WO2013033961A1

WO2013033961A1 - Prame、wt1双价肿瘤dna疫苗

Info

Publication number: WO2013033961A1
Application number: PCT/CN2011/084048
Authority: WO
Inventors: 朱义
Original assignee: 四川百利药业有限责任公司
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-03-14
Also published as: CN102973950B; CN102973950A

Abstract

本发明公开了PRAME和WT1的双价肿瘤DNA疫苗，该疫苗的核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1所示。所述疫苗通过增强机体针对PRAME和WT1抗原蛋白的特异性体液和细胞免疫反应，对PRAME和WT1抗原阳性肿瘤进行杀伤。

Description

PRAME、 WT1双价肿瘤 DNA疫苗

技术领域

本发明涉及 PRAME、 WT1双价肿瘤匪疫苗。

背景技术

手术、放疗和化疗是癌症治疗的三种常规手段，近年来，随着新型化疗药物的研发上市，手术与放疗技术的不断更新，肿瘤患者的长期存活率有所提高。然而，由于肿瘤的早期诊断技术还不尽完善，相当一部分实体瘤患者在手术时已有不同程度的转移。放疗和化疗虽然能在一定程度上预防扩散和转移，但仍有相当一部分患者不能免于复发。其次，现代科学证明肿瘤干细胞及循环肿瘤细胞是导致转移与复发的根源，而三大常规疗法对这两类肿瘤细胞作用很小。

肿瘤免疫学（ tumor Immunology )是利用免疫学的理论和方法，研究肿瘤的抗原性、机体的免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系，机体对肿瘤的免疫应答及其抗肿瘤免疫的机制、肿瘤的免疫诊断和免疫防治的科学。

肿瘤免疫学在过去的十多年有突飞猛进的进展。首先，现在已证明肿瘤患者存在对肿瘤的特异性免疫反应，手术、化疗、放疗所治愈的部分肿瘤患者，并不是因为这些手段能杀死全部肿瘤细胞，而是由于当肿瘤细胞负荷显著降低时，机体的免疫功能有所恢复，清除了微小残留病灶或抑制残留肿瘤细胞的增殖。其次，过继免疫疗法的临床实验证明，当患者被注入足够量的肿瘤特异的效应细胞（LAK或 TIL ) 时，不但能延长总存活期，在部分患者中并能观察到肿块缩小。结合这两方面的结果，治疗性肿瘤疫苗受到越来越多的关注。此类疫苗的作用机理是运用增强肿瘤特异性抗原的免疫原性的方法，诱发机体的抗肿瘤免疫应答，达到缩小和消除肿瘤的目的。目前在临床试验上用的肿瘤疫苗有多种形式，有细胞型（树突状细胞，灭活的肿瘤细胞）、细胞均浆型、合成生物大分子型（多肽、蛋白、 DNA/RNA ) , 及病毒载体型。其中， DNA疫苗具有多方面的优越性。第一，它能诱导产生具有长期免疫记忆的免疫应答。第二，棵露 DNA不含诱导产生抗体反应的抗原组份，而这些抗疫苗的抗体会削弱疫苗的效价。第三，生产与制备成本低，工艺筒单。尽管 DNA疫苗的优势明显，由于其在人体内的表达效率低等原因，以致临床效果不甚理想。发明内容

本发明的目的是提供 PRAME、 WT1双价肿瘤 DNA疫苗。该 DNA疫苗构思巧妙，在人体内的表达率高，适用人群广。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

PRAME、 WT1双价肿瘤 DNA疫苗，该疫苗的碱基序列如 SEQ ID NO: 1所示。所述碱基序列对应的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。

上述 PRAME、 WT1双价肿瘤 DNA疫苗在制备用于肿瘤治疗药物或疫苗中的用途。

所述肿瘤为 WT1阳性肿瘤和 /或 PRAME阳性肿瘤。

所述肿瘤包括：胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、肠癌、子宫内膜癌、宫颈癌、睾丸癌、曱状腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、乳腺癌、食道癌、胃癌、神经内分泌癌、肝癌、胆嚢癌、骨癌、软组织癌、食道癌、淋巴瘤等。

上述 PRAME、 WT1肿瘤 DNA疫苗可以通过下述主要步骤的方法得到：按照 SEQ ID NO: 1所示的核酸序列进行抗原基因合成，此序列包括：多段 PRAME和 WT1基因片段，片段连接序列， H ind I I I、 EcoR I限制性内切酶识别序列和 KozaK翻译起始序列。之后通过 Hindl l l和 EcoR I限制性内切酶将抗原基因和 pVAXl质粒分别进行剪切，使其暴露粘性末端。再用 DNA连接酶将抗原基因和 pVAXl质粒通过粘性末端相连，成为重组质粒。将重组质粒转染大肠杆菌，使其在大肠杆菌细胞中复制、扩增。经质粒的抽提和纯化，得到满足要求的 PRAME、 WT1双价肿瘤 DNA疫苗。

本发明选用多段 PRAME和 WT-1基因片段序列，并将这些片段以串珠方式连接，加上限制性内切酶和 Kozak翻译起始序列进行全基因合成，并连接到商品用载体 pVAXl ( Invi trogen ) 以完成疫苗构建。编码区同时连接至大肠杆菌表达质粒，用于少量制备蛋白多肽来作为评价疫苗效价的试剂。

本发明为了达到比较好的治疗效果，防止肿瘤因抗原流失而躱避免疫攻击，发明人经过多次反复试验设计了一个双价疫苗包括两种不同的肿瘤抗原， PRAME( Melanoma antigen preferentially expressed in tumors )^WT-1( Wilms tumor protein )。这两种抗原在癌细胞的增殖、转移及扩散中起不同的作用。 PRAME参与视黄酸受体相关的信号转导，被认为对肿瘤细胞的生长与抗凋亡的功能有关。而 WT-1则被认为是一个转录因子，参与肿瘤细胞的多种生物功能。这两种抗原在胰腺癌标本中的表达率都比较高（ > 75% ), 除之以外，它们在其他实体瘤与血液癌中的表达率也相当高。

本发明将肿瘤相关抗原 PRAME和 WT1部分片段基因序列及其他相关序列重组，并构建到真核表达 DNA质粒载体中，以该质粒为主要成分制成注射剂药物，用于治疗多种恶性肿瘤。其原理为：该疫苗在被注射进入人体后，可进入人体细胞并表达重组抗原蛋白，进而激发人体针对 PRAME和 WT1抗原的特异性免疫反应。所产生的特异性体液和细胞免疫将杀灭 PRAME和 WT1抗原阳性肿瘤，达到癌症治疗目的。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明肿瘤 DNA疫苗构思巧妙，在人体内的表达率高，适用人群广。通过增强机体针对 PRAME和 WT1抗原蛋白的特异性体液和细胞免疫反应，对 PRAME 和 WT1抗原阳性肿瘤进行杀伤，从而达到治疗多种癌症目的。由于 PRAME和 WT1 在多种癌症的肿瘤细胞中有特异性高量表达，而在人体正常细胞中不表达，所以该 DNA肿瘤疫苗将能够用于治疗多种癌症。附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：图 1是本发明实施例 1体液免疫效价评价结果图；图 2是本发明实施例 1细胞免疫效价评价结果图；图 3是本发明实施例 1免疫细胞杀伤肿瘤细胞的效价评价结果图；图 4是本发明实施例 1体内肿瘤细胞杀伤实验评价结果图。具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和 I或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例 1 : 免疫转基因小鼠检测特异免疫反应强度和抗肿瘤细胞效果实验实验方案如下：

1、受试动物：

1 0-12周龄 HLA-A2. 1转基因雌性小鼠。 2、受试动物分组：

HLA-A2.1转基因小鼠随机分为两个大组，每个大组分为三个小组，每小组分别标为

1 ) 1-1：动物体外实验实验组

2) 1-2：动物体外实验对照组

3) 1-3: 动物体外实验观察组

4) 2-1: 动物体内实验实验组

5 ) 2-2: 动物体内实马全对照组

6 ) 2-3: 动物体内实验观察组

每小组各 15只转基因小鼠，共 90只。

3、淋巴结免疫注射（观察组不注射）：

方法： 1 )稀释质粒：分别取 2mg重组质粒和空质粒（ pVAXl ), 用 PBS緩沖液稀释到 0. ½g/mL, 以备后续实验使用。

2)麻醉动物：使用异氟烷气管吸入麻醉。

3 )进行淋巴结免疫注射前，分别在 1-1和 1-2组小鼠眼眶静脉丛取血 0. lmL, 作为后续 ELISA实验的阴性对照。

4)淋巴结注射：实验组和对照组在无菌条件下暴露腹股沟淋巴结，用微注射器注射受试物质粒到淋巴结内，共注射 4次，时间分别为第 1、 4、 15和 18天。对每组动物注射方式如下：

实险组： 1-1, 2_1 (注射 25uL, 0.4mg/mL重组质粒）

对照组： 1-2, 2-2 (注射 25uL, 0.4mg/mL空质粒 )

观察组： 1-3, 2-3 (不注射）

4、免疫应答评价：在第 28天分别处死 1-1 , 1-2和 1-3组小鼠并采其外周血和脾脏细胞，进行免疫应答的评价。

1) 体液免疫效价评价：

评价目的与方法： ELISA法。评价目的是测定外周血中是否有特异抗体产生及抗体的效价。方法是用 0. 05M PH9. 6碳酸盐包被緩沖液将目标抗原蛋白稀释至蛋白质含量为 5 g/ml , 酶标板每孔加入 l OOul置于 4 °C过夜；用 0. 15M PH7. 4 PBS清洗后，加入 200ul 1% BSA/PBS在室温下与酶标板非特异性结合 60min以封闭酶标板，清洗后加入 l OOul稀释后的外周血清与抗原在室温下孵育结合 60min, 清洗未结合抗体后，加入 l OOul适当浓度的的抗小鼠二抗酶联抗体室温下孵育 60min, 清洗后加入 l OOul适当浓度的底物在室温下标记显色 30min, 测量 0D值，用血清稀释滴度表述抗体产生密度。

实验结果：如图 1所示， 1-1 (实验组）显色度远远高于 1-2组（对照组）及 1-3组（观察组），表明实验组小鼠血清中抗体含量远远高于对照组和观察组，证明 PRAME、 WT1双价 DNA疫苗能够激发转基因小鼠的特异性体液免疫反应。

2) 细胞免疫效价评价：

评价目的与方法：

a. ELISP0T实验。

目的是评价是否有特异性 CTL (细胞毒 T淋巴细胞）产生。方法如下：将脾从处死的动物分离，在密度梯度离心后分离得到单核细胞，并将其重悬在 HL-1培养基中备用。酶标版每孔加 l OOul稀释后的小鼠抗 IFN- γ的抗体在 4 °C包被过夜，清洗后加入 200ul 封闭液，室温孵育 2h;将小鼠脾细胞（每孔 4X10⁵个）和 l OuL 100ug/ml的目标抗原蛋白在 37 °C , 5%C0₂和 100%湿度下与酶标板孵育结合 36h,使针对目标抗原的特异性 T细胞产生的 IFN- γ被抗体固定于酶标板上；清洗细胞后，加入 l O Oul稀释后的小鼠抗 IFN- γ的检测抗体在室温下共孵育 2h , 再加入底物显色 30min; 将酶标板避光干燥 2h , 通过 ELI SP0T酶联斑点分析系统对斑点进行分析检测免疫动物中的 CTL应答；

实验结果：如图 2所示，用 1-1组（实验组）脾细胞得到的斑点数远远高于

1-2组（对照组）及 1-3组（观察组 ), 表明实验组小鼠体内产生了大量的针对 PRAME、 WT1的 CTL , 而对照组及观察组小鼠体内几乎没有产生了针对 PRAME、 WT1的 CTL。

b. 免疫细胞杀伤肿瘤细胞的效价。方法如下：

取免疫小鼠的脾脏细胞（2X10⁶个 /孔）与 PRAME/WT1抗原阳性、 HLA-A2. 1白细胞表型的肿瘤细胞（10⁵个/孔）在 37 °C , 5%C02和 100%湿度下共孵育 4h, 离心后加入底物共孵育 30min, 用 LDH法评价其杀伤肿瘤细胞的效果。

实验结果：如图 3所示， 1-1组（实验组）显色度远远高于 1-2组（对照组）及 1-3组（观察组），表明实验组小鼠体内产生了大量的针对 PRAME、 WT1 的 CTL , 而对照组及观察组小鼠体内几乎没有产生了针对 PRAME、 WT1的 CTL。 5. 体内肿瘤细胞杀伤实验：

淋巴节注射免疫后（第 28天），对 2-1 , 2-2组的转基因小鼠尾静脉注射等细胞数量（ 1 0⁷个）的 5uM CFSE标记的 PRAME、 WT1抗原阳性、 HLA-A2. 1白细胞表型的肿瘤细胞和 0. 5uM抗原阴性、 HLA-A2. 1白细胞表型的肿瘤细胞， 18 小时后取外周血用流式细胞仪（ FACS )检测经标记的两种细胞的含量。

实马全结果：如图 4所示， 2-1组中，用 5uM CFSE标记的 PRAME/WT1抗原阳性、 HLA-A2. 1白细胞表型的肿瘤细胞量远远低于用 0. 5uM抗原阴性、 HLA-A2. 1 白细胞表型的肿瘤细胞。而 2-2组中两种细胞含量几乎相同。结果表明 2-1组小鼠体内产生了大量的针对 PRAME/WT1抗原阳性、 HLA-A2. 1白细胞表型的 CTL。实施例 2 : 人外周血实验检测特异免疫反应强度和抗肿瘤细胞效果实验实验目的是在体外模拟人体内抗原表达递呈、免疫应答以及对肿瘤细胞的杀伤效果。

通过 F i co l l浓度梯度离心的方法从白细胞表型为 HLA-A2. 1的人外周血中分离外周血单个核细胞（PBMCs)。从 PBMCs中通过 CD14+磁珠分离得到树突状细胞（ DCs ); 通过 CD8+磁珠分离得到 CTL。将 DCs与一定量的重组质粒共孵育一定时间后，再将 DCs与 CTL共孵育一段时间，进行 ELI SP0T实验以检测特异性 CTL产生情况及效价，同时检测体外肿瘤细胞杀伤效价。

具体方法: ¾口下：

1. 用 I FN- γ的抗体包被酶标版，用 CTL和抗原蛋白与酶标板孵育结合，抗原特异 CTL产生的 IFN- γ被其抗体固定于酶标板上，清洗细胞后，用抗人 I FN- γ的抗体进行标记显色，通过 EL I SPOT酶联斑点分析系统对斑点进行分析得出结果；

实验结果：实验组有大量的酶联斑点出现，而用培养基与抗原共孵育的对照组没有酶联斑点出现，表明产生了针对 PRAME、 WT1的 CTL。

2. 免疫细胞杀伤肿瘤细胞实验：将 CTL与 PRAME、 WT1抗原阳性、 HLA-A2. 1 白细胞表型的肿瘤细胞共孵育，用 LDH法评价其杀伤肿瘤细胞的效果。

实验结果：实验组显色度远远高于对照组，表面产生了大量的针对 PRAME/WT1的 CTL。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims

1、 PRAME、 WTl双价肿瘤 DNA疫苗，其特征在于该疫苗的碱基序列如 SEQ ID NO: 1所示。

2、根据权利要求 1所述的 PRAME、 WTl双价肿瘤 DNA疫苗，其特征在于：所述碱基序列对应的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。

3、权利要求 1所述的 PRAME、 WTl双价肿瘤 DNA疫苗在制备用于肿瘤治疗药物或疫苗中的用途。

4、根据权利要求 3所述的 PRAME、 WTl双价肿瘤 DNA疫苗在制备用于肿瘤治疗药物或疫苗中的用途，其特征在于：所述肿瘤为 WT1阳性肿瘤。

5、根据权利要求 3所述的 PRAME、 WTl双价肿瘤 DNA疫苗在制备用于肿瘤治疗药物或疫苗中的用途，其特征在于：所述肿瘤为 PRAME阳性肿瘤。