WO2013039244A1 - 骨格筋再生促進剤 - Google Patents

骨格筋再生促進剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2013039244A1
WO2013039244A1 PCT/JP2012/073794 JP2012073794W WO2013039244A1 WO 2013039244 A1 WO2013039244 A1 WO 2013039244A1 JP 2012073794 W JP2012073794 W JP 2012073794W WO 2013039244 A1 WO2013039244 A1 WO 2013039244A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
muscle
regeneration
enzyme
skeletal muscle
chondroitinase
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/073794
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
北川　裕之
雅久 三上
Original Assignee
生化学工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 生化学工業株式会社 filed Critical 生化学工業株式会社
Priority to EP12832558.6A priority Critical patent/EP2756849B1/en
Priority to US14/343,960 priority patent/US9144601B2/en
Priority to JP2013533751A priority patent/JP5785619B2/ja
Publication of WO2013039244A1 publication Critical patent/WO2013039244A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01035—Hyaluronoglucosaminidase (3.2.1.35), i.e. hyaluronidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02004—Chondroitin ABC lyase (4.2.2.4), i.e. chondroitinase

Definitions

  • the present invention relates to a skeletal muscle regeneration promoter for muscular diseases or myogenic diseases, and in particular, can enhance the regeneration of muscle fibers of muscular diseases or myogenic diseases without affecting healthy muscle fibers.
  • the present invention relates to a possible skeletal muscle regeneration promoter.
  • the regeneration and enlargement of the muscle is usually performed as follows. That is, when the muscle receives a stimulus such as the load, muscle satellite cells localized between the basement membrane and the plasma membrane of the muscle fiber cells (muscle cells) of the muscle are activated and start to proliferate.
  • the muscle satellite cell corresponds to a stem cell having both the ability to differentiate into cells of multiple lines (multipotency) and the ability to maintain pluripotency even after cell division (self-replication ability).
  • the proliferated myo-satellite cells become myoblasts from which myofiber cells are derived, fuse with existing myofibers, and regenerate and enlarge muscles containing the fused myofibers. Become.
  • the muscle regeneration ability is extremely low, or even if the muscle regeneration ability is present, the muscle fibers easily collapse (wear). To do. For this reason, the muscular disease patient often has a collapse rate higher than the muscle regeneration rate, and often causes muscle atrophy.
  • Non-Patent Documents 1-3 Although many methods for increasing (improving) the muscle regeneration rate have been reported as methods for treating the above-mentioned muscle diseases or myogenic diseases (Non-Patent Documents 1-3), at present, satisfactory treatment This is a situation where no method has been established.
  • the chondroitin sulfate (CS) is a major extracellular matrix component in the nervous system and a component involved in the formation of a neural network.
  • the chondroitin sulfate (CS) is a component that inhibits the regeneration of the axon in the adult cranial nervous system that has received traumatic disorders such as spinal cord injury. That is, the chondroitin sulfate (CS) becomes both a necessary component and an inhibitory component depending on the situation.
  • chondroitinase degrading enzyme derived from bacteria that degrades chondroitin sulfate (CS) expressed at the site
  • ChABC chondroitinase ABC
  • the enzyme ABC acts on the chondroitin sulfate (CS), and the chondroitin sulfate (CS) is decomposed (removed).
  • the inhibitory component of axon regeneration disappears in the nervous system, regeneration of the axon is promoted, and not only a new neural network is constructed, but also recovery of nerve function is realized. Many such examples have been reported (Non-patent Documents 4-6).
  • intervertebral hernia An example of a disease accompanied by a compression disorder in the nervous system is intervertebral hernia.
  • the intervertebral disc herniation is a disease caused by protrusion of the nucleus pulposus in the intervertebral disc, and the protruding nucleus pulposus stimulates nerves in the vicinity of the nucleus pulposus, so that symptoms such as low back pain appear.
  • JP-A-11-147837 discloses a pharmaceutical composition for administration to the spinal epidural space, which contains a glycosaminoglycan degrading enzyme and a pharmaceutical carrier.
  • the glycosaminoglycan degrading enzyme is an enzyme that degrades glycosaminoglycan into unsaturated oligosaccharides and unsaturated disaccharides, and corresponds to chondroitinase that degrades chondroitin sulfate (CS).
  • the nucleus pulposus of the herniated disc that has migrated to the spinal epidural space can be efficiently digested, and inflammatory cells Promotes phagocytosis of nucleus pulposus.
  • the invention described in Patent Document 1 has the effect that the epidural migrating nucleus pulposus is eliminated very efficiently and effectively, and the spinal cord is not affected at all.
  • Patent Document 2 discloses an elastic fiber formation promoter containing an enzyme that degrades chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate B, and chondroitin sulfate C.
  • the elastic fiber formation promoter is administered to the site of the hypertrophic scar or keloid, thereby reducing the tissue volume of the hypertrophic scar or keloid or normalizing the tissue leading to the radical treatment of the keloid. The process can also be evaluated.
  • chondroitinases such as ChABC, chondroitinase AC, chondroitinase ACII, chondroitinase ACIII, chondroitinase B, chondroitinase C, chondroitin sulfate ABC exolyase, and recently Hyal. It is known that mammalian-derived hyaluronic acid-degrading enzymes such as -1 and PH-20 also have an activity of decomposing CS (Non-patent Documents 7 and 8).
  • Non-Patent Documents 1-6 and Patent Documents 1 and 2 do not describe the treatment of the above-mentioned muscle diseases or myogenic diseases, and there is a problem that these treatment methods have not been established at present. is there.
  • an object of the present invention is to provide a skeletal muscle regeneration promoter capable of enhancing the regeneration of muscle fibers of myogenic diseases.
  • the present inventor has completed the novel skeletal muscle regeneration promoter according to the present invention as a skeletal muscle regeneration promoter for muscular diseases or myogenic diseases.
  • the skeletal muscle regeneration promoter according to the present invention contains an enzyme that degrades chondroitin sulfate as an active ingredient, and is administered to the muscle fiber of a mammal having a muscle disease or myogenic disease, thereby regenerating the muscle fiber.
  • a skeletal muscle regeneration promoter that enhances is an enzyme that degrades chondroitin sulfate used to promote skeletal muscle regeneration in muscular diseases or myogenic diseases, and is used in the muscle fibers of mammals with muscular diseases or myogenic diseases.
  • the present invention relates to the enzyme that enhances regeneration of the muscle fiber by being administered.
  • Another aspect of the present invention includes a step of administering an enzyme that degrades chondroitin sulfate in an amount effective for skeletal muscle regeneration to a muscle fiber of a muscle disease or myogenic disease mammal.
  • the present invention relates to a method for promoting skeletal muscle regeneration in a disease.
  • the enzyme is chondroitin sulfate (CS) present in the outer periphery of the muscle fiber (cell). ) Will be disassembled. Therefore, inhibition of muscle fiber regeneration by the chondroitin sulfate (CS) can be eliminated, and regeneration and hypertrophy of the muscle fiber can be enhanced.
  • the enzyme has very little side effect on healthy muscle fibers that are neither the muscle disease nor the myogenic disease, and is very safe. Therefore, the skeletal muscle regeneration-promoting agent of the present invention is effective as a skeletal muscle regeneration-promoting agent with excellent safety that is limited to muscle fibers of the muscle disease or the myogenic disease.
  • the enzyme is derived from a mammal having the activity of degrading chondroitinase ABC, chondroitinase AC, chondroitinase ACII, chondroitinase ACIII, chondroitinase B, chondroitinase C, chondroitin sulfate ABC exolyase, chondroitin sulfate Any of the hyaluronic acid-degrading enzymes can be included.
  • the myogenic disease is any of congenital or progressive muscular dystrophy, congenital or distal myopathy, myotonic dystrophy, myotonia syndrome, mitochondrial disease, periodic limb paralysis, malignant hyperthermia, ion channel disease. Can be configured to include.
  • the skeletal muscle regeneration promoter can be configured to be an injectable preparation containing the enzyme as an active ingredient.
  • the enzyme dosage may be 0.1 mIU / g to 10.0 mIU / g per administration.
  • the enzyme is administered at a predetermined concentration in the range of 0.5 IU / mL to 200.0 IU / mL at a plurality of doses over a predetermined region of the myofiber, with a dose of 1 ⁇ L to 5000 ⁇ L. It can be configured to be in form.
  • the skeletal muscle regeneration promoting agent may be configured to be used in combination with a treatment including either stem cell treatment or treatment using a myostatin inhibitor derived from a cytokine having a function of suppressing muscle mass. I can do it.
  • a therapeutic agent for myopathy or myogenic disease comprising an enzyme that degrades chondroitin sulfate as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention relates to an enzyme that degrades chondroitin sulfate used to treat muscle diseases or myogenic diseases.
  • Another aspect of the present invention includes the step of administering an enzyme that degrades chondroitin sulfate in an amount effective for treating a muscular disease or myogenic disease to a muscular disease or myogenic disease mammal,
  • the present invention relates to a method for treating myogenic diseases. More specifically, the present invention is as follows. (1) A skeletal muscle regeneration promoter for muscle diseases or myogenic diseases, which contains an enzyme that degrades chondroitin sulfate as an active ingredient, and is administered to muscle fibers of mammals with muscle diseases or myogenic diseases And a skeletal muscle regeneration promoter that enhances the regeneration of the muscle fibers.
  • the enzyme has chondroitinase ABC, chondroitinase AC, chondroitinase ACII, chondroitinase ACIII, chondroitinase B, chondroitinase C, chondroitin sulfate ABC exolyase, and chondroitin sulfate decomposing activity.
  • the skeletal muscle regeneration-promoting agent according to (1) comprising any of mammal-derived hyaluronic acid-degrading enzymes.
  • the myogenic disease is any of congenital or progressive muscular dystrophy, congenital or distal myopathy, myotonic dystrophy, myotonia syndrome, mitochondrial disease, periodic limb paralysis, malignant hyperthermia, ion channel disease
  • the skeletal muscle regeneration promoting agent according to (1) or (2).
  • the skeletal muscle regeneration promoter according to any one of (1) to (4), wherein the dose of the enzyme is 0.1 mIU / g to 10.0 mIU / g per administration.
  • the enzyme is administered in a predetermined concentration range of 0.5 IU / mL to 200.0 IU / mL at a plurality of doses over a predetermined region of the muscle fiber, each dose ranging from 1 ⁇ L to 5000 ⁇ L.
  • the skeletal muscle regeneration promoter according to any one of (1) to (5), wherein (7)
  • the skeletal muscle regeneration-promoting agent is used in combination with a treatment including a stem cell treatment or a treatment using a myostatin inhibitor derived from a cytokine having a function of suppressing muscle mass, (1)
  • the skeletal muscle regeneration promoter according to any one of (6) to (6).
  • a therapeutic agent for muscular diseases or myogenic diseases comprising an enzyme that degrades chondroitin sulfate as an active ingredient.
  • the skeletal muscle regeneration promoter for muscle diseases or myogenic diseases can enhance the regeneration of muscle fibers of myopathy or myogenic diseases without affecting healthy muscle fibers.
  • the present invention can also be used as a skeletal muscle promoting reagent.
  • CTX + ChABC It is a bar graph which shows an example of the cross-sectional area of the cell in the muscle fiber of a 1st mouse
  • CX laminin / Hoechst observation of the muscular fiber of the mdx mouse
  • the skeletal muscle regeneration promoter according to the present invention is a skeletal muscle regeneration promoter for muscular diseases or myogenic diseases. Furthermore, the skeletal muscle regeneration-promoting agent according to the present invention contains an enzyme that degrades chondroitin sulfate (CS) as an active ingredient, and is administered to the muscle fibers of mammals with muscular diseases or myogenic diseases. It is a skeletal muscle regeneration promoter that enhances fiber regeneration.
  • CS chondroitin sulfate
  • the enzyme contained as an active ingredient is not particularly limited as long as it is an enzyme that degrades chondroitin sulfate (CS) present around muscle fibers (cells).
  • chondroitinase such as chondroitinase ABC (ChABC), chondroitinase AC, chondroitinase ACII, chondroitinase ACIII, chondroitinase B, chondroitinase C, chondroitin sulfate ABC exolyase is used. I can do it.
  • it may be an enzyme having the activity of degrading chondroitin sulfate (CS).
  • hyaluronic acid-degrading enzymes derived from mammals such as HYAL-1 and PH-20 can also be used (Non-patent Documents 7 and 8).
  • chondroitinase ABC is derived from, for example, Proteus vulgaris
  • chondroitinase AC is derived from, for example, Flavobacterium heparinum
  • chondroitinase ACII is derived from, for example, Arthrobacter aurescens
  • chondroitinase ACIII is derived from, for example, Flavobacterium sp. Hp102.
  • chondroitinase B is derived from, for example, Flavobacterium heparinum
  • chondroitinase C is derived from, for example, Flavobacterium sp. Hp102.
  • the enzyme may be one kind of enzyme or a mixture of plural kinds of enzymes. Moreover, the enzyme described in this specification includes both meanings.
  • the enzyme is preferably ChABC or a mammal-derived hyaluronic acid-degrading enzyme from the viewpoint of enhancing the degradation of chondroitin sulfate (CS), and if it is the ChABC, it is more preferably ChABC derived from Proteus vulgaris.
  • the skeletal muscle regeneration promoter containing the enzyme can be prepared and prepared by a pharmacologically known method.
  • the skeletal muscle regeneration promoter may be in a solution state, a frozen state, a dry state, or the like.
  • the skeletal muscle regeneration promoter containing the enzyme is mainly used for injectable preparations.
  • the injectable preparation is filled and sealed in an appropriate container such as an ampoule, a vial, an injection syringe, and distributed as it is, Alternatively, it can be stored and used for administration as an injection.
  • the injectable preparation is kept sealed in the container, distributed or stored, and distilled for injection before administration. It can be dissolved in a solvent (solvent) such as water, (phosphate buffered) physiological saline, glucose aqueous solution, or sorbitol aqueous solution, and used as an injection.
  • solvent solvent
  • the muscle disease is not particularly limited as long as it is a non-genetic disease in which a mammalian muscle is damaged.
  • the muscular disease include dermatomyositis, polymyositis, nodular polyarteritis, polymyalgia rheumatica, SLE (systemic lupus erythematosus), rheumatoid arthritis, Sjogren's syndrome, systemic scleroderma, mixed connective tissue Endocrine diseases such as collagen diseases such as Alzheimer's disease, toxoplasmosis, trichomoniasis, purulent myositis, gas gangrene, necrotizing myositis, inflammatory myopathy including acute viral myositis, hypothyroidism, hyperthyroidism Toxic muscle diseases, hyperlipidemia drugs, toxic muscle diseases such as steroids, and the like.
  • the muscle disease is different from a myogenic disease (myopathy) that causes muscle atrophy due to the muscle itself, but a nerve that causes muscle atrophy due to anterior spinal cord cell and peripheral nerve damage. Since neuropathies are also applicable, examples of such muscular diseases include infant spinal muscular atrophy (Welndich Hoffmann's disease), Charco Marie-Tooth disease, congenital myelin dysplasia, and muscular atrophic lateral cord. It may include sclerosis.
  • the myogenic disease is not particularly limited as long as it is a genetic disease that damages muscles of mammals.
  • the myogenic diseases include ion channels including congenital or progressive muscular dystrophy, congenital or distal myopathy, myotonia syndrome including myotonic dystrophy, mitochondrial disease, periodic limb paralysis, and malignant hyperthermia. Diseases are listed.
  • the muscular dystrophy include Duchenne muscular dystrophy and Becker muscular dystrophy.
  • the myogenic disease is preferably muscular dystrophy from the viewpoint of enhancement of muscle fiber regeneration due to degradation of chondroitin sulfate (CS), and more preferably Duchenne muscular dystrophy among the muscular dystrophy.
  • CS chondroitin sulfate
  • the mammal is not particularly limited as long as it is a mammal having muscle fibers (cells) of muscle disease or myogenic disease.
  • Examples of the mammal include humans, chimpanzees, dogs, rats, and mice.
  • the method of administering the skeletal muscle regeneration-promoting agent containing chondroitinase to the muscle fiber of a mammal having the muscle disease or the myogenic disease is characterized by penetrating the skeletal muscle regeneration promoting agent around the muscle fiber cells. If it is the method of making it, it will not specifically limit. Examples of the administration method include subcutaneous administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, intrarectal administration, and transdermal administration, and intramuscular administration is preferred.
  • the dosage of the enzyme is not particularly limited as long as it is a dosage that enhances regeneration of the muscle fibers.
  • the dosage of the enzyme is preferably, for example, 0.1 mIU / g to 10.0 mIU / g per administration, from the viewpoint of enhancing muscle fiber regeneration due to the degradation of the chondroitin sulfate (CS). If a human body weight of 60 kg is targeted, for example, the dose of the enzyme may be in the range of 0.1 mIU / g to 6.7 mIU / g.
  • the administration form of the enzyme is not particularly limited as long as it is an administration form that enhances regeneration of the muscle fibers.
  • an enzyme having a predetermined concentration in the range of 0.5 IU / mL to 200.0 IU / mL is administered at a plurality of doses over a predetermined region of the muscle fiber in a dose range of 1 ⁇ L to 5000 ⁇ L.
  • chondroitin sulfate (CS) expressed in a predetermined region of the muscle fiber can be comprehensively decomposed, which is preferable from the viewpoint of enhancement of muscle fiber regeneration due to degradation of the chondroitin sulfate (CS).
  • the enzyme is ChABC
  • a plurality of locations for example, 2 to 10 locations
  • each dose of 30 ⁇ L The muscle fibers can be regenerated and hypertrophy can be enhanced.
  • the subject is a human with a body weight of 60 kg, for example, the normal intramuscular dose may be in the range of 1000 ⁇ L to 2000 ⁇ L.
  • 1U (unit) of the enzyme in the present specification is defined as the amount of enzyme that liberates 1 micromole of reaction product per minute from the enzyme under conditions near the optimum pH and the optimum temperature.
  • 1 U of ChABC is defined as the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide from chondroitin 6-sulfate per minute at pH 8.0 and 37 ° C. The same applies to various chondroitinases.
  • the enzyme is preferably an enzyme that is purified to the extent that it can be used as a skeletal muscle regeneration promoter (medicine or therapeutic agent) and does not substantially contain a substance that is not allowed to be mixed as a skeletal muscle regeneration promoter.
  • the enzyme preferably has a specific activity of a predetermined value or more.
  • the enzyme is preferably purified to have a specific activity of 100 U / mg protein or more. More preferably, the enzyme is purified to have a specific activity of 300 U / mg protein or more.
  • the skeletal muscle regeneration promoter according to the present invention as long as it contains the enzyme as an active ingredient, conventional excipients, binders, lubricants, colorants, disintegrants, buffers, isotonic agents, Additives used in normal skeletal muscle regeneration promoters (medicines) such as preservatives and soothing agents may be included.
  • the enzyme when used as an injectable preparation, the enzyme is used in a solvent such as distilled water for injection, (phosphate buffered) physiological saline, glucose aqueous solution, or sorbitol aqueous solution.
  • a solvent such as distilled water for injection, (phosphate buffered) physiological saline, glucose aqueous solution, or sorbitol aqueous solution.
  • a solution in which only a predetermined concentration is dissolved may be prepared, and the prepared solution may be used as an injectable preparation.
  • a section of a mouse (skeletal) muscle fiber to be evaluated for muscle fiber regeneration is removed by cutting the muscle fiber of the anterior tibial muscle of the mouse in a direction perpendicular to the muscle fiber.
  • the excised section becomes a cross section perpendicular to the muscle fiber by the cutting method, and becomes a cross section in the short direction of the muscle fiber.
  • the sections are snap frozen in isopentane cooled with liquid nitrogen to prevent muscle fiber collapse.
  • the rapidly frozen section is prepared as a section having a thickness of 10 ⁇ m using a cryostat, attached on an APS (aminosilane) -coated slide glass (manufactured by Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.), and dried on a paraffin extender. Thereafter, it is stored at ⁇ 80 ° C. Thereby, the slice for evaluation can be obtained.
  • APS aminonosilane
  • a paraffin extender manufactured by Matsunami Glass Industrial Co., Ltd.
  • the immobilized section was washed with PBS, treated with MOM mouse Ig blocking reagent containing 2% goat serum (MOM-Immunodetection-kit reagent, Vector UK), and allowed to stand for 1 hour for blocking. Process.
  • anti-laminin antibody manufactured by Sigma
  • anti-CS stump antibody 2-B-6
  • MOM Immunodetection kit reagent Vector
  • a mixed solution is prepared as a primary antibody.
  • the anti-laminin antibody is diluted 400 times by volume with respect to the M.O.M. diluted solution
  • the anti-CS stump antibody is diluted 200 times by volume with respect to the M.O.M. diluted solution.
  • the anti-laminin antibody is an antibody that recognizes laminin present in the basement membrane of muscle fibers (cells), and a secondary antibody that recognizes the anti-laminin antibody [Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG By combining with (H + L) (manufactured by Invitrogen)], the outer edge of the muscle fiber can be observed as green fluorescence.
  • the anti-CS stump antibody is an antibody that recognizes a chondroitin sulfate (CS) stump structure that is degraded by an enzyme that degrades the chondroitin sulfate (CS).
  • chondroitin sulfate (CS) stump structure in muscle tissue sections is red. Can be detected as fluorescence.
  • the prepared primary antibody is dropped onto the section after the blocking treatment, reacted at 4 ° C. overnight, and the section after the reaction is washed three times with the PBS.
  • Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG H + L
  • Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1 Gamma1
  • the Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG H + L
  • the Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1 gamma 1
  • the prepared secondary antibody is added dropwise to the washed section, reacted at 37 ° C. for 1 hour, and the reacted section is washed three times with the PBS.
  • Hoechst 33342 manufactured by Invitrogen
  • diluted with the PBS is added dropwise to the washed section and reacted at room temperature for 20 minutes.
  • the Hoechst 33342 is diluted 500 times with respect to the PBS.
  • the Hoechst 33342 stains the central nucleus of the muscle fiber in a fluorescent blue color, whereby the central nucleus of the muscle fiber can be observed.
  • the section after the reaction was appropriately washed with the PBS, the section after the washing was sealed using a predetermined mounting agent (FLUOROSHIELD, manufactured by ImmunoBioScience Corp.), and a predetermined all-in-one fluorescence microscope (BZ-800, KEYENCE Observed).
  • the setting condition of the all-in-one fluorescence microscope is set to change the fluorescent blue color in the digitized image to a red pseudo color in order to clarify the presence (localization) of the nucleus in the muscle fiber.
  • the skeletal muscle regeneration-promoting agent according to the present invention aseptically removes chondroitinase ABC (EC4.2.2.4, manufactured by Seikagaku Corporation) (ChABC), which is an enzyme that degrades chondroitin sulfate (CS).
  • ChoABC chondroitinase ABC
  • Somnopentyl (manufactured by Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.) was intraperitoneally administered to a wild-type mouse (C57BL / 10 strain, equivalent to about 20 g, manufactured by Japan SLC Co., Ltd.) after 5 weeks (weeks old) to 6 weeks of age and anesthetized. Then, 30 ⁇ L of the injectable preparation was administered to the anterior tibial muscle of the left hind limb of the wild type mouse using a predetermined syringe. Therefore, the dosage of the injectable preparation is a dosage corresponding to 60 mIU at a time with respect to the ChABC. For the mouse, the dose of ChABC is 3.0 mIU / g.
  • muscle fiber sections were prepared according to (1-1)-(1-2), and fluorescence observation was performed.
  • FIG. 1 shows an example of ⁇ CS observation and Laminin / Hoechst observation of healthy mouse muscle fibers 7 days after administration of physiological saline (Vehicle), and muscle fibers of healthy mice 7 days after administration of ChABC. It is a figure which shows an example of (DELTA) CS observation of this and Laminin / Hoechst observation. In addition, the scale bar of the white horizontal line in the lower left is 100 ⁇ m.
  • chondroitin sulfate (CS) in muscle tissue is degraded by the administration of ChABC, but hardly affects muscle fiber regeneration and hypertrophy in healthy mice. In other words, the administration of ChABC has almost no side effects on healthy muscles, suggesting that it is very safe.
  • CTX Naja mossambica mossambica-derived cardiotoxin
  • cobra venom Naja mossambica mossambica-derived cardiotoxin
  • the CTX is characterized in that it does not affect (disturb) any cells involved in the regeneration of the muscle, such as muscle satellite cells, blood vessels, and peripheral nerves. Therefore, even if the CTX is administered to the muscle, the regeneration of the muscle fiber will eventually be started.
  • necrosis of muscle fibers starts immediately after administration of CTX, and macrophages invade the necrotic muscle fibers after 24 hours (1 day) immediately after administration. After 72 hours (3 days) immediately after the administration, muscle stem cells showing muscle fiber regeneration begin to appear.
  • administration of the CTX to muscles can cause a pseudo-disease (damage) in the muscle fibers of the muscles (for example, Jin, Y., 5 others, “Acta Neuropathol. 99”, 2000, see pages 619-627).
  • a mouse in which the CTX is administered to the (skeletal) muscle is used as a muscle injury (disease) model mouse, and the ChABC is further administered to the mouse in the muscle injury model to regenerate the muscle of the mouse in the muscle injury model. Whether to enhance the process was investigated.
  • CTX was prepared as an injectable preparation adjusted to the above concentration with physiological saline and administered by a syringe.
  • a wild-type mouse different from the first mouse was prepared, and only 30 ⁇ L of the CTX at the above concentration was administered to the front tibial muscle of the left hind limb of the wild-type mouse, and 3 days had passed after the administration. Later, 30 ⁇ L of the predetermined concentration (2.0 IU / mL) of ChABC was additionally administered to the anterior tibial muscle, and the mouse was used as a second mouse.
  • the dose of ChABC is 60 mIU at a time.
  • a wild-type mouse different from the first mouse and the second mouse is prepared, and a mixed solution of CTX and ChABC (concentration of CTX in the mixed solution) is added to the front tibial muscle of the left hind limb of the wild-type mouse. : 10 ⁇ M, ChABC concentration: 2.0 IU / mL) was administered at 30 ⁇ L, and the mouse was used as the third mouse.
  • the mixed amount of ChABC corresponds to the above-mentioned dose and is 60 mIU.
  • muscle fiber sections were prepared according to the above (1-1)-(1-3), and fluorescence observation and image analysis were performed.
  • the fluorescence observation was the Laminin / Hoechst observation
  • the image analysis was the cross-sectional area of muscle fiber cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of Laminin / Hoechst observation of muscle fibers of a first mouse (CTX), a second mouse (CTX >> ChABC), and a third mouse (CTX + ChABC).
  • CTX Laminin / Hoechst observation of muscle fibers of a first mouse
  • CTX a second mouse
  • CTX + ChABC a third mouse
  • the scale bar of the white horizontal line in the lower left is 100 ⁇ m.
  • FIG. 3 is a bar graph showing an example of the cross-sectional area of cells in the muscle fibers of the first mouse (CTX), the second mouse (CTX >> ChABC), and the third mouse (CTX + ChABC).
  • * shown in FIG. 3 shows the t test of P ⁇ 0.01.
  • the cross-sectional area of the cells in the muscle fibers of the first mouse is significantly larger than the cross-sectional area of the cells in the muscle fibers of the first mouse Is felt.
  • the ChABC when the ChABC is administered to the muscle of a mouse of a muscle damage model corresponding to a muscle disease, the ChABC degrades chondroitin sulfate (CS) that inhibits the regeneration of muscle fibers, and the regeneration and enlargement of the muscle fibers. It is understood that enhances.
  • CS chondroitin sulfate
  • the cross-sectional area of the cells in the muscle fibers of the third mouse (CTX + ChABC) is compared with the cross-sectional area of the cells in the muscle fibers of the second mouse (CTX >> ChABC) as shown in FIG. It is felt that it is significantly large. Therefore, the ChABC is more effective for regeneration and hypertrophy of the muscle fibers when the CTX is administered to the muscle, in other words, when the CTX is administered at the same time as the necrosis of the muscle fibers is initiated by the CTX. Is understood.
  • the inventor has inferred about this as follows. That is, in the third mouse (CTX + ChABC), the CTX penetrates into the muscle fibers, and at the same time, the ChABC administered together with the CTX penetrates into the muscle fibers and is expressed around the muscle fibers. Degrads chondroitin sulfate (CS) immediately. Therefore, it is assumed that the chondroitin sulfate (CS) is decomposed during the regeneration of the muscle fibers, effectively preventing the regeneration of the muscle fibers and increasing the regeneration rate.
  • the skeletal muscle regeneration promoter according to the present invention is administered to the muscle of the myogenic disease model mouse to regenerate the muscle fibers. Whether to enhance the process was investigated.
  • mice in which the dystrophin protein is deficient on the muscle fiber membrane due to mutations in the dystrophin gene begin to cause necrosis of their own muscle fibers after the lapse of 3 weeks and also cause regeneration of muscle fibers after necrosis.
  • the so-called Duchenne muscular dystrophy myogenic disease has occurred in the mdx mice.
  • ChABC ChABC at a predetermined concentration (2.0 IU / mL) is applied to the anterior tibial muscle of the left hind limb of an mdx mouse (C57BL / 10 strain, approximately 20 g, manufactured by CLEA Japan, Inc.) after 5 to 6 weeks of age. Only administered.
  • the dose of ChABC is 60 mIU at a time.
  • 30 ⁇ L of physiological saline was administered to the anterior tibial muscle of the right hind limb of the mdx mouse.
  • the fluorescence observation was the Laminin / Hoechst observation
  • the image analysis was the ratio of myofiber cells having no central nucleus.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of Laminin / Hoechst observation of muscle fibers of an mdx mouse 3 days after administration of physiological saline (Vehicle) and ChABC.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of Laminin / Hoechst observation of muscle fibers of mdx mice 7 days after administration of physiological saline (Vehicle) and ChABC.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of Laminin / Hoechst observation of muscle fibers of mdx mice 14 days after administration of physiological saline (Vehicle) and ChABC. 4 to 6 have the same dimensions, and the scale bar of the lower left white horizontal line in FIG. 6 is 100 ⁇ m.
  • FIG. 7 is a bar graph showing an example of the proportion of cells without a central nucleus in muscle fibers of mdx mice 3 days, 7 days and 14 days after administration of physiological saline (Vehicle) and ChABC.
  • * shown in FIG. 7 shows the t test of P ⁇ 0.005.
  • the ratio of cells without the central nucleus in the muscle fibers of mdx mice 14 days after the administration of ChABC is lower than that in muscle fibers of mdx mice after 7 days. ing. This is probably because the effect of administration of ChABC disappeared.
  • the ratio of the cells without the central nucleus in the muscle fibers of the mdx mice administered with the ChABC was higher than that in the muscle fibers of the mdx mice administered with the physiological saline. It is felt that it is very high.
  • the inventor believes that the enhancement of muscle fiber regeneration by administration of the ChABC is effective only for a predetermined period, but if the ChABC is repeatedly administered at a predetermined period, We believe that it can help prevent or delay myogenic necrosis.
  • mice were mainly employed as mammals and the pharmacological pharmacological test of ChABC was carried out.
  • similar effects can be obtained even in other mammals such as humans. Presumed to be possible.
  • ChABC is used as the enzyme that degrades chondroitin sulfate (CS).
  • CS chondroitin sulfate
  • a chondroitinase such as chondroitinase AC, chondroitinase ACII, chondroitinase ACIII, chondroitinase B, chondroitinase C, chondroitin sulfate ABC exolyase is employed, the same effect is obtained.
  • any enzyme may be used as long as it is an enzyme that also has the activity of degrading chondroitin sulfate (CS), that is, an enzyme that substantially degrades chondroitin sulfate (CS).
  • CS chondroitin sulfate
  • hyaluron such as HYAL-1
  • HYAL-1 Even if an acid-degrading enzyme is employed, the same effect can be obtained.
  • the mdx mouse muscular dystrophy was adopted as the myogenic disease. However, considering the principle, it does not depend on the type of the myogenic disease. Even if a myogenic disorder including any of muscular dystrophy, congenital or distal myopathy, myotonic dystrophy, myotonia syndrome, mitochondrial disease, periodic limb paralysis, malignant hyperthermia, or ion channel disease is the same Has the effect of.
  • the skeletal muscle regeneration promoter contains an enzyme that degrades chondroitin sulfate (CS) as an active ingredient, and is administered to muscle fibers of mammalian muscular diseases or myogenic diseases. It is a skeletal muscle regeneration promoter that enhances muscle fiber regeneration.
  • CS chondroitin sulfate
  • the enzyme when a skeletal muscle regeneration promoter containing the enzyme is administered to the muscle fiber of the muscle disease or the myogenic disease, the enzyme degrades chondroitin sulfate (CS) present in the outer periphery of the muscle fiber. Will do. Therefore, inhibition of muscle fiber regeneration by the chondroitin sulfate (CS) can be eliminated, and regeneration and hypertrophy of the muscle fiber can be enhanced.
  • the enzyme has very little side effect on healthy muscle fibers that are neither the muscle disease nor the myogenic disease, and is very safe. Therefore, the skeletal muscle regeneration-promoting agent of the present invention is effective as a skeletal muscle regeneration-promoting agent with excellent safety that is limited to muscle fibers of the muscle disease or the myogenic disease.
  • the skeletal muscle regeneration promoter according to the present invention is useful as a skeletal muscle regeneration promoter for myogenic diseases such as muscular dystrophy, as well as normal muscle diseases, and affects healthy muscle fibers.
  • myogenic diseases such as muscular dystrophy, as well as normal muscle diseases, and affects healthy muscle fibers.
  • it is effective as a skeletal muscle regeneration promoter that can enhance the regeneration of muscle fibers of muscle diseases or myogenic diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤であって、有効成分としてコンドロイチナーゼを含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与することで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤を提供する。これにより、前記コンドロイチナーゼが、前記筋線維の外周囲に存在するコンドロイチン硫酸を分解するため、前記コンドロイチン硫酸による筋線維の再生の阻害を消失させ、当該筋線維の再生、肥大化を亢進させることが可能となる。

Description

骨格筋再生促進剤
　本発明は、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤に関し、詳しくは、健全な筋線維に影響を及ぼすことなく、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維の再生を亢進させることが可能な骨格筋再生促進剤に関する。
　ヒトを含む健全な哺乳動物の筋（筋肉、筋組織）に過剰な負荷を与えると、当該筋の一部は損耗するが、通常、当該筋は、再生能力を有しており、前記損耗した筋の一部は、前記負荷に耐えるために、速やかに再生され、肥大化する。
　前記筋の再生及び肥大化は、通常、以下のようになされる。即ち、前記筋が前記負荷などの刺激を受けると、当該筋の筋線維の細胞（筋細胞）の基底膜と形質膜との間に局在する筋衛星細胞が活性化し、増殖を開始する。ここで、前記筋衛星細胞とは、複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を兼ね備える幹細胞に対応する。そして、前記増殖した筋衛星細胞は、筋線維の細胞の由来となる筋芽細胞となって、既存の筋線維と融合し、当該融合された筋線維を含む筋が再生、肥大化することになる。
　一方、何らかの理由により筋に損傷（疾患）を有する筋疾患患者は、前記筋の再生能力が極めて低下していたり、当該筋の再生能力があったとしても前記筋線維が容易に崩壊（損耗）したりする。そのため、前記筋疾患患者は、前記筋の再生速度よりも崩壊速度が上回り、筋萎縮を招く場合が多い。
　又、前記筋疾患のうち、代表的な筋原性疾患である筋ジストロフィーの患者では、前記筋線維の崩壊と再生が繰り返し生じているにも関わらず、健常者と比較して、前記筋線維の崩壊速度が前記筋線維の再生速度よりも速い。そのため、前記筋原性疾患患者は、自己の筋の萎縮が次第に進行し、その結果、若年期で死に至ることになる。
　上述した筋疾患又は筋原性疾患の治療方法として、前記筋の再生速度を亢進（向上）させる方法が、多数、報告されているものの（非特許文献１－３）、現時点では、良好な治療方法が確立されていない状況である。
　ところで、神経再生医療において、損傷した軸索を再生（伸長）する方法として、神経系の細胞外に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する方法が挙げられる。
　前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、神経系において主要な細胞外マトリックス成分であり、神経回路網の形成に関与する成分である。一方、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、脊髄損傷などの外傷性障害を受けた成体の脳神経系において前記軸索の再生を阻害する成分となる。つまり、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、場面に応じて、必要成分にも阻害成分にもなるのである。
　そこで、前記外傷性傷害を受けた神経損傷部位に、当該部位に発現したコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する細菌由来のコンドロイチン分解酵素、例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣｈＡＢＣ）を投与すると、当該コンドロイチナーゼＡＢＣが前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）に作用し、当該コンドロイチン硫酸（ＣＳ）が分解（除去）される。すると、前記神経系において軸索の再生の阻害成分が消失するため、当該軸索の再生が促進され、新たな神経回路網が構築されるだけでなく、神経機能の回復も実現される。このような例は、多数、報告されている（非特許文献４－６）。
　又、前記神経系における圧迫障害を伴う疾患として、椎間板ヘルニアが挙げられる。前記椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核の突出などに起因する疾患であり、突出した髄核が当該髄核付近の神経を刺激するため、腰痛などの症状が現れる疾患である。
　前記椎間板ヘルニアの治療について、特開平１１－１４７８３７号公報（特許文献１）には、グリコサミノグリカン分解酵素及び医薬担体を含有する、脊髄硬膜外腔投与用の医薬組成物が開示されている。前記グリコサミノグリカン分解酵素とは、グリコサミノグリカンを不飽和オリゴ糖および不飽和二糖に分解する酵素で、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解するコンドロイチナーゼに対応する。ここでは、前記コンドロイチナーゼを含む医薬組成物を脊髄硬膜外腔内に投与することで、当該脊髄硬膜外腔に遊走した椎間板ヘルニアの髄核を効率的に消化し、又、炎症細胞による髄核の貪食を促進する。その結果、前記特許文献１に記載の発明では、極めて効率的且つ有効に硬膜外遊走髄核を消失させ、更に、脊髄に全く影響を与えないという効果を有するとしている。
　又、前記コンドロイチナーゼが、肥厚性瘢痕やケロイドの治療に適用された例がある。例えば、国際公開第２００９／０７２６５４号（特許文献２）には、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｃを分解する酵素を含有する、弾性線維形成促進剤が開示されている。ここでは、前記弾性線維形成促進剤を、前記肥厚性瘢痕やケロイドの部位に投与することで、当該肥厚性瘢痕やケロイドの組織体積の縮小や当該ケロイドなどの根治治療へつながる組織の正常化の過程も評価することが可能となるとしている。
　ＣＳを分解する酵素として、ＣｈＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼなどのコンドロイチナーゼがあるが、近年、Hyal-1やPH-20などの哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素にもＣＳを分解する活性があることが知られている（非特許文献７、８）。
埜中征哉、「臨床神経学 12」、１９９８年、ｐ．997-1000 Grounds, M. D.、「Curr. Opin. Neurol. 12」、１９９９年、ｐ．535-543 Anderson, J. E.、「Biochem. Cell Biol. 76」、１９９８年、ｐ．13-26 Bradbury, E. J.、外７名、「Nature 416」、２００２年、ｐ．636-640 Silver, J.、外１名、「Net. Rev. Neurosci. 5」、２００４年、ｐ．146-156 Carulli, D.、外３名、「Curr. Opin. Neurobiol. 15」、２００５年、ｐ．116-120 Robert, S and Mark J. J.、「Chem. Rev. 106」、２００６年、p．818-839 Hafida, E. H.、「Arthritis Res Ther 7」、２００５年、p．R756-R768
特開平１１－１４７８３７号公報 国際公開第２００９／０７２６５４号
　しかしながら、前記非特許文献１－６、前記特許文献１、２には、上述した筋疾患又は筋原性疾患の治療について記載がなく、現時点では、これらの治療方法が確立されていないという問題がある。
　一方、in vitroの筋芽細胞（C2C12 細胞）培養系において、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の発現量を低下させることで、筋分化の進行が促進されることが本発明者により見出されている。そこで、in vivoにおいても、同様に、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の発現量を低下させることで、筋分化の亢進、筋線維の肥大化、筋再生の誘導が期待出来る可能性がある。
　そこで、本発明は、前記問題を解決するためになされたものであり、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤に関し、詳しくは、健全な筋線維に影響を及ぼすことなく、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維の再生を亢進させることが可能な骨格筋再生促進剤を提供することを目的とする。
　本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤（骨格筋再生治療薬）として本発明に係る新規な骨格筋再生促進剤を完成させた。
　即ち、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、有効成分としてコンドロイチン硫酸を分解する酵素を含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤である。
　本発明の他の面は、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進するために使用されるコンドロイチン硫酸を分解する酵素であって、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる、該酵素、に関する。
　本発明の他の面は、骨格筋再生に有効な量のコンドロイチン硫酸を分解する酵素を、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与する工程を含む、筋疾患又は筋原性疾患における骨格筋再生促進方法、に関する。
　これにより、前記酵素を含む骨格筋再生促進剤を、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に投与すると、当該酵素が、前記筋線維（細胞）の外周囲に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解することになる。そのため、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）による筋線維の再生の阻害を消失させ、当該筋線維の再生、肥大化を亢進させることが可能となる。又、前記酵素は、前記筋疾患又は前記筋原性疾患のいずれでもない健全な筋線維に対して副作用が殆ど無く、非常に安全である。そのため、本発明の骨格筋再生促進剤は、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に対象を限定した安全性の優れる骨格筋再生促進剤として有効である。
　又、前記酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ、コンドロイチン硫酸の分解活性を有する哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素のいずれかを含むよう構成することが出来る。
　又、前記筋原性疾患が、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症、イオンチャネル病のいずれかを含むよう構成することが出来る。
　又、前記骨格筋再生促進剤が、前記酵素を有効成分とする注射用製剤であるよう構成することが出来る。
　又、前記酵素の投与量が、一投与当たり０．１ｍＩＵ／ｇ～１０．０ｍＩＵ／ｇであるよう構成することが出来る。
　又、前記酵素の投与形態が、０．５ＩＵ／ｍＬ～２００．０ＩＵ／ｍＬの範囲の所定濃度の酵素を、前記筋線維の所定領域にわたって複数箇所、１μＬ～５０００μＬの範囲の投与量ずつ投与する形態であるよう構成することが出来る。
　又、前記骨格筋再生促進剤が、幹細胞治療、筋肉量の抑制機能を有するサイトカインに由来するマイオスタチンの阻害剤を用いた治療のいずれかを含む治療と併用して用いられるよう構成することが出来る。
　又、本発明によれば、コンドロイチン硫酸を分解する酵素を有効成分とする、筋疾患又は筋原性疾患治療剤も提供される。
　本発明の他の面は、筋疾患又は筋原性疾患を治療するために使用されるコンドロイチン硫酸を分解する酵素に関する。
　本発明の他の面は、筋疾患又は筋原性疾患の治療に有効な量のコンドロイチン硫酸を分解する酵素を、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物に投与する工程を含む、筋疾患又は筋原性疾患の治療方法、に関する。
　より詳細には、本発明は、以下のとおりである。
（１）　筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤であって、有効成分としてコンドロイチン硫酸を分解する酵素を含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤。
（２）　前記酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ、前記コンドロイチン硫酸の分解活性を有する哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素のいずれかを含む、（１）に記載の骨格筋再生促進剤。
（３）　前記筋原性疾患が、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症、イオンチャネル病のいずれかを含む、（１）又は（２）に記載の骨格筋再生促進剤。
（４）　前記骨格筋再生促進剤が、前記酵素を有効成分とする注射用製剤である（１）～（３）のいずれかに記載の骨格筋再生促進剤。
（５）　前記酵素の投与量が、一投与当たり０．１ｍＩＵ／ｇ～１０．０ｍＩＵ／ｇである（１）～（４）のいずれかに記載の骨格筋再生促進剤。
（６）　前記酵素の投与形態が、０．５ＩＵ／ｍＬ～２００．０ＩＵ／ｍＬの範囲の所定濃度の酵素を、前記筋線維の所定領域にわたって複数箇所、１μＬ～５０００μＬの範囲の投与量ずつ投与する形態である、（１）～（５）のいずれかに記載の骨格筋再生促進剤。
（７）　前記骨格筋再生促進剤が、幹細胞治療、筋肉量の抑制機能を有するサイトカインに由来するマイオスタチンの阻害剤を用いた治療のいずれかを含む治療と併用して用いられる、（１）～（６）のいずれかに記載の骨格筋再生促進剤。
（８）　コンドロイチン硫酸を分解する酵素を有効成分とする、筋疾患又は筋原性疾患治療剤。
　本発明に係る筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤では、健全な筋線維に影響を及ぼすことなく、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維の再生を亢進させることが可能となる。また、本発明は、骨格筋促進試薬としても利用可能である。
生理食塩水（Vehicle）の投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察及びLaminin／Hoechst観察の一例を示す図と、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣｈＡＢＣ）の投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察及びLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。 第一のマウス（ＣＴＸ）、第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。 第一のマウス（ＣＴＸ）、第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積の一例を示す棒グラフである。 生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から３日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。 生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から７日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。 生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である（写真）。 生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維における中心核が存在しない細胞の割合の一例を示す棒グラフである。
　以下に、添付図面を参照して、本発明に係る骨格筋再生促進剤の実施形態について説明し、本発明の理解に供する。尚、以下の実施形態は、本発明を具体化した一例であって、本発明の技術的範囲を限定する性格のものではない。
　＜骨格筋再生促進剤＞
　本発明に係る骨格筋再生促進剤は、筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤である。更に、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、有効成分としてコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素を含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤である。
　ここで、有効成分として含まれる酵素は、筋線維（細胞）の周辺に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素であれば、特に限定されない。前記酵素として、例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣｈＡＢＣ）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼなどのコンドロイチナーゼを用いることが出来る。又、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解活性を併せて有する酵素でも良く、例えば、HYAL-1やPH-20などの哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素を用いることもできる（非特許文献７、８）。
　ここで、コンドロイチナーゼＡＢＣは、例えば、Proteus vulgaris由来であり、コンドロイチナーゼＡＣは、例えば、Flavobacterium heparinum由来である。又、コンドロイチナーゼＡＣIIは、例えば、Arthrobacter aurescens由来であり、コンドロイチナーゼＡＣIIIは、例えば、Flavobacterium sp. Hp102由来である。又、コンドロイチナーゼＢは、例えば、Flavobacterium heparinum由来であり、コンドロイチナーゼＣは、例えば、Flavobacterium sp. Hp102由来である。
　又、前記酵素は、１種類の酵素であっても、複数種の酵素の混合物であっても良い。又、本明細書に記載の酵素は、これら両方の意味を包含する。
　又、前記酵素は、ＣｈＡＢＣ又は哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素であると、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解亢進の観点から好ましく、当該ＣｈＡＢＣならば、Proteus vulgaris由来のＣｈＡＢＣであると更に好ましい。
　又、前記酵素を含む骨格筋再生促進剤は、製剤学的に公知の方法によって調整・製剤することが出来る。ここで、前記骨格筋再生促進剤は、溶液状態、凍結状態、乾燥状態などの状態であってもよい。
　又、前記酵素を含む骨格筋再生促進剤は、主として注射用製剤に使用される。ここで、前記骨格筋再生促進剤を、溶液状態の注射用製剤に使用する場合、当該注射用製剤を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させ、或いは保存し、注射剤として投与に使用することが出来る。又、前記骨格筋再生促進剤を、乾燥状態の注射用製剤に使用する場合、当該注射用製剤を前記容器中に密封状態で保持させて、流通させ、或いは保存し、投与前に注射用蒸留水、（リン酸緩衝）生理食塩水、ブドウ糖水溶液、ソルビトール水溶液等の溶媒（溶剤）に溶解し、注射剤として投与に使用することが出来る。
　又、前記筋疾患は、哺乳動物の筋が損傷した非遺伝性疾患であれば、特に限定されない。前記筋疾患として、例えば、皮膚筋炎、多発性筋炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性強皮症、混合性結合組織病などの膠原病、トキソプラズマ症、トリコモナス症、化膿性筋炎、ガス壊疽、壊死性筋炎、急性ウイルス性筋炎などの感染症を含む炎症性筋疾患、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症などの内分泌性筋疾患、高脂血症治療薬、ステロイドなどの中毒性筋疾患などが挙げられる。又、前記筋疾患は、筋肉そのものに原因があって筋肉が萎縮する筋原性疾患（myopathy）とは異なるものの、脊髄前角細胞と末梢神経の損傷により筋肉が萎縮する神経に原因がある神経原性疾患（neuropathy）も該当するので、当該筋疾患として、例えば、乳児脊髄性筋萎縮症(ウェルドニッヒ・ホフマン病)、シャルコ・マリー・ツース病、先天性ミエリン形成不全症、筋萎縮性側索硬化症などを含んでも構わない。
　又、前記筋原性疾患は、哺乳動物の筋が損傷する遺伝性疾患であれば、特に限定されない。前記筋原性疾患として、例えば、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィーなどを含むミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症などを含むイオンチャネル病などが挙げられる。又、前記筋ジストロフィーとして、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィーなどが挙げられる。
　又、前記筋原性疾患は、筋ジストロフィーであると、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解による筋線維の再生亢進の観点から好ましく、当該筋ジストロフィーのうち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーであると更に好ましい。
　又、前記哺乳動物は、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維（細胞）を有する哺乳動物であれば、特に限定されない。前記哺乳動物として、例えば、ヒト、チンパンジー、ドッグ、ラット、マウスなどが挙げられる。
　又、前記コンドロイチナーゼを含む骨格筋再生促進剤を前記筋疾患又は前記筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与する方法は、前記骨格筋再生促進剤を前記筋線維の細胞周辺に浸透させる方法であれば、特に限定されない。前記投与方法として、例えば、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、直腸内投与、経皮投与などが挙げられるが、筋肉内投与が好ましい。
　又、前記酵素の投与量は、前記筋線維の再生を亢進させる投与量であれば、特に限定されない。前記酵素の投与量として、例えば、一投与当たり０．１ｍＩＵ／ｇ～１０．０ｍＩＵ／ｇであると、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解による筋線維の再生亢進の観点から好ましい。仮に、体重６０ｋｇのヒトを対象とする場合、例えば、前記酵素の投与量として、０．１ｍＩＵ／ｇ～６．７ｍＩＵ／ｇの範囲が挙げられる。
　又、前記酵素の投与形態は、前記筋線維の再生を亢進させる投与形態であれば、特に限定されない。前記酵素の投与形態として、例えば、０．５ＩＵ／ｍＬ～２００．０ＩＵ／ｍＬの範囲の所定濃度の酵素を、前記筋線維の所定領域にわたって複数箇所、１μＬ～５０００μＬの範囲の投与量ずつ投与する形態であると、前記筋線維の所定領域に発現したコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を網羅的に分解することが可能となり、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解による筋線維の再生亢進の観点から好ましい。例えば、前記酵素がＣｈＡＢＣである場合、２．０ＩＵ／ｍＬのＣｈＡＢＣを、前記筋線維の所定領域にわたって複数箇所（例えば、２箇所～１０箇所）、３０μＬの投与量ずつ投与すると、効果的に、前記筋線維を再生させ、肥大化を亢進させることが可能となる。仮に、体重６０ｋｇのヒトを対象とする場合、例えば、通常の筋肉内投与の投与量は、１０００μＬ～２０００μＬの範囲が挙げられる。
　ここで、本明細書における酵素の１Ｕ（単位）は、至適ｐＨ及び至適温度付近の条件において、当該酵素から１分間に１マイクロモルの反応生成物を遊離させる酵素量と定義される。例えば、前記ＣｈＡＢＣの１Ｕとは、ｐＨ８．０、３７℃で１分間にコンドロイチン６－硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。各種コンドロイチナーゼであっても同様である。
　又、前記酵素は、骨格筋再生促進剤（医薬、治療薬）として使用できる程度に精製され、骨格筋再生促進剤として混入が許されない物質を実質的に含まない酵素であることが好ましい。又、前記酵素は、所定以上の比活性を有することが好ましいが、例えば、前記酵素が前記ＣｈＡＢＣである場合、その比活性が１００Ｕ／ｍｇ蛋白以上に精製された酵素であると、好ましく、更に、比活性が３００Ｕ／ｍｇ蛋白以上に精製された酵素であると、尚好ましい。
　又、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、有効成分として前記酵素を含有する限り、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤などの通常骨格筋再生促進剤（医薬）に用いられる添加剤を含んでも構わない。
　例えば、本発明に係る骨格筋再生促進剤を、注射用製剤として使用する場合には、前記酵素を、注射用蒸留水、（リン酸緩衝）生理食塩水、ブドウ糖水溶液、ソルビトール水溶液等の溶媒に所定濃度だけ溶解させた溶液を作製し、前記作製した溶液を注射用製剤として使用すればよい。
　＜実施例＞
　以下に、本発明の実施例としてマウスを用いた評価方法、試験例を具体的に説明するが、本発明の適用が本実施例に限定されるものでない。
　＜評価方法＞
（１－１）筋線維の切片作製
　筋線維の再生の評価対象となるマウスの（骨格）筋線維の切片は、当該マウスの前脛骨筋の筋線維を当該筋線維に対して直角方向に切断することにより摘出させる。前記摘出された切片は、その切断方法により、前記筋線維に直角な横断面となり、前記筋線維の短手方向の断面となる。前記切片は、筋線維の崩壊を防止するために、液体窒素で冷却したイソペンタンに入れて、急速凍結させる。
　次に、前記急速凍結させた切片を、クライオスタットを用い、厚さ１０μｍの切片として作製し、ＡＰＳ（アミノシラン）コートスライドグラス（松浪硝子工業株式会社製）上に貼り付け、パラフィン伸展器上で乾燥後、－８０℃で保存する。これにより、評価用の切片を得ることが出来る。
（１－２）免疫蛍光染色による筋線維（細胞）の形態観察
　前記（１－１）で作製した切片を、溶媒がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）である４ｗ／ｖ％濃度のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて室温で３０分間処理し、固定化させる。
　次に、前記固定化させた切片を前記ＰＢＳで洗浄後、２％ヤギ血清を含むM.O.M.マウスIgブロッキング試薬（M.O.M. Immunodetection kitの試薬、英国Vector社製）で処理し、１時間静置してブロッキング処理を行う。
　一方、抗ラミニン抗体（Sigma社製）と、抗ＣＳ切り株抗体（2-B-6）（生化学工業株式会社製）とをM.O.M.希釈溶液（M.O.M. Immunodetection kitの試薬、Vector社製）で希釈し混合した混合液を、一次抗体として作製する。前記抗ラミニン抗体は、前記M.O.M.希釈溶液に対して体積で400倍希釈し、前記抗ＣＳ切り株抗体は、前記M.O.M.希釈溶液に対して体積で200倍希釈する。
　ここで、前記抗ラミニン抗体は、筋線維（細胞）の基底膜に存在するラミニン（Laminin）を認識する抗体であり、前記抗ラミニン抗体を認識する二次抗体[Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) （Invitrogen社製）]と組み合わせることにより、緑色の蛍光として、当該筋線維の外縁を観察することが出来る。又、前記抗ＣＳ切り株抗体は、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素が分解したコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の切り株構造を認識する抗体である。前記抗ＣＳ切り株抗体を認識する二次抗体[Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1（ガンマ１）（Invitrogen社製）]と組み合わせることにより、筋組織切片中のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の切り株構造を赤色の蛍光として検出することができる。
　前記作製した一次抗体を、前記ブロッキング処理後の切片に滴下し、４℃で終夜反応させ、当該反応後の切片を前記ＰＢＳで３回洗浄する。
　一方、Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) （Invitrogen社製）及びAlexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1（ガンマ１）（Invitrogen社製）を前記M.O.M.希釈溶液で希釈し混合した混合液を、二次抗体として作製する。前記Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)は、前記M.O.M.希釈溶液に対して体積で200倍希釈し、前記Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1（ガンマ１）は、前記M.O.M.希釈溶液に対して体積で200倍希釈した。
　そして、前記洗浄後の切片に、前記作製した二次抗体を滴下し、３７℃で１時間反応させ、当該反応後の切片を前記ＰＢＳで３回洗浄する。更に、当該洗浄後の切片に、前記ＰＢＳで希釈したHoechst 33342（Invitrogen社製）を滴下し、室温で２０分間反応させる。ここで、前記Hoechst 33342は、前記ＰＢＳに対して体積で500倍希釈する。前記Hoechst 33342は、筋線維の中心核を蛍光青色に染色し、これにより、当該筋線維の中心核を観察することが出来る。
　更に、前記反応後の切片を前記ＰＢＳで適宜洗浄後、当該洗浄後の切片を所定の封入剤（FLUOROSHIELD、ImmunoBioScience Corp.製）を用いて封入し、所定のオールインワン蛍光顕微鏡（BZ-800、KEYENCE製）により観察する。前記オールインワン蛍光顕微鏡の設定条件は、筋線維中の核の存在（局在）を鮮明にするために、デジタル化された画像中の蛍光青色を赤色の擬似カラーに変更する設定条件とする。
（１－３）画像解析
　前記（１－２）で得られた筋線維の画像を解析することで、筋線維について定量評価する。前記定量評価を行う場合、下記の２種類の値を算出することで行う。
（１－３－１）筋線維の細胞の断面積
　前記画像のうち、１視野（９１８μｍ×６３４μｍ）内に存在する中心核を有する筋線維をすべて（１００～２００個／視野、１検体あたり少なくとも３視野）抽出し、当該抽出した全ての筋線維の細胞の断面積（ＣＳＡ）（cross-sectional area）を計測した。そして、前記計測した断面積を抽出数で除算することで、一細胞当たりの平均断面積を算出した。ここで、一細胞当たりの平均断面積が大きい程、前記筋線維の再生（増殖）、肥大化が亢進（活性化）していることを示す。
（１－３－２）中心核が存在しない筋線維の細胞の割合
　前記画像のうち、１視野（９１８μｍ×６３４μｍ）内に存在する筋線維をすべて（１００～２００個／視野、１検体あたり少なくとも３視野）抽出し、当該抽出した筋線維の細胞のうち、中心核が存在しない細胞の数を計測した。そして、前記計測した中心核が存在しない細胞の数を抽出数で除算した割合（％：百分率）を算出した。前記中心核が存在しない細胞の割合が高い程、前記筋線維の再生、肥大化および筋線維の安定化が亢進していることを示す。
　＜試験例＞
（２－１）健全（正常）マウスを用いた薬効薬理試験
　健全なマウスの筋（線維）に本発明に係る骨格筋再生促進剤を投与することで、当該筋線維の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
　ここで、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素であるコンドロイチナーゼＡＢＣ（ＥＣ4.2.2.4  生化学工業株式会社製）（ＣｈＡＢＣ）を無菌的に生理食塩水（大塚製薬株式会社製）に所定濃度（例えば、２．０ＩＵ／ｍＬ）溶解した注射用製剤を用いた。
　生後５週間（週齢）～６週間経過後の野生型マウス（C57BL/10系統　約２０ｇ相当　日本ＳＬＣ株式会社製）に、ソムノペンチル（共立製薬株式会社製）を腹腔投与し、麻酔をかけた。そして、前記野生型マウスの左後肢の前脛骨筋に、所定の注射器を用いて、前記注射用製剤を３０μＬ投与した。そのため、当該注射用製剤の投与量は、前記ＣｈＡＢＣに対して一回につき６０ｍＩＵに相当する投与量である。前記マウスに対しては、前記ＣｈＡＢＣの投与量は、３．０ｍＩＵ／ｇとなる。
　又、対照実験として、前記野生型マウスの右後肢の前脛骨筋に、前記注射用製剤に用いた生理食塩水のみを３０μＬ投与した。
　次に、各製剤（薬剤）の投与直後から７日経過後のマウスを用いて、前記（１－１）－（１－２）により、筋線維の切片を作製し、蛍光観察を行った。
　ここで、前記蛍光観察は、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解による切り株構造の蛍光シグナルのみを観察するΔＣＳ観察と、個々の筋線維の細胞の形態と核の局在を検出するLaminin／Hoechst観察とした。
　図１は、生理食塩水（Vehicle）の投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察及びLaminin／Hoechst観察の一例を示す図と、ＣｈＡＢＣの投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察及びLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。尚、左下の白色横線のスケールバーは１００μｍである。
　前記生理食塩水の投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察では、図１に示すように、前記切り株構造に対応する蛍光シグナルが全く観察されなかった。これにより、前記生理食塩水の投与により、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解は行われないことが理解される。
　一方、前記ＣｈＡＢＣの投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のΔＣＳ観察では、図１に示すように、前記蛍光シグナルが、各筋線維の外周囲を縁取るように観察された、これにより、前記ＣｈＡＢＣの投与により、前記筋線維の膜の外縁に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解が行われたことが理解される。
　又、前記生理食塩水及び前記ＣｈＡＢＣの投与から７日経過後の健全マウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図１に示すように、筋線維の中心核を示す赤色の蛍光シグナルが全く観察されなかった。ここで、前記中心核を有する筋線維が存在する場合、筋線維の再生、増殖に関与する筋衛星細胞が活性化していることを意味する。そのため、前記中心核を有する筋線維の細胞が全く観察されないということは、前記筋衛星細胞の活性化が見られず、前記生理食塩水及び前記ＣｈＡＢＣの投与によって、筋線維の再生、肥大化は特に促進されないことを意味する。従って、これにより、前記ＣｈＡＢＣの投与によって筋組織内のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）は分解されるものの、健全マウスの筋線維の再生、肥大化に殆ど影響を与えないことが理解される。言い換えると、前記ＣｈＡＢＣの投与は、健全な筋に対して、副作用が殆ど無く、非常に安全性が高いことが示唆される。
（２－２）筋疾患のマウスを用いた薬効薬理試験
　次に、筋疾患（損傷）したマウスの筋に本発明に係る骨格筋再生促進剤を投与することで、当該筋線維の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
　前記筋疾患をマウスの筋に生じさせるために、以下の方法を採用した。即ち、コブラ毒として知られるNaja mossambica mossambica由来カルジオトキシン（ＣＴＸ）は、筋に投与すると、当該筋の筋線維の細胞膜を破壊して、当該筋線維を壊死させるという特徴を有する。一方、前記ＣＴＸは、前記筋の再生に関与する細胞、例えば、筋衛星細胞、血管、末梢神経のいずれにも影響（障害）を与えないという特徴を有する。そのため、前記ＣＴＸを前記筋に投与したとしても、当該筋線維の再生は、いずれ開始されることになる。又、前記ＣＴＸは、投与直後から筋線維の壊死が始まり、当該投与直後から２４時間（１日）経過後に、前記壊死された筋線維内にマクロファージが侵入する。そして、前記投与直後から７２時間（３日）経過後に、筋線維の再生を示す筋幹細胞が出現し始める。つまり、筋に対する前記ＣＴＸの投与は、当該筋の筋線維に擬似的に疾患（損傷）を生じさせることが可能なのである（例えば、Jin, Y.、外５名、「Acta Neuropathol. 99」、２０００年、ｐ．619-627を参照）。
　そこで、前記ＣＴＸを（骨格）筋に投与したマウスを筋損傷（疾患）モデルのマウスとし、当該筋損傷モデルのマウスに更に前記ＣｈＡＢＣを投与することで、当該筋損傷モデルのマウスの筋の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
　先ず、所定の濃度（例えば、１０μＭ）の前記ＣＴＸのみを３０μＬだけ前記野生型マウスの左後肢の前脛骨筋に投与し、そのマウスを第一のマウスとした。尚、前記ＣＴＸは、生理食塩水により前記濃度に調製した注射用製剤とし、注射器により投与した。
　次に、前記第一のマウスとは別の野生型マウスを用意し、当該野生型マウスの左後肢の前脛骨筋に、前記濃度のＣＴＸのみを３０μＬだけ投与し、当該投与直後から３日経過後に、当該前脛骨筋に前記所定濃度（２．０ＩＵ／ｍＬ）のＣｈＡＢＣを３０μＬだけ追加投与し、そのマウスを第二のマウスとした。ここで、前記ＣｈＡＢＣの投与量は、一回につき６０ｍＩＵである。
　尚、前記第二のマウスにおいて、前記ＣＴＸの投与直後から３日経過後に前記ＣｈＡＢＣを投与した理由は、当該３日経過後に前記筋衛星細胞に由来する筋芽細胞の融合が観察されるようになるため、発明者は、その時期に発現する前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解させれば、前記筋線維の再生、肥大化が著しく亢進されると考えたからである。
　又、前記第一のマウス及び前記第二のマウスとは別の野生型マウスを用意し、当該野生型マウスの左後肢の前脛骨筋に、ＣＴＸとＣｈＡＢＣの混合液（混合液中のＣＴＸ濃度：１０μＭ、ＣｈＡＢＣ濃度：２．０ＩＵ／ｍＬ）を３０μＬ投与し、そのマウスを第三のマウスとした。ここで、前記ＣｈＡＢＣの混合量は、上述した投与量に対応し、６０ｍＩＵである。
　そして、各製剤の投与直後から７日経過後のマウスを用いて、前記（１－１）－（１－３）により、筋線維の切片を作製し、蛍光観察、画像解析を行った。
　ここで、前記蛍光観察は、前記Laminin／Hoechst観察とし、前記画像解析は、筋線維の細胞の断面積とした。
　図２は、第一のマウス（ＣＴＸ）、第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。尚、左下の白色横線のスケールバーは１００μｍである。
　図３は、第一のマウス（ＣＴＸ）、第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積の一例を示す棒グラフである。尚、図３に示す＊は、Ｐ＜０．０１のｔテストを示す。
　前記第一のマウス（ＣＴＸ）の筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図２に示すように、中心核を有する細胞が肥大化することなく密集していることが観察される。これにより、前記ＣＴＸの投与により、前記筋線維の壊死に対応して、当該筋線維の再生が、通常通り、発現していることが理解される。
　一方、前記第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）及び前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図２に示すように、中心核を有する筋線維が肥大化していることが観察される。これにより、前記ＣｈＡＢＣの投与により、前記筋線維の再生、肥大化が亢進されていることが理解される。
　又、前記第一のマウス（ＣＴＸ）、前記第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）、前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積では、図３に示すように、前記第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）及び前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積が、前記第一のマウスの筋線維における細胞の断面積と比較して、有意に大きいことが感得される。これにより、筋疾患に対応する筋損傷モデルのマウスの筋に前記ＣｈＡＢＣを投与すると、当該ＣｈＡＢＣが、筋線維の再生を阻害するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解し、当該筋線維の再生、肥大化を亢進させることが理解される。
　尚、前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積は、図３に示すように、前記第二のマウス（ＣＴＸ＞＞ＣｈＡＢＣ）の筋線維における細胞の断面積と比較して、有意に大きいことが感得される。そのため、前記ＣｈＡＢＣは、前記ＣＴＸが筋に投与された時点、言い換えると、前記ＣＴＸにより筋線維の壊死が始まる時点と同時に投与した方が、当該筋線維の再生、肥大化に効果的であることが理解される。
　これについて、発明者は、以下のように推察している。即ち、前記第三のマウス（ＣＴＸ＋ＣｈＡＢＣ）において、前記ＣＴＸが前記筋線維の内部に浸透すると同時に、当該ＣＴＸとともに投与されたＣｈＡＢＣが当該筋線維の内部に浸透し、当該筋線維の周辺に発現するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を即時に分解する。そのため、前記筋線維の再生時には、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）が分解された状態となり、当該筋線維の再生の阻害を効果的に防止し、当該再生速度を亢進させたと推察する。
（２－３）筋原性疾患のモデルマウスを用いた薬効薬理試験
　更に、筋原性疾患のモデルマウスの筋に本発明に係る骨格筋再生促進剤を投与することで、当該筋線維の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
　前記筋原性疾患のモデルマウスは、以下の方法を採用した。即ち、ジストロフィン遺伝子の変異によりジストロフィンタンパク質が筋線維の膜上で欠損しているｍｄｘマウスは、生後３週間経過後に自己の筋線維の壊死が起こり始めるとともに、壊死後の筋線維の再生も生じることが知られている（例えば、Nonaka, I.、「Lab. Anim. Sci. 48」、１９９８年、ｐ．8-17を参照）。つまり、前記ｍｄｘマウスには、所謂デュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋原性疾患が生じている。
　そこで、前記ｍｄｘマウスを筋原性疾患モデルのマウスとし、当該筋原性疾患モデルのマウスに前記ＣｈＡＢＣを投与することで、当該筋原性疾患モデルのマウスの筋の再生過程を亢進させるか否かを検討した。
　先ず、生後５週間～６週間経過後のｍｄｘマウス（C57BL/10系統　約２０ｇ相当、日本クレア株式会社製）の左後肢の前脛骨筋に前記所定濃度（２．０ＩＵ／ｍＬ）のＣｈＡＢＣを３０μＬだけ投与した。ここで、前記ＣｈＡＢＣの投与量は、一回につき６０ｍＩＵである。又、対照実験として、前記ｍｄｘマウスの右後肢の前脛骨筋に生理食塩水を３０μＬだけ投与した。
　そして、各製剤の投与直後から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスを用いて、前記（１－１）－（１－３）により、筋線維の切片を作製し、蛍光観察、画像解析を行った。
　ここで、前記蛍光観察は、前記Laminin／Hoechst観察とし、前記画像解析は、中心核が存在しない筋線維の細胞の割合とした。
　図４は、生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から３日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。又、図５は、生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から７日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。又、図６は、生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察の一例を示す図である。尚、図４～図６は、同一寸法であり、図６における左下の白色横線のスケールバーは１００μｍである。
　図７は、生理食塩水（Vehicle）及びＣｈＡＢＣの投与から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維における中心核が存在しない細胞の割合の一例を示す棒グラフである。尚、図７に示す＊は、Ｐ＜０．００５のｔテストを示す。
　前記生理食塩水の投与から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図４～図６に示すように、３日、７日、１４日経過後のいずれであっても、中心核を有する細胞がまばらに観察された。又、前記中心核が存在しない細胞の割合では、図７に示すように、３日、７日、１４日経過後のいずれであっても、約３０％～約４０％であった。これにより、前記ｍｄｘマウスの筋線維の細胞は、壊死と再生とを一定頻度で繰り返していることが理解される。
　一方、前記ＣｈＡＢＣの投与から３日、７日、１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維のLaminin／Hoechst観察では、図４～図６に示すように、７日経過後の筋線維の細胞が最も大きく、肥大化していることが観察された。又、前記中心核が存在しない細胞の割合では、図７に示すように、７日経過後の中心核が存在しない細胞の割合が最も高く、約５０％であった。これにより、前記ｍｄｘマウスの筋線維に前記ＣｈＡＢＣを投与すると、当該ＣｈＡＢＣの投与直後から７日までの間に、当該筋線維の再生速度がその壊死速度よりも上回り、当該筋線維の再生、肥大化が亢進したことが理解される。言い換えると、前記ＣｈＡＢＣが、筋原性疾患の筋線維の再生を助長し、当該筋線維を安定化（壊死回避）させたことが理解される。
　尚、前記ＣｈＡＢＣの投与から１４日経過後のｍｄｘマウスの筋線維における中心核が存在しない細胞の割合は、図７に示すように、７日経過後のｍｄｘマウスの筋線維におけるそれと比較して低下している。これは、前記ＣｈＡＢＣの投与の効果が消失したためと考えられる。一方、前記ＣｈＡＢＣを投与したｍｄｘマウスの筋線維における中心核が存在しない細胞の割合は、図７に示すように、前記生理食塩水を投与したｍｄｘマウスの筋線維におけるそれと比較して、全体的に高いことが感得される。
　そのため、発明者は、前記ＣｈＡＢＣの投与による筋線維の再生の亢進は、所定期間のみ有効であるものの、当該ＣｈＡＢＣを所定周期で繰り返し投与すれば、当該筋線維の再生の亢進の継続により、当該筋原性疾患の筋の壊死の阻止又は遅延を促すことが出来ると考えている。
　又、上述した試験例では、主としてマウスを哺乳動物として採用して、前記ＣｈＡＢＣの薬効薬理試験を実施したが、他の哺乳動物、例えば、ヒトであっても、同様の作用効果を得ることが出来ると推認される。
　又、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素として、上述した試験例では、前記ＣｈＡＢＣを採用したが、原理原則から考慮すると、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素の種類にはよらないため、例えば、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼなどのコンドロイチナーゼを採用しても、同一の作用効果を奏する。又、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の分解活性を併せて有する酵素、つまり、実質的にコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素であれば、どのような酵素でもよく、例えば、HYAL-1などのヒアルロン酸分解酵素を採用しても、同一の作用効果を奏する。
　又、前記筋原性疾患として、上述した試験例では、前記ｍｄｘマウスの筋ジストロフィーを採用したが、原理原則から考慮すると、前記筋原性疾患の種類にはよらないため、例えば、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症、イオンチャネル病のいずれかを含む筋原性疾患を採用しても、同一の作用効果を奏する。
　このように、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、有効成分としてコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解する酵素を含み、哺乳動物の筋疾患又は筋原性疾患の筋線維に投与することで、当該筋線維の再生を亢進させる骨格筋再生促進剤である。
　これにより、前記酵素を含む骨格筋再生促進剤を、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に投与すると、当該酵素が、前記筋線維の外周囲に存在するコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を分解することになる。そのため、前記コンドロイチン硫酸（ＣＳ）による筋線維の再生の阻害を消失させ、当該筋線維の再生、肥大化を亢進させることが可能となる。又、前記酵素は、前記筋疾患又は前記筋原性疾患のいずれでもない健全な筋線維に対して副作用が殆ど無く、非常に安全である。そのため、本発明の骨格筋再生促進剤は、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に対象を限定した安全性の優れる骨格筋再生促進剤として有効である。
　現在、筋疾患や筋原性疾患について、幹細胞治療（例えば、橋本有弘、「蛋白質 核酸 酵素 49」、２００４年、p.741-748など）や筋肉量の抑制機能を有するサイトカイン（例えば、フォリスタチン）に由来するマイオスタチンの阻害剤を用いた治療（例えば、Nakatani, M.、外１１名、「FASEB J. 22」、２００８年、ｐ.477-487など）、これらの研究が、臨床適用に向けて活発に展開されている。本発明に係る骨格筋再生促進剤（実施例では、ＣｈＡＢＣ）を用いた治療法は、これらの治療法と併用することにより、前記筋疾患又は前記筋原性疾患の筋線維に対してより効果的な治療法となると考えられる。
　以上のように、本発明に係る骨格筋再生促進剤は、通常の筋疾患はもちろん、筋ジストロフィーなどの筋原性疾患の骨格筋再生促進剤として有用であり、健全な筋線維に影響を及ぼすことなく、筋疾患又は筋原性疾患の筋線維の再生を亢進させることが可能な骨格筋再生促進剤として有効である。

Claims (6)

  1. 　筋疾患又は筋原性疾患の骨格筋再生促進剤であって、
    　有効成分としてコンドロイチン硫酸を分解する酵素を含み、筋疾患又は筋原性疾患の哺乳動物の筋線維に投与されることで、当該筋線維の再生を亢進させる
    　骨格筋再生促進剤。
  2. 　前記酵素が、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ、前記コンドロイチン硫酸の分解活性を有する哺乳類由来のヒアルロン酸分解酵素のいずれかを含む
    　請求項１に記載の骨格筋再生促進剤。
  3. 　前記筋原性疾患が、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症、イオンチャネル病のいずれかを含む
    　請求項１又は２に記載の骨格筋再生促進剤。
  4. 　前記骨格筋再生促進剤が、前記酵素を有効成分とする注射用製剤である
    　請求項１～３のいずれか一項に記載の骨格筋再生促進剤。
  5. 　前記骨格筋再生促進剤が、幹細胞治療、筋肉量の抑制機能を有するサイトカインに由来するマイオスタチンの阻害剤を用いた治療のいずれかを含む治療と併用して用いられる
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の骨格筋再生促進剤。
  6. 　コンドロイチン硫酸を分解する酵素を有効成分とする、筋疾患又は筋原性疾患の治療剤。
PCT/JP2012/073794 2011-09-15 2012-09-18 骨格筋再生促進剤 WO2013039244A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12832558.6A EP2756849B1 (en) 2011-09-15 2012-09-18 Skeletal muscle regeneration promoter
US14/343,960 US9144601B2 (en) 2011-09-15 2012-09-18 Skeletal muscle regeneration promoter
JP2013533751A JP5785619B2 (ja) 2011-09-15 2012-09-18 骨格筋再生促進剤

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011202470 2011-09-15
JP2011-202470 2011-09-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013039244A1 true WO2013039244A1 (ja) 2013-03-21

Family

ID=47883459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/073794 WO2013039244A1 (ja) 2011-09-15 2012-09-18 骨格筋再生促進剤

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9144601B2 (ja)
EP (1) EP2756849B1 (ja)
JP (1) JP5785619B2 (ja)
WO (1) WO2013039244A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022115347A1 (en) * 2020-11-25 2022-06-02 Intrinsic Medicine, Inc. Methods for improving muscle strength and mobility

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04330280A (ja) * 1991-04-26 1992-11-18 Seikagaku Kogyo Co Ltd 安定化コンドロイチナーゼａｂｃ、その保存方法及び治療剤
JPH10265503A (ja) * 1997-03-26 1998-10-06 Maruho Kk 骨格筋成長剤
JPH11147837A (ja) 1997-08-22 1999-06-02 Seikagaku Kogyo Co Ltd 椎間板ヘルニア治療剤
WO2009072654A1 (ja) 2007-12-07 2009-06-11 Seikagaku Corporation ケロイド及び肥厚性瘢痕根治治療剤

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06502840A (ja) * 1989-10-27 1994-03-31 ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティ ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及び他のグリカンによる細胞成長の阻害
US5997863A (en) * 1994-07-08 1999-12-07 Ibex Technologies R And D, Inc. Attenuation of wound healing processes
EP1646353A4 (en) * 2003-05-16 2008-06-04 Acorda Therapeutics Inc FUSION PROTEINS FOR THE TREATMENT OF THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM
JP5846558B2 (ja) * 2009-07-09 2016-01-20 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞への分化誘導方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04330280A (ja) * 1991-04-26 1992-11-18 Seikagaku Kogyo Co Ltd 安定化コンドロイチナーゼａｂｃ、その保存方法及び治療剤
JPH10265503A (ja) * 1997-03-26 1998-10-06 Maruho Kk 骨格筋成長剤
JPH11147837A (ja) 1997-08-22 1999-06-02 Seikagaku Kogyo Co Ltd 椎間板ヘルニア治療剤
WO2009072654A1 (ja) 2007-12-07 2009-06-11 Seikagaku Corporation ケロイド及び肥厚性瘢痕根治治療剤

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERSON, J. E., BIOCHEM. CELL BIOL. 76, vol. 76, 1998, pages 13 - 26
BRADBURY, E. J., NATURE 416, 2002, pages 636 - 640
CARULLI, D., CURR. OPIN. NEUROBIOL. 15, vol. 15, 2005, pages 116 - 120
GROUNDS, M. D., CURR. OPIN. NEUROL. 12, vol. 12, 1999, pages 535 - 543
HAFIDA, E. H., ARTHRITIS RES THER 7, 2005, pages R756 - R768
IKUYA NONAKA, RINSHO SHINKEIGAKU 12, vol. 12, 1998, pages 997 - 1000
JIN, Y., ACTA NEUROPATHOL. 99, vol. 99, 2000, pages 619 - 627
MIURA TAKAYUKI ET AL.: "Decorin binds myostatin and modulates its activity to muscle cells", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 340, no. 2, 10 February 2006 (2006-02-10), pages 675 - 80, XP024924098 *
NAKATANI, M., FASEB J. 22, vol. 22, 2008, pages 477 - 487
NAOHIRO HASHIMOTO, TANPAKUSHITSU KAKUSAN KOSO OR PROTEIN NUCLEIC ACID ENZYME 49, vol. 49, 2004, pages 741 - 748
NONAKA, 1., LAB. ANIM. SCI. 48, vol. 48, 1998, pages 8 - 17
ROBERT, S; MARK J. J., CHEM. REV. 106, vol. 106, 2006, pages 818 - 839
See also references of EP2756849A4 *
SHINJI KOYAMA ET AL.: "Kin Bunka Katei ni Okeru Chondroitin Ryusan no Kino Kaiseki", JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, 2010, pages 3P-0090, XP008173081 *
SILVER, J., NET. REV. NEUROSCI. 5, vol. 5, 2004, pages 146 - 156
VILLENA JOAN ET AL.: "Dermatan sulfate exerts an enhanced growth factor response on skeletalmuscle satellite cell proliferation and migration", JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY, vol. 198, no. 2, February 2004 (2004-02-01), pages 169 - 178, XP055145179 *
YUMI YABUTA ET AL.: "Takakuka o Tomonau Kokkakukin Bunka Katei ni Okeru Chondroitin Ryusan no Hatsugen Hendo", ABSTRACTS OF ANNUAL MEETING OF PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, vol. 128, no. 3, 5 March 2008 (2008-03-05), pages 48, XP008173362 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2756849B1 (en) 2016-03-16
EP2756849A1 (en) 2014-07-23
US9144601B2 (en) 2015-09-29
EP2756849A4 (en) 2015-03-25
JPWO2013039244A1 (ja) 2015-03-26
JP5785619B2 (ja) 2015-09-30
US20140234286A1 (en) 2014-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xie et al. Cellular senescence in knee osteoarthritis: molecular mechanisms and therapeutic implications
Zhou et al. Kinsenoside attenuates osteoarthritis by repolarizing macrophages through inactivating NF-κB/MAPK signaling and protecting chondrocytes
Chen et al. Pseurotin A inhibits osteoclastogenesis and prevents ovariectomized-induced bone loss by suppressing reactive oxygen species
Perandini et al. Chronic inflammation in skeletal muscle impairs satellite cells function during regeneration: can physical exercise restore the satellite cell niche?
Latourte et al. Emerging pharmaceutical therapies for osteoarthritis
JP6885620B2 (ja) 筋障害を相殺するための手段と方法
Gorth et al. IL-1ra delivered from poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres attenuates IL-1β-mediated degradation of nucleus pulposus in vitro
US7863256B2 (en) Amide derivatives of hyaluronic acid in osteoarthrosis
Schepers et al. Targeting phosphodiesterases—Towards a tailor-made approach in multiple sclerosis treatment
Colussi et al. Nitric oxide deficiency determines global chromatin changes in Duchenne muscular dystrophy
JP7209000B2 (ja) Ａｐｌ型ペプチドを含む医薬組成物
US8722876B2 (en) Antisense oligonucleotides against AChE in the treatment of gastrointestinal inflammation disorders
Culibrk et al. The role of chronic inflammatory bone and joint disorders in the pathogenesis and progression of Alzheimer's disease
Giugliani et al. Recent advances in treatment approaches of mucopolysaccharidosis VI
Penon-Portmann et al. Current and new therapies for mucopolysaccharidoses
Wang et al. Andrographolide attenuates synovial inflammation of osteoarthritis by interacting with tumor necrosis factor receptor 2 trafficking in a rat model
Wang et al. Intracerebroventricular administration of lupus serum induces microglia activation and leukocyte adhesion in the cerebromicrovasculature of mice
US20050054091A1 (en) Methods of using deacetylase inhibitors to promote cell differentiation and regeneration
JP5785619B2 (ja) 骨格筋再生促進剤
Lamperti et al. Muscular dystrophies: histology, immunohistochemistry, molecular genetics and management
Loomis et al. Thrown for a loop: fibro-adipogenic progenitors in skeletal muscle fibrosis
Schaaf et al. Restoring the regenerative balance in neuromuscular disorders: satellite cell activation as therapeutic target in Pompe disease
KR102307115B1 (ko) 시프로플록사신에 의한 줄기세포의 연골전구세포로의 유도 및 연골세포로의 분화
Akat et al. Cell therapy strategies on Duchenne muscular dystrophy: A systematic review of clinical applications
CN113116888B (zh) 依布硒啉的用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12832558

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013533751

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14343960

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012832558

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE