WO2013025064A2 - Ｗｎｔ 유인 수용체를 포함하는 항암 조성물 - Google Patents

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WO2013025064A2
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Yun Chae Ok
Lee Jung-Sun
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Definitions

  • the present invention relates to a cancer cancer composition that inhibits the activation of Wnt signaling involved in the development of tumors using the Wnt attractant receptor.
  • Lung cancer is a cancer with a poor prognosis and the most common cause of cancer-related deaths worldwide.
  • Standard therapies such as surgical procedures and radiation therapy, are ineffective in many cases (1), but new and promising new therapies are being developed with increasing understanding of the molecular mechanisms of lung cancer (2).
  • chemoresistance remains the main cause of treatment failure (3).
  • EGFRCepithelial growth factor receptor is one of the causes of lung adenocarcinomas and confers strong resistance to these tumors, gefitinib or erlotinib, EGFR tyrosine kinase inhibitors (4, 5).
  • Many invasive lung cancers show a variety of other cancer-related genes in lung adenocarcinoma by showing modifications in various cancer-related genes, including Wnt, K-ras, extracellular signal-regulated kinase (ERK), Akt, and cyclooxygenase-2. It suggests that molecular mechanisms work (6-8).
  • Wnt-1 The role of Wnt signaling in cancer was first reported more than 20 years ago as Wnt-1 was discovered as an integration site for mouse mammalian tumor virus (9). Many studies have reported that changes in the expression of Wnt ligands, receptors and extracellular antagonists are associated with cancer initiation / progression and stem cell self-renewal / differentiation (10). Expression of Wnt ligand, low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5), and LRP6 in lung cancer Wnt antagonists that inhibit the interaction with receptors by inhibiting Wnt ligands (for example, Wnt inhibitory factor-1 (WIF-1), secreted Frizzled-related proteins (sFRP), and dickkopf proteins (DKK)). Expression is reduced or inactivated (11, 12). Thus overexpression of monoclonal antibodies and siRNA and Wnt antagonists against Wnt reduces tumor growth in various in vitro and in vivo tumor models.
  • WIF-1 Wnt inhibitory factor-1
  • LRP6 a member of the LRP superfamily, is required for the activation of general Wnt signaling mechanisms that lead to the stabilization and migration of the key functional molecule ⁇ -catenin (13). Binding to Wnt requires LRP6 consisting of four separate YWTD ⁇ -propeller / EGF-like domains to pair the first and second domains (E1 and ⁇ 2) (14-16).
  • SLRP6E1E2 a novel water soluble Wnt receptor consisting of the E1 and ⁇ 2 sites of LRP6.
  • the present inventors have made diligent research efforts to develop a gene anticancer therapeutic composition in which antitumor activity is maximized by efficiently inhibiting tumor development and growth.
  • the new water-soluble Wnt receptor SLRP6E1E2 inhibits the growth, proliferation and metastasis of cancer cells and induces the death of cancer cells by binding to the Wnt 3a protein to inhibit Wnt signaling mechanisms in cancer.
  • the invention was completed.
  • an object of the present invention to provide a composition for preventing or treating cancer have.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating cancer, comprising a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a composition comprising a pharmaceutically effective amount of a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 do.
  • the present inventors have made diligent research efforts to develop a gene anticancer therapeutic composition in which antitumor activity is maximized by efficiently inhibiting tumor development and growth.
  • SLRP6E1E2 a new water-soluble Wnt receptor, inhibits the growth, proliferation and metastasis of cancer cells and induces cancer cell death by inhibiting Wnt signaling mechanism in cancer through binding to Wnt 3a protein.
  • polypeptide refers to a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by peptide bonds.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of SLRP6E1E2, a new water soluble Wnt receptor composed of the E1 and E2 sites of LRP6.
  • SLRP6E1E2 inhibits the activation of Wnt signaling, which plays an important role in the development, growth, proliferation and metastasis of cancer by binding to Wnt ligand and blocking ligand-receptor interaction.
  • the water-soluble Wnt receptor of the present invention reduces cytoplasmic ⁇ -catenin levels and TCF transcriptional activity, inhibits cancer cell proliferation, induces apoptosis of cancer cells, tumor growth Of ⁇ ⁇ -2 and ⁇ ⁇ — which play important roles in angiogenesis, tumor growth and metastasis. Reduces the amount of expression and reduces the permeability of tumor cells. Therefore, the composition of the present invention can be used as an effective anticancer composition that effectively inhibits the progression of cancer.
  • SLRP6E1E2 of the present invention is also interpreted to include an amino acid sequence showing a substantial identity (substantial identity) with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 sequence.
  • the substantial identity is at least 80% when the amino acid sequence of the present invention and any other sequence are aligned as best as possible and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • amino acid sequence more preferably at least 90% homology, most preferably at least 95% homology.
  • the SLRP6E1E2 used in the present invention includes not only proteins having a natural amino acid sequence thereof, but also amino acid sequence variants thereof are also included in the scope of the present invention.
  • a variant of the SLRP6E1E2 protein refers to a protein in which the natural amino acid sequence of the SLRP6E1E2 protein and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • Amino acid exchange in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole is known in the art (H. Neuroath, RL Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.
  • the S LRP6E1E2 protein may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylication, glycosylat ion, methylation, or farnesylation.
  • the SL P6E1E2 protein or variant thereof can be extracted from nature or synthesized (Merri field, J. Amer. Chem. Soc .. 85: 2149-2156, 1963) or prepared by recombinant methods based on DNA sequences ( Sambrook, J. et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (2001).
  • the present invention provides a composition for preventing or treating cancer, which comprises a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a composition comprising a pharmaceutically effective amount of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to provide.
  • the nucleotide sequence of the present invention has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the nucleotide sequence of SLRP6E1E2 consisting of the E1 and E2 extracellular domains (Wnt binding sites) of LRP6.
  • nucleotide sequence used in the present invention is not limited to the nucleotide sequence described in the attached sequence listing.
  • nucleic acids include functionally equivalent codons or codons encoding the same amino acids (eg, by codon degeneracy, six codons for arginine or serine), or codons encoding biologically equivalent amino acids. And nucleic acid molecules.
  • nucleic acid molecules used in the present invention are also interpreted to include sequences that exhibit substantial identity with the sequences listed in the Sequence Listing.
  • the above substantial identity is at least 6 phases when the sequence of the present invention and any other sequence are aligned as best as possible and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • homology more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, most preferably 90% homology.
  • BLAST NCBI Basic Local Alignment Search Tool
  • NBC I National Center for Biological Information
  • blastp blasm and sequencing programs
  • blastx blastx
  • tblastn tblastx
  • BLSAT is http: //www.ncbi. Accessible at nlm.nih.gov/BLAST/. Sequence homology comparisons using this program can be found at http://ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the nucleotide sequence of the present invention is included in a gene delivery system.
  • gene transporter includes all mediators used to deliver a foreign gene to a host cell or the like and ultimately express the delivered gene using a host cell gene expression system.
  • the gene carrier of the present invention is a plasmid, recombinant adenovirus, Adeno-associated viruses (AAV), retrovirus, lentivirus, herpes simplex virus, Mizzles virus, Pox virus, Samkyree forester virus, vaccinia virus, polymer, nanomaterial, liposome or niosome.
  • AAV Adeno-associated viruses
  • the nucleotide sequence to be delivered in the present invention can be applied to all gene carriers used in conventional gene therapy, preferably plasmid, adenovirus (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3: 2075-2080 ( 1997), adeno-associated virus (Lashford LS., Et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed.A. Meager (1999)), retrovirus (Gunzburg WH, et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed.A. Meager, (1999)), Lentiviruses (Wang G. et al., J. Clin. Invest.
  • the gene carrier of the present invention is prepared by applying to recombinant adenovirus. i, adenovirus
  • Adenoviruses are widely used as gene transfer vectors due to their medium genome size, ease of manipulation, high titers, wide range of target cells and excellent infectivity. Both ends of the genome contain 100-200 bp of Inverted Terminal Repeat (ITR), which is an essential cis element for DNA replication and packaging.
  • ITR Inverted Terminal Repeat
  • the genome El regions (E1A and E1B) encode proteins that regulate transcription and transcription of host cell genes, while the E2 regions (E2A and E2B) encode proteins that are involved in viral DNA replication.
  • non-replicating adenoviruses lacking the E1 region are widely used.
  • the E3 region is removed from conventional adenovirus vectors to provide a site for insertion of foreign genes (Thi ⁇ appaya, B. et al., Cell, 31: 543-551 (1982); and Riordan, JR et al. , Science, 245: 1066-1073 (1989).
  • the nucleotide sequence of the present invention can be inserted at the promoter sequence position of the E1A gene to regulate the expression of the E1A gene.
  • the term "deletion" as used in connection with a viral genome sequence indicates that the sequence is not only completely deleted, but also partially deleted. It has a meaning to include.
  • the recombinant adenovirus vector of the present invention is one in which the E1B and E3 regions are deleted, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention is inserted into the E1B or E3 region.
  • adenovirus can pack up to about 105% of the wild-type genome, approximately 2 kb can be additionally packaged (Ghosh-Choudhury et al., ⁇ J., 6: 1733-1739 (1987)).
  • the above-described foreign sequence inserted into the adenovirus may additionally bind to the genome of the adenovirus.
  • Retrovirus Foreign genes carried by adenoviruses replicate in the same way as episomes, and have very low genetic toxicity to host cells. Therefore, gene therapy using the adenovirus gene delivery system of the present invention is considered to be very safe. ⁇ . Retrovirus
  • Retroviruses are widely used as gene transfer vectors because they insert their genes into the host genome, carry large amounts of foreign genetic material, and have a broad spectrum of cells that can infect them.
  • the target nucleotide sequence to be transported is inserted into the retrovirus genome instead of the sequence of the retrovirus to produce a nonreplicating virus.
  • a packaging cell line containing gag, pol and env genes but no LTRGong terminal repeat) and ⁇ sequences is constructed (Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983)).
  • RNA transcripts of the recombinant plasmids which are packaged into a virus and the virus is Discharged to the medium
  • Nicolas and Rubinstein “Retroviral vectors," In: Vectors '
  • the medium containing the recombinant retrovirus is collected, concentrated and used as a gene delivery system.
  • Adeno-associated virus is suitable as the gene delivery system of the present invention because it can infect non-dividing cells and has the ability to infect various kinds of ' cells. Details of the manufacture and use of AAV vectors are disclosed in detail in US Pat. Nos. 5,139,941 and 4,797,368. Studies on MV as a gene delivery system are described in LaFace et al, Viology, 162: 483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21: 928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94: 1440-1448 (1994) and Flotte et al., Gene Therapy, 2: 29-37 (1995). Recently, MV vectors have been conducting clinical I as a treatment for cystic fibrosis.
  • the AAV virus is a plasmid comprising the gene sequence of interest (relaxin gene and the target nucleotide sequence to be transported) with two MV terminal repeats located next to it (McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963 -1973 (1988); and Samulski et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989) and expression plasmids (McCarty et al., J. Virol.) Comprising wild type MV coding sequences without terminal repeats. , 65: 2936-2945 (1991), by cotransfection IV.
  • poxviruses GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8 (2) : 97-120 (2008), vectors derived from Rio virus, Mizzles virus, and Samkyree forester virus can also be used as a delivery system capable of intracellularly delivering a desired nucleotide sequence.
  • Polymeric carriers widely used as non-viral gene carriers include PEG, PEI, PLL, gelatin chitosan (Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres.Int J Pharm 148: 231-240) 1997)) PLL (poly-LLysine) (Maruyama A, Is ihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T. Nanopart icle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D, Llact ide).
  • Liposomes are automatically formed by phospholipids dispersed in the aqueous phase. Examples of successfully delivering foreign DNA molecules into liposomes into cells include Nicolau and Sene® Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982) and Nicolau et al. , Methods Enzymol., 149: 15 he 176 (1987). Meanwhile, LipofectamineCGibco BRL) is the most widely used reagent for the transformation of animal cells using liposomeol.
  • Liposomes containing the target nucleotide sequence to be transported carry the target nucleotide sequence to be transported into the cell by interacting with the cell through mechanisms such as endocytosis, adsorption to the cell surface, or fusion with a plasma cell membrane.
  • niosomes are bilayer transporters consisting of a combination of a non-ionic surfactant and cholesterol, which can contain polar and nonpolar materials.
  • liposomes which are carriers of lipid fine particles by osmotically active phospholipids, etc., they are stable, and the surfactants used in the manufacture do not require special conditions for storage and handling.
  • the method of introducing the gene delivery system of the present invention described above may be carried out through various methods known in the art.
  • the gene delivery system when the gene delivery system is built on the basis of the viral vector, it is performed according to a virus infection method known in the art. Infection of host cells with viral vectors is described in the above cited references.
  • the gene delivery system is a naked recombinant DNA molecule or plasmid
  • the micro-injection method Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980); and Harland and Weintraub, J. Cell Biol. 101: 1094 1099 (1985)
  • calcium phosphate precipitation Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973); and Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987)
  • electric Perforation Nemann, E. et al., EMB0 J., 1: 841 (1982); and Tur-Kaspa et al., Mol.
  • the composition of the present invention inhibits the activation of the Wnt signaling mechanism in cancer cells.
  • the composition of the present invention inhibits the activation of the Wnt signaling mechanism in cancer cells by binding a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to the Wnt 3a protein.
  • the levels of Wnt 3a and LPR6 proteins in SLRP6E1E2-transduced cells were lower than in the control group, which effectively binds the LPR6 E1-E2 domains of SLRP6E1E2 to Wnt 3a, resulting in ' tumor progression. It means that the involved Wnt signaling is suppressed.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for various diseases or diseases related to tumors, such as gastric cancer, lung cancer, breast cancer and ovarian cancer.
  • diseases or diseases related to tumors such as gastric cancer, lung cancer, breast cancer and ovarian cancer.
  • the cancer treated with the composition of the present invention is lung cancer.
  • treatment refers to (i) prevention of tumor cell formation; (ii) inhibiting a disease or condition associated with the tumor following removal of the tumor cells; And (iii) alleviation of a disease or disorder associated with a tumor following removal of tumor cells.
  • compositions of the present invention are conventionally used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, mantle, starch, acacia rubber, phosphate chamomile, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, DMS0, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydric benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Including, but not limited to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral administration, for example Administration may be by intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or topical administration.
  • Intraperitoneal administration in ovarian cancer and in the portal vein in liver cancer can be administered by infusion method, in the case of breast cancer can be directly injected into the tumor mass, in the case of colon cancer by direct injection into the enema
  • In the case of bladder cancer can be administered by direct injection into the catheter.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be determined by factors such as formulation method, mode of administration, age of patient, weight, sex, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response. Various, usually skilled, physicians can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention comprise 1 ⁇ 10 5 -1 ⁇ 10 15 pfu / n ⁇ of recombinant adenovirus, and typically 1 ⁇ 10 10 pfu is injected once every two weeks.
  • compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated using pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • compositions of the present invention may be used as a single therapy, but may also be used in combination with other conventional chemotherapy, cell therapy, or radiation therapy, and such combination therapy may be used to more effectively treat cancer.
  • Chemotherapeutic agents that may be used with the compositions of the present invention include cisplatin, carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclophosphamide, Ifosf amide, melphalan, chlorambuci 1, bisulfan, nitrosourea, diactinomycin, daunorubicin, doxorubicin (doxorubicin) doxorubicin), bleomycin, picomycin, Mitomycin, etoposide, t amo if en, taxol, transplatinum, 5-fluorouracil, vincristin ), Vinblastin, methotrexate, and the like.
  • Radiation therapy that can be used with the composition of the present invention is X-ray irradiation, ray irradiation and the like.
  • Cytopathic therapies that can be used with the compositions of the present invention are dendritic cells, natural killer cells, Tumor Infiltrating Lymphocytes, and Cytotoxic T Lymphocytes. ⁇ Effects of the Invention ⁇
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of cancer comprising the Wnt attractant receptor as an active ingredient.
  • composition of the present invention or expression product thereof is useful as an effective anticancer composition by binding to Wnt ligand and blocking ligand-receptor interaction to inhibit the occurrence, growth, proliferation and metastasis of cancer and induce death of cancer cells.
  • Wnt ligand and blocking ligand-receptor interaction to inhibit the occurrence, growth, proliferation and metastasis of cancer and induce death of cancer cells.
  • La is a diagram showing a schematic diagram of the gene structure of the adenovirus vector used in the present invention.
  • Lb shows the intrinsic expression of Wnt3a in some human lung cancer cell lines.
  • Figure lc is a figure showing the expression and secretion of SLRP6E1E2. Supernatants of cell cultures were examined using FLAG- or L P6-specific antibodies.
  • Figure ID shows H322 and H460 cells transformed with dEl-k35 / LacZ or dEl-k35 / sLRP6ElE2 (50 M0I) for 48 hours, and the cell debris was transformed into Wnt 3a (IP: Wnt 3a) or LRP6 (IP: LRP6).
  • FIG. 2 shows that the attractant Wnt receptor SLRP6E1E2 decreases cytoplasmic ⁇ -catenin and ⁇ -cell factor transcriptional activity.
  • 2A is a diagram showing the results of TCF / LEF luciferase reporter analysis in A549 cells (dEl-k35 / LacZ- Compared to transformed or PBS-treated cells) .05).
  • FIG. 2B shows TCF / LEF luciferase reporter assay results in H460 and H322 cells (*: 0.05 compared to PBS-treated or dEl-k35 / LacZ_ transformed cells with or without Wnt3a).
  • Figure 2c is a diagram showing the results observed after transforming H322 cells with or without Wnt3a with dEl-k35 / LacZ or dEl-k35 / sLRP6ElE2 (50 M0I) and labeled with anti- ⁇ -catenin (magnification) ⁇ 630).
  • FIG. 3 is a diagram showing that the induced Wnt receptor SLRP6E1E2 inhibits the proliferation of human lung cancer cells.
  • A549 cells were treated as in FIG.
  • FIG. 3A Western blotting was performed using antibodies specific for Dvl2, Axin, Cyclin D1 or GSK-3 (FIG. 3B).
  • H460 cells were treated as in FIG. 3A (Western blotting for 50 MOD, MEK, ERK, Survivin, mTOR, PI3K and Akt.
  • FIG. 4 is a diagram showing that the induced Wnt receptor SLRP6E1E2 induces apoptosis of human lung cancer cells.
  • the cells were transformed with dEl-k35 / LacZ or dEl-k35 / sLRP6ElE2 (20 MOD, photographed 72 hours later). Photographs were taken (magnification ⁇ 200) (FIG. 4A).
  • SLRP6E1E2-induced apoptosis was also detected using TUNEL staining (magnification ⁇ 400) (FIG. 4B).
  • FIG. 4C shows the total number of TUNEL-positive cells per field.
  • FIG. 4e is processed as the H460 cells and FIG. 4d and cytoplasm and some micro Figure shows the results of analyzing the intracellular location of cytochrome C by Western blotting of the fractions.
  • FIG. 4F is a diagram showing the results of A549 cells treated as shown in FIG. 4D, stained with anti-cytochrome c antibody (green) and MitoTracker (red), and observed with a laser fluorescence confocal microscope (magnification xl260). .
  • FIG. 5A shows PBS (vi) in tumors on Days 1, 3 and 5;
  • FIG. 5b is a diagram showing the results of immunostaining for E1A or FLAG tumor cut section of each group (magnification x40 and xlOO).
  • 5C is a diagram showing the results of staining tumor groups of each group with DAPI (blue), anti-Ki67 (red), and TdT-mediated TUNEL (green) (magnification xlOO).
  • FIG. 5d is a diagram showing the results of observing blood vessels through staining for CD31 (magnification xlOO).
  • FIG. 5F shows the result of staining cells with DAPI (blue), anti-Wnt3a (red) or anti- ⁇ -catenin (green) (magnification xlOO).
  • FIG. 6 shows the disruption of intercellular junctions and epithelial-mesenchymal metastases in tumor cells by Wnt3a treatment.
  • FIG. 6A is a diagram showing the results of observing the change in morphology of the H322 cells with Wnt3a (100 ng / ml) for a specified time period under an optical microscope (magnification ⁇ 200).
  • 6b is a diagram showing the results of measuring E-cadherin, vimentin and ⁇ -catenin mRNA levels after treatment with Wnt3a in H322 cells.
  • 6C shows DAPI (blue), TRITC-labeled after incubation of H322 cells for 24 hours with or without Wnt3a (100 ng / ml).
  • Figure shows the staining with paloidine (red) or anti-E-cadherin (green) (magnification x630).
  • FIG. 7 shows that the attractant Wnt receptor SLRP6E1E2 inhibits the migration and infiltration of cancer cells and regulates the expression of epithelial-mesenchymal metastasis (EMT) markers and MMPs.
  • 7A is a diagram showing the results of quantitative analysis of A549 lung cancer cell migration. The experiment was repeated three times and the results were expressed as mean standard error, * .05 PBS or dEl-k35 / LacZ treatment control; ** /) .001 PBS or dEl-k35 / LacZ with Wnt3a
  • FIG. 7B shows the results of quantifying tumor cell infiltration by the number of cells present per each filter in five fields. The experiment was repeated three times and the results were expressed as mean standard error.
  • FIG. 7c shows the results of measuring the expression of EMT markers in H322 cells 24 hours after treatment with PBS, dEl-k35 / LacZ or dEl-k35 / sLRP6ElE2 in the presence or absence of Wnt3a (100 ng / ml) The cells were stained with DAPI (blue), TRITC-labeled paloidine (red) or anti-E-cadherin (green) (magnification ⁇ 630), FIG. 7d shows that A549 cells were treated as shown in FIG. 3a.
  • Figure shows the results of measuring MMP-2 and MMP-9 mRNA levels using semiquantitative RT-PCR. [Specific contents to carry out invention]
  • MAPK kinase MEKl / 2 p44 / 42 mitogen-activated protein kinase (MAPK Erkl / 2), mTOR, polyclonal antibodies against phosphat idyl inositol 3-kinase (PI3K) and Akt and nt3a, Dvl2, Axin, glycogen synthase Monoclonal antibodies against kinase (GSI (3-P), PARPCpoly (ADP-ribose) polymerase) and cleavage caspase-3 were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, Mass.).
  • Antibodies to epithelial-mesenchymal metastasis (EMT) related molecules ⁇ -catenin and E-cadherin were purchased from Cell Signaling Technology.
  • Antibodies and protein A / G agarose beads against cyclin DUH-295), cytochrome c (C-20 for Western blotting analysis) and LRP6CC-10) were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).
  • Monoclonal antibodies against caspases were purchased from StressGen Biotechnologies (Victoria, BC).
  • Polyclonal antibodies against cytochrome c (6H2.B4 for immunohistochemical analysis) were purchased from BD Pharmingen (San Diego, CA).
  • Alexa Fluor 488-conjugated and Alexa Fluor 568-conjugated anti-rabbit IgG antibodies were purchased from Invitrogen (Carlsbad, Calif.).
  • DAPKl g / ml), Hoechst 33342 and TRITCXtetramethylrhodamine isothiocyanate-conjugated paloidin were purchased from Sigma (St. Louis, M0).
  • Purified Wnt3a protein was purchased from R & D Systems CMinneapol is (MN).
  • the pCA14—SLRP6E1E2 vector was co-transformed with a non-replicating adenovirus 5/35 chimeric vector (dEl-k35) or a replicable oncolytic adenovirus vector (RdB-k35) ( 19), pdEl-k35 / sLRP6ElE2 and pRdB-k35 / sLRP6ElE2 were produced, respectively.
  • Nonreplicated dEl-k35 / LacZ and replicable oncolytic RdB-k35 vectors were used as negative controls (20) (FIG. La). All viruses were obtained by known methods (21).
  • Luciferase Reporter Assay for Measurement of ⁇ -Catenin Activity TOPflash and FOPflash luciferase reporter vectors (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) were used to measure ⁇ _catenin / T-cell factor (TCF) signaling activity.
  • Mitochondrial fractions were prepared using the Qproteome mitochondrial separation kit (QIAGEN,
  • A549 cells with or without Wnt3a were plated on two-chamber slides (3 ⁇ 10 4 cells / chamber, Nunc, Naperville, IL) and transduced with PBS, dEl-k35 / LacZ or dEl_k35 / sLRP6ElE2.
  • Next 1 cells were fixed and incubated for 30 minutes in a medium containing 250 ⁇ MitoTracker Red mitochondrial stain (Molecular Probes, Eugene, OR). The cells were then incubated with 0.5 mg / ml anti-cytochrome c antibody. The following day, the staining results were visualized with Alexa Flour 488-conjugated goth anti-mouse IgG antibody. After washing, slides were stained with Hoechst 33258 (1 mg / ml) for nuclear staining.
  • Tumor tissue was fixed and embedded in paraffin wax for histology and immunohistochemical staining. Representative faces were stained with hemaroxylin and eosin and observed by light microscopy.
  • tumor confrontation was determined using anti-mouse CD31 IgG (BD Pharmingen), anti-rabbit ⁇ -catenin IgG Cell Signaling Technology) or anti-mouse Wnt 3a IgG (Santa C Mau z BCD technology). Stained with. Positive immune responses were visualized using ABC-peroxidase kits (ChemMate TM DAK0 EnvisCD3 TM Detec CD31kit; DAKO). Move and Penetration Analysis
  • In vitro migration analysis was performed by a known method (23).
  • Conditioned media were obtained from A549 cells transformed with PBS, dEl-k35 / LacZ or dEl—k35 / sLRP6ElE2A549 after treatment with or without Wnt3a and placed in the lower Transwell chamber.
  • A549 cells were plated in the upper chamber (7 ⁇ 10 4 cells / well). Incubated at 37 ° C. for 4 hours, fixed, and stained with hemaroxylin and eosin.
  • In vitro Matrigel invasion assays were performed using a Biocoat TM cell migration chamber.
  • the Matrigel based membrane matrix 37 mg / fi Iter; BD Biosciences, San Jose, Calif.
  • RNA total RNA (1 g) was isolated using RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, Calif.), And cDNA was synthesized using -dT primer and M—MLV reverse transcriptase (Invitrogen).
  • PCR polymerase chain react ion
  • MMP2 matrix metal loproteinase 2
  • Water soluble Wnt attractant receptors are expressed in lung cancer cells and bind to Wnt3a. Endogenous Wnt3a levels were measured by western blotting in six non-small cell lung cancer cell lines (A549, H322, H596, H460, H358 and H2009). In the H322, H460 and H2009 cell lines, Wnt3a was expressed more strongly than other cell lines (FIG. Lb). Thus, H322 and H460 cells were selected to measure the ability of water soluble Wnt attracting receptors (SLRP6E1E2) to inhibit Wnt signaling.
  • SLRP6E1E2 water soluble Wnt attracting receptors
  • luciferase reporter system activated by ⁇ -catenin / TCF to confirm its effect on ⁇ -catenin (24).
  • luciferase activity was low in A549 cells transduced with dEl-k35 / LacZ or dEl-k35 / sLRP6ElE2 in the absence of Wnt3a.
  • Treatment with Wnt3a increased luciferase expression by approximately 7-8 fold in control cells, but not in dEl-k35 / sLRP6ElE2-transformed cells.
  • immunofluorescence staining was performed on H322 cells treated with PBS or transduced with dEl-k35 / LacZ or dEl-k35 / sLRP6ElE2. Without Wnt3a treatment, ⁇ -catenin staining occurred only in intercellular contacts primarily in all groups.
  • control cells When stimulated with Wnt3a, control cells (PBS and dEl-k35 / LacZ) had reduced ⁇ -catenin locality at the plasma membrane, especially at the cellcell junction, and ⁇ -catenin levels in the cytoplasm and nucleus. Increased.
  • Wnt plays an important role in cell proliferation by activating the ERK and PI3K-Akt pathways (26).
  • SLRP6E1E2 could inhibit these pathways in H460 cells.
  • clEl-k35 / sLRP6ElE2-transformed cells were found to have lower basal levels of MEK, ERK1 / 2 and survivin than control cells (FIG. 3C). Although these proteins were increased by Wnt3a treatment, dEl-k35 / sLRP6ElE2-transduced cells were still at very low levels compared to control cells.
  • SLRP6E1E2 is MEK-ERK and PI3K- It can be seen that the anti-proliferative effect by inhibiting Wnt signaling through the Akt pathway.
  • Attractant Vint SLRP6E1E2 receptors induce apoptosis
  • the cleaved (activated) form of caspase-3 was also greatly increased by SLRP6E1E2.
  • c! El-k35 / sLRP6ElE2-transformed cells also showed increased cytoplasmic cytokine c and reduced microsomal cytochrome c levels. Stimulation by Wnt3a showed a similar effect.
  • immunofluorescence was performed. PBS-treated and dEl-k35 / LacZ-transduced cells showed cytoplasmic cytochrome c staining, consistent with mitochondrial positions.
  • Attractant fnt receptor SLRP6E1E2 inhibits growth of xenograft tumors
  • Tumors were formed by subcutaneous injection of H460 cells into the abdomen of nude mice.
  • the average size of the tumor was injected with PBS, dEl-k35, k35-RdB, dEl-k35 / k35 sLRP6ElE2 or RdB- / sLRP6ElE2 at 1, 3 and 5 days after reaching 80-100 ⁇ 3.
  • Figure 5a shows that the tumor volume injected with the SLRP6E1E2-expressing vector is significantly reduced compared to the control. 25 days later, tumors treated with PBS was reached the average volume of 3883.1 ⁇ 418.08 ⁇ 3, tumors treated with dEl-k35 and RdB-k35 is reached respectively 3388.1 ⁇ 226.9 mm 3 and 1991 ⁇ 311.8 ⁇ 3 ' .
  • tumor growth was compared with dEl-k35 / sLRP6ElE2 (compared to 1645.3 ⁇ 353.6 mm 3 PBS or dEl-k35 group) .05) or RdB-k35 / sLRP6ElE2 (923.3 ⁇ 180.4 ⁇ 3 PBS or RdB-k35 group. 0.01) was significantly reduced in the mice administered.
  • Tissues injected with tumor adenoviruses (RdB-k35 and RdB-k35 / sLRP6ElE2) showed fewer endothelial and vascular tissues than PBS-treated tumors (/ 3 ⁇ 4 : 0.05), dEl-k35 or dEl-k35 / sLRP6ElE2. There was no change in vascular density in the tumor injected (FIGS. 5D and 5E).
  • vascular density in tumors injected with SLRP6E1E2-expressing adenovirus was no different from the control group, indicating that the anti-tumor efficacy of SLRP6E1E2 was not mediated by anti-angiogenic effects.
  • EMT is an important process in tumor development, and the Wnt ⁇ —catenin signaling pathway plays an important role in this process.
  • the present inventors investigated whether Wnt3a induces EMT in tumor cells. As a result, it was confirmed that after 1 day of Wnt3a treatment, the cells were extended to have a spindle shape similar to that of the mesenchymal cells (FIG. 6A). We also observed an increase in the expression of the mesenchymal markers Vimentin and ⁇ -catenin followed by an increase in the epithelial marker ⁇ -cadherin (FIG. 6B). Immunofluorescence staining revealed that cytokeratin and E-cadherin levels dramatically decreased at intercellular contacts after Wnt3a treatment (FIG. 6C).
  • SLRP6E1E2 Regulates EMT-Related Marker Expression and MMP-2 / MMP-9 Activity Acquisition of migration properties by cancer cells is an important factor in the propagation of metastatic tumor cells (29). Increasing Wnt3a enhances motility and permeability As seen, we investigated whether expression of SLRP6E1E2 inhibits in vitro motility and permeability when interfering with the Wnt signaling pathway. We investigated the effect of SLRP6E1E2 on A549 cells using transwell motility and Matrigel invasion assays.
  • Conditioned media were collected from PBS—treated, dEl-k35 / LacZ-transduced and dEl-k35 / sLRP6ElE2 ′ transduced cells, with or without Wnt3a treatment . .
  • Control media obtained in dEl-k35 / sLRP6ElE2-transduced cells reduced mobility by 12.4% (untreated Wnt3a) and 23.8% (Wnt3a treated) compared to control media obtained from dEl-k35 / LacZ-transduced cells (/ ) .001) (Fig. 7a).
  • control medium obtained in dEl-k35 / sLRP6ElE2-transduced cells was 34.2% (wnt3a untreated) and 56.23 ⁇ 4 »(Wnt3a treated) compared to the control medium obtained from dEl-k35 / LacZ-transduced cells. Reduced (FIG. 7B). E-cadherin expression and actin pilate were also decreased by Wnt3a, but increased in dEl-k35 / sLRP6ElE2-transduced cells compared to controls treated with or without Wnt3a (FIG. 7C).
  • P matrix metalloproteinase
  • treatment with Wnt3a increased ⁇ P-2 and ⁇ P-9 in PBS-treated and dEl-k35 / LacZ-transduced A549 cells, but did not or did not process Wnt 3a.
  • / sLRP6ElE2-transduced cells showed low expression of fflP-2 and P-9.
  • LRP6 expression promotes cancer cell proliferation and tumori genes is by altering beta- cat en in subcellular distribution. Oncogene 23: 9129-35 (2004).
  • Forrester WC The Ror receptor tyrosine kinase family. Cell Mol Life Sci 59: 83-96 (2002).

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Abstract

본 발명은 Wnt 유인 수용체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다 본 발명의 조성물 또는 이의 발현 산물은 Wnt 리간드에 결합하여 리간드-수용체 상호작용을 차단함으로써 암의 발생, 성장, 증식 및 전이를 억제하고 암세포의 사멸을 유도함으로써 효율적인 항암 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
Wn t 유인 수용체를 포함하는 항암 조성물 【기술분야】
본 발명은 Wnt 유인 수용체를 이용， 종양의 발달에 관여하는 Wnt 시그널링의 활성화를 억제하는 할암 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
폐암은 예후가 좋지 않고 전 세계적으로 암 -관련 사망의 가장 일반적인 원인이 되는 암이다. 2009년에 미국 암협회 (American Cancer Society)는 미국에서 발병한 새로운 폐암 환자의 수를 219,440명으로 집계하였다. 외과적 수술 및 방사선 치료와 같은 표준 치료법은 많은 경우 효과적이지 않으나 (1), 폐암의 분자수준의 기작에 대한 이해가 높아지면서 새롭고 유망한 새로운 치료법이 개발되고 있다 (2)..화학 치료법의 발달로 침습성 비소세포 폐암 환자의 생존율을 증가시키기는 했으나， 화학요법에 대한 내성 (chemoresistance)이 치료 실패의 주요 원인으로 남아있다 (3). EGFRCepithelial growth factor receptor)에서의 돌연변이 활성화는 폐 선암 (lung adenocarcinomas)의 원인 중 하나이며， 이들 종양에 EGFR 티로신 카이네이즈 억제자인 gefitinib 또는 erlotinib에 대한 강한 저항성을부여한다 (4， 5). 많은 침습성 폐암은 Wnt, K-ras, ERK(extracel lular signal-regulated kinase) , Akt 및 사이클로옥시게나아제 -2을 포함하는 다양한 암 -관련 유전자에서 변형을 보임으로써 폐 선암에서의 암 생성에 다양한 다른 분자적 기작이 작용함을 시사한다 (6-8).
암에서의 Wnt 시그널링의 역할은 20여년 전에 마우스 포유류 종양 바이러스의 부착 부위 (integration site)로서 Wnt-l가 발견됨에 따라 처음으로 보고되었다 (9). 많은 연구들은 Wnt 리간드， 수용체 및 세포외 길항제의 발현변화가 암의 발단 /진행 및 줄기세포의 자가재생 /분화와 관련되어 있다고 보고하고 있다 (10). Wnt 리간드, LRP5( low-density lipoprotein receptorrelated protein 5) 및 LRP6의 발현은 폐암에서 증가하지만, Wnt 리간드를 억제하여 수용체와의 상호작용을 차단하는 Wnt 길항제 [예를 들어 WIF-l(Wnt inhibitory factor-1)], sFRP(secreted Frizzled-related proteins) 및 DKK(dickkopf proteins)의 경우 발현이 감소하거나 불활성화 된다 (11， 12). 따라서ᅳ Wnt에 대한 단일클론 항체 및 siRNA와 Wnt 길항제의 과발현은 다양한 인 비트로 및 인 비보 종양 모델에서 종양의 성장을 감소시킨다.
LRP 상과 (superfamily)에 속하는 LRP6는 핵심 작동분자인 β- 카테닌의 안정화 및 핵으로의 이동을 야기시키는 일반적인 Wnt 시그널링 기작의 활성화에 필요하다 (13). Wnt에 결합하기 위해서는 4개의 개별적인 YWTD β-추진자 /EGF-유사 도메인으로 이루어져 제 1 및 제 2 도메인 (E1 및 Ε2)을 페어링하는 LRP6가 필요하다 (14-16). 본 발명자들은 LRP6의 E1 및 Ε2 부위로 구성된 새로운 수용성 Wnt 수용체인 SLRP6E1E2의 치료적 유용성에 대해 연구하였다, 본 발명자들은 세포외 Wnt 리간드에 결합하고 리간드- 수용체 상호작용을 차단하는 SLRP6E1E2의 생물학적 효과를 조사하였다. 그， 결과 특정 Wnt 리간드 /수용체 상호작용이 항암 치료제로서의 잠재적인 용도를 가질 수 있다는 직접적인 증거를 얻었다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 종양의 발생 및 성장을 효율적으로 억제함으로써 항종양 활성이 극대화된 유전자 항암 치료 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 새로운 수용성 Wnt 수용체인 SLRP6E1E2가 Wnt 3a 단백질과의 결합을 통해 암에서의 Wnt 신호전달 기작을 억제함으로써 암세포의 성장， 증식 및 전이를 억제하고 암세포의 사멸을 유도한다는 사실을 발견함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 게 2서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 서열목특 게 2서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 약제학적 유효량을 포함하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명자들은 종양의 발생 및 성장을 효율적으로 억제함으로써 항종양 활성이 극대화된 유전자 항암 치료 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 새로운 수용성 Wnt 수용체인 SLRP6E1E2가 Wnt 3a 단백질과의 결합을 통해 암에서의 Wnt 신호전달 기작을 억제함으로써 암세포의 성장, 증식 및 전이를 억제하고 암세포의 사멸을 유도한다는 사실을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드" 는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 서열목록 제 2서열의 아미노산 서열은 LRP6의 E1 및 E2 부위로 구성된 새로운 수용성 Wnt 수용체인 SLRP6E1E2의 아미노산 서열이다. 본 발명에 따르면, SLRP6E1E2는 Wnt 리간드에 결합하여 리간드-수용체 상호작용을 차단함으로써 암의 발생， 성장， 증식 및 전이에 중요한 역할을 하는 Wnt 시그널링의 활성화를 억제한다.
보다 구체적으로， 본 발명의 실시예에 따르면， 본 발명의 수용성 Wnt 수용체는 세포질 β-카테닌 수준 및 TCF 전사활성을 감소시키고， 암 세포 증식을 억제하며， 암세포의 세포사멸을 유도하고, 종양의 성장을 억제하며， 혈관신생， 종양성장 및 전이에서 중요한 역할을 하는 腿 Ρ-2 및 匪 Ρ— 9의 발현량을 감소시키고， 종양세포의 침투성을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 암화의 진행을 효과적으로 억제하는 효율적인 항암 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 SLRP6E1E2는 서열목록 제 2서열의 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은， 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도록 얼라인하고， 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에， 최소 80%의 상동성， 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성 , 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
또한, 본 발명에서 이용되는 SLRP6E1E2는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. SLRP6E1E2 단백질의 변이체란 SLRP6E1E2 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 SLRP6E1E2 단백질은 인산화 (phosphorylation)， 황화 (sulfation)， 아크릴화 (acrylat ion) , 당화 (glycosylat ion)， 메틸화 (methylation) 또는 파네실화 (farnesylation) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다.
상기 SL P6E1E2 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merri field, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001). 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 제 2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목톡 제 2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 약제학적 유효량을 포함하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제 1서열의 뉴클레오타이드 서열은
LRP6의 E1 및 E2 세포외 도메인 (Wnt 결합부위)으로 이루어진 SLRP6E1E2의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어， 코돈의 축퇴성에 의해， 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다) , 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면， 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도록 얼라인하고， 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에， 최소 6 의 상동성 , 보다 바람직하게는 70%의 상동성， 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성， 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)； Needleman and unsch, J. Mo I. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24： 307- 31(1988)； Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988)； Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989)； Corpet et al. , Nuc. Acids Res. 16:10881- 90(1988)； Huang et al . , Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24 :307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al . , J. Mol. Biol. 215 :403-10 (1990))은 NBC I (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://ww.ncbi .nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 유전자 전달체 (gene delivery system)에 포함되어 있다.
본 명세서에서 용어 "유전자 전달체" 는 외래 유전자를 숙주세포 등에 전달하여 궁극적으로 전달된 유전자를 숙주세포의 유전자 발현 시스템을 이용하여 발현시키기 위해 사용되는모든 매개체를 포함한다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 유전자 전달체는 플라스미드， 재조합 아데노바이러스， 아데노 -관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스， 렌티바이러스， 헤르페스 심플렉스 바이러스， 미즐스 바이러스， 폭스 바이러스， 샘리키 포리스터 바이러스, 백시니아 바이러스， 폴리머， 나노물질， 리포좀 또는 니오좀이다.
본 발명에서 전달하고자 하는 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달체에 적용될 수 있으며， 바람직하게는 플라스미드， 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al . , Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련바이러스 (Lashford LS. , et al . , Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager (1999)), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al . , Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager , (1999)) , 렌티바이러스 (Wang G. et al. , J. Clin. Invest . 104(11) :R55-62( 1999)) , 헤르페스심플렉스 바이러스 (Chamber R. , et al .， Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al. , Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M. , The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infect ious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2) :97-120(2008)) , 리오바이러스， 미즐스 바이러스， 샘리키 포리스터 바이러스， 플리머 (Hwang et al., In vitro and In vivo Trans feet ion Efficiency of Human Osteoprotegerin Gene using Non-Viral Polymer Carriers., Korean J. Bone Me tab. 13(2)： 119-128(2006)) , 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199， S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002), 나노물질 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는， 본 발명의 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스에 적용하여 제조된다. i , 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기， 조작의 편의성， 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 백터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며， 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다, E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다. 현재 개발된 아데노바이러스 백터 중에서， E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 백터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thi隱 appaya, B. et al . , Cell, 31:543-551(1982)； 및 Riordan, J. R. et al . , Science, 245:1066- 1073(1989)). 따라서， 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 E1A 유전자의 프로모터 서열 위치에 삽입되어 E1A 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어 , "결실" 은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라， 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
바람직하게는， 본 발명의 재조합 아데노바이러스 백터는 E1B 및 E3 영역이 결실된 것이고, 본 발명의 서열목록 제 1서열의 뉴클레오타이드 서열은 E1B 또는 E3 영역에 삽입된다.
또한， 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에， 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다 (Ghosh-Choudhury et al. , ΕΜΒΟ J. , 6：1733-1739(1987)). 따라서ᅳ아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며， 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서， 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다. ϋ . 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고， 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 백터로서 많이 이용되고 있다ᅳ
레트로바이러스 백터를 구축하기 위하여， 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여， gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTRGong terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al .， Cell, 33：153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면， Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며， 이 전사체는 바이러스로 패키징되고， 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors , " In: Vectors '■ A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds. ) , Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2세대 레트로바이러스 백터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasaharaet al. Science, 266: 1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 백터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다. iii. AAV 백터
아데노 -관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고， 다양한 종류의'세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 백터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5，139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다. 유전자 전달 시스템으로서의 MV에 대한 연구는 LaFace et al , Viology, 162:483486(1988), Zhou et al .， Exp. Hematol. (NY), 21:928- 933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2 :29-37 (1995)에 개시되어 있다. 최근에， MV 백터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 MV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열 (릴랙신 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al .， J. Virol. , 62:1963-1973(1988)； 및 Samulski et al . , J. Virol. , 63： 3822- 3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 MV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al .， J. Virol. , 65：2936-2945( 1991))를 동시 형질전환시켜 제조된다. IV. 다른 바이러스 백터
다른 바이러스 백터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al .， Human Gene Therapy 10 :649ᅳ 657 (1999) ; Ridgeway, "Mammal i an expression vectors , " In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt , eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988)； Baichwal and Sugden , "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer . New York: Plenum Press, 117- 148 ( 1986) 및 Coupar et al. , Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11) :R55-62( 1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R.， et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411- 1415(1995)), 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M. , The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2) :97—120(2008) , 리오바이러스， 미즐스 바이러스， 샘리키 포리스터 바이러스로부터 유래된 백터들도， 목적 뉴클레오타아드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
V . 폴리머
비바이러스성 유전자 전달체로서 폭넓게 사용되는 폴리머계 전달체로는 PEG, PEI, PLL, 젤라틴 키토산 (Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres. Int J Pharm 148:231-240(1997)) PLL(poly- LLysine)(Maruyama A, Is ihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T. Nanopart icle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D,Llact ide) . Biocon jugate Che 8：735-742(1997)) 및 PEI(polyethyleneamine)(Abdal lah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammal i an brain: Polyethyleneimine. Human Gene Ther 7：1947-1954(1996)) 등이 이용되고 있다. 폴리머계 유전자 전달체들의 장점은 면역반응과 급성독성의 발현율이 낮고 제조법이 간단하며 대량생산이 가능하다는 점이다. vi. 리포좀 및 니오좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Seneᅳ Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al . , Methods Enzymol., 149: 15그 176 (1987)에 개시되어 있다. 한편， 리포좀올 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 LipofectamineCGibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스， 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
리포좀이 인지질을 이용하여 만들어 지는 것에 반하여 니오좀 (niosome)은 비-이온성 계면활성제 (non-ionic surfactant) 및 콜레스테를 (cholesterol)의 흔합으로 구성된 이중막 수송체로 극성 및 비극성 물질을 봉입할 수 있고， 삼투압적으로 활성이 있으몌 인지질 등에 의한 지질미립자의 운반체인 리포좀에 비하여 안정하고， 또한 제조시 사용되는 계면활성제가 보관 및 취급 시에 특별한 조건이 필요하지 않다는 장점을 가진다. 한편， 상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.
본 발명에서， 유전자 전달 시스템이 바이러스 백터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 백터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.
본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는， 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094- 1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al . , Virology, 52:456(1973)； 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al. , EMB0 J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al. , Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀 -매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982)； 및 Nicolau et al .， Methods Enzymol . , 149:157- 176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal， Mol. Cell Biol., 5:1188- 1190(1985))， 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 87：9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 암세포에서의 Wnt 시그널링 기작의 활성화를 억제한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 서열목록 제 2서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 Wnt 3a 단백질에 결합함으로써 암세포에서의 Wnt 시그널링 기작의 활성화를 억제한다. 본 발명의 실시예에 따르면， SLRP6E1E2-형질도입 세포에서 대조군보다 Wnt 3a 및 LPR6 단백질의 수준이 낮았으며， 이는 SLRP6E1E2의 LPR6 E1-E2 도메인이 Wnt 3a에 효과적으로 결합하여， 결과적으로'종양의 진행에 관여하는 Wnt 시그널링을 억제하였음을 의미한다. 본 발명의 조성물은 상술한 바와 같이， 암 세포의 성장 및 증식 억제 또는 암세포의 살상 효능을 나타내므로， 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암， 유방암， 난소암, 간암, 뇌암， 전립선암, 육종 (sarcoma), 기관지암， 비인두암， 후두암， 췌장암， 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물로 치료되는 암은 폐암이다.
본 명세서쎄서 용어 "치료" 는 ( i ) 종양 세포 형성의 예방; (ii) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (iii) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스, 덱스트로스， 수크로스， 솔비를， 만니틀， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슴， 알기네이트, 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스， DMS0, 폴리비닐피롤리돈， 셀를로스， 물， 시럽, 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드특시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제， 감미제， 향미제, 유화제， 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고， 예컨대 정맥내 투여， 복강내 투여, 근육내 투여， 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고， 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며， 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고， 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 질병 증상의 정도， 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하며， 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로， 본 발명의 약제학적 조성물은 1 X 105 - 1 X 1015 pfu/n^의 재조합 아데노바이러스를 포함하며， 통상적으로 1 X 1010 pfu를 이를에 한번씩 2주 동안주사한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제， 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나， 다른 통상적인 화학 요법， 세포 치료제 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며， 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplat in)， 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine) , 시클로포스파미드 (cyclophosphamide)， 이포스파미드 (ifosf amide)， 멜팔 (melphalan), 클로라부실 (chlorambuci 1 ) , 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin)， 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin)， 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (pi icomycin)， 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide) , 탁목시펜 (t amo i f en) , 택솔 (taxol), 트랜스라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5- fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin) , 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 선 조사 등이다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 세포지료 요법은 수지상 세포 (dendritic cells), (Natural Killer) 세포， TIL(Tumor Infiltrating Lymphocytes) 및 CTL( Cytotoxic T Lymphocytes) 등이다. 【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 Wnt 유인 수용체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물 또는 이의 발현 산물은 Wnt 리간드에 결합하여 리간드-수용체 상호작용을 차단함으로써 암의 발생， 성장， 증식 및 전이를 억제하고 암세포의 사멸을 유도함으로써 효율적인 항암 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 유인 Wnt 수용체 SLRP6E1E2의 특성을 나타낸 그림이다. 도 la는 본 발명에서 사용된 아데노바이러스 백터의 유전자 구조의 모식도를 나타낸 그림이다. 도 lb는 몇몇 인간 폐암세포주에서 Wnt3a의 내재적 발현양상을 나타낸 그림이다. 도 lc는 SLRP6E1E2의 발현 및 분비를 나타낸 그림이다. 세포 배양액의 상층액은 FLAG- 또는 L P6- 특이적 항체를 이용하여 조사하였다. 도 Id는 H322 및 H460 세포를 dEl-k35/LacZ 또는 dEl-k35/sLRP6ElE2(50 M0I)로 48시간동안 형질전환하고， 세포파쇄물을 Wnt 3a (IP: Wnt 3a) 또는 LRP6(IP: LRP6)에 대한 항 혈청으로 면역침강시킨 뒤 동일한 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 유인 Wnt 수용체 SLRP6E1E2가 세포질 β-카테닌 및 Τ-세포 인자 전사활성을 감소시킴을 나타낸 그림이다. 도 2a는 A549 세포에서의 TCF/LEF 루시퍼라제 리포터 분석결과를 나타낸 그림이다 (dEl-k35/LacZ- 형질전환 또는 PBS-처리 세포와 비교시 ).05). 도 2b는 H460 및 H322 세포에서의 TCF/LEF 루시퍼라제 리포터 분석결과를 나타낸 그림이다 (Wnt3a를 처리하거나 처리하지 않은 PBS-처리 또는 dEl-k35/LacZ_ 형질전환 세포와 비교시 *:0.05). 도 2c는 Wnt3a를 처리하거나 처리하지 않은 H322 세포를 dEl-k35/LacZ 또는 dEl-k35/sLRP6ElE2(50 M0I)로 형질전환하고 항 -β-카테닌으로 표지한 후 관찰한 결과를 나타낸 그림이다 (배율 χ630) .
도 3은 유인 Wnt 수용체 SLRP6E1E2가 인간 폐암세포의 증식을 억제함을 나타내는 그림이다. A549 및 H322 세포를 dEl_k35/LacZ 또는 dEl- k35/sLRP6ElE2(20 M0I)로 형질전환하고， 다음날 이들 Wnt3a(100 ng/ml)의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 3일 후에， ΜΠ 분석으로 세포증식을 측정하였다 (평균士표준오차) (도 3a) * .05, #/ ).01 각 그룹의 무처리 대조군， 001 dEl-k35/LacZ-형질전환 또는 PBS-처리 세포， n.s.=유의성 없음 (not significant). A549 세포를 상기 도 3a에서와 같이 처리하고， Dvl2, Axin, Cyclin D1 또는 GSK-3에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다 (도 3b). H460 세포를 상기 도 3a에서와 같이 처리하고 (50 MOD, MEK, ERK, Survivin, mTOR, PI3K 및 Akt에 대한 웨스턴 블롯팅을 하였다.
도 4는 유인 Wnt 수용체 SLRP6E1E2가 인간 폐암세포의 세포사멸 (apoptosis)를 유도함을 나타낸 그림이다ᅳ 세포들을 dEl-k35/LacZ 또는 dEl-k35/sLRP6ElE2로 형질전환하고 (20 MOD, 72시간 뒤에 사진을 촬영하였다 (배율 x200) (도 4a). 또한 TUNEL 염색을 이용하여 SLRP6E1E2- 유도 세포사멸을 검출하였다 (배율 x400) (도 4b). 도 4c는 각 필드당 TUNEL- 양성 세포의 전체 숫자를 나타낸 그림이다 (평균士표준오차). *7¾0.05 Wnt3a 하에서 PBS 또는 dEl-k35/LacZ를 처리， 001 PBS-처리 또는 dEl- k35/LacZ-형질전환 대조군， n.s.=유의성 없음. 도 4d는 sLRP6ElE2-매개 세포사멸을 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과를 나타낸 그림이다. H460 세포를 dEl-k35/LacZ 또는 dEl_k35/sLRP6ElE2(20 M0I)로 형질전환하고, 비절단 (unc leaved) PARP, 절단 (cleaved) PARP, pro-카스파아제 -3, 절단 카스파아제 -3 및 사이토크름 c를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 하였다. 도 4e는 H460 세포를 상기 도 4d와 같이 처리하고 세포질 및 마이크로좀 분획물에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행하여 사이토크롬 C의 세포내 위치를 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 도 4f는 A549 세포를 상기 도 4d와 같이 처리하고， 항 -사이토크롬 c항체 (녹색) 및 MitoTracker (붉은색)으로 염색한 뒤 레이져 형광 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 그림이다 (배율 xl260).
도 5는 유인 Wnt 수용체 SLRP6E1E2가 종양의 성장과 특성화를 억제함을 나타낸 그림이다. 도 5a는 1일， 3일 및 5일 째에 종양에 PBS (画) ,
dEl-k35/LacZ(#), RdB-k35(A), dEl-k35/sLRP6ElE2 (x) 또는 RdB-
k35/sLRP6ElE2 (秦)를 투여한 결과를 나타낸 그림이다. 결과는 평균士표준오차 (n=7)로 표현하였다, */ ).05 PBS-처리 또는 dEl-k35-처리 대조군 및 dEl-k35/sLRP6ElE2. 으 01 PBS-처리 또는 dEl-k35-처리 대조군. 도 5b는 각 그룹의 종양 절단면을 E1A 또는 FLAG에 대해 면역염색을 한 결과를 나타낸 그림이다 (배율 x40 및 xlOO). 도 5c는 각 그룹의 종양 조직을 DAPI (파란색)， 항 -Ki67(붉은색) 및 TdT-매개 TUNEL (녹색)으로 염색한 결과를 나타낸 그림이다 (배율 xlOO). 도 5d는 CD31에 대한 염색을 통해 혈관을 관찰한 결과를 나타낸 그림이다 (배율 xlOO). 도 5e는 각 처리그룹의 평균 모세혈관 농도 (CD31 양성 세포 /필드)를 나타낸 그림이다. 결과는 평균士표준오차로 표현하였다. */ ).05 PBS, dEl-k35 또는 dEl- k35/sLRP6ElE2. n.s,=유의성 없음ᅳ 도 5f는 세포를 DAPI (블루), 항- Wnt3a (붉은색) 또는 항 -β-카테닌 (녹색)으로 염색한 결과를 나타낸 그림이다 (배율 xlOO).
도 6은 Wnt3a 처리에 의해 종양세포에서의 세포간 연결부위 및 상피- 중간엽 전이가 붕괴됨을 보여주는 그림이다. 도 6a H322 세포를 지정된 시간동안 Wnt3a(100 ng/ml)를 처리하고, 형태의 변화를 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 그림이다 (배율 χ200). 도 6b는 H322 세포에 Wnt3a를 처리한 후 E-카드헤린， 비멘틴 (Vimentin) 및 β—카테닌 mRNA 수준을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 도 6c는 H322 세포를 Wnt3a(100 ng/ml)의 존재 또는 부재하에 24시간 동안 배양 후 DAPI (파란색)， TRITC-표지 팔로이딘 (붉은색) 또는 항 -E-카드헤린 (녹색)으로 염색한 결과를 나타난 그림이다 (배율 x630) .
도 7은 유인 Wnt 수용체 SLRP6E1E2가 암세포의 이동 및 침투를 억제하고 상피-중간엽 전이 (EMT)마커 및 MMP의 발현을 조절함을 보여주는 그림이다. 도 7a는 A549 폐암세포 이동의 정량적 분석결과를 나타낸 그림이다, 실험은 세 번 반복하고 결과를 평균士표준오차로 나타냈다, * .05 PBS 또는 dEl-k35/LacZ 처리 대조군; **/ ).001 PBS 또는 dEl- k35/LacZ를 Wnt3a와 함께 처리, 도 7b는 종양 세포의 침투를 다섯 개의 필드 내의 각각의 필터당 존재하는 세포의 숫자로 정량화한 결과를 나타낸 그림이다. 실험은 세 번 반복하고 결과를 평균士표준오차로 나타냈다. * .05 PBS 또는 dEl-k35/LacZ 처리 대조군; **/ ).001 PBS 또는 dEl- k35/LacZ를 Wnt3a와 함께 처리. 도 7c는 Wnt3a(100 ng/ml)의 존재 또는 부재 하에서 PBS, dEl-k35/LacZ 또는 dEl-k35/sLRP6ElE2로 처리한 후 24시간 뒤에 H322 세포 내에서의 EMT 마커의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그림이다, 세포들올 DAPI (파란색)， TRITC-표지 팔로이딘 (붉은색) 또는 항 E-카드헤린 (녹색)으로 염색하였다 (배율 χ630), 도 7d는 A549 세포들을 상기 도 3a와 같이 처리하고 반정량적 (semiquantitative) RT-PCR을 이용하여 MMP-2 및 MMP-9 mRNA수준을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험재료 및 실험방법
실험재료
MAPK 카이네이즈 (MEKl/2 p44/42 마이토젠-활성화 단백질 카이네이즈 (MAPK Erkl/2), mTOR, PI3K(phosphat idyl inositol 3-kinase) 및 Akt에 대한 다클론 항체 및 nt3a, Dvl2, Axin, 글리코겐 신타아제 카이네이즈 (GSI(3-P ), PARPCpoly (ADP-ribose) polymerase) 및 절단 카스파아제 -3에 대한 단일클론 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)에서 구입하였다. 상피—중간엽 전이 (EMT) 관련분자인 β-카테닌 및 E- 카드헤린에 대한 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입하였다. 사이클린 DUH-295), 사이토크름 c (웨스턴 블롯팅분석을 위한 C-20) 및 LRP6CC-10)에 대한 항체 및 단백질 A/G 아가로스 비드는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. 카스파아제에 대한 단클론 항체는 StressGen Biotechnologies (Victoria, BC)에서 구입하였다. 사이토크롬 c (면역조직화학분석을 위한 6H2.B4)에 대한 다클론항체는 BD Pharmingen (San Diego, CA)에서 구입하였다. Alexa Fluor 488-접합 및 Alexa Fluor 568-접합 항 -래빗 IgG 항체는 Invitrogen(Carlsbad, CA)에서 구입하였다. DAPKl g/ml), Hoechst 33342 및 TRITCXtetramethylrhodamine isothiocyanate)-접합 팔로이딘 (phal loidin)은 Sigma(St. Louis, M0)에서 구입하였다. 정제된 Wnt3a 단백질은 R&D SystemsCMinneapol is, MN)에서 구입하였다. 수용성 LRP6수용체를 발현하는 아데노바이러스 백터의제조
수용성 LRP6 수용체 (SLRP6E1E2)의 생물학적 기능을 연구하기 위하여， 본 발명자들은 LRP6의 E1 및 E2 세포외 도메인 (Wnt-결합 부위)의 컨스트럭트를 구축하였으며 (17)， FLAG-tagged sLRP6ElE2를 셔를백터에 서브클로닝하였다 (18). 상기 pCA14— SLRP6E1E2 백터는 복제불능 아데노바이러스 5/35 키메릭 백터 (dEl-k35) 또는 복제 가능 키메릭 종양분해 (oncolytic) 아데노바이러스 백터 (RdB-k35)와 함께 형질전환 (co- transformation)하여 (19)， 각각 pdEl-k35/sLRP6ElE2 및 pRdB- k35/sLRP6ElE2를 제작하였다.
이들 재조합 플라스미드는 HEK293 세포주에 형질도입되어 dEl- k35/sLRP6ElE2 및 RdB-k35/sLRP6ElE2를 생성하였다. 복제불능 dEl-k35/LacZ 및 복제가능 종양분해 RdB-k35 백터는 음성 대조군으로 사용하였다 (20) (도 la). 모든 바이러스들은 공지된 방법에 의하여 수득하였다 (21). β-카테닌 활성 측정올 위한루시퍼라제 리포터 분석 β_카테닌 /TCF(T-cell factor) 시그널링 활성을 측정하기 위하여 TOPflash 및 FOPflash 루시퍼라제 리포터 백터 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)를 사용하였다. A549, H322 및 H460 세포를 배양하여 음성대조군인 0.3 g TOPflash (야생형 TCF 결합부위를 가지는) 또는 FOPflash (변이된 TCF 결합부위를 가지는)와 함께 dEl-k35/LacZ 또는 dEl— k35/sLRP6ElE2(20, 50 M0I)로 형질전환시켰다. 12시간 후에， 배지를 100 ng/ml의 Wnt3a를 첨가하거나 첨가하지 않은 1% DMEM로 대체하고 세포들을 다시 24시간동안 배양하였다. 세포 추출물은 Dual -Luc if erase Reporter Assay Sys t em (Pr omega, Madison, WI)을 이용하여 분석하였다. 세포 증식 분석
세포증식 측정은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazoliimi bromide) 분석을 이용하여 수행하였다 (Sigma)(19) . A549 및 H322 세포를 24-웰 플레이트 (2X104 세포 /웰)에 씨딩하였다. 24시간 후에， 세포들에 PBS, dEl-k35/LacZ 또는 dEl— k35/sLRP6ElE2를 처리하였다. 다음날 세포를 재조합 Wnt3a(100 ng/ml)로 자극하거나， Wnt3a를 처리하지 않고 다시 48시간 동안 배양하였다. 이후 540nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 웨스턴블롯팅 및 면역침강
100 mm 플레이트에서 1% 우태아혈청이 첨가된 DMEM에서 배양한 세포들을 dEl— k35/LacZ 또는 dEl-k35/sLRP6ElE2로 형질전환시켰다. 다음날， 세포들을 Wnt3a(100 ng/ml)로 16시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. 면역 블롯팅은 공지된 방법으로 수행하였다 (19), 면역형광분석
면역형광 현미경 관찰을 위하여， 배양된 세포들을 고정시키고 투과화시켰다. 시료들을 블로킹시키고 E-카드헤린， β-카테틴 또는 항- 사이토크롬 c 일차항체와 함께 배양하였다. 염색은 Alexa Flour 488-접합 고트 항 -래빗 IgG 이차항체로 가시화시켰다. 최종 항체처리시에는 핵 염색을 위하여 TRITC-접합 팔로이딘 및 Hoechst 33342 또는 DAPI 염료 (모두 1 g/ml , Sigma)도 포함되었다. 세포들은 공초점 레이져-스캐닝 현미경 (LSM510, Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY)으로 관찰하였다. 미토콘드리아 분획 및 웨스턴 블롯팅
미토콘드리아 분획물은 Qproteome 미토콘드리아 분리용 킷 (QIAGEN,
Hilden, Germany)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 준비하였다. 세포들을 세척하고 얼음으로 넁각시킨 라이시스 완층액에 부유시켰다. 10분간 배양한 후에, 파쇄물을 원심분리하고 세포질 단백질을 포함하는 상층액을 제거하였다. 핵을 포함하는 침전물， 세포 파편 및 파쇄되지 않은 세포들을 재부유하여 얼음으로 냉각시킨 분쇄 완층액 (disrupt ion buffer)에 재부유시키고 원심분리하였다. 이후 상층액 (마이크로좀 분획물)을 깨끗한 마이크로 튜브에 옮겼다. 수득한 미토콘드리아 포함 침전물을 미토콘드리아 저장 완층액으로 세척하여 원심분리하였다. 래빗 항 -사이토크롬 c 항체를 이용하여 상술한 과정을 통해 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 사이토크롬 c 면역염색
Wnt3a를 처리하거나 처리하지 않은 A549 세포를 two-chamber 슬라이드 (3X104세포 /챔버， Nunc, Naperville, IL)에 플레이팅시키고 PBS, dEl-k35/LacZ 또는 dEl_k35/sLRP6ElE2와 함께 형질도입하였다. 다음1 세포를 고정시키고 250 ηΜ의 MitoTracker Red 미토콘드리아 염색제 (Molecular Probes, Eugene, OR)를 포함하는 배지에서 30분간 상온 배양하였다. 세포들을 이후 0.5 mg/ml 항 -사이토크롬 c 항체와 함께 배양하였다. 다음날， 염색결과를 Alexa Flour 488-접합 고트 항-마우스 IgG 항체로 가시화시켰다. 세척 후에, 슬라이드는 핵 염색을 위하여 Hoechst 33258(1 mg/ml)로 염색하였다. 인간 이종이식모델에서의 항 -종양효과
이종이식 인간 비소세포 폐암은 6-8주령의 수컷 무흉선 (athymic) nu/nu 마우스 (Charles River Japan, Yokohama, Japan)에 lxiO7의 H460 세포를 복부에 피하주사 함으로써 확립하였다. 종양의 부피가 약 80-100 腿 3에 다달았을 때， 마우스를 평균 종양부피가 유사한 다섯개의 그룹으로 나누었다. 처리 첫째날， 셋째날 및 다섯째날에 아데노바이러스 백터를 종양내 주사 (2X1010 V바이러스 입자 /마우스)하였다. 종양 부피 ( )는 다음과 같이 계산하였다: V= 0.52Χ3 2Χό (a, 최소 표면직경; b, 최대 표면직경) 종양조직 및 면역조직화학
조직 검사 및 면역조직화학 염색을 위하여 종양조직을 고정시키고 파라핀 왁스에 박아넣었다. 대표적인 대면을 헤마록실린 및 에오신으로 염색하고 광학현미경으로 관찰하였다. 모세혈관의 농도 및 Wnt 발현을 정량화하기 위하여， 종양 대면을 항-마우스 CD31 IgG(BD Pharmingen) , 항- 래빗 β-카테닌 IgG Cell Signaling Technology) 또는 항—마우스 Wnt 3a IgG (Santa C마우 z BCDtechnology)로 염색하였다. 양성 면역반응은 ABC- peroxidase kits (ChemMate™DAK0 EnvisCD3™ Detec CD31kit; DAKO)를 이용하여 가시화시켰다. 이동 및 침투 분석
인 비트로 이동분석은 공지된 방법으로 실시하였다 (23). 조건을 맞춘 배지를 Wnt3a를 처리하거나 처리하니 않은 후 PBS, dEl-k35/LacZ 또는 dEl— k35/sLRP6ElE2A549로 형질전환시킨 A549 세포로부터 수득하고 아래쪽의 트랜스웰 (Transwell) 챔버에 위치시켰다. A549 세포를 위쪽 챔버 (7X104 세포 /웰)에 플레이팅하였다. 37°C에서 4시간 동안 배양하고 고정시킨 후， 헤마록실린 및 에오신으로 염색하였다. 인 비트로 매트리젤 침투 분석 (Matrigel invasion assays)은 Biocoat™ 세포이동 챔버 (cell migration chamber)를 이용하여 수행하였다. 매트리젤 기반 막 매트릭스 (37mg/f i Iter； BD Biosciences, San Jose, CA)는 필터 (8μιη 포어)로 코팅되어 있으며， 실험은 세포이동 분석과 동일하게 수행하였다.
RT( Reverse transcript ion) -PCR
요약하면， RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 총 RNA(1 g)를 분리하고, 을리고 -dT 프라이머 및 M— MLV 역전사효소 (Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR(polymerase chain react ion)은 cDNA(25 ng)를 주형으로 하여 다음의 프라이머를 이용하여 수행하였다: MMP2(matrix metal loproteinase 2)， 정방향 5' - CTCAGATCCGTGGTGAGATCT-3 ' ， 역방향 5' -CTTTGGnCTCCAGCTTCAGG-3 ' ， MMP9, 정방향 5' -ATCCAGTTTGGTGTCGCGGAGC-3 ' ， 역방향 5' -
GAAGGGGAAGACGCACAGCT-3' ， E-카드헤린， 정방향 5' - ACGATGATGTGAACACCTACA-3 ' , 역방향 5' -ATGCCATCGTTGTTCACTGCA-3 ' ， 비멘틴 (Vimentin), 정방향 5' -TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3 ' ， 역방향 5' - GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3 ' ， β-카테닌， 정방향 5' -GCTGATTTGATGGAGTTGGA- 3' ， 역방향 5' -TCAGCTACTTGTTCTTGAGTGM-3 ' ， β-액틴， 정방향 5' - CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3 ' ， 역방향 5' -GGAGCAATGATCTTGATCTT-3' . 통계적 분석
실험결과는 평균값의 표준오차 값 (SEM)으로 나타냈다. 각 그룹의 결과는 일원 분산분석 (one-way analysis of variance)을 통해 비교하였으며 , 이후 필요에 따라 단일 관찰 (unpaired observation)을 위한 post hoc Student Ds ^-test 또는 다중 비교를 위한 본페로니 교정 (Bonferroni ds correction)을 수행하였다. P < 0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 실험결과
수용성 Wnt 유인 수용체는 폐암세포에서 발현되고 Wnt3a에 결합한다 내생의 Wnt3a 수준을 여섯 개의 비소세포 폐암세포주 (A549, H322, H596, H460, H358 및 H2009)에서 웨스턴 블롯팅을 통해 측정하였다. H322, H460 및 H2009 세포주에서 다른 세포주보다 Wnt3a가 더 강하게 발현하였다 (도 lb). 따라서， 수용성 Wnt 유인 수용체 (SLRP6E1E2)가 Wnt 시그널링을 억제하는 능력을 측정하기 위하여 H322 및 H460 세포를 선택하였다. dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 A549 세포에서의 SLRP6E1E2의 발현은 항 -FLAG 및 항 -LRP6 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다 (도 lc). dE-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서의 SLRP6E1E2 분비는 용량-의존적이었다. ■
다음으로， dEl-k35/LacZ 또는 dEl-k35/sLRP6ElE2가 형질도입된 세포에서의 SLRP6E1E2와 Wnt3a의 결합올 측정하였다. 세포 파쇄물을 항- Wnt3a 또는 항 -LRP6 항체를 이용하여 면역침강시키고 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 도 Id에서 보는 바와 같이， Wnt3a 및 LRP6 단백질 수준은 dEl- k35/LacZ로 형질도입된 세포들보다 dEl-k35/sLRP6ElE2로 형질도입된 세포들에서 더 낮았다. 이는 LRP6 E1E2 도메인이 효과적으로 Wnt3a에 결합함을 시사한다 유인 ¥nt 수용체는 세포질 β-카테닌 수준 및 TCF 전사활성을 감소시킨다.
SLRP6E1E2가 Wnt3a에 결합하기 때문에， 본 발명자들은 이의 β- 카테닌에 대한 효과를 확인하기 위하여 β—카테닌 /TCF에 의하여 활성화되는 루시퍼라제 리포터 시스템을 이용하였다 (24). 도 2a에서 보는 바와 같이， Wnt3a가 없을 때 dEl-k35/LacZ 또는 dEl-k35/sLRP6ElE2로 형질도입된 A549 세포에서 루시퍼라제 활성이 낮았다. Wnt3a를 처리하자 루시퍼라제 발현이 대조군 세포에서 대략 7-8배가 증가하였으나， dEl-k35/sLRP6ElE2- 형질전환된 세포에서는 그렇지 않았다. Wnt3a를 처리하지 않았을 때， dEl- k35/LacZ 대조군에 비하여 dEl— k35/sLRP6ElE2로 형질도입된 H460 세포에서는 48%, H322 세포에서는 12%가 감소하였다 (도 2b; p<0.05). Wnt3a 의 자극은 dEl-k35/LacZ로 형질도입된 H460 세포와 H322 세포에서 루시퍼라제 활성을 각각 53% 및 102% 증가시켰다. 그러나 dEl-k35/LacZ- 형질도입된 세포와 비교했을 때 dEl-k35/sLRP6ElE2—형질도입된 H460 (48%) 및. H322 (52%) 세포의 루시퍼라제 활성은 유의하게 낮았다 (PO.05). β- 카테닌의 국지성 (localization)에 SLRP6E1E2가 미치는 영향을 조사하기 위하여， PBS를 처리하거나 dEl— k35/LacZ 또는 dEl-k35/sLRP6ElE2로 형질도입된 H322 세포에서 면역형광 염색을 실시하였다. Wnt3a를 처리하지 않은 경우， 모든 그룹에서 β-카테닌 염색은 일차적으로 세포간 접촉부위에서만 일어났다. Wnt3a로 자극을 준 경우， 대조군 세포 (PBS 및 dEl-k35/LacZ)들은 원형질 막， 특히 세포간 연접부 (cellcell junction)에서의 β-카테닌 국지성이 감소하였으며, 세포질과 핵에서의 β- 카테닌 수준이 증가하였다.
반대로， dEl-k,35/sLRP6ElE2-형질도입 세포들은 세포질에서 더 낮은 β-카테닌 수준을 보였으며, 막에서의 β_카테닌 수준은 더 높았다 (도 2c). 이러한 기능연구의 결과는 SLRP6E1E2 및 Wnt 간의 상호작용이 Wnt 시그널링을 차단하기에 층분하다는 것을 시사한다. 유인 Wnt 수용체 SLRP6E1E2는 폐암세포 증식을 억제한다.
Wnt 기작은 증식을 비롯한 방대한 범위의 세포기능을 조절한다 (25). 인 트로에서 A549 및 H322 세포의 증식에 SLRP6E1E2가 미치는 영향올 조사하기 위하여， 세포들올 PBS로 처리하거나 dEl-k35/LacZ 또는 dEl- k35/sLRP6ElE2로 형질도입하였다. 72시간 후 dEl— k35/sLRP6ElE2(20 M0I)로 형질도입한 뒤, 세포증식은 dEl-k35/LacZ로 형질도입한 대조군에 비하여 A549 세포에서 39%， H322 세포에서 51% 감소하였다. Wnt3a에 의한 자극은 대조군 세포의 증식을 대략 10—20% 증가시켰으나， dElᅳ k35/sLRP6ElE2- 형질도입된 세포에는 영향을 미치지 않았다. 증식은 dEl-k35/LacZ- 형질도입된 경우보다 dEl— k35/sLRP6ElE2-형질도입된 경우에 A549 세포에서 54%, H322 세포에서 61% 감소하였다 (/ ).001 도 3a).
SLRP6E1E2의 항 -증식 작용과 관련된 시그널링 경로를 조사하기 위하여， 본 발명자들은 이것이 Wnt 시그널링에 대한 미치는 영향을 검사하였다. 도 3b에서 보는 바와 같이， 대조군 세포 (PBS and dEl— k35/LacZ)에서의 Dvl2 및 Axin의 단백질 수준은 에 Wnt3a에 의하여 ¬¬증가하였으나， dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서는 Wnt3a에 의한 변화가 없었다. 유사하게， 사이클린 D1 발현은 Wnt3a 처리 후 대조군 세포에서 조금 증가하였으나， dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서는 조금 감소하였다. Wnt3a 처리 후 GSK3 수준도 역시 조금 증가하였다.
Wnt는 ERK 및 PI3K-Akt 경로를 활성화시킴으로써 세포증식에 중요한 역할을 한다 (26). 따라서 본 발명자들은 H460 세포에서 SLRP6E1E2가 이들 경로를 억제할 수 있는지를 조사하였다. 그 결과， clEl-k35/sLRP6ElE2- 형질전환 세포에서 대조군 세포보다 MEK, ERK1/2 및 survivin의 기저 수준보다 낮음을 발견하였다 (도 3c). 이들 단백질은 Wnt3a 처리에 의해 증가하기는 했으나, dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포는 대조군 세포에 비하여 여전히 매우 낮은 수준이었다. niTOR, PI3 및 Akt의 발현은 Wnt3a 에 의해 영향을 받지 않으며, 대조군보다 dEl— k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서 더 낮았다. 이들 결과를 종합하면， SLRP6E1E2는 MEK-ERK 및 PI3K- Akt 경로를 통해 Wnt 시그널링을 억제함으로써 항 -증식 작용을 함을 알 수 있다.
유인 Vint SLRP6E1E2수용체는 세포사멸을 유도한다
Wnt 시그널링은 아품토시스를 억제하고 세포 증식 및 생존을 촉진한다 (27). SLRP6E1E2가 비소세포 폐암의 증식을 억제하는 분자 메카니즘을 조사하기 위하여， 본 발명자들은 SLRP6E1E2가 세포사멸 (apoptosis)에 미치는 영향을 조사하였다. dEl— k35/sLRP6ElE2 형질도입 3일 후에， A549, H1299 및 H358 세포들이 배양접시에서 점차적으로 분리되고， 부착된 세포들보다 더 등글고 작아짐을 관찰하였다 (도 4a). 이는 SLRP6E1E2가 아품토시스를 유도함을 말해준다. 아톱토시스의 증거는 핵의 세포고사 소체 (apoptotic body)를 탐색함으로써 수집하였으며 (데이터 없음)， 뉴클레오좀간 DNA 절편화 (internucleosomal DNA fragment at ion)를 검출하는 TUNEL 분석을 통해 측정하였다 (28). 도 4b에서 보는 바와 같이, Wnt3a의 존재 또는 부재 하에서， 대조군 세포에서보다 dEl-k35/sLRP6ElE2—형질도입 세포에서 더 많은 TUNEL-양성 세포가 관찰되었다. TUNEL 염색의 정량화 결과로부터 dEl-k35/LacZ- 형질도입 대조군 세포에서보다 dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서 아픕토시스 비율이 대략 1.9배 (Wnt3a 미처리) 및 2.^fl(Wnt3a 처리) 더 높다는 사실을 확인하였다 6«;0.001) (도 4c). 본 발명자들은 카스파아제 패밀리 및 사이트크롬 c가 가장 잘 알려져있는 아픕토시스의 조절자들을 측정하였다. Wnt3a의 존재 또는 부재하에서， dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서의 전장 116-kDa PARP 단백질은 감소하고 85-kDa 절단 단편들은 증가하였다 (도 4d). 카스파아제 -3의 절단 (활성화)된 형태도 SLRP6E1E2에 의하여 크게 증가하였다. 도 4e에서 보는 바와 같이， c!El-k35/sLRP6ElE2- 형질전환 세포도 증가된 세포질 사이토크름 c 및 감소된 마이크로좀 사이토크롬 c 수준을 보였다. Wnt3a에 의한 자극도 유사한 효과를 나타냈다. 사이토크롬 c의 국지성을 보다 심도있게 조사하기 위하여, 면역형광분석을 실시하였다. PBS-처리 및 dEl-k35/LacZ-형질도입 세포는 세포질 사이토크름 c 염색을 보여 미토콘드리아 위치와 일치하였다. 반대로 SLRP6E1E2를 분비하는 세포는 확산된 세포질 사이토크롬 c 염색결과를 보여 미토콘드리아에서 세포질로의 이동과 일치된 결과를 보였다 (도 4f). 유인 fnt 수용체 SLRP6E1E2는 이종이식 종양의성장을 억제한다 본 발명자들은 SLRP6E1E2가 마우스 이종이식 모델에서 종양의 성장을 억제하는 능력을 측정하였다. 종양은 H460 세포를 누드마우스의 복부에 피하주사함으로써 형성시켰다. 종양의 평균 크기가 80-100 讓 3에 도달한 후 1, 3 및 5일 째에 PBS, dEl-k35, RdB-k35, dEl-k35/sLRP6ElE2 또는 RdB- k35/sLRP6ElE2를 주입하였다. 도 5a는 SLRP6E1E2-발현백터를 주입한 종양의 부피가 대조군에 비하여 유의하게 감소함을 보여준다. 25일 후에， PBS를 처리한 종양은 3883.1 ±418.08 隱 3의 평균부피에 도달하였으며， dEl-k35 및 RdB-k35를 처리한 종양은 각각 3388.1 ±226.9 mm3 및 1991 ±311.8 画 3에 도달하였다'. 반대로， 종양의 성장은 dEl-k35/sLRP6ElE2 (1645.3±353.6 mm3 PBS 또는 dEl-k35 그룹과 비교시 ).05) 또는 RdB- k35/sLRP6ElE2(923.3±180.4 画 3 PBS 또는 RdB-k35 그룹과 비교시 0.01)를 투여한 마우스에서 크게 감소하였다.
종양조직에서 SLRP6E1E2의 생물학적 효과를 조사하기 위하여， 마지막 아데노바이러스 주입 3일 후 종양을 채취하였다. 아데노바이러스 E1A 단백질 발현의 분석을 통해 RdB-k35 및 RdB-k35/sLRP6ElE2가 복제되어 종양 전체에 퍼져있음을 확인하였다 (도 5b, E1A). SLRP6E1E2의 면역조직화학 분석결과 (도 5b, FLAG) , RdB-k35/sLRP6ElE2-처리 종양에서 SLRP6E1E2이 보다 널리 퍼져있음을 확인함으로써 종양 아데노바이러스가 복제불능 아데노바이러스에 비하여 보다 효율적으로 SLRP6E1E2를 발현하여 보다 우수한 항 -종양 효과를 발휘함을 알 수 있었다. 이종이식 H460에서의 SLRP6E1E2-발현백터의 항—증식 및 세포사멸 효과
SLRP6E1E2의 마우스 이종이식 종양 성장에 대한 효과를 조사하기 위하여， 종양 샘플에서 Ki-67 면역염색으로 증식 세포를， TUNEL 염색으로 사멸세포를 분석하였다. 그 결과， 대조군에 비하여 dEl-k35/sLRP6ElE2 또는 RdB-k35/sLRP6ElE2 처리 종양에서 Ki-67 발현은 감소하고 TUNEL—양성 세포는 증가함을 확인하였다 (도 5c). 본 발명자들은 dEl— k35/sLRP6ElE2- 처리 종양에서보다 RdB-k35/sLRP6ElE2-처리 종양에서 더 많은 TUNEL-양성 세포를 검출하였으며， 이는 이전의 결과와 일치하는 것이다. SLRP6E1E2- 처리 종양에서 혈관신생이 감소되는지 여부를 확인하기 위하여, 모세혈관 밀도를 CD31 염색으로 측정하였다. 종양 아데노바이러스 (RdB-k35 및 RdB- k35/sLRP6ElE2)가 주입된 조직에서 PBS—처리 종양보다 더 적은 내피세포 및 혈관조직이 관찰되었으나 (/¾：0.05)， dEl-k35 또는 dEl— k35/sLRP6ElE2가 주입된 종양에서 혈관 밀도의 변화는 없었다 (도 5d 및 5e). 나아가， SLRP6E1E2-발현 아데노바이러스가 주입된 종양에서의 혈관 밀도는 대조군과 차이가 없어 SLRP6E1E2의 항종양 효능은 항-혈관신생 효과에 의해 매개되는 것이 아님을 보여준다.
SLRP6E1E2—발현 아데노바이러스의 항종양 작용에서의 Wnt 시그널링의 역할을 보다 자세히 조사하기 위하여, 종양조직에서의 Wnt 및 β-카테닌 위치를 측정하였다. PBS 또는 대조군 백터 (dEl-k35 and RdB— k35)를 처리한 종양에서 β-카테닌 및 Wnt의 높은 내재적 분비를 관찰하였으나 (도 5f), SLRP6E1E2-발현 백터에서는 유의하게 감소하였다. 이로써 종양세포에서의 Wnt 시그널링의 차단이 종양 성장을 지연시키는 중요한 인자라는 것을 알 수 있다.
Wnt 처리는세포의 외형을 변화사키고 종양세포의 EMT를 유도한다 EMT는 종양 발달에서 중요한 과정이며, Wnt Λβ—카테닌 신호 경로는 이 과정에서 중요한 역할을 한다. 이에， 본 발명자들은 Wnt3a가 종양세포에서 EMT를 유도하는지 여부를 조사하였다. 그 결과， Wnt3a 처리 1일 후에 세포가 연장되어 중간엽 세포의 형상과 유사하게 스핀들 (spindle) 형상이 된다는 사실을 확인하였다 (도 6a). 본 발명자들은 또한 중간엽 마커인 Vimentin 및 β-카테닌의 발현이 증가하고, 이에 수반하여 상피 마커인 Ε-카드헤린이 증가한다는 사실을 관찰하였다 (도 6b). 면역형광 염색결과 Wnt3a 처리 후 세포간 접촉부에서 사이토케라틴 및 E-카드헤린 수준이 극적으로 감소하였음을 확인하였다 (도 6c).
SLRP6E1E2는 EMT-관련마커 발현 및 MMP-2/MMP-9활성을조절한다 암세포에 의한 이동 특성의 획득은 전이 종양세포의 전파에 중요한 요소이다 (29). Wnt3a의 증가가 운동성 및 침투성을 강화시키는 것으로 보이기 때문에， 본 발명자들은 SLRP6E1E2의 발현으로 Wnt 시그널링 경로를 방해할 경우， 인 비트로 상의 운동성 및 침투성을 억제하는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 트랜스웰 (transwell) 운동성 및 매트리젤 침투 분석 (Matrigel invasion assays)을 이용하여 A549 세포에 대한 SLRP6E1E2의 영향을 조사하였다. Wnt3a 처리하거나 처리하지 않은 후에， PBS—처리， dEl- k35/LacZ-형질도입 및 dEl-k35/sLRP6ElE2ᅳ형질도입 세포로부터 조건이 조절된 배지를 수집하였다.. dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서 수득한 조절배지는 dEl-k35/LacZ-형질도입 세포로부터 수득한 조절배지에 비하여 이동성을 12.4%(Wnt3a 미처리) 및 23.8%(Wnt3a 처리) 감소시켰다 (/ ).001) (도 7a). 유사하게， dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서 수득한 조절배지는 dEl-k35/LacZ-형질도입 세포로부터 수득한 조절배지에 비하여 침투성을 34.2%(Wnt3a 미처리) 및 56.2¾»(Wnt3a 처리) 감소시켰다 (도 7b). E-카드헤린 발현 및 액틴 필라민트 역시 Wnt3a에 의하여 감소하였으나， dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서는 Wnt3a를 처리하거나 처리하지 않은 대조군에 비하여 증가하였다 (도 7c).
악성이 된 세포의 침투 및 전이 과정은 匪 P(matrix metalloproteinase)에 의한 세포외 매트릭스의 분해가 관여한다. 이에 본 발명자들은 혈관신생， 종양성장 및 전이에서 중요한 역할을 하는 讓 P-2 및 醒 P-9의 발현에 SLRP6E1E2가 미치는 영향올 조사하였다. 도 7d에서 보는 바와 같이， Wnt3a의 처리는 PBS-처리 및 dEl-k35/LacZ-형질도입 A549 세포에서 匪 P-2 및 腿 P-9를 증가시켰으나， Wnt 3a를 처리하거나 처리하지 않은 dEl-k35/sLRP6ElE2-형질도입 세포에서는 fflP— 2 및 丽 P-9의 발현량이 낮았다. 이들 결과를 종합할 때， SLRP6E1E2는 인간 비소세포 폐암 세포주에서 다중의 Wnt-관련 경로에 영향을 줌으로써 세포 침투성을 감소시키는 것을 알수 있다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참고문헌
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Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
서열목록 제 2서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
[청구항 2】
서열목록 제 2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
【청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 게 1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서， 상기 뉴클레오타이드 서열은 유전자 전달체 (gene delivery system)에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5】
제 4 항에 있어서， 상기 유전자 전달체는 플라스미드， 재조합 아데노바이러스， 아데노 -관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스， 렌티바이러스， 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스， 미즐스 바이러스, 폭스 바이러스, 셈리키 포리스터 바이러스， 폴리머， 나노물질, 리포좀 또는 니오좀인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
제 5 항에 있어서， 상기 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스 백터인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 7】
제 6 항에 있어서， 상기 재조합 아데노바이러스 백터는 E1B 및 E3 영역이 결실된 것이고， 상기 서열목록 게 1서열의 뉴클레오타이드 서열은 E1B 또는 E3 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8]
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9】
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서 상기 조성물은 암세포에서의 Wnt 시그널링 기작의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10]
제 9 항에 있어서 상기 조성물은 서열목록 제 2서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 Wnt 3a 단백질에 결합함으로써 암세포에서의 Wnt 시그널링 기작의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 111
서열목록 게 2서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 약제학적 유효량을 포함하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법 .
【청구항 12]
서열목록 제 2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 약제학적 유효량을 포함하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료 방법 .
【청구항 13】
제 12 항에 있어서， 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 게 1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 14】
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서， 상기 뉴클레오타이드 서열은 유전자 전달체 (gene delivery system)에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법ᅳ
【청구항 15】
제 14 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 플라스미드， 재조합 아데노바이러스, 아데노—관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스， 헤르페스 심플렉스 바이러스， 백시니아 바이러스, 미즐스 바이러스， 폭스 바이러스， 셈리키 포리스터 바이러스， 폴리머， 나노물질， 리포좀 또는 니오좀인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 16]
제 15 항에 있어서， 상기 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스 백터인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 17】
제 16 항에 있어서， 상기 재조합 아데노바이러스 백터는 E1B 및 E3 영역이 결실된 것이고， 상기 서열목록 게 1서열의 뉴클레오타이드 서열은 E1B 또는 E3 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 18】
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서， 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 19]
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서， 상기 조성물은 암세포에서의 Wnt 시그널링 기작의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 20】
제 19 항에 있어서， 상기 조성물은 서열목록 제 2서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 fct 3a 단백질에 결합함으로써 암세포에서의 Wnt 시그널링 기작의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
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