WO2013045226A1

WO2013045226A1 - Mikroskop für die weitfeldmikroskopie

Info

Publication number: WO2013045226A1
Application number: PCT/EP2012/067176
Authority: WO
Inventors: Ingo Kleppe; Daniel Schwedt
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy Gmbh
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-04
Publication date: 2013-04-04
Also published as: US20140347461A1; DE102011083847A1; US9435992B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop für die Weitfeldmikroskopie mit einem Detektierungsstrahlengang und einem Beleuchtungsstrahlengang. Das Mikroskop umfasst eine im Detektierungsstrahlengang und / oder Beleuchtungsstrahlengang angeordnete Filterradvorrichtung mit mindestens einem Filterrad (1, 2), wobei das mindestens eine Filterrad (1, 2) um eine Achse drehbar gelagert ist, und wobei das mindestens eine Filterrad (1, 2) in Segmente unterteilt ist. Mindestens in einem ersten Teil (3) der Segmente sind Filter einen ersten Teilkreis bildend angeordnet, so dass sie beim Drehen des Filterrades (1, 2) nacheinander in den Detektierungsstrahlengang bzw. Beleuchtungsstrahlengang eingebracht werden. Eine Kamera (8) ist mit einem Flächendetektor im Detektierungsstrahlengang angeordnet, die Kamera (8) Bilder mit einer vorgegebenen Bildaufnahmefrequenz aufzeichnend ausgestaltet. Bei einem solchen Mikroskop umfasst die Filterradvorrichtung eine motorisch angetriebene Welle (6), auf der das mindestens eine Filterrad (1, 2) drehbar gelagert ist, und die mit einer vorgegebenen Umdrehungsfrequenz drehbar ausgebildet ist. Das Mikroskop umfasst außerdem eine Ansteuerung zur Synchronisierung von Bildaufnahmefrequenz und Umdrehungsfrequenz in Abhängigkeit von den auf dem mindestens einen Filterrad (1, 2) angeordneten Filtern auf.

Description

Titel

Mikroskop für die Weitfeldmikroskopie

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop für die Weitfeldmikroskopie mit einem Detektierungsstrah- lengang und einem Beleuchtungsstrahlengang. Dieses Mikroskop umfasst eine im Detektie- rungsstrahlengang und / oder im Beleuchtungsstrahlengang angeordnete Filterradvorrichtung mit mindestens einem Filterrad, wobei das mindestens eine Filterrad um eine Achse drehbar gelagert ist und in Segmente, d.h. Kreissegmente, unterteilt ist. Mindestens in einem ersten Teil der Segmente sind Filter angeordnet, die zusammen einen ersten Teilkreis bildend angeordnet sind, so dass sie beim Drehen des Filterrades nacheinander in den Detektierungsstrahlengang bzw. den Beleuchtungsstrahlengang eingebracht werden. Das Mikroskop umfasst außerdem mindestens eine Kamera mit einem Flächendetektor im Detektierungsstrahlengang. Die Kamera kann eine herkömmliche Digitalkamera sein oder ein Flächendetektor mit entsprechender Abbildungsoptik. Als Flächendetektor geeignet ist beispielsweise ein CCD- oder CMOS- Detektor. Die Kamera zeichnet Bilder, sogenannte frames, mit einer vorgegebenen Bildaufnahmefrequenz, der sogenannten framerate, auf bzw. ist dazu in der Lage. Die Bildaufnahmefrequenz ist vorgebbar und liegt in der Regel bei etwa 24 Bildern pro Sekunde, sie kann aber auch darüber oder darunter liegen, beispielsweise in einem Bereich zwischen einem Bild pro Sekun- de und 30 Bildern pro Sekunde.

Beschreibung der Erfindung

Für die Untersuchung lebender Organismen hat sich in den letzten Dekaden die Fluoreszenz- mikroskopie zum wichtigsten Werkzeug entwickelt. Dabei spielt neben den unterschiedlichen Kontrastverfahren insbesondere auch die Möglichkeit eine Rolle, dass eine Probe gleichzeitig mit einer Vielzahl von Farbstoffen markiert werden kann und diese Farbstoffmarkierungen simultan gemessen werden können. In der Regel erfolgt dies durch eine spektrale Selektion, die sowohl auf Anregungsseite, also im Beleuchtungsstrahlengang, als auch auf Detektierungssei- te, also im Detektierungsstrahlengang erfolgen kann, wobei die spektrale Selektion auch in beiden Teilstrahlengängen gleichzeitig vorgenommen werden kann. Für die Beobachtung solcher Lebendproben bevorzugt eingesetzt werden Laserscanning-Mikroskope, da hier die spektrale Aufspaltung sowohl auf Detektierungsseite als auch auf Anregungsseite relativ flexibel und einfach gehandhabt werden kann.

In der Weitfeldmikroskopie lässt sich zwar auf der Beleuchtungsseite durch die Einführung verschiedener, wechselweise und gemeinsam schaltbarer Lichtquellen wie LEDs, Laser, etc. eine gewisse Flexibilität herstellen. Auf der Detektierungsseite ist die Weitfeldmikroskopie im Gegen- satz dazu jedoch nicht besonders flexibel. Dies liegt zum einen an der geringen Anzahl der möglichst sensitiven Detektoren bzw. Kameras, die noch mit verhältnismäßig geringem Aufwand praktikabel eingebunden werden können. Die Handhabung von mehr als drei Kameras wird bereits sehr aufwendig. Zum anderen besteht ein Problem darin, dass für die Weitfeldmikroskopie, die eine Probe nicht punktweise abtastet, sondern ein Gesamtbild der Probe liefert, die Bildinformation spektral aufgespaltet werden muss. Im Vergleich zum Punktscanner ist dies optisch deutlich anspruchsvoller. Die derzeit bekannten Standardlösungen beinhalten ein Filterrad, das für die jeweilige Aufnahme in die entsprechende Position gefahren wird. Das Filterrad kann dabei auch aus mehreren Filterkomponenten bestehen, wie beispielsweise einem Anregungsfilter, einem Hauptfarbteiler und einem Emissionsfilter. Bei paralleler Detektierung auf mehreren Kameras wird das Filterrad zur spektralen Bildteilung verwendet.

Um eine konstruktiv weniger aufwendige und mit einer geringen Anzahl von Detektierungskanä- len verknüpfte spektral aufgelöste Detektierung zu ermöglichen gibt es im Stand der Technik bereits verschiedene Ansätze. Die beiden wesentlichen Ansätze basieren auf der Verwendung von Flüssigkristallen und akustooptischen, einstellbaren Filtern (Acousto-Opical Tunable Filter, AOTF).

Flüssigkristalle sind zwar hoch flexibel, besitzen aber eine extrem schlechte Transmission. Zudem funktioniert die Unterdrückung des Lichtes, was nicht durch den Filter hindurch soll, nur über Polarisierung. Die Verwendung von AOTF erfordert größere Eingriffe in das Optikdesign des Mikroskops, zudem ist die Bildqualität, die durch die notwendigen Modulation des AOTF erzeugt wird, nicht ausreichend hoch. Da in der Detektierung kein kollimierter Strahl vorhanden ist, wird die Verwendung von AOTF auch auf das Gesichtsfeld beschränkt. Beide Methoden bieten zwar den Vorteil relativ großer Flexibilität in der Wahl der Filterbänder, sind aber in den optischen Eigenschaften zur Bildgebung sowie der Unterdrückung dem klassischen Filter weit unterlegen.

Auch solche klassischen Filter werden verwendet. Sie sind in der Regel in Rädern und / oder Filterwürfeln verbaut, dabei werden Anregungsfilter mit Farbteilern und Emissionsfiltern kombi- niert. Die Unterdrückung ist durch die Wahl entsprechender Filter mit entsprechenden Be- schichtungen und durch die Wahl des Winkelspektrums hervorragend und bisher von anderen Verfahren nicht erreicht. Die Farben werden hier optimal getrennt. Da aber sowohl die Filterräder als auch die bekannten verwendeten Filterrevolver nur wenige Positionen, etwa 6 bis 10, zur Verfügung haben, ist die Auswahlmöglichkeit auf wenige Voreinstellungen beschränkt. Der Wechsel der Filter erfolgt zudem relativ langsam, wobei sich für spezielle Farbstoffkombinationen allerdings sogenannten Multibandfilter einsetzen lassen, die jedoch wieder Kompromisse in Bezug auf die Unterdrückung und die Steilheit der Kanten im Übergangsbereich zwischen unterdrückten und durchgelassenen Wellenlängen nach sich ziehen.

Klassische Verfahren zur spektralen Aufteilung bestehen in der Verwendung von Gittern oder Prismen. Dabei ist es jedoch schwierig die Bildinformation zu konservieren, da beispielsweise bei Prismen die spektrale Auflösung nicht allzu hoch ist, und andererseits Gitter eine Polarisationsabhängigkeit mit sich bringen, sowie weitere Nachteile aufweisen, was die Transmission betrifft.

Auch die Anwendung interferometrischer Methoden, bei der jedem Pixel eine spektrale Information zugeordnet wird, ist bekannt. Diese Verfahren arbeiten jedoch nur langsam und können nur sequentiell Daten messen. Darüber hinaus ist ein Interferometer polarisationssensitiv und im Hinblick auf seine Justierung schwierig zu handhaben und anfällig für Dejustierungen.

Eine weitere Methode besteht schließlich im sogenannten Unmixing, bei dem verschiedene Farbstoffe rein rechnerisch getrennt werden. Es müssen dabei jedoch so viele Kanäle detektiert werden, wie Fluorophore zur Einfärbung der Proben benutzt werden.

Zusammenfassend ist keine der oben beschriebenen Methoden in der Lage, in der Weitfeldmikroskopie eine Probe flexibel spektral zum einen mit ausreichend hoher Wechselgeschwindigkeit und zum anderen mit einer hoher Qualität, was die Filterung betrifft, zu detektieren. Aufgabe der Erfindung ist es daher, diese Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und insbesondere ein Weitfeldmikroskop dahingehend weiter zu entwickeln, dass eine flexible spektrale Detektierung in der Weitfeldmikroskopie mit einer solch hohen Qualität, wie sie die Verwendung klassischer Filter liefert, zu ermöglichen, so dass eine biologische, möglicherweise lebende Probe in ausreichend schneller Zeit vermessen werden kann, ohne dass beispielsweise bei der Verwendung von Fluorophoren die Probe ausbleicht.

Diese Aufgabe wird bei einem Mikroskop der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass die Filterradvorrichtung eine motorisch angetriebene Welle umfasst, auf der das mindestens eine Filterrad drehbar gelagert ist, und die sich mit einer vorgegebenen Umdrehungsfrequenz drehend ausgebildet ist, und das Mikroskop eine Ansteuerung zur Synchronisierung von Bildaufnahmefrequenz und Umdrehungsfrequenz, d.h. der Drehzahl der Welle, in Abhängigkeit von den auf dem mindestens einen Filterrad angeordneten Filtern umfasst. Im Gegensatz zu den üblichen Verwendungen von Filterradrevolvern bietet die Anordnung des mindestens einen Filterrades auf einer Welle den Vorteil, dass diese ohne großen Aufwand motorisch angetrieben werden kann und ebenfalls ohne großen Aufwand hohe Drehzahlen einstellbar sind, die einen kontinuierlichen und schnellen Wechsel der Filter ermöglichen. Die Welle und das auf ihr angeordnete mindestens eine Filterrad müssen dabei selbstverständlich so im Strahlengang angeordnet sein, dass die auf dem mindestens einen Filterrad angeordneten Filter von dem Licht, welches sich im Beleuchtungs- und / oder Detektierungsstrahlengang ausbreitet, getroffen wird, ohne jedoch den Strahlengang anderweitig zu behindern. Die AnSteuerung verknüpft die Drehzahl mit der Bildaufnahmefrequenz der Kamera bzw. des Detektors. Dabei kann sowohl die Bildaufnahmefrequenz als auch die Umdrehungsfrequenz der Wel- le gesteuert werden .

Auf diese Weise ist es möglich, dafür Sorge zu tragen, dass pro aufgenommenes Bild die De- tektierung bzw. Beleuchtung nur mit bestimmten Filtern oder Kombinationen von Filtern vorgenommen wird. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist durch diese Synchronisation von Bildaufnahmefrequenz und Umdrehungsfrequenz pro aufgenommenes Bild nicht mehr als ein Filter des ersten Teilkreises im Detektierungsstrahlengang und / oder Beleuchtungsstrahlengang angeordnet. Auf dem mindestens einen Filterrad lassen sich verschiedene spektrale Funktionalitäten, wie Anregungsfilter, Strahlteiler oder Emissionsfilter, anordnen, die sequentiell in den Strahlengang eingebracht werden. Aufgrund der Anordnung auf einer rotierenden Welle lässt sich eine hohe spektrale Flexibilität über zeitliches Multiplexing erreichen, wobei die Filterräder oder Filterscheiben prinzipiell alle in der Fluoreszenzmikroskopie notwendigen Filterfunktionen bedienen können. Durch die Synchronisation von Bildaufnahmefrequenz und Umdrehungsfrequenz müssen die spektralen Beleuchtungs- und Detektierungseigenschaften des Mikroskops mit jedem aufzunehmenden Bild, mit jedem frame, neu festgelegt werden, wobei die Bilder mit hoher Geschwindigkeit, nämlich mit üblichen Raten von etwa 24 Bildern pro Sekunde aufgenommen werden können.

Auf diese Weise kann beispielsweise zwischen zwei Bildern zwischen farbstoffoptimierten spektralen Charakteristiken umgeschaltet werden, so dass sich nach der Aufnahme nur weniger Bilder entsprechend der Anzahl der verwendeten Farbstoffe ein vollständig entmischtes Bild ergibt, da jeder Farbstoff systembedingt separat angeregt wird. Andererseits kann aber auch über diskret variierte spektrale Charakteristiken innerhalb von mehreren frames, beispielsweise innerhalb einer Sekunde, die Probe vollständig spektral charakterisiert werden. Die Filter können dabei beispielsweise als monolithische Schichten auf ein Substrat, welches als Filterrad dient, aufgebracht sein. Eine andere Möglichkeit besteht darin, ein Filterrad mit entsprechenden Öffnungen bereitzustellen, in welche die Filter eingesetzt werden, wobei sie dort entweder permanent oder auswechselbar angeordnet sein können ; letzteres erhöht die Flexibilität. Selbstverständlich können auch die Filterräder als Ganzes ausgewechselt werden.

Der Platz auf der Filterscheibe kann dabei in Kombination mit entsprechend ausgelegten Strahlengängen so ausgenutzt werden, dass auf einem Filterrad mehrere Filter bei einer Aufnahme durchlaufen werden. So sind in mindestens dem ersten Teil der Segmente Filter mindestens einen weiteren Teilkreis bildend angeordnet, so dass die Segmente des ersten Teils in radialer Richtung mindestens zwei aufeinanderfolgend angeordnete Filter aufweisen. Der Strahlengang ist dann beispielsweise so ausgebildet, dass das gleiche Segment vom Lichtstrahl zweimal getroffen wird, einmal auf dem ersten Teilkreis, beispielsweise einem äu ßeren Teilkreis, und das andere Mal auf einem weiteren Teilkreis, beispielsweise einem inneren Teilkreis. Auf dem äu ßeren Teilkreis lassen sich vorteilhaft die Filterfunktionen für solche Experimente anordnen, die ein Schalten zwischen einer Vielzahl von Filtern voraussetzen, wie beispielsweise Emissi- ons-Fingerprinting oder Wellenlängenspans, da hier eine größere Fläche pro Segment zur Verfügung steht und damit eine Strahlquerschnittsüberdeckung leichter zu erreichen ist. Auf dem inneren Teilkreis lassen sich Filter anordnen, die beispielsweise nur wenig gewechselt werden müssen ; hier lassen sich die Filter beispielsweise alternierend anordnen, wobei mindestens ein Teil der Filter zwei oder mehr Segmente des ersten Teils der Segmente überdeckend ausgestaltet sein kann, verschiedene Sektoren also fusioniert werden können, um mittels einer größeren Filterfläche eine einfachere Triggerung zu erreichen. Dabei wird die Umlaufgeschwindigkeit der Filterscheibe - oder alternativ die Bildaufnahmefrequenz - so angepasst, dass während der Belichtungszeit der Kamera stets nur eine Filterfunktion pro Teilkreis und Segment im Strahlengang aktiv ist. Selbstverständlich ist auch eine Konzeption des Strahlengangs derart möglich, dass der äu ßere Teilkreis nur von der Detektierung verwendet wird und der innere Teilkreis nur von Beleuchtungslicht beleuchtet wird, oder umgekehrt. Auch die Verwendung von mehr als zwei Teilkreisen ist selbstverständlich möglich, da insbesondere die Filterräder und/oder Filter mit verschiedenen Durchmessern und verschiedener Größe konzipiert werden können.

Bevorzugt ist das mindestens eine Filterrad in Pupillennähe des Mikroskopstrahlengangs angeordnet, da dies minimale Filterflächen erlaubt und sich beispielsweise leichte Fehlanpassungen in der Synchronisation oder auch Farbverläufe dann nicht als Artefakte im Bild bemerkbar ma- chen.

Um die Verwendung mehrerer Filter in dem gleichen Segment zu ermöglichen, umfasst die Filterradvorrichtung des Mikroskops vorzugsweise Mittel zur Umlenkung von Licht, welches von einem ersten Filter in einem Segment des ersten Teils von Segmenten reflektiert wurde, auf einen zweiten Filter in demselben Segment. Falls mehr als zwei Filter in einem Segment angeordnet sind, so weist die Filterradvorrichtung entsprechend weitere Umlenkmittel auf. Auch die Umlenkung auf Filter in anderen Segmenten oder anderen Filterrädern ist mit solchen Umlenkmitteln herstellbar. Die Mittel zur Umlenkung lassen sich dabei auf verschiedene Weise realisie- ren, wobei die verschiedenen Mittel auch kombiniert werden können.

Eine Möglichkeit besteht darin, dass die Mittel zur Umlenkung mindestens einen Spiegel zur Umlenkung des Lichts, welches von einem oder mehreren der Filter reflektiert wurde, auf einen weiteren Filter in dem mindestens einen Filterrad umfasst. Dabei kann der Spiegel fest ange- ordnet sein, er kann aber bevorzugt auch entlang des Strahlweges verschiebbar angeordnet sein, was mehr Einstellmöglichkeiten zulässt.

Um unerwünschtes Licht, welches beispielsweise von den Filtern reflektiert wird, effizient zu unterdrücken, weisen die Mittel zur Umlenkung zweckmäßig eine mindestens der Anzahl der Teilkreise entsprechende Zahl von verschließbaren Blenden auf, die den Filtern vor- oder nachgeordnet sein können. Dies ist beispielsweise bei der Verwendung von mehreren Detektie- rungskanälen sinnvoll, die dann einzeln blockiert werden können. Entsprechend der Anzahl von Detektierungskanälen ist auch eine Anzahl von Detektoren vorgesehen. In einer weiteren Ausgestaltung umfasst die Filterradvorrichtung daher mindestens einen weiteren Spiegel, der eben- falls bevorzugt entlang dem Strahlweg verschiebbar angeordnet ist, welcher dem mindestens einen Filterrad im Strahlengang nachgeordnet ist und das Licht auf eine weitere Kamera mit einem Flächendetektor reflektierend ausgestaltet ist.

Die Mittel zur Umlenkung können au ßerdem ein in den Strahlengang einbringbares Reflexions- prisma zur Versetzung des einfallenden Strahls vor dem Auftreffen auf das Filterrad umfassen. Auf diese Weise lässt sich beispielsweise zwischen verschiedenen Filteranordnungen eines Segments innerhalb des Rades umschalten. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft einsetzbar, wenn sich die spektralen Charakteristiken der Filterflächen überlappen. In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist zwischen den Segmenten des ersten Teils jeweils ein Segment eines zweiten Teils von Segmenten angeordnet, wobei die Segmente des zweiten Teils reflektierend ausgestaltet sind. Besonders vorteilhaft lassen sich die das zur De- tektierung verwendete Licht vollständig reflektierenden Segmente des zweiten Teils von Segmenten im Zusammenhang mit der Synchronisierung oder Triggerung verwenden. Dazu um- fasst die Filterradvorrichtung einen an die Ansteuerung gekoppelten lichtempfindlichen Detektor, beispielsweise einen Fotodetektor, zur Detektierung von Licht, welches von allen gleichzeitig im Strahlengang befindlichen Filtern des Filterrades reflektiert wurde. Die Ansteuerung verwendet zur Synchronisierung, d.h. zur Steuerung der Umlauffrequenz und / oder der Bildaufnahmefrequenz Schwankungen in der Intensität. Zweckmäßig weist die Filterradvorrichtung auch Mittel zur Einkopplung von Beleuchtungslicht auf. In einer weiteren Ausgestaltung umfassen die Umlenkmittel ein vollverspiegeltes Rad, welches auf der Welle in einem vorgegebenen Abstand zu dem mindestens einen Filterrad positioniert ist und starr mit diesem verbunden ist. Es ist gemeinsam mit diesem auf der Welle zwischen vorgegebenen Positionen verschiebbar, diese Positionen lassen sich beispielsweise mit Einrastpositionen realisieren, die auch für einzelne Filterräder, die nicht mit vollverspiegelten Rä- dem gekoppelt sind, verwenden lassen. Dies lässt sich insbesondere für die Einkopplung von Beleuchtungslicht, welches zur Anregung von Fluorophoren verwendet werden kann, verwenden.

In einer weiteren Ausgestaltung umfasst die Filterradvorrichtung mindestens ein zweites Filter- rad, wobei das mindestens eine zweite Filterrad zur Ausrichtung der Filter zueinander gegen das erste Filterrad und / oder gegen den Drehsinn der Welle rotiert werden kann. Auch die Welle, auf der das mindestens eine Filterrad gelagert ist, kann senkrecht zu ihrer Rotationsachse verschiebbar angeordnet sein, was weitere Einstellmöglichkeiten erlaubt, indem beispielsweise verschiedene Filterräder wechselweise in den Strahlengang eingebracht werden können, ohne dass ein Umbau notwendig ist. Auch lassen sich verschiedene auf der Scheibe angeordnete Teilkreise selektiv auswählen.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale, auch die in den Ansprüchen genannten, nicht nur in den angegebenen Kombinatio- nen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:

Fig.1 a und Fig.1 b zwei mögliche Ausgestaltungen von Filtern,

Fig.2 eine erste Ausgestaltung einer Filterradvorrichtung mit zugehörigem

Strahlengang,

Fig.3a und Fig. 3b eine zweite Ausgestaltung einer Filterradvorrichtung,

Fig.4 eine dritte Ausgestaltung einer Filterradvorrichtung,

Fig.5 eine vierte Ausgestaltung einer Filterradvorrichtung,

Fig.6 eine fünfte Ausgestaltung einer Filterradvorrichtung, Fig.7 eine sechste Ausgestaltung einer Filterradvorrichtung, Fig.8 eine siebte Ausgestaltung einer Filterradvorrichtung und

Fig.9 eine achte Ausgestaltung einer Filterradvorrichtung.

Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen

In Fig.1 sind zwei mögliche Ausgestaltungen von Filterrädern oder Filterscheiben gezeigt. Das in Fig.1 a gezeigte Filterrad 1 und das in Fig.1 b gezeigte Filterrad 2 unterscheiden sich jeweils in der Anordnung der Filter auf ihnen. Das in Fig.1 a gezeigte Filterrad 1 ist in Segmente unterteilt. Ein erster Teil 3 von Segmenten ist dabei größer als ein zweiter Teil 4 von Segmenten. Auf dem ersten Teil 3 von Segmenten sind verschiedene Filter F F₂, F₃ und F_A, F_B angeordnet. Jedes der Segmente des ersten Teils 3 von Segmenten ist dabei in zwei Teilkreise unterteilt, einen äußeren Teilkreis und einen inneren Teilkreis, die durch die punkgestrichelte Linie getrennt sind. Segmente des ersten Teils 3 von Segmenten weisen also in radialer Richtung mindestens zwei aufeinanderfolgend angeordnete Filter auf. In radialer Richtung variieren unterschiedliche Kombinationen häufig verwendeter Filterfunktionen, die in den Strahlengang eingedreht werden können. Prinzipiell lassen sich diese als beliebige Filtertypen - beispielsweise Anregungsfilter, Strahlteiler oder Emissionsfilter - ausgestalten. Auf konstanten Durchmessern des äußeren, ersten Teilkreises und des inneren, zweiten Teilkreises wechseln dann die für die typischen Experimente vorgesehenen, spektral variierenden Filterfunktionen.

Die Flächen des zweiten Teils 4 von Segmenten sind vorteilhaft reflektierend ausgeführt, dies ist jedoch nicht zwingend, für die Ansteuerung jedoch vorteilhaft. Besonders vorteilhaft lassen sich die Filterräder 1 , 2 in Pupillennähe des Mikroskopstrahlenganges anordnen, da dies mini- male Filterflächen erlaubt bzw. leichte Fehlanpassungen in der Synchronisierung und / oder Farbverläufe sich dann nicht als Artefakte im Bild bemerkbar machen. Auf dem äußeren, ersten Teilkreis des Filterrades 1 lassen sich vorteilhaft die Filterfunktionen für solche Experimente anordnen, die ein Schalten zwischen einer Vielzahl von Filtern F F₂, F₃ etc. voraussetzt, beispielsweise Emissions-Fingerprinting oder Wellenlängenscans, da hier eine größere Fläche pro Segment zur Verfügung steht. Eine Strahlquerschnittsüberdeckung ist auf diese Weise leichter zu erreichen. Der zweite Teilkreis schaltet dagegen beispielsweise nur zwischen sehr wenigen Filterfunktionen alternierend hin und her, hier F_A und F_B, wobei - wie in Fig.1 b gezeigt - verschiedene Segmente des inneren Teilkreises auch fusioniert werden können, um mittels einer größeren Filterfläche eine einfachere Triggerung zu erreichen. Dies lässt sich selbstverständlich auch auf den äußeren Teilkreis und gegebenenfalls weitere Teilkreise in anderen Konfigurationen übertragen.

Das Filterrad ist Teil einer Filterradvorrichtung, die im Detektierungsstrahlen- und / oder im Beleuchtungsstrahlengang eines Mikroskops für die Weitfeldmikroskopie angeordnet ist. Das Fil- terrad 1 , 2, von dem die Filterradvorrichtung mindestens eines umfasst, ist um eine Achse, die in den Figuren senkrecht zur Blattebene durch den Kreismittelpunkt der Filterräder 1 , 2 verläuft, drehbar gelagert, wozu die Filterradvorrichtung eine motorisch angetriebene Welle mit einer vorgegebenen oder vorgebbaren Umdrehungsfrequenz umfasst. Beim Drehen des Filterrades 1 , 2 werden die Filter F_{1 :} F₂, F₃ nacheinander in den Detektierungsstrahlengang bzw. Beleuchtungsstrahlengang eingebracht. Gleiches gilt für die auf dem zweiten Teilkreis angeordneten Filter F_A, F_B. Die auf dem gleichen Segment des ersten Teils 3 von Segmenten angeordneten Filter, beispielsweise und F_A in Fig.1 a, befinden sich jedoch gleichzeitig im Strahlengang. Die Filter können als monolithische Schichten auf ein als Filterrad dienendes Substrat aufgebracht sein, oder in entsprechende Öffnungen des Filterrades eingesetzt sein, wobei sie bevorzugt auswechselbar sind.

An das Mikroskop im Detektierungsstrahlengang angeschlossen ist außerdem mindestens eine Kamera mit einem Flächendetektor, wobei die Kamera Bilder mit einer vorgegebenen Bildauf- nahmefrequenz aufzeichnend ausgestaltet ist. Das Mikroskop weist dann eine Ansteuerung zur Synchronisierung von Bildaufnahmefrequenz und Umdrehungsfrequenz in Abhängigkeit von den auf den mindestens einen Filterrad 1 , 2 angeordneten Filtern F_{1 :} F₂, F₃ und F_A, F_B auf. Dabei wird die Umdrehungsfrequenz der Welle, also die Umlaufgeschwindigkeit des Filterrades 1 , 2 an die Bildaufnahmefrequenz der Kamera so angepasst, dass während der Belichtungszeit der Kamera stets nur eine Filterfunktion pro Teilkreis im Strahlengang aktiv ist, d.h. also pro aufgenommenes Bild nicht mehr als ein Filter des ersten Teilkreises etc. im Detektierungsstrahlengang und / oder im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist. Auch die Anpassung der Bildaufnahmefrequenz an die Umdrehungsfrequenz, beispielsweise über eine Triggerung des Auslösers, ist denkbar und wird weiter unten beschrieben.

Weist ein Filterrad mindestens zwei Teilkreise auf, so umfasst die Filterradvorrichtung auch Mittel zur Umlenkung von Licht, welches von einem ersten Filter in einem Segment des ersten Teils 3 reflektiert wurde, auf einen zweiten Filter in demselben Segment auf. Diese Mittel zur Umlenkung sollen anhand der folgenden Zeichnungen in Fig.2 bis Fig.9, in denen verschiedene Ausgestaltungen einer Filterradvorrichtung gezeigt sind, näher erläutert werden.

In Fig.2 ist eine erste Ausgestaltung einer Filterradvorrichtung gezeigt. Das hier verwendete Filterrad ist als Emissionsfilterscheibe 5 ausgestaltet und umfasst drei Teilkreise, in einem Segment des ersten Teils 3 von Segmenten sind hier drei Filter 5a, 5b, 5c gezeigt. Die Emissi- onsfilterscheibe 5 ist auf einer Welle 6 angeordnet, die motorisch angetrieben rotiert. Auf diese Weise wird zwischen unterschiedlichen, spektralen Transmissionseigenschaften hin- und hergeschaltet. Die verschiedenen radial angeordneten Filterschichten sind in der Abbildung durch die Abschnitte 5a, 5b und 5c angedeutet. Von der Probe kommendes Detektierungslicht 7, beispielsweise Fluoreszenzlicht, wird zunächst, je nach seinen spektralen Eigenschaften, teilweise an der ersten Filterfläche 5a in Richtung einer ersten Kamera 8 transmittiert, und teilweise an der Filterschicht 5a reflektiert. Reflektierte Signalanteile werden dann über einen entsprechend entlang des Strahlweges verschiebbar angeordneten Spiegel 9 auf einen weiteren wählbaren Teilkreis gelenkt und dort über die Filterflächen 5b bzw. 5c gefiltert. Je nach Stellung des Spie- gels 9 wird das Licht entweder auf die Filterschicht 5b oder auf die Filterschicht 5c gelenkt; die zweite Möglichkeit ist durch die gestrichelte Konfiguration dargestellt. Die Filterradvorrichtung umfasst außerdem mindestens einen, bevorzugt entlang den Strahlweg verschiebbare angeordnete weiteren Spiegel 10, welcher der Emissionsfilterscheibe 5 im Strahlengang nachgeordnet ist. Dieser nimmt das durch die zweite Filterstufe 5b oder 5c transmittierte Licht auf und lenkt dieses auf eine weitere Kamera 1 1 , die ebenfalls mit einem Flächendetektor ausgestaltet ist. Auf diese Weise lässt sich spektrales Multiplexing auf zwei Detektierungskanälen gleichzeitig erreichen, wodurch eine hohe spektrale Flexibilität erreicht wird.

In Fig.3 ist eine optische Anordnung dargestellt, in der das als Emissionsfilterscheibe 5 ausges- taltete Filterrad wie in Fig.2 gezeigt ausgebildet ist. Anstelle des verschiebbaren Spiegels 9 wird hier ein fest angeordneter Spiegel 12 verwendet, der das von den jeweiligen Filterflächen 5a, 5b, 5c reflektierte, von der Probe stammende Detektierungslicht 7 auf die übrigen radialen Filterpositionen eines Segments des ersten Teils 3 von Segmenten lenkt, so dass eine größere Anzahl von Detektierungskanälen aufgespannt wird. Nicht benötigte Detektierungskanäle wer- den mit individuellen Shuttern, d.h. verschließbaren Blenden 13a, 13b, 13c vor den den jeweiligen Detektierungskanälen zugeordneten Kameras 14a, 14b, 14c blockiert. Die Geometrie der Anordnung ermöglicht es außerdem, dass Beleuchtungslicht aus einer Beleuchtungslichtquelle 15 über die Emissionsfilterscheibe 5 eingekoppelt wird, da die Reflexionseigenschaften den Transmissionseigenschaften der Filterschichten 5a-5c entgegengesetzt sind, wie in Fig.3b ge- zeigt ist. Unerwünscht transmittiertes Anregungslicht gelangt so nicht auf die Kameras 14a - 14c.

Eine weitere Anordnung ist in Fig.4 dargestellt. Auch hier werden beispielhaft drei Kameras 14a, 14b und 14c verwendet. Mittels verschiebbarer Spiegel 16a und 16b, die hier in verschie- denen Richtungen des Strahlweges verschiebbar sind, lässt sich das von den Filterschichten 5a und 5b reflektierte Licht umlenken. Die von Filtern nicht bedeckten Bereiche des ersten Teils 3 von Segmenten, d.h. die Bereiche zwischen den Filtern, vollständig reflektierend ausgestaltet, wobei sich der Ausdruck vollständig auf das verwendete Spektrum bezieht. Die Bereiche zwischen den Filterschichten 5a und 5b sowie 5b und 5c sowie der Bereich zwischen der Filter- schicht 5a und dem Rand der Emissionsfilterscheibe 5 sind also vollständig reflektierend ausgestaltet. In der hier gezeigten gestrichelten Konfiguration des Spiegels 16a und des Spiegels 16b wird der Lichtstrahl des Beleuchtungslichtes 7, der von der Filterschicht 5a reflektiert wurde, vom Spiegel 16b zunächst auf einen Bereich zwischen zwei Filterschichten, welcher vollre- flektierend ausgestaltet ist, gelenkt. Nach Reflektion am Spiegel 16b wird das Beleuchtungslicht auf die Filterschicht 5c gelenkt.

Zusätzlich umfasst die gezeigte Anordnung auch ein Reflexionsprisma 17, welches in den Strahlengang zur Versetzung des einfallenden Strahls von Beleuchtungslicht 7 einbringbar ist. Im Gegensatz zu der einfacher gestalteten Ausführung in Fig.3 ist die in Fig.4 gezeigte Anordnung insbesondere dann vorteilhaft einsetzbar, wenn sich die spektralen Charakteristiken der Filterflächen 5a-5c überlappen. Im Resultat werden hier beispielhaft drei Detektierungskanäle aufgespannt, von denen jeweils jeder einzelne unabhängig von den anderen ein- oder aus- schaltbar ist.

Als zusätzliche Option weist die in Fig.4 gezeigte Anordnung außerdem einen Fotodetektor 18 auf, der hier das Licht, was von allen gleichzeitig im Strahlengang befindlichen Filterschichten des Filterrades reflektiert wurde, detektiert. Da in der Regel nur ein Teil des Lichtes an den Fil- terflächen reflektiert wird und die dem Fotodetektor zugewandten Flächen des zweiten Teils 4 der Segmente das verwendete Spektrum vollständig reflektierend ausgestaltet sind, kann das Ausgangssignal zur Triggerung bzw. Synchronisierung der Kameras 14a-14c genutzt werden, da die auf den Fotodetektor 18 auftreffende Lichtintensität maximal ist, wenn die Segmente des zweiten Teils 4 der Segmente im Strahlengang stehen und sämtliches Licht reflektiert wird. Die Kameras sind dann zwischen der fallenden und steigenden Flanke aktiv zu schalten. Der Fotodetektor ist also an die Ansteuerung gekoppelt, die Ansteuerung nutzt die Schwankungen in der Intensität zur Steuerung der Bildaufnahmefrequenz. Es wird also die Bildaufnahmefrequenz mit der Umlauffrequenz synchronisiert, wobei auch die Länge der aufnahmefreien Zeiten so gesteuert werden kann. Dies ist durch entsprechende Steuerleitungen 19 in Fig.4a symbolisiert. In Fig.4b ist beispielhaft die Triggerung einer Bildaufnahme als Funktion der Intensität I über der Zeit t dargestellt. Zu einer Zeit t1 sinkt die vom Fotodetektor 18 registrierte Intensität I schlagartig ab, was bedeutet, dass Licht durch mindestens eine der Filterschichten 5a-5c hindurchtritt. Die Flächendetektoren der Kameras 14a-14c werden dann auf Registrierung geschaltet. Beim Erreichen der Zeit t2 steigt die registrierte Intensität wieder an, was bedeutet, dass das Be- leuchtungslicht 7 wieder vollständig reflektiert wird. Die Aufnahme wird beendet.

Der Fotodetektor 18 lässt sich nicht nur bei der in Fig.4 gezeigten Anordnung, sondern auch bei den vorangehend gezeigten Anordnungen sowie den in den folgenden Zeichnungen noch zu zeigenden Anordnungen einsetzen.

In Fig.5 ist eine weiter Anordnung, bei der auf der Welle 6 zusätzlich zu der Emissionsfilterscheibe 5 noch eine weitere Emissionsfilterscheibe 20 mit Filterschichten 20a, 20b und 20c angeordnet ist. Die Bestückung mit Filterschichten kann unterschiedlich sein. Um verschiedene radiale Positionen auf den Filterscheiben zu aktivieren, werden die Filterscheiben 5 und 20 auf verschiedene vordefinierte Positionen auf der rotierenden Welle eingesetzt, wobei entweder die eine Filterscheibe 5 oder die andere Filterscheibe 20 oder beide Filterscheiben zueinander zur Ausrichtung der Filter zueinander gegen das jeweils andere Filterrad auf der Welle verschiebbar ist. Die Scheiben können also auf verschiedene vordefinierte Positionen umgesetzt werden, diese vordefinierten Positionen sind vorteilhaft Einrastpositionen. Auch andere Fixiermöglichkeiten sind denkbar, wie beispielsweise magnetische Kupplungen. Die Umsetzung, in Fig.5 durch den Doppelpfeil zwischen der gezeigten Position der Filterscheibe 20 und der gestrichelten Position der Filterscheibe 20 angedeutet, kann sowohl manuell als auch automatisiert erfolgen. Um einen Abgleich der sequentiellen Abfolge der Transmissionscharakteristiken zu erzielen, ist es vorteilhaft, wenn eine der beiden Filterscheiben 5 oder 20 in der zum Rotationssinn der rotierenden Welle entgegengesetzten Richtung gedreht werden kann, wobei die Filterscheibe in durch die Segmentierung vordefinierten Positionen einrasten kann und anschließend eine Drehung im Rotationssinn der Welle, hier durch den im Uhrzeigersinn weisenden runden Pfeil angedeutet, erlaubt wird.

In einer weiteren, in Fig.6 gezeigten Anordnung, sind auf der rotierenden, rotorisch angetriebenen Welle 6 drei verschiedene Filterscheiben 5, 21 und 22 angeordnet. Zusätzlich zur Emissionsfilterscheibe 5 befindet sich auf der Welle noch eine Strahlteilerscheibe 21 mit entsprechenden Filterflächen 21 a-21 c und eine Anregungsfilterscheibe 22 mit entsprechenden Anregungsfil- tern 22a-22c. Die Anregungsfilterscheibe 22 und die Strahlteilerscheibe 21 sind unabhängig gegen den Drehsinn der Welle drehbar und auf feste Winkelstellungen einrastbar auf der Welle angeordnet, so dass die richtige Winkelorientierung der Scheiben gewährleistet werden kann. Um zwischen verschiedenen Teilkreisen zu schalten , wird in dieser Anordnung die gesamte Welle 6 in der von der Welle 6 und dem Detektierungsstrahl des Detektierungslichts 7 aufge- spannten Ebene entlang des Radius der Filterscheiben senkrecht zur Rotationsachse der Welle verschoben, die Welle 6 ist in dieser Richtung verschiebbar gelagert. Auf diese Weise wird es möglich Licht der Beleuchtungslichtquelle 15 in den Mikroskopstrahlengang über Reflexion des Beleuchtungslichts an den Filterflächen 21 a-21 c der Strahlteilerfilterscheibe 21 einzukoppeln. Das Anregungslicht wird dabei zuvor beim Durchtritt durch die Filterflächen 22a-22c der Anre- gungsfilterscheibe 22 entsprechend gefiltert. Von der Probe stammendes Fluoreszenzlicht, welches das Detektierungslicht 7 im Detektierungslichtstrahl bildet, wird an den Filterflächen 5a- 5c der Emissionsfilterscheibe 5 von Anregungslichtresten bereinigt und in Richtung der hier nicht gezeigten Kameras weitergeleitet. In Fig.7 ist eine optische Anordnung skizziert, in der ein als multifunktionale Filterscheibe 23 ausgestaltetes Filterrad auf der rotierenden Welle 6 angeordnet ist. Die Filterscheibe 23 kann auf der Welle in verschiedenen vorgegebenen Positionen positioniert werden, wobei sie auf den entsprechenden Positionen einrasten kann. Auf diese Weise wird es möglich, dass von der Probe stammendes Detektierungslicht 7, beispielsweise Fluoreszenzlicht, mit unterschiedlichen Filterflächen 23a und 23b behandelt werden kann, bevor es in Richtung eines Detektors, dargestellt durch den nach rechts weisenden Pfeil, weitergeleitet wird. Die Filterflächen 23a und 23b dienen als Strahlteilungsfilter, die das Beleuchtungslicht, welches zur Anregung verwendet wird, aus der Beleuchtungslichtquelle 15 in den Mikroskopstrahlengang einreflektieren. Die inneren beiden der insgesamt vier Teilkreise der Filterscheibe 23 sind mit Anregungsfiltern 23c und 23d versehen, die das Anregungslicht vor der Aufspiegelung durch einen festen Spiegel 12 und die Strahlteilerfilterflächen 23a und 23b durchläuft. Die beim Verschieben der Filterscheibe 23 entstehenden Strahlversätze werden durch einen verstellbaren Spiegel 10 ausgeglichen. In Fig.8 ist die multifunktionale Filterscheibe 23 zusammen mit einem vollverspiegelten Rad 24 auf der Welle 6 angeordnet. Beide sind in einem vorgegebenen Abstand zueinander positioniert und außerdem starr miteinander verbunden sowie gemeinsam auf der Welle 6 zwischen vorgegebenen Positionen verschiebbar. Beide Scheiben 23 und 24 können gemeinsam in vordefinierten Positionen auf der Welle 6 einrastend angebracht werden. Dadurch werden Strahlversätze, die bei einem alleinigen Verschieben der Filterscheibe 23 auftreten könnten, vermieden. Somit kann Anregungslicht der Beleuchtungslichtquelle 15 mit dem Spiegel 10 zunächst in Richtung der ausgewählten Anregungsfilterflächen 23c und 23d abgelenkt werden. Das vollverspiegelte Rad 24 lenkt das Anregungslicht dann auf die gewählten Strahlteilungsfilterflächen 23a und 23b, welche das Beleuchtungslicht auf den Mikroskopstrahlengang aufspiegeln. Von der Probe stammendes Fluoreszenzlicht, das Detektierungslicht 7, wird durch die Strahlteilerfilterflächen 23a und 23b und in Richtung eines rechts außerhalb des Blattes angeordneten Detektors gelenkt. Sind die Zwischenräume zwischen den Filterflächen 23a-23d voll verspiegelt, so wird die Probe in den kurzen Zeiträumen, in denen die Kamera nicht aufnimmt, auch nicht beleuchtet, was das Ausbleichen reduziert.

Eine zu der in Fig.8 gezeigten ähnliche Ausgestaltung ist in Fig.9 gezeigt, hier ist die multifunktionale Filterscheibe 23 zusätzlich noch mit einer Emissionsfilterscheibe 26 starr verbunden, so dass sich alle drei Scheiben gemeinsam auf vordefinierte Positionen schieben lassen, um entsprechend gewählte Filterflächen zu aktivieren. Das Licht der Beleuchtungsquelle 15 wird mit- tels eines festen Spiegels 27 auf den vorausgewählten Anregungsfilter 23c oder 23d der multifunktionalen Filterscheibe 23 gelenkt. Danach lenkt das vollverspiegelte Rad 24 das gefilterte Anregungslicht auf den entsprechend ausgewählten Strahlteilerfilter 23a oder 23b, welcher das Anregungslicht in den Mikroskopstrahlengang einkoppelt. Von der Probe stammendes Detektierungslicht 7 wird zunächst durch den Strahlteilerfilter 23a oder 23b auf der multifunktionalen Filterscheibe 23 transmittert und anschließend durch einen passend gewählten Emissionsfilter 26a oder 26b der Emissionsfilterscheibe 26 von Anregungslichtresten bereinigt und in Richtung des Detektors nach rechts weitergeleitet. In dieser Anordnung sind die inneren Teilkreise der Emissionsfilterscheibe 26 mit reflexunterdrückenden Beschichtungen versehen, da diese von Anregungslicht möglichst reflexfrei durchstrahlt werden sollten. - 14 -

Bezuqszeichenliste

1 , 2 Filterrad

3 erster Teil von Segmenten

4 zweiter Teil von Segmenten

5 Emissionsfilterscheibe

5a, 5b, 5c, 5d Filterschichten

6 Welle

7 Detektierungslicht

8 Kamera

9, 10 Spiegel

1 1 Kamera

12 Spiegel

13a, 13b, 13c Blende

14a, 14b, 14c Kamera

15 Beleuchtungslichtquelle

16a, 16b Spiegel

17 Reflexionsprisma

18 Fotodetektor

19 Steuerleitungen

20 Emissionsfilterscheibe

20a, 20b, 20c Filterschichten

21 Strahlteilerfilterscheibe

21 a, 21 b, 21 c Filterschichten

22 Anregungsfilterscheibe

22a, 22b, 22c Filterschichten

23 Filterscheibe

23a, 23b, 23c Filterschichten

24 vollverspiegelr.es Rad

25 starre Verbindung

26 Emissionsfilterscheibe

26a, 26b Filterschichten

FA, FB, F_C Filter

Claims

Patentansprüche

Mikroskop für die Weitfeldmikroskopie mit einem Detektierungsstrahlengang und einem Beleuchtungsstrahlengang, umfassend

eine im Detektierungsstrahlengang und / oder Beleuchtungsstrahlengang angeordnete Filterradvorrichtung mit mindestens einem Filterrad (1 , 2),

wobei das mindestens eine Filterrad (1 , 2) um eine Achse drehbar gelagert ist, und wobei das mindestens eine Filterrad (1 , 2) in Segmente unterteilt ist,

wobei mindestens in einem ersten Teil (3) der Segmente Filter (F^ F₂, F₃) einen ersten Teilkreis bildend angeordnet sind, so dass sie beim Drehen des Filterrades (1 , 2) nacheinander in den Detektierungsstrahlengang bzw. Beleuchtungsstrahlengang eingebracht werden,

mindestens eine Kamera (8) mit einem Flächendetektor im Detektierungsstrahlengang, die Bilder mit einer vorgegebenen Bildaufnahmefrequenz aufzeichnend ausgestaltet ist, dadurch gekennzeichnet, dass

in mindestens dem ersten Teil (3) der Segmente Filter mindestens einen weiteren Teilkreis bildend angeordnet sind, so dass die Segmente des ersten Teils (3) in radialer Richtung mindestens zwei aufeinanderfolgend angeordnete Filter aufweisen,

die Filterradvorrichtung eine motorisch angetriebene Welle (6) umfasst, auf der das mindestens eine Filterrad (1 , 2) drehbar gelagert ist, und die sich mit einer vorgegebenen Umdrehungsfrequenz drehend ausgebildet ist, und

das Mikroskop eine Ansteuerung zur Synchronisierung von Bildaufnahmefrequenz und Umdrehungsfrequenz in Abhängigkeit von den auf dem mindestens einem Filterrad (1 , 2) angeordneten Filtern aufweist.

Mikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass durch die Synchronisation von Bildaufnahmefrequenz und Umdrehungsfrequenz pro aufgenommenes Bild nicht mehr als ein Filter des ersten Teilkreises im Detektierungsstrahlengang und / oder Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist

Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Filterrad (1 , 2) in einer Pupillenebene des Mikroskopstrahlengangs angeordnet ist.

4. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, das mindestens ein Teil der Filter zwei oder mehr Segmente des ersten Teils (3) von Segmenten überdeckend ausgestaltet ist.

5. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Filter als monolithische Schichten auf einem als Filterrad (1 , 2) dienenden Substrat aufgebracht sind, oder in entsprechende Öffnungen des Filterrades (1 , 2) bevorzugt auswechselbar eingesetzt sind.

6. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterradvorrichtung Mittel zur Umlenkung von Licht, welches von einem ersten Filter (F^ F₂, F₃) in einem Segment des ersten Teils (3) von Segmenten reflektiert wurde, auf einen zweiten Filter (F_A, F_B) in demselben Segment umfasst.

7. Mikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Umlenkung mindestens einen, bevorzugt entlang des Strahlweges verschiebbar angeordneten, Spiegel (9) zur Umlenkung von Licht, welches von einem oder mehreren der Filter reflektiert wurde, auf mindestens einen weiteren Filter im Filterrad (1 , 2) umfassen.

8. Mikroskop nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Umlenkung eine mindestens der Anzahl der Teilkreise entsprechende Zahl von verschließbaren Blenden (13a, 13b, 13c), die den Filtern vor- oder nachgeordnet sind, zur Unterdrückung unerwünschten Lichts umfasst.

9. Mikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterradvorrichtung mindestens einen, bevorzugt entlang dem Strahlweg verschiebbar angeordneten weiteren Spiegel (10) umfasst, der dem mindestens einen Filterrad (1 , 2) im Strahlengang nachgeordnet ist und das Licht auf eine weitere Kamera (1 1 ) mit einem Flächendetektor reflektierend ausgestaltet ist.

10. Mikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Umlenkung ein in den Strahlengang einbringbares Reflexionsprisma (17) zur Versetzung des einfallenden Strahls vor dem Auftreffen auf das Filterrad (1 , 2) umfassen und / oder die von den Filtern nicht bedeckten Bereiche der Segmente des ersten Teils (3) von Segmenten vollständig reflektierend ausgestaltet sind.

1 1 . Mikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Umlenkmittel ein vollverspiegeltes Rad umfassen, welches auf der Welle (6) in einem vorgegebenen Abstand zu dem mindestens einen Filterrad (1 , 2) positioniert ist, starr mit die- sem verbunden und gemeinsam mit diesem auf der Welle (6) zwischen vorgegebenen Positionen verschiebbar ist.

Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Segmenten des ersten Teils (3) jeweils ein Segment eines zweiten Teils (4) von Segmenten angeordnet ist, wobei die Segmente des zweiten Teils (4) reflektierend ausgestaltet sind.

Mikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterradvorrichtung einen an die Ansteuerung gekoppelten lichtempfindlichen Detektor (18) zur Detektierung von Licht, welches von allen gleichzeitig im Strahlengang befindlichen Filtern des Filterrades (1 , 2) reflektiert wurde, umfasst, und die Ansteuerung Schwankungen in der Intensität zur Steuerung der Umlauffrequenz und / oder der Bildaufnahmefrequenz verwendbar ausgestaltet ist.

14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterradvorrichtung Mittel zur Einkopplung von Beleuchtungslicht aufweist.

15. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die Welle (6) mindestens eine Einrastposition zur Aufnahme eines Filterrades (1 , 2) aufweist und das mindestens eine Filterrad (1 , 2) zwischen verschiedenen Einrastpositionen auf der Welle (6) verschiebbar ist.

16. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Filter- radvorrichtung mindestens ein zweites Filterrad (1 , 2) umfasst, wobei das mindestens eine zweite Filterrad (1 , 2) zur Ausrichtung der Filter der Filterräder zueinander gegen das erste Filterrad (1 , 2) und / oder gegen den Drehsinn der Welle (6) rotiert werden kann.

17. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Welle (6) senkrecht zu ihrer Rotationsachse verschiebbar gelagert ist.