WO2012173319A1 - 봉독 포스포리파아제를 유효성분으로 포함하는 프리온 질병 치료용 조성물 - Google Patents

봉독 포스포리파아제를 유효성분으로 포함하는 프리온 질병 치료용 조성물 Download PDF

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WO2012173319A1
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bee venom
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degenerative brain
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PCT/KR2011/010341
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박상열
정재교
문명희
설재원
이유진
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전북대학교산학협력단
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    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01004—Phospholipase A2 (3.1.1.4)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating prion diseases comprising Bee venom PLA2 as an active ingredient, and more particularly to inhibiting the neuronal cell death induced by PrPsc to enable treatment of prion diseases as an active ingredient It relates to a composition for treating prion diseases.
  • Prion is a cause of mad cow disease, a protein found in the brains of mammals and birds that is normally a harmless protein.
  • the function of normal prion protein is known to perform various functions such as antioxidant function, neurotransmitter function in the body.
  • PrPc a prion protein normally present in cells
  • PrPsc a prion protein that causes prion disease
  • binds to PrPc it loses the function of PrPc, which inhibits cell proliferation and growth, and ultimately causes neuronal death.
  • Group III secreted PLA2 has been reported to slow the progression of each neurodegenerative disease by regulating the growth and proliferation of neurons to inhibit the production of factors that induce neurodegenerative disease.
  • Therapeutics for prion disease are currently being studied in various fields and, for example, mice are known to have developed a vaccine against PrPsc.
  • studies have been made to make the resistance to prion infection by genetic treatment that prevents the expression of prion protein, and it has been reported that quinacrine, quinoline, RNA aptamer, and anti-PrP antibody show antiprion effect. And staying in the animal testing phase, did not get a satisfactory effect.
  • group III secreted PLA2 has been reported to modulate the activity of neurodegenerative factors, there has been no report on the application and effect of prion disease, and the effect of group III sPLA2 on cytotoxicity against PrPsc. None has been revealed at all.
  • the first problem to be solved by the present invention is to provide a composition that can regulate the activity of neurodegenerative factors affecting neuronal cell death.
  • the second problem to be solved by the present invention is to provide a composition for treating degenerative brain disease comprising the composition as an active ingredient.
  • the present invention to achieve the first object,
  • composition for controlling the expression of AKT or p-38 MAPK kinase comprising bee venom phospholipase A2 (phospholipase A2, Group III sPLA2) isolated from bee venom as an active ingredient.
  • the composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the present invention to achieve the second object,
  • composition for the treatment of degenerative brain disease comprising bee venom phospholipase A2 (phospholipase A2, Group III sPLA2) isolated from bee venom as an active ingredient.
  • bee venom phospholipase A2 phospholipase A2, Group III sPLA2 isolated from bee venom as an active ingredient.
  • the composition can inhibit neuronal cell death caused by the modified prion protein.
  • the composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the degenerative brain disease may include kuru disease, Creutzfeldt-Jakob disease, modified Creutzfeldt-Jakob disease, humane Creutzfeldt-Jakob disease, familial Creutzfeldt-Jakob disease, sporadic Creutz disease Felt-Jacob disease, Gutsman-Streisler-Sheinker's disease, fatal familial insomnia and fatal sporadic insomnia.
  • the composition may be in the form of a suspension, lyophilized preparation, non-aqueous injection or aqueous injection.
  • the composition may be administered intracutaneously, subcutaneously or intramuscularly.
  • treatment is meant to stop or delay the progression of the disease when used in subjects with symptoms of onset.
  • the "pharmaceutical composition” may include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient, or combination thereof as necessary with the compound of the present invention.
  • carrier refers to a substance that facilitates the addition of a compound into a cell or tissue.
  • dilute is defined as a substance that not only stabilizes the biologically active form of a compound of interest, but also is diluted in water to dissolve the compound.
  • pharmaceutically acceptable means a property that does not impair the biological activity and physical properties of the compound.
  • the composition comprising Bee venom sPLA2 (Group III sPLA) according to the present invention as an active ingredient can regulate the activity of neurodegenerative factors, thereby effectively inhibiting the death of neurons caused by the modified prion protein. It can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases.
  • FIG. 1 shows the results of measuring cell viability by treatment with SH-SY5Y neurons with bvPLA2 for 1 hour and exposure to 50 uM PrP (106-126) for 23 hours by Annexin V analysis.
  • Cells were treated with FITC-Annexin V, which binds to phosphatidylserine on the plasma membrane during apoptosis, and M1 is representative of Annexin V positive cells.
  • Figure 2 is a graph showing the average value of Annexin V positive cell for each treatment.
  • Figure 3 shows immunofluorescence staining (green) by TUNEL analysis after treatment of SH-SY5Y neurons with 50 uM PrP (106-126) and control staining of cells without apoptosis (prpodium iodide, PI, red) Is an image.
  • Figure 4 is a Lactate dehydrogenase (LDH) analysis of cells treated with bvPLA2 for 1 hour and treated with 50 uM PrP (106-126), a graph showing the degree of LDH release.
  • LDH Lactate dehydrogenase
  • SH-SY5Y neurons were treated with bvPLA2 for 1 hour in a dose-dependent manner and exposed to 50 uM PrP (106-126) for 15 hours, by Western blot for AKT, p-AKT, p-38, The amounts of p-p38, caspase-3 and cleaved caspase-3 were measured.
  • 3 is an experimental result of reducing the neuronal cell death by PrP (106-126) by controlling the expression of AKT, a neurodegenerative factor, bvPLA2.
  • FIG. 6 shows SH-SY5Y neurons treated with 50 nM bvPLA2 or 100 nM wortmannin for 1 hour and exposed to 50 uM PrP (106-126) for 23 hours, followed by cell survival by Annexin V assay (cell viability).
  • M1 is representative of Annexin V positive cell.
  • Figure 7 is a graph showing the average value of Annexin V positive cell for each treatment.
  • Figure 9 is a Lactate dehydrogenase (LDH) analysis of cells treated with bvPLA2 or wortmannin for 1 hour and treated with 50 uM PrP (106-126), which is a graph showing the degree of LDH release.
  • LDH Lactate dehydrogenase
  • FIG. 10 shows that SH-SY5Y neurons were treated with bvPLA2 in a dose-dependent manner for 1 hour, and treated with 100 nM of wortmannin with and without 50 uM PrP (106-126), respectively. It was exposed for a time, and this is an image showing the results of measuring the amount of AKT, p-AKT by western blot.
  • FIG. 11 shows cell viability by treatment with SH-SY5Y neurons with 50 nM bvPLA2 or 100 nM SB203580 for 1 hour, followed by exposure to 50 uM PrP (106-126) for 23 hours by Annexin V assay. Is the result of measurement.
  • M1 is representative of Annexin V positive cell.
  • Figure 13 shows immunostaining staining (green) and control staining of cells without apoptosis by TUNEL analysis after treatment with SH-SY5Y neurons without treatment with bvPLA2 or SB203580, but with 50 uM PrP (106-126). (prpodium iodide, PI, red).
  • FIG. 14 is a Lactate dehydrogenase (LDH) assay for cells treated with bvPLA2 or SB203580 for 1 hour and treated with 50 uM PrP (106-126), showing the degree of LDH release.
  • LDH Lactate dehydrogenase
  • FIG. 15 shows that SH-SY5Y neurons were treated with bvPLA2 in a dose-dependent manner for 1 hour and treated with 100 nM of SB203580 for 15 hours in 50 uM PrP (106-126), respectively. Exposed to this, the image showing the result of measuring the amount of p38, p-p38 by western blot.
  • the present invention is a composition for treating degenerative brain disease caused by modified prion protein, collected from bees (apis meliifera), Bee venom (bee venom) secretory phospholipase A2 (Group III sPLA2) as an active ingredient Characterized in that.
  • Prion disease is a degenerative brain disease, characterized by symptoms such as neuropathy, gliosis, neuronal loss, and the like.
  • PrPsc a modified prion protein, binds to PrPc, it loses its function. Growth is inhibited and ultimately results in the death of nerve cells.
  • PrP (106-126) has physical properties similar to PrPsc in cytotoxicity, beta-sheet formation, and the like. Therefore, by PrP (106-126) on the regulation of cell death mechanism and the effect of prion disease treatment of the composition comprising Bee venom secreting phospholipase A2 (Group III sPLA2) according to the present invention as an active ingredient Induced neurons confirmed the effect.
  • the present invention in order to confirm the effect of group III secreted PLA2 on neuronal cell death induced by PrPsc by the treatment of cholesterol and PrP (106-126) to SH-SY5Y cell line cell viability test, DNA Fragmentation assay and Western blotting were performed. Through this, expression of AKT and p38 was confirmed. Accordingly, the results of group III sPLA2 on neuronal cytotoxicity of PrPsc were examined.
  • the present invention is a composition comprising phospholipase A2 (Group III sPLA2) as an active ingredient, characterized in that to regulate the expression of AKT or p-38 MAPK kinase.
  • phospholipase A2 Group III sPLA2
  • PrP causes neuronal cell death (apoptosis), inhibits the expression of PI3K / AKT kinase and increases the expression of p38 MAPK and caspase-3, when treated with bvPLA2 according to the present invention. AKT expression is increased and p38 MAPK expression is decreased to inhibit apoptosis by PrP (106-126).
  • composition for treating degenerative brain disease is characterized by comprising bee venom phospholipase A2 (phospholipase A2, Group III sPLA2) isolated from bee venom as an active ingredient, wherein the degenerative brain disease is kuru disease, Creutz Felt-Jakob disease, modified Creutzfeldt-Jakob disease, anthropomorphic Creutzfeldt-Jakob disease, familial Creutzfeldt-Jakob disease, sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, Gutsman-Streisler-Sheinker disease, fatal familial insomnia or fatality It may be sporadic insomnia.
  • bee venom phospholipase A2 phospholipase A2, Group III sPLA2 isolated from bee venom as an active ingredient
  • the degenerative brain disease is kuru disease, Creutz Felt-Jakob disease, modified Creutzfeldt-Jakob disease, anthropomorphic Creutzfeldt-Jakob
  • Compositions containing Group III sPLA2 according to the present invention as an active ingredient are oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injections of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., respectively, according to conventional methods. It may be in the form of a solution. It may preferably be used in the form of suspensions, lyophilized preparations, non-aqueous injections, or aqueous injection solutions, even more preferably in sterile injectable solutions.
  • the composition is lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, poly Vinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • a solvent dissolution aid, buffer, isotonic agent, stabilizer, antioxidant, analgesic agent, suspending agent, etc. which are commonly used in the art, and as the solvent, additives and diluents, sterile distilled water , Saline solution, pH adjuster, albumin, sodium chloride, mannitol, ring gel injection solution, glucose and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in the extract. ) Or lactose, gelatin and the like are mixed. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc are also used. Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. .
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the preferred dosage of the composition for treating degenerative brain disease according to the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the drug form, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, at a dosage of 8 micrograms to 5 milligrams, preferably 8 micrograms to 2 milligrams, more preferably 16 micrograms to 1 milligram per day, preferably injections, even more preferably It would be desirable to administer by intramuscular injection.
  • the number of administrations can be administered once a day, several times a day, once a day for two days to one week, etc., but the number of administrations is not limited.
  • the dosage, frequency of administration and method of administration are not intended to limit the scope of the invention in any aspect.
  • composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example by oral, rectal or intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections.
  • Neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) was obtained from American Type Culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA), 10% fetal bovine serum and gentamicin (0.1 mg / ml). ) was cultured in a cell culture (37 °C, 5% CO 2 ).
  • PrP (106-126) peptide treatment was performed by PrP (106-126) (base sequence, Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala -Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly) was synthesized in Peptron and the peptide was dissolved in DMSO at 12.5 mM concentration and stored at -80 ° C.
  • Cytotoxicity was analyzed by LDH analysis using LDH cytotoxicity detection kit (Takara Bio, Japan). The degree of LDH emission was measured by measuring absorbance at 490 nm using a microplate reader (Spectra Max M2, USA).
  • Cell death was analyzed by cell death using Annexin V assay kit, and the method was analyzed by measuring fluorescence at 488 nm photoexcitation, 525-530 nm emission.
  • the terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay confirms apoptosis of cell lines, ie, kills cells.
  • APOBrdU DNA fragmentation assay KIT was used.
  • the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) method was used to bind FITC (green) to dUTP attached to nick.
  • Cells were dissected in phosphate buffer saline (PBS) and fixed in paraformaldehyde (PFA) for 15 minutes. Cells were incubated for 1 hour at 37 ° C. in 50 uL DNA-labelling solution (10 uL TdT reaction buffer, 0.75 uL TdT enzyme, 8 uL Br-dUTP), then 5 uL anti-BrdU- for 30 minutes at 20 ° C. Binding by treatment with FITC antibody. Then, apoptosis of cells was confirmed under fluorescence microscopy, and prpodium iodide (PI) was used for counterstaining of cells that did not have apoptosis.
  • PBS phosphate buffer saline
  • PFA paraformaldehyde
  • Neuronal cell line SH-SY5Y was dissolved in lysis buffer (25 mM HEPES; pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl 2 , 0.1mMDTT, protease inhibitor mixture). 10-15% SDS-PAGE and immunoblotting were performed. The dissolved protein was transferred to the etrocellulose membrane by electrophoresis on a 10-15% SDS-polyacrylamide gel. Immune activity was measured using a secondary antibody conjugated with ECL system and horseradish peroxidase (HRP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • Antibodies used for immunoblotting are caspase-3, p38, phospho-p38, AKT, phospho-AKT and ⁇ -actin. Images were observed using a Fusion-FX7 imaging system.
  • neuronal SH-SY5Y is a bvPLA2, AKT inhibitor.
  • bvPLA2 can reduce neuronal cell death by prion-femide (PrP 106-126) by increasing the expression of p-AKT protein and decreasing the expression of p-p38 protein.
  • the present invention can regulate the activity of neurodegenerative factors, thereby effectively inhibiting the death of neurons caused by modified prion proteins, and can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative brain diseases. Industrially available.

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Abstract

본 발명은 봉독으로부터 분리된 봉독 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, Group Ⅲ sPLA2)를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로서, AKT 또는 p-38 MAPK 키나제의 발현을 조절하여 변형 프리온 단백질에 의해서 유발되는 신경세포 사멸을 억제하여 퇴행성 뇌질환의 치료가 가능한 것을 특징으로 하며, 본 발명에 따른 Group sPLA를 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경 퇴행 인자의 활성을 조절할 수 있고, 이에 의해서 변형 프리온 단백질에 의해서 유발되는 신경세포의 사멸을 유효하게 억제할 수 있으며, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

봉독 포스포리파아제를 유효성분으로 포함하는 프리온 질병 치료용 조성물
본 발명은 Bee venom PLA2를 유효성분으로 포함하는 프리온 질병 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 PrPsc에 의해 유도된 신경 세포 사멸을 억제하여 프리온 질병의 치료가 가능한 Bee venom PLA2를 유효성분으로 하는 프리온 질병 치료용 조성물에 관한 것이다.
프리온은 광우병을 유발하는 인자로써, 포유류와 조류의 두뇌에서 발견되는 것으로 정상적으로는 무해한 단백질이다. 정상적인 프리온 단백질의 기능은 신체 내에서 항산화물질의 기능, 신경전달물질의 기능 등 다양한 기능을 수행한다고 알려져 있다.
그러나, 이러한 프리온 단백질에 이상이 생기면 신경세포 내의 다른 정상 단백질들을 자신과 같은 이상 형태로 변형시키고 이들이 신경세포 내에 축적되면 그 독성으로 신경세포가 죽게 되는 것으로 알려져 있다.
프리온 질병은 영국에서 소해면뇌병증(bovine spongiform encephalopathy, BSE, mad cow disease, 광우병)이 발병한 이후 영국 및 서유럽국가의 축산 경제에 막대한 손해를 끼쳤으며, 다시 사람에게 옮겨져 변이형 크로이츠펠트야콥병(variant Creutzfeldt-jakob disease, vCJD)이 되었고, 그로 인해 200 여명이 넘는 사람이 사망했다.
현재, 알려져 있는 모든 프리온 질환들은 치료 방법이 없어 치명적이기 때문에 세계적으로 프리온 질병에 대한 연구가 진행 중에 있으나 아직까지는 연구 결과가 미비한 실정이다.
많은 연구 결과에 따르면 세포 내 정상적으로 존재하는 프리온 단백질인 PrPc는 세포성장 및 증식을 위하여 필수적인 것으로 알려져 있다. 프리온 질병을 일으키는 프리온 단백질인 PrPsc가 PrPc와 binding하게 되면 PrPc의 기능을 소실하게 되어 세포 증식 및 성장이 억제되게 되며, 궁극적으로는 신경 세포의 사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, Group Ⅲ secreted PLA2는 신경 세포의 성장 및 증식을 조절하여 신경 퇴행성 질환을 유도하는 인자들의 생성을 억제하여 각 신경 퇴행성 질환의 진행을 늦추는 것으로 보고된바 있다.
현재 프리온 질병에 대한 치료제가 다양한 방면에서 연구 중에 있으며 실례로, 마우스에서는 PrPsc에 대한 백신을 개발한 것으로 알려져 있다. 또한, 프리온 단백의 발현을 막는 유전처리를 함으로써 프리온 감염에 내성을 갖게 하는 연구들이 진행되고 있으며, 퀴나크린, 퀴놀린, RNA 엡타머, 항 PrP 항체 등이 항프리온 효과를 보인다는 보고가 있지만, 세포 및 동물 실험단계에 머물러 있고, 만족할 만한 효과를 얻지 못한 실정이다.
특히, Group Ⅲ secreted PLA2가 신경 퇴행 인자의 활성을 조절할 수 있다는 보고는 있으나, 프리온 질병에 대한 적용 및 효과에 대해서는 구체적으로 보고된바 없고, group Ⅲ sPLA2가 PrPsc에 대한 세포독성에 미치는 영향에 대해서는 전혀 밝혀진 바가 없다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 신경세포 사멸에 영향을 주는 신경 퇴행 인자의 활성을 조절할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여,
봉독으로부터 분리된 봉독 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, Group Ⅲ sPLA2)를 유효성분으로 포함하는 AKT 또는 p-38 MAPK 키나제의 발현을 조절하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 약학적 수용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위하여,
봉독으로부터 분리된 봉독 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, Group Ⅲ sPLA2)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 변형 프리온 단백질에 의해서 유발되는 신경세포 사멸을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시에에 의하면, 상기 조성물은 약학적 수용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 퇴행성 뇌질환은 쿠루병, 크로이츠펠트-야콥 질병, 변형크로이츠펠트-야콥 질병, 의인성 크로이츠펠트-야콥 질병, 가족성 크로이츠펠트-야콥 질병, 산발성 크로이츠펠트-야콥 질병, 거츠만-스트로이슬러-쉐인커병, 치명적 가족성 불면증 및 치명적 산발성 불면증 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 현탁제, 동결건조제제, 비수성 주사제 또는 수성 주사제 형태일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 피내, 피하 또는 근육으로 투여될 수 있다.
상기 "치료"라 함은 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
상기 "약학적 조성물"은 본 발명의 화합물과 함께 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 "담체(carrier)"라 함은 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미한다.
상기 "희석제(diluent)"라 함은 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐아니라, 화합물을 용해시키는 물에서 희석되는 물질로 정의된다.
상기 "약학적으로 허용되는"이라 함은 화합물의 생물학적 활성과 물성을 손상시키지 않는 성질을 의미한다.
기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
본 발명에 따른 Bee venom sPLA2(Group Ⅲ sPLA)를 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경 퇴행 인자의 활성을 조절할 수 있고, 이에 의해서 변형 프리온 단백질에 의해서 유발되는 신경세포의 사멸을 유효하게 억제할 수 있으며, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 SH-SY5Y 신경세포에서 PrP(106-126)에 의해서 유도된 신경세포 사멸로부터 bvPLA2이 미치는 효과를 확인한 결과로서,
도 1는 SH-SY5Y 신경세포를 bvPLA2로 1 시간 동안 처리하고, 50 uM PrP(106-126)에 23시간 동안 노출시킨 후 Annexin V 분석에 의해서 세포 생존 정도(cell viability)를 측정한 결과이다. 세포는 apoptosis동안 플라즈마 멤브레인의 포스파티딜세린에 결합하는 FITC-Annexin V로 처리하였고, M1은 Annexin V positive cell의 대푯값이다.
도 2는 각 처리구에 대한 Annexin V positive cell의 평균값을 나타내는 그래프이다.
도 3는 SH-SY5Y 신경세포를 50 uM PrP(106-126)로 처리한 이후의 TUNEL 분석에 의한 면역형광염색(녹색)과, apoptosis가 일어나지 않은 세포의 대조염색(prpodium iodide, PI, 적색)을 나타낸 이미지이다.
도 4는 bvPLA2로 1 시간 동안 처리하고, 50 uM PrP(106-126)로 처리한 세포에 대한 Lactate dehydrogenase (LDH) 분석으로서, LDH 방출 정도를 나타낸 그래프이다.
*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있고, **은 대조구와 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음을 나타낸다.
도 5는 PrP(106-126)에 의한 신경세포 사멸에서 AKT 및 p38 인산화 조절에 미치는 bvPLA2의 효과를 나타낸 이미지로서,
SH-SY5Y 신경세포를 bvPLA2로 1 시간 동안 dose-dependent 방식으로 처리하고, 50 uM PrP(106-126)에 15 시간 동안 노출시켰고, 이에 대해서 western blot에 의해서 AKT, p-AKT, p-38, p-p38, caspase-3, cleaved caspase-3의 양을 측정하였다.
도 3은 bvPLA2가 신경 퇴행 인자인 AKT의 발현을 조절하여 PrP(106-126)에 의한 신경세포 사멸을 감소시키는 것에 대한 실험 결과로서,
도 6는 SH-SY5Y 신경세포를 50 nM bvPLA2 또는 100 nM 워트만닌으로 1 시간 동안 처리하고, 50 uM PrP(106-126)에 23 시간 동안 노출시킨 후 Annexin V 분석에 의해서 세포 생존 정도(cell viability)를 측정한 결과이다. M1은 Annexin V positive cell의 대푯값이다.
도 7는 각 처리구에 대한 Annexin V positive cell의 평균값을 나타내는 그래프이다.
도 8는 SH-SY5Y 신경세포를 bvPLA2 또는 워트만닌으로 처리하지 않고, 50 uM PrP(106-126)로 처리한 이후의 TUNEL 분석에 의한 면역형광염색(녹색)과, apoptosis가 일어나지 않은 세포의 대조염색(prpodium iodide, PI, 적색)을 나타낸 이미지이다.
도 9는 bvPLA2 또는 워트만닌으로 1 시간 동안 처리하고, 50 uM PrP(106-126)로 처리한 세포에 대한 Lactate dehydrogenase (LDH) 분석으로서, LDH 방출 정도를 나타낸 그래프이다.
*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있고, **은 대조구와 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음을 나타낸다.
도 10는 SH-SY5Y 신경세포를 bvPLA2로 1 시간 동안 dose-dependent 방식으로 처리하고, 100 nM의 워트만닌을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 대해서 각각 50 uM PrP(106-126)에 15 시간 동안 노출시켰고, 이에 대해서 western blot에 의해서 AKT, p-AKT 양을 측정한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4는 bvPLA2가 신경 퇴행 인자인 p38의 발현을 조절하여 PrP(106-126)에 의한 신경세포 사멸을 감소시키는 것에 대한 실험 결과로서,
도 11는 SH-SY5Y 신경세포를 50 nM bvPLA2 또는 100 nM SB203580으로 1 시간 동안 처리하고, 50 uM PrP(106-126)에 23 시간 동안 노출시킨 후 Annexin V 분석에 의해서 세포 생존 정도(cell viability)를 측정한 결과이다. M1은 Annexin V positive cell의 대푯값이다.
도 12는 각 처리구에 대한 Annexin V positive cell의 평균값을 나타내는 그래프이다.
도 13는 SH-SY5Y 신경세포를 bvPLA2 또는 SB203580으로 처리하지 않고, 50 uM PrP(106-126)로 처리한 이후의 TUNEL 분석에 의한 면역형광염색(녹색)과, apoptosis가 일어나지 않은 세포의 대조염색(prpodium iodide, PI, 적색)을 나타낸 이미지이다.
도 14는 bvPLA2 또는 SB203580으로 1 시간 동안 처리하고, 50 uM PrP(106-126)로 처리한 세포에 대한 Lactate dehydrogenase (LDH) 분석으로서, LDH 방출 정도를 나타낸 그래프이다.
*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있고, **은 대조구와 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음을 나타낸다.
도 15는 SH-SY5Y 신경세포를 bvPLA2로 1 시간 동안 dose-dependent 방식으로 처리하고, 100 nM의 SB203580을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 대해서 각각 50 uM PrP(106-126)에 15 시간 동안 노출시켰고, 이에 대해서 western blot에 의해서 p38, p-p38 양을 측정한 결과를 나타낸 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 변형 프리온 단백질에 의해서 유발되는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물서, 꿀벌(apis meliifera)로부터 채취하고, 이에 포함된 Bee venom(봉독) 분비성 포스포리파아제 A2(Group Ⅲ sPLA2)를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.
프리온 질병은 퇴행성 뇌질환으로서, 신경이상, 신경교증(글리오시스), 신경세포손실 등의 증상으로 특징되는 것으로서, 변형 프리온 단백질인 PrPsc가 PrPc와 binding하게 되면 PrPc의 기능을 소실하게 되어 세포 증식 및 성장이 억제되게 되며, 궁극적으로는 신경 세포의 사멸을 유발하게 되어 발생한다.
PrP(106-126)는 PrPsc와 세포독성, 베타-시트를 형성하는 형태 등에서 물리적으로 유사한 특성을 가지고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Bee venom(봉독) 분비성 포스포리파아제 A2(Group Ⅲ sPLA2)를 유효성분으로 하는 조성물의 세포 사멸 기작의 조절 및 프리온 질병 치료의 효과에 대해서 PrP(106-126)에 의해서 유도된 신경세포로 그 효과를 확인하였다.
이에 본 발명은 이하 실시예에서, group Ⅲ secreted PLA2이 PrPsc에 의해 유도된 신경 세포 사멸에 미치는 효과를 확인하기 위하여 SH-SY5Y 세포주에 콜레스테롤과 PrP(106-126)을 처리하여 cell viability test, DNA fragmentation assay 및 Western blotting을 실시하였다. 이를 통하여 AKT, p38의 발현을 확인하였고, 이에 따라 PrPsc의 신경 세포 독성에 대한 group Ⅲ sPLA2의 효능을 검토하여 유의적인 결과를 확인하였다.
본 발명은 phospholipase A2(Group Ⅲ sPLA2)를 유효성분으로 포함하는 조성물로서, AKT 또는 p-38 MAPK 키나제의 발현을 조절하는 것을 특징으로 한다.
PrP(106-126)은 신경 세포의 사멸(apoptosis)를 유발하고, PI3K/AKT 키나제의 발현을 억제하고, p38 MAPK 및 caspase-3의 발현을 증가시키는데, 본 발명에 따른 bvPLA2를 처리할 경우에 AKT 발현이 증가되고, p38 MAPK 발현이 감소되어 PrP(106-126)에 의한 apoptosis가 억제된다.
또한, 본 발명에 따른 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물은 봉독으로부터 분리된 봉독 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, Group Ⅲ sPLA2)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 퇴행성 뇌질환은 쿠루병, 크로이츠펠트-야콥 질병, 변형크로이츠펠트-야콥 질병, 의인성 크로이츠펠트-야콥 질병, 가족성 크로이츠펠트-야콥 질병, 산발성 크로이츠펠트-야콥 질병, 거츠만-스트로이슬러-쉐인커병, 치명적 가족성 불면증 또는 치명적 산발성 불면증일 수 있다.
본 발명에 따른 Group Ⅲ sPLA2를 유효성분으로 함유하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태일 수 있다. 바람직하게는 현탁제, 동결건조제제, 비수성 주사제, 또는 수성 주사용액의 형태, 보다 더 바람직하게는 멸균 주사용액제제로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 더 포함할 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 당업계에서 통상적으로 사용하는 용제, 용해보조제, 완충제, 등장화제, 안정제, 항산화제, 무통화제, 현탁화제 등을 사용하여 조제가능하며, 상기 용제, 첨가제 및 희석제로는 멸균증류수, 생리식염수, pH 조절제, 알부민, 염화나트륨, 만니톨, 링겔주사액, 포도당 등을 들 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol),마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 8 마이크로그램 내지 5 밀리그램, 바람직하게는 8 마이크로그램 내지 2 밀리그램, 보다 바람직하게는 16 마이크로그램 내지 1 밀리그램의 투여량으로, 바람직하기로는 주사제, 보다 더 바람직하기로는 근육내 주사법으로 투여하는 것이 바람직할 것이다. 투여 회수는 1일 1회, 1일 수회, 2일 내지 1주일간 1회 등으로 투여가능하나, 그 투여횟수에는 그 제한이 없다. 상기 투여량, 투여횟수 및 투여방법은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피내, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
<실시예>
본 발명의 실시예에서 사용한 재료와 방법은 다음과 같다.
(1) 신경모세포종(neuroblastoma)인 세포주(SH-SY5Y)는 American Type Culture collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양받아, 10% 우태혈청(fetal bovine serum)과 젠타마이신(0.1 mg/ml)을 포함하는 배지에서, 세포배양기(37 ℃, 5% CO2)로 배양하였다.
또한, PrP (106-126) 펩타이드 처리는 PrP (106-126) (염기서열, Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly)은 Peptron에서 합성하였고, 펩타이드는 12.5 mM 농도의 DMSO에 녹인 후, - 80 ℃에서 저장하였다.
(2) Lactate dehydrogenase (LDH) 분석
세포독성은 LDH 세포독성 탐지 키트(Takara Bio사, 일본)를 이용한 LDH 분석을 통하여 분석하였다. 마이크로플레이트 리더기(Spectra Max M2, 미국)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 LDH 방출 정도를 측정하였다.
(3) Annexin V 분석
세포 사멸은 Annexin V 분석 키트를 사용하여 세포 사멸을 분석하였으며, 그 방법은 488 nm 광여기, 525-530 nm 발광에서 형광을 측정하여 분석하였다.
(4) TUNEL 분석
TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 분석은 세포주의 apoptosis를 확인, 즉 사멸하는 세포를 측정하는 것으로서, 본 발명에서는 ApoBrdU DNA fragmentation assay KIT를 사용하여 측정하였다. terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) method를 사용하여 nick에 붙는 dUTP에 FITC (녹색)를 결합시켰다.
세포는 phosphate buffer saline(PBS)에서 해부되고, paraformaldehyde (PFA)에 15 분간 고정시켰다. 세포는 50 uL DNA-labelling 용액(10 uL TdT reaction 버퍼, 0.75 uL TdT 엔자임, 8 uL Br-dUTP)내에서 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였고, 이후 20 ℃에서 30 분 동안 5 uL anti-BrdU-FITC 항체로 처리하여 결합시켰다. 이후 형광 현미경하에서 세포의 apoptosis를 확인하였고, apoptosis가 일어나지 않은 세포의 대조염색을 위하여 prpodium iodide(PI)를 이용하였다.
(5) Western blot 분석
신경세포주 SH-SY5Y는 lysis 버퍼(25 mM HEPES; pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0.1mMDTT, protease inhibitor mixture)에 용해시켰다. 10-15% SDS-PAGE와 면역블롯(immunoblotting)을 수행하였다. 용해된 단백질은 10-15% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 이트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. 면역활성은 ECL 시스템과 HRP(horseradish peroxidase)가 컨쥬게이트된 secondary antibody를 이용하여 측정하였다.
면역블롯(immunoblotting)에 사용한 항체는 caspase-3, p38, phospho-p38, AKT, phospho-AKT, β-actin이다. 이미지는 Fusion-FX7 imaging system을 이용하여 관찰하였다.
평가예 1. SH-SY5Y 신경세포에서 PrP(106-126)에 의해서 유도된 신경세포 사멸로부터 bvPLA2이 미치는 효과(neurotoxcity의 감소)
하기 도 1 ~ 도 3에 SH-SY5Y 신경세포에서 PrP(106-126)에 의한 신경세초 사멸에 대한 bvPLA2이 미치는 영향을 Annexin V 분석한 결과를 나타내었다. PrP(106-126)를 처리하고, bvPLA2를 처리하지 않은 경우 분석결과, 59.1%가 증가(하기 도 1 및 도 2)한 반면에, bvPLA2를 처리한 경우에는 PrP(106-126)에 의한 신경세포 사멸이 억제되었다. 이러한 결과는 LDH 방출 정도를 측정한 결과와 일치하였다.(도 4) 또한, TUNEL 분석과 caspase-3의 면역블롯(immunoblotting)에서도 bvPLA2가 PrP(106-126)에 의한 apoptosis를 억제함을 확인할 수 있다.
평가예 2. bvPLA2가 AKT와 p38 MAPK 단백질 활성 조절에 의해서 P(106-126)에 의한 신경세포 사멸을 억제함에 대한 확인
(1) group III PLA2는 AKT 조절을 통하여 신경세포생존과 성장을 조절할 수 있으므로 bvPLA2가 AKT와 p38 MAPK, caspase-3 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. SH-SY5Y 신경세포를 서로 각각 다른 농도의 bvPLA2로 1 시간 동안 처리하고, PrP(106-126)에 노출시켰다.(하기 도 5) 그 결과, PrP(106-126)를 처리한 경우에는 인산화된-p38(p-p38)의 발현은 증가하였고, 인산화된-AKT(p-AKT)의 발현은 감소하였다. 이에 반하여, PrP(106-126)를 처리한 신경세포에서 bvPLA2를 처리한 경우에는 p-p38 단백질의 발현이 감소하고, P-AKT 발현이 증가하였다. 따라서, bvPLA2가 AKT 및 p38 MAPK 발현을 조절하여 프리온-펩타이드에 의해서 일어나는 신경세포의 사멸(apoptosis)을 억제함을 알 수 있다.
(2) 또한, bvPLA2가 AKT, p38 MAPK 단백질의 발현을 조절하여 PrP(106-126)에 의한 신경세포의 사멸(apoptosis)을 억제함을 확인하기 위하여, 신경세포 SH-SY5Y를 bvPLA2, AKT 저해제인 워트만닌, p38 저해제인 SB203580을 각각 처리하고, 이를 PrP(106-126)에 노출시켰다.(하기 도 3, 하기 도4)
[워트만닌] [SB203580]
Figure PCTKR2011010341-appb-I000001
Figure PCTKR2011010341-appb-I000002
먼저, bvPLA2에 의해서 Annexin V positive cell이 감소하였으나, 상기 AKT 저해제인 워트만닌의 처리에 의해서 그 효과가 다시 나타나지 않았다.(도 6 도 7) 이러한 결과는 LDH-releasing 정도를 측정한 하기 도 9에서도 동일한 결과를 나타내었다. 또한, 하기 도 8 및 10의 TUNEL 분석과 Western blot 분석에서도 동일하게 bvPLA2가 AKT의 발현을 감소시키고, PrP(106-126)에 의한 신경세포 사멸을 억제하는 역할을 함을 확인할 수 있다.
그리고, SH-SY5Y에 bvPLA2 또는 SB203580을 처리하고 PrP(106-126)에 노출시킨 결과, PrP(106-126)만을 처리한 경우에는 멤브레인에 결합하는 Annexin V의 양이 증가하였으나, bvPLA2 또는 SB203580을 처리한 경우에는 그 양이 감소하였고, PrP(106-126)에 의한 apoptosis가 억제되었음을 확인하였다.(하기 도 11 및 도 12) 이러한 결과는 LDH-releasing 정도를 측정한 결과(하기 도 14)에서도 동일하였으며, 하기 도 13 및 15의 TUNEL 분석과 Western blot 분석에서도 동일한 결과를 나타내었다.
상술한 바와 같이, bvPLA2는 p-AKT 단백질의 발현을 증가시키고, p-p38 단백질의 발현을 감소시킴으로서, 프리온-펨타이드(PrP(106-126))에 의한 신경세포 사멸을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 신경 퇴행 인자의 활성을 조절할 수 있고, 이에 의해서 변형 프리온 단백질에 의해서 유발되는 신경세포의 사멸을 유효하게 억제할 수 있으며, 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용하게 이용될 수 있어 산업상 이용가능하다.

Claims (8)

  1. 봉독으로부터 분리된 봉독 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, Group Ⅲ sPLA2)를 유효성분으로 포함하는 AKT 또는 p-38 MAPK 키나제의 발현을 조절하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 수용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 AKT 또는 p-38 MAPK 키나제의 발현을 조절하는 조성물.
  3. 봉독으로부터 분리된 봉독 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, Group Ⅲ sPLA2)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 조성물은 변형 프리온 단백질에 의해서 유발되는 신경세포 사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 수용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 퇴행성 뇌질환은 쿠루병, 크로이츠펠트-야콥 질병, 변형크로이츠펠트-야콥 질병, 의인성 크로이츠펠트-야콥 질병, 가족성 크로이츠펠트-야콥 질병, 산발성 크로이츠펠트-야콥 질병, 거츠만-스트로이슬러-쉐인커병, 치명적 가족성 불면증 및 치명적 산발성 불면증 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 조성물은 현탁제, 동결건조제제, 비수성 주사제 또는 수성 주사제 형태인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물.
  8. 제 3 항에 있어서,
    상기 조성물은 피내, 피하 또는 근육으로 투여되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물.
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