JPH06502840A - ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及び他のグリカンによる細胞成長の阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及び他のグリカンによる細 胞成長の阻害 １７　概論 本発明は、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、又はデルマタン硫酸、またヘパ ラン硫酸、ヘパリン又はヒアルロン酸（ヒアルロン酸塩）、又はこれらの分子の いずれかの組み合わせ□特に、グリコサミノグリカン又はプロチオングリカン□ を含有する組成物、及び、神経突起（ｎｅｕｒｉ　ｔｅ）の成長の阻害ならびに 神経膠細胞の侵入又は移動の阻害における上記組成物の使用に関する。本発明は 、また、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、 ヘパリンあるいはヒアルロン酸塩に対する抗体のようなケラタン硫酸、コンドロ イチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリンあるいはヒアルロン酸塩 により介在される阻害の拮抗剤：ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタ ン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン又はヒアルロン酸を分解する（ｄｅｇｒａｄｅ ）酵素；ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、 ヘパリン又はヒアルロン酸に特異的なレクチン、又はケラタン硫酸、コンドロイ チン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン又はヒアルロン酸に対する 受容体の三糖拮抗剤を含む組成物；及び、細胞成長あるいは再生、特に、神経突 起の成長又は神経膠細胞の移動を促進させるための上記組成物の使用に関する。

本発明の組成物の治療のための使用か提供される。

２、発明の背景 ２．１．軸索成長 軸索は、神経系の成長の間、それらの目標に向かって一定の形式で成長する。こ の指示された伸長の間、軸素成長円錐体は周囲の要素から複数の相互作用を受け 、これには例えば、細胞外基質（Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｏら、１９８２．サイエン ス２１６　：　８９７−８９９；　Ｈａｎｋｉｎ、　Ｍ、Ｈ及び５ｉｌｖｅｒ、 　Ｊ、、　１９８６．　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｘｏｎａｌ　ｇｕｉｄ ａｎｃｅ　：　ｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎｇ　ｆｉ ｂｅｒ　ｓｙｓｔｅｍｓ、　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂａ５ｉｓｏｆ 　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、　（Ｌｅｏｎ　Ｗ、　Ｂｒｏｗｅｒ編）第２巻 ：　５６５−５９９゜Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃａｒｐ、、＋＋ ！　Ｅ−り、　ユニＥ　７州、Ｍｉｒｓｋｙら、１９８６．　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃ ｙｔｏｌｏｇｙ　１５（６）：　７９９−８１５；　Ｒｏｇｅｒｓら。

１９８６　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、１１３：　４２９−４３５；　Ａｎｔｏｎ ｉｃｅｋら、１９８７．　、Ｊ、　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．　１０４（６）：　１５ ８７−１５９５；　Ｂｏｒｋ　ら、１９８７．　Ｊ、Ｃａｍｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ 。

２６４：　１４７−１５８；　Ｌｉｅｓｉ、　Ｐ、及び５ｉｌｖｅｒ、　Ｊ、、 　１９８８．　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ。

１３０：　７７４−７８５；　Ｌｕｍ５ｄｅｎ、　Ａ、及びＫｅｙｎｅｓ、　Ｒ ，、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ　３３７４２４−４２８）、神経上皮細胞終末足（ ｅｎｄｆｅｅｔ）の表面（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊ、。

及び５ａｐｉｒｏ、　Ｊ、、１９８１．　Ｊ、Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒａｌ、　２ ０２．５２１−５３８；　５ｉｌｖｅｒ。

Ｊ、、及びＲｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ、　Ｕ、、　１９８４．　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂ ｉｏｌ、　１０６：　４８５−４９９；Ｂａ５ｔｉａｎｉ、　Ｍ、　Ｊ、及びＧ ｏｏｄｍａｎ、　Ｃ，Ｓ、、　１９８６．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　６（１ ２）：　３５４２−３５５１；　Ｋｕｗａｄａ、　Ｊ、Ｙ、、　１９８６．５ｃ ｉｅｎｃｅ　２３３：　７４０−７４６；Ｈｏ１ｌｅｙ、　Ｊ、　Ａ、、　ｔ９ ８７．　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　１２３：　３８９−４００；　Ｈｏ１ｌｅ ｙ、　Ｊ。

及び５ｉｌｖｅｒ、　Ｊ、、　１９８７．　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　１２３ ：　３７５−３８８）　、他の軸索（Ｒｕｔ　１ｓｈａｕｓｅｒら、１９７８． 　Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、７９：　３８２−３８３；　Ｆｕｓｈｉｋｉ。

Ｓ、及び５ｃｈａｃｈｎｅｒ、　Ｍ、、　１９８６．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　 ３８９：　１５３−１６７）及び神経膠（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊ、及びＲｏｂｂ、 　Ｒ，Ｍ、、　１９７９．　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ。

６８：ｌ７５−１９０：　Ｓｉｎｇｅｒら、１９７９．　Ｊ、Ｃｏｍｐ、Ｎｅｕ ｒｏｌ、１８５：　１−２２；Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｓ、、　１９８３．　ｉｎ　５ ｐｉｎａｌ　Ｃｏｒｄ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ州、１５１−１６２頁；　５ｉｌｖ ｅｒ、　Ｊ、、１９８４゜Ｊ、Ｃａｍｐ、　Ｎｅｕｒａｌ、２２３：　２３８− ２５１；　Ｐｏ５ｔｏｎら、１９８５．　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒＮｅｕｒｏｓ ｃｉｅｎｃｅ　Ａｂｓｔｒａｃｔ、　１１：　５８４；　Ｂａ５ｔｉａｎｉ、　 Ｍ、Ｊ、及びＧｏｏｄｎａｎ。

Ｃ，Ｓ、、　＋９８６．上掲；　Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｎ、　Ｇ、　Ｆ、、及び５ｔ ｅｉｎｄｌｅｒ、　Ｄ、　Ａ、。

１９８６、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、３８０：　３４１−３４８；　Ｐｏ５ｔｏｎら 、１９８７．　Ｔｈｅ　Ｍａｋｉｎｇｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｒｖｏｕｓ　Ｓｙｓｔ ｅｍ、　Ｌｏｎｄｏｎ：　Ｌｏｎｇｍａｎｓ）がある。これらの種々の表面の付 着特性が適当な経路に沿って軸素を導くということが示唆されている（Ｌｅｔｏ ｕｒｎａｕ、　Ｐ、　Ｃ，１９７５，Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　４４：９２− １０１；　Ｓｉｄｍａｎ、　Ｒ，Ｌ、及びＷｅｓｓｅｌｌｓ、　Ｎ、　Ｋ、、　 １９７５．　Ｅｘｐ。

Ｎｅｕｒａｌ、　４８：　２３７−２５１；　Ｃｏｎ５ｔａｎｔｉｎｅ−Ｐａｔ ｏｎ　Ｍ、、　１９８３．　Ｄｅｖｅｌ。

Ｂｉｏｌ、９７．　２３９−２４４；　Ｒｏｇｅｒｓ　ら、１９８３．　Ｄｅｖ ｅｌ、Ｂｉｏｌ、９８：　２１２−２２０：　Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ　Ｒ，Ｗ、及 びＰａｒｋ、　Ｋ、　Ｈ，Ｃ，、１９８４，Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ。

１０４：　１８−２７：　５ｉｌｖｅｒ、　Ｊ、及びＲｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ、 　Ｕ、、　１９８４．　Ｄｅｖ。

Ｂｉｏｌ、１０６＋　４８５−４９９；　Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ、Ｋ、Ｊ、ら、１ ９８６．　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

１０３：　２６５９−２６７２）。傾斜的に組織化された局所の役割（ｌｏｃａ ｌ　ｃｕｅｓ）も、また、方向性を付与する際には重要であろう。（Ｌｕｍｓｄ ｅｎ、　Ａ。

Ｇ、Ｓ、、及びＤａｖｉｅｓ、　Ａ、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ ｏｎ）　３０６：　７８６−７８８）。

実際、発展の種々の段階において適当な軌道に沿って軸索を成長するためには、 これらの要素の多く、又はすべてが協奏的に相互作用しうるであろう。

最近の知見は、軸素を阻害又は寄せつけない機構が存在し、これは付着性あるい は誘引機構と同じ程度に軸索を導くために重要であるということを示している。

（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊ、、及び５ａｐｉｒｏ、　Ｊｌ、１９８１、Ｊ、Ｃｏｍｐ 、　Ｎｅｕｒｏｌ、２０２：　５２１−５２８；　Ｈａｙｄｏｎら、１９８４． 　Ｓｃｉｅｎｃｅ２２６：　５６１−５６４；　Ｐｏ５ｔｏｎら、１９８５．　 ５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ＮｅｕｒｏｓｅｉｅｎｃｅｓＡｂｓｔｒａｃｔ　ＩＩ ：　５８４、Ｋａｐｆａｍｍｅｒ、　、１゜Ｐ、、及びＲａｐｅｒ、　、］、Ａ 、、　１９８７．１．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　７（５）：　１５９５−１６００ ；　Ｋａｐｆｈａｍｍｅｒ、　、１．　Ｐ、、及びＲａ、ｐｅｒ。

、１．　Ａ、　１９８７．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｅｉ、　７（１）：　２０１− ２１２；　Ｐｅｒｒｉｓ　Ｒ，及びＪｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｓｌ、１９８７．　． １．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０５（６）：　２５１１−２５２１：　５ｉｌｖｅ ｒら、１９８７．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｅｉ、７（７）：　２２６４−２２７２ ；　ＭｃＣｏｂｈら、１９８８．　Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９：　１９−２６；　Ｐａｔｔｅｒｓ ｏｎ、Ｐ、Ｈ，、１９８８，Ｎｅｕｒｏｒｌ　２６３−２６７；　Ｓｅｈｗａｂ 、　Ｍ、Ｅ、、及びＣａｒｏｎｉ、　Ｐ、、　１９８８．　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃ ｉ。

８（７）：　２３８ト２３９３＋　Ｔｏｓｎｅｙ、　Ｋ、、１９８８．　Ｄｅｖ ｅｌ、　Ｂｉａｌ、１２７＋　２６６−２８６；　Ｗｅｂｓｔｅｒら、、１９８ ８．　Ｊ、Ｃｏｍｐ、Ｎｅｕｒｏｌ、２６９：　５９２−６１１；Ｇｕｒｗｉ　 ｔｚ、　Ｄ、及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ、　Ｄ、　Ｄ、、　１９８８．　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５：　３４４０−３４４４）。阻害要素は細胞の境 界又は軸素の経路に沿った境界を形成することかでき（Ｓｉｌｖｅｒ、　、１． 、１９８４．　Ｊ。

Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　２２３：　２３８−２５１）　、そして、これは 化学的手段並びに機械的に作用しうる（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊ、、及びＲｕｔｉｓ ｈａｕｓｅｒ、　Ｕ、。

＋９８４，１掲；　Ｔｏｓｎｅｙ、　Ｋ、及びＬａｎｄｍｅｓｓｅｒ、　Ｌ、、 　１９８５．　Ｄｅｖｅｌ。

Ｂｉｏｌ、１０９：　１９３−２１４；　５ｉｌｖｅｒら、１９８７．　Ｊ、　 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　７：　２２６４−２２７２；　５ｔｅｒｎ、　Ｃ，Ｄ、、 及びＫｅｙｎｅｓ、　Ｒ，Ｊ、、　１９８７．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ。

９９：　２６１−２７２；　Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｍ、Ｊ、ら、１９８８．　Ｊ、Ｃ ｏｍ１）、Ｎｅｕｒｏｌ、２６９５９２−６１１）。軸索阻害は神経膠細胞に関 連して（Ｓｉｌｖｅｒら、　１９８２．．１゜Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒａｌ、　２ １０：　１０−２９；　５ｉｌｖｅｒ、　Ｊ、、　１９８４．　Ｊ、Ｃｏｍｐ、 　Ｎｅｕｒｏｌ。

２２３：　２２８−２５１；　Ｐｏ５ｔｏｎら、１９８５．　５ｏｃｉｅｔｙ　 ｆｏｒ　ＮｅｕｒｏｃｓｉｅｎｃｅＡｂｓｔｒａｃｔ　１１：　５８４；　５ｉ ｌｖｅｒら、　１９８７，１掲；　５ｔｅｉｎｄｌｅｒ、　Ｄ、　Ａ、。

及びＣｏｏｐｅｒ、　Ｎ、　Ｇ、　Ｆ、、　１９８７．　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｒａ ｉｎ　Ｒｅｓ、　３６：　２７−３８＋Ｓｃｈｗａｂ、　Ｈ，Ｅ、、及びＣａｒ ｏｎｉ、　Ｐ、、　１９８８．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　８（７）：２３８ ＋−２３９３）、Ｍ藁の要素に応答して（Ｋｅｙｎｅｓ、　Ｒ，Ｊ、、及び５ｔ ｅｒｎ。

Ｃ，Ｄ、、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１０：　７８６− ７８９；　Ｔｏｓｎｅｙ、Ｋ、。

１９８８、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　１２７：　２２６−２８６）又は可溶 性要素に応答して（Ｈａｙｄｏｎら、１９８４．　５ｃｉｅｎｃｅ　２２６：　 ５６１−５６４；　Ｖｅｒｎａ、Ｊ、Ｍ、１９８５゜、１．　Ｅｍｂｒｙｏｌ、 Ｅｘｐ、Ｍｏｒｐｈｏｌ、８６：　５３−７０；　Ｍｃ　Ｃｏｂｂら、１９８８ ．　．１゜Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、　１９：　１９−２６）　、種々のク ラスのニューロンの間で起こり得る。しかしなから、我々は未だ、軸素境界につ いては限られた理解しか有していない。これらか何から構成され、とのように機 能し、そして、軸索かこれらに会うと、細胞レベル及び分子レベルて何が起こる かについての知見を得ることか望まれる。

軸素成長に対する境界となりつる中枢神経系の１つの領域は、成長しつつあるを 椎動物のを髄の背側中心線に位置する上衣板（ｒｏｏｆｐｌａｔｅ）である（Ｈ ｉｓ、　Ｗ、　１８９１．　ｒ、　Ｖｅｒｌａｎｇｅｒｔｅｓ　Ｍａｒｋ、　２ ９：　１−７４；　Ｒａｍｏｎ　ｙ　Ｃａｊａｌ、　Ｓ、、　１９１１．　Ｈｉ ｓｔｏｌｏｇｉｅ　ｄｕ　ｓｙｓｔｅｍｅ　ｎｅｒｖｅｕｘ　ｄｅ１’ｈｏｍｍ ｅ　ｅｔ　ｄｅｓ　ｖｅｒｔｅｂｒｅｓ、　（ｆｒａｎｃａｉｓｅ　ｒｅｖ、　 ｅｔ　ｍ１ｓｅ　ａ　ｊｏｕｒ　ｐａｒ１’ａｕｔｅｕｒ　Ｅｄ、）第１巻、　 Ａ、、　Ｍａｌｏｉｎｅ、パリ）。この領域は、トリチウム化したチミジンオー トラジオグラフィーの使用により（Ａｌｔｍａｎ、　Ｊ、、及びＢａｙｅｒ、　 Ｓ、Ａ、、　１９８４．　ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｎａｔｏｍｙ。

Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　８５巻、　５３ −８３頁、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

ハイデルベルグ、独国）、及び、胚子の放射状神経膠細胞を特異的にラベルする ＲＣＩ及びＲＣ２抗体を使用することにより（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９８６．　 ８Ｃ７，５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｂｓｔｒａｃ ｔ　１２：　１８２）、形態学的に決定されたとおりの原始的な神経膠細胞を包 含する。

上衣板は、Ｅ９で当初−列の細胞外空間として観察される過度的なチャネルを含 む（Ｓｎｏｗ、　Ｄ、ら、　１９８７．５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉｅｎｃｅｓ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　１３（１）：　１９８７）　、上衣板は、 Ｅ１２．５ではくさび形であるか、ＥＩ５．５ではラットのを髄の背側中心線で 長い、薄い中隔様の構造となるように除々に変形する。後横（ｄｏｒｓａｌ　ｒ ｏｏｔ）神経節からの一次求心性神経、ならびに、初期に腹側で変速する軸索の １！側サブ集団は、上衣板にきわめて接近するようになる。両方の軸素系は列側 のを髄において可能なターゲット又は経路を有するとしても、それらはそこに達 するために上衣板を横切ることはない。第１図は、ラットのＥ１３．５及びＥＩ ５．５における変速する、並びに、ｇ覚軸索系の上衣板に対する関係を示す模式 的なダイアゲラムであるａ（７かしながら、ラットの胚の成長の後期の段階にお いて（Ｓｍｉｔｈ、　Ｃ，Ｌ、、　！９８３．．１．Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ 、　２２０：　２９−４３）及びカエルのものにおいて（Ｎｏｒｄｌａｎｄｅｒ 、　Ｒ，及びＳｉｎｇｅｒ　Ｍ、、　１９８２．　ＥＸｌｌ、　Ｎｅｕｒｏｌ、 　７５：　２２１−２２８）感覚軸索の集団は背側変速を形成するために、後柱 （ρｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｃｏｌｕｍｎ）のすぐ下で背側を髄を横切る。

２゜２．プロテオグリカン ブロテすグリカンは、約５０−９５９６のポリサッカライドと約５−５０％の蛋 白から成る、結合組織に豊富にみられる分子である。グリコサミノグリカンはプ ロテオグリカンの多糖鎖であり、アミン糖の誘導体である、グルコサミン又はガ ラクトサミンのいずれかから成る三糖の繰り返し単位を有する。負に荷電したカ ルポキニ・レート又は硫酸基は、少なくとも三糖の糖単位の１つに見い出される 。一般のグリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸塩（ＨＡ）、コンドロイチン硫 酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘハラン硫酸（ Ｈ３）及びヘパリン（Ｆ（Ｎ）を含有する。ヒアルロンＭ、コンドロイチン６− 硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸及びヘパリンの三糖単位の構造式は次のよ うである（図に示された以上の種々の程度の硫酸化を有する形状か存在すること に注意されたい）； （本頁以下余白） プロテオグリカンのグリコサミノグリカン鎖は、コア蛋白と呼ばれるポリペプチ ド主鎖に共存結合していることが知られている（Ｓｔｒｙｅｒ、　Ｌ、、　１９ ８１．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　笈２版、　Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　 ＆Ｃｏ、　ニューヨーク、第２００−２０３頁）。

プロテオグリカンと成長促進分子の組み合わせは、パイオニアの軸索が伸長する 多くの領域で存在する。神経細胞粘着分子（ＮＣＡＭ）並びにラミニンは、成長 する光学経路に沿ってプロテオグルカンと縦に一列に並んで存在している（Ｌｉ ｅｓｉ、　Ｐ、、及び５ｉｌｖｅｒ、　Ｊ、、　１９８８．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏ ｌ、　１３０：　７７４−７８５；　５ｉｌｖｅｒ及びＲｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ 。

１９８４、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、１０６：　４８５−４９９；　Ｂｏｒｋら、、１ ９８７．　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ。

２６４：　１４７−１５８）。

他の位置測定の研究において、トスネー（Ｔｏｓｎｅｙ）とランドメサ−（Ｌａ ｎｄｍｅｓｓｅｒ）は、後硬腫かアンシャンブルー染色により測定されるとおり に高レベルのグリコサミノグリカンを含有し、神経軸素の成長錘体はこれらの領 域を捜しめないことを示した（１９８５．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１０９：　 １９３−２１４）。フンデルブルグ（Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇ）らは、外側上皮で ケラタン硫酸の存在を確認した。ニワトリ前脳の研究によれば、コンドロイチン −６−硫酸は軸素が見い出されない皮質の板領域の下方にチャネルになって多量 に存在することを示している（Ｐａｌｍｅｒｔ　ら、　１９８６．５ｏｃｉｅｔ ｙ　ｆｏｒ　ＳｃｉｕｒＯｓｃｉｅｎｃｅｓＡｂｓｔｒａｃｔ　１２（２）：　 １３３４）　、ケラタン硫酸プロテオグリカンはラット大脳皮質（Ｖｉ　ｔｅｌ ｌｏら、　１９７８．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　５３ ９３０５−３１４）及びヒト脳の澱粉様小体で（Ｌｉｕ、　Ｈ，Ｍら、　１９８ ７．　、Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、　１４：　４９−６０）確認されている。

２．３．細胞成長のプロテオグリカン制御具なったプロテオグリカンは、種々の 異った細胞型の移動行為に対して広範な作用を与えることが示されている（Ｗａ ｌｉｃｋｅ、　Ｐ、Ａ。

＋９８８．　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、１０２：　１４４−１４８；　Ｄａｍａ ｎら、１９８８．　Ｊ、Ｃｅ１ｌＰｈｙｓｉｏ１．　＋３５：　２９３−３０） 　、ベリス（Ｐｅｒｒｉｓ）及びジョ／Ｘンソン（、Ｉｏｈａｎｓｓｏｎ）は、 一種のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンはインビトロにおいて神経稜細胞の 移動を阻害することを示している。

特定のグリコサミノグリカン／プロテオグリカンは、インヒドロでの神経突起の 成長及び細胞付着において阻害作用を有することを示している。カルホネット（ Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｏ）らは、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びヘパリン か三次元ＨＥＭＡ−ゲル培養システムにおいてフィブロネクチン上でひなの後板 神経節及びＰＣ−１２軸索成長を阻害することを示した（１９８３．　Ｊ、　Ｎ ｅｕｒｏｓｃｉ、　３（ＩＩ）２３２４−２３３５）。フィブロネクチンによる 神経突起の成長の支持は、ＨＨＭＡ／フィブロネクチンゲルにヘパリンを添加す ることにより存意に減少した。このプロテオグリカンは、高濃度において、コレ ラ毒Ｂ／ガングリオシドＧＭＩ−結合基質へのヒト神経芽細胞腫の付着及び神経 突起の形成をも阻害する（Ｍｕｎｇａｉら、　１９８８．　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ。

１７５：　２９９−２４７）。

未分画の軟骨プロテオグリカンは、わずかに精製された軟骨成分であるか、イン ビトロにおいて神経芽細胞がコラーゲン及びフィブロネクチンに結合するのを阻 害することが発見された（Ｒｉｃｈら、　１９８１．　Ｎａｔｕｒｅ　２９３： 　２２４−２２６）。デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳ　−ＰＧ）は、プ ラズマフィブロネクチン−被覆培養基質上に３Ｔ３神経芽細胞か付着し、拡散す ることを阻害するのか観察された（Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋａら、１９８７．　Ｊ 、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０５：　１４４３−１４５４）。

しかしながら、それ以前に、基本的にはヘパラン硫酸とデルマタン硫酸のグリコ サミノグリカン（ＧＡＧｓ）は、神経芽細胞（マウス３Ｔ３細胞）のフィブロネ クチンへの付着のメディエータ−として確認されていた。血清フィブロネクチン に結合したヘノくラン及びデルマタンＧＡＧｓは、他のプロテオグリカン、とり わけ種々のコンドロイチン硫酸及び少程度に硫酸化されたヘノくラン硫酸かカラ ムに結合しなかったにもかかわらず、セファロースに共有結合した（Ｌａｔｅｒ ｒａら、１９８０．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７ ７：　６６６２−６６６６）。

スルホン化されたグリコサミノグリカンは、抗菌防御機構の一部として、膀胱膜 に付着する菌の能力を減少させることか報告されている（Ｐａｒｓｏｎｓ、　Ｃ ，Ｌ、、　１９８６．　Ｕｒｏｌｏｇｉｃ　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｖｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ　１３（４）：　５６３−５６８．　Ｐａｒｓｏｎｓ、Ｃ，Ｌ、 ら、１９８１．　Ｊ、Ｉｎｆｅｃ。

Ｄｉｓ、１４４（２）：　１８０；　Ｐａｒｓｏｎｓ、　Ｃ，Ｌ、ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２５：　３２４−３２９＋Ｐａｒｓｏｎｓ、Ｃ，Ｌ、ら、１９７８．　 Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、９３（２）：　４２３−４３２）。

３、本発明の概要 本発明は、ケラタン硫酸（ＫＳ）、コンドロイチン硫酸（Ｃ３）、デルマタン硫 酸（ＤＳ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ　）、ヘノくリン（ＨＮ）及び／又はヒアルロ ン酸（ＨＡ）は神経突起成長、即ち軸索の成長、及び神経膠細胞の移動又は侵入 を阻害できるという発見に関する。神経突起成長、即ち、軸索の成長と神経再生 は、ここでは「神経成長」として言及されうる。

これらのグリカンの存在は、ラミニンやＮＣＡＭ＠ような神経成長促進因子の存 在下においてさえも、神経突起の成長を阻害する。

これらのグリカンは神経膠細胞、特に星状細胞かラミニン上で移動し又は侵入す るのを防止する。この結果、本発明はケラタン硫酸、及び、ケラタン硫酸を含む 分子及び組成物を、神経突起成長及び／又は神経膠細胞の移動又は侵入、又は神 経あるいは神経膠細胞の再生を防止するために使用する方法に関する。神経突起 の成長又は神経膠細胞の移動又は侵入を阻害する方法は、所望の場合には、治療 上使用できる。ケラタン硫酸を含む上記の分子は、これに限定されるものではな いか、ケラタン硫酸グリコサミノグリカン及びケラタン硫酸プロテオグリカンを 含有し、ケラタン硫酸プロテオグリカンが最も好ましい。さらに、本発明は、コ ンドロイチン硫酸を含有する分子及び組成物に関係し、神経突起の成長又は神経 膠細胞の移動又は侵入を阻害し、又は、避けるために上記のものを治療上使用す ることに向けられる。コンドロイチン硫酸を含有する分子は、これに限定される ものではないか、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンを含み、より好まし くは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む。本発明は、また、デルマタ ン硫酸を含有する分子及び組成物に向けられ、また、神経突起の成長又は神経膠 細胞の移動又は侵入を阻害し又は回避するため、これらのものを治療上使用する ことに向けられる。デルマタン硫酸の分子は、限定されるものではないが、デル マタン硫酸グリコサミノグリカン、より好ましくはデルマタン硫酸プロテオグリ カンを包含する。

他の態様においては、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘ パラン硫酸、ヘパリン及び／又はヒアルロン酸の阻害剤及び拮抗体、及びこれら を含有する分子及び組成物は、神経突起の成長を促進させ、神経膠細胞の移動又 は侵入を促進するために使用でき、治療上投与できる。上記の阻害剤及び拮抗剤 は、限定されるものではないが、ＫＳＳＣＳ、　ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡ 及びそれらの誘導体又はフラグメントに対する抗体、ＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳ、Ｈ Ｓ、ＩＮ又はＨＡを分解する酵素、ＫＳ、　Ｃ３，ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又は） （Ａに対して特異的なレクチン及びＫＳ、　Ｃ３，ＤＳ、　１．ｓ、　ＨＮ又は ＨＡに対して特異的な受容体の三糖拮抗剤を含有する。この態様において、神経 突起の成長及び神経膠細胞の移動又は侵入の促進は、ＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳ、　 ＨＳ、ＮＨ又はＨＡを含む分子の阻害的影響を除くことにより生ずるもので、内 因的又は外因的に加えられた分子により神経突起の成長又は神経膠細胞の移動又 は侵入の促進か可能となる。

他の態様において、本発明方法においてはケラタン硫酸を含む分子は、他のグリ コサミノグリカン又はそれらの三糖単位、好ましくは、コンドロイチン硫酸とと もに使用できる。

本発明は、また、ケラタン硫酸及び／又はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸 、ヘパラン硫酸、ヘパリン又はヒアルロン酸塩を含む分子及び組成物の有効量を 含む薬剤組成物を提供する。

後の節の実施例において詳述されるように、ケラタン硫酸は単独で、又は、コン ドロイチン硫酸のような他の分子と組み合わさって、胚のを髄中の上衣板を通し て軸索が伸長するのを阻害することに部分的に関連しうるということを示す免疫 組織化学的な局在性の資料が提供される。他の実施例においては、我々は、イン ビトロにおいて、ケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン又はデル マタン硫酸プロテオグリカンが濃度に依存して神経突起の伸長を活発に抑制する ことを示す。この実施例は、また、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸／コンドロ イチン硫酸は濃度に依存した態様で星状細胞を含む神経膠細胞の侵入又は移動を 阻害することを示す。

３．１．定義 本明細書で使用する場合、次の語は以下の意味を育するものである。

ＣｈＥ　：コリンエステラーゼ Ｃ８：コンドロイチン硫酸 ＤＲＧ　：後横神経節 ＤＳ　−ＰＧ　：デルマタン硫酸プロテオグリカンＥ１１．５：胚日数１１．５ ＧＡＧ　：グリコサミノグリカン ＨＡ　：ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩ＨＮ：ヘバリン ＨＲＰ　：西洋ワサビペルオキシダーゼＨ８：ヘパラン硫酸 １ｇ＝免疫グロブリン ＫＳ：ケラタン硫酸 ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ　：ケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネートＬＮ：ラミニン ＮＣＡＭ　：神経細胞付着分沿 ＮＧＳ　：正常ヤギ血清 Ｐ３．生後３日 ＰＢＳ　ニリン酸緩衝塩溶液 ＰＧ：プロテオグリカン ＲＣＳ　：ラット軟骨肉腫腫瘍細胞系軟骨コンドロイチン硫酸プロテオグリカン ＲＩＴＣ：ローダミンイソチオシアネートＴＢＳ／ＢＳＡ　：　トリス緩衝塩溶 液／牛血清アルブミンＴＰＡ　：テトラゴノロブスバープレアス　凝集素（ロー タステトラゴノ口ブス、ロータス　レクチン）４、図の説明 第１図は、胚日数１３．５　（Ｅ　１３．５）及びＥ１５．５のう・ソト頚部の を髄の模式的ダイアグラムである。成長するを柱（感覚の〉軸索（ＳＡ）と文運 する軸索（ＣＡ）に対する上衣板（ＲＰ）の関係が示されている。初期の文運す る軸索の背側集団は、上衣板の近（で始まる。

軸索は背側に伸長し、次いで、床板（ＦＰ）て交叉するために索の末梢の近くで 腹側に向かう。−次感覚求心性神経（ＳＡ）は２１３．５に卵形索の後接の入口 で待機し、２〜３セグメントの間をくちばし側に、及び尾側に向かう。を柱軸索 は成長とともに内側に移動し、Ｅ１５．５までには上衣板と境を接するようにな る。文運する軸索と同様に、を柱軸素は背側中心線境界を守る。

第２図。（Ａ）　８１１．５ラツトの頚部を髄の横向きの１μｍプラスチック切 片。上衣板はくさび型に成り始め、Ｅ１３．５で最も顕著になるであろう。細胞 は、より直線状である隣接する神経上皮細胞と比較して、アーチ状に配列する。

仮定の上衣板神経膠細胞の間の細胞外空間は、を髄の残部の細胞間にみられる空 間に比較して存意ではない（第３Ａ図を比較＞　；　ＣＣ１中心管（ｃｅｎｔａ ｉ　ｃａｎａｌ）、（２５０Ｘ）、（Ｂ）腹側変速軸索を染色する１ｃ１２抗体 でラベルしたＥｌｌ、５日目のラット頚部のを髄の１０μｍ低温保持（ｃｒｙｏ ｓｔａｔ）軸索。

成長のこの段階ではわずかに１個の神経突起か外側髄でラベルされている。背側 を髄では上衣板（ＲＰ）近くでラベル化した突起か欠除していることに注意され たい（２００Ｘ）、（Ｃ）図（Ｂ）の１ｃＩ２ラベル化神経突起の一層高倍率の 拡大図、（矢印）、（４００Ｘ）。成長のこの段階では抗−ＫＳ抗体による明白 な染色か、上衣板では欠けている。

第３図。Ｅ１３．５のラット頚部を髄の上衣板。（Ａ）上衣板（ＲＰ）神経膠は 軟膜表面に尖端突起を拡張し、終末足で停止する。これらの神経膠細胞の間には 、大きな細胞外空間の拡張性のネットワークが点在する。細胞と空間は一緒にな って、を髄の背側面でくさび型の領域を形成する。互いに接近して並置されてい る周辺領域の細胞と上衣板の細胞を比較されたい。周辺細胞及びその突起は、そ のうちのいくつかは文運するニューロンであるが、周界に沿って背側にそして上 衣板から離れてアーチを形成する。（６３０Ｘ）。（Ｂ）抗ケラタン硫酸（ａ− ＫＳ）モノクローナル抗体でラベルされた、（Ａ）と問合かつ同じ髄レベルの横 断の凍結切片。ケラタン硫酸エピトープは、成長のこの段階では上衣板（ＲＰ） に特異的である。ラベルされたパターンは神経膠細胞のくさび型の領域及び（Ａ ）で見られた上衣板の点在する細胞外空間と直接的に一致することに注意された い：ＣＣ１中心管、（６３０Ｘ）。

第４図。抗体ＩＣ１２でラベルしたＥ１３．５のラットの頚部を髄の横断の凍結 切片。文運する軸索（ＣＡ）は、それらかを髄の背側壁から周囲に沿って底板（ ｆｐ）に向かい、そこで中心線を横切り、腹部索へ向きを変えるとき、上衣板（ ＲＰ）から型にはまった経路をとる。

抗体１ｃ１２は、また、卵形束（ｏｖａｌ　ｂｕｎｄｌｅ　：　ｏｂ）　、後板 （ｄｒ）及び抜根神経節（ｄｒｇ）をラベルする、（１８０Ｘ）。

第５図。上衣板（ＲＰ）神経節と隣接するニューロンの間の境界、及び、８１３ ．５ラット順部を髄における神経突起の透過型電子顛微鏡写真。大きな細胞外空 間の１つの例か“ＲＰ”の真下に生じている（７．０ＯＯＸ　’）。

第６図。Ｅ１３．５のラットの頚部を髄における文運軸索と上衣板（ＲＰ）の関 係。（Ａ）モノクローナル抗体ＩＣ１２で局在化された文運する軸素（Ｃａ）は 、背側索に沿って細胞体（染色されていない）から生じ、上衣板から離れて進む 。文運する軸索は背側中心線を横切らない、（２５０Ｘ）。（Ｂ）隣接するを髄 の切片（第３図Ｂの低倍率）は、抗−ケラタン硫酸抗体（ａ−ＫＳ）でラベルさ れた上衣板を示す。を髄の他のどこにも反応生成物が欠乏していることに注意さ れたい。これらの２個の図面を重ねあわせると、文運する軸索の間には、重複す ることなく、上衣板神経節が局在することか示される：ＣＣ１中心路、（２５０ Ｘ）。

第７図。種々の抗−ケラタン硫酸モノクローナル抗体が（Ａ）ａ　−ＫＳ、（Ｂ ）　４−Ｄ−１及び（Ｃ）　８−Ｃ−２で局在化された、Ｅ１５．５ラツトの頚 部を髄の上衣板におけるケラタン硫酸エピトープの異なった発現（材料及び方法 は記載を参照のこと）。（Ａ）と（Ｂ）図においては、上衣板は軟膜表面から中 心路までラベルされるか、（Ｃ）図においては、上衣板の背側の、多くか免疫反 応性であるにすぎない。さらに、抗体４−Ｄ−１及び８−Ｃ−１は上皮（ｅ）を 認識しくＢ及びＣ）、抗体ＦＣ−２は索を囲む基底板（ｂｌ）を認識する。

（Ｃ）、　（Ａ、Ｂ、Ｃ＝４００Ｘ）。

第８図。上衣板のエンド−Ｂ−ガラクトシダーゼ及びケラタナーゼ消化。（Ａ） ３７°Ｃて２時間、コントロイチナーゼＡＢＣにより処理され、次いて、抗体（ ａ−ＫＳ）てケラタン硫酸か染色されたＥ１３．５ラツトの頚部を髄の断面。ラ ベルの模様は断面かコントロイチナーセＡＢＣにより予め処理されなかったとき に見られるものと変わらなかった（第６Ｂ図と比較されたい）。皮膚も通常はこ の抗体により染色される（４００Ｘ）。（Ｂ）２個のケラタン硫酸に特異的な酵 素である・エンド−Ｂ−ガラクトシダーゼ、及びケラタン硫酸て予め処理された Ｅ　１３ラツトの頚部を髄。この処理に続く抗−ＫＳ抗体によれば、ケラタン硫 酸のラベルはほとんど観察されない。これらの結果は、抗体４−Ｄ−１及び８− Ｃ−２を使用するＥ　１５動物におけるものと重複する。

第９図。他の抗体及びレクチンも上衣板神経節を認識するか、これらの領域に特 別なものではない。これらは、（Ａ）Ｌ２、（Ｂ）５Ａ５（高度にシアル酸化さ れたＮ−ＣＡＭ）、（Ｃ）　ａ−ＳＳＥＡ−１及び（Ｄ）ロータス（ｌｏｔｕｓ ）レクチン（ＴＰ、Ａ）。（Ａ）と（Ｂ）図はＥ１３．５のものであり、　（Ｃ ）と（Ｄ）図はＥ１５．５のラットを髄である。

（Ａ）図において、Ｌ２免疫反応性（「Ｖ」型パターン）である上衣板（ＲＰ） を、反応生成物か完全に存在しない床板（ｆｐ）と比較されたい。この明白な領 域の真下には、Ｘ字形に交差する文運軸索か横たわる。この抗体も上皮（ｅ）と 文運軸索（Ｃａ）をラベルする。

抗体５Ａ５（Ｂ）は、その他のものの中から文運軸索（Ｃａ）と上衣板（ＲＰ） をラベルする；ａ−５ＳＥＡ−１（Ｃ）は上衣板（ＲＰ）と床板（示されていな い）をラベルする。この抗体は、８−Ｃ−２（第７図Ｃ）のように、上衣板の背 側の大部分を認識するのみであることに注意されたい。しかしなから、幾つかの 断面は同様に上衣板のより低い部分において、この抗体による軽度のラベル化を 示す。ロータスレクチン（Ｄ）は背側中心線に沿って上衣板（ＲＰ）をラベルす る。

（Ａ、　１６０Ｘ　；　Ｂ、　１８０Ｘ　；　Ｃ，４００Ｘ　；　Ｄ、　４００ Ｘ）。

第１０図。Ｅ１３．５及びＥ１５．５のラットの頚部を髄におけるコリンエステ ラーゼの局在化。　（Ａ）　Ｅ　１３を髄におけるコリンエステラーゼの発現の パターンは、上衣板におけるケラタン硫酸に対する免疫染色のパターンと類似し ている。コリンエステラーゼは、索の他の位置、例えば、基底の神経上皮細胞（ ｂｅ）の室部分や旧Ｓの卵形束（ｏｂ）にも存在する（２５０Ｘ）。（Ｂ）　Ｅ 　１５．５に関して上衣板の形態における成長の制御された変化は、コリンエス テラーゼの発現における変化と一致する。コリンエステラーゼの発現のパターン は再度、ケラタン硫酸のそれと類似している。Ｅ１５．５においては、を柱軸素 （ｄａ）、基底上皮細胞（ｂｅ）、境界溝（ｓｌ）及び運動ニューロン（ｍｎ） も染色される、（２５０Ｘ）。（Ｃ）（Ｂ）で示された上衣板の高倍率は、成長 のこの段階におけるを柱軸索の上衣板神経節の近傍を密接に示している。コリン エステラーゼを柱軸索のサブ集団にも存在するように思われる、（６３０Ｘ）。

第１１図。２１５．５ラツトのを髄の横断面（上衣板を第１２図の抗−ＫＳラベ ルされた断面と比較されたい）。プラスチック断面は、神経膠細胞の先端及び基 底突起、及びこの柔膜及び中心路（ｅｃ）に対する関係を示す。を柱（ｄｃ）軸 索の上衣板神経節での近傍に注意されたい、（６３０Ｘ）。

第１２図。抗−ＫＳ抗体（ａ−ＫＳ）でラベルされたラット頚部の精Ｍ　（Ｅ　 １５．５）の低温保持断面（１０μｍ）。（Ａ）において、上衣板の背側部分は 、腹部分がより薄くなって、しようご状に開いている：ｄｃ、を柱（４００Ｘ） 、（Ｂ）高倍率での同様な断面は、を柱軸素が背側上成板細胞（矢印）に接近し 、それらと境を接するときのを柱軸索を示す。を柱軸素が侵入し続けるとき、こ れは上衣板の余部に沿って空間を充たす（６５０Ｘ）。

第１３図。ケラタン硫酸エピトープは、神経支配されていない他の領域により発 現される。多数の抗−ケラタン硫酸抗体によるラベル化は、Ｅ１５．５ラツトに おける成長過程の肋骨軟骨を囲む細胞（Ａ）及び（Ｂ）において、及び、上皮の 外層（Ｃ）により見い出される；　（Ａ　２５０Ｘ　；　Ｂ及びＣ，６３０Ｘ） 。

第１４図。６１７．５の上衣板は最早ケラタン硫酸エピトープを発現しないが、 ラベル化は依然として周囲の軟骨において存在する（１５０Ｘ）。

第１５図。ケラタン硫酸に対する抗体による、ハムスターの中脳の視蓋の背側中 心線の免疫組織化学的ラベル化。（Ａ）抗体４−Ｄ−１によるラベル化は、主に 、ワサビのペルオキシダーゼ反応生成物により示されるように視蓋中心線に沿っ てのみ生ずる、（４００Ｘ）。

（Ｂ）視蓋中心線は、また、免疫蛍光にて暗領域中に示される抗体８−Ｃ−２て ラベルされる。この抗体による基底層における上衣板のすぐ上の反応生成物の強 度に注意されたい（４００Ｘ）。ケラタン硫酸に対する他の抗体もこの領域を染 色する（示されていない）。

室における濃い染色に注意されたい。

第１６図。基体の調製方法：６０ミリのペトリ皿をメタノールとニトロセルロー スの混合物でコーティングし、層流フード内で空気乾燥した。セルロースストリ ップ（３５０μｍの巾）を所望の蛋白溶液（例えば、プロテオグリカン、ＰＧ、 プラスＬＮ又はＮＣＡＭ）とＲＩＴＣラベルに浸たし、垂直な細長い一片として ベトリ皿の中心に移す（平行線で示される）。吸気ガラスピペットで皿の全体に ラミニンを適用し、次いで直ちに媒質を適用する。ＤＲＧか切断され、種を移植 する用意か出来る迄、皿は蛍光を保存するために暗部に保存する。２４時間後に 、皿を固定し、カバーガラスを置き、写真をとる。

第１７図。コントロール。（Ａ）ストリップは１μｇ／ｍｌのラミニンとＲＩＴ Ｃを含有し、皿全体に１００μｇ／ｍｌのラミニンを拡散させる。

（Ｂ）ストリップはＩＯμｇ／ｍｌのラミニンとＲｆＴＣを含存し、皿全体に１ ００μｇ／ｍｌのラミニンを拡散させる。ニトロセルロースは移された最初の反 応試薬とのみ結合するので、ラミニン片はｌ及び１１００ｕ　／ｍｌ　（Ａ）又 はｌＯ及びｌｏｏμｇ／ｍｌ　（Ｂ）の交互の濃度を生ずる。矢印は（Ａ）にお いてレーンの境界を示しており、ＲＩＴＣ蛍光は（Ｂ）においてレーンの位置を 示す。各々の場合、神経突起は阻害の証拠を何ら示さずに、自由にレーンを横切 るが、このことは、プロトコールの特異性あるいはＲＩＴＣの毒性がいずれもこ のアッセイでは問題ではないことを示している、２５０　Ｘ。

第１８図。　１００μｇ／ｍｌラミニンを皿全体に拡散させて、牛ＫＳ／Ｃ３− ＰＧ　（１ｍｇ／ｍｌ）とＲＩＴＣをストリップに移す。皿の中心上に穏やかに 拡散された後板神経節は、ラミニンのストリップに付着しくＫＳ／Ｃ３−ＰＧ＋ ＲＩＴＣの小片の間の領域）、神経突起を送り出す。ラミニン上で豊かな成長が 起こっている間に神経突起がＫＳ／Ｃ５−ＰＧと出会うと、神経突起及び支持細 胞の阻害か生ずる：２５０Ｘ。

第１９図。ＫＳ／Ｃ３−ＰＧによる神経突起の成長阻害は濃度依存性である。こ のプロトコールにおいて、プロテオグリカンのストリップは左から右に０．２ｍ ｇ／ｍｌから１．　Ｏｎ＋ｇ／ｍｌの増大する濃度中に置かれる。

この図は、０．２ｍｇ／ｍｌ　（左）及び０．４ｍｇ／ｍｌ　（中心）を示す。

矢印はレーンの境界を示す。１．０ｍｇ／ｍｌで完全な阻害を示す第１８図と比 較されたい；４０Ｘａ 第２０図。神経突起か１　ｍｇ／ｍｌの牛ＫＳ／Ｃ５−ＰＧで積極的に阻害され たのか、または、誘導分子の欠除による単なる停止にすぎないのかを決定するた めに、我々はラミニンをプロテオグリカンと混合した。　（Ａ）において、１． ０ｍｇ／ｍｌのＫＳ／Ｃ５−ＰＧを１０μｇ／ｍｌのラミニン＋ＲＪＴＣと混合 する（蛍光はレーンの位置を示している）。豊富な成長を可能とするラミニンの 濃度か存在するときでさえも、神経突起は依然としてＫＣ／Ｃ５−ＰＧにより阻 害される（第１７図におけるコントロールを参照）。ラミニンの濃度か１００μ ｇ／ｍｌに高められるとき、神経突起はＫＳ／Ｃ５−ＰＧ金含有ストリップを横 断することかできる。２５０Ｘ。

第２１図。Ｉ　ｍｇ／ｍｌのＫＳ／Ｃ５−ＰＧを２つの濃度のポリシアル酸化さ れたＮＣＡＭと混合したものに対する、ＤＲＧ神経突起の応答：１０μｇ／ｍＩ のＮＣＡＭで、神経突起はＫＳ／Ｃ３−ＰＧにより阻害される。しかしながら、 ラミニンの高濃度とは異なって、　１００μｇ／ｍｌのＮＣＡＭは、依然として すべてではないが、２．３の神経突起に対しては阻害的である；４０Ｘ。

第２２図。ＮＣＡＭ混合物に対するコントロール。ｌＯμｇ／ｍｌのボリンアル 酸付加されたＮＣＡＭを含有するストリップは、神経突起に対して誘導性基質を 提供する。ストリップ中１００μｇ／ｍｌのラミニンからＮＣＡＭに増大する神 経突起はパターン変化を示さず、又は、繊維束形成において変化を示す、１６０ Ｘ。

第２３図。酵素消化アッセイ■。（Ａ）ＤＲＧ神経突起は、１　ｍｇ／ｍｌの濃 度での牛ＫＳ／Ｃ３−ＰＧに対してみられるのと同じ態様で、ｌ　ｍｇ／ｍｌの ひなＫＳ／Ｃ３−ＰＧにより阻害される：垂直の矢印はレーン境界の位置を示す ＋　（Ｂ）　ＫＳ／Ｃ３−ＰＧをケラタナーゼで処理するとき、多くのものは依 然として阻害されるか、幾つかの神経突起は横切る。

垂直の矢印はレーンの境界を示す：水平の矢印はレーンに伸長した神経突起を示 す；２５０Ｘ。

第２４図。酵素消化アッセイ■。　（Ａ）　ＫＳ／Ｃ３−ＰＧをコンドロイチン ＡＢＣリアーゼで処理すると１、幾分かの阻害は依然として明らかであるが、多 くの神経突起がストリップを横切ることを可能とする：垂直の矢印はレーンの１ つを示す、　４０Ｘ、（Ｂ）　ＫＳ／Ｃ３−ＰＧをケラタナーゼ及びコンドロイ チンＡＢＣリアーゼの両方で処理し、蛋白核とＬＮのみを残すと、神経突起の阻 害はもはやみられない。

この実験は、非阻害性作用を示す中性分子の存在のためのコントロールとしても 役立つ（ｌＩ論を参照）。矢印と蛍光はレーンの位置を示す、　１００Ｘ。

第２５図。ラット軟骨肉腫軟骨プロテオグリカン（ＲＣ３；　Ｉｍｇ／ｍｌ）は コンドロイチン硫酸を含有するか、ケラタン硫酸鎖は含有しない。コンドロイチ ンは上述の牛及びひなのＫＳ／Ｃ３−ＰＧのように、Ｃ−４−Ｓ形態であり、Ｃ −６−３形態ではない。この反応試薬では、部分的な阻害かみられるが、牛やひ なのＫＳ／ＣＳ−・ＰＧと同じ程は、神経突起の阻害において有効ではない。垂 直の矢印はレーンの境界を示ず、水平の矢印は、レーンに向かって伸長する神経 突起を示す。

４０Ｘ０ 第２６図。Ｃ６神経膠細胞の侵入に対するインヒドロアッセイ。

（Ａ）侵入の阻害。ストリップ上には細胞は見られない。（Ｂ）侵入のわずかな 阻害。ストリップ上の少数の細胞の存在に注意されたい。細胞は融合性ではない 。（Ｃ）侵入の阻害はない。細胞の移動及び融合性はストリップ上で明らかであ る。

５、発明の詳細な説明 本発明は、ケラタン硫酸（ＫＳ）、コンドロイチン硫酸（Ｃ３）、デルマタン硫 酸（ＤＳ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン（ＨＮ）、及び／又はヒアルロン 酸（ヒアルロン酸塩、ＨＡ）が、神経突起の成長即ち軸索成長、又は神経再生（ ここでは、“神経成長”という）、又は神経膠細胞特に星状細胞の移動、侵入又 は再生を阻害しうるという知見に関する。神経突起の成長即ち神経成長の阻害は 、ラミニンやＮＣＡＭのような神経成長促進因子の存在下であっても、ＫＳ及び ／又はＣ３５ＤＳ、　ＨＳＳＨＮ又はＨＡから生ずる。神経膠細胞、特に、星状 細胞の移動又は侵入の阻害は、ラミニンの存在下であってもＫＳ及び／又はＣ３ ，ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡから生ずる。したかって、本発明は、神経突起 の成長及び／又は神経膠細胞の移動又は侵入、又は神経又は神経膠細胞の再生を 阻害又は防止するため、そして、所望の場合には、治療のために、ＫＳ及びＫＳ を含む分子及び組成物を使用する方法に向けられる。ＫＳから成るかかる分子は 、限定されないが、ＫＳグリコサミノグリカン及びＫＳプロテオグリカンを含み 、ケラタン硫酸プロテオグリカンか最も好ましい。本発明は、さらに、Ｃ３を含 む分子及び組成物、ならびに、神経突起の成長、神経膠細胞の移動又は侵入、又 は、神経又は神経膠細胞の再生を阻害し又は防止するために前記のものを治療上 使用することに向けられる。Ｃ８を含む分子は、限定されるものではないが、Ｃ Ｓグリコサミノグリカン及びＣＳプロテオグリカンを包含し、コンドロイチン硫 酸プロテオグリカンが好ましい。本発明は、また、デルマタン硫酸を含む分子及 び組成物、並びに、神経突起の成長、神経膠細胞移動又は侵入、又は神経又は神 経膠細胞の再生を阻害し又は防止するための前記のものの治療上の使用に向けら れる。ＤＳを含む分子は、限定されないが、ＤＳグリコサミノグリカン及びＤＳ プロテオグリカンを含み、デルマタン硫酸プロテオグリカンが好適である。

本発明は、さらに、ヘパラン硫酸、ヘパリン及びヒアルロン酸塩を含有する分子 、及び、神経突起の成長、神経膠細胞の移動又は侵入、又は神経又は神経膠細胞 の再生を阻害し、又は防止するための上記のものの治療上の使用に向けられる。

他の態様において、ＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡの阻害剤及 び拮抗剤、及びこれらを含有する分子及び組成物は、神経突起の成長、又は神経 の再生即ち神経成長、又は神経膠細胞特に星状細胞の移動、侵入又は再生を促進 するために使用でき、治療上投与されうる。この阻害剤及び拮抗剤は、これに限 定されるものではないか、ＫＳ、　Ｃ３，ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡに対す る抗体、結合領域を有するこれらの誘導体又はフラグメント、ＫＳ、　ＣＳ、　 ＤＳＳＨＳ、　ｌ（Ｎ又はＨＡを分解する酵素、ＫＳ、　Ｃ５５ＤＳ、　ＨＳ、 　ＨＮ又はＨＡに特異的なレクチン、及びＫＳ、　Ｃ３，ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ 又はＨＡに特異的な受容体の三糖拮抗剤を含む。

この態様において、神経突起の成長即ち軸索成長、又は神経膠細胞特に星状細胞 の移動又は侵入、又は神経あるいは神経膠細胞の再生の促進は、ＫＳＳＣ３，Ｄ Ｓ、　ＨＳ、　ＩＩＮ又は）ＩＡを含む分子の阻害的な影響を取り除くことによ り生じ、こうして、神経突起の成長即ち軸索成長、又は神経膠細胞特に星状細胞 の移動又は侵入、又は神経あるいは神経膠細胞の再生の促進は、内因的又は外因 的に分子を加えることにより可能となる。

本発明のその他の態様に関し、本発明の方法においては、ＫＳを含有する分子は 他のグリコサミノグリカン又はそれらの三糖単位、好ましくはコンドロイチン硫 酸を含む分子とともに使用され得る。

本発明は、また、ＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳＳＨＳ、　ＨＮ及び／又はＨＡを含む有 効量の分子及び組成物を含有する医薬組成物を提供する。

後章の実施例で詳細に述べられるように、免疫組織化学的に局在するデータが提 供され、これは、ＫＳが単独で、又はコンドロイチン硫酸のような他の分子と組 み合わさって、胚のを髄における上衣板を通して軸索が伸長するのを阻害するの に一部関係しうるということを示している。他の実施例において、我々はインヒ ドロにおいてケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが濃度に依存 して神経突起の伸長を積極的に阻害することを示す。

他の実施例において、我々はデルマタン硫酸がインビトロでのニューロン性のセ ルライン及び神経細胞の成長を阻害することを示す。インビトロでの他の実施例 は、ＫＳ／Ｃ５−ＰＧ及びＤＳ−ＰＧは神経膠細胞及び星状細胞の移動及び侵入 を阻害することを示す。

５．１０本発明の阻害性組成物 神経突起の成長、又は神経膠細胞特に星状細胞の移動又は侵入、又は神経あるい は神経膠細胞の再生を阻害又は防止するために、本発明において使用することが 意図される組成物（ここでは、“阻害性組成物”という）は、少なくともＫＳ、 　Ｃ３，ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡの二接から成る分子の有効量を含有する 。こうして、例えば、本発明の範囲を限定するものではないか、上記分子はＫＳ 二三糖ＫＳグリコサミノグリカン、ＫＳプロテオグリカン、Ｃ３二糖、ＣＳグリ コサミノグリカン、ＣＳプロテオグリカン、ＤＳ二三糖ＤＳグリコサミノグリカ ン、ＤＳプロテオグリカン、又はこれらのいずれかを含有する化合物とすること ができる。本発明の特定の態様において、上記の阻害性組成物は、ＫＳを含む上 記分子に加えて、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を含む上記分子及びデルマタン硫 酸（ＤＳ）を含む上記分子から成る群より選ばれる他のグリコサミノグリカン又 はプロテオグリカン又はそれらの二接を含有する。特定の態様において、ＫＳ及 びＣ３の両方を含むプロテオグリカン（ＫＳ／Ｃ５−ＰＧ）が使用され得る。コ ンドロイチン硫酸のＣ−４−Ｓ及びＣ−６−Ｓのイオンの結合型は両方とも本発 明の範囲内のものと考えられるが、神経突起の成長及び神経の成長を阻害するた めにはＣ−６−Ｓ型が好ましい。本発明で使用するＫＳは、これに限定されない が、タイプ■　（角膜の）ＫＳ（分枝を有せず、高度に硫酸化されており、かつ 、エンド−ｂ−ガラクトシダーゼ及びケラタン硫酸か順次に使用されるとき一層 容易かつ完全に分解される（Ｍｅｌｒｏｓｅ及びＧｈｏｓｈ、　１９８５．　Ａ ｎａｌ。

Ｂｉｏｉｅｈｅｍ、　１７０：　２９３−３００））及びタイプ■（骨格の）　 ＫＳを含有する。

本発明の他の特別な態様では、分子はＤＳを含み得る。

本発明において使用するための、ＫＳ、　Ｃ５５ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡ 、及び他のプロテオグリカン／グリコサミノグリカンを含む分子は、当該分野で 知られている常法により得ることができる。例えば、ＫＳ／Ｃ３−ＰＧは公知の 方法により（Ｃａｒｒｉｎｏ、　Ａ、及びＣａｐｌａｎ、　Ａ、　１．。

１９８５、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：　１２２−１２７）、四肢 の間充織の細胞等の細胞培養した軟骨基質から分離しうる。他の態様において、 ＫＳ−ＰＧはＫＳ−ＰＧに富んだ原料であるフカのヒレから分離することかでき る。ＫＳＳ二叉はＫＳグリコサミノグリカンが望ましい態様においては、ＫＳＳ 二叉はＫＳグリコサミノグリカンはＫＳ−ＰＧをエンド−ｂ−ガラクトシダーゼ 又はケラタン硫酸でそれぞれ消化した後に分離することができる（エンド−ｂ− ガラクトシダーゼはＫＳ二糖残基を特異的に開裂させる；ケラタン硫酸は蛋白へ のグリコサミノグリカン結合において特異的に開裂させる）。代わりに、ＫＳＳ 二叉びグリコサミノグリカンは市販の原料から化学的に合成でき、又は購入でき る。

簡単に述べると、１つの単なる特別の実施例としては、プロテオグリカンはプロ テアーゼインヒビターを含有する４モルのグアニジニウムクロリドにて軟骨基質 から抽出でき、ＣｅＣ１平衡密度勾配遠心分離及びセファロースＣＬ−２Ｂクロ マトグラフィーにより精製することが可能である（Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈら、 　１９８７．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６２：　１０５７４−１０５８１）。

５．２０本発明の成長促進組成物 本発明は、また、神経突起の成長、又は神経膠細胞特に星状細胞の移動又は侵入 、又は神経あるいは神経膠細胞の再生を促進する組成物（ここでは“成長−促進 組成物”という）を使用する方法を提供する。上記の成長促進組成物は、ケラタ ン硫酸（ＫＳＳ二叉ＫＳグリコサミノグリカン、ＫＳプロテオグリカン、又はこ れらを含む分子により示されるとおりのもの）のインヒビター又は拮抗剤又は神 経突起の成長及び神経膠細胞の移動又は侵入、又は神経あるいは神経膠細胞の再 生を阻害する活性を破壊する剤（ここでは、総称して“成長促進因子“という） を含む。この生長促進因子は、限定されるものではないか、ケラタン硫酸を認識 する抗体、結合領域を含むこれらの誘導体及びフラグメント、ケラタン硫酸を分 解する酵素、ケラタン硫酸に特異的なレクチン及びケラタン硫酸受容体の三糖拮 抗剤を含む（後記する第７．１．６，３及び７．２．４゜４、節を参照）。

他の態様において、成長促進組成物はＣＳ　（ＣＳ二三糖ＣＳグリコサミノグリ カン、ＣＳプロテオグリカン又はこれらをを含有する分子により示されるもの） のインヒビター又は拮抗剤もしくは神経突起の成長、又は神経膠細胞の移動又は 侵入、又は神経あるいは神経膠細胞の再生を阻害する活性を破壊する剤を含む。

こうして、本発明は、また、Ｃ３（これのフラグメント）に対する抗体、Ｃ８を 分解する酵素、Ｃ３に特異的なレクチン、及びＣ８受容体の三糖拮抗剤にも向け られる。

他の態様において、成長促進組成物はＤＳ　（ＤＳ二三糖ＤＳグリコサミノグリ カン、ＤＳプロテオグリカン、又はこれらを含む分子により示される）のインヒ ビター又は拮抗剤又は神経突起の成長、又は神経膠細胞の移動又は侵入、又は神 経あるいは神経膠細胞の再生を阻害する活性を破壊する剤を含む。こうして、本 発明は、また、ＤＳ　（及びそのフラグメント）に対する抗体、ＤＳを破壊する 酵素、ＤＳに特異的なレクチン及びＤＳ受容体の三糖拮抗剤に向けられる。

さらに他の態様において、成長促進組成物はＨＳ、　ＨＮ又はＨＡ　（ＨＳ、Ｈ Ｎ又はＨＡの三糖、ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡグリコサミノグリカン、又はＨＳ。

ＨＮ又はＨＡプロテオグリカン、又はこれらを含む分子により表わされるものと して）のインヒビター又は拮抗剤又は神経突起の成長、又は神経膠細胞の移動あ るいは侵入、又は神経あるいは神経膠細胞の再生を阻害する活性を破壊する剤を 含存する。こうして、本発明はＨＳ、　ＨＮ又はＨＡ　（及び、それらのフラグ メント）に対する抗体、ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡを破壊する酵素、ＨＳ、　ＨＮ又 はＨＡに特異的なレクチン及びＨＳ、　ＨＮ又はＨＡ受容体の三糖拮抗剤にも向 けられる。

５．２．１．抗体組成物 ケラタン硫酸、ＣＳ、　ＤＳＳＨ３，ＨＮ又はＨＡを認識し、かつ、使用しうる 抗体は、予め分離されている既知の抗体に加えて新しく製造しうる抗体を含む。

ＫＳＳ二叉ＫＳグリコサミノグリカン、ＫＳ−ＰＧ、又はこれらを含む組成物は 、抗−ＫＳ抗体を産生ずるための免疫源として使用し得る。

Ｃ３二糖、ＣＳグリコサミノグリカン、Ｃ５−ＰＧ、又はこれらを含む組成物は 、抗−Ｃ３抗体を産生させるための免疫源として使用しうる。

ＤＳ二三糖ＤＳグリコサミノグリカン、ＤＳ−ＰＧ又はこれらを含有する組成物 は、抗−ＤＳ抗体を産生させるための免疫源として使用しうる。ＫＳ、　Ｃ３， ＤＳ、　Ｈ３ＳＨＮ又はＨＡのエピトープに対するポリクローナル抗体を製造す るために、当該分野で既知の各種の方法か使用できる。抗体を製造するために、 限定されるものではないか、ウサギ、マウス、ラット等を含む種々のホスト動物 がＫＳ、　Ｃ３，ＤＳ、ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡ−含有組成物の注射により免疫可 能である。宿主の種に依存して、免疫応答を増大させるために種々のアジュバン トが使用でき、限定されるものではないが、これには、フロイントのもの（完全 及び不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような表 面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョ ン、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅ ｍｏｃｙａｎｉｎｅｓ）、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ　（Ｂａｃｉｌｌｅ 　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウムバルブムのような 潜在的に使用しうるヒトアジュバントを含む。

好適な態様において、ＫＳＳＣＳＳＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡに対するモノ クローナル抗体が製造される。

ＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＮＡに対するモノクローナル抗体を 製造するには、培養における連続細胞系により抗体分子の産生を提供する如何な る方法も使用しうる。例えば、初期にコーラ−及びミルスタインにより開発され たハイブリドーマ法（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：　４９５−４９７）は 、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法ＣＫｏｚｂｏｒら、　１９８３ ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：　７２）、ヒトのモノクローナル 抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら。

１９８５、　ｉｎ　”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　 Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ”、　ＡｌａｎＲ，Ｌｉ５ｓ社、第７７−９６頁 ）及び学習者とその仲間の組み換えＥ、ｃｏｌｉライブラリー法（Ｓａｓｔｒｙ ら、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、 Ａ。

８６：　５７２８−５７３２）等と同様に、本発明の範囲内にある。

治療のために使用するモノクローナル抗体は、ヒトのモノクローナル抗体又はキ メラのヒト−マウス（又は他の種）のモノクローナル抗体であろう。ヒトのモノ クローナル抗体は、当該分野で既知の多くの手法のいずれかにより製造しうる（ 例えば、Ｔｅｎｇら。

１９１３３、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、 　８０：　７３０８−７３１２；　Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３．　ｒｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：　７２−７９；　０１ｓｓｏｎら、１９８２．　Ｎ ｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９２：　３−１６を参照）。キメラの抗体分子は、マウスの 抗原−結合領域にヒトの定常領域を含ませて、製造され得る（Ｍｏｒｒ　ｉ　ｓ ｏｎら、、１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、 Ａ、８１：　６８５１；　Ｔａｋｅｄａら、、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１ ４：　４５２）。

本発明により使用しつる過去に製造されたＫＳに対する抗体は、限定されるもの ではないが、次のものを含む：抗体ＭＺ１５　（Ｚａｎｃｔｔｉら、、　１９８ ５．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０１：　５３−５９）　（ＫＳの硫酸化 ポリＮ−アセチルラクトサミン領域に対して特異的）；　１／２０１５−Ｄ−４ （Ｃａｔｅｒｓ。

ら、、１９８３．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８：　８８４８−８８５４） 　；　４／８／１−Ｂ−４（Ｃａｔｅｒｓｏｎ　ら、、１９８５．　Ｆｅｄ、Ｐ ｒｏｃ、４４：　３８６−３９３）　（１／２０１５−Ｄ−４及び４／８／１− ８−４はともにＭＺ＋５と重複するエピトープを認識するか、それぞれ、ヒトの 関節の軟骨及び雄の子牛の鼻軟骨に対して製造された）＋　４−Ｄ−１；　及び ８−Ｃ−２（４−Ｄ−１及び８−Ｃ−２はともにニワトリの骨髄に対して製造さ れ、ケラタン硫酸の高度に硫酸化された形態の２つの異なったエピトープを認識 する）：そして、ａ−Ｋｓモノクローナル抗体１／２０１５−Ｄ−４も商業的に 入手される（ＩＣＮＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｌｉ５ｌｅ、　ｆ ｌｌｉｎｏｉｓ、カタログ番号Ｎ（Ｌ６９６２５１）。

モノクローナル抗体３−８−３　（市販されている）は、コンドロイチンＡＢＣ リアーゼによるＣ−６−５型の消化の後で、コンドロイチン硫酸のＣ−４−Ｓ型 を特異的に認識する（Ｃｏｕｃｈｍａｎ、　Ｊ、　Ｒ，、１９８４゜Ｎａｔｕｒ ｅ　３０７：　６５０−６５２）。

ＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳＳ）Ｉｓ、　ＨＮ又はＨＡエピトープに対する抗体の分子 状クローンは、既知の方法で製造することができる。組換えＤＮＡ法（Ｍａｎｉ ａｔｉｓら、１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃ０１（ｌ　Ｓｐｒｌｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）！ａｒｂｏｒ、二！−ヨーク）は、モノクローナル抗体分子 又はその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築するために使用され得る。

抗体分子は、既知の方法、例えば、免疫吸着又はイノムアフィニティー　りロマ トグラフィー、ＨＰＣＬ　（高性能液体クロマトグラフィー）のようなりロフト 法、又はこれらの組み合わせにより精製され得る。

分子の結合領域を含む抗体フラグメントは、既知の方法で製造しつる。例えば、 限定されるものではないか、これらのフラグメントは次のものを含む：抗体分子 のペプシン消化により製造しうるＦ（ａｂ’　）２フラグメント；このＦ（ａｂ ’　）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂ’フラグメ ント、及び抗体分子をパパインと還元剤で処理して得られるＦａｂフラグメント 。

５　、２．２．酵素組成物 本発明の実施に際して、ケラタン硫酸を分解する酵素を使用することができ、限 定されないが、これはエンド−ｂ−ガラクトシダーゼ及びケタラーゼを含む。特 定の態様において、ＫＳを分解するために、エンド−ｂ−ガラクトシダーゼ及び ケラタナーゼの両方を同時に、又は、順次に使用することができる。本発明の他 の態様において、ＫＳを分解する酵素は、他のプロテオグリカン／グリコサミノ グリカンを分解する酵素、例えば、コンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸を分 解する酵素と同時に、又は、順次に使用しつる。特別の面において、コンドロイ チン硫酸を分解する酵素はコンドロイチンＡＢＣリアーゼである。

エンド−ｂ−ガラクトシダーゼ、ケラタナーゼ、及びコンドロイチンＡＢＣリア ーゼは市販されている（例えば、Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｒｃ）。

他の面において、Ｃ３を分解する酵素が本発明の実施において使用でき、これは 、限定されないか、コンドロイチナーセ及びコンドロイチンＡＢＣリアーゼを含 む。

さらに、池の面において、ＤＳを分解する酵素か本発明の実施（こおいて使用で き、限定されるものではないか、コンドロイチンＡＢＣリアーゼを含む。

また、本発明の成長促進組成物のその他の面において、ヘノくラン硫酸、ヘパリ ン又はヒアルロン酸塩を分解する酵素を使用することかできる。この酵素は、限 定されるものではないか、へ＜ラナーゼ及びヒアルロニダーゼを含む。

５　、２．３．他の組成物 アグルチニンとも言及され、ＫＳ、　Ｃ３，ＤＳ、　Ｈ３，ＨＮ又はＩ（、Ａｉ こ特異的なレクチンは、本発明の成長促進組成物の他の面を構成する。

ケラタン硫酸に結合するレクチンは本発明を実施するとき（こ使用しうる。加え て、コンドロイチン硫酸と結合するレクチン（よ、本発明の実施において使用で きる。他の面において、デルマタン硫酸と結合するレクチンは本発明の実施に際 し使用しうる。さら（こ他の面において、ヘパラン硫酸、ヘパリン、又はヒアル ロン酸塩に対して特異的なレクチンは、本発明の実施において使用しつる。

特定の態様において、Ｎ−アセチル−Ｄ−グリコサミンに特異的なトリチウム化 したブルガリス（Ｖｕｌｇａｒｉｓ、小麦胚）から得られるレクチンが使用しう る。トリチウム化したブルガリスレクチンは、ＫＳ、　ＣＳ及びＯ３に結合する 。他の態様において、テトロコ゛ノロブスブルブレアアグルチニン（ＴＰＡ：Ｔ ｅｔｒｏｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｐｕｒｐｕｒｅａｓ３ｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）か使 用され得ろ。テトロゴノロブスブルプレアは、トウサイ（ａｓｐａｒａｇｕｓ　 ｐｅａ）　、ウィンシトピー（ｗｉｎｇｅｄ　ｐｅａ）及びロータス（ｌｏｔｕ ｓ）アグルチニン又はレクチンとして知られている。この発明の実施　に際し育 用な他のレクチンは、決して限定されるものではないが、アブルスブレ力トリウ ス（ａｂｒｕｓ　ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）　（Ｊｅｑｕｉｒｉｔｙ　ｂｅａｎ 　ａｇｇＬｕｔｉｎｉｎ）、アラキスヒボゲ了（ａｒａｃｈ−ｉｓ　ｈｙｐｏｇ ｅａ）　（ピーナツツアグルチニン）、バンデイラエアシンプリシフアリア（ｂ ａｒ＋ｄｅｉｒａｅａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）、エリスリーナコラロデ ンドロン（ｅｒｙｔｈｒｉｎａ　ｃｏｒａｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ）　（コーラル 本のアグルチニン）、ヘリックスボマチア（ｈｅｌｉｘ　ｐｏｍａｔｉａ）　（ Ｒｏｍａｎｓｎａｉｌ　ａｇｇｌｕｔｉｎ）及びヘリックスアスベルシア（ｈｅ ｌｉｘ　ａｓｐｅｒｓｉａ）　（ｇａｒｄｅｎ　５ｎａｉｌ　ａｇｇｌｕｔｏｎ ｉｎ）　、リムルスボリフエムス（ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）　 （ｌｉｍｕｌｉｎ又はｈｏｒｓｅｓｈｏｅ　ｃｒａｂ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ） 、マクラボミツエラ（ｍａｃｌｕｒａ　ｐｏｍｉｆｅｒａ）　（ｏｓａｇｅ　ｏ ｒａｎｇｅ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）　、モモルデカチャランチア（ｍｏｍｏｒ ｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ）、ファゼオルス　リリメンシス（ｐｈａｓｅｏ ｌｕｓ　１ｉｎ＋ｅｎｓｉｓ）　（Ｉｉｍａ　ｂｅａｎ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ）、ファゼオルスプルガリス（ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）　（ｒ ｅｄ　ｋｉｄｎｅｙ　ｂｅａｎ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ブソフす力ルブステ トラゴノロブス（ｐｓｏｐｈｏｅａｒｐｕｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ） 　（ｗｉｎｇｅｄ　ｂｅａｎ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ソフすラ　ジャポニカ （ｓｏｐｈｏｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）　（ｐａｇｏｄａ　ｔｒｅｅ　Ｉｅｔｉ ｎ）、ウレックスユーロバス（ｕｌｅｘ　ｅｕｒｏｐａｓ）　（ｇｏｒｓｅ　ａ ｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ビシア　ビロサ（ｖｉｃｉａ　ｖｉｌｌｏｓａ）　（ｈ ａｉｒｙ　ｖｅｔｃｈ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、バグナラジアータ（ｖａｇｎ ａ　ｒａｄｉａｔａ）　（ｍｕＢ　ｂｅａｎ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、及びウ イステリアフロリブンダ（ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）　（ｊａ ｐａｎｅｓｅｗｉｓｔｅｒｉａ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）等を含むＫＳ、　Ｃ３ ，ＤＳ、　Ｈ３，ＩＮ又はＨＡを含む三糖、グリコサミノグリカン又はプロテオ グリカンに結合するいかなるレクチンも、本発明の成長促進組成物において使用 しうる。

ＫＳ、　Ｃ３５ＤＳ、　ＨＳ、ＩＮ又はＨＡに特異的な神経又は神経膠細胞上の 受容体を抑制する三糖拮抗剤は、本発明を実施する際に使用しうる。適当な二種 の拮抗剤はＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳ、　）Ｉｓ、　ＨＮ又はＨＡに対する受容体に 結合するが、これらの阻害機能には影響しない。

プロテオグリカン合成の代謝ブロッカ−も本発明において使用しうる。プロテオ グリカン又はグリコサミノグリカンの合成又は分泌を阻害又は防止する薬物又は 剤は、ＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡの合成又は分泌を防止し 、その結果、ＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳ、　ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡの阻害作用を排除 する。

５．３．治療のための使用 ５．３．１．本発明の阻害組成物 神経突起の生長、神経膠細胞の移動又は侵入、又はあるいは神経膠細胞の再生を 阻害することか望ましい場合には、本発明の阻害組成物は治療上有用であり得る 。例えば、阻害組成物は神経膠腫や神経組織の腫瘍、例えば、神経芽腫のような 悪性のＢ瘍をもつ患者の治療に際して使用しつる。他の態様においては、神経腫 （軸素が適当なターゲットを失なった、又は、神経の生長のための基質経路を失 なった場合の状態に関連する無秩序の軸索の成長）の治療のために使用しつる。

例えば、切断、外傷又は先天的な異常なとに関連する神経腫の治療を行うことか できる。神経の成長促進因子の過剰生産から生ずる異常は、これに限定されるも のではないが、神経成長因子、毛様体の向神経性因子、脳由来の成長因子、ラミ ニン、ＮＣＡＭ、Ｌ２及び５ＳＥＡ−１を含むものは、阻害組成物を投与して治 療することかできる。阻害組成物は、中枢及び／又は末梢の神経系の異常を治療 するために使用し得る。

他の態様において、本発明の生成物は外傷、手術、感染（ウィルス又は細菌）、 代謝疾患、悪性腫瘍、毒性薬物への露出又は他の過剰形成の場合に引き起こされ る神経膠細胞の移動又は侵入に対するバリアーとして使用しつる。コーティング 方法により前記した状態から器官又は組織を特異的に保護するために、これらを 使用することができる。例えば、後板の神経節、視神経、及び視神経の交差は、 非コントロールの細胞の侵入及び付着から保護するために、プロテオグリカンで コーティングしうる。これは予防処置として有用であり、又は、既に発病した患 者の症状を治療する際に適用しうる。

−の態様において、単独の、又は、いかなる分子形状として見い出されてもよい コンドロイチン硫酸とともに製造されたあるいは見い出されるあらゆる分子形状 におけるケラタン硫酸を含有する、又は、いかなる分子形状で見い出されてもよ いデルマタン硫酸を含む組成物は、優先的に、神経突起の生長を阻害するために 使用しつる。他の態様において、知覚されるときは如何なる分子形であってもよ い、ケラタン硫酸及び／又はコンドロイチン硫酸又はデルマタン硫酸は、神経膠 細胞、特に星状細胞の移動又は侵入を優先的に阻害するのに使用しうる。

５　、３．２．本発明の成長−促進組成物本発明の成長促進組成物は、神経突起 の成長が阻害されている場合、及び、神経膠細胞、特に星状細胞の移動、侵入又 は再生か望まれているような、神経突起の成長又は神経再生が望まれる場合の処 決において、治療上使用され得る。成長促進組成物は外傷、手術、虚血、感染、 代謝病、栄養失調、悪性腫瘍、毒物、バラネオプラスチック症、発作、神経系の 再生不良等により神経又は神経膠細胞か損傷を受けた患者に投与しうる。上記異 常の例としては、これに限定されるものではないか、アルツハイマー症、パーキ ンソン氏病、ハンチントン舞踏症、筋萎縮性の外側硬化症、進行性核上麻痺（ｓ ｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ　ｐａｌｓｙ）及び末梢神経病か挙げられる。アルツハ イマー症又はシステミックな類澱粉症（ａｎｙ！ｏｉｄｏｓｉｓ）の治療に対す る特定の態様に関し、特定の一面において成長促進組成物は類澱粉症の斑点部位 に到達可能とするために治療上適用することかできる（Ｓｅｌｋｏｅ、　Ｄ、　 Ｊ、、　１９８９．　Ｃｅ１ｌ　５８：　６１１−６１２を参照）。他の特定の 態様において、本発明の成長促進組成物は、形成過程にある廠痕（ｓｃａｒ）ま たは存在している廠痕を通しての神経成長を促進するために使用することかでき る。この成長促進組成物は、中枢及び／又は末梢神経系において、例えば、神経 路、繊維システム及び管の再生を阻害するのを防止し、その結果促進させるため に使用しつる。

特定の態様において、本発明の成長促進及び／又は阻害用組成物は、所望の経路 に沿うように軸索の成長を適宜向けるために使用しうる。

さらに、他の態様において、本発明の成長促進組成物は、神経膠細胞、特に星状 細胞の移動又は侵入を促進させるために使用しうる。

５　、３．３．薬剤組成物 本発明は、また、症状に応じて、有効量の阻害組成物又は成長促進組成物及び薬 剤的に許容しうる担体を含有する薬剤組成物を提供する。かかる薬剤的に許容し うる担体は、限定されるものではないが、塩水、緩衝塩液、デキストロース及び 水を含む、滅菌された生物耐容性の薬剤担体である。

特定の症状又は状態を治療する際に有効である阻害用又は成長−促進用組成物の 量は、異常又は状態の性質に依存するであろうから、通常の診断法で決定できる 。阻害用組成物の使用に関する場合には、所望の治療部位において神経突起の成 長又は付着（例えば、ラミニン、Ｎ　（ＡＭ）又は星状細胞を含む神経膠細胞の 移動又は侵入を促進する要素の濃度と比較して、高濃度のＫＳ、　ＣＳ、　ＤＳ 、ＨＳ、　ＨＮ又はＨＡを含む分子を使用することか好ましい。

５　、３．４．投与形態 本発明の薬剤組成物を投与する方法は、当業者に知られた方法を含む。室内及び 鞘内注射を含む適当な経路により本発明の薬剤組成物を中枢神経系に導入するこ とは望ましいかもしれない、室内注射は、例えばオマヤ（Ｏｍｍａｙａ）貯蔵器 のような貯蔵器に付設された室内用カテーテルにより容易になし得る。

さらに、本発明の薬剤組成物は治療を要する部位に局所的に投与することが望ま れるかもしれない：これは、限定されるものではないが、例えば、手術中の局所 還流、注射、カテーテルにより、又は、移植により達成でき、右移植は、孔を有 する、孔を育しない又はゼラチン状の物質であり、シアラスチック（ｓｉａｌａ ｓｔｉｃ）膜又はファイバーのような膜を含むものである。薬剤組成物でコーテ ィングされたポリマー移植物は、治療を要する部位に適用又は挿入しうる。右ポ リマーは種々の組成物、孔径及び幾何形をとることができる。限定されるもので はないが、使用しつるポリマーは、ニトロセルロース、ポリ無水物及びアクリル ポリマーから製造されるものである。

本発明は、また、リボゾーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル又は他の半透膜 を介して投与される薬剤組成物を提供する。本発明の種々の態様において、阻害 ないしは成長促進組成物の持続的放出を達成する上記組成物を使用することもで きる。

また、阻害あるいは成長−促進を必要とする領域に、阻害あるいは成長−促進組 成物を積極的に産生ずる細胞を導入することもできる。例えば、ＫＳ、　ＣＳ、 又はＤＳを変成させる酵素を分泌する組み換え細胞は、成長−促進組成物か指示 される場合には投与しうる。異なる態様において、成長−促進組成物か指示され る場合には、抗−ＫＳ、抗−Ｃ８又は抗−ＤＳモノクローナル抗体を分泌するハ イブリドーマ細胞を投与できる。細胞は適当な生物学的膜によりカプセル化し、 患者に移植しつる。

（本頁以下余白） ６、　を髄並びに視蓋の神経膠上衣板の細胞的・分子的特徴軸索バリアーの成長 におけるケラタン硫酸プロテオグリカンの役割 軸索経路の端に沿った戦略位置に在るある種の神経膠構造は、成長期の間、軸索 の伸長を総合的に支配できるバリアー構築のための力学的／化学的要素をもって いる可能性がある。軸索バリアーと推定される上衣板（ｒｏｏｆ　ｐｌａｔｅ） は、成長期間中のを髄の背中線（ｄｏｒｓａｌ　ｍ１ｄｌｉｎｅ）に沿って存在 し、神経文運と後柱軸索の誘導に重要な役割を果たしていると思われる。本発明 者らは、当該領域における上衣板の形態的変化と、軸索が近くに伸びてきたとき にバリアー機能にどのような分子が関係するかを調べるために、上衣板について 研究した。上衣板の光学および電子顛微鏡的観察から次のことか明らかになった 。すなわち、この神経膠領域は劇的な形態的変化を受ける。Ｅ１２．Ｓ頃、細胞 先端間に大きな細胞外空間を有する“模型”の形から、Ｅ１５．５には細胞外空 間か消失し、薄くて密な隔壁へと変化する。免疫細胞化学的手法により、次のこ とが明らかになった。高シアル酸化神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、Ｌ２モノク ローナル抗体で認識される炭水化物、コリンエステラーゼ、時期特異的胚抗原１ １テトラゴノロブス・プルブレア（ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｐｕｒｐｕ ｒｅａｓ）凝集素と結合するリガンド、以上か上衣板により発現される。しかし ながら、これらの分子は、軸素の成長を許容し又は誘引する他のを髄領域にも見 られる。軸素が背中線に近づいてきたとき、ただしクロスしないとき、上衣板に 特異的に現れる分子は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）　、ケラタン硫酸であ る。ケラタン硫酸は、視蓋中線にも、外表皮や成長中の軟骨のような非神経支配 の領域にも見られる。我々のデータは次のことを示唆している。すなわち、ケラ タン硫酸は、単独で又は上衣板近くに現れる他の分子と共に、胚期を髄において 上衣板を通り抜ける軸索の伸長の抑制に、部分的に関与している。

１１．５８目（２１１，５）　、Ｅ１２．５　、ＥＩ３．５　、Ｅ１４．５　、 Ｅ１５．５のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胚の幹領域を、０．１５Ｍリ ン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の４％バラホルムアルデヒド／１％グルタルアルデヒド に４°Ｃて一夜浸して固定した。組織はトリミングし、０．１５Ｍ　ＰＢＳで１ 時間洗い、１％四酸化オスミウム中で２−３時間氷上にて後固定した。切片を０ ゜１５Ｍ　ＰＢＳでさらに１時間洗い、エタノールで脱水し、５ｐｕｒｒ’　ｓ 樹脂に包埋した。１　ミクロン切片は１％トルイジンブルーて染色した。薄い切 片は電子ＩＩＩ微鏡用に酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した。一部の組織標本 は、上衣板神経膠間の細胞外空間に与える影響をみるため、緩衝液の塩濃度を１ ．５−２．０と変えた。

６．１．２　免疫細胞化学 胚比５．１２．５．１３．５．１５．５．１７．５８目のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａ ｗｌｅｙラットを断頭しく小さいので１１．５−１２．５８目のものは除いた） 、４％バラホルムアルデヒド液で液浸固定し、２時間氷上におき、３０％ンヨ糖 ＰＢＳ液に一夜おいて凍結保護処理した。クリオスタット切片（１０−１５μｍ ）はゼラチンスライド上に集め、１０ｍＭの１％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）　（Ｉ ＣＮ　Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）とｏ、ｉ％トリトンＸ−１００（ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、）　ｐＨ７，２中で３０分室温にて インキュベートした。

ＰＢＳ／ＮＧＳ　テ洗った後、切片をＰＢＳ／ＮＧＳ／　）リドンＸ−１００テ 希釈した一次抗体と４°Ｃで一夜インキユベートした。切片を洗った後、ＨＲＰ −複合ヤギー抗−マウスＩｇＧまたはＩｇＭ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ ｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）二次抗体と、またはフルオレセイン複合 二次抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ）と４℃で一夜インキユベートした。ＨＲＰ−複合二次抗体で処理した切片の 場合は、組織切片を洗い、過酸化水素で活性化した３゛、３−ジアミノベンジジ ン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ、、最終濃度＝０．００３％）中で 約５−１０分インキュベートした。この反応を緩衝液で停止させ、切片を二重蒸 留水で洗い、風乾し、エタノールの濃度を上げながら脱水し、Ｐｅｒｍａｕｎｔ 取り付は媒体（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、）でカバーグラス をかけた。フルオレセインで処理した切片は緩衝液で洗い、免疫蛍光を保存する ためＮ−プロピルガレートを用いてカバーグラスをかけた。対照は一次抗体での 処理はしなかったか、続く他の工程は変わらなかった。

生後０８目（ＰＯ）とＰ３の５ｙｒｉａｎハムスタ一新生児を切開し、断頭し、 液浸固定し、ラット胚で用いたのと同じようにクリオスタット切片とした。但し 、を髄の代わりに視蓋からの切片を集めた。組織切片は以下に述べるように種々 のケラタン硫酸エピトープに対して誘導された一連のモノクローナル抗体と反応 させた。

種々の細胞表面に対する多数の抗体および細胞外分子か試験された。モノクロー ナル抗体ＩＣＩ２　（Ｄｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｎｅｕｒｏｎ。

１　：１０５−１１６）は、文運軸素上の糖タンパク質を認識する。抗体５Ａ５ はＮＣＡＭ上のポリシアル酸成分に結合する。他の人によっては、ＮＣＡＭかニ ワトリ脳における唯一のポリシアル酸源でありうることか示されている。シアル 酸を除去するために、ＮＣＡＭにエンド−Ｎ−処理を施すと５Ａ５抗体はＮＣＡ Ｍ認識かできなくなる。さらに５Ａ５は高ノアル化ＮＣＡＭの分子量に一致する ２５０　ＫＤで、脳のウェスターンプロット上のバンドをラベルする。抗−５Ｓ ＥＡ−１（Ｓｏｆｔｅｒ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｋｎｏｗｌｃｓ、Ｂ、Ｂ、、１９ ７８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　７５（１１） ５５６５−５５６９）は８細胞期のマウス胚の側法に初めて現れる時期特異的胚 抗原を認識する。英国ハロウにある臨床研究センターのＴｅｎＦｅ１ｚｉより贈 呈されたモノクローナル抗体ＭＺ１５　（Ｚａｎｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０１：５３−５９）は、ブタ軟骨 細胞を使って十分に特性決定され、ケラタン硫酸オリゴ糖上の硫酸化ポリ−Ｎ− アセチルラクトサミン領域に特異的であることがわかっている（Ｍｅｈｍｅｔ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５７：３８ ５−３９１）。モノクローナル抗体１／２０１５−Ｄ−４（Ｃａｔｅｒｓｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５８　：８８４８−８８５４）および４／８／１−Ｂ−４（Ｃａｔｅｒｓｏｎ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４４：３８６−３９３ ）は、ＭＺ１５と重複するエピトープを認識するが、それぞれヒト関節軟骨と去 勢ウシの鼻軟骨に対して誘導されたものであった。４−Ｄ−１抗体と８−Ｃ−２ 抗体はニワトリ骨髄に対して生産され、高硫酸化形のケラタン硫酸の２つの異な るエピトープを認識する。モノクローナル抗体ａ−ＫＳはケラタン硫酸のエピト ープに特異的である。Ｍｅｌｉｔｔａ　５ｃｈａｃｈｎｅｒ　（チューリッヒに あるスイス国立テクノロジー研究所）より贈呈されたＬ２　（Ｋｒｕｓｅｅｔ　 ａｌ、、　１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１１：１５３−１ ５５）は、数主の神経細胞接着分子とミニリン関連糖タンパク質に共通した炭水 化物成分を認識する。デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−およびコンドロイ チン−６−硫酸を局在化するための免疫細胞化学はコンドロイチナーゼ消化と共 に使用した（Ｃｏｕｃｈｍａｎ、　Ｊ、　Ｒ，、１９８４，Ｎａｊｕｒｅ　３０ ７：６５０−６５２）。

６．１．３　酵素消化アッセイ １３．５および１５．５日目のラット胚を４％バラホルムアルデヒド液で２時間 氷上て液浸固定し、３０％ショ糖液て４°Ｃ−夜凍結保護処理した。クリオスタ ット切片（１５１ｍ）をゼラチンスライド上に集め、風乾した。酵素処理は、組 織切片を２０．４０または６０分、０，００１．０、Ｏｌまたは０．１単位／ｍ ｌ濃度のエンド−Ｂ−ガラクトシダーゼかケラタナーゼまたは両方と順次インキ ュベートすることから成っていた。エシェリキア・フレンジ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）から単離されるエンド−Ｂ−ガラクトシダーゼはＭ ｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、０．１Ｍ　酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ５，８で希釈した。シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、） から単離されるケラタナーゼはＭｉ　ｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し 、トリス塩酸緩衝液ｐＨ７，４で希釈した。

対照は（１）を髄切片をコンドロイチナーゼＡＢＣ酵素で２０．４０および６０ 分、トリス酢酸緩衝液ｐＨ７，３中０．１単位／ｍｌ濃度でインキュベートし、 上記プロトコールに従って、ａ−ＫＳ、　８−Ｃ−２および４−Ｄ−１抗体でケ ラタン硫酸を免疫染色すること、（２）既知のコンドロイチン含有組織、すなわ ちニワトリ大腿（３６期）をコンドロイチナーゼＡＢＣ，ケラタナーゼおよびエ ンド−Ｂ−ガラクトシダーゼとインキュベートし、その後３−Ｂ−３抗体（市販 されている）を用いてＣｏｕｃｈｍａｎ、　Ｊ、　Ｒ，、１９８４，Ｎａｔｕｒ ｅ　３０７：６５０−６５２）のプロトコールに従ってコンドロイチン硫酸を染 色すること、から成っていた。

コンドロイチナーゼによるインキュベーションは３７℃で行い、ケラタナーゼと エンド−Ｂ−ガラクトシダーゼのそれは室温で行った。

１３．５および１５．５日目のラット胚をパラホルムアルデヒド／グルタルアル デヒド（１：ｌまたは４：０．ｌ）で３時間氷上て液浸固定し、３０％ショ糖液 て４°Ｃ−夜凍結保護処理した。を髄のクリオスタット切片（１５１ｍ）をクロ ムーアルム（ｃｈｒｏｍ−ａ　ｆｕｎ）塗布スライド上に集めた。その後、組織 はＴＢＳ／ＢＳＡ　（トリス緩衝液／ウシ血清アルブミン）中で１５分室温にて ブロックした。ブロックを除去し、切片はＨＲＰと複合させたウィンシトピー（ ｗｉｎｇｅｄ　ｐｅａ）またはトウサイ（ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｐｅａ）レクチ ン、テトラゴノロブス・ブルプレア（ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｐｕｒｐ ｕｒｅａｓ）凝集素（ＴＰＡ）　（なおロータス・テトラゴノロブス（ｌｏｔｕ ｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）またはロータスレクチンとしても知られて いる、（Ｓｔｅｉｎｄｌｅｒ、　Ｄ、　Ａ、、　ａｎｄ　Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｎ、 　Ｇ、　Ｆ、、　１９８７．　Ｄｅｖ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　３６：２７− ３８）を用いて４°Ｃで一夜ｌ・７５または１・１００の濃度でインキュベーシ ョンた。ＴＰＡ結合を促進するため最初のインキュベーションに陽イオンを含む ＴＢＳ／ＢＳＡを添加した。組織を洗い、ＴＰＡをジアミノベンジジンで視覚化 した（セクション６．１．２のプロトコール参照）。最終洗浄後、組織を脱水し 、上記のようにカバーグラスをかけた。

６．１．５　コリンエステラーゼアッセイ１３．５および１５．５日目のラット 胚を０．　ＩＭ　ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド溶液で液浸固定し、を髄 をクリオスタット切片とした（１０−１５１ｍ）　、組織切片はＫｏｅｌｌｅ、 　Ｇ、　Ｂ、、　ａｎｄ　Ｆｒｉｅｄｅｎｗａｌｄ、　、Ｊ。

Ｓ、、　１９４９．　Ｐｒｏｅ、　Ｓａｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、 　７０：６１７−６２２の変法を使ってコリンエステラーゼ用に処理した。切片 は蒸留水で何度も洗い、暗室で０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、４ｍＭ硫酸鋼、１６ ｍＭグリシンおよびアセチルチオコリンヨーダイトの混合物中室温で一夜インキ ユベートした。切片を水洗し、１％硫化ナトリウム中で５−１０分インキュベー トし、再度水洗し、４％ホルマリン緩衝液中４°Ｃて一夜インキユベートした。

組織を最後にもう一度洗い、脱水し、上記のようにカバーグラスをかけた。

６．２　結果 上衣板は胚１１．５−１２．５日目（Ｅｌ　１．５−１２．５）に形態学的変化 を受ける。８１１．５で、上衣板細胞はより放射状といえる隣接感覚上皮細胞に 比して、アーチ状に配列している（図２Ａ）。上衣板細胞間の細胞外空間は最小 で、隣接細胞間のそれに匹敵する。これに比べて、Ｅｌ３．５では、直径約２〜 １０μｍはどの大きな細胞外空間か初期上成板神経膠の間にみられるか、隣接細 胞間にはみられない（図３Ａ）。その空間の形とサイズの大きさは全ての動物に 一致してみられるもので、それらは上衣板の先端領域に沿って存在している。Ｅ ｌ３．５では、上衣板細胞は“模”型に並んでいる。電子顛微鏡でみると、上衣 板細胞の先端突起は軸素終末の軟膜表面にまで達していて、基部突起は背側中心 管に達するようにみえる。上衣板の全細胞が軟膜表面から中心管まで広がってい るわけではない。なぜなら、これらの細胞はＥｌ４まで分裂している（Ａｌｔｍ ａｎ、　Ｊ。

、　ａｎｄ　Ｂａｙｅｒ、　Ｓ、　Ａ、、　１９８４．　ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅ ｓ　ｉｎ　Ａｎａｔｏｍｙ、　Ｅｍｂｒｙｏｌ。

ｇｙ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　８５．　Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ。

Ｇｅｒｍａｎｙ、　ｐｐ、　５３−８３）。上衣板は、８１３．５では、軟膜か ら中心管までの長さがほぼ７０μｍ、幅が真ん中あたりで約１００μｍである。

１μｍのプラスチック切片の吻−尾分析（ｒｏｓｔｒａｌ−ｃａｕｄａｌ　ａｎ ａｌｙｓｉｓ）は次のことを示している。すなわち、細胞外空間は頚部と胸部の を髄全体の上衣板に存在する。空間は実際にあるようにみえ、組織の処理によっ て生したものとは思われない。なぜなら、いろいろに変えてみても、例えば緩衝 液の塩濃度を１．５−２．０倍に変えてみても、周辺組織のものと比べて空間は 変わらない。さらに、ＡｌｔｍａｎとＢａ、ｙｅｒ　（１９８４、前掲）は違っ た方法で調製した組織の上衣板に大きな直径の細胞外空間を観察している。

２つの軸索系かを髄の背側領域に存在しており、上衣板かそれらのバリアーとし て機能するのに適切であると思われる時期に上衣板近くまで移動する。。２つの 内の１つは、腹側文運軸素のサブ集団で、を髄の背側壁にある二次ニューロンか ら生じている。

これらのニューロン突起は抗体ＩＣ１２（Ｄｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８ ．　Ｎｅｕｒｏｎ　ｌ：１０５−１１６）で視覚化され得る（図４）。神経発生 は腹背方向の勾配で起こり、Ｅｌｌ、５で側方細胞体から生じる文運軸索かみら れ、この時期には、あるにしてもごく僅かな軸素が背側にあるにすぎない（図２ ＢおよびＣ）。しかしながら、Ｅ１２．５では、文運軸索はＩＣ１２のラベリン グによって証明されるように、最背側のを髄に存在している。このグループの幾 つかのニューロンの非染色細胞体はその後上衣板に接して存在し、それらの突起 は、腹側にターンする前に上衣板の周縁部分に沿ってアーチ状をなしている。第 ２の神経集団、後柱軸索は、を髄に入って可倒に届くよう模索でターンするので 、上衣板のすぐ近くまで達する。Ｅ１３゜５では、これらの軸索は背中線から約 １５０μｍのところに卵形の束として存在している（図１）。しかしながら、Ｅ １５では、それらはを髄の背中線で上衣板に接する。超微細構造的観察では、神 経突起は上衣板とクロスするのではなく、その周縁部分に沿って上衣板に密接に くっついているのが見える（図５）。かくして、上衣板に接した細胞からの全突 起は、この背中線構造から排除されると思われる。

上衣板の表面分子またはマトリックス分子を特定するために、本発明者らは各種 の抗原を調べ、上衣板におけるその分布とを髄の他の部分におけるそれとを比較 した。上衣板により発現された殆との分子はを髄の他の部分にも見られたし、胚 の他の領域にも見られた（以下に考察する）。しかしながら、ケラタン硫酸の分 布だけか上衣板に特有に見られ、Ｅ１２．５　＜らいでまず見られ、Ｅ１３．５ ではより顕著であった（図３Ａ）。免疫細胞化学的局在化で、このグリコサミノ グリカンエピトープが初期神経膠細胞中または細胞上にあることが示された。こ の分子の発現パターンは、Ｅ１３゜５の胚の１１ｍプラスチック切片に現れる上 衣板細胞とそれらの細胞外空間の形状にもろに合致している（図３Ｂ）。図６Ａ と６Ｂは、１ｃ１２でラベルした文運軸素と上衣板細胞のケラタン硫酸ラベリン グとの関連を示したものである。このようにケラタン硫酸の出現は、後柱軸素の 到達より前によく見られ、最背側の文運集団か軸素を伸長する前に存在するよう には見えず、それと同時に現れるように見える。さらに、これらのマーカーはケ ラタン硫酸エピトープが上衣板に特異的であり、この発生期のを髄の他のとの部 分にも見られないことを示している（図６Ｂ）。ａ−ＫＳ抗体と４−Ｄ−１抗体 は最背側から最腹側までの背中線をラベルしく図７ＡおよびＢ）、一方１−Ｂ− ４抗体は最腹側部分をより多く認識する。染色パターンの違いは、これらの抗体 がわずかに異なるケラタン硫酸エピトープを認識することを示唆している。なぜ なら、ケラタン硫酸は種々のレベルの硫酸化と鎖長で発現され（Ｈｅｉｎｅｇａ ｒｄ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｐａｕｌｓｓｏｎ、　Ｍ、、　１９８４．５ｔｒｕｃ ｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｏｇｉｙｃａｎｓ 。

ｉｎ　Ｋ、Ａ、Ｐｉｅｚ　＆　Ａ、Ｈ，Ｒｅｄｄｉ　（Ｅｄ、）、Ｅｘｔｒａｃ ｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｐｐ、２７７−３ ２２．　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉ ｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）　、上衣板はこれらのエピトープの混合物を含むからであ る。

抗ケラタン硫酸抗体の幾つかは、また、本発明者らか研究した切片の他の構造物 もラベルする。例えば、多くの抗ケラタン硫酸抗体は、Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ 　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６，Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１１６：２６７−２７７ ）によってこのグリコサミノグリカンを含むことが示された真皮をラベルする（ 図７ＢおよびＣ）。抗体８−Ｃ−２はを髄周囲の基底板をさらにラベルする（図 ７Ｃ）。

本発明者らがケラタン硫酸を上衣板へ局在化するのに使っている抗体がこのグリ コサミノグリカンに特異的かどうか試験するため、上衣板からこの分子を消化す るためにケラタン硫酸特異的酵素を２種類使用した：すなわち、エンド−Ｂ−ガ ラクトシダーゼとケラタナーゼである。ケラタナーゼ単独では精製したタイプＩ ケラタン硫酸（角膜ＫＳ）を完全には消化しないということか、Ｍｅｌｒｏｓｅ 　とＧｈｏｓｈ　（１９８５，Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７０：２９３− ３００）によって示されている。しかし、完全な分解は、エンド−Ｂ−ガラクト シダーゼとケラタナーゼの両方を順次使用したときに得られた。彼らはまた、タ イプｌｌＮ５　（骨格ＫＳ）がこの２つの酵素を用いても完全に分解されないが 、どちらか１つの酵素を使う場合と比べて実質的改良か見られるということも示 した。エンド−Ｂ−ガラクトシダーゼとケラタナーゼを順次使用した我々の実験 では、上衣板における染色強度は、ケラタン硫酸特異的抗体を使った場合、未処 理切片に比べて肉眼で観察したとき大きく減少した（図８Ｂ）。幾つかのインキ ュベーションは気づかない程の染色レベルの結果となったか、切片に応じて微妙 な変化が見られた。軟骨や基底板のような他のケラタン硫酸含有組織は、酵素消 化後多くのケラタン硫酸を残していたが、皮膚は若干の観察しうる染色強度の減 少を示した。対照は次のことを示した。つまり、コンドロイチナーゼ消化か上衣 板のケラタン硫酸免疫染色の強度に肉眼でわかる効果を及はさず（図８Ａ）、エ ンド−Ｂ−ガラクトシダーゼとケラタナーゼかコンドロイチン−６−硫酸を多く 含んでいる組織として知られるニワトリ大腿骨組胞に対するコンドロイチン硫酸 抗体の染色強度に何の影響も及ぼさなかった（Ｃａｒｒｉｎｏ、　Ａ、、　ａｎ ｄ　Ｃａｐｌａｎ、　Ａ、　１．、１９８５、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 　２６０：１２２−１２７）　、かくして、それぞれの酵素は相応の基質に特異 的であるように見える。第２の対照は、非特異的プロテアーゼが抗ケラタン硫酸 抗体による上衣板のラベリングの減少に寄与する関係を軽減させる。

初期上成板神経膠は、ＥＩ３．５で多くの他の特徴ある分子を発現するが、ケラ タン硫酸と対照的に、それらはを髄の他の場所でも見られる。モノクローナル抗 体Ｌ２／ＨＮＫ−１によって認識される炭水化物（グルクロン酸３−硫酸）は上 衣板細胞により発現される（図９Ａ）。これに対して、底板はし２によるラベリ ングが全熱ない。５Ａ５抗体は上衣板の中線部にのみ、高シアル酸化ＮＣＡＭを 局在化する（図９Ｂ）。Ｌ２と５Ａ５は両方ともＤＲＧ　、を髄の前板後板、後 板入口帯・周辺帯をラベルする。コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）の組織化学吋ア ッセイは、上衣板神経膠がこの分子を、Ｅ１２．５とＥ１３．５に、同様に発現 することを示した（図１０Ａ）。ＥＩ２．５および１３．５の上衣板におけるＣ ｈＥ発現パターンは、この時期での、すなわち楔型分布での、抗ケラタン硫酸抗 体のそれに似ている。ＣｈＥ染色は、後板入口帯にも、境界溝の神経膠細胞上お よびこの時期の基底板感覚上皮の腹部にも存在する（図１０Ａ）。

上衣板は、Ｅ１５．５までに第２のより劇的な形態変化を受ける。

予定される神経膠細胞は背中線で長く薄い中隔様構造へと変換される（図１１） 。細胞外空間は大きく減少し、この時期以前に見られた以上に密な構造となって いる。上衣板は軟膜表面から中心溝の先端までほぼ１６０μｍに及ぶが、幅はそ れか拡張する背側面を除いて、わずか１０−１５μｍである。このように上衣板 は、長さにおいて２倍増、幅において１０倍減となる。

発達変化は、２１５．５と同様、ケラタン硫酸エピトープの分布に起こる。そし てその局在化は上記の形態的パターン変化を反映している（図１２Ａ）。微分干 渉（ＤＩＣ）　ＩＩＩ微鏡を用いると、最内側の後柱軸索が、ケラタン硫酸でラ ベルした上衣板細胞の拡大してきた背側部に接しているのを認めることができる （図１２ＡおよびＢ）。

ケラタン硫酸エピトープは成長中の軟骨により発現された。ラベルは軟骨細胞群 のまわりに（図１３）、時には個々の軟骨細胞自体のまわりに存在している。

上衣板により発現される他のマーカーもまた、成長中にその分布を変える。Ｅ１ ５．５では、上衣板はもはや抗体Ｌ２／ＨＮＫ−１または５Ａ５で陽性のラベル を示さないが、５ＳＥＡ−１では陽性となる（図９Ｃ）。この分子の発現は、そ れが上衣板神経膠細胞の最背部にはあるか最腹側部にはないという点で、８−Ｃ −２および１−Ｂ−４抗原のそれに似ている。５ＳＥＡ−１抗原は上衣板に特異 的ではない。それは底板神経膠によっても発現される。レクチンＴＰＡもまた、 ＥＩ５．５ては上衣板神経膠と他の多くの放射状細胞に結合する。ＴＰＡは、軟 膜表面から背側中心溝までの全体の背中線をラベルする（図９Ｄ）。

ＣｈＥはＥ１５．５で軟膜表面から中心溝の先端までの背中線に沿って存在する （図１０ＢおよびＣ）。この時期では、それは基底感覚上皮の腹部分、運動細胞 、前接と境界溝および成長中の１幹の肢芽軟骨において、感覚軸素のサブ集団に よっても発現される。

Ｅ１７．５では、上衣板は背中線の最小部分を横方向に占めるか、それでも軟膜 表面から背側中心溝へと広がっている。ケラタン硫酸エピトープはＥ１７．５で はもはや上衣板に免疫細胞化学的に検出できず（図１４）、を髄周囲の基底板に も検出できないか、軟骨と真皮には残留している。

上衣板と中枢神経系における他の推定背中線軸索バリアーとの類似性を発見する ため、本発明者らはケラタン硫酸の存在について正常ハムスターの視蓋を試験し た。ハムスターは、５ｃｈｎｅｉｄｅｒ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｇ、Ｅ、、１９ ７３．　Ｂｒａｉｎ　Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　８ニア３− １０９）およびＰｏ５ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ。（Ｐｏｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８８．５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｂｓｔｒａｃ ｔ　１４：５９４）の研究の観点から選んだ。そこでは、視蓋中線に集中する新 生児期病変が再交叉視覚投影の異常な発達をもたらすということが示されている （「考察」を参照）。実際、ハムスター視蓋の背中線は、生後１日目（ＰＯ）と ３日目（ＰＧ）に、この時期は眼の軸索が視蓋間を通り抜けさせないようこの中 線領域が正常に機能し得る時期なのだが、抗体４−Ｄ−１（図１５Ａ）、８−Ｃ −２（図１５Ｂ）および１−Ｂ−４（示さず）に対してケラタン硫酸陽性である 。ラットのを髄におけると同様、ケラタン硫酸は中脳正中線を単独でラベルする 。ラベリングは軟膜表面から５ｙｌｖｉｕｓの背側大脳アクアダクト（ａｑｕａ ｄｕｃｔ）までの背中線の金縁に沿って見られる。

６．３　考察 本発明者らは、を髄の上衣板が初期胚発生中に形態学的、分子的変化を受けるこ とを示した。Ｅ１３．５では、大きな細胞外空間のネットワークが上衣板神経膠 細胞間の軟膜表面近くに現れ、上衣板の楔形状に関与している。Ｅ１５．５まで に、上衣板の形は中線で長く薄い隔壁となり、細胞外空間は顕著に減少する。上 衣板細胞はを髄の他の領域にもある多くの分子を発現するか、特定のグリコサミ ノグリカン、ケラタン硫酸がＥ１２．５で上衣板神経膠に単独で現れ、Ｅ１７． ５ではもう検出できなくなる。を髄における線維系の成長に関連してケラタン硫 酸染色パターンを追跡することにより、我々は、上衣板はケラタン硫酸が存在す る時は軸索に決して侵入されないということ、また、腹側文運経路の最背部と後 柱の中線境界に最終的にはなってしまうということ、を観察した。Ｅ１７．５頃 、背中線をクロスする背側灰色文運は（Ｓｍｉｔｈ、　Ｃ，Ｌ、、　＋９８３、 　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　１８５：ｌ−２２）、ケラタン硫酸がも はや免疫細胞化学的に検出できなくなった時に成長する。上衣板は、成長期の間 中線に近づいてきた軸素、つまり腹側交連系の小サブ集団と後柱最内側（すなわ ち細路）線維を構成する多くの軸索、と特異的に相互作用し、その抑制効果を発 揮するらしい。

ケラタン硫酸はｉｎ　ｖｉｖｏでは単独で生ずることはなく、むしろケラタン硫 酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ）として生じるら しい。我々は免疫細胞化学的手法を用いては、上衣板神経膠がコンドロイチン硫 酸を発現するのを発見てきなかった。しかし、これはグリコサミノグリカンの固 定または染色か難しいためと考えられる。コンドロイチン硫酸が、他のグリコサ ミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン同様、上衣板中に存在し、軸索抑 制を支配するケラタン硫酸グリコサミノグリカンフ′プロテオグリカンのような 池の分子と結びついて働いている可能性はある。

６、３．１　軸素境界およびバリアーとしての神経膠細胞神経膠構造は、上衣板 以外の神経系の領域で軸素境界またはバリアーとして働いていることが示唆され た。マウス（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊ。

、　１９８４．前掲〉とニワトリ　（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊ、、　１９８７．前掲 ；　Ｐｏ５ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．前掲）の視交叉の前端近くの間 脳／終脳結合部の神経膠構造は、成長する視神経線維のバリアーとして働いてい るように思われる。０２Ａ系統の前駆細胞で構成されるらしい（Ｓｉｌｖｅｒ、 　Ｊ、、　１９８４．前掲）“結節様′構造は（Ｒａｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８３．　Ｎａｔｕｒｅ、　３０３：３９０−３９６）　、可倒ヘターンして終 脳の臭覚領域に入っていく代わりに、中脳と間脳へ向かう機能的に有利な経路の １つを移動する線維が選ぶことを確実にしているらしい。

５ｙｒｉａｎハムスターにおける視蓋成長の研究は、神経膠細胞からなる背中線 バリアーが正常な軸素−標的結合の形成に重要な役割を果たしていることを明ら かにした。５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｇ、　Ｅ、、　１９７３゜前掲およびＳｏ、 　Ｋ、、　１９７９．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｎｅ ｕｒｏｌｏｇｙ。

１８６：２４１−２５８の古典的研究は、視蓋（上圧）の初期片側病変が不適− 当な視蓋小葉の間の機能的に順応性のないシナプス連結部と視索軸索の変則的交 叉をもたらすことを示した。最近では、我々は、もし病変が中線のみに起きて背 部基底板か無傷である場合に、交叉か起こることを学んだ（Ｐｏｓｔｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８８．５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒＮｅｕｒｏｓｅｉｅｎｃｅ　Ａ ｂｓｔｒａｃｔ　１４：５９４）。面白いことに、この視蓋中線境界はを髄上衣 板のそれによく似た神経膠細胞から成っている。

それらは初期放射状形態を持ち続け、成長期に特異的にケラタン硫酸を発現する 。これは、中脳の背中線か移動する視軸索の側制限の正常維持に重要な役割を果 していること、および神経膠構造か成長錐体のバリアーとして機能しうることを 示している。もし成長しているを髄の上衣板が視蓋の中線神経膠構造と同様に機 能するなら、それは変則的軸索の伸長に対して極めて重要なブロック（遮断）を 形成しているかもしれない。一般的に、中枢神経系の背中線のバリアーは右側対 左側の感覚情報の分離に役立っているかもしれない。

神経膠は軸索分枝の領域を区画化することにも貢献している可能性がある。抗神 経膠線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）によって同定された境界神経膠の１つの タイプは、新生児皮質に見られる（Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｎ、　Ｇ、　Ｆ、、　ａｎ ｄ　５ｔｅｉｎｄｌｅｒ、　Ｄ、　Ａ、、　１９８６．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、 　３８０・３４１−３４８）。マウス第［Ｖ皮質層の体性感覚胴体分野のこれら の細胞による区画化は、ｍｙｓｔａｃｉａｌ　ｖｉｂｒｉｓｓａｅのパターン化 と直接的に相互関連していた。神経膠はある種のレクチンによって特異的に認識 される糖複合体の密な発現により表される（Ｓｔｅｉｎｄｌｅｒ。

Ｄ、　Ａ、、　ａｎｄ　Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｎ、　Ｇ、　Ｆ、、　１９８７．　Ｄ ｅｖ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　３６：２７−３８）。胴体壁領域の神経膠細胞 は、明らかにｖｉｂｒｉｓｓａ１機能に関連した樹状視床終末の成熟パターン化 を反映している。しかしながら、この境界の形は上衣板とは違っている。それは より可塑的であるように思われる。なぜなら、胴体壁の強マトリックス産生神経 膠か請求心性軸索に関連した活動−依存性シグナルに応じて、その位置をシフト することができるからである。遮断シナプス領域において同様の役割を果たす細 胞は、また、０１ａｎｄら（１９８８゜Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　８（１）＋ ３５３−３６７）によっても、蛾Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａの臭覚領域に観察 されている。

を髄の上衣板細胞は、その形状と軸索排斥のメカニズムについて明らかにする３ つの、別々ではあるか関連した特色に基づいて討論するに値するものである＝（ １）神経膠細胞間の細胞外空間の構造的貢献の可能性、（２）細胞外空間を通る 軸索の成長の欠如、（３）これらの細胞によって発現される分子の抑制機能。

６、３．２　上衣板における細胞外空間細胞外空間の量的発達変化は上衣板の密 度と形状の創成に重要である。Ｅ１３．５では、細胞外空間の場所は上衣板の先 端領域に沿って優先的にあり、模型の形成に役割を果たしているように思える（ 図３Ａ）　、　Ｅ１４．５では、細胞はもはや分裂せず（Ａｌｔｍａｎ、　Ｊ、 。

ａｎｄ　Ｂａｙｅｒ、　Ｓ、　Ａ、、　１９８４．　ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　 ｉｎ　Ａｎａｔｏｍｙ、　Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ、　Ｖｏｌ、　８５．　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｈｅｉｄｅｌ ｂｅｒｇ、　Ｇｅｒｍａｎｙ、　ｐｐ、　５３−８３）、しかもを髄は横方向に 広がりつつあるので、細胞外空間はこの広がりに貢献しているか、それを可能に しているように思える。ケラタン硫酸とおそら＜　ＫＳ／Ｃ３−ＰＧのコンドロ イチン硫酸鎖も、グリコサミノグリカンが優先的に水と結合することが知られて いるので、細胞外空間の創成を助けることができるだろう　（Ｍａｒｇｏｌｉｓ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９７５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４（１）：８５−８８） 。

６、３．３　上衣板に関連した軸索の成長上衣板において軸索の成長がないとい うことはいささか驚きであった。なぜなら、ここ（Ａｌｔｍａｎ、　Ｊ、、　ａ ｎｄ　Ｂａｙｅｒ、　Ｓ、　Ａ、、　１９８４、前掲）や他の成長している神経 系において次のこと、すなわち、神経膠細胞間のマトリックスで満ちた大きな細 胞外空間か、チャンネルに合体するとき、軸索か標的に向かうように誘引する方 法で作用することが示唆されているからである（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｊ、、　ａｎ ｄ　Ｒｏｂｂ、　Ｒ，Ｍ、、　１９７９．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　６８：ｌ７ ５−１９０；　Ｓｉｎｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ。

、　１９７９．　Ｊ、Ｃａｍｐ、Ｎｅｕｒａｌ、　１８５＋１−２２；　５ｉｌ ｖｅｒ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｓｉｄｍａｎ。

Ｒ，Ｌ、、　１９８０．　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　１８９：１０１ −Ｉｌｌ；　Ｎｏｒｄｌａｎｄｅｒ、　Ｒ。

ａｎｄ　Ｓｉｎｇｅｒ、　Ｍ、、　１９８２．　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　７ ５：２２１−２２８）　ａ神経堤細胞の移入がチャンネル様細胞外環境によって 導かれるということ、また、細胞外マトリックスが直接的に関与しているという こと、の証拠が存在している（Ｂｒｏｎｎｅｒ、　Ｍ、　Ｅ、、　ａｎｄ　Ｃｏ ｈｅｎ、　Ａ、　Ｍ、。

１９７９、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６：１８４３− １８４７；　Ｂｒｏｎｎｅｒ−Ｆｒａｓｅｒ、　Ｍ、、　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、 　Ａ、　Ｍ、、　１９８０．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　７７：１３０−１４１＋ 　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　７ ７：１４２−１５６；　ＬｅＬｉｅｖｒｅ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８０．　Ｄｅ ｖ、　Ｂｉｏｌ、　７７：３６２−３７８；　Ｂｒｏｎｎｅｒ−Ｆｒａｓｅｒ、 　Ｍ、、　１９８２゜Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　９１：５Ｏ−６３）。しかしなが ら、本発明者う（７）上衣板（７）　１！察は、大きな細胞外空間の単なる物理 的存在か将来の軸索経路を必ずしも予言していないことを示した。なぜなら、背 中線の空間は軸索の成長を阻むとみえる領域を規定しているからである。我々の データは、ケラタン硫酸グリコサミノグリカン／プロテオグリカンが、他のグリ コサミノグリカン／プロテオグリカンと共に、多分空間中かあるいは神経膠細胞 の表面に存在し、空間中へと拡がって、バリアーを強固な性質とするため周囲を 改変するように機能しうることを示している。

６、３．４　上衣板神経膠により発現される分子ケラタン硫酸エピトープは、部 分的に、上衣板において分子バリアーの形成に機能するだろう。また、本発明者 らは、光学顕微鏡下で、成長している軟骨の周辺領域と個々の軟骨細胞の周辺マ トリックスがケラタン硫酸様免疫反応性を示すことも観察した。

軟骨は神経支配を受けていない。さらに、我々は外側真皮が、成長している間、 ケラタン硫酸エピトープを発現することを見いだした。

重要なことだが、組織培養実験は、ケラタン硫酸グリコサミノグリカンが直接的 に軸素の成長を抑制し得ることを示した（セクション７参照）。

明らかに考えられることは、我々の使った抗体が上衣板のケラタン硫酸を認識し ていたのか、それとも分子組成がケラタン硫酸に似た他の抗原に結合していたの か、ということである。特異性のための条件は、種々のケラタン硫酸エピトープ に対する多くの異なった十分に同定された抗体が上衣板を染色するということで あった。しかしながら、強力な証拠が我々の酵素消化実験から得られた。２種類 のケラタン硫酸特異的酵素とを髄切片をインキュベートしたとき（非特異的効果 を対照として）、抗体染色の強度が減少したという事実は、次のことを示してい る：（１）ケラタン硫酸が実際に上衣板神経膠上かまたは神経膠中に発現される 、（２）上衣板がタイプ■　（角膜）　ＫＳを含んでいる。角膜ケラタン硫酸は 側鎖をもたず、高硫酸化された分子であって、エンド−Ｂ−ガラクトシダーゼと ケラタン硫酸を順次使うと、最も簡単かつ完全に分解される（Ｍｅｌｒｏｓｅ　 ａｎｄ　Ｇｈｏｓｈ、　１９８５．　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７０： ２９３−３００）。

この研究は、最背側と最腹側の上衣板には分子的差異かあることを示している。

なぜなら、抗−５ＳＥＡ−１、１−８−４および８−Ｃ−２抗体は背側部のみを ラベルする。この異質性は、上衣板における軸索抑制の時間的、領域的変化の観 点から重要である。その理由は、後期に、背部文運が背中線の中心部を通って成 長するからである（Ｓｍｉｔｈ、　１９８３．　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒｏ ｌ、　２２０：２９−４３）。重要なことだが、文運の形成はケラタン硫酸の発 現が検出不能なレベルに低下した時期に起こる。

推定上の軸素バリアー領域、上衣板、軟骨におけるコリンエステラーゼの存在は 、上記の研究から明らかなように、コリンエステラーゼが神経突起の成長に影響 を与えうる可能性を示唆している。

Ｌ２、シアル酸化ＮＣＡＭおよび５ＳＥＡ−１は細胞−細胞接着に関係している が、上衣板におけるそれらの役割は、成長の間、上衣板神経膠間で増加するよう にみえる形態発生的密度をもたらすことかもしれない。他の影響を欠いているが 、これらの分子は軸索を上衣板へ引き付けることができるだろう。マイナス的ま たは抑制的因子が、起こりうるこの軸索誘引環境を乗り越えるために要求される だろう。

７、　ケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ ）はｉｎ　ｖｉｔｒｏで神経突起の成長を抑制するセクション６の例で詳述した ように、げっ菌類の上衣板と視蓋およびニワトリの終脳における成長中の下板（ ｓｕｂｐｌａｔｅ）の１０ｖｉｖｏ研究で次のことが判明した。すなわち、２種 類のグリコサミノグリカンか、ケラタン硫酸単独でもしくはコンドロイチン硫酸 と共に、おそらくプロテオグリカンの形で（ＫＳ−ＰＧ　、　Ｃ５−ＰＧまたは ＫＳ／Ｃ５−ＰＧ）　、これらの領域内に、軸索が接近してくるがこれらの境界 に侵入しない時期に存在していた。ＫＳ／Ｃ５−ＰＧが成長錐体（ｇｒｏｗｔｈ 　ｃｏｎｅ）の伸長を活発に抑制するかどうかを調べるため、また、この巨大分 子のどの成分がこの現象に重要であるかを調へるため、本発明者らは、種々の純 分子のストリップが移入されたニトロセルロース被覆ペトリ皿を用いる技術を使 った。我々は、ニワトリの後板神経節を、ＫＳ／Ｃ５−ＰＧレーン上で、成長促 進分子ラミニン（ＬＮ）またはＮＣＡＭのレーンと交互に増殖させた。神経突起 はＬＮまたはＮＣＡＭのストライブに沿って豊富に増殖した。反対に、ＫＳ／Ｃ ５−ＰＧ含有ストライブにあうと、神経突起は突然止まるかまたはターンし、濃 度依存的にＫＳ／Ｃ３−ＰＧストリップの境界に沿って移動した。抑制効果がＫ Ｓ／Ｃ５−ＰＧの存在によるものか、単に軸索フリーレーンにＬＮまたはＮＣＡ Ｍが無いためか決定するため、我々は、単独で最大成長を促進する濃度で、ＬＮ またはＮＣＡＭをＫＳ／Ｃ５−ＰＧと混合した。そしてＫＳ／Ｃ５−ＰＧは誘引 分子が存在するときでもなお抑制的であることを観察した。ＫＳ／Ｃ３−ＰＧプ ラスＮＣＡＭは、ＮＣＡＭが非常に高濃度のときでも抑制的であった。しかしな がら、高濃度のＬＮは、ＫＳ／Ｃ５−ＰＧの抑制効果を消失させることができた 。ＫＳ／Ｃ５−ＰＧからのＫＳまたはＣ８の酵素消化は、抑制レーンを横切って 種々の程度の神経突起の成長を許した。そして、両方のグリコサミノグリカン成 分の分解は、分子のタンパク質コアのみを残して、完全に抑制効果を欠く結果と なった。異なったグリコサミノグリカン、デルマタン硫酸、を含むプロテオグリ カン（ＤＳ−ＰＧ）とラット軟骨肉腫の軟骨Ｃ３−ＰＧは、同一濃度でＫＳ／Ｃ ５−ＰＧはどには軸素抑制効果を示さなかった。これらのアッセイは、ＫＳ／Ｃ ５−ＰＧかｉｎ　ｖｉｔｒｏで胚の後接神経節神経突起を活発に抑制することを 示した。完全な抑制はＫＳと０３分子両方の寄与を必要とした。

（本頁以下余白） ７．１材料と方法 ７、　１．　１．基体の調製 組織培養基体は６０−ｍｍのペトリ皿に６ｍｌメタノールに溶解した５ｃｍ２の ニトロセルロース（シュレイカー＆シュエル（ＳＣｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃ ｈｕｅｌｌ）タイプＢＡ８５）の混合物０．５ｍｌを均一に被覆し、層流フード 中で風乾した（ラゲナウア、Ｃ，（Ｌａｇｅｎａｕｒ。

Ｃ）およびレモン、Ｖ、（Ｌｅｍｍｏｎ、Ｖ、）、１９８７．Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４　：　７７５３−７７５７）。

セルロース（ワットマンフィルターペーパー、＃ｌ）を３５０μｍのストリップ に切断し、ニトロセルロース基体に種々のタンパク物質をプロットするために用 いた。個々のタンパク溶液はローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）または フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ　ＩＴＣ）をマーカーとして含有し、こ れらは後に検出してストリップの正確な位置を決定することかできる。

セルロースストリップを２０μｌの所望のタン、＜り溶液に浸し、これらをニト ロセルロースで被覆皿に垂直のパターンで移しく第１図）、３０秒間静置してか ら取り出した。そのニトロセルロース上の試験分子を乾燥した後、１００μｇ／ ｍｌのラミニン（ＬＮ）（ギブコ社）を曲がったガラスパスツールピペットを使 って皿の上に均一に薄膜として広げた。すぐに培地をその培養皿に添加しくＤＭ ＥＭ／Ｆ　１２＋１０％ウシ胎児血清＋５％ニワトリ胚抽出物＋１％抗生物質） 、培養皿を必要とするまでインキュベーターに保存した。血清はプロテオグリカ ン結合に不正確な結果を与えることが知られているため、重要なことは本実験は 血清を含まない培地、ＤＭＥＭ／Ｆ　１２＋Ｎ２　（１：　１００、ポツテンシ ュタイン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ　）　、Ｊ、Ｅ　およびサトウ、Ｇ、Ｈ，。

１９７９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７６　：　５１４ −５１７　）＋１％抗生物質を用いて繰り返したことである。しかし、培地中の 血清の有無は本発明者らの検定結果には重要ではなかった。

７．１．２．後接神経節の調製物 ニワトリの首を切り、内臓を取り出し、を柱とを髄を注意して除去することによ りニワトリＥ９後板神経節（ＤＲＧ）をカルシウム−マグネシウム不含の緩衝液 中で注意深く切断した。次にこのＤＲＧを洗浄して周囲組織を除去後、細い鉗子 で取り出した。

試験培養皿の培地を除去してｔｏｏｎｇ／ｍｇの神経成長因子を含む新鮮な培地 に入れ替えた。先を細く引いたガラスパスツールピペットに先のＤＲＧを吸い取 り、パターン化したストライプを有する培養皿の中央付近に丁寧に分散させた。

一枚の培養皿上におよそ２０のＤＲＧをまいた。これら培養皿を２４時間インキ ュベートし、続けて４％バラホルムアルデヒド１０．１％グルタルアルデヒドで １時間固定した。培養皿にモイアル（Ｍｏｗｉａｌ）中てカバーグラスをかけて から、神経突起およびストライプの位置を同時に観察できるように位相光学系と 蛍光の混合を可能にするバリオリューム（Ｖａｒｉｏｌｕｍｅ　）を備えたライ ッオルトプラン２　（Ｌｅｉｔｚ　０ｒｔｈｏｐｌａｎ　２　）蛍光顕微鏡を使 って観察した。

７．１．３．　ドツトプロットイムノアッセイＫＳ／Ｃ３−ＰＧがニトロセルロ ースに結合していることを確かめるために、種々の抗ケラタン硫酸抗体を用いる ドツトプロットイムノアッセイを行った（他の方法としては″ＳＳ−標識のプロ テオグリカンを用いた。下記参照。）。４つの室に仕切っである培養皿に小さな 四角いニトロセルロースペーパーを置いた。それぞれの小室に１μｍのＫＳ／Ｃ ３−ＰＧをスポットし、５分間風乾した。このペーパーを稀釈していない正常ヤ ギ血清（ＮＧＳ）で１０分間ブロックし、続いて緩衝液で５回洗浄した。それぞ れのウェルに異なる抗ケラタン硫酸抗体、すなわち８−　Ｃ−２および４−　Ｄ −Ｌ　ａ−ＫＳ、５−　Ｄ−４および１−Ｂ−４（カーダーリン（Ｃａｔｅｒｓ ｏｎ）ら、１９８５、Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、４４　：　３８６−３９３）または ＭＺ１５（ザネッチ（Ｚａｎｅｔｔｉ　）ら、１９８５１．Ｉ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、１０１　：　５３−５９）を１０ｍＭ　ＰＢＳ＋３％Ｎ ＧＳ＋０．２％トリトンＸ−１００の混合物中１：１００で満たし、３７°Ｃで 一晩インキユベートした。ウェルを緩衝液で５回すすぎ、ヤギ抗−マウスＨＲＰ 複合１ｇＧまたはＩｇＭの第二抗体を添加し、３７°Ｃで一晩インキユベートし た。このニトロセルロースペーパーを次にＰＢＳ＋０．００３％過酸化水素中の ０゜０１％ジアミノベンジジンと反応させた。全ドツトはＫＳ／Ｃ３−ＰＧがニ トロセルロースペーパーに結合することを示す反応生成物を示した。

７．１．４．ＫＳ／ＣＳ−ＰＧの３ＳＳ標識付は培養基体に結合するプロテオグ リカンの量を決定するため、標識した材料をＤＲＧ培養物に用いた同じ手順で基 体にコートした。

標識したプロテオグリカンは元は８日目のニワトリ肢間葉細胞の培養物の軟骨マ トリックスから５０μＣｉ／ｍｌの［”Ｓ］−スルフェートでその培養物を標識 した後に分離した（デルア（ＤｅＬｕａ）ら、１９７７、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、２５２　：　６６００−６６０８）。このプロテオグリカンをプロテアーゼ 阻害剤を含む４Ｍの塩化グアニジニウムで抽出し、ＣｓＣ１平衡密度勾配遠心分 離およびセファロースＣＬ−２Ｂクロマトグラフィーにより精製した（ヘイネス ワース（［（ａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ　）ら、１９８７、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、２６２：　１０５７４−１０５８１）、セファ０−スＣＬ−２Ｂカラムか らの適当な画分を集め、４°Ｃにて蒸留水に対して透析し、３ｓＳ　ｃ　ｐｍ／ ｍｇ　（乾燥重量）の数値を決定することかできるように凍結乾燥した。標識し たプロテオグリカンを培養基体に結合させた後、結合したプロテオグリカンを含 有する培養皿の部分を切り出し、２０ｍ１のガラスシンチレーションバイアルに 移した。サイドシフト（Ｃｙｔｏｓｃｉｎｔ）シンチレーションカクテル（ＩＣ Ｎ）を先のバイアルに入れ、結合したｉｓＳの量をベックマンＬＳ６８００カウ ンターを用いたシンチレーションスペクトロメトリーで決定した。結合したプロ テオグリカンの量は３ＳＳの結合量からの”Ｓ　ｃｐｍ／ｍｇ　（乾燥重量）の 数値に基づいて算出することができた。

７１５、ラミニン検出のための免疫細胞化学ストリップ中のラミニンの存在を検 出するために本発明者らはポリクローナル抗ラミニン抗体（ＢＲＣ，Ｖ、レモン （Ｌｅｍｍｏｎ））を用いて、ＫＳ／Ｃ３−ＰＣ＋　ＬＮのストリップを標識し た。

６０ｒｎｍのニトロセルロース被覆培養皿にウシＫＳ／Ｃ３−ＰＣ（１ｍｇ／ｍ ｌ）＋ＬＮ　（１０μｇ／ｍｌ）をプロットした。非特異的結合をブロックする ために、本発明者らはストリップを１０％の正常ヤギ血清を含む１０ｍＭのＰＢ Ｓ　（ＰＢＳ／ＮＧＳ）中で３０分間室温でインキュベートした。次にこの培養 皿をＰＢＳ／ＮＧＳ中で一次抗体とインキュベートし、緩衝液で５回洗浄し、Ｆ ＩＴＣと結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧとともに更に１時間インキュベートし、 緩衝液で５回洗浄し、Ｎ−プロピルガレートでカバーグラスをかけて蛍光を保護 した。ＬＮの存在はストリップ中に容易に視覚化でき、ＬＮ／ＰＧ混合物により 最初に形成されたレーンに正確に似ていた。

７、　１．　６．抜根神経節アッセイの改良７．１．６．１．ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ ：ラミニン混合物本発明者らはニトロセルロースプレート上にストライプを作成 した。このストライプはラミニンおよびＫＳ／Ｃ３−ＰＧの混合物を含むストリ ップであり、ラミニン濃度は４枚のプレート間で１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌに変えた。ＫＳ／Ｃ３−ＰＣの濃度 は最大の神経突起抑制を示すことが知られている１ｍｇ／ｍｌに保った。本実験 の残りの部分は既述のように行った。コントロールはｌＯμｇ／ｍｌのラミニン ＋ＲＩＴＣのストリップからなり、ｌＯμｇ　／　ｍｌのラミニンを培養皿全面 に塗布しく基本的な実験では１００μｇ／ｍｌを用いた）、続いてＤＲＧをまき 、２４時間インキュベートして、ラミニンのこの濃度か通常の成長に充分である かどうかを調べた。

７．１６．２．ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ　：ＮＣＡＭ混合物ポリシアル酸化ＮＣＡＭは 成長の間上衣板中に存在する（上記６章を参照）。プロテオグリカンとＮＣＡＭ との組み合わの効果を試験するために、本発明者らはＰＧと（ＬＮに代えて）Ｎ ＣＡＭ　（Ｐ、ヤング（Ｙａｎｇ）およびＵ、ラティスハウサ−（Ｒｕｔｉｓｈ ａｕｓｅｒ　）の提供品）をレーン中で混合した。ポリシアル酸化ＮＣＡＭはイ ムノアフィニティ精製によりＥ１４ニワトリ脳小胞の０゜５％ＮＰ４０抽出物か らミリグラムの量で調製した。抽出物中のＮＣＡＭは臭素化シアン法により活性 化したセファロース４Ｂビーズに結合させた抗ニワトリＮＣＡＭモノクローナル 抗体（５Ｅ）ＩｇＧに結合し、ＮＣＡＭを０．５７％ジエチルアミン、ｐＨ１１ ，５（ホフマン（Ｈｏｆｆ＋＋＋ａｎ　）ら、１９８２、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、　２５７　（１３）ニア７２０−７７２’９）で溶出させた。得られた ＮＣＡＭをポリシアル酸化し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでは２００　ｋＤ 以上泳動する。ＮＣＡＭ（１０または１００μｇ／ｍｌ）を１ｍｇ／ｍｌのＫＳ ／Ｃ３−ＰＧと組み合わせて使用し、インキュベーションを上記のように行った 。これらの培養皿はＫＳ／Ｃ３−ＰＧ　＋　ＬＮ混合物およびＫＳ／Ｃ３−ＰＣ だけのものと比較した。

７、　１．　６．　３．ケラタン硫酸鎖の酵素的消化ケラタン硫酸鎖に特異的な ２種類の分解酵素、エンド−β−ガラクトシダーゼおよびケラタナーゼ（メルロ ース（Ｍｅｌｒｏｓｅ　）　。

Ｊ　およびゴッシｘ　（Ｇｈｏｓｈ）、Ｐ、　、１９８５．分析生化学（Ａｎａ ｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　、１７０　：　２９３−３０ ０）　（フィルスサイエンス（Ｍｉｌｅｓ　Ｓｃｉ、））および／またはコンド ロイチン硫酸鎖に特異的な酵素、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（フィルスサイ エンス）を１００Ｕ／ｍｌの濃度で、ラミニン（１０μｇ／ｍｌ）およびウシま たはニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＧ　（１ｍｇ／ｍｌ）の混合物を含むストライブの ある培養皿に加えた。エンド−β−ガラクトシダーゼおよびケラタナーゼはこの 濃度で１０１ｍの凍結ラットを髄切片中のケラタン硫酸を著しく分解することか 観察された。ＤＲＧをまき、この細胞を前と同じように２４時間インキュベート した。酵素処理したストライプを有する培養皿を酵素を付与しなかったコントロ ール培養皿と同時にインキュベートして、神経突起の成長を比較した。コントロ ール培養皿のあるものはプロテアーゼ阻害剤（１０ｍＭ）リス酢酸緩衝液（ｐＨ ７，２）中のアポプロチン、ロイペプチンおよびペプスタチンを各１ｍｇ／ｍｌ ）を含有していた。

さらに酵素分解生成物は８日目のニワトリ軟骨肢節間葉細胞培養物から分離した ニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＧを出発材料として溶液中に以下の酵素を用いて調製し た（カルジノ（Ｃａｒｒｉｎｏ　）　、　Ａ１．カブラン（Ｃａｐｌａｎ）、　 Ａ、１．　、　１９８５．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６０　：１２２−１２７）：　（１）プロテオグリカンからケラタン硫酸鎖を 除去するためケラタナーゼのみ、（２）コンドロイチン鎖を除去するためコンド ロイチンＡＢＣリアーゼのみ、および（３）純粋なタンパクコアを得るためにケ ラタナーゼとコンドロイチンＡＢＣリアーゼの組み合わせ。イムノドツトプロッ トによると、すべてのコンドロイチン鎖はこの処理により除去されるか、約ｌＯ ％のケラタン硫酸鎖はタンパクコアに消化後も結合したままであることか示され た。タンパクコア＋ＬＮの培養皿は質量作用（ｍａｓｓ　ａｃｔｉｏｎ）の可能 な効果を試験するためのコントロールとして用いた。これらはすべて３７°Ｃで １時間反応させた。ＬＮと混合した４つの試薬のそれぞれに対して、前に行った ようにそれらのＥ９ニワトＩＪ　Ｄ　ＲＧ神経突起に対する抑制効果を検定した 。

７、　１．　６．　４．　ラット軟骨肉腫軟骨プロテオグリカン軟骨肉腫軟骨プ ロテオグリカン（ＰＣ３）（カリノ（Ｃａｒｒｉｎｏ）およびカブラン（Ｃａｐ ｌａｎ）　、１９８５．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６０　：１２２−１ ２７）を基本アッセイで用いた。このプロテオグリカンはＫＳｉｉ域か欠如し、 コンドロイチン硫酸がウシまたはニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＧに見られるＣ−６− Ｓ形ではなくＣ−４−３形であること以外はウシまたはニワトリＫＳ／ＣＳ−Ｐ Ｇにかなり類似している。

７、　１．　６．　５．デルマタン硫酸プロテオグリカンアッセイウシおよびニ ワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＣによる神経突起抑制か他のプロテオグリカンに共通した ものであるかどうかを知るために、本発明者らはデルマタン硫酸プロテオグリカ ン（ＤＳ−ＰＧ）を、多くの他の可能性のあるグリコサミノグリカンの一つとし て、上述の基本プロトコールで使用した。ＤＳ−ＰＧを前と同し濃度で用いて、 これを前にニワトリおよびウシＫＳ／ＣＳ−ＰＧで行ったようにラミニンと混合 した。ニワトリ（Ｅ９）ＤＲＧニューロンをこの試験培養物にまいて分析した。

７．２　結果 本発明者らの目的は、ケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（Ｋ Ｓ／Ｃ３−ＰＧ）が、単独で又は、上衣板中もしくはその周囲に存在する他の分 子との組み合わせで、試験管内で神経突起の成長を活発に抑制し得るかどうかを 示すことのできるアッセイを開発することであった。これを達成するため、本発 明者らはランゲナウア（Ｌａｇｅｎａｕｒ）およびレモン（Ｌｅｍｍｏｎ）　（ １９８７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８４ニア７５ ３−７７５７）か開発した、精製した分子を一定の幾何学パターンで塗布するこ との可能なニトロセルロース被覆ペトリ皿を利用する、細胞培養技術の変法を用 いた。

７、　２．　１．神経突起成長の抑制のアッセイニトロセルロースはベトリ皿プ ラスチックに簡単に付着し、培養の研究のためのタンパクを非共有的に結合する ことのできる基体である。このために本発明者らはラミニン（ＬＮ）および神経 細胞付着分子（ＮＣＡＭ）といったタンパクを結合させる基体として、細胞付着 を容易にしおよび／または神経突起の伸長を可能にすることが知られているニト ロセルロース被覆培養皿を用いた。

（ラティスハウサー（Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ　）ら、１９７８、Ｊ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｆ、７９　：　３８２−３９３　；レトーアネアウ（Ｌｅｔｏｕｒｎ ｅａｕ）　、Ｐ、Ｃ，、１９７５，Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、４４：９２−１０１； ７ントーベ（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ　）　ら、１９８３１．１．　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、９７　：　Ｉ　８８２−１８９０　：リーツ（Ｌｉｅｓｉ）ら、１９８ ４、Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、１１　：　２４１−２５１　；ランダ ー（Ｌａｎｄｅｒ）ら、＋９８５、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　８２　：２１８３−２１８７　：コーエン（Ｃｏｈｅｎ　）ら、 １９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２２　：　４６５−４６７；ミルスキー（Ｍｉｒｓ ｋｙ）ら、１９８６、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ、１５　（６）ニア９９−８１ ５．および今回の結果）。本発明者らはまた興味のあるプロテオグリカン、すな わちケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ） またはこの巨大分子の種々の部分（そのタンパクコア、またはＫＳ−ＰＧ、また はＣ３−ＰＧ）を結合させた。更に、本発明者らはデルマタン硫酸プロテオグリ カン（ＤＳ−ＰＧ）およびラットの軟骨肉腫軟骨プロテオグリカン（ＰＣ３）を 比較のために結合させた。全ニワトリ（Ｅ９）後板神経節（Ｄ　ＲＧ）を精製分 子の縦のストライブ（図１６）の入った培養皿にまいた。アッセイは血清を含む 培地中で実施し、次に比較のために血清を含まない培地で繰り返した。それぞれ のアッセイの結果は血清の存在如何にかかわらず不変であった。神経突起成長の 分析は、これらＰＧレーンから離れたＬＮ被覆面に付着したＤＲＧの観察を、プ ロテオグリカン含有のストライブ上に部分的または完全に固定されたものから分 離することにより行った。可変的な神経束の厚さと神経突起の網状をなす性質が 正確なカウントを妨げたので、抑制を受けた神経突起の数を抑制を受けなかった もの（つまりＰＧレーンとクロスしたもの）と比較して正確に定量することはで きなかった。考慮したすべての場合に、神経突起の束が完全な抑制を受けたかま たは受けなかったかについての結果は自明であり、抑制に関してはイエス（ｙｅ ｓ）とノー（ｎｏ）の方法で考慮した。中間的なパターンか表れたときは、平均 的なケースの代表的な写真を撮った。

７、　２．　２．成長促進分子の効果 １１−１Ｏ１ｚ／ｍｌのＬＮのみのＲＩＴＣ［識ストライブからなる試験培地は Ｅ９ニワトリＤＲＧからの神経突起の成長を助けた。ｌまたは１０μｇ／ｍｌの ＬＮストリップをＲＩＴＣと共に中央においた培養皿、及び培養皿全体にわたっ て１０または１００μｇ／ｍｌのＬＮを塗布した培養皿はそれぞれのＤＲＧ周囲 の神経突起の対称輪の生産を促進し、ストライブ状に置いたＬＮ／ＲＩＴＣと残 りのストライブを占有するために培養皿上−面に塗布したＬＮの間のラインにお いて成長の差がなかった（第１７図ＡおよびＢ）。このコントロールは培地設定 の技術的特異性又はＲＩＴＣでストリップを標識することから生じる毒性の問題 がこの例では要因とはならないことを示している。ニトロセルロース単独で培養 したＤＲＧのコントロールは細胞付着や神経突起の成長をほとんどまたはまった く示さなかった。

７、　２．　３．抑制分子の役割 ＲＩＴＣで標識したＫＳ／Ｃ３−ＰＧをニトロセルロース被覆培養皿上にストラ イブ状にプロットしさらにＬＮが皿全面に被覆されて残りのレーンを占有してい る場合に、ＤＲＧから伸長した神経突起は全体としてＫＳ／Ｃ３−ＰＧレーンの 境界で止まるか、または一方向または他方向に向かってレーンの境界に沿って成 長した。重要なことはＤＲＧから移動している支持細胞が成長中のもしくは抑制 された神経突起の前線とはいかなる相関性もなかった。ＤＲＧのあるものはゼロ または２．３の支持細胞を持つのみてあったが、あるものは多くを有し、あるも のは支持細胞成長のみを育していた。支持細胞があってもなくても、神経突起か ＫＳ／ＣＳ−ＰＧのレーンに接触している場合、プロテオグリカン１ｍｇ／ｍｌ で神経突起は完全に抑制された（第１８図）（後述するニトロセルロースに結合 したＫＳ／Ｃ３−ＰＧの実際の濃度の分析を参照）。ＲＩＴＣ標識化ＫＳ／Ｃ５ −ＰＣストライブを蛍光マイクロスコピーで、ＤＲＧ神経突起を位相差マイクロ スコピーで同時に観察した結果、これら神経突起かプロテオグリカンのストライ ブの境界で別個に応答することか分かった（第１８図）。

興味あることに、神経節から移動するＤＲＧの細胞体は多くの支持細胞かそうで あったように、ＰＧレーンの境界に沿って停止する傾向かあった。

０．２ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌの範囲のＫＳ／Ｃ３−ＰＧの濃度勾配は 単一の培養皿中で試験した。本発明者らの観察によれば、その濃度が低い場合で は、非常に多くの神経突起かレーンとクロスするが、ＰＧａ度が０．２ｍｇ／ｍ ｌ　（写真の左側）から０．４ｍｇ／ｍｌ　（写真の右側）となるにつれレーン とクロスする神経突起は少なくなった（１．０ｍｇ／ｍｌで完全抑制を示す′： Ｊｃｌｓ図と比較のこと）。ＰＧのより低い濃度でレーンとクロスするパターン は、ストリップの境界に沿って上から下に分析して、クロス点間の完全抑制の広 かりにより間欠的であった。

７、　２．　４．後板神経節アッセイの改良？、２．４，１．ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ ：ＬＮ混合物本発明者らはＬＮがこれらのアッセイ培地中で果たす役割をさらに 調へようとした。しかし、ＫＳ／Ｃ３−ＰＣは培養皿中のニトロセルロースに結 合したものであって、ケラタン硫酸のドツトプロットイムノアッセイのポジティ ブな結果に基づいては、ストライブ部分のすべてがプロテオグリカンで被覆され たのか、または培養皿を最初にＰＣ次にＬＮの順序で被覆した場合、ラミニンが にトロセルロース被膜またはプロテオグリカンそのものにさえ）結合する場所が 残されているのかどうかは分からなかった。

ラミニンがストリップに直接に取り込まれたのかを確かめるために、本発明者ら はニトロセルロース上にプロットする前にラミニンをＫＳ／Ｃ３−ＰＧと混合し た。ポリクローナル抗ラミニン抗体を用いる免疫細胞化学により、ラミニンがス トライブ中に実際に存在していることが示された。さらに、本発明者らはプロテ オグリカンと組み合わせたＬＮの抑制効果をなお引き起こす最大濃度を決定した 。２５μｇ／ｍｌ（または未満）のラミニンと１ｍｇ／ｍｌのＫＳ／Ｃ３−ＰＧ の比率は成長を完全に抑制できたか（第２０図Ａ）、一方、５０または１００μ ｇ／ｍｌのＬＮはＫＳ／ＣＳ−ＰＧ＋ＬＮのストライブとクロスする神経突起の 数を増加させた（第２０図Ｂ）ことを本発明者らは知った。コントロールとして 、最低の試験濃度のＬＮ（この場合は１０μｇ　／　ｍｌ）の成育能力を試験し 、ＫＳ／ＣＳ−ＰＧが存在しない場合、このＬＮの量で神経突起の成育か大きか ったことを観察した（第１７図Ｂ）。

７、　２．　４．　２．実際のＫＳ／Ｃ３−ＰＧ濃濃度フットプロットイムノア ッセイデータは示さず）および試験培養皿とコントロール中のＤＲＧ神経突起の 挙動から、ＫＳ／Ｃ３−ＰＣはニトロセルロースに付着することが知られていた か、本発明者らのインヒビジョンアッセイ中にニトロセルロースで被覆したベト リ皿に吸着した状態のプロテオグリカンの量については本発明者らは確実なこと は分からなかった。ストライブ中のＫＳ／Ｃ３−ＰＧの濃度を決定するために、 本発明者らはプロテオグリカンの硫黄を放射性同位体ｓｓ３であらかじめ標識し た。本発明者らの培養プレートから受けたカウントをニトロセルロースのみまた は緩衝液のみのあらかじめ計算した標準のカウントと比較することにより、本発 明者らはプロテオグリカン１ｍｇ／ｍｌの溶液を培養皿に移しかえ、媒体で洗浄 した後、ＫＳ／Ｃ３−ＰＧかストライブ中に０．２５−１．０μｇ／ｍｌ存在し ていることを決定した。プロテオグリカンの濃度がＬＮ１１度が増加するにした がって減少するのかどうかおよびこれがどの程度に減少するものかを調べるため に、本発明者らはＬＮがｏ−１ｏｏμｇ／ｍｌの増加する濃度で混合したＫＳ／ ＣＳ−ＰＧ　（以下に述べるＫＳ／Ｃ３−ＰＧ＋ＬＮ混合物）を用いてこの試験 を繰り返した。本発明者らは幾分意外ながらプロテオグリカンの濃度は用いるＬ Ｎの濃度とは関係なくほとんど変化しないままであることを発見した。ＬＮおよ びＫＳ／Ｃ３−ＰＧのニトロセルロースへの結合的特徴は複雑と考えられ、未だ もって決定していない相互作用かＫＳ／Ｃ３−ＰＧ分子とＬＮ分子およびニトロ セルロースの間に生じているのかもしれない。恐らく、ＬＮ分子は濃度か増加す るにしたがってますますＫＳ／Ｃ３−ＰＣ分子の周囲に密に集まるのかもしれな い。また、溶液中のＬＮはＰＧに比べてかなり低い濃度で存在しているため、Ｐ Ｇａ１度に対する効果は、ＬＮａ度かかなり増加するまで観察できないかもしれ ない。理由はとうてあれ、この結果は、本アッセイにおけるＬＮの濃度を変えて いる間も、一定量のＫＳ／Ｃ３−ＰＧに対し神経突起か応答することを決定でき たのは幸いであった。

７．２．４．３．ＫＳ／ＣＳ−ＰＧ：ＮＣＡＭ混合物上記アッセイにおいて、Ｌ Ｎは付着および伸長促進分子として用いた。しかし本発明者らおよび他の研究者 らによる免疫学的染色に基づくと、ＬＮはその細胞外の形ではを髄の側面壁中の 上衣板に接して存在するが、非常に低い濃度でのみ存在しているかもしくは上衣 板自体の内部では細胞質の形でのみ存在しているに違いない。従って、本発明者 らは以前に上衣板細胞により示したように（６章、前述）　、ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ ＋ポリシアル酸化ＮＣＡＭを用いるストライブアッセイで分子的結合を調べた。

ＬＮレーンが交互にくるＫＳ／ＣＳ−ＰＧ＋ＮＣＡＭレーンのインビトロの結合 は、インビボで見つけられたこれら特別な分子のパターンに近似している（しか し恐らくＣ８ではない）。本発明者らは１０または１００μｇ／ｍｌのポリシア ル酸化ＮＣＡＭおよび１ｍｇ／ｍｌのＫＳ／Ｃ３−ＰＧを混合し、これらストリ ップをニトロセルロースにプロットし、乾燥してｌＯＯμｇ／ｍｌのＬＮをその 培養皿に均一に塗布した。本発明者らは、ＫＳ／ＣＳ−ＰＣはＩＯμｇ／ｍｌの ＮＣＡＭの添加によって著しく抑制的であること（第２１図）および１００μｇ ／ｍ１程度のＮＣＡＭはまだ神経突起のクロスをほとんど可能にさせないことを 観察した。ＬＮを交互に並ばせたストライブ中にＮＣＡＭのみ１０−１００μｇ ／ｍｌを含む（すなわち、ＫＳ／Ｃ３−ＰＧが存在しない）コントロールは、Ｎ ＣＡＭのみのこの濃度かＤＲＧ神経突起成長を促す誘導基体であることを示した （第２２図）。レーンの内部もしくはレーン間の神経突起のパターンの分析はこ の形での成長とＮＣＡＭ対しＮ上の成長の間にはいかなる差異も示さなかった。

興味深いことに軸索がＬＮからＮ　ＣＡ　Ｍまたはその逆に伸長する中間面での 神経突起のパターンにはとんな差異も明らかにならなかった。

７．２．４．４．酵素消化アッセイ 本発明者らはＫＳ／ＣＳ−ＰＣ分子の個々の成分の効果を分析した。このために 特定の酵素を用いてＫＳ／Ｃ３−ＰＧ分子の種々な部分を消化した。この目的の ための標準酵素の問題としてはケラタン硫酸またはコンドロイチン硫酸銀をウシ ＫＳ／Ｃ３−ＰＧのタンパクコアから完全に分解するには不充分なことである。

しかしニワトリのものにおいては実質的な分解ができた。従って、本発明者らは ニワトリ肢芽軟骨の８日目の培養物から分離したニワトリＫＳ／ＣＳ−ＰＧをこ の消化アッセイのために用いた。

ニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＧは培養皿にプロットする前にケラタナーゼ、コンドロ イチンＡＢＣリアーゼ、または両方の溶液で処理した。　酵素分解後、これらの 試薬を５−１０μｇ／ｍｌのＬＮに混合した。これらの４種類の試薬を用いる培 地により以下のことが示された：　（１）未消化のニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＧは ウシＫＳ／Ｃ３−ＰＧと同じ濃度で用いられるとき神経突起の成長を著しく抑制 しく第２３図Ａ）、（２）ケラタナーセ（第２３図Ｂ）またはコンドロイチンＡ ＢＣリアーゼのみ（第２４図）を使用することによりある程度のクロスか起こる ため、ｃｓｍおよびＫＳＭは完全な抑制に必要であり、（３）このプロテオグリ カン分子のタンパクコアは、ケラタナーセおよびコンドロイチンＡＢＣリアーゼ の両方をともに使用することにより示されたニワトリＤＲＧ神経突起に対して何 の抑制効果も示さない（第２４図Ｂ）。

タンパクコアアッセイは神経突起抑制を起こさないという事実はこのプロトコー ルにおいては質量作用効果が神経突起の挙動を支配する頚著なファクターではな いという根拠となるものである。

消化アッセイの第二のタイプにおいて、本発明者らはストライブか未消化のＫＳ ／ＣＳ−ＰＧ＋ＬＮの混合物を含むストライブを存する培養皿中のＤＲＧ神経突 起の挙動とＤＲＧを接種する直前にケラタナーゼまたはコンドロイチン処理処理 をした培養皿のＤＲＧ神経突起の挙動とを比較した。従って、これらの消化はプ ロティラング前の溶液中ではなく培養皿で行った。この変更により、ケラタナー ゼまたはコンドロイチン処理がＤＲＧ接種に先行するときコントロールに比較し て、かなりの量が成長しレーンとクロスするという上記の発見を確かめることが できた。このことはさらにラミニンが実際に培養皿に存在し、それも軸索成長か 抑制されていないとき、その成長を促進するのに充分な濃度で存在していること を示していた。

７、　２．　４．　５．軟骨肉種細胞系軟骨コンドロイチン硫酸プロテオグリカ ン（ＣＳ−ＰＧ） 本発明者らはｌＯμｇ／ｍ１のＬＮと混合したラット軟骨肉種腫瘍細胞系軟骨プ ロテオグリカン（ＰＣ３）（Ｃ３−ＰＧのタイブ）を調べた。このＲＣＳはウシ ＫＳ／Ｃ３−ＰＧと以下の２弘で異なる以外は構造的に同じである：　（１）こ のものはＫＳｉｌ領域が欠如している（ハスカル（Ｈａｓｅａｌｌ　）　、　Ｖ 、　Ｃ，、ｌ　９８１、Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、 　Ｖ　ｏ　ｌ　、ｌ　、　Ｖ、ギンスブルク（Ｇｉｎｓｂｕｒｇ）　１ｉ集、Ｊ ｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、　１−４９ページ）および（２ ）Ｃ３ｉＪＩはＣ−４−Ｓ形の中に存在している（先に議論のウシおよびニワト リＫＳ／Ｃ３−ＰＧはＣ−６−Ｓである）。

この改良法で観察された多くのＤＲＧ神経突起はＣ３−ＰＣ境界で止まったが、 神経突起のかなりの部分かウシおよびニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＧで事実上完全な 抑制に充分な１ｍｇ／ｍｌの濃度でしばしばストリップとクロスした（第２５図 ）。従って、このＣ３−ＰＧ分子はＤＲＧ神経突起の抑制を達成するのにウシま たはニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＧよりも効果が低い。部分的な抑制か観察されたた め、データはＫＳ鎖か完全な抑制を行うのみならず、Ｃ３は神経突起の反発に大 きく寄与することかできることを示した。ここではＲＣＳ中のＣ−４−３および ウシおよびニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＧのＣ−６−Ｓに応答する神経突起成長は直 接には比較できないことを考慮する必要がある。

７、　２．　４．　６．他のグリコサミノグリカン含有のプロテオグリカンの神 経突起抑制に対する役割 観察される抑制効果はグリコサミグリカンケラタン硫酸およびコンドロイチン硫 酸に特異的かどうかを試験するために、本発明者らはプロテオグリカン形（ＤＳ −ＰＧ）のウシのグリコサミノグリカン、デルマタン硫酸を多（の他の可能なグ リコサミノグリカンの一つの選択として用いた。本発明者らはこのプロテオグリ カンは１ｍｇ／ｍｌの同じ濃度でウシまたはニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＧで観察さ れたよりもＤＲＧに対し抑制かがなり低く、第２５図に示されるラット軟骨内積 軟骨プロテオグリカン（ＰＣ３）に対する応答とかなり似ていることを発見した 。

（本頁以下余白） ７．３．考察 たとえＬＮまたはＮＣＡＭかそれ自身で通常充分な神経突起成長を可能とする濃 度で存在していても、後接神経節神経突起はラミニン（ＬＮ）または神経細胞付 着分子（ＮＣＡＭ）と混合したケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリ カン（ＫＳ／ＣＰ−ＰＧ）により濃度依存性で抑制を受けることを本発明者らは 示した。グリコサミノグリカン特異酵素消化によるＫＳまたはＣ８の除去によっ て、神経突起をいろいろな程度にＰＧレーンとクロスさせることができる。両方 のグリコサミノグルカンをプロテオグリカンから除去して、ＬＮと混合したタン パクコアのみを残すとき、レーンを超える神経突起の成長はＬＮまたはＮＣＡＭ のみを含有するコントロールに起こるように完全には妨げられることはなかった 。これらの結果は、ＫＳＭおよびＣ８鎖は神経突起抑制特性を有するが、タンパ クコアはこれを育さないことを示している。また、タンパクコアのみの利用は、 神経突起の抑制か単に質量作用効果よるものではないことを主張するための適当 な対照としても役立つ。

７、　３．　１．神経膠細胞は軸素の親和性または反発性分子を同時に発現また は隠蔽することができる 本発明者らの以前のデータ（６章）は上衣板の神経膠細胞かその表面に５ＳＥＡ −Ｌ　Ｌ２　（ＨＮＫ−１）およびＮＣＡＭなとの付着性分子を発現することを 示した。軸索は上衣板を通過しないため、これらの分子は神経膠細胞を一つにま とめるように作用するか、それら細胞を周囲の付着部位の小室の軟膜表面か背側 部分に結び付けるのに役立つように作用するものと思われる。また、上衣板は本 発明者らがインビトロでＤＲＧ神経突起に抑制的であることを示したＫＳも発現 させる。従って、インビボでの上衣板の神経膠細胞は細胞−細胞接合性の分子と 細胞反発性分子を同時に作ったり隠蔽することができる。こうしたことは例えば 神経膠細胞プロセルで境界付けられ、ＣＳプロテオグリカン含有の細胞外マトリ ックスで満たされた巨大細胞外隙の記載があるニワトリサブプレートなどのＣＮ Ｓ中の他の軸素不応性部位でも起こっている可能性がある（パルメート（Ｐａｌ ｍｃｒｔ　）たち、１９８６．５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　 Ａｂｓｔ、１２　：　１３３４　）。

７、　３．　２．すべてのグリコサミノグリカンは神経突起伸長に関して機能的 に同じではない 本発明者らの結果は、ウシのデルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳ−ＰＧ）が 同じ濃度でウシＫＳ／ＣＳ−ＰＣと比較して神経突起抑制の低下量を起こすため 、抑制の差異が同じ種の中のプロテオグリカン間に存在していることを示してい る。プロテオグリカンは多様な方法で軸索に影響を与えるが、ケタラン硫酸−、 コンドロイチン硫酸−１およびデルマタン硫酸プロテオグリカンを用いた本発明 者らのこの研究は他のゲルコサミノグリカンを用いた他の実験室の結果と組み合 わせてみると、これらの分子は一般に神経突起成長および細胞付着に抑制性であ ることを示している。

生物学的影響の差異の部分的な原因となりつるプロテオグリカンのグリコサミノ グリカン部分の特徴として、硫酸化のレベルとパターンを変えられる。ＲＣＳプ ロテオグリカンは、ＤＳ−ＰＧかそうであるように、Ｃ−４−Ｓの形のコンドロ イチン硫酸から構成されている（ＤＳＩのイズロン酸はグルクロン酸にエピマー 化してＣ−４−Ｓｉｌを形成することか可能であり、ＤＳ−ＰＧはしばしば多く の数のこれらの鎖からなる（ハスコール（Ｈａｓｃａｌｌ）　、　Ｖ、　Ｃ，、 １９８１，Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、　Ｖｏｌ、　 ｌ：１−４９；ハイネガード（ｔ（ｅｉｎｅｇａａｒｄ）およびボールスソン（ Ｐａｕｌｓｓｏｎ）　、１９８４．　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉ ｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７７−３２２　）。

しかし、ウシおよびニワトリＫＳ／Ｃ３−ＰＣのＣ８鎖はＣ−６−３の形である 。ＲＣＳプロテオグリカンおよびＤＳ−ＰＧは神経突起抑制の程度に関して同じ ような結果を起こし、抑制の程度がニワトリおよびウシＫＳ／Ｃ３−ＰＧとは異 なっていたため、この僅かな構造変化は成長円錐により検出し、これを異なる程 度に抑制させると解釈することができる。

７、　３．　３．すべての神経膠チャンネルは同じではない文献によればを椎動 物における多くの発達軸索システムにおいて、神経膠細胞突起によって境界付け られマトリックスで満たされた巨大細胞外チャンネルは一般に、上衣板およびニ ワトリのサブプレート境界のチャンネルのように、先頭軸索（この成長円錐は神 経膠細胞膜に密接に関連している）のルートを指し示してくれるとしている（ヒ ス（Ｈｉｓ）、Ｗ、、１８８７．　Ａｒｃｈ、　Ａｎａｔ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、 　ＬｅｉｐｚｉｇＡｎａｔ、　Ａｂｔ、　９２：３６８−３７８；シルバー（Ｓ ｉｌｖｅｒ）、　Ｊ、およびロブ（Ｒｏｂｂ）、Ｒ，Ｍ、、１９７９．Ｄｅｖ、 　Ｂｉｏｌ、　６８：１７５−１９０：クラヤネク（Ｋｒａｙａｎｅｋ）、Ｓ、 、Ｔｈｅ　Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ　Ｒｅｃｏｒｄ　１９７：９５−１０吐シルバ ー（Ｓｉ　１ｖｅｒ）、　、Ｊ。

、およびシトマン（Ｓｉｄｍａｎ）、Ｒ，Ｌ、、ｌ９８０．Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　 Ｎｅｕｒｏｌ、　１８９：１０１−１．１１：ノードランダー（Ｎｏｒｄｌａｎ ｄｅｒ）、　Ｒ，、およびシンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）、　Ｍ、、１９８２．Ｅｘ ｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、７５：２２１−２２８、ナカニシ、Ｓ、、１９８３．Ｄｅ ｖ、　Ｂｉｏｌ、　９５二３０５−３１６　；シンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ）、 Ｓ、、　１９８３．　ｉｎ　５ｐｉｎａｌ　ＣｏｒｄＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ ｏｎ、　Ｃ＋Ｃ，カオ（Ｋａｏ）他編集、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　 Ｙ。

ｒｋ、　Ｎ、Ｙ、、ｐｐ、１５１−１６２；ボルフ（Ｂａｒｋ）らたち、１９８ ７．Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒｏｌ、　２６４：１４７−１５８）。穴を有す る広いチャンネルはマトリックスのプロテオグリカンに結合した水和グリコサミ ノグリカンにより形成されやすい（マルゴリス（Ｍａｒｇｏｌｉｓ）たち、１９ ８６、Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、４８１　：　４６−５４　； 　ルツカ（Ｒｕｔｋａ　）たち、１９８８、Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、　６９ 　：　１５５−１７０　）Ｏ興味を引くことに、この同じ種類の軸索前形成神経 膠チャンネルは無を椎動物にも同じように存在し、このことは神経膠「ノ１イウ エイＪを形成する基本的分子機構が発達の間に広（保存されてきたことを示唆す るものである（ジャコブス（Ｊａｃｏｂｓ）　、Ｊ、　Ｒ，、およびゴツトマン （Ｇｏｏｄｍａｎ　）　、Ｃ，Ｓ、　、１９８９、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、９　 （７）＋２４０２−２４１１）、しかし、ゲラ歯動物類の上衣板およびニワトリ のサブプレートの神経膠細胞突起で作られた巨大細胞外空間が軸素伸長に役立つ ものではないことは明らかである。解剖学的には軸索経路の神経膠細胞およびバ リアおよびそれらが結び付いたチャンネルは同じようにみえるが、機能的には明 らかにかなり異なっている。軸素が他のものでなくある種のチャンネルの神経膠 壁に沿って成長する理由は何か。ゲルコサミノグリカンが軸素成長に生来的に抑 制的であるとき、とうしていったいゲルコサミノグリカンを用いて軸索が成長す る場所てスペースを作るのか。その答えは細胞外空間そのものの物理的存在にあ るのではなく、チャンネルもしくはチャンネル中の細胞外マトリックスに接する 細胞の表面の分子的性質にあるように思われる。

７、　３．　４．プロテオグリカンは抑制的となりつるか修飾されて許容的とな るのかもしれない 本発明者らはグリコサミノグリカンは抑制をいろいろな程度に引き起こし、これ は濃度および種類に依存することを示したか、本発明者らはまたゲルコサミノグ リカンは成長許容性になりうろこと、つまりプロテオグリカンの抑制効果は成長 促進分子であるラミニンの適度な濃度に伴って減少もしくは完全に遮蔽すること かできることも知ったのである。ＮＣＡＭはプロテオグリカンか仲介する抑制を 相殺するには著しく非効果的である。これらの結果によれば、神経軸索の成長円 錐はその化学的な環境の差異を調査することかでき、そのサンプリンング調査に 基づいて自動性についての「決定」をすることができることが示唆された（レト ウアネアウ（Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ）、Ｐ、Ｃ，，１９７５，Ｄｅｖ、　Ｂｉｏ ｌ、　４４：９２−１０１を参照）。従って、神経突起成長を抑制するように働 く（もしくはその逆に働く）分子の影響を成長促進分子は通常、変更することか できるように思われる。従って、親和性もしくは粘着性を有する分子と神経膠上 もしくはその周囲の抑制分子との比率を変えるか、もしくはそれら分子の様子を 一時的に変更することにより、広い範囲の神経突起パターンを引き出すことかで きる。この範囲は、神経膠境界とすべての隣接する軸索（たとえば、上衣板、ニ ワトリのサブプレート及び背面眼茎）との間の完全な分離から（第１９図の右の レーンのもののように間欠的な交差パターンであり、これはインビボで床板の変 速およびを髄視床の軸索、または体性感覚皮質のバレル領域に対する視床アフエ レンツ（ａｆｆｅｒｅｎｔｓ）で起こる）、完全な非曲性／直線の軸素パターン （例えば近位視神経のもの）への部分的分離までである。

（本頁以下余白） ８　デルマタン硫酸およびケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン はニューロン様細胞系の神経突起の成長をインヒドロで阻害する デルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳ−ＰＧ）およびケラタン硫酸／コンドロ イチン硫酸プロテオグリカン（ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ）はニューロン様細胞系のＰＣ −１２の細胞から神経突起の成長を阻害することが発見された。神経突起成長の 阻害は０．１ｍｇ／ｍ　Ｉ　（１，２５ｕＭ）のＤＳ−ＰＧおよび０．２５ｍｇ ／ｍ！（０，３１μＭ）のＫＳ／Ｃ３−ＰＧの濃度で示された。

８．１．　材料および方法 ８、　１．　１．基質の調製 組織培養ベトリ皿（６０ｍｍ）を前述の７．　１．　１．章で述べたようにニト ロセルロースで被覆した。セルロース濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ＃１）を３５０μｍ のストリップに切断し、種々のプロテオグリカンをこのニトロセルロース支持体 上にプロットするために用いた。これらのストリップを目的とするプロテオグリ カン混合物２０μｌに浸した。次に、１ｍｇ／ｍｌのラミニン（ＬＮ）溶液を曲 がったガラスパスツールピペットを用いて培養皿に均一に広げた。これらの手順 の定量的な説明と適当なコントロールは前記の第７章に詳しい記載がある。

ストライブはＬＮ　（４０μｇ／ｍｌ）、およびいろいろな濃度のＫＳ／Ｃ３− ＰＧ、またはＤＳ−ＰＧの混合物を有するニトロセルロースで被覆した培養皿上 で作成した。

８．１．２．ＰＣ−１２ニユーロン様細胞系の調製実験に用いるＰＣ−１２細胞 は最終濃度でＤＭＥＭおよび１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清および３０μｇ ／ｍｌゲンタマイシンからなる培地中で培養した。融合性プレートは０．２５％ トリプシンでアグリゲートを防いだ。

８、ｌ、３．神経突起の成長抑制のアッセイ実験手順で用いるプレートをプレー ト６０ｍｍあたり約１００万の細胞を接種した。実験で用いる培地に神経成長因 子（ＮＧＦ）を最終濃度で５０　ｎ　ｇ／ｍ　１補った。

神経突起の成長に対して完全に抑制性のプロテオグリカンで被覆したストライブ を（−）、僅かな成長を可能にするものを（＋／−）、神経突起成長を可能にす るものを（＋）として評価した。

８．２．結果：　ＫＳ／Ｃ３−ＰＧのＰＣ−１２細胞軸素成長におよぼす効果 ＰＣ−１２細胞をプロテオグリカンの異なる濃度を有する原質に塗布し、ＮＧＦ の存在下で培養した。神経突起の成長は２４．４８および９６時間後に評価し、 これを表１に示す。

（本頁以下余白） 表１ ２、７ｍｇ／ｍｌ　（３，３７μＭ）　−−−１，０ｍｇ／ｍｌ　（１，２５μ Ｍ）　十／−−−０、５ｍｇ／ｍｌ　（０，６２μＭ）　＋／−−−０、２５ｍ ｇ／＋ｎｌ　（０，３１μＭ）　＋／　−＋／　−＋／　−ＤＳ−ＰＧ１！！１ 度　２４時間　４８時間　９６時間０、８ｍｇ／ｍｌ　（１０μＭ）　−−−０ 、４ｍｇ／ｍｌ　（５μＭ）　＋／−−０、２ｍｇ／ｍｌ　（２，５μＭ）　＋ ／　−＋／　−−０、１ｍｇ／ｍｌ　（１，２５μＭ）　＋　＋／−＋／−０， ０５ｍｇ／ｍｌ　（０，６２μＭ）　＋　＋　十８．３．考察 これらのデータはＤＳ−ＰＧおよびＫＳ／Ｃ５−ＰＧがＰＣ−１２細胞の神経突 起の成長に抑制性であることを示唆している。

ＰＣ−１２細胞はモルベースでＤＳ−ＰＣよりもＫＳ／Ｃ３−ＰＧに高い感受性 を示すが、重量ベースでは、異なるプロトグリカン組成物は同様な抑制を示す。

後者の観察は後根神経節の神経突起成長に対するＫＳ／Ｃ３−ＰＧおよびＤＳ− ＰＧの同様な抑制効果に対応するものである。ＤＳ−ＰＧはモルベースでＤＲＧ ニューロンに対しＫＳ／Ｃ３−ＰＧよりも抑制性が低い（前述７゜２、　４．　 ６．章、後述９．２章）。従って、ＰＣ−１２のニューロン様細胞の神経軸索の 成長円錐はＤＲＧニューロンか示すプロテオグリカン抑制に対して同じ特異性を 分は合っているように思える。７．　３．　２．章に考察されているように、両 方の細胞タイプからの神経軸素の成長円錐はＣ−６−３以上にＣ−４−３に対す る構造特異性を示すことができる。

９、ＤＳ−ＰＧのＤＲＧ軸素成長に対する影響ＫＳ／Ｃ５−ＰＧは後根神経節に ワトリＥ６からのＤＲＧ。

前記７．　２．　１．章）の神経突起の成長を抑制することを示した。

この実例ではＤＳ−ＰＧの神経突起成長の抑制を測定した。

９．１．材料と方法 ＤＲＧを前記７．１．２．章に記載のように調製した。ＤＳ−ＰＧストライブを ７．　１．　１．章および８．　１．　１．章に既述のとうりにラミニンで被覆 したニトロセルロース上で調製した。

成長抑制のアッセイは８．　１．　３．章に既述のとうりに実施した。ＤＲＧ　 にワトリＥ６後板神経節）を１００μｇ／ｍ１のラミニン上の異なる濃度のデル マタン硫酸プロテオグリカンを含む原質上に塗布し、神経成長因子（ＮＧＦ）の 存在下で培養した。

神経突起の成長に完全に抑制性のＤＳ−ＰＧで被覆したストライブを（−）、成 長を僅かに可能にするものを（＋／−）　、神経突起の成長を可能にするものを （＋）として評価した。

９２．結果 Ｅ−６ｖｉ根神経ｉ　（ＤＲＧ）細胞をデルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳ −ＰＧ）ストリップで処理したニトロセルロース上で培養した。成長測定の結果 を表２に示す。

表２ ２４時間後のＤＳ−ＰＧ上のＤＲＧ成長抑制ＤＳ−ＰＧａ度 およびアッセイ条件　軸索成長 ０．１ｍｇ／ｍｌ　ＤＳ−ＰＧ　＋ ０．２ｍｇ／ｍｌ　ＤＳ−ＰＧ　＋／−０，４ｍｇ／ｍｌ　ＤＳ−ＰＧ　− ０，８ｍｇ／ｍｌ　ＤＳ−ＰＧ　− ＤＲＧ軸索成長はＤＳ−ＰＣの０．４ｍｇ’／ｍｌ　（５μＭ）の低い量で完全 に抑制され、ＤＳ−ＰＧの０．２ｍｇ／ｍｌ　（２゜５μＭ）で部分的に抑制さ れた。

９．３　考察 これらの結果はＤＲＧ細胞はＤＳ−ＰＧによる抑制にニューロン様細胞ラインＰ Ｃ−１２よりも僅かながら感受性か高いことを示唆している。ＤＲＧ細胞はＤＳ −ＰＧの０．２ｍｇ／ｍｌの低い量で成長か部分的に抑制され、ＰＣ−１２細胞 はＤＳ−ＰＧの０．４ｍｇ／ｍｌで部分的に抑制された。

前記７．　２．　４．　６．章に報告のように、モルベースではＤＲＧ細胞はＤ Ｓ−ＰＧよりもＫＳ／Ｃ３−ＰＧに対して、より感受性かある。これらの結果は モルベースでＤＳ−ＰＧに対してよりもＫＳ／Ｃ３−ＰＧに対して、より感受性 かあるＰＣ−１２細胞系での結果と一致するものである。

１０、デルマタン硫酸およびケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸はインビトロで 神経膠細胞侵入を抑制するデルマタン硫酸プロテオグリカン（ＤＳ−ＰＧ）およ びケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸（ＫＳ／Ｃ５−ＰＧ）は神経膠細胞および 神経膠星状細胞侵入を抑制することが発見された。Ｃ−６ラツト神経膠腫瘍細胞 およびＭＣＧ−２８の幼若の不死マウス神経膠星状細胞はプロテオグリカンで被 覆した原質を９６時間までの間侵入することはできなかった。

！０．　１．材料と方法 １０、　１．　１．基体の調製 細胞培養ベトリ皿（６０−ｍｍ）をニトロセルロースで被覆した（シュレイカー ＆シュエルＣ３ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｃｈｕｅｌｌ　）　、タイプＢＡを６ ｍｌメタノールに溶解し５ｃｍ”につき０．５ｍ１）。

セルロースロ紙（Ｗｈａｔｍａｎ＃１）を３５０μｍのストリップに切断し、ニ トロセルロース基体上に種々のプロテオグリカンをプロットするために用いた。

これらストリップを２０μｍの目的とするプロテオグリカン混合物に浸した。Ｉ ｍｇ／ｍｌのラミニン（ＬＮ）溶液を曲ったガラスパスツールピペットでその培 養皿に均一に付けた。これらの方法は既述の７．１．１章にも述へられている。

ストライブはニトロセルロースで被覆した培養皿上にＬＮ　（４０μｇ／ｍりお よび種々の濃度のＫＳ／Ｃ３−ＰＧまたはＤＳ−ＰＧの混合物を用いて作成した 。

１０、　１．　２．細胞系の調製 実験に用いる異なる細胞系は、ＤＭＥＭおよび５％のウシ胎児血清、５％の小ウ シ血清および３０μｇ／ｍｌゲンタマイシンから成る培地で培養した。融合性プ レートは０．２５％トリプシンでアグリゲートを防いだ。実験操作で用いたプレ ートはｌ：６の比率で融合性プレートより接種した。Ｃ−６ラツト神経膠腫瘍細 胞（パガネッチ（Ｐａｇａｎｅｔｔｉ　）たち、１９８８、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ。

１０７：２２９１−２２９１）およびＭＣＧ−２８の幼若のマウス不死神経膠星 状細胞（ＳＶ−４０により不死化した（　ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）ネズミ新 産児の神経膠星状細胞系）をこれらの実験に利用した。

１０、　１．　３、成長抑制のアッセイ細胞侵入に完全に抑制的であるプロテオ グリカンで被覆したストリップを（−）、僅かな侵入を可能にするものを（＋／ −）、および侵入可能性のものを（＋）と評価した（第２６図）。

＋０．２．結果 ＋０．２．１．Ｃ−６に対するＤＳ−ＰＧの効果およびＭＣＧ−２８細胞の移動 および侵入 Ｃ−６神経膠細胞を異なる濃度のＤＳ−ＰＧ上に塗布した。

プレートは３．２４および４８時間、および５日後に評価した。

結果を第３図に示す。

表３ ＤＳ−ＰＧ上のＣ−６細胞侵入の抑制 ０．８ｍｇ／ｍｌ　（１０μＭ）　−−−−０，４ｍｇ／ｍ１（５μＭ）　−− −−０，２ｍｇ／ｍｔ（２，５μＭ）　−−−−０，１ｍｇ／ｍ１（１，２５μ Ｍ）＋　＋　＋　＋ＭＣＧ−２８の不死化した幼若神経膠星状細胞を異なる濃度 のＤＳ−ＰＧ上に塗布した。プレートは２４．４８、および７２時間、および５ 日後に評価した。結果を第４図に示す。

表４ ０．８ｍｇ／ｍｌ　（１０μＭ）　−−−−０，４ｍｇ／ｍ１（５μＭ）　−＋ ／　−０，２ｍｇ／ｍｌ　（２，５ｔｔＭ’）　十／−＋　＋　＋０．１ｍｇ／ ｍ１（１，２５μＭ）　＋　＋　＋　＋ＤＳ−ＰＧの０．４および０．２ｍｇ／ ｍ１間の濃度において、この細胞系はもはや抑制を受けることなく、ニトロセル ロースストリップに侵入することができる。ＤＳ−ＰＧは２種類の細胞系の成長 を同じように抑制したが、神経膠細胞（Ｃ−６）または神経膠星状細胞（ＭＣＧ −２８）の明らかな抑制促進は観察されなかった。

１０．２．２．ＫＳ／Ｃ３−ＰＧのＣ−６に対する効果およびＭＣＧ２８の細胞 移動と侵入 Ｃ−６およびＭＣＧ−２８細胞を種々な濃度のＫＳ／Ｃ５−ＰＧ上で培養し、時 間の間隔をあけて評価した。結果を表５に示す。

表５ ＫＳ／Ｃ３−ＰＣによるＣ−６およびＭＣＧ−２８の２．７ｍｇ／ｍｌ　（３， ３７μＭ）　＋／　−＋／　−＋１．０ｍｇ／＋ｎｌ　（１，２５μＭ）　＋　 ＋　＋０．５ｍｇ／ｍｌ　（０，６２ｕ　Ｍ）　十　＋　＋ｂ、　ＭＣＧ−２８ ＫＳ／Ｃ３−ＰＧ濃度　２４時間　４８時間　５日２．７ｍｇ／ｍｌ　（３，３ ７μＭ）　＋／　−＋／　−＋１．０ｍｇ／ｍ１（１，２５μＭ）　＋／　−＋ 　＋０．５ｍｇ／ｍ１（０，６２μＭ）　＋／　−＋　＋０．２５ｍｇ／ｍｌ　 （０，３１μＭ）　＋　＋　＋１０、　２．　３．細胞移動および侵入に関する ＫＳ／Ｃ３−ＰＧおよびＤＳ−ＰＧの比較 異なる細胞系をＫＳ／Ｃ５−ＰＧまたはＤＳ−ＰＧを被覆したストライブ上で培 養した。培養２４および４８時間後、プレートの細胞侵入の程度を評価した。Ｋ Ｓ／Ｃ３−ＰＧ上の成長の結果を表６に示す。ＤＳ−ＰＧ上の成長の結果を表７ に示す。

表６ ＫＳ／Ｃ３−ＰＣによるＣ−６およびＭＣＧ−２８表７ ＤＳ−ＰＧによるＣ−６およびＭＣＧ−２８ＭＣＧ−２８−−＋　＋ １０．３．考察 ＤＳ−ＰＧは等しい乾燥重量濃度で比較するとＫＳ／Ｃ３−ＰＧよりも強い阻害 剤である。１．０ｍｇ／ｍｌ　（１，２５μＭ）のＫＳ／Ｃ５−ＰＧ上で培養し たＣ−６およびＭＣＧ−２８細胞は２４時間で侵入を示したか（表６Ｌ　Ｏ，８ ｍｇ／ｍｌ　（１０μＭ）のＤＳ−ＰＧ上の侵入の抑制は少なくとも４日間持続 した（表３および４）。等しいモル濃度ては、ＫＳ／Ｃ３−ＰＧおよおびＤＳ− ＰＧＳは成長を同等に抑制することか見出された。

この結果は後板神経節の観察（上述９．２章）およびニューロン様細胞系ＰＣ− １２（上述８．２章）の観察とは対照的であり、これらの先の例ではＫＳ／Ｃ３ −ＰＧはモルベースでＤＳ−ＰＧよりも効力のある抑制物質として働いていた。

乾燥重量ベースではＫＳ／Ｃ３−ＰＧおよびＤＳ−ＰＧは神経突起成育に対して 同等の抑制を示す。

これらの結果は神経膠星状細胞を含む神経膠細胞は神経細胞ニューロンよりもプ ロテオグリカン抑制に僅かに異なる特異性を有することを示している。神経突起 の成長と神経膠細胞の移動または侵入は恐らく局所マトリックス中のプロテオグ リカンの組成に依存して異なる程度に抑制されるものと思われる。従って、プロ テオグリカンはインビボで神経細胞および非神経細胞成長に対する巧妙な調節作 用を及ぼして細胞成長を空間的に調節しているのであろう。

多（の参考文献をここに挙げたが、それらの開示は参照することにより完全な形 でここに組み込まれる。

Ｅ１３５ Ｅ１５５ ＦＩＧ、２Ａ ＦＩＧ。５ ＦＩＧ、６Ａ ＦＩＧ、６Ｂ ＦＩＧ、８Ａ ＦＩＧ、８Ｂ ＦＩＧ、　９Ａ　ＦＩＧ。９８ ＦＩＧ、９ＣＦＩＧ、９Ｄ ＦＩＧ、１１ ＦＩＧ、　１２Ａ ＦＩＧ、１４ ＦＩＧ、１５Ａ ＦＩＧ、１５Ｂ ＦｆＧ、１６ ＦＩＧ、１７Ａ ＦＩＧ、１８ ＦＩＧ、　１９ ＦＩＧ、２０Ａ ＦｉＧ、２０Ｂ ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、２２ ＦＩＧ、　２３４ ＦＩＧ、２３Ｂ ＦＩＧ、２４Ａ ＦＩＧ、２４８ ＦＩＧ、　２５ 国際調査報告 １″′″”′″″ｍ　ｉｌＭ、ｍ　ＩＩ″　ＰＣＴ、’υＳ特１％１９９フロン トページの続き （７２）発明者　シルバー、シェリー アメリカ合衆国　オハイオ州　４４１２４．　リントバースト、フォード　ロー ド　１３０３（７２）発明者　バレル、エイトリアンアメリカ合衆国　オハイオ 州　４４１２２．ウッドメア、アパートメント　２２１．チャグリン　ブルーバ ード　２８８１０ （７２）発明者　ロウフ乙ディクラ アメリカ合衆国　ミズーリ州　６３１４６．セントルイス、バーンヒル　コート 　２０−４０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．有効量のケラタン硫酸二糖から成る分子および製剤学的に許容される担体を 含有する医薬組成物。 ２．前記分子はケラタン硫酸プロテオグリカンである、請求項１の医薬組成物。 ３．前記分子はケラタン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項１の医薬組成 物。 ４．有効量のコンドロイチン硫酸二糖から成る分子および製剤学的に許容される 担体を含有する医薬組成物。 ５．前記分子はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである、請求項４の医薬組 成物。 ６．前記分子はコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項４の医 薬組成物。 ７．有効量のデルマタン硫酸二糖から成る分子および製剤学的に許容される担体 を含有する医薬組成物。 ８．前記分子はデルマタン硫酸プロテオグリカンである、請求項７の医薬組成物 。 ９．前記分子はデルマタン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項７の医薬組 成物。 １０．デルマタン硫酸はＣ−４硫黄結合を有する、請求項７の医薬組成物。 １１．コンドロイチン硫酸二糖、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン、お よびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンより成る群がら選ばれた化合物から成 る第二分子をさらに含む、請求項１、２または３の医薬組成物。 １２．デルマタン硫酸二糖、デルマタン硫酸グリコサミノグリカン、およびデル マタン硫酸プロテオグリカンより成る群から選ばれた化合物から成る第二分子を さらに含む、請求項１、２または３の医薬組成物。 １３．コンドロイチン硫酸はＣ−６硫黄結合を有する、請求項４の医薬組成物。 １４．ケラタン硫酸はＩ型（角膜由来）である、請求項１、２または３の医薬組 成物。 １５．ケラタン硫酸はＩＩ型（骨格由来）である、請求項１、２または３の医薬 組成物。 １６．有効量の、ケラタン硫酸二糖、ケラタン硫酸グリコサミノグリカンまたは ケラタン硫酸プロテオグリカンの成長抑制作用を相殺または破壊する分子、およ び製剤学的に許容される担体を含有する医薬組成物。 １７．有効量の、コンドロイチン硫酸二糖、コンドロイチン硫酸グリコサミノグ リカンまたはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの成長抑制作用を相殺または 破壊する分子、および製剤学的に許容される担体を含有する医薬組成物。 １８．有効量の、デルマタン硫酸二糖、デルマタン硫酸グリコサミノグリカン、 またはデルマタン硫酸プロテオグリカンの成長抑制作用を相殺または破壊する分 子、および製剤学的に許容される担体を含有する医薬組成物。 １９．有効量の、ケラタン硫酸に対する抗体、または結合ドメインを含むその断 片もしくは誘導体、および製剤学的に許容される担体を含有する医薬組成物。 ２０．有効量の、コンドロイチン硫酸に対する抗体、または結合ドメインを含む その断片もしくは誘導体、および製剤学的に許容される担体を含有する医薬組成 物。 ２１．有効量の、デルマタン硫酸に対する抗体、または結合ドメインを含むその 断片もしくは誘導体、および製剤学的に許容される担体を含有する医薬組成物。 ２２．前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１９の医薬組成物。 ２３．前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項２０の医薬組成物。 ２４．前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項２１の医薬組成物。 ２５．前記モノクローナル抗体はＭＺ１５、１／２０／５−Ｄ−４、４／８／１ −Ｂ−４、４−Ｄ−１、および８−Ｃ−２より成る群がら選ばれる、請求項２２ の医薬組成物。 ２６．有効量の、ケラタン硫酸を分解する酵素、および製剤学的に許容される担 体を含有する医薬組成物。 ２７．有効量の、コンドロイチン硫酸を分解する酵素、および製剤学的に許容さ れる担体を含有する医薬組成物。 ２８．有効量の、デルマタン硫酸を分解する酵素、および製剤学的に許容される 担体を含有する医薬組成物。 ２９．前記酵素はエンド−ｂ−ガラクトシダーゼおよびケラタナーゼより成る群 から選ばれる、請求項２６の医薬組成物。 ３０．前記酵素はコンドロイチナーゼおよびコンドロイチンＡＢＣリアーゼより 成る群から選ばれる、請求項２７の医薬組成物。 ３１．前記酵素はコンドロイチンＡＢＣリアーゼより成る群から選ばれる、請求 項２８の医薬組成物。 ３２．有効量の、コンドロイチン硫酸を分解する酵素をさらに含む、請求項２６ の医薬組成物。 ３３．有効量の、コンドロイチン硫酸を分解する酵素をさらに含む、請求項２９ の医薬組成物。 ３４．有効量の、デルマタン硫酸を分解する酵素をさらに含む、請求項２６の医 薬組成物。 ３５．有効量の、デルマタン硫酸を分解する酵素をさらに含む、請求項２９の医 薬組成物。 ３６．有効量の、デルマタン硫酸を分解する酵素をさらに含む、請求項３３の医 薬組成物。 ３７．神経成長の抑制を望む患者に、有効量の、ケラタン硫酸二糖から成る分子 を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ３８．神経膠細胞の移動または侵入の抑制を望む患者に、有効量の、ケラタン硫 酸二糖から成る分子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ３９．前記分子はケラタン硫酸プロテオグリカンである、請求項３７の方法。 ４０．前記分子はケラタン硫酸プロテオグリカンである、請求項３８の方法。 ４１．前記分子はケラタン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項３７の方法 。 ４２．前記分子はケラタン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項３８の方法 。 ４３．神経成長の抑制を望む患者に、有効量の、コンドロイチン硫酸二糖から成 る分子を投与することから成る、前記患者の治療方法４４．神経膠細胞の移動ま たは侵入の抑制を望む患者に、有効量の、コンドロイチン硫酸二糖から成る分子 を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ４５．前記分子はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである、請求項４３の方 法。 ４６．前記分子はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである、請求項４４の方 法。 ４７．前記分子はコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項４３ の方法。 ４８．前記分子はコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項４４ の方法。 ４９．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項３８、４０、４２、４４ 、４６、または４８の方法。 ５０．神経成長の抑制を望む患者に、有効量の、デルマタン硫酸二糖から成る分 子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ５１．神経膠細胞の移動または侵入の抑制を望む患者に、有効量の、デルマタン 硫酸二糖から成る分子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ５２．前記分子はデルマタン硫酸プロテオグリカンである、請求項５０の方法。 ５３．前記分子はデルマタン硫酸プロテオグリカンである、請求項５１の方法。 ５４．前記分子はデルマタン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項５０の方 法。 ５５．前記分子はデルマタン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項５１の方 法。 ５６．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項５１、５３、または５５ の方法。 ５７．前記患者は神経膠腫をもつ、請求項３７、３９、または４１の方法。 ５８．前記患者は神経組織の腫傷をもつ、請求項３７、３９、または４１の方法 。 ５９．前記腫瘍は神経芽細胞腫である、請求項５８の方法。 ６０．前記患者は神経腫をもつ、請求項３７、３９、または４１の方法。 ６１．コンドロイチン硫酸二糖、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンおよ びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンより成る群から選ばれた化合物から成る 、有効量の第二分子を前記患者に投与することをさらに含む、請求項３７、３９ 、または４１の方法。 ６２．デルマタン硫酸二糖、デルマタン硫酸グリコサミノグリカン、およびデル マタン硫酸プロテオグリカンより成る群から選ばれた化合物から成る、有効量の 第二分子を前記患者に投与することをさらに含む、請求項３７、３９、または４ １の方法。 ６３．コンドロイチン硫酸はＣ−６硫黄結合を有する、請求項６１の方法。 ６４．ケラタン硫酸はＩ型（角膜由来）である、請求項３７、３９、または４１ の方法。 ６５．ケラタン硫酸はＩＩ型（骨格由来）である、請求項３７、３９、または４ １の方法。 ６６．前記患者は神経膠腫をもつ、請求項５０、５２、または５４の方法。 ６７．前記患者は神経組織の腫瘍をもつ、請求項５０、５２、または５４の方法 。 ６８．前記腫瘍は神経芽細胞腫である、請求項６７の方法。 ６９．前記患者は神経腫をまつ、請求項５０、５２、または５４の方法．。 ７０、神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、ケラタ ン硫酸二糖、ケラタン硫酸グリコサミノグリカンまたはケラタン硫酸プロテオグ リカンの神経成長抑制作用を相殺または破壊する分子を投与することから成る、 前記患者の治療方法。 ７１．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進を 望む患者に、有効量の、ケラタン硫酸二糖、ケラタン硫酸グリコサミノグリカン またはケラタン硫酸プロテオグリカンの神経膠細胞移動または侵入抑制作用を相 殺または破壊する分子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ７２．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項７１の方法。 ７３．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、コンド ロイチン硫酸二糖、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンまたはコンドロイ チン硫酸プロテオグリカンの神経成長抑制作用を相殺または破壊する分子を投与 することから成る、前記患者の治療方法。 ７４．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進を 望む患者に、有効量の、コンドロイチン硫酸二糖、コンドロイチン硫酸グリコサ ミノグリカンまたはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの神経膠細胞移動また は侵入抑制作用を相殺または破壊する分子を投与することから成る、前記患者の 治療方法。 ７５．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項７４の方法。 ７６．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、デルマ タン硫酸二糖、デルマタン硫酸グリコサミノグリカンまたはデルマタン硫酸プロ テオグリカンの神経成長抑制作用を相殺または破壊する分子を投与することから 成る、前記患者の治療方法。 ７７．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進を 望む患者に、有効量の、デルマタン硫酸二糖、デルマタン硫酸グリコサミノグリ カンまたはデルマタン硫酸プロテオグリカンの神経膠細胞移動または侵入抑制作 用を相殺または破壊する分子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ７８．前記神経膠細胞はアスドロ神経膝である、請求項７７の方法。 ７９．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、ケラタ ン硫酸に対する抗体、または結合ドメインを含むその断片もしくは誘導体を投与 することから成る、前記患者の治療方法。 ８０．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進を 望む患者に、有効量の、ケラタン硫酸に対する抗体、または結合ドメインを含む その断片もしくは誘導体を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ８１．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項８０の方法。 ８２．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、コンド ロイチン硫酸に対する抗体、または結合ドメインを含むその断片もしくは誘導体 を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ８３．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進を 望む患者に、有効量の、コンドロイチン硫酸に対する抗体、または結合ドメイン を含むその断片もしくは誘導体を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ８４．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項８３の方法。 ８５．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、デルマ タン硫酸に対する抗体、または結合ドメインを含むその断片もしくは誘導体を投 与することから成る、前記患者の治療方法。 ８６．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進を 望む患者に、有効量の、デルマタン硫酸に対する抗体、または結合ドメインを含 むその断片もしくは誘導体を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ８７．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項８６の方法。 ８８．前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項７９、８０、または８１の 方法。 ８９．前記モノクローナル抗体はＭＺ１５、１／２０／５−Ｄ−４、４／８／１ −Ｂ−４、４−Ｄ−１、および８−Ｃ−２より成る群がら選ばれる、請求項８８ の方法。 ９０．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、ケラタ ン硫酸を分解する酵素を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ９１．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進を 望む患者に、有効量の、ケラタン硫酸を分解する酵素を投与することから成る、 前記患者の治療方法。 ９２．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項９１の方法。 ９３．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、コンド ロイチン硫酸を分解する酵素を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ９４．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膝細胞の移動もしくは侵入の促進を 望む患者に、有効量の、コンドロイチン硫酸を分解する酵素を投与することから 成る、前記患者の治療方法。 ９５．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項９４の方法。 ９６．神経膠傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、デルマ タン硫酸を分解する酵素を投与することから成る、前記患者の治療方法。 ９７．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進を 望む患者に、有効量の、デルマタン硫酸を分解する酵素を投与することから成る 、前記患者の治療方法。 ９８．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項９７の方法。 ９９．前記酵素はエンド−ｂ−ガラクトシダーゼおよびケラタナーゼより成る群 から選ばれる、請求項９０、９１、または９２の方法１００．前記酵素はコンド ロイチナーゼおよびコンドロイチンＡＢＣリアーゼより成る群から選ばれる、請 求項９３、９４、または９５の方法。 １０１．前記酵素はコンドロイチンＡＢＣリアーゼより成る群から選はれる、請 求項９６、９７、または９８の方法。 １０２．前記患者に、有効量の、コンドロイチン硫酸を分解する酵素を投与する ことをさらに含む、請求項９０、９１、または９２の方法。 １０３．前記患者に、有効量の、コンドロイチン硫酸を分解する酵素を投与する ことをさらに含む、請求項９９の方法。 １０４．前記患者に、有効量の、デルマタン硫酸を分解する酵素を投与すること をさらに含む、請求項９０、９１、または９２の方法。 １０５．前記患者に、有効量の、デルマタン硫酸を分解する酵素を投与すること をさらに含む、請求項９９の方法。 １０６．前記患者に、有効量の、デルマタン硫酸を分解する酵素を投与すること をさらに含む、請求項１０２の方法。 １０７．神経損傷は外傷、手術、虚血、感染、代謝異常、栄養欠損症、悪性疾患 、毒性物質への暴露、および神経系の変性疾患より成る群から選ばれた疾病また は障害が原因で起こる、請求項７０、７９、または９０の方法。 １０８．神経膠細胞の損傷は外傷、手術、虚血、感染、代謝異常、栄養欠損症、 悪性疾患、毒性物質への暴露、および変性疾患より成る群から選ばれた疾病また は障害が原因で起こる、請求項７１、８０、または９１の方法。 １０９．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項１０８の方法１１０． 神経損傷は外傷、手術、虚血、感染、代謝異常、栄養欠損症、悪性疾患、毒性物 質への暴露、および神経系の変性疾患より成る群から選ばれた疾病または障害が 原因で起こる、請求項７３、８２、または９３の方法。 １１１．神経膠細胞の損傷は外傷、手術、虚血、感染、代謝異常、栄養欠損症、 悪性疾患、毒性物質への暴露、および変性疾患より成る群から選ばれた疾病また は障害が原因で起こる、請求項７４、８３、または９４の方法。 １１２．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項１１１の方法１１３． 神経膠傷は外傷、手術、虚血、感染、代謝異常、栄養欠損症、悪性疾患、毒性物 質への暴露、および神経系の変性疾患より成る群から選ばれた疾病または障害が 原因で起こる、請求項７６、８５、または９６の方法。 １１４．神経膠細胞の損傷は外傷、手術、虚血、感染、代謝異常、栄養欠損症、 悪性疾患、毒性物質への暴露、および変性疾患より成る群から選ばれた疾病また は障害が原因で起こる、請求項７７、８６、または９７の方法。 １１５．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項１１４の方法１１６． 神経損傷はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンテントン舞踏病、筋萎縮性 側索硬化症、進行性核上性麻痺、および末梢神経障害より成る群から選ばれた神 経系の変性疾患が原因で起こる、請求項７０、７９、または９０の方法。 １１７．神経損傷はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンテントン舞踏病、 筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、および末梢神経障害より成る群から選 ばれた神経系の変性疾患が原因で起こる、請求項７３、８２、または９３の方法 。 １１８．神経損傷はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンテントン舞踏病、 筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、および末梢神経障害より成る群から選 ばれた神経系の変性疾患が原因で起こる、請求項７６、８５、または９６の方法 。 １１９．神経膠細胞の移動または侵入は外傷、手術、ウイルス感染、細菌感染、 代謝異常、悪性疾患、毒性物質への暴露、および過形成状況より成る群から選ば れた疾病または障害が原因で起こる、請求項３８、４０、または４２の方法。 １２０．神経膠細胞の移動または侵入は外傷、手術、ウイルス感染、細菌感染、 代謝異常、悪性疾患、毒性物質への暴露、および過形成状況より成る群から選ば れた疾病事たは障害が原因で起こる、請求項４４、４６、または４８の方法。 １２１．神経膠細胞の移動または侵入は外傷、手術、ウイルス感染、細菌感染、 代謝異常、悪性疾患、毒性物質への暴露、および過形成状況より成る群から選ば れた疾病または障害が原因で起こる、請求項５１、５３、または５５の方法。 １２２．器官または組織を、有効量の、ケラタン硫酸二糖、ケラタン硫酸プロテ オグリカンおよびケラタン硫酸グリコサミノグリカンより成る群から選ばれた分 子で覆うことから成る、神経膠細胞の侵入から器官または組織を保護する方法。 １２３．器官または組織を、有効量の、コンドロイチン硫酸二糖、コンドロイチ ン硫酸プロテオグリカンおよびコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンより成 る群から選ばれた分子で覆うことから成る、神経膠細胞の侵入から器官または組 織を保護する方法。 １２４．器官または組織を、有効量の、デルマタン硫酸二糖、デルマタン硫酸プ ロテオグリカンおよびデルマタン硫酸グリコサミノグリカンより成る群から選ば れた分子で覆うことから成る、神経膠細胞の侵入から器官または組織を保護する 方法。 １２５．前記器官または組織は脊髄神経節、視神経、および視神経交差より成る 群から選ばれる、請求項１２２、１２３、または１２４の方法。 １２６．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項１２２、１２３、また は１２４の方法。 １２７．前記神経膠細胞はアストロ神経膠である、請求項１２５の方法１２８． 有効量のヘパラン硫酸二糖から成る分子および製剤学的に許容される担体を含有 する医薬組成物。 １２９．前記分子はヘパラン硫酸プロテオグリカンである、請求項１２８の医薬 組成物。 １３０．前記分子はヘパラン硫酸グリコサミノグリカンである、請求項１２８の 医薬組成物。 １３１．有効量のヘパリン二糖から成る分子および製剤学的に許容される担体を 含有する医薬組成物。 １３２．前記分子はヘパリンプロテオグリカンである、請求項１３１の医薬組成 物。 １３３．前記分子はヘパリングリコサミノグリカンである、請求項１３１の医薬 組成物。 １３４．有効量のヒアルロン酸二糖から成る分子および製剤学的に許容される担 体を含有する医薬組成物。 １３５．前記分子はヒアルロン酸グリコサミノグリカンである、請求項１２６の 医薬組成物。 １３６．有効量の、ヘパラン硫酸二糖、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンまた はヘバラン硫酸プロテオグリカンの成長抑制作用を相殺または破壊する分子を含 有する医薬組成物。 １３７．有効量の、ヘパリン二糖、ヘパリングリコサミノグリカンまたはヘパリ ンプロテオグリカンの成長抑制作用を相殺または破壊する分子を含有する医薬組 成物。 １３８．有効量の、ヒアルロン酸二糖またはヒアルロン酸グリコサミノグリカン の成長抑制作用を相殺または破壊すあ分子を含有する医薬組成物。 １３９．神経成長の抑制を望む患者に、有効量の、ヘバヲン硫酸二糖、ヘペラン 硫酸プロテオグリカンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンより成る群から 選ばれた分子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 １４０．神経成長の抑制を望む患者に、有効量の、ヘパリン二糖、ヘペリンプロ テオグリカンまたはヘパリングリコサミノグリカンより成る群から選ばれた分子 を投与することから成る、前記患者の治療方法。 １４１．神経成長の抑制を望む患者に、有効量の、ヒアルロン酸二糖またはヒア ルロン酸グリコサミノグリカンより成る群から選ばれた分子を投与することから 成る、前記患者の治療方法。 １４２．神経膠細胞の移動または侵入の抑制を望む患者に、有効量の、ヘパラン 硫酸二糖、ヘパラン硫酸プロテオグリカンまたはヘパラン硫酸グリコサミノグリ カンより成る群から選ばれた分子を投与することから成る、前記患者の治療方法 。 １４３．神経膠細胞の移動または侵入の抑制を望む患者に、有効量の、ヘパリン 二糖、ヘパリンプロテオグリカンまたはヘパリングリコサミノグリカンより成る 群から選ばれた分子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 １４４．神経膠細胞の移動または侵入の抑制を望む患者に、有効量の、ヒアルロ ン酸二糖またはヒアルロン酸グリコサミノグリカンより成る群から選ばれた分子 を投与することから成る、前記患者の治療方法。 １４５．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、ヘパ ラン硫酸二糖、ヘパラン硫酸プロテオグリカンまたはヘバラン硫酸グリコサミノ グリカンの神経成長抑制作用を相殺または破壊する分子を投与することから成る 、前記患者の治療方法。 １４６．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、ヘパ リン二糖、ヘパリンプロテオグリカンまたはヘパリングリコサミノグリカンの神 経成長抑制作用を相殺または破壊する分子を投与することから成る、前記患者の 治療方法。 １４７．神経損傷があるかまたは神経成長の促進を望む患者に、有効量の、ヒア ルロン酸二糖またはヒアルロン酸グリコサミノグリカンの神経成長抑制作用を相 殺または破壊する分子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 １４８．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進 を望む患者に、有効量の、ヘバラン硫酸二糖、ヘパラン硫酸プロテオグリカンま たはヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの神経膠細胞移動または侵入抑制作用を 相殺または破壊する分子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 １４９．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進 を望む患者に、有効量の、ヘパリン二糖、ヘパリンプロテオグリカンまたはヘパ リングリコサミノグリカンの神経膠細胞移動または侵入抑制作用を相殺または破 壊する分子を投与することから成る、前記患者の治療方法。 １５０．神経膠細胞の損傷があるかまたは神経膠細胞の移動もしくは侵入の促進 を望む患者に、有効量の、ヒアルロン酸二糖またはヒアルロン酸グリコサミノグ リカンの神経膠細胞移動または侵入抑制作用を相殺または破壊する分子を投与す ることから成る、前記患者の治療方法。