, 산화질소를 생성하거나 종양사멸인자-알파(TNF-α), 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6)생성에 관여한다. 또한 대식세포는 세포간의 작용에서 T 헬퍼 세포를 활성화시키는 역할을 한다. 염증 자극은 대식세포에서 보조자극분자인 CD40, CD80, CD86을 유도하고, 보조자극분자들은 T 헬퍼 세포와 리간드 결합하여 세포간에 충분한 신호를 보낸다. 식물 유래 다당류로 인한 대식세포의 활성화는 염증 신호를 시작하는 PPR에 의해 매개되는 것으로 보여진다. 그러나, 이 식물 유래 다당류의 대식세포 활성화 효과를 실험한 in vitro 와 in vivo 연구들은 구강 섭취 실험으로 이루어지지 않았다.

또한 아라비노자일란(Arabinoxylan)은 혈액과 림프조직에서 일부 종양세포와 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 것으로 조사되었으며, 식물 세포벽이 완전한 상태로는 섭취시 아라비노자일란(Arabinoxylan)이 체내에 흡수하기 어려운 상태이다.

따라서 아라비노자일란(Arabinoxylan)의 수용화를 위하여 주로 강알칼리나 유기용매를 사용하여 세포벽을 분해하는 방법이 주로 연구되어 왔다. 하지만 생산 과정중 오염물질이 많이 발생하여 산업적으로 응용하기에 용이하지 않다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 기존 아라비노자일란(Arabinoxylan)의 추출 공정은 밀기울을 압출성형 후 효소처리한 공정(대한민국 특허등록 10-0379582), 버섯 균사 배양 및 열수추출후 에탄올 첨가하여 원심분리 하는 방법 (대한민국 특허등록 10-0491362)등이 있으나 이는 처리 전 후의 총 아라비노자일란(Arabinoxylan)을 측정함으로서 섭취시 체내 흡수가 용이하지 않은 불용성 아라비노자일란(Arabinoxylan)을 포함한 공정에 관련된 것이었으며, 미강에 효소처리 후 고온 고압 처리 및 알카리 및 초음파 처리하여 추출하는 방법 (대한민국 특허등록 10-1345729)은 공정에 투입되는 기계적 에너지 투입량이 높으며, 알카리 처리에 따른 폐수 처리의 문제가 발생한다.

최근, Zhou et al.,은 식물로부터 불용성 아라비노자일란을 추출하는 일반적인 방법인 알카리 처리와 효소처리를 통하여 밀기울 아라비노자일란 추출물의 면역 활성을 평가하였다. 밀기울에서 알칼리 처리로 추출한 아라비노자일란보다 효소 처리로 추출한 아라비노자일란이 대식세포 식균작용 및 T 세포 의존성 대식세포 면역력 증강에 잠재적 효과가 있는 것으로 보고하였다. 효소처리 아라비노자일란이(수용성 아라비노자일란과 유사한 패턴을 보임) 알칼리처리 아라비노자일란보다(아라비노스 대비 자일로스 비율이 불용성 아라비노자일란과 유사한 형태를 나타냄) 아라비노스에 대비한 자일로스 비율이 높게 함유되어 있었다. 밀기울의 안전성과 기능성식품 원료로써의 가공적성 증진 측면에서 효소처리는 가장 효율적인 아라비노자일란 추출방법이다. 본 발명에서는 밀기울에 자일로스 구조에서 베타1-4 글리코실결합을 끊어주는 xylanase를 처리하여 불용성 아라비노자일란이 쉽게 수용화될 수 있도록 하였다. 그리고나서 in vivo 실험을 통해 효소처리 밀기울의 대식세포 작용 및 항염 반응에 미치는효과를 실험하였다.

한국 특허등록 제10-0379582호 한국 특허등록 제10-0491362호 한국 특허등록 제10-1345729호

본 발명은 밀기울에 물리적 에너지를 투입 즉, 압출성형 후 습열 처리 및 건조를 통하여 밀기울의 세포벽 구조를 변형시켜 수용성 아라비노자일란 및 식이섬유의 추출 함량을 증가시켜 숙주의 저항성을 증강시켜 암, 면역결핍질환, 약물 치료 후 면역능의 억제 등과 같은 질병상태에 대해 효과를 발휘할 수 있는 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법을 제공함에 그 목적이 있는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위한 구체적인 해결적 수단은,

"밀기울에 15% 수분 함량을 갖도록 가수한 후, 바렐 온도 100℃, 스크류 회전속도 550 RPM 으로 압출성형 하는 압출성형단계; 상기 압출 성형된 밀기울에 원료 중량대비 10배의 증류수를 가수한 후 121℃에서 1시간동안 고압 가열한 후 40~50℃에서 냉각하는 가열 및 냉각단계; 상기 가열후 냉각한 밀기울 100 중량부 기준 1.5 중량부의 셀루클라스트(Celluclast) 효소를 투입 2시간동안 교반하는 효소교반단계; 상기 효소처리된 밀기울을 분무건조기로 건조한 후 분쇄기 3,100 RPM으로 분쇄하는 분쇄단계; 로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법과,

상기 가공된 밀기울 0.1~50중량부에 중력, 박력, 강력 밀가루중 어느 하나의 밀가루 50~99.1중량부를 혼합하는 단계를 포함하여 면역기능 향상을 위한 밀가루 프리믹스를 제공토록한 것을 특징으로 하는 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법"을 그 구성적 특징으로 함으로서 상기의 목적을 달성할 수 있다.

상기와 같이 구성된 본 발명은 종래방식으로는 밀기울의 구조상 물리적 충격에 의하여 분쇄가 되기 어려운 탄성을 가지고 있고, 아라비노 자일란으로 구성된 세포벽은 그 크기가 매우 작아 수용성 아라비노자일란을 증가시키기 어려웠으나,

본 발명에서는 밀기울의 압출성형을 통하여 수용성 분획물의 용출을 용이하게 하고, 습열 처리인 가열단계를 통하여 수용성 아라비노자일란과 식이섬유의 기능성을 가진 가공식품을 제조할 수 있는 수용성 아라비노자일란 및 식이섬유 추출을 위한 밀기울의 가공방법이 가능한 바, 구체적으로는 본 발명에 따른 압출성형 및 가열 처리 밀기울 분말을 사용하면, 수용성 아라비노자일란의 함량이 높으면서 식이섬유 함량이 높은 면류·빵류·쿠키류 등의 식품 및 물 또는 우유에 타 먹을수 있는 즉석 섭취 식품 (Ready to eat food) 제조가 가능하고, 이를 섭취함으로써 면역기능 증대, 아라비노자일란 효과 등의 기능성이 강화된 식품을 간단하게 제조할 수 있는 것이다.

이상에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예를 예를들어 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

도 1은 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법의 흐름도,
도 2 내지 도 9는 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 의해 효소처리 된 밀기울의 경구 투여 후 대식세포에 의해 표현 스케빈저 수용체를 나타낸 도면들,
도 10 및 도 11은 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 의해 효소 처리된 밀기울의 대식세포 탐식 능력에 대한 효과를 나타낸 그래프,
도 12 내지 도 14는 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 있어서 대식세포에 용해 염증 매개 물질에 효소 처리된 밀기울의 경구 투여의 효과를 나타낸 그래프,
도 15 내지 도 22는 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 있어서 밀기울의 경구 투여 한 후 LPS 자극 된 대 식세포에 의해 표현 접촉에 의존 염증 분자의 분포도,
도 23 및 도 24는 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 있어서 LPS를 주입후 혈청 염증 반응에 밀기울의 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법의 구체적인 구성 및 설명을 도면과 함께 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법의 흐름도이며, 도 2 내지 도 9는 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 의해 효소처리 된 밀기울의 경구 투여 후 대식세포에 의해 표현 스케빈저 수용체를 나타낸 도면들이고, 도 10 및 도 11은 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 의해 효소 처리된 밀기울의 대식세포 탐식 능력에 대한 효과를 나타낸 그래프이며, 도 12 내지 도 14는 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 있어서 대식세포에 용해 염증 매개 물질에 효소 처리된 밀기울의 경구 투여의 효과를 나타낸 그래프이고, 도 15 내지 도 22는 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 있어서 밀기울의 경구 투여 한 후 LPS 자극 된 대 식세포에 의해 표현 접촉에 의존 염증 분자의 분포도이며, 도 23 및 도 24는 본 발명인 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법에 있어서 LPS를 주입후 혈청 염증 반응에 밀기울의 효과를 나타낸 그래프이다.

[압출성형단계] ------ S1

본 단계는 밀기울에 15% 수분 함량을 갖도록 가수한 후, 피더(Feeder)를 통하여 압출성형기인 바렐에 투입하고, 압출성형기 바렐의 온도 100℃, 스크류 회전속도 550 RPM 으로 압출성형하였다.

[가열 및 냉각단계] ------ S2

본 단계는 상기 압출성형된 밀기울에 원료 중량대비 10배의 증류수를 가수한 후 121℃에서 1시간동안 고압 가열한 후 40~50℃에서 냉각하는 단계이다.

[효소교반단계] ------ S3

본 단계는 상기 가열후 냉각한 밀기울 100 중량부 기준 1.5 중량부의 셀루클라스트(Celluclast) 효소를 투입 2시간동안 교반하는 단계이다.

[분쇄단계] ------ S4

본 단계는 상기 효소처리된 밀기울을 분무건조기로 건조한 후 분쇄기 3,100 RPM으로 분쇄하는 단계를 거침으로서 본 발명이 완성되는 것이다.

바람직하게는 상기 모든 단계를 거쳐서 제조, 가공된 밀기울 0.1~50중량부에 중력, 박력, 강력 밀가루중 어느 하나의 밀가루 50~99.1중량부를 혼합하는 단계를 포함하여 면역기능 향상을 위한 밀가루 프리믹스를 제공토록 할 수 있는 것이다.

상기와 같은 단계를 거친 가공된 밀기울(이하 '본 발명'이라 한다)에 대한 구체적인 가공 및 그 실시예는,

1. 효소처리 밀기울 제조

동아원(당진, 한국)에서 생산된 밀기울을 원료로 이용하였다. 압출성형을 통해 밀기울의 세포벽 구조를 변형시켜 효소 침투성을 증가시켰다. 압출성형은 쌍축압출성형기(FX40, 밀링산업, 한국)을 이용하였고, 밀기울에 15% 수분 함량을 갖도록 가수한 후, 바렐 온도 100℃, 스크류 회전속도 550 RPM 으로 압출성형하였다.

압출성형 밀기울 3g에 증류수 30ml을 가한 후 121℃에서 1시간동안 고압가열한 후 40~50℃에서 냉각하였다. 셀루클라스트 (Celluclast 1.5L, Novozyme, Denmark) 효소를 압출성형 밀기울에 2% 용량으로 가한 후 2시간 동안 교반하였다.

효소처리한 혼합물을 분무건조기(D-0303, Katsuaki, 일본)으로 건조한 후 분쇄기(Laboratory Mill 3100, Perten, Finland)로 분쇄하였다

2. 식이섬유 정량

총식이섬유, 불용성 식이섬유, 수용성 식이섬유는 American Association of Analytical Communities 991.43 방법에 준하여 효소 정량법으로 측정하였다. 시료는 0.5 mm 입자 크기 이하로 분쇄한 후, 각 효소를 내열성 알파 아밀레이즈 (90℃, 30분), 프로테이즈 (60℃, 30분), 아밀로글리코시데이즈 (60℃, 30분) 처리하여 전분과 단백질을 제거하였다. 78%, 95% 에탄올, 아세톤으로 세척하여 여과한 후 남은 잔사를 총식이섬유를 정량하였다. 전분과 단백질을 제거한 시료를 60℃ 증류수로 세척하여 여과한 후 남은 잔사를 측정하여 불용성 식이섬유를 정량였고, 여과된 혼합물을 95% 에탄올로 세척하여 한번더 여과하여 남은 잔사를 측정하여 수용성 식이섬유를 정량하였다.

3. 수용성 아라비노자일란 정량

수용성 아라비노자일란 함량은 아라비노자일란을 구성하는 오탄당을 반응시약과 반응하여 발색된 정도를 측정하여 정량하였다, 반응시약은 빙초산 110ml, 염산 30ml, 20% 플로로글루시놀 용액 60ml, 1.75% 글루코스 용액 1ml을 혼합하여 제조하였다. 시료 25g에 증류수 25ml을 가하여 30분간 교반한 후 원심분리여 얻은 상층액 1ml에 증류수 1ml을 가하였다. 자일로스를 표준물질로 하여 반응시약 10ml을 가하여 25분간 반응시킨 후 552nm. 510nm에서 흡광도를 측정하고 계산하여 수용성 아라비노스 양을 정량하였다.

4. 당조성 분석

단당류에 대한 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석은 National Renewable Energy Laboratory에 의해 제안된 실험 분석 절차를 사용하여 측정하였다. 튜브에 시료와 trifluoroacetic acid 100 ㎕를 첨가하여 밀봉한 다음 100℃에서 4시간동안 가수분해 하였다. 분해 후, 고순도 물 300 ㎕을 넣어 pH를 6.0으로 보정하고, 각각의 시료는 0.2 ㎛ 시린지 필터로 필터링 하였다. 모든 시료는 Dionex HPLC 시스템에서 Dionex Carbopac PA1 column과 electrochemical detector(HPAEC-PAD system, Dionex, USA)를 사용하여 분석하였다. 18 mM의 NaOH를 이동상으로 사용하였고, 1.0 mL/min의 유속으로 일정하게 흘려주었다. Column 온도는 36℃를 유지하였다. 시료 50 ㎕를 고순도 물 450 ㎕를 시료주입 바이알에서 혼합하였다(1:10 희석). 시료주입양은 25 ㎕였다. 표준품인 D(-)-arabinose, D(+)-galactose, D(+)-xylose(Sigma, St. Louis, MO, USA)는 2, 20, 100, 200 μM로 준비하였다. 이 표준품의 데이터는 각 단당류에 대한 별도의 표준곡선을 구성하는데 사용하였다. 선택된 시료 또한 알고있는 arabinose, galactose, xylose, glucose의 농도와 피크를 HPLC로 분석하여 확인하였다.

5. 동물실험

7주된 수컷 Balb/c 마우스는 SamTaco(Osan, South Korea)로부터 분양받았으며, 12시간의 명암주기에서 온도, 습도, 무균제어가 되어있는 동물 시설에 수용하였다. 우리의 동물 프로토콜(KHUASP(SE)-15-012)은 Kyung Hee University Institutional Animal Care and Use Committee에 의하여 승인되었고, 마우스 사육은 US National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals(1996)에 따랐다.

6. In vivo 실험 1

마우스는 세 그룹으로 나누었다(대조군, 500 mg/kg, 그리고 2500 mg/kg). 압출성형 효소처리밀기울은 하루에 한번씩 4주간 구강투여를 통하여 주어졌다. 각 군의 체중을 매주 모니터링 하였고, 실험기간동안 그룹간 차이는 없었다. 마우스를 희생하기 4일전에, 3.5% 멸균 thioglycollate용액(BD, Sparks, MD, USA) 2 mL을 복강내 주사하였다. 실험 종료일에 마우스를 경추 탈구에 의해 희생시키고, 복강 대식세포는 차가운 DMEM으로 분리하였다. 원심분리 후, 세포를 10% fetal bovine serum(FBS; hyclone, Utah, USA)와 1% penicillin-streptomycin에 재 현탁 시켰다. 우리는 그 세포를 유세포분석 또는 ex vivo 배양에 사용하였다.

7. In vivo 실험 2

하루에 한번씩 4주간 압출성형 효소처리 되거나 처리되지 않은 밀기울의 동일량(2500 mg/kg)을 마우스에게 경구투여하였다. 실험기간의 종료일에 1.3 mg/kg의 LPS(serotype 055:B5, Sigma)를 복강 내 주사하였다. 1시간 후에 혈액을 intraobitally채취하고 원심분리 하였다. 혈청은 분석할때까지 -20℃에서 보관하였다.

8. 유세포 분석

세포는 2회 phosphate buffered saline(PBS)로 세척하였고, FACS 염색 버퍼(PBS/0.1% NaN₃/1% FBS)에서 1x10⁶ cell/mL이 되도록 재현탁 하였다. 세포는 rat anti-mouse CD16/CD32(BD Pharmingen, SanDiego, CA, USA)를 사용하여 4℃에서 5분간 블록킹하였고, FITC- conjugated anti-mouse SRA, anti-mouse CD11b, anti-CD40, PE-conjugated anti-mouse CD11b, anti-mouse CD36, 그리고 anti-mouse CD86 (BD pharmingen)을 냉암소에서 30분간 사용하여 염색하였다. 염색된 세포를 세척하고, 재현탁하고, Navios Flow Cytometer(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 데이터의 처리는 Kaluza 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

9. ex vivo 세포배양

세포를 37℃에서 배양하고, 비부착 세포를 제거하였다. 염증분석을 위해서 세포를 100 ng/mL의 LPS로 24시간동안 자극하였다. 상등액과 세포를 다음 분석을 위하여 회수하였다.

10. 탐식기능 분석

세포를 24시간동안 FITC-immunoglobulin(Ig)-latex beads와 함께 배양한 다음, 유세포분석을 위하여 수집하였다.

11. Nitric oxide 결정

상기 배양으로부터 얻은 상등액 50 ㎕를 상온에서 15분간 Griess 시약(Sigma)의 동일 부피로 배양시켰다. 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

12. 싸이토카인 분석

제조사의 프로토콜(BD Pharmingen)에 따라 효소면역분석법(ELISA)에 의해 상층액 또는 혈청 내 TNF-α와 IL-6의 수준을 결정하였다.

13. 통계분석

데이터는 t test 또는 ANOVA를 IBM SPSS 22 software로 분석하였고, p value는 0.05이내에서 유의성을 고려하였다.

상기와 같이 본 발명을 가공한 결과,

1. 식이섬유, 아라비노자일란, 단당류 분석

밀기울의 식이섬유, 수용성 아라비노자일란, 단당류들을 분석하였다. Table 1은 미처리 밀기울, 압출성형처리 밀기울, 효소복합처리 밀기울(압출성형 및 효소처리 밀기울)의 화학조성을 나타낸다. 본 연구에서 분석한 식이섬유는 xylanase로 분리된 올리고당이 포함되지 않은 것이며, 밀기울의 압출성형 효소처리 결과 불용성 식이섬유 함량과 총 식이섬유 함량은 39.44%와 43.75%에서 30.84%와 38.65%로 감소하였다. 압출성형만 실시했을 경우 수용성 아라비노자일란 함량이 2.2배 증가하였고, 압출성형과 효소처리를 복합처리 하였을 때 22배 증가하였다. 구성당 분석결과 효소처리 밀기울은 xylose와 arabinose가 약 2배 증가하였다.

2. 압출성형 효소처리 밀기울의 대식세포내 스케빈저 수용체와 식세포 활성에 미치는 효과

우선 효소처리 밀기울이 SRA와 CD36와 같은 대표적인 대식세포 스케빈저 수용체의 수준에 영향을 미치는지 측정하였다. 본 연구에서는 CD11b를 대식세포에 대한 마커로 사용하였고, 복강 대식세포의 99% 이상이 CD11b(+)인 것을 확인하였다. SRA와 CD36분자만이 CD11b(+) 세포에서 발현되었다(도 2, 도 6).
도 3은 도 2에 대한 데이터로서 히스토그램이 우측으로 이동할수록 양이 많다는 의미이며 대조군(control군)에 비해 2500 mg/kg을 섭취한 군의 히스토그램이 우측으로 이동한다.
도 4는 대식세포의 탐식기능을 담당하는 막수용체의 일종인 SRA의 양을 유세포형광분석기로 분석한 것이며, 도 5는 대조군, 500 mg/kg, 2500 mg/kg군의 SRA 양을 막대그래프로 표시하였으며 2500 mg/kg에서 유의하게 SRA의 양이 증가하였을 보여주는 것이다.
FITC가 붙은 항체에 결합된 SRA의 양을 나타내는 SRA(+)CD11b(+)세포의 백분율 및 SRA의 평균 형광 강도(M.F.I.)를 비교하면, 고농도군에서 현저한 증가를 관찰할 수 있었다(도 2-도 5). CD36 분자에 대해서, 그룹들간에 SRA(+)CD11b(+)세포 비율의 차이를 발견할 수 없었지만, CD36의 M.F.I.값은 고농도 압출성형 효소처리 밀기울을 투여한 그룹에서 유의적으로 증가하였다(도 6-도 9).
도 8는 대식세포의 탐식기능을 담당하는 막수용체의 일종인 CD36의 양을 유세포형광분석기로 분석한 것으로서, 도 7의 히스토그램이 우측으로 이동할수록 양이 많다는 의미이며 대조군(control군)에 비해 2500 mg/kg을 섭취한 군의 히스토그램이 우측으로 이동하며, 도 9는 대조군, 500 mg/kg, 2500 mg/kg군의 CD36 양을 막대그래프로 표시하였으며 2500 mg/kg에서 유의하게 CD36의 양이 증가하였을 보여주는 것이다.
그 다음으로, 탐식기능 평가를 위하여 FITC-Ig-latex bead의 세포흡수를 측정하였다. 여기서 사용되는 latex bead는 Ig로 피복되었기 때문에, 이들 입자의 내재화(internalization)에 관여하는 탐식기능용 수용체는 Fc 수용체 이다. 각 군의 복강대식세포를 24시간 동안 FITC-Ig-Latex bead와 함께 배양하였다. 고농도투여군의 M.F.I. 값은 대조군과 비교하여 크게 향상된 탐식능력을 나타냈다(도 10 및 도 11).
도 10과 도 11이 같은 것으로서, 대조군과 밀기울투여군의 마우스 복강대식세포가 latex bead를 탐식하는 양을 보여주는데 도 9의 히스토그램이 우측으로 이동할수록 양이 많다는 의미하며, 도 11은 이것을 막대그래프로 보여주며 2500 mg/kg 투여군에서 대식세포가 latex bead를 유의하게 많이 탐식하였음을 나타낸 것이다.

3. LPS 자극된 대식세포의 NO 및 염증성 사이토카인에 대한 효소처리 밀기울의 효과

압출성형 효소처리 밀기울의 경구투여가 대식세포의 염증반응에 영향을 주는지 살펴보았다. 따라서, 대조군 그룹과 압출성형 효소처리 밀기울 투여 그룹에서 분리한 복강대식세포를 TLR4 자극제인 LPS를 이용하여 24시간동안 자극하였다. NO 대신 nitrite의 양을 측정했는데 이 이유는 NO의 반감기가 15초이내이기 때문이다. 고용량 급여군은 대조군에 비하여 NO가 31%의 유의적인 감소를 나타냈다(도 12). LPS로 자극된 상등액의 TNF-α와 IL-6의 레벨은 용량 및 고용량 급여군에서 모두 유의하게 억제되었으며, 저용량군에서 더 감소되었다(도 13, 도 14).

4. LPS 활성화된 대식세포에 접촉 의존성 염증분자에 대한 압출성형 효소처리 밀기울의 경구투여 효과

대식세포의 기능의 중요한 성질은 세포간의 직접적인 첩촉을 통하여 Th cell(helper T cell)의 항원을 제시하는 것이다. LPS로 대식세포를 자극하였고, CD40과 CD86분자의 표면발현을 유세포분석으로 측정하였다. LPS 자극에 의해 CD40(+)CD11b(+)세포와 CD86(+)CD11b(+)세포가 15.7%에서 85.5%와 4.1%에서 78.4%로 각각 증가하였다(도 15, 도 19). 저용량 및 고용량 급여군은 모두 CD40 M.F.I.의 감소와 함께 CD40(+)CD11b(+)세포의 백분율이 유의적으로 감소하였다(도 15-도 18).
도 16은 도 15를 막대그래프로 나타낸 도면이며, 도 17은 역시 히스토그램이 우측으로 이동할수록 CD40의 양이 많이 만들어짐을 의미. CD40은 대식세포가 T 보조세포로부터 받는 신호를 전달하는 단백질이며 밀기울투여군에서 이 단백질의 양이 감소하였다. 따라서 밀기울섭취군에서 T 보조신호와의 접촉이 줄어서 대식세포의 염증반응이 감소할 수 있음을 보여주는 것이다.
도 18은 도 17를 막대그래프로 나타낸 도면이다.
한편, 그룹간에 CD86(+)CD11b(+) 세포의 비율에 대한 차이를 발견할수 없었다. 하지만, CD86 M.F.I. 값은 세포당 분자발현의 감소를 나타내면서 고용량 급여군에서 유의적으로 감소하였다(도 19-도 22).
도 20 및 도 22는 도 19 및 도 21에 대한 막대그래프로서 이 두개의 결과는 밀기울 섭취에 의한 변화가 없는 것으로 나타났다.

5. LPS의 복강내주사에 반응하는 혈청 사이토카인에 대한 압출성형 효소처리 밀기울의 효과

상기결과는 압출성형 효소처리 밀기울을 급여한 마우스에서 대식세포가 체외(ex vivo) 항 염증 활성을 나타내는 것을 입증하였기 때문에, 이러한 항 염증 반응은 생체 내(in vivo)에서 발생하는지 여부를 확인하는 것이 중요하다. 또한 수용성 아라비노자일란의 함량이 이러한 항염반응에 기여하는 인자인지 조사하였다. 이를 위해, 본 실험에서 압출성형만 실시한 밀기울을 급여한 쥐를 포함하였다. 각 그룹의 투여량은 상기 결과에 기초하여 2,500 mg/Kg이었다. 쥐에게 4주간 두 종류의 밀기울을 급여한 후에, 우리는 LPS를 복강으로 자극한 후 혈중 TNF-α와 IL-6의 수준을 측정하였다. 밀기울 종류에 관계가 없이 혈청 TNF-α의 수준이 감소되었다, 그러나 압출성형 효소처리 밀기울과 압출성형만 실시한 밀기울 급여군 간의 차이를 발견하지 못하였다(도 23). 대조적으로, 혈청 IL-6의 수준은 압출성형 밀기울보다 압출성형 효소처리 밀기울 급여군의 마우스에서 유의하게 억제되었다(도 24). 이러한 데이터는 효소처리 또는 수용성 아라비노자일란의 증가가 밀기울의 항염증 효과를 향상시켰음을 나타낸다.

상기와 같이 본 발명은 최소한의 공정과 비용으로 처리한 밀기울의 면역 향상 가능성을 제시하였다.

대식세포의 식균작용에 대한 중요성은 대식세포가 외래 유기물의 침입뿐만 아니라, 사균, 죽은 세포에서 방출된 파편, 숙주로부터 원치않는 조직성분을 제거한다는 것이다. 이러한 작용은 염증반응을 방지하기 위하여 신속하게 처리해야 한다. 스케빈저 수용체는 대식세포에 특히 풍부하게 들어있고, 박테리아 LPS나 산화 지질단백질등과 같은 외래 또는 숙주에 음전하 고분자들을 인식한다. 압출성형 효소처리 밀기울의 경구 투여는 SRA와 CD36 분자의 표현이 강화되고, 이는 향상된 식균작용력을 암시한다. 게다가, Fc 수용체는 항체의 Fc 부분에 결합함으로써 항원/항체복합체를 내부화 하여 대식세포의 적응면역의 생물학적 기능에 참여하는 것을 허용한다. 압출성형 효소처리 밀기울을 먹인 쥐에서 분리한 대식세포의 FITC-Ig-latex bead의 uptake의 증가는 Fc 수용체의 활성 또는 발현이 향상되었음을 의미한다. 전반적으로, 압출성형 효소처리 밀기울은 식세포 수용체의 상향 조절을 통해 대식세포의 식세포 활동을 증가시키는 것으로 생각된다.

NO는 산소의 존재 하에서 NO 합성효소에 의해 L-arginine으로부터 합성된다. NO합성효소의 세가지 아형 중, 제 2형 합성효소 또는 유도형NO 합성효소는 병원균이나 미생물 생성물, 인터페론들에 의해 발현된다. NO는 항균물질이지만, 지나친 생산은 숙주세포에 해롭게 된다. TNF-α와 IL-6는 병원균의 확산을 제한하고 혈중 면역세포를 병원균이 대식세포에 의해 완전히 제거되지 않은 곳으로 끌어들이기 때문에 중요하다. 이러한 수용성 염증매개체의 중요성에도 불구하고, 대식세포의 부적절한 생산물은 주변 조직에 손상을 끼친다. 우리는 NO, TNF-α 및 IL-6의 감소된 수준으로 볼 때 압출성형 효소처리 밀기울 그룹에서 대식세포가 ex vivo에서 항 염증 활성을 나타낸 것을 발견했다. 유도성 NO합성효소, TNF-α와 IL-6은 LPS/TLR4-mediated NF-kB와 mitogen활성화 단백질인산화효소(MAP) 단백질 신호전달 경로에 의해 모두 조절된다. 우리는 이 세포내 신호전달 분자가 영향을 받은 방법은 연구하지 않았다.

CD40은 T세포 반응 뿐만 아니라 NO의 합성, TNF-α, 그리고 IL-6같은 대식세포의 기능과, CD86과 CD40 같은 보조 자극분자의 기능을 강화시키면서 접촉의존 세포간 신호를 매개하는 세포표면분자이다. 대식세포에서의 CD40발현은 NF-kB와 MAP kinase를 통해 TLR작용제에 의해 증가된다. 세포표면에서 CD40신호의 차단은 여러 만성 염증성 및 자가면역질환을 억제하는 것으로 보고되어있다. 특히, LPS유도된 CD40발현의 downregulation으로 관찰된 패턴은 고용량 투여그룹보다 저용량 투여그룹에서 더 효과적인 TNF-α와 IL-6에서 관찰된 것과 유사하였다. 투여량이 증가하면서 다른 알수없는 구성요소들이 저용량 투여에서 CD40, TNF-α 및 IL-6 억제를 일으켰다고 추측한다. CD86은 Th-cell의 항원 제시에 참여하고, 대식세포의 활성화를 위한 마커로 사용된다. 이 분자는 고용량 투여군에서 억제되었고, 이는 CD86과 CD40은 차별적으로 규제되었음을 의미한다.

압출성형 효소처리 밀기울의 항염증 효과가 LPS의 침투성 주입에 대한 반응으로 발생하였음을 보여주었다. 흥미롭게도, 압출성형 효소처리 밀기울의 섭취 후 혈청 TNF-α와 IL-6의 감소를 비교했을때 미처리 밀기울만 TNF-α에 영향을 받았다. 대식세포에서 TNF-α와 IL-6의 분비에 LPS를 연결하는 세포내 신호전달경로가 동일하지 않다. 또한, 복강내 LPS에 반응하는 혈청 TNF-α와 IL-6의 서로다른 반응속도가 동물실험연구에서 관찰되었다; 혈청 TNF-α와 IL-6의 피크는 각각 1시간, 3-4시간 이었다. 두 사이토카인이 차별적으로 규제되는 점을 감안할 때, 압출성형 효소처리밀기울은 각 사이토카인의 생산 경로의 upstream을 방해하는 것 같다. 수용성아라비노자일란의 또는 압출성형 효소처리를 통한 다른 물질의 증가는 관찰된 차이를 설명하는 것을 보여준다. 압출성형 효소처리 밀기울의 경구투여가 어떻게 이런 결과를 나타내었는지는 불명확하다.

Prebiotics는 위의 산도, 숙주 효소에 의한 가수분해 및 소화흡수에 저항하는 음식물로 정의되고; 장내 세균에의해 발효되며; 특히 Bifidobacterium과 Lactobacillus종 같은 선택적으로 유익한 장내세균의 성장이나 활성을 자극하여 인간의 건강을 향상한다. 아라비노자일란과 그 가수분해 산물인 아라비노자일란-올리고사카라이드(AXOS)는 prebiotics의 기준을 충족시킨다. 무작위, 위약 대조 연구는 효소처리 밀기울 추출물 또는 AXOS의 경구 섭취가 대변의 Bifidobacterium종 과 단쇄지방산 생성물이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 탄수화물의 발효를 나타내고, 콜론 독성, 돌연변이 유변력 그리고 발암물질과 연관된 결장 단백질 발효의 감소를 나타낸다. 아라비노자일란은 Bifidobacterium에 의해 직접 발효되는 기질이 아니다. 장내 아라비노자일란은 반추동물의 제1위 또는 인간의 대장 Bacteroides 종 등에서 처음 발효되고, 그리고 자일로올리고당과 AXOS 같은 가수분해물이 Bifidobacterium종, Lactobacillus종, Bacteroides 종에 의해 발효된다. 밀기울로부터 분리된 아라비노자일란의 복강내 처리는 구강 처리와는 달리 어떠한 면역효과도 나타내지 않았다. 그 효과는 소화관에서의 대사와 관련될 수 있음을 시사한다. 그러므로, 압출성형 효소처리 밀기울의 잠재적 프리바이오틱 효과는 면역 증강 및 항염증에 효과가 있을 것이다. 또한, 효소적으로 처리한 밀기울 내의 항산화 성분의 효과를 배재되어서도 안된다. 밀기울은 페놀산, 특히 페룰산의 풍부한 급원이다. 효소 처리는 조직 메트릭스로부터 다른 페룰산 및 페놀산의 방출을 향상시키고, 페놀성 화합물의 생체 이용율을 향상시킨다. 페룰산은 in vitro상 대식세포에서 NF-kB의 조정를 통하여 LPS에 의한 염증반응을 억제한다.

결론적으로 본 발명은 전분이나 단백질의 제거와 같은 복잡한 처리 없이 단지 압출성형 및 효소처리를 하여 준비하였다. 이러한 간단한 공정을 통하여, 밀기울은 대식세포의 활성과 in vivo내에서 항염증 효과가 증가하였다. 우리의 결과는 면역활성을 갖는 기능성 식품으로 효소처리 밀기울의 유용성에 대한 증거를 제공한 것이다.

S1 ; 압출성형단계 S2 ; 가열 및 냉각단계
S3 ; 효소교반단계 S4 ; 분쇄단계

Claims

밀기울에 15% 수분 함량을 갖도록 가수한 후, 바렐 온도 100℃, 스크류 회전속도 550 RPM 으로 압출성형 하는 압출성형단계;
상기 압출 성형된 밀기울에 원료 중량대비 10배의 증류수를 가수한 후 121℃에서 1시간동안 고압 가열한 후 40~50℃에서 냉각하는 가열 및 냉각단계;
상기 가열후 냉각한 밀기울 100 중량부 기준 1.5 중량부의 셀루클라스트(Celluclast) 효소를 투입 2시간동안 교반하는 효소교반단계;
상기 효소처리된 밀기울을 분무건조기로 건조한 후 분쇄기 3,100 RPM으로 분쇄하는 분쇄단계; 로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법.
상기 제 1 항에서 가공된 밀기울 0.1~50중량부에 중력, 박력, 강력 밀가루중 어느 하나의 밀가루 50~99.1중량부를 혼합하는 단계를 포함하여 면역기능 향상을 위한 밀가루 프리믹스를 제공토록한 것을 특징으로 하는 면역기능 향상을 위한 밀기울의 가공방법.