WO2013002158A1 - 細胞培養装置および細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
培養容器は6ウェル用セルカルチャインサートと6ウェルプレートとした。角膜上皮細胞を培養する前日に、フィーダー細胞として、マイトマイシンC(10μg/ml)で37℃2時間処理したNIH-3T3細胞を2×104/cm2となるように、6ウェルプレートに播種した。NIH-3T3細胞を播種した翌日に、フナコシ社より購入したウサギ眼球の角膜輪部から常法に従って角膜上皮細胞を採取し、2×104/cm2 となるように6ウェル用セルカルチャインサートに播種した。培養液には、上皮系細胞の培養に用いられる5%FBSを含むKCM培地を用いた。培養液の交換は、細胞培養容器の上層下層共に、培養開始5、7、9-14日目に1回行った。培養期間中は、位相差顕微鏡で細胞増殖状況を確認した。
各培養条件で作製した細胞シート内に含まれる細胞数と、DNA量から、増殖過程での細胞数を定量した。作製後の細胞シートに含まれる細胞数の算出方法を以下に記載する。まずディスパーゼ(200U/ml)を培養下層に注入し、37℃60分処理した。処理後、ピンセットで細胞シートの培養表面から剥離させた。剥離した細胞シートを0.25%トリプシンで37℃10分処理して、細胞懸濁液として細胞シートに含まれる細胞数を求めた(TC10bio-rad社製)増殖過程での細胞数定量は以下の通り実施した。培養4,6,8,10、12、14日目の細胞を回収し、DNA定量キット(プライマリーセル)を用いて、サンプルの蛍光強度と予め細胞数が明らかであるサンプルの蛍光強度より細胞数を算出した(n=3)。
実例1は培養12日目に、比較例1、比較例2は培養14日目に、常法に従い凍結包埋を実施した。凍結包埋した組織から, ミクロトームで厚さ10 μmの切片を作製した。作製した切片を用いて常法に従い、ヘマトキシリンーエオジン染色、および免疫組織染色を実施した。免疫組織染色には、抗pan-CK抗体(クローン名Kspan1-8)、抗CK3抗体(AE5)、抗クローディン1抗体(A10)、抗p63抗体(4A4)を用いた。実施例1と比較例1においては、切片5枚よりp63陽性細胞数/全細胞数を求めて、p63陽性細胞率を算出した。コロニー形成率を求めるために、作製した細胞シートを、0.25%トリプシン溶液を用いて細胞懸濁液として、その内2000個の細胞を、あらかじめNIH-3T3細胞を2×104/cm2となるように播種した10cmディッシュに播種し、約10日間KCM培地にて培養した。
細胞からのトータルRNAの抽出はRNeasy mini kit(キアゲン)を用いて実施した。アジレント社製Rabbit オリゴDNAマイクロアレイを用いて、1色法により、約30000万遺伝子の発現量を蛍光シグナル強度として求めた(n=3)。アレイ間のシグナル強度を75precentile shift法で補正し、データを正規化した。n=3の平均値を用いて、実施例1と比較例1の遺伝子発現量を比較し、相関係数rを求めた。
2…制御装置
3…恒温槽
4…培養容器
5…温度調節部
6…湿度調節部
7…ガス供給部
8…ガス濃度調節部
9…培養液・廃液タンク
10…培養液供給ポンプ
11…温度・湿度・ガスセンサ
12…細胞観察用CCDカメラ
13…表示装置
14…光干渉断層計
15…電気抵抗測定装置
16…抑制膜
17…多孔膜
18…枠体
19…温度センサ
Claims (15)
- 組織を形成する幹細胞または前駆細胞を培養する培養領域を有する細胞培養装置であって、
前記培養領域内の酸素供給量を調節する酸素調節部と、
前記酸素調節部を制御する制御部と、
前記細胞の培養期間のうち、
前記幹細胞または前駆細胞が自己複製する期間内の第一の期間における第一の酸素供給量と、
前記幹細胞または前駆細胞が分化する期間を含む第二の期間における、前記第一の酸素供給量よりも多い酸素供給量の第二の酸素供給量と、
を制御し、
前記幹細胞または前駆細胞の自己複製による増殖の度合いに基づいて、前記第一の酸素供給量を前記第二の酸素供給量に変更するよう、前記酸素調節部を制御する制御部と、
を有することを特徴とする細胞培養装置。 - 上皮組織を形成する幹細胞または前駆細胞が培養される培養領域を有する培養容器を保持する容器保持部と、
前記培養容器内の酸素供給量を調節する酸素調節部と、
前記酸素調節部を制御する制御部と、
前記幹細胞または前駆細胞の培養期間のうち、
前記幹細胞または前駆細胞が前記培養領域に形成された培養面と接するように増殖する期間内の第一の期間における第一の酸素供給量と、
前記培養面に増殖した幹細胞または前駆細胞が前記培養面上に重層するように増殖する期間を含む第二の期間における、前記第一の酸素供給量よりも酸素供給量の高い第二の酸素供給量と、
を制御し、
前記培養面と接するように増殖する期間における、増殖の度合いに基づいて、前記第一の酸素供給量を前記第二の酸素供給量に変更するよう、前記酸素調節部を制御する制御部と、を有することを特徴とする細胞培養装置。 - 前記第一の酸素供給量は、1%以上15%未満であることを特徴とする請求項1記載の細胞培養装置。
- 前記第二の酸素供給量は、15%以上60%未満であることを特徴とする請求項1記載の細胞培養装置。
- 前記細胞培養装置は、
前記幹細胞または前駆細胞を撮像する撮像部をさらに備え、
前記制御部は、
前記撮像部から取得した画像から、前記度合いを算出することを特徴とする請求項1記載の細胞培養装置。 - 前記制御部は、
前記自己複製する期間のうち、前記幹細胞または前駆細胞が前記培養領域内の所定領域まで自己複製によって増殖した場合、前記第一の酸素供給量を前記第二の酸素供給量に変更するよう、前記酸素調節部を制御することを特徴とする請求項5記載の細胞培養装置。 - 前記制御部は、
前記自己複製する期間のうち、前記幹細胞または前駆細胞が前記培養領域内の所定領域まで自己複製によって増殖した後、所定時間が経過した時点にて、前記第一の酸素供給量を前記第二の酸素供給量に変更するよう、前記酸素調節部を制御することを特徴とする請求項5記載の細胞培養装置。 - 前記細胞培養装置は、
前記培養領域に、幹細胞または前駆細胞を培養させる第一の面を有し、
前記増殖の度合いは、前記第一の面に対する前記幹細胞または前駆細胞の占有率であることを特徴とする請求項1記載の細胞培養装置。 - 前記細胞培養装置は、
前記幹細胞または前駆細胞を撮像する撮像部をさらに備え、
前記制御部は、前記撮像部から取得した画像から、前記占有率を算出することを特徴とする請求項8記載の細胞培養装置。 - 前記細胞培養装置は、
前記占有率を表示させる表示部を有することを特徴とする請求項9記載の細胞培養装置。 - 前記制御部は、
前記占有率に基づいて、前記第一の酸素供給量を前記第二の酸素供給量に変更するよう前記酸素調節部を制御することを特徴とする請求項9記載の細胞培養装置。 - 前記細胞培養装置は、前記幹細胞または前駆細胞を撮像する撮像部をさらに備え、前記制御部は、前記撮像部から取得した画像に基づいて、前記幹細胞または前駆細胞の大きさの平均の時系列変化を算出することを特徴とする請求項1記載の細胞培養装置。
- 前記細胞培養装置は、
前記時系列変化を表示させる表示部を有することを特徴とする請求項11記載の細胞培養装置。 - 前記制御部は、
前記時系列変化から、前記幹細胞または前駆細胞が自己複製する期間のうち、前記幹細胞または前駆細胞の大きさの平均が最大となる時点以降の期間を特定し、
前記幹細胞または前駆細胞の大きさの平均が最大となる時点以降の期間に、記酸素供給量を前記第一の酸素供給量から前記第二の酸素供給量に変更するよう、前記酸素調節部を制御することを特徴とする請求12記載の細胞培養装置。 - 前記制御部は、
前記幹細胞または前駆細胞の大きさの平均が最大となる時点以降の期間のうち、前記幹細胞または前駆細胞の大きさの平均が一定となる期間に、前記酸素供給量を前記第一の酸素供給量から前記第二の酸素供給量に変更するよう、前記酸素調節部を制御することを特徴とする請求項14記載の細胞培養装置。
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