WO2013002484A1 - 복제효소 인산화를 조절하는 신규 c형 간염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

복제효소 인산화를 조절하는 신규 c형 간염 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel hepatitis C preventive or therapeutic composition that effectively inhibits the replication of the virus by regulating the stability and activity of the kinase involved in the replication enzyme phosphorylation of hepatitis C virus.
  • Hepatitis C virus is the main pathogen for hepatitis other than hepatitis A and B. More than 170 million people around the world are chronically infected with HCV. Long-term HCV infection leads to chronic hepatitis and can lead to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Moreover, concurrent administration of IFN- ⁇ injections and ribavirin, currently standard HCV therapy, is of limited use due to severe side effects. In addition, IFN- ⁇ is effective in less than 50% of genotype 1 HCV-infected patients. Therefore, various treatment options are being studied to develop effective and specific treatments with minimal toxicity.
  • HCV has a positive sense single stranded RNA genome of approximately 9.6 kb, which has one long open reading frame (ORF) with untranslated regions (UTRs) at the 5 'and 3' ends. It consists of.
  • the ORF encodes a single polyprotein that is processed by cellular and viral proteases into at least 10 functional viral proteins, including structural and nonstructural proteins.
  • the 65-kDa size HCV NS5B protein with RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) activity is an essential enzyme for HCV RNA replication.
  • PRK2 protein kinase C-related kinase 2
  • Heat shock protein 90 (Hsp90), on the other hand, exhibits additional functions while interacting with various cellular client proteins to protect them from proteasome degradation. Hsp90 has also been identified as an essential host-factor in the maturation of viral proteins. Recently, it has been demonstrated that Hsp90 forms a trimer with the cyclophilin family immunophilins HCV NS5A and FKBP9 to regulate HCV RNA replication.
  • Hsp90 inhibitors analogs of the benzoquinone ansamycin antibiotic geldanamycin, 17-allyaminogeldanamycin (17-AAG) and 17-DMAG (17- (dimethylaminoethylamino) -17-demethoxygeldanamycin), were used for cell-based assays using HCV replication.
  • human liver transplantation trans -humanized liver HCV infected was shown to inhibit HCV replication in the chimeric mice.
  • Hsp90 helps fold various client proteins.
  • One such prospective client is 3-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1).
  • PDK1 stabilization regulation by Hsp90 inhibition is cell dependent.
  • PDK1 is a high kinase of PRK2 and PRK2 is a cellular kinase capable of performing HCV NS5B phosphorylation, from which the Hsp90 inhibition influences the phosphorylation of NS5B protein, thereby inhibiting HCV replication.
  • the present invention was completed by analyzing whether or not to cause an effect.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating hepatitis C comprising a compound represented by the following formula (1):
  • Ar 1 is aryl or nitrogen-containing heteroaryl having 5 to 24 carbon atoms, or nitrogen-containing substituted heterocycle having 3 to 12 carbon atoms,
  • R 1 is alkyl having 1 to 10 carbon atoms substituted with -NH- (O)-or nitrile
  • Ar 2 is 5 to 24 carbon atoms unsubstituted or substituted with cycloalkyl having 3 to 12 carbon atoms, nitrogen-containing substituted heterocycle having 3 to 12 carbon atoms, nitrogen-containing heteroaryl having 5 to 24 carbon atoms, and aryl having 5 to 24 carbon atoms.
  • the present invention finds that inhibition of hepatitis C virus replication by PDK1-PRK2 signaling pathway through Hsp90 inhibition results in treatment of novel PRK2 inhibitors and / or Hsp90 inhibitors to prevent hepatitis C, particularly interferon-insensitive hepatitis C. It can be effectively prevented or treated.
  • FIG. 1 shows a tertiary structural model (A) of PKR2 through structural modeling and a structure (B) in which Y27632 is docked to the structure.
  • Figure 2 illustrates a novel PRK2 inhibitor of the present invention.
  • Figure 3 shows the anti-HCV activity of the novel PRK2 inhibitor of the present invention
  • A is a PRK2 phosphorylation inhibitory effect of 17 PRK2 activity inhibitor candidates selected through structural modeling
  • B is a selected PRK2 inhibitor (# 10, # 11, # 12, # 13 and # 17) effect on HCV NS5B protein expression
  • C shows the intracellular HCV RNA content following treatment with selected PRK2 inhibitors (# 11 and # 17).
  • FIG. 4 shows cytotoxicity results according to the novel PRK2 inhibitor treatment of the present invention in R-1 cells (A) and Huh7 cells (B), and HCV in Huh7 cells (D) infected with R-1 cells (C) and HCV. RNA replication inhibitory effect is shown.
  • Figure 5 shows the inhibitory effect of in vitro phosphorylation of NS5B protein according to the novel PRK2 inhibitor treatment of the present invention.
  • Figure 6 shows the effect on HCV RNA replication of the novel PRK2 inhibitor, # 17 compound derivatives of the present invention.
  • Figure 7 shows the inhibitory effect of in vitro phosphorylation of NS5B by the novel PRK2 inhibitor, # 17 compound derivatives of the present invention.
  • Figure 8 shows the chemical structure of 17-DMAG (A) and the stabilization and activation state (B) of PDK1 and PRK2 following 17-DMAG treatment in Huh7 cells.
  • Figure 9 shows the anti-HCV effect of 17-DMAG
  • A is a graph showing the effect of 17-DMAG on HCV subgenomic replicon (top figure) and cell viability (bottom graph)
  • B The expression analysis of PDK1 and PRK2 in Huh7 and R-1 cells
  • C changes in protein content according to 17-DMAG treatment in R-1 cells
  • D transfection of pcDNA3.1-PRK2 by concentration After analysis of HCV genome copy number in R-1 cells treated with 17-DMAG
  • E shows the Tet-derived vector expressing the HCV NS protein (NS3-NS5B) (Hup) and Huh7TR-. Photograph (bottom photo) showing phosphorylated NS5B content following 17-DMAG or HA1077 treatment in NS cells.
  • Figure 10 shows the effect of inhibiting HCV replication according to the parallel treatment of 17-DMAG and IFN- ⁇ or HA1077, (A) 17-DMAG and / or HA1077 alone or in combination with IFN- ⁇ in R-1 cells HCV RNA content according to, (B) shows the effect of IFN- ⁇ on PDK1-PRK2 signaling pathway.
  • Figure 11 shows the anti-HCV effect of 17-DMAG in cells infected with genotype 2a HCV (JFH1), (A) intracellular HCV RNA content following 17-DAMG or IFN- ⁇ treatment in HCV infected Huh7 cells , (B) measured the change in HCV IRES activity following 17-DMAG treatment in Huh7 cells transfected with a dual luciferase reporter system (top figure) (bottom graph), (C) 17 in Huh7 cells -The results of analysis of cell cycle changes following DMAG treatment are shown.
  • JFH1 genotype 2a HCV
  • the inventors predicted PRK2 tertiary structure to discover novel PRK2 inhibitors with increased efficacy for the treatment of HCV, and used the AutoDock-4 program to find a substance that can dock to the active site of PRK2.
  • the present invention was completed by screening and discovering novel PRK2 inhibitors through docking experiments.
  • the present invention provides a compound represented by the following Chemical Formula 1 as a novel hepatitis C prophylactic or therapeutic agent:
  • Ar 1 is aryl or nitrogen-containing heteroaryl having 5 to 24 carbon atoms, or nitrogen-containing substituted heterocycle having 3 to 12 carbon atoms,
  • R 1 is alkyl having 1 to 10 carbon atoms substituted with -NH- (O)-or nitrile
  • Ar 2 is 5 to 24 carbon atoms unsubstituted or substituted with cycloalkyl having 3 to 12 carbon atoms, nitrogen-containing substituted heterocycle having 3 to 12 carbon atoms, nitrogen-containing heteroaryl having 5 to 24 carbon atoms, and aryl having 5 to 24 carbon atoms.
  • Alkyl refers to a straight or branched chain or cyclic saturated hydrocarbon having 1 to 10 carbon atoms unless otherwise stated.
  • Examples of C 1-10 alkyl groups are methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, isopropyl, isobutyl, sec-butyl and tert-butyl, isopentyl, neopentyl, isohexyl , Isoheptyl, isooctyl, isononyl and isodedecyl, but is not limited thereto.
  • Cycloalkyl unless otherwise stated, includes monocyclic and fused rings as non-aromatic, saturated hydrocarbon rings having 3 to 12 carbon atoms.
  • Representative examples of C 3-12 cycloalkyl include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and cyclooctyl.
  • Nonrogen-containing heterocycle refers to a saturated or unsaturated (but not aromatic) group having a single ring or multiple condensed rings containing from 3 to 12 carbon atoms and at least one nitrogen atom in the ring, and fused bridges and spiro rings System, and in a fused ring system, one or more rings can be cycloalkyl, aryl or heteroaryl, provided that the point of attachment is via a heterocyclic ring.
  • the nitrogen and / or sulfur atoms of the heterocyclic group are optionally oxidized to provide N-oxides, sulfinyl, and sulfonyl moieties.
  • Aryl refers to a monovalent aromatic carbocyclic group of 5 to 24 carbon atoms having a single ring (eg phenyl) or multiple condensed rings (eg naphthyl or anthryl), wherein the condensed ring is aromatic (Eg, 2-benzoxazolinone, 2H-1,4-benzoxazin-3 (4H) -one-7-yl, etc.) may or may not be, provided the point of attachment is at the aromatic carbon atom .
  • Preferred aryls include phenyl and naphthyl.
  • Heteroaryl refers to an aromatic group of 5 to 24 carbon atoms and 1 to 4 heteroatoms including at least one nitrogen atom, oxygen atom, or sulfur atom in the ring.
  • Such heteroaryl groups have a monocycle (eg pyridinyl or furyl) or multiple condensed rings (eg indolizinyl or benzothienyl), the condensed ring may or may not be aromatic and / or a heteroatom It may or may not contain, provided that the point of attachment is via an atom of an aromatic heteroaryl group.
  • the nitrogen atom of the heteroaryl group is optionally oxidized to provide an N-oxide (N ⁇ O), sulfinyl, or sulfonyl moiety.
  • Preferred heteroaryls include pyridinyl, pyrrolyl, indolyl, thiophenyl, and furanyl.
  • Heteroaryloxy refers to -O-heteroaryl and heteroaryl is as defined herein.
  • Ar 1 is aryl or nitrogen-containing heteroaryl having 6 to 10 carbon atoms, or nitrogen-containing substituted heterocycle having 6 to 10 carbon atoms,
  • R 1 is alkyl having 1 to 2 carbons substituted with -NH- (O)-or nitrile
  • Ar 2 is 6 to 10 carbon atoms unsubstituted or substituted with a cycloalkyl having 6 to 12 carbon atoms, a nitrogen-containing substituted heterocycle having 6 to 12 carbon atoms, a nitrogen-containing heteroaryl having 6 to 10 carbon atoms, and an aryl having 6 to 10 carbon atoms.
  • Heteroaryloxy containing at least one of oxygen, nitrogen, and sulfur atoms of N, or aryl having 6 to 10 carbon atoms substituted with -NH- (O) -R 2 , wherein R 2 represents alkyl having 1 to 2 carbon atoms Can be represented.
  • the compound of Formula 1 is 3-[(2-ethylbutanoyl) amino] -N- (pyridin-4-yl) benzamide (3-[(2-ethylbutanoyl) amino] -N- (pyridin 4-yl) benzamide), cyclohexanecarboxylic acid (1H-benzoimidazol-5-yl) -amide, (3r, 5r, 7r)- N- (quinolin-5-yl) adamantane-1-carboxamide ((3r, 5r, 7r) -N- (quinolin-5-yl) adamantane-1-carboxamide), 1-methyl-4-phenyl Piperidine-4-carbonitrile (1-methyl-4-phenylpiperidine-4-carbonitrile), 2-oxo-N-4-pyridinyl-3-piperidinecarboxamide (2-oxo-N-4-pyridinyl -3-piperidinecarboxamide), N- (2-oxo-
  • the compound of Formula 1 was obtained by screening a substance docked at the PRK2 active site using the FlexX-Pharm program of the Sybyl 7.2 modeling package of Tribos, and inhibits PRK2 phosphorylation by inhibiting the activity of PRK2 to prevent NS5B of hepatitis C virus. Inhibition of protein phosphorylation, and inhibition of phosphorylation of the NS5B protein is characterized in that it can be used as a prophylactic or therapeutic agent for hepatitis C because it inhibits viral replication.
  • composition for preventing or treating hepatitis C of the present invention may further include a Hsp90 (Heat shock protein 90) inhibitor.
  • Hsp90 Heat shock protein 90
  • the Hsp90 inhibitors destabilize PRK2 by inactivating Hsp90 activity and promoting degradation of the upper kinase PDK1 to reduce the phosphorylated form of PRK2.
  • the decrease in the amount and activity of PRK2 can inhibit HCV replication by inducing phosphorylation inhibition of HCV NS5B.
  • the combination of the PRK2 inhibitor and the Hsp90 inhibitor including the compound of Formula 1 may exhibit a remarkably superior therapeutic effect as compared to the case of treating them alone as a double hit strategy to inhibit hepatitis C virus replication.
  • the combination of PRK2 inhibitor and Hsp90 inhibitor has an effect similar to that of inhibiting hepatitis C virus replication by IFN- ⁇ alone treatment. Therefore, it can show an effective therapeutic effect in IFN- ⁇ non-sensitive hepatitis C patients.
  • 17-AAG (17-allyaminogeldanamycin), or 17-DMAG (17- (dimethylaminoethylamino) -17-demethoxygeldanamycin)
  • 17-AAG 17-allyaminogeldanamycin
  • 17-DMAG 17- (dimethylaminoethylamino) -17-demethoxygeldanamycin
  • the parallel administration of PRK2 inhibitor or Hsp90 inhibitor and IFN- ⁇ shows an effect of inhibiting hepatitis C virus replication by at least 90% compared to the untreated group.
  • concurrent administration of PRK2 inhibitors and Hsp90 inhibitors has shown anti-HCV efficacy equivalent to IFN- ⁇ treatment alone.
  • composition for preventing or treating hepatitis C of the present invention can be prevented or treated for hepatitis C by administering in parallel with IFN- ⁇ .
  • the PRK2 inhibitor and Hsp90 inhibitor alone and in parallel administration can effectively control viral replication.
  • composition for preventing or treating hepatitis C of the present invention may be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or media.
  • the amount of active ingredient in the above formulation is in a suitable dosage within the preferred range.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers include carriers and vehicles commonly used in the medical arts, and specifically include ion exchange resins, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (eg, human serum albumin), buffer materials (eg, Various phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), water, salts or electrolytes (e.g.
  • protamine sulfate disodium hydrogen phosphate, carbohydrogen phosphate, sodium chloride and zinc salts
  • gelatinous Silica magnesium trisilicate
  • polyvinylpyrrolidone polyvinylpyrrolidone
  • cellulosic substrates polyethylene glycols, sodium carboxymethylcellulose, polyarylates, waxes, polyethylene glycols or wool, and the like.
  • composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, an emulsifier, a suspending agent, or a preservative in addition to the above components.
  • the composition according to the invention may be prepared in an aqueous solution for parenteral administration, preferably a buffered solution such as Hanks' solution, Ringer's solution or physically buffered saline. Can be used.
  • Aqueous injection suspensions can be added with a substrate that can increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethylcellulose, sorbitol or dextran.
  • compositions of the present invention may be in the form of sterile injectable preparations of sterile injectable aqueous or oily suspensions.
  • Such suspensions may be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (eg Tween 80) and suspending agents.
  • the sterile injectable preparation may be a sterile injectable solution or suspension (eg, a solution in 1,3-butanediol) in a nontoxic parenterally acceptable diluent or solvent.
  • Vehicles and solvents that may be used include mannitol, water, Ringer's solution, and isotonic sodium chloride solution.
  • sterile, nonvolatile oils are conventionally employed as a solvent or suspending medium. For this purpose any non-irritating non-volatile oil can be used including synthetic mono or diglycerides.
  • PRK2 protein tertiary structure was predicted to find novel inhibitors of PRK2 activity with increased efficacy for HCV therapy.
  • the PRK2 tertiary structure was predicted using the Modeller program in the InsightII software package using the PKA structure with similar structure.
  • the predicted model was carried out using the Discover program until the energy gradient was less than 0.1 kcal / mol.
  • the final model was evaluated using the Profile 3D and PROCHECK programs.
  • the docking experiment was then performed using the AutoDock-4 program.
  • the final docking model was obtained using the PyMol package (http://pymol.sourceforge.net).
  • FIG. 1B shows the predicted tertiary structure of PRK2 and Y27632 docked structure showing inhibitory effect similar to that of HA1077 currently used in the clinic as a substance that inhibits PRK2 activity.
  • 17 PRK2 inhibitor candidates were obtained by screening the substances docked at the PRK2 kinase active site using the FlexX-Pharm program of the Sybyl 7.2 modeling package from Tribos.
  • R-1 cell line removes cis- acting RNA elements, structural protein coding sites of viral 5 'and 3' terminal untranslated sites (UTRs), which are essential for HCV RNA replication It consists of a selectable marker inserted to select and a nonstructural protein (NS3-NS5B) coding gene required for replication.
  • selectable markers are expressed by an internal ribosome entry site (IRES) consisting of HCV 5'-UTR and part of the core protein coding gene, a structural protein capsid protein, and HCV nonstructural proteins are constructed to be expressed by the IRES of EMCV. It is.
  • IRES internal ribosome entry site
  • HCV subgenomic replicon RNA was obtained by in vitro transcription using T7 RNA polymerase, and free ribonucleotide was removed using a spin column, followed by liver cancer cell line. Introduced via electric shock.
  • a stable cell line ie, a HCV subgenomic
  • Quantitative real-time PCR analysis using TaqMan probe confirmed the presence of about 10 7 copies / mL of HCV RNA copies. Since this R-1 cell line is a cell line in which HCV RNA replication is taking place, it can be used to evaluate the effect of inhibiting HCV replication by PRK2 activity inhibitors.
  • the R-1 cell line was treated with 5 PRK2 inhibitors selected at 20 ⁇ M final concentration, HA1077, which is currently used in clinical trials, and Y27632 compound having another PRK2 inhibitory effect for 48 hours, respectively.
  • HCV NS5B protein and HCV RNA contents from lysate (50 ⁇ g) were analyzed by Western blot analysis and real-time RT-PCR analysis.
  • RNA content was found to be dose dependently reduced (FIGS. 4C and D). It can be seen that the # 17 compound that inhibits PRK2 activity can be effectively used to inhibit HCV RNA replication, and the efficacy of the # 17 compound is slightly higher in JFH-1 infected cells than in HCV subgenomic replicon cells. there was. In addition, the selected # 17 compound did not significantly inhibit cell activity when treated with R-1 cells (A) and Huh7 (B) at a concentration of 100 ⁇ M.
  • Inhibitors # 11 and # 17 were selected using recombinant active PRK2 and purified HCV NS5B protein as substrates in the presence of gamma- 32 P ATP and 100 ⁇ M ATP. The reaction mixture was separated by SDS-PAGE (8% gel) and the result was confirmed by radioradiography (autoradiography).
  • the HCV RNA content was reduced by 50% in the cell line treated with inhibitor # 17, and 60% in the cell line treated with the inhibitor # 20, which is a derivative.
  • the known PRK2 inhibitors HA1077 and Y27632 showed inhibitory effects of 40% and 49%, respectively.
  • Inhibitor # 20, one of the derivatives of inhibitor # 17, showed the highest inhibitory activity, and the effect of HA1077 and Y27632 inhibitors in clinical trials was better than that in cell lines.
  • inhibitor # 20 showed an excellent ability to inhibit HCV replication compared to other derivatives.
  • the phosphorylated PRK2 and NS5B contents were reduced by about 80% compared to the control group.
  • Hsp90 inhibition influences the phosphorylation of HCV NS5B protein to induce HCV replication inhibitory effect.
  • Huh7 human liver cancer cell line used to test the effect of Hsp90 on HCV replication Dulbecco's modified Eagle's with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1% penicillin / streptomycin and 1% non-essential amino acids in medium (DMEM) under standard culture conditions (5% CO 2 , 37 ° C.).
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM non-essential amino acids in medium
  • Huh7TR-NS a human liver stabilizing cell line that induced the expression of HCV NS protein (NS3-NS5) by tetracycline addition, was treated with blasticidin S (10 ⁇ g / mL) and Zeocine (100 ⁇ g). / mL) was added to DMEM medium to culture the cell line.
  • NS protein expression in Huh7TR-NS was induced for 24 hours by addition of 1 ⁇ g / mL tetracycline.
  • R-1 a cell line derived from Huh7 cells that maintains stable and spontaneous replication of genotype 1b HCV subgenomic replicon RNA, has already been described.
  • IFN- ⁇ was purchased from Sigma-Aldrich (I-4276).
  • HCV RNA full length of genotype 2a HCV clone JFH1 was prepared via in vitro transcription using the MEGAscript T7 kit (Ambion, Austin, TX, USA) and introduced into the Huh7 cells by electroporation as previously described.
  • culture medium was collected 72 hours after electroshock, centrifuged at low speed to clear, then passed through a 0.45 ⁇ m-filter (Millipore, Billerica, MA, USA) before use for Huh7 cell infection. I was.
  • HCV subgenomic replicon cells or HCV infected Huh7 cells were co-treated with 17-DMAG or PRK2 inhibitor alone or IFN- ⁇ 100 IU / mL for 72 hours.
  • Cytotoxicity of 17-DMAG was determined by the MTS [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxylmethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium] reagent according to the manufacturer's instructions. Promega, Madison, Wis., USA). The experimental method is as follows.
  • Huh7 or R-1 cells (2 ⁇ 10 4 cells / well) were seeded in 96-well plates and 17-DMAG was treated for 72 hours by concentration. The culture medium was then removed and MTS substrate dissolved in culture medium containing 5% FBS was added to each well of the plate. The cells were incubated at 37 ° C. for 1 hour, and the absorbance at 490 nm was read in a 96-well microplate auto reader using the GloMax-Multi detection system (Promega).
  • Lysis Buffer A 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150
  • protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) with EDTA removed.
  • cell lysates 500 ⁇ g
  • anti-p-Ser antibody clone PSR-45; Sigma-Aldrich
  • Immunoprecipitates isolated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) were transferred to nitrocellulose membranes (Hybond-ECL; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) and immunoblotting with anti-NS5B serum.
  • HCV RNA levels were quantified by RT-PCR using TaqMan probes targeting primer pairs and sites within HCV 5′-UTR.
  • Cellular glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase was used as an internal control.
  • Analysis was performed using the DyNAmo probe 2-step qRT-PCR kit (Finnzymes, Espoo, Finland) and the CHROMO4 continuous fluorescence detector (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • CMV promoter expresses jellyfish luciferase (RLuc) reporter gene and HCV IRES dependent protein expression level can be measured by firefly luciferase (FLuc).
  • RLuc jellyfish luciferase
  • FLuc firefly luciferase
  • Dual luciferase expression vectors were constructed. Bicistronic dual luciferase vectors were transfected into Huh7 cells using Fugene HD (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). After 48 hours RLuc and FLuc activity in cell lysates were quantified using the Dual-Glo Luciferase Assay Kit (Promega) on GloMax-Multi Detection System (Promega).
  • Huh7 cells treated with 17-DMAG or HA1077 for 48 hours were collected and washed with PBS.
  • the cells were fixed with cold ethanol for 30 minutes, treated with RNase A (100 ⁇ g / mL) for 5 minutes at room temperature, and then 50 ⁇ g / mL propidium iodide (PI, Sigma-Aldrich) for 30 minutes at 37 ° C. ) And the cell cycle was analyzed using a FACS caliber flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, Calif., USA).
  • Huh7 Huh7, 17-DMAG
  • a second-generation geldanamycin derivative known to be effective for oral administration and safer than geldanamycin or its analogue 17-AAG was used.
  • FIG. 8A Huh7 cells were treated with increasing concentrations of 17-DMAG for 48 hours, and steady state levels of PDK1 were assessed by immunoblot analysis.
  • 17-DMAG inhibits viral RNA replication in R-1 cells that maintain autologous replication of genotype 1b HCV subgenomic replicon RNA.
  • an MTS assay was performed prior to assessing the antiviral activity of 17-DMAG to assess whether the drug interferes with cell viability. Specifically, R-1 cells carrying the selective HCV subgenomic replicon (top figure) and its parental cell line Huh7 were treated with a constant concentration of 17-DMAG for 72 hours and evaluated for cell viability according to MTS analysis. It was.
  • 17-DMAG did not show significant cytotoxicity against Huh7 cells at concentrations up to 500 nM ( ⁇ 15% inhibition at 500 nM).
  • anti-HCV activity of 17-DMAG at a level below 50 nM was tested in R-1 cells.
  • R-1 cells were treated with vehicle (0.25% DMSO) or 17-DMAG for 72 hours, and the content of these proteins through immunoblotting of cell lysates (50 ⁇ g) with antibodies specific for the protein. was measured.
  • Anti- ⁇ -tubulin antibody (bottom panel) was used as internal loading control. Protein content was measured according to the immunoblot concentration analysis, and the relative intensities calculated for PDK1 and PRK2 as well as their phosphorylated forms were quantified in terms of ⁇ -tubulin signal. Representative blot pictures are shown from three independent experiments showing similar results.
  • the contents of PDK1 and p-PRK2 were decreased in R-1 cells treated with 17-DMAG at a final concentration of 10 or 50 nM (FIG. 9C).
  • PRK2 stability was 17 at 50 nM concentration in R-1 cells.
  • Treatment with DMAG was not affected.
  • 17-DMAG treatment in R-1 cells effectively inhibited HCV RNA replication and showed approximately 50% inhibition at a concentration of 50 nM (FIG. 9D second bar).
  • Huh7TR-NS cells Schematic of Tet-derived vector expressing HCV NS protein (NS3-NS5B) is shown at the top of FIG. 9), where expression of HCV NS protein does not occur with viral RNA replication.
  • 17-DMAG 50 nM
  • P10 OH HA1077 20 ⁇ M
  • Proteins phosphorylated amino acid serine were immunoprecipitated from cell lysates using anti-phosphoserine antibodies. Immunoprecipitated proteins (lanes 5 to 8) and 4% of each donor cell lysate (lanes 1 to 4) were immunoblotted with purified polyclonal anti-NS5B antibody. When no inhibitor was treated, it was indicated with (-).
  • IFN- ⁇ and ribavirin are currently the standard therapy for the treatment of HCV infection.
  • 50 nM 17-DMAG and IFN- ⁇ 100 IU / in R-1 cells containing genotype 1b HCV subgenomic replicons. mL) was treated. After 72 hours, the level of HCV subgenomic replicon RNA was analyzed according to quantitative RT-PCR.
  • the HCV RNA content decreased by about 80% when treated with 100 IU / mL IFN- ⁇ alone, while about 100 times viral RNA when co-treated with IFN- ⁇ 50 nM 17-DMAG. A reduction was induced.
  • the combination of HA1077 (20 ⁇ M) and IFN- ⁇ (100 IU / mL) also enhanced the anti-HCV activity of IFN- ⁇ .
  • a dual reporter assay was performed.
  • Huh7 cells were transfected with dual reporter assay plasmids (FIG. 11B, top figure) and 17-DMAG was treated for 72 hours by concentration.
  • the dual luciferase reporter consists of the CMV promoter, the firefly luciferase, the N-terminal part of the core-coding region constituting the HCV IRES together with the HCV 5'-UTR, and the HCV 3'-UTR sequentially from the 5 'end. have.
  • the levels of firefly luciferase (cap-dependent translation) and jellyfish luciferase (HCV IRES mediated translation) are measured via dual luciferase assays and are expressed relative to the percentage of DMSO treated controls (first bar). Three independent experiments were performed three times. Data is presented as mean ⁇ standard deviation of three experiments.
  • 17-DMAG did not affect HCV IRES mediated translation.
  • Huh7 cells were treated with DMSO (0.25%) or 500 nM 17-DMAG for 48 hours, the cell cycle was analyzed using a flow cytometer and the percentages of G1, S, and G2 / M phase cells were shown.
  • PI3K inhibitor LY294002 was used as a positive control.
  • Huh7 cells treated with 500 nM 17-DMAG did not significantly alter the cell cycle
  • LY294002 a PI3 kinase inhibitor used as a positive control in the assay, predicted cells in G1-phase as expected. Are arrested.
  • the present invention provides a new mechanism for how HCV replication is regulated by Hsp90 inhibition.
  • 17-DMAG an Hsp90 inhibitor
  • This demonstrates the important role of Hsp90 in the regulation of HCV NS5B phosphorylation by PDK1-PRK2 signaling pathway.
  • the PDK1-PRK2 pathway is a target for potential anti-HCV drugs. Therefore, concurrent administration of inhibitors targeting PDK1 or PRK2 or inhibitors targeting these kinases may be an effective treatment for HCV.
  • a strategy of inducing destabilization and inactivation of PDK1 and / or PRK2 to inhibit HCV viral genome replication will provide successful HCV therapy.
  • the present invention can be used as a prophylactic or therapeutic agent for hepatitis C, in particular interferon non-sensitive hepatitis C.

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Abstract

본 발명은 복제효소 인산화를 조절하는 신규 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 구조모델링을 통해 발굴된 신규한 PRK2 저해제를 통해 C형 간염을 예방 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라 Hsp90 저해제를 병행투여 함으로써 C형 간염, 특히 인터페론 비감수성 C형 간염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

복제효소 인산화를 조절하는 신규 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 C형 간염바이러스의 복제효소 인산화에 관여하는 인산화효소의 안정성과 활성을 조절하여 효과적으로 바이러스의 복제를 억제하는 신규 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)는 A형 및 B형 이외의 간염에 대한 주요 병인균이다. 전세계 1억 7천만 명 이상의 사람들이 HCV에 만성적으로 감염되어 있다. 장기간 HCV 감염은 만성 간염에 이르며, 간경화 및 간세포성 암종을 유발할 수 있다. 더욱이, 현재 표준 HCV 치료법인 IFN-α 주사제 및 리바비린의 병행투여는 심각한 부작용으로 인해 사용이 제한적이다. 또한, IFN-α는 유전형 1 HCV-감염된 환자들의 50% 미만 정도에서 효과가 있다. 그러므로, 최소한의 독성을 지니며 효과적이고 특이적인 치료법을 개발하기 위한 다양한 치료 옵션들이 연구되고 있는 중이다.
HCV는 대략 9.6kb의 양성 센스 단일가닥 RNA 게놈을 가지고 있으며, 상기 게놈은 5' 및 3' 말단에 비번역 부위(untranslated region, UTRs)를 가진 한 개의 긴 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)으로 구성되어 있다. 상기 ORF는 세포성 및 바이러스성 프로테아제에 의해 구조 단백질 및 비구조 단백질을 포함하여 적어도 10개의 기능성 바이러스 단백질로 프로세스되는 단일 폴리단백질을 코딩한다. RdRp(RNA-dependent RNA polymerase) 활성을 지닌 65-kDa 크기의 HCV NS5B 단백질은 HCV RNA 복제에 필수적인 주 효소이다.
선행 연구에 따르면, 바이러스 RNA 복제효소는 PRK2(protein kinase C-related kinase 2)에 의해 인산화되고, PRK2 저해제에 의한 PRK2 활성 억제는 HCV 복제를 효과적으로 억제하는 것으로 밝혀져 있다.
한편, 열충격 단백질 90(Heat shock protein 90, Hsp90)은 다양한 세포성 클라이언트 단백질들과의 상호작용을 통해 프로테아좀 분해로부터 그들을 보호함과 동시에 부가 기능들을 나타낸다. Hsp90은 또한 바이러스 단백질의 성숙 시 필수 숙주-인자인 것으로 확인되었다. 최근에, Hsp90이 HCV RNA 복제를 조절하기 위해 사이클로필린 패밀리 이뮤노필린인 HCV NS5A 및 FKBP9과 삼합체를 형성함이 입증되었다. 더욱이, Hsp90 저해제로, 벤조퀴논 안사마이신 항생물질 겔다나마이신의 유사체인 17-AAG(17-allyaminogeldanamycin) 및 17-DMAG(17-(dimethylaminoethylamino)-17-demethoxygeldanamycin)이 HCV 복제를 이용한 세포 기반 분석과 인간의 간이 이식된(trans-humanized liver) HCV 감염된 키메라 쥐에서 HCV 복제를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 현재 HCV 복제에서 Hsp90의 정확한 역할은 알려져 있지 않다. Hsp90은 다양한 클라이언트 단백질의 폴딩을 돕는다. 상기 예상되는 클라이언트 중 하나는 PDK1(3-phosphoinositide-dependent kinase-1)이다. 그러나, PDK1의 불안정화가 유방암 세포주에서는 발견되지 않는데, 이는 Hsp90 억제에 의한 PDK1 안정화 조절이 세포 의존적으로 달라짐을 시사하는 것이다.
따라서, PDK1은 PRK2의 상위 키나아제이며, PRK2는 HCV NS5B 인산화를 수행할 수 있는 세포성 키나아제임이 본 발명자들에 의해 입증된바, 이로부터 Hsp90 억제가 NS5B 단백질의 인산화에 영향을 미쳐 HCV 복제에 억제 효과를 유발할지 여부를 분석하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 효능이 우수한 신규 PRK2 저해제를 발굴하고, Hsp90 억제를 통한 C형 간염바이러스 복제 억제 효과를 확인함으로써 이들을 이용한 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2012003102-appb-I000001
상기 식에서,
Ar1은 탄소수 5 내지 24의 아릴 또는 질소-함유 헤테로아릴, 또는 탄소수 3 내지 12의 질소-함유 치환 헤테로고리이고,
R1은 -NH-(O)- 또는 나이트릴로 치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬이며,
Ar2는 탄소수 3 내지 12의 시클로알킬, 탄소수 3 내지 12의 질소-함유 치환 헤테로고리, 탄소수 5 내지 24의 질소-함유 헤테로아릴, 탄소수 5 내지 24의 아릴로 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 24의 산소, 질소 및 황 원자 중 적어도 하나를 함유하는 헤테로아릴옥시, 또는 -NH-(O)-R2로 치환된 탄소수 5 내지 24의 아릴이고, 여기서, R2는 탄소수 1 내지 10의 알킬을 나타낸다.
본 발명은 Hsp90 저해를 통해 PDK1-PRK2 신호전달경로에 의한 C형 간염바이러스의 복제를 억제함을 발견함으로써 신규 PRK2 저해제 및/또는 Hsp90 저해제를 처리하여 C형 간염, 특히 인터페론 비감수성 C형 간염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 구조모델링을 통한 PKR2의 3차 구조 모델(A)과 상기 구조에 Y27632가 도킹된 구조(B)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 신규 PRK2 저해제를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 신규 PRK2 저해제의 항-HCV 활성을 나타낸 것으로, (A)는 구조모델링을 통해 선발된 17개 PRK2 활성 저해제 후보물질의 PRK2 인산화 저해 효과, (B)는 선택된 PRK2 저해제(#10, #11, #12, #13 및 #17)의 HCV NS5B 단백질 발현에 미치는 효과, (C)는 선택된 PRK2 저해제(#11 및 #17) 처리에 따른 세포내 HCV RNA 함량을 나타낸 것이다.
도 4는 R-1 세포(A)와 Huh7 세포(B)에서 본 발명의 신규 PRK2 저해제 처리에 따른 세포독성 결과와, R-1 세포(C) 및 HCV로 감염된 Huh7 세포(D)에서의 HCV RNA 복제 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 신규 PRK2 저해제 처리에 따른 NS5B 단백질의 인 비트로 인산화의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 신규 PRK2 저해제, #17 화합물 유도체들의 HCV RNA 복제에 대한 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 신규 PRK2 저해제, #17 화합물 유도체들에 의한 NS5B의 인 비트로 인산화의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 17-DMAG의 화학 구조(A) 및 Huh7 세포에서 17-DMAG 처리에 따른 PDK1 및 PRK2의 안정화 및 활성화 상태(B)를 나타낸 것이다.
도 9는 17-DMAG의 항-HCV 효과를 나타낸 것으로, (A)는 HCV 서브게놈 레플리콘(상단 도면)과 세포 생존능에 대한 17-DMAG의 효과를 나타내는 그래프(하단 그래프), (B)는 Huh7 및 R-1 세포에서 PDK1 및 PRK2의 발현 분석 결과, (C)는 R-1 세포에서 17-DMAG 처리에 따른 단백질의 함량 변화, (D)는 pcDNA3.1-PRK2를 농도 별로 트렌스팩션 시킨 후 17-DMAG를 처리한 R-1 세포에서의 HCV 게놈 카피수를 분석한 결과, (E)는 HCV NS 단백질(NS3-NS5B)의 발현하는 Tet-유도 벡터(상단 도면)와, Huh7TR-NS 세포에서 17-DMAG 또는 HA1077 처리에 따른 인산화된 NS5B 함량을 나타내는 사진도(하단 사진)이다.
도 10은 17-DMAG 및 IFN-α 또는 HA1077의 병행처리에 따른 HCV 복제 억제 효과를 나타낸 것으로, (A)는 R-1 세포에서 17-DMAG 및/또는 HA1077 단독 처리 또는 IFN-α와 병행처리에 따른 HCV RNA 함량이고, (B)는 PDK1-PRK2 신호전달경로에 IFN-α가 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 유전자형 2a HCV(JFH1)로 감염시킨 세포에서 17-DMAG의 항-HCV 효과를 나타낸 것으로, (A)는 HCV 감염된 Huh7 세포에서 17-DAMG 또는 IFN-α 처리에 따른 세포내 HCV RNA 함량, (B)는 듀얼 루시퍼라아제 리포터 시스템(상단 도면)을 트랜스팩션 시킨 Huh7 세포에서 17-DMAG 처리에 따른 HCV IRES 활성의 변화를 측정한 결과(하단 그래프), (C)는 Huh7 세포에서 17-DMAG 처리에 따른 세포주기의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 HCV 치료제로 사용할 수 있는 효능이 증가된 신규 PRK2 활성저해제를 발굴하기 위하여 PRK2 3차 구조를 예측하고, AutoDock-4 프로그램을 사용하여 PRK2의 활성 부위에 도킹(docking)할 수 있는 물질을 스크리닝하고 도킹실험을 통해 신규 PRK2 활성저해제를 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 신규한 C형 간염 예방 또는 치료제로서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2012003102-appb-I000002
상기 식에서,
Ar1은 탄소수 5 내지 24의 아릴 또는 질소-함유 헤테로아릴, 또는 탄소수 3 내지 12의 질소-함유 치환 헤테로고리이고,
R1은 -NH-(O)- 또는 나이트릴로 치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬이며,
Ar2는 탄소수 3 내지 12의 시클로알킬, 탄소수 3 내지 12의 질소-함유 치환 헤테로고리, 탄소수 5 내지 24의 질소-함유 헤테로아릴, 탄소수 5 내지 24의 아릴로 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 24의 산소, 질소 및 황 원자 중 적어도 하나를 함유하는 헤테로아릴옥시, 또는 -NH-(O)-R2로 치환된 탄소수 5 내지 24의 아릴이고, 여기서, R2는 탄소수 1 내지 10의 알킬을 나타낸다.
본 발명의 화합물의 치환체 정의에 사용된 용어는 하기와 같다.
"알킬"은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 1 내지 10의 직쇄 또는 분지쇄 또는 고리형의 포화 탄화수소를 가리킨다. C1-10 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 이소헥실, 이소헵틸, 이소옥틸, 이소노닐 및 이소데실이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
"시클로알킬"은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 3 내지 12의 비방향족, 포화 탄화 수소환으로서 단일환 및 융합환을 포함한다. C3-12 시클로알킬의 대표적 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
"질소-함유 헤테로고리"는 3 내지 12개의 탄소 원자 및 환 내에 질소 원자를 적어도 하나 포함하는 단일 환 또는 다중 축합 환을 갖는 포화 또는 불포화(방향족은 아님) 기를 언급하며, 융합된 브릿지 및 스피로 환 시스템일 수 있고, 융합된 환 시스템에서, 하나 이상의 환은 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있고, 단, 부착 지점은 헤테로고리 환을 통한다. 한 구체예에서, 헤테로고리 기의 질소 및/또는 황 원자는 선택적으로 산화되어 N-옥시드, 술피닐, 및 술포닐 부분을 제공한다.
"질소-함유 치환 헤테로고리"는 알킬, 치환 알킬, 옥소 (=0), 티옥소 (=S), 알콕시, 치환 알콕시, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환 아미노, 아미노아실, 아릴, 치환 아릴, 아릴옥시, 치환 아릴옥시, 시아노, 할로겐, 히드록시, 니트로, 카르복실, 카르복실 에스테르, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로고리, 치환 헤테로고리, -SO2-알킬 및 -SO2-시클로알킬로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 내지 5개의 치환기를 갖는 상기 질소-함유 헤테로고리를 언급한다.
"아릴"은 단일 환(예를 들어, 페닐) 또는 다중 축합 환(예를 들어, 나프틸 또는 안트릴)을 갖는 5 내지 24개의 탄소 원자의 1가의 방향족 카르보고리 기를 언급하며, 축합 환은 방향족(예를 들어, 2-벤족사졸리논, 2H-1,4-벤족사진-3(4H)-온-7-일 등)일 수도 또는 아닐 수도 있으며, 단, 부착 지점은 방향족 탄소 원자에 있다. 바람직한 아릴은 페닐 및 나프틸을 포함한다.
"헤테로아릴"은 환 내에 적어도 하나의 질소 원자, 산소 원자, 또는 황 원자를 포함하는 탄소수 5 내지 24의 탄소 원자 및 1 내지 4개의 헤테로원자의 방향족 기를 언급한다. 이러한 헤테로아릴 기는 단일환(예를 들어, 피리디닐 또는 푸릴) 또는 다중 축합 환(예를 들어, 인돌리지닐 또는 벤조티에닐)을 가지며, 축합 환은 방향족 일 수도 또는 아닐 수도 있으며 및/또는 헤테로원자를 함유할 수도 또는 아닐 수도 있고, 단, 부착 지점은 방향족 헤테로아릴 기의 원자를 통한다. 한 구체예에서, 헤테로아릴기의 질소 원자는 선택적으로 산화되어 N-옥시드(N→O), 술피닐, 또는 술포닐 부분을 제공한다. 바람직한 헤테로아릴은 피리디닐, 피롤릴, 인돌릴, 티오페닐, 및 푸란일을 포함한다.
"헤테로아릴옥시"는 -O-헤테로아릴을 언급하며 헤테로아릴은 본원에 정의된 바와 같다.
상기 화학식 1의 화합물은 구체적으로,
Ar1은 탄소수 6 내지 10의 아릴 또는 질소-함유 헤테로아릴, 또는 탄소수 6 내지 10의 질소-함유 치환 헤테로고리이고,
R1은 -NH-(O)- 또는 나이트릴로 치환된 탄소수 1 내지 2의 알킬이며,
Ar2는 탄소수 6 내지 12의 시클로알킬, 탄소수 6 내지 12의 질소-함유 치환 헤테로고리, 탄소수 6 내지 10의 질소-함유 헤테로아릴, 탄소수 6 내지 10의 아릴로 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 10의 산소, 질소 및 황 원자 중 적어도 하나를 함유하는 헤테로아릴옥시, 또는 -NH-(O)-R2로 치환된 탄소수 6 내지 10의 아릴이고, 여기서, R2는 탄소수 1 내지 2의 알킬을 나타낼 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 보다 구체적으로, 3-[(2-에틸부타노일)아미노]-N-(피리딘-4-일)벤자마이드(3-[(2-ethylbutanoyl)amino]-N-(pyridin-4-yl)benzamide), 시클로헥산카르복실산(1H-벤조이미다졸-5-일)-아마이드(cyclohexanecarboxylic acid (1H-benzoimidazol-5-yl)-amide), (3r,5r,7r)-N-(퀴놀린-5-일)아다만탄-1-카복사마이드((3r,5r,7r)-N-(quinolin-5-yl)adamantane-1-carboxamide), 1-메틸-4-페닐피페리딘-4-카보나이트릴(1-methyl-4-phenylpiperidine-4-carbonitrile), 2-옥소-N-4-피리디닐-3-피페리딘카복사마이드(2-oxo-N-4-pyridinyl-3-piperidinecarboxamide), N-(2-옥소제판-3-일)피리딘-4-카복사마이드(N-(2-oxoazepan-3-yl)pyridine-4-carboxamide), 2-옥소-N-(피리딘-4-일)-2H-크로메네-3-카복사마이드(2-oxo-N-(pyridin-4-yl)-2H-chromene-3-carboxamide), 2-옥소-N-(4-피리디닐)-1,2-디하이드로-3-피리딘카복사마이드(2-oxo-N-(4-pyridinyl)-1,2-dihydro-3-pyridinecarboxamide), 1-벤질-2-옥소-N-(4-피리디닐)-1,2-디하이드로-3-피리딘카복사마이드(1-benzyl-2-oxo-N-(4-pyridinyl)-1,2-dihydro-3-pyridinecarboxamide), 또는 5-옥소-N-피리딘-4-일-[1,3]티아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카복사마이드(5-oxo-N-pyridin-4-yl-[1,3]thiazolo[3,2-a]pyrimidine-6-carboxamide) 중 어느 하나일 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 Tribos 사의 Sybyl 7.2 모델링 패키지의 FlexX-Pharm 프로그램을 사용하여 PRK2 활성 부위에 도킹되는 물질을 스크리닝하여 얻은 것으로, PRK2의 활성을 억제하여 PRK2 인산화를 억제함으로써 C형 간염바이러스의 NS5B 단백질 인산화를 억제하며, 상기 NS5B 단백질의 인산화 억제는 바이러스 복제를 억제하므로 C형 간염의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물은 Hsp90(Heat shock protein 90) 저해제를 더 포함할 수 있다.
상기 Hsp90 저해제는 Hsp90 활성을 불활성화시키고, 상위 키나아제인 PDK1의 분해를 촉진하여 PRK2의 인산화된 형태를 감소시킴으로써 PRK2를 불안정화한다. 상기 PRK2의 양 및 활성 감소는 HCV NS5B의 인산화 억제를 유도함으로써 HCV 복제를 억제할 수 있다.
따라서, 상기 화학식 1의 화합물을 포함한 PRK2 저해제와 Hsp90 저해제의 병해투여는 C형 간염바이러스 복제를 억제하는 더블 히트 전략으로서 이들을 각각 단독 처리하는 경우에 비해 현저히 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다.
일 구체예에 따르면, PRK2 저해제와 Hsp90 저해제의 병해투여는 IFN-α 단독 처리에 의한 C형 간염바이러스 복제를 억제하는 정도와 유사한 정도로 효과를 갖는다. 따라서, IFN-α 비감수성 C형 간염 환자에서 효과적인 치료 효과를 나타낼 수 있다.
상기 Hsp90 저해제로 17-AAG(17-allyaminogeldanamycin), 또는 17-DMAG(17-(dimethylaminoethylamino)-17-demethoxygeldanamycin) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 다른 구체예에 따르면, PRK2 저해제 또는 Hsp90 저해제 및 IFN-α의 병행투여는 비 처리 군과 비교 시 90% 이상 C형 간염바이러스 복제를 억제하는 효과를 나타낸다. 또한 PRK2 저해제 및 Hsp90 저해제의 병행투여는 IFN-α 단독 처리와 상응하는 항-HCV 효능을 보이고 있다.
따라서, 본 발명의 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물은 IFN-α와 병행 투여하여 C형 간염을 예방 또는 치료할 수 있다. 아울러 IFN-α가 치료 효과를 나타내지 못하는 환자의 경우 PRK2 저해제와 Hsp90 저해제의 단독 및 병행투여는 효과적으로 바이러스 복제를 제어할 수 있다.
또한, 본 발명의 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 매질(media)과 혼합될 수 있다. 상기 제제화에서 활성 성분의 양은 바람직한 범위 내에서 적절한 투여량으로 한다.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.
또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 신규 PRK2 저해제의 발굴
HCV 치료제로 사용할 수 있는 효능이 증가된 신규 PRK2 활성 저해제를 발굴하기 위하여 PRK2 단백질 3차 구조를 예측하였다. PRK2 3차 구조는 구조가 유사한 PKA의 구조를 이용해 InsightII 소프트웨어 페키지내의 Modeller 프로그램을 사용하여 예측하였다. 예측된 모델은 Discover 프로그램을 사용해 에너지 최소화를 energy gradient가 0.1 kcal/mol·미만이 될 때까지 진행하였다. 최종 모델은 Profile 3D와 PROCHECK 프로그램을 사용하여 평가하였다. 다음 AutoDock-4 프로그램을 사용하여 도킹실험을 수행하였다. 최종 도킹 모델은 PyMol 패키지(http://pymol.sourceforge.net)를 사용하여 얻었다.
도 1B는 PRK2의 예측된 3차 구조와 PRK2의 활성을 억제하는 물질로 현재 임상에 사용되고 있는 HA1077과 비슷한 저해효과를 보이는 Y27632가 도킹된 구조를 볼 수 있다.
다음으로, Tribos 사의 Sybyl 7.2 모델링 패키지의 FlexX-Pharm 프로그램을 사용하여 PRK2 키나아제 활성 부위에 도킹되는 물질을 스크리닝하여 17개의 PRK2 저해제 후보물질을 얻었다.
<실험예 1> 신규 PRK2 저해제 처리에 따른 PRK2의 인산화 억제 및 항-HCV 효능 분석
상기 실시예 1에서 얻은 신규 저해제들의 PRK2 인산화 억제능을 확인하기 위하여 HCV 서브게놈 레프리콘을 함유하고 있는 R-1 세포주를 이용하였다.
R-1 세포주는 HCV RNA 복제에 필수적인 바이러스 5’ 및 3’ 말단 비번역 부위(UTR)의 시스-트랜스 액팅 RNA 요소(cis-acting RNA elements), 구조단백질 코딩 부위를 제거하고 여기에 복제되는 RNA을 선별할 수 있도록 삽입한 선별 마커, 그리고 복제에 필요한 비구조단백질(NS3-NS5B) 코딩 유전자로 구성되어 있다. 레플리콘에서 선별 마커는 HCV 5’-UTR과 구조단백질 캡시드 단백질인 코어 단백질 코딩 유전자의 일부로 구성된 internal ribosome entry site(IRES)에 의해 발현되고, HCV 비구조단백질들은 EMCV의 IRES에 의해 발현이 되도록 구성되어 있다. 레플리콘 세포주를 얻기 위해 HCV 서브게놈 레플리콘 RNA를 T7 RNA 중합효소를 사용하여 인 비트로 전사(in vitro transcription)시켜 얻고, 프리 리보뉴클레오타이드(free ribonucleotide)를 스핀 컬럼을 사용하여 제거한 뒤 간암 세포주에 전기충격을 통해 도입시켰다. G418 존재 하에서 안정한 세포주, 즉 HCV 서브게놈이 복제되어 G418에 대해 내성을 보이는 세포주를 얻고 이 세포주에서 HCV 비구조 단백질의 발현을 웨스턴 블랏으로 분석하여 복제가 일어나고 있음을 확인하여 R-1 세포주를 구축하였다. TaqMan 프로브를 사용한 정량적인 실시간 PCR 분석으로 HCV RNA 카피 수가 107 copies/mL 정도 존재함을 확인하였다. 이 R-1 세포주는 HCV RNA 복제가 일어나고 있는 세포주이므로 PRK2 활성 저해제에 의한 HCV 복제 억제 효과를 평가하는데 사용 가능하다.
R-1 세포주에 PRK2 저해제를 10 또는 20μM의 최종농도로 48시간 동안 처리한 후 PRK2의 활성에 필수적인 Thr816 잔기의 인산화 여부를 phospho-PRK2 항체를 사용한 웨스턴 블랏 분석을 통해 인산화된 PRK2의 발현 수준을 측정하였다. 항-α-튜뷸린 항체를 사용한 면역블랏팅은 동일한 량의 단백질이 로딩되었는지를 확인하기 위해 수행하였다.
그 결과, 5개의 화합물(#10, #11, #12, #13 및 #17: 도 2에 구조 도시함)이 50% 이상의 PRK2 인산화 억제효과를 보였다(도 3A).
다음으로 상기 R-1 세포주에 20 μM 최종농도로 선별된 5개의 PRK2 저해제와 현재 임상에 사용되고 있는 PRK2 활성저해제인 HA1077와 또 다른 PRK2 활성억제효과가 있는 Y27632 화합물을 각각 48 시간 동안 처리한 후 세포 용해물(50 ㎍)로부터 HCV NS5B 단백질과 HCV RNA 함량을 웨스턴 블랏 분석과 실시간 RT-PCR 분석을 통하여 분석하였다.
그 결과, #11번과 #17번 화합물이 HA1077과 유사한 정도로 HCV 복제 저해 효과를 보임을 확인하였다(도 3B 및 C).
다음으로, R-1(도 4A 및 C)과 HCV가 감염된 세포주(도 4D)에서 신규 PRK2 저해제에 의한 HCV 복제 효과를 분석하였다.
이를 위해, 두 세포주에 #17번 화합물을 20 μM 보다 고농도(60 및 100 μM)로 48시간 처리한 후 HCV RNA 게놈 수준을 실시간 RT-PCR 분석을 통해 확인하였다. 수치는 3반복 측정들의 평균±SD이다. HCV RNA 타이터는 실시간 PCR 분석을 통해 정량화하였다. 3회 독립 실험들을 3반복 실시하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, RNA 함량이 투여량 의존적으로 감소함을 확인하였다(도 4C 및 D). 이는 PRK2 활성을 억제하는 #17 화합물이 HCV RNA 복제 억제를 위해 효과적으로 사용될 수 있고, #17 화합물의 효능은 HCV 서브게놈 레플리콘 세포에서 보다는 JFH-1이 감염된 세포에서 약간 더 높게 나타남을 볼 수 있었다. 또한 선별된 #17 화합물은 100 μM 농도로 R-1세포(A)와 Huh7(B)에 처리시 세포활성을 크게 억제하지 않음을 볼 수 있었다.
다음으로, 선별된 신규 PRK2 저해제의 HCV NS5B 단백질 인산화 억제능을 시험하기 위하여 인 비트로 키나아제 분석(in vitro kinase assay)을 수행하였다.
재조합 활성 PRK2와 정제된 HCV NS5B 단백질을 기질로 이용하여 감마-32P ATP와 100 μM의 ATP가 존재하는 조건하에서 선별된 #11 및 #17번 저해제를 처리하였다. 반응 혼합물은 SDS-PAGE(8% 젤)로 분리한 후 방사능사진촬영(autoradiography)으로 그 결과를 확인하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, #11번과 #17번 모두 HCV NS5B 단백질 인산화를 억제함을 확인할 수 있었고, #11번 화합물은 기존 PRK2 활성저해제(HA1077 및 Y27632)와 비교하여 저해 정도가 비슷하여 이후 실험에서는 #17번 PRK2 활성저해제의 유도체를 제작하여 추가로 실험하였다.
가장 좋은 효과를 보였던 #17번 저해제를 토대로 하여 5개의 유도체(18-22번: 도 2 참조)들을 제작하고, 이들 저해제들 또는 HA1077 및 Y27632를 R-1 세포주에 각 20 μM 최종농도로 48시간 처리한 후 HCV RNA 게놈 수준을 실시간 RT-PCR 분석을 통하여 확인하고, DMSO 처리한 대조군의 퍼센트 대비로 표현하였다. 3회 독립 실험을 3반복으로 수행하였다. 데이터는 3회 실험들의 평균±SD로 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, #17번 저해제를 처리한 세포주에서 HCV RNA 함량이 50% 가량 감소하였고, 유도체인 #20번 저해제를 처리한 세포주에서는 60%의 감소 효과를 보였다. 기존의 알려진 PRK2 저해제인 HA1077과 Y27632는 각 40%와 49%의 억제 효과를 보였다. #17번 저해제의 유도체 중 하나인 #20번 저해제가 가장 뛰어난 억제능을 보였고, 또한 임상실험에 들어가 있는 저해제인 HA1077과 Y27632를 세포주에 처리했을 때 보다 더 나은 효과를 관찰할 수 있었다.
마지막으로, 인 비트로 키나아제 분석을 통해 #17번 화합물의 유도체들인 #18, #19, #20, #21 및 #22번 화합물들의 PRK2와 HCV NS5B 인산화 억제를 분석하였다.
1μM의 재조합 PRK2와 10μM의 HCV NS5B 단백질을 10μCi γ-32P ATP 및 100 μM ATP 존재 하에서 30분 동안 인산화시켰다. 반응 혼합물은 SDS-PAGE (8% 젤)에 의해 분리하였고, 방사능사진촬영에 의해 분석하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 저해제 #20번이 다른 유도체들에 비해 뛰어난 HCV 복제 억제능력을 보였다. 처리된 시료에서 인산화된 PRK2와 NS5B의 함량이 대조군에 비해 약 80% 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
<실시예 2> Hsp90의 HCV 복제에 대한 효과
(세포배양 및 시약)
Hsp90 억제가 HCV NS5B 단백질의 인산화에 영향을 줌으로써 HCV 복제 억제 효과를 유발할지를 확인하였다.
Hsp90의 HCV 복제에 대한 효과를 실험하기 위해 사용된 Huh7 사람 간암 세포주는 10% 우태아혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 비필수 아미노산이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 표준 배양 조건 하(5% CO2, 37℃)에서 배양하였다.
테트라사이클린 첨가로 HCV NS 단백질(NS3-NS5)을 발현이 유도되는 사람 간 안정화 세포주인 Huh7TR-NS는 블라스티시딘 에스(blasticidin S)(10 ㎍/mL) 및 제오신(Zeocine)(100 ㎍/mL)을 DMEM 배지에 추가로 첨가한 상태에서 세포주를 배양하였다. Huh7TR-NS에서 NS 단백질 발현은 1 ㎍/mL의 테트라사이클린을 첨가하여 24시간 동안 유도하였다. 유전형 1b HCV 서브게놈 레플리콘 RNA의 안정하고 자발적인 복제를 유지하는 Huh7 세포에서 유래한 세포주인 R-1는 이미 설명한 바 있다. 17-DMAG, PRK2 저해제인 HA1077 및 PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)의 저해제인 LY294002는 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA), 칼바이오켐(La Jolla, CA, USA), 및 바이오몰(Plymouth Meeting, PA, USA)에서 각각 얻었다. IFN-α는 시그마-알드리치(I-4276)에서 구입하였다.
(HCV 감염 및 약물 처리)
유전형 2a HCV 클론 JFH1의 감염성 HCV RNA 전장은 MEGAscript T7 키트(Ambion, Austin, TX, USA)를 사용하여 인 비트로 전사를 통해 제조하였고, 이미 설명한 바와 같이 Huh7 세포에 전기충격(electroporation)으로 도입시켰다.
간단히 요약하면, 전기충격 후 72시간째에서 배양 배지를 수집하고, 낮은 속도로 원심분리하여 맑게 한 다음, Huh7 세포 감염을 위해 사용하기 전에 0.45㎛-필터(Millipore, Billerica, MA, USA)를 통과시켰다.
세포는 주기적 전동(periodic rocking)으로 3시간 동안 흡수시켜 0.3의 감염 다중도에서 HCV로 감염시키고 나서, PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세척하고 완전 DMEM에서 유지하였다. HCV 서브게놈 레플리콘 세포 또는 HCV에 감염된 Huh7 세포(JFH1)에 17-DMAG 또는 PRK2 저해제 단독 또는 IFN-α 100 IU/mL)와 72시간 동안 병행처리하였다.
(세포독성 분석)
17-DMAG의 세포독성은 제조업체의 설명서에 따라 MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxylmethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] 시약(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 측정하였다. 실험방법은 다음과 같다.
Huh7 또는 R-1 세포(2×104 cell/well)를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 17-DMAG를 농도별로 72시간 동안 처리하였다. 그 후, 배양 배지를 제거하고 5% FBS 함유하는 배양 배지에 녹인 MTS 기질을 상기 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 상기 세포를 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 490 nm에서의 흡광도는 GloMax-Multi 검출 시스템(Promega)을 사용하여 96-웰 마이크로플레이트 자동판독기에서 판독하였다.
(면역블랏 분석 및 면역침전)
PDK1, p-PDK1(S241), PRK2, 및 p-PRK2(T816)(모두 Cell Signaling Technology사 제품임, Beverly, MA, USA)에 대한 항체를 사용하여 저해제 또는 IFN-α 처리한 세포로부터 얻은 총 세포 용해물을 면역블랏 분석에 사용하였다. PKC 아형 α, β,γ를 검출하기 위해, 3개의 PKC(protein kinase C) 아형, α, β,γ(anti-pan-PKC; Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA)에 존재하는 공통서열(consensus sequence)에 대한 다클론성 항체를 사용하였다. 항-α-튜뷸린 항체(Oncogene Research Products, Cambridge, MA, USA)는 동량의 단백질을 로딩하였음을 확인하기 위한 면역블랏팅에 사용하였다.
공동-면역침전(co-immunoprecipitation) 실험을 위해, 세포는 EDTA를 제거한 프로테아제 저해제 칵테일(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)이 첨가된 라이시스 버퍼 A(100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 17.5 mM β-글리세로포스페이트)에서 재현탁하고, 30분 동안 얼음 위에서 정치하였다. 원심분리 후, 세포 용해물(500 ㎍)과 항-p-Ser 항체(clone PSR-45; Sigma-Aldrich)를 함께 배양하였다. SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리된 면역침전물을 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond-ECL; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)으로 옮기고, 항-NS5B 혈청으로 면역블랏팅을 실시하였다.
(정량적인 실시간 RT-PCR)
R-1 또는 HCV 감염된 세포(JFH1)에서 TRIzol LS 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출하고, 제조업체의 설명서에 따라 정제하였다. HCV RNA 수준은 프라이머 쌍과 HCV 5'-UTR 내에 있는 부위를 표적으로 하는 TaqMan 프로브를 사용하여 RT-PCR에 의해 정량화하였다. 세포성 글리세알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제는 내부 대조군으로 사용하였다. 분석은 DyNAmo 프로브 2-스텝 qRT-PCR 키트(Finnzymes, Espoo, Finland) 및 CHROMO4 컨티뉴어스 형광검출기(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다.
(듀얼 루시퍼라아제 리포터 분석)
mRNA 5' 말단 Cap 의존적 단백질 발현량의 분석을 위해 CMV 프로모터에 의해 해파리의 루시퍼라아제(RLuc) 리포터 유전자가 발현되게 하고 HCV IRES 의존적 단백질 발현량은 반딧불이의 루시퍼라아제(FLuc)로 측정할 수 있게 듀얼 루시퍼라아제 발현 벡터를 구축하였다. Fugene HD(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 바이시스트로닉(bicistronic) 듀얼 루시퍼라아제 벡터를 Huh7 세포에 트랜스팩션시겼다. 48시간 뒤 세포 용해물에서 RLuc 및 FLuc 활성은 GloMax-멀티 검출계(Promega)에서 듀얼-글로 루시퍼라아제 분석 키트(Promega)를 사용하여 정량화하였다.
(세포주기 분석)
48시간 동안 17-DMAG 또는 HA1077 처리한 Huh7 세포를 수집하고 PBS로 세척하였다. 상기 세포는 차가운 에탄올로 30분 동안 고정하고, 실온에서 5분 동안 RNase A(100 ㎍/mL)를 처리한 후 37℃에서 30분 동안 50 ㎍/mL 프로피디움 아이오다이드(PI, Sigma-Aldrich)로 염색하고, FACS 칼리버 플로우 사이토미터(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포주기를 분석하였다.
<실시예 3> Hsp90 저해제의 PDK1 및 PRK2의 안정성 및 활성화에 미치는 효과
HCC 세포주 Huh7에서 PDK1은 Hsp90 억제에 의해 불안정화되는 지를 시험하기 위해, 구강투여에 효과적이고, 겔다나마이신 또는 이의 유사체인 17-AAG보다 안전한 것으로 알려진 제2세대 겔다나마이신 유도체인 17-DMAG를 사용하였다(도 8A). 48시간 동안 17-DMAG의 농도를 증가시키면서 Huh7 세포에 처리하고, 면역블랏 분석을 통해 PDK1의 정상상태 수준을 평가하였다.
도 8B에 나타난 바와 같이, 17-DMAG 처리는 PDK1 함량을 점차적이고 유의적으로 감소시켰다. 아울러 PRK2 함량은 500 nM에서 미처리 대조군 함량 대비 68% 정도 감소하는 것으로 나타났다. 다른 키나아제, 예를 들어, pan-PKC(α, β,γ) 및 Rho-kinase I(ROCKI)에 대한 면역블랏 분석 결과, 그들의 정상상태 함량은 유의적인 영향을 받지 않았다. 이 결과는 PKC-α 및 PKC-γ의 안정화는 Hsp90에 의해 조절되지 않음을 입증하는 것이다.
<실시예 4> Hsp90 저해제의 HCV RdRp 인산화에 대한 효과
유전형 1b HCV 서브게놈 레플리콘 RNA의 자가 복제를 유지하는 R-1 세포에서 17-DMAG가 바이러스 RNA 복제를 억제하는 지를 실험하였다. 17-DMAG의 항바이러스 활성을 평가하기 전에, 상기 약물이 세포 생존능을 간섭하는지 여부를 평가하기 위해 MTS 분석을 수행하였다. 구체적으로, 선택적인 HCV 서브게놈 레플리콘(상단 도면)을 탑재하고 있는 R-1 세포 및 그것의 모세포주 Huh7에 일정 농도의 17-DMAG를 72시간 동안 처리하고 MTS 분석에 따라 세포 생존능을 평가하였다.
도 9A에 나타난 바와 같이, 17-DMAG는 500 nM까지의 농도에서 Huh7 세포에 대해 유의적인 세포독성을 나타내지 않았다(500 nM에서 15% 미만 억제).
그러나, PDK1 및 PRK2가 두 세포주에서 비슷한 정도로 존재하지만 R-1 세포가 모세포주 Huh7 보다 17-DMAG에 대해 훨씬 민감하였다(도 9B).
따라서, R-1 세포에서는 50 nM 보다 낮은 수준의 17-DMAG의 항-HCV 활성을 실험하였다. 이를 위해, R-1 세포에 비히클(0.25% DMSO) 또는 17-DMAG를 72시간 동안 처리하여 세포 용해물(50 ㎍)과 상기 단백질에 특이적인 항체들과의 면역블랏팅을 통해 상기 단백질들의 함량을 측정하였다. 항-α-튜뷸린 항체(하단 패널)를 내부 로딩 대조군으로 사용하였다. 면역블랏의 농도계측식 분석에 따라 단백질의 함량을 측정하고, 그들의 인산화된 형태뿐만 아니라 PDK1 및 PRK2에 대해 계산된 상대 강도들은 α-튜뷸린 신호 대비로 환산하여 정량분석 하였다. 유사한 결과를 나타내는 3회 독립 실험 결과 대표적인 블랏 사진을 도시하였다. 10 또는 50 nM의 최종농도로 17-DMAG를 처리한 R-1 세포에서 PDK1 및 p-PRK2의 함량은 감소함을 볼 수 있었으며(도 9C) R-1 세포에서 PRK2 안정성은 50 nM 농도에서는 17-DMAG를 처리하여도 영향을 받지 않았다. R-1 세포에서 17-DMAG 처리는 HCV RNA 복제를 효과적으로 억제하였고, 50 nM의 농도에서 대략 50% 정도의 억제효과를 보였다(도 9D 두 번째 바).
또한, pcDNA3.1 벡터(도 9C의 첫 번째 및 두 번째 바) 또는 pcDNA3.1-PRK2의 농도를 높여가면서 트랜스팩션시킨 R-1세포에 비히클(0.25% DMSO, 대조군) 또는 50 nM 17-DMAG를 72시간 동안 처리한 후, 세포를 수집하고, 세포내에 남아있는 HCV RNA 수준을 분석하였다. 상대적인 HCV 게놈 카피 수는 DMSO 처리한 대조군 대비 퍼센트로 표현하였다. 3회 독립 실험을 3반복 수행하였다. 제시한 데이터는 3회 독립 실험의 평균±표준편차(SD) 값이다.
활성화된 PRK2는 HCV NS5B 인산화와 HCV 복제 향상에 관련되어 있음은 이미 관찰된 바 있다. 17-DMAG는 R-1 세포에서 PDK1의 안정성을 감소시켜 p-PRK2 수준을 낮추기 때문에, NS5B 인산화를 억제하기 위한 Hsp90 저해제의 능력을 분석하였다.
이를 위해, HCV NS 단백질의 발현이 바이러스 RNA 복제와 함께 일어나지 않는 Huh7TR-NS 세포[HCV NS 단백질(NS3-NS5B)을 발현하는 Tet-유도 벡터의 개략도는 도 9의 상단에 나타냄]를 1 ㎍/mL 테트라사이클린을 배지에 첨가한 후 24시간 동안 배양하여 NS 단백질의 발현을 유도한 다음, 17-DMAG(50 nM) 또는 PRK2 저해제인 HA1077(20μM)를 48시간 동안 처리하였다. Huh7TR-NS 모세포주인 Huh7TR-4는 HCV NS 단백질을 발현하지 않으며, 대조군으로 사용하였다. 아미노산 세린이 인산화된 단백질은 항-포스포세린 항체를 이용하여 세포 용해물로부터 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질(레인 5 내지 8) 및 4%의 각 제공 세포 용해물(레인 1 내지 4)은 정제한 다클론성 항-NS5B 항체와 면역블랏팅 시켰다. 저해제를 처리하지 않은 경우는 (-)로 표시하였다.
도 9E에 나타난 바와 같이, 항-p-Ser 항체로 p-NS5B를 면역침전한 후 면역블랏팅한 결과, 17-DMAG 처리는 HCV NS 단백질을 발현하는 Huh7TR-NS 세포에서 NS5B 인산화를 억제함을 입증하였다(레인 6과 7를 비교할 것). 또한, PRK2 저해제인 HA1077 역시 20μM 농도로 처리 시 PRK2의 활성억제를 통해 NS5B 인산화를 억제함을 확인하였다(레인 8).
이상의 결과는 HCV가 복제되고 있는 R-1 세포에서 17-DMAG의 복제억제 효과는 PDK1-PRK2 신호전달경로에 의한 것이며, Hsp90 억제를 통한 HCV 복제 조절이 PDK1의 하위 키나아제인 PRK2를 통해 이루어짐을 보여주고 있다.
<실시예 5> Hsp90 저해제 및 IFN-α 또는 PRK2 저해제의 병행처리에 따른 HCV 복제 억제 효과
IFN-α 및 리바비린의 병행투여는 현재 HCV 감염 치료를 위한 표준 치료법이다. IFN-α와 병행처리 시 HCV 복제를 억제하는 17-DMAG의 능력을 평가하기 위해, 유전자형 1b HCV 서브게놈 레플리콘을 포함하는 R-1 세포에 50 nM 17-DMAG 및 IFN-α 100 IU/mL)를 처리하였다. 72시간 후, HCV 서브게놈 레플리콘 RNA의 수준은 정량적 RT-PCR에 따라 분석하였다.
도 10A에 나타난 바와 같이, 100 IU/mL IFN-α를 단독 처리한 경우 HCV RNA 함량은 대략 80% 정도 감소한 반면, IFN-α 50 nM 17-DMAG를 병행처리 한 경우에는 대략 100배 정도 바이러스 RNA 감소를 유도하였다. 또한, HA1077 (20 μM) 과 IFN-α(100 IU/mL)를 병행처리 한 경우도 역시 IFN-α의 항-HCV 활성을 향상시켰다. 이들 결과는 17-DMAG 및 IFN-α의 병행처리는 HCV 복제를 억제하기 위한 효과적인 전략이라는 주목할만한 증거를 제공하는 것이다. 더욱이, 17-DMAG (50 nM) 및 HA1077 (20 μM)를 병행처리 한 경우, 바이러스 복제를 대략 80% 정도 억제하였고, 이는 100 IU/mL IFN-α를 단독처리 하여 얻은 억제효과와 같은 수준이다. 이는 상기 병행처리가 HCV NS5B 인산화를 차단하여 HCV 복제를 효과적으로 억제함을 시사하는 것이다.
다음으로, IFN-α가 PDK1-PRK2 신호전달경로에 영향을 주는지를 알아보기 위해, R-1 세포에 시간대 별로 6시간까지 100 IU/mL IFN-α를 처리하였다. 세포 용해물에 대해 SDS-PAGE를 실시하고, 면역블랏 분석을 실시하였다. 항-α-튜뷸린 항체와의 면역블랏팅은 로딩에 대한 내부 대조군으로 사용하였다. 유사한 결과를 나타내는 3회 독립 실험 중 하나로부터 대표 결과를 도시하였다.
도 10B에 나타난 바와 같이, IFN-α 처리 후, p-PRK2 또는 PRK2 함량 어느 곳에도 유의적인 변화가 관찰되지 않았다(레인 1 내지 4 참조). 또한, 처리 세포에서 PDK1 활성화에 대한 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 이들 결과는 상기 실험 조건에서 PDK1 및 PRK2의 세포내 함량 또는 안정화와 활성화 상태는 R-1 세포에서 IFN-α 처리에 의해 영향을 받지 않음을 시사하는 것이다. Huh7 세포에서도 유사한 결과가 관찰되었다(레인 5 내지 8 참조).
<실시예 6> HCV 감염된 세포에서 Hsp90 저해제의 항-HCV 활성 조사
17-DMAG가 HCV가 감염된 세포에서도 복제를 억제할 수 있는 지를 분석하기 위해, Huh7 또는 Huh7에서 유래한 세포주에서 감염성 비리온을 생산하는 유전자형 2a HCV 감염성 클론 JFH1을 사용하여 실험을 수행하였다. JFH1 RNA를 전기충격으로 Huh7 세포에 도입한 후 수집된 배양 상등액을 바이러스 감염시료로 사용하여 10cm-플레이트에서 60-70% 컨플루언시 상태로 자란 Huh7 세포에 감염시키고, 50 nM 17-DMAG 단독처리 하거나, 100 IU/mL IFN-α와 병행처리 하였다. 72시간 후, 총 세포 RNA를 추출하고, 감염된 세포에서 남아있는 HCV에 대한 정량적 RT-PCR 분석을 실시하였다.
도 11A에 나타난 바와 같이, 500 nM 17-DMAG를 처리한 경우, 바이러스 RNA 함량을 87% 정도 감소시켰고, 이 처리농도에서 MTS 분석에 의해 평가된 세포 활성도는 15% 내외 정도로 감소하는 결과를 보여 세포활성을 크게 저해하지 않음을 확인할 수 있었다(도 9A 참조). 이는 바이러스 RNA 복제를 대략 90% 정도 억제하는 100 IU/mL의 IFN-α의 단독처리 효과에 필적할만한 것이다. 이 결과는 또한 17-DMAG가 유전자형 2a HCV 감염된 세포에서 HCV 복제를 효과적으로 억제할 수 있음을 명확히 보여주는 결과이다.
다음으로, HCV IRES 매개 트랜슬레이션에 대한 17-DMAG의 효과를 조사하기 위해, 듀얼 리포터 분석을 수행하였다. Huh7 세포를 듀얼 리포터 분석 플라스미드로 형질감염시키고(도 11B, 상단 그림), 17-DMAG를 농도별로 72시간 동안 처리하였다. 듀얼 루시퍼라아제 리포터는 5' 말단에서부터 순차적으로 CMV 프로모터, 반딧불이 루시퍼라아제, HCV 5'-UTR과 함께 HCV IRES를 구성하는 코어-코딩 부위의 N-말단 일부, 그리고 HCV 3'-UTR로 이루어져 있다. 반딧불이 루시퍼라아제(cap-의존적 트랜슬레이션) 및 해파리 루시퍼라아제(HCV IRES 매개 트랜슬레이션)의 수준은 듀얼 루시퍼라아제 분석을 통해 측정되고 DMSO 처리한 대조군의 퍼센트 대비로 표현된다(첫 번째 바). 3회 독립 실험을 3반복 수행하였다. 데이터는 3회 실험의 평균±표준편차로 나타냈다.
도 11B에 나타난 바와 같이, 17-DMAG는 HCV IRES 매개 트랜슬레이션에 영향을 미치지 않았다.
다음으로, 플로우 사이토미터를 사용하여 세포주기 분석을 수행하였다. Huh7 세포에 DMSO (0.25%) 또는 500 nM 17-DMAG를 48시간 동안 처리하고, 플로우 사이토미터를 사용하여 세포주기를 분석하며, G1, S, 및 G2/M기 세포의 퍼센트를 나타냈다. PI3K 저해제인 LY294002를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 11C에 나타난 바와 같이, 500 nM 17-DMAG를 처리한 Huh7 세포는 세포주기를 유의적으로 바꾸지 않는 반면, 상기 분석 시 양성 대조군으로 사용한 PI3 키나아제 저해제인 LY294002는 예상한 대로 G1-기에서 세포를 어레스트 하였다.
결론적으로, 본 발명은 HCV 복제가 Hsp90 억제에 의해 어떻게 조절되는 지에 대한 새로운 메커니즘을 제공한다. Hsp90 저해제인 17-DMAG는 PDK1 및 PRK2를 불안정화하며, 이로 인해 HCV 복제를 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었다. 이는 PDK1-PRK2 신호전달경로에 의한 HCV NS5B 인산화의 조절에 있어서 Hsp90의 중요한 역할을 입증하는 것이다. PDK1-PRK2 경로는 잠재적인 항-HCV 약물을 위한 타겟이다. 그러므로, PDK1 또는 PRK2를 각각 표적으로 하는 저해제 또는 이들 키나아제들을 표적으로 하는 제해제들의 병행투여는 HCV에 대한 효과적인 치료법이 될 수 있다. 아울러 PDK1 및/또는 PRK2의 불안정화 및 불활성화를 유도하여 HCV 바이러스 게놈 복제를 억제하는 전략은 성공적인 HCV 치료법을 제공할 것이다.
본 발명은 C형 간염, 특히 인터페론 비감수성 C형 간염의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003102-appb-I000003
    상기 식에서,
    Ar1은 탄소수 5 내지 24의 아릴 또는 질소-함유 헤테로아릴, 또는 탄소수 3 내지 12의 질소-함유 치환 헤테로고리이고,
    R1은 -NH-(O)- 또는 나이트릴로 치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬이며,
    Ar2는 탄소수 3 내지 12의 시클로알킬, 탄소수 3 내지 12의 질소-함유 치환 헤테로고리, 탄소수 5 내지 24의 질소-함유 헤테로아릴, 탄소수 5 내지 24의 아릴로 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 24의 산소, 질소 및 황 원자 중 적어도 하나를 함유하는 헤테로아릴옥시, 또는 -NH-(O)-R2로 치환된 탄소수 5 내지 24의 아릴이고, 여기서, R2는 탄소수 1 내지 10의 알킬을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    Ar1은 탄소수 6 내지 10의 아릴 또는 질소-함유 헤테로아릴, 또는 탄소수 6 내지 10의 질소-함유 치환 헤테로고리이고,
    R1은 -NH-(O)- 또는 나이트릴로 치환된 탄소수 1 내지 2의 알킬이며,
    Ar2는 탄소수 6 내지 12의 시클로알킬, 탄소수 6 내지 12의 질소-함유 치환 헤테로고리, 탄소수 6 내지 10의 질소-함유 헤테로아릴, 탄소수 6 내지 10의 아릴로 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 10의 산소, 질소 및 황 원자 중 적어도 하나를 함유하는 헤테로아릴옥시, 또는 -NH-(O)-R2로 치환된 탄소수 6 내지 10의 아릴이고, 여기서, R2는 탄소수 1 내지 2의 알킬을 나타내는 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    화학식 1의 화합물은 3-[(2-에틸부타노일)아미노]-N-(피리딘-4-일)벤자마이드(3-[(2-ethylbutanoyl)amino]-N-(pyridin-4-yl)benzamide), 시클로헥산카르복실산(1H-벤조이미다졸-5-일)-아마이드(cyclohexanecarboxylic acid (1H-benzoimidazol-5-yl)-amide), (3r,5r,7r)-N-(퀴놀린-5-일)아다만탄-1-카복사마이드((3r,5r,7r)-N-(quinolin-5-yl)adamantane-1-carboxamide), 1-메틸-4-페닐피페리딘-4-카보나이트릴(1-methyl-4-phenylpiperidine-4-carbonitrile), 2-옥소-N-4-피리디닐-3-피페리딘카복사마이드(2-oxo-N-4-pyridinyl-3-piperidinecarboxamide), N-(2-옥소제판-3-일)피리딘-4-카복사마이드(N-(2-oxoazepan-3-yl)pyridine-4-carboxamide), 2-옥소-N-(피리딘-4-일)-2H-크로메네-3-카복사마이드(2-oxo-N-(pyridin-4-yl)-2H-chromene-3-carboxamide), 2-옥소-N-(4-피리디닐)-1,2-디하이드로-3-피리딘카복사마이드(2-oxo-N-(4-pyridinyl)-1,2-dihydro-3-pyridinecarboxamide), 1-벤질-2-옥소-N-(4-피리디닐)-1,2-디하이드로-3-피리딘카복사마이드(1-benzyl-2-oxo-N-(4-pyridinyl)-1,2-dihydro-3-pyridinecarboxamide), 또는 5-옥소-N-피리딘-4-일-[1,3]티아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카복사마이드(5-oxo-N-pyridin-4-yl-[1,3]thiazolo[3,2-a]pyrimidine-6-carboxamide) 중 어느 하나인 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    Hsp90(Heat shock protein 90) 저해제를 더 포함하는 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    Hsp90 저해제는 17-AAG(17-allyaminogeldanamycin) 및 17-DMAG(17-(dimethylaminoethylamino)-17-demethoxygeldanamycin)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    IFN-α와 병행투여 하는 것을 특징으로 하는 C형 간염 예방 또는 치료용 조성물.
PCT/KR2012/003102 2011-06-30 2012-04-23 복제효소 인산화를 조절하는 신규 c형 간염 예방 또는 치료용 조성물 WO2013002484A1 (ko)

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